CN102083853B - 融合蛋白及其在利什曼病的诊断和治疗中的用途 - Google Patents
融合蛋白及其在利什曼病的诊断和治疗中的用途 Download PDFInfo
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Abstract
本发明通常涉及由合成的基因构建体产生的融合蛋白,所述合成的基因构建体包含来源于利什曼原虫属抗原K26、K39和K9的元件。所述融合蛋白在利什曼病的诊断中,特别是在诸如人和犬的动物中的内脏利什曼病的诊断中是特别有用的。
Description
对于相关申请的交叉引用
本申请根据35U.S.C.§119(e)要求2008年7月3日提交的美国临时专利申请第61/078,255号的优先权,其中通过引用该临时申请的全文将其并入本文。
关于序列表的声明
以文本形式代替纸质版本提供了本申请相关的序列表,并且该序列表在此通过引用并入本说明书。包含本序列表的文本文件的名称是480239_406PC_SEQUENCE_LISTING.txt。该文本文件为53KB,2009年7月2日创建,并且与本书明书同时通过EFS-Web电子提交。
背景
技术领域
本发明通常涉及由合成的嵌合基因构建体产生的融合蛋白及其在利什曼病的诊断和治疗中的用途,所述合成的嵌合基因构建体包含来自K26、K39和K9的序列。
相关领域的描述
利什曼原虫属(Leishmania)生物是巨噬细胞的细胞内原生动物寄生虫,其导致人和家畜中广泛范围的临床疾病,所述家畜主要是犬。在某些感染中,该寄生虫可处于潜伏很多年。在其他的情况中,宿主可以发展为多种形式的利什曼病中的一种。例如,该疾病可以是无症状的或可以表现为亚临床内脏利什曼病,所述亚临床内脏利什曼病的特征为不适、腹泻和间歇性肝肿大的轻微症状。患有亚临床或无症状疾病的患者通常具有低的抗体滴度,这使得该疾病难以用标准技术进行检测。可选择地,利什曼病可表现为皮肤疾病,该皮肤疾病是严重的但通常是自限的医学问题,或者利什曼病可表现为高度破坏性的不是自限的粘膜疾病。最终并且最严重的情况下,该疾病可表现为累及脾、肝和***的急性内脏感染,如果听任不治疗的话,该疾病通常是致死疾病。急性内脏利什曼病的症状包括肝脾肿大、发热、白细胞减少、贫血和丙种球蛋白过多。
该疾病的3种主要临床变种已知为:皮肤变种、粘膜皮肤变种和内脏变种。皮肤利什曼病可自身表现为白蛉叮咬部位的单一皮肤溃疡,感染后不久或数月后显现为弥散性损伤。粘膜皮肤综合征以皮肤形式发展,但数月或数年后进展为口、鼻或咽的损伤。皮肤和粘膜皮肤疾病的主要长期影响是瘢痕形成。内脏利什曼病具有3-6个月的潜伏期并且累及网状内皮***。
内脏利什曼病的临床表现包括肝和脾的增大、发热、贫血和体重丢失。在缺乏治疗的情况下,有症状的内脏疾病通常以死亡结束。近些年来,HIV和引起内脏疾病的利什曼原虫属种的共存已经导致数百双重感染的个体的病例(Berman,J.D.,(1997)Clin.Infect.Dis.24:684)。在2000年,世界卫生组织最近估计利什曼病侵袭88个国家的人,3亿5千万人处于染上该疾病的风险并且每年约2百万新病例。该疾病的毁灭性的影响的实例为苏丹内脏利什曼病的最近流行,其夺去估计100,000人的生命(Seaman,J.,et al.(1996)Int.J.Epidemiol.25:862)。如海湾战争期间亲内脏利什曼病的爆发所证实的,该疾病频繁成为军事行动中的威胁(Magill,J.,et al.(1993)N Engl J Med 328:1383)。
在世界很多地区,利什曼病是严重的问题,包括巴西、中国、东非、印度和中东地区。该疾病在地中海地区还是地方性的,包括法国南部、意大利、希腊、西班牙、葡萄牙和北非。在过去的20年中,利什曼病的病例数显著增加并且现在世界各地存在数百万的该疾病的病例。每年诊断约2百万的新病例,25%的新病例是内脏利什曼病。然而,目前没有疫苗或可行的有效治疗。
利什曼病由利什曼原虫属的数个种引起。动质体目的这些单细胞生物与锥体虫有关,锥体虫是非洲的昏睡病和南美的查加斯病的成因生物。利什曼原虫属寄生虫通常以两种截然不同的方式存在,昆虫载体的能动的前鞭毛体和存在于哺乳动物宿主中的固定的无鞭毛体。前鞭毛体通过受感染的遍及世界热带和温带各处的白蛉的叮咬而被传播到人。当传递至哺乳动物宿主时,前鞭毛体感染网状内皮***的巨噬细胞并转变为无鞭毛体。
利什曼病的准确诊断常常难以实现。有利什曼原虫属的20个种感染人,包括杜氏利什曼原虫(L.donovani)、恰氏利什曼原虫(L.chagasi)、婴儿利什曼原虫(L.infantum)、硕大利什曼原虫(L.major)、亚马逊利什曼原虫(L.amazonensis)、巴西利什曼原虫(L.braziliensis)、巴拿马利什曼原虫(L.panamensis)、墨西哥利什曼原虫(L.mexicana)、热带利什曼原虫(L.tropica)和圭亚那利什曼原虫(L.guyanensis),并且没有明确指示利什曼原虫属感染存在的特有迹象或症状。已经使用了寄生虫检测方法,但这些方法既不是敏感的也不是临床实用的。现有的皮肤测试通常使用整体的或分解的寄生虫。这些测试通常是不敏感的、不可再现的并且易于与多种其他疾病交叉反应。此外,这些测试中使用的制剂通常是不稳定的。
因此,需要改进的方法用于利什曼原虫属感染的检测。例如,本领域需要更敏感的和特异性更强的方法用于检测利什曼原虫属感染和鉴别那些可能进展为急性内脏感染的无症状利什曼原虫属感染。本发明实现这些需要并且进一步提供其他相关利益。
概述
本发明通常涉及包含至少两种异源利什曼原虫属抗原的组合物、包含所述抗原的融合多肽和编码所述抗原和融合物的多核苷酸,其中所述利什曼原虫属抗原选自K39、K26和/或K9。本发明还涉及在利什曼病的诊断、治疗和预防中使用本发明的多肽和多核苷酸的方法。本发明的抗原,当被联合使用和/或作为如本文所述的融合多肽或多核苷酸使用时,提供改进的和预想不到的优势,并且在利什曼病诊断和疫苗开发方面是特别有用的。
因此,根据一个实施方案,本发明提供分离的融合多肽,其包含两个或更多个选自K26、K39和K9的利什曼原虫属抗原或其免疫原部分或变体。在相关实施方案中,分离的融合多肽包含至少全部三种以上的利什曼原虫属抗原,其中至少一种抗原分离自杜氏利什曼原虫。
在具体实施方案中,本发明的融合多肽包含以下:包含至少K26的142-267位残基(SEQ ID NO:5)的第一免疫原部分;包含至少K39的2110-2343位残基(SEQ ID NO:6)的第二免疫原部分;和包含至少K9的1-399位残基(SEQ ID NO:7)的第三免疫原部分。在更具体的实施方案中,本发明的融合多肽包含如SEQ ID NO:8的10-262位氨基酸残基所示的氨基酸序列。在某些实施方案中,所述融合多肽包含MHHHHHHTS(SEQ IDNO:21)的N末端氨基酸序列。在某些其他实施方案中,所述融合多肽包含如SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列。
在多个实施方案中,本发明提供编码本发明的融合多肽的分离的多核苷酸。
本发明还提供与本文各处所述的融合多肽特异性地结合的分离的抗体或抗原结合片段。
在另一实施方案中,本发明考虑到药物组合物,其包含以下与生理学可接受的载体的组合:本发明的融合多肽,或识别本发明的融合多肽的分离的抗体或抗原结合片段,或编码本发明的融合多肽的多核苷酸。
在相关实施方案中,本发明考虑到疫苗组合物,其包含以下与非特异性免疫应答增强剂的组合:本发明的融合多肽,或识别本发明的融合多肽的分离的抗体或抗原结合片段,或编码本发明的融合多肽的多核苷酸。
在具体实施方案中,本发明提供在选自血清、血液和唾液的生物样品中检测无症状或亚临床利什曼原虫属感染的方法,所述方法包括:使生物样品与融合多肽接触,所述融合多肽包含两个或更多个选自K26、K39和K9的利什曼原虫属抗原或其免疫原部分;并在所述生物样品中检测与所述融合多肽结合的抗体的存在,从而检测所述生物样品中无症状亚临床或活动性利什曼原虫属感染。在更具体的实施方案中,检测生物样品中无症状或亚临床利什曼原虫属感染的方法利用包含以下的融合多肽:包含至少K26的142-267位残基(SEQ ID NO:5)的第一免疫原部分;包含至少K39的2110-2343位残基(SEQ ID NO:6)的第二免疫原部分;和包含至少K9的1-399位残基(SEQ ID NO:7)的第三免疫原部分。在仍然更具体的实施方案中,所述融合多肽包含如SEQ ID NO:8的10-262位残基所示的氨基酸序列。在仍然更具体的相关实施方案中,所述融合多肽还包含MHHHHHHTS(SEQ ID NO:21)的N末端氨基酸序列。
在相关实施方案中,检测生物样品中无症状或亚临床利什曼原虫属感染的方法使用与固体支持物结合的融合多肽,其中所述固体支持物可以包含,例如硝化纤维、胶乳或塑料材料。在某些实施方案中,所述方法还包括i)从固体支持物去除未结合的样品;ii)将检测试剂添加到所述固体支持物;并且iii)相对于预定截断值测定与所述固体支持物结合的检测试剂的的水平,从而检测所述生物样品中无症状或亚临床利什曼原虫属感染。
在多个实施方案中,本发明提供鉴别受可能发展为急性内脏利什曼病的无症状或亚临床内脏利什曼病侵袭的患者的方法,所述方法包括:使获自受无症状或亚临床内脏利什曼病侵袭的患者的生物样品与第一多肽接触,所述第一多肽是融合多肽,其包含两个或更多个选自K26、K39和K9的利什曼原虫属抗原或其免疫原部分,所述生物样品选自血清、血液和唾液;并且独立地使所述生物样品与包含如SEQ ID NOs:6、10或11所示的氨基酸序列的第二多肽接触;并且在所述样品中检测与第一和第二多肽的至少一个结合的抗体的存在,从而鉴别受可能发展为急性内脏利什曼病的无症状或亚临床内脏利什曼病侵袭的患者。
在具体实施方案中,鉴别受可能发展为急性内脏利什曼病的无症状或亚临床内脏利什曼病侵袭的患者的方法使用融合多肽,其包含:包含至少K26的142-267位残基(SEQ ID NO:5)的第一免疫原部分;包含至少K39的2110-2343位残基(SEQ ID NO:6)的第二免疫原部分;和包含至少K9的1-399位残基(SEQ ID NO:7)的第三免疫原部分。在仍然更具体的实施方案中,所述融合多肽包含如SEQ ID NO:8的10-262位氨基酸残基所示的氨基酸序列。在仍然更具体的相关实施方案中,所述融合多肽还包含MHHHHHHTS(SEQ ID NO:21)的N末端氨基酸序列。
在相关实施方案中,鉴别受可能发展为急性内脏利什曼病的无症状或亚临床内脏利什曼病侵袭的患者的方法使用与固体支持物结合的融合多肽,其中所述固体支持物可以包含,例如硝化纤维,胶乳或塑料材料。在某些相关实施方案中,所述方法还包括i)从每个固体支持物去除未结合的样品;ii)将检测试剂添加到每个固体支持物;并且iii)相对于预定截断值的水平比较与每个固体支持物结合的检测试剂水平,从而鉴别受可能发展为急性内脏利什曼病的无症状或亚临床内脏利什曼病侵袭的患者。
在具体实施方案中,所述检测试剂包含与结合剂结合的报告基团。在相关实施方案中所述结合剂选自抗免疫球蛋白、蛋白G、蛋白A和凝集素。在其他相关实施方案中,所述报告基团选自放射性同位素、荧光基团、发光基团、酶、胶体金、生物素和染料颗粒。
在多个其他实施方案中,本发明提供用于检测生物样品中无症状或亚临床内脏利什曼病的诊断试剂盒。在具体实施方案中,用于检测生物样品中无症状或亚临床内脏利什曼病的试剂盒包含融合多肽和检测试剂,所述融合多肽包含两个或更多个选自K26、K39和K9的利什曼原虫属抗原或其免疫原部分,其中所述样品选自血清、血液和唾液。
在某些实施方案中,用于鉴别受可能发展为急性内脏利什曼病的无症状或亚临床内脏利什曼病侵袭的患者的诊断试剂盒包含第一多肽、第二多肽和检测试剂,所述第一多肽是融合多肽,其包含两个或更多个选自K26、K39和K9的利什曼原虫属抗原或其免疫原部分,所述第二多肽包含如SEQ ID NOs:10或11所示的氨基酸序列。
本发明的试剂盒还可以包含含有与结合剂结合的报告基团的检测试剂,和/或结合剂选自抗免疫球蛋白、蛋白G、蛋白A和凝集素和/或报告基团选自放射性同位素、荧光基团、发光基团、酶、胶体金、生物素和染料颗粒。
附图简要描述
图1显示出K28融合基因构建体的示意图,其包含N末端9个氨基酸的基序、LdK26基因序列的142-267位多核苷酸(SEQ ID NO:1)、LdK39基因序列的2110-2343位多核苷酸(SEQ ID NO:2)和LdK9基因序列的1-399位多核苷酸(SEQ ID NO:3),所述N末端9个氨基酸的基序包含6×HIS标签(即6个组氨酸残基)。
图2显示出K28、K39和K9抗原检测来自委内瑞拉的人类患者的血清中的VL的能力的比较。
图3显示出K9、K26、K28和K39抗原检测来自委内瑞拉的犬的血清中的VL的能力的比较。
序列标识简要描述
SEQ ID NO:1表示杜氏利什曼原虫K26基因序列的142-267位多核苷酸,其编码K26抗原的免疫原部分。
SEQ ID NO:2表示杜氏利什曼原虫K39基因序列的2110-2343位多核苷酸,其编码K39抗原的免疫原部分。
SEQ ID NO:3表示杜氏利什曼原虫K9基因序列的1-399位多核苷酸,其编码免疫原部分和全长K9抗原。
SEQ ID NO:4表示合成基因K28的多核苷酸序列,其包含N末端9个氨基酸的基序、SEQ ID NO:1的多核苷酸序列,所述N末端9个氨基酸的基序包含6×HIS标签,所述SEQ ID NO:1的多核苷酸序列与SEQ IDNO:2的多核苷酸序列融合,所述SEQ ID NO:2的多核苷酸序列与SEQ IDNO:3的多核苷酸序列融合。ORF始于第4位核苷酸。
SEQ ID NO:5表示杜氏利什曼原虫K26抗原的142-267位多核苷酸所编码的免疫原多肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO:6表示杜氏利什曼原虫K39抗原的2110-2343位多核苷酸所编码的免疫原多肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO:7表示杜氏利什曼原虫K9抗原的1-399位多核苷酸所编码的免疫原全长多肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO:8表示SEQ ID NO:4所编码的K28多肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO:9表示杜氏利什曼原虫K26抗原的单一重复单元的氨基酸序列。
SEQ ID NO:10表示杜氏利什曼原虫K39抗原的单一重复单元的氨基酸序列。
SEQ ID NO:11表示杜氏利什曼原虫K39抗原的单一重复单元的氨基酸序列。
SEQ ID NO:12表示编码SEQ ID NO:9的杜氏利什曼原虫K26抗原的单一重复单元的多核苷酸序列。
SEQ ID NO:13表示编码SEQ ID NO:9的杜氏利什曼原虫K26抗原的单一重复单元的多核苷酸序列。
SEQ ID NO:14表示编码SEQ ID NO:10的杜氏利什曼原虫K39抗原的单一重复单元的多核苷酸序列。
SEQ ID NO:15表示编码SEQ ID NO:11的杜氏利什曼原虫K39抗原的单一重复单元的多核苷酸序列。
SEQ ID NO:16表示杜氏利什曼原虫K26基因的全长多核苷酸序列。
SEQ ID NO:17表示杜氏利什曼原虫K39基因的全长多核苷酸序列。
SEQ ID NO:18表示杜氏利什曼原虫K9基因的全长多核苷酸序列。
SEQ ID NO:19表示SEQ ID NO:16所编码的氨基酸序列。
SEQ ID NO:20表示SEQ ID NO:17所编码的氨基酸序列。
SEQ ID NO:21表示在本发明的多肽的重组产生中使用的示例性的N末端组氨酸标签。
详细描述
利什曼原虫属抗原及其融合物
本发明通常涉及使用利什曼原虫属抗原的组合物和方法。本发明的组合物通常包含利什曼原虫属种的至少两种异源抗原或其免疫原部分。可以从例如对于多种利什曼原虫属种的国立生物技术信息中心(NationalCenter for Biotechnology Information(NCBI))数据库获得利什曼原虫属抗原序列,所述多种利什曼原虫属种包括杜氏利什曼原虫、恰氏利什曼原虫、婴儿利什曼原虫、硕大利什曼原虫、亚马逊利什曼原虫、委内瑞拉利什曼原虫(L.venezuelensis)、巴西利什曼原虫、巴拿马利什曼原虫、墨西哥利什曼原虫、热带利什曼原虫和圭亚那利什曼原虫。
在一方面,本发明提供如本文所述的包括融合多肽的分离的利什曼原虫属多肽和包含所述分离的利什曼原虫属多肽的组合物。通常,本发明的多肽会是分离的多肽并且可以包含来自两个或更多个利什曼原虫属基因的氨基酸序列的多肽片段(例如抗原/免疫原部分)、多个多肽片段(例如融合多肽)或全长多肽,所述利什曼原虫属基因包括但不限于K26、K39和/或K9。本领域技术人员应当理解到,抗原多肽片段还可以获自本领域内已经可以获得的那些。使用常规重组和/或合成技术可以制备本发明的多肽、所述多肽的抗原/免疫原片段和其他变体。
在某些实施方案中,本发明的多肽是融合多肽。在具体实施方案中,所述融合多肽包含K26、K39和/或K9抗原或其免疫原部分,所述免疫原部分是抗原的/免疫原的,即它们在免疫测定(例如ELISA或T细胞刺激检测)中与来自受感染的个体的抗血清和/或T细胞可检测地反应。可以使用技术人员熟知的技术进行对于免疫原活性的筛选。例如,可以使用诸如Harlow and Lane,Antibodies:A Laboratory Manual(抗体:实验手册),Cold Spring Harbor Laboratory Press,1988中所述的那些方法进行这些筛选。在一个示例性的实例中,本发明的多肽(例如融合多肽)可以被固定在固体支持物上并且与患者血清接触以允许血清中的抗体与固定的多肽的结合。然后,可以去除未结合的血清并使用诸如125I标记的蛋白A检测结合的抗体。
如技术人员应当意识到的,本发明的融合多肽可以包含本文公开的利什曼原虫属K26、K39和/或K9多肽的抗原或免疫原部分或片段。如本文所用的“免疫原部分”是本发明的免疫原多肽的片段,所述片段自身与识别所述多肽的B细胞和/或T细胞表面抗原受体是免疫上反应性的(即特异性地结合)。通常可以使用熟知技术鉴定免疫原部分,例如Paul,Fundamental Immunology(基础免疫学),5th ed.,Lippincott Williams &Wilkins,2003和其中引用的文献中总结的那些方法。这些技术包括对于与抗原特异性抗体、抗血清和/或T细胞系或克隆反应的能力筛选多肽。如本文所用的抗血清和抗体是“抗原特异性的”,如果它们特异性地与抗原结合(即它们在免疫测定中与蛋白反应并且不与无关蛋白可检测地反应)。可以如本文所述和使用熟知技术制备这些抗血清和抗体。
在具体实施方案中,本发明的融合多肽的抗原/免疫原部分或多肽片段是以基本不低于全长融合多肽的反应性的水平与抗血清和/或T细胞反应的部分(例如在ELISA和/或T细胞反应性检测中)。优选地,融合多肽中抗原/免疫原部分的免疫原活性的水平是全长融合多肽的免疫原性的至少约50%、优选地至少约70%和最优选地大于约90%。在某些情况下,会鉴定出具有高于对应的全长融合多肽的免疫原活性的免疫原活性水平的优选的免疫原部分,例如,具有高于约100%或150%或更高的免疫原活性。在具体实施方案中,所述全长融合多肽的免疫原性会具有由其中包含的每种抗原/免疫原部分所贡献的加成的免疫原性。
本发明的融合多肽还可以包含一个或多个多肽,其与T细胞和/或针对本发明的多肽生成的抗体是免疫上反应性的,特别是与针对具有本文公开的氨基酸序列的多肽或其免疫原片段或变体生成的抗体是免疫上反应性的。在具体实施方案中,所述被针对的多肽是本文所述的融合多肽。
在本发明的另一实施方案中,提供了融合多肽,其包含能够激发T细胞和/或抗体的两个或更多个多肽,所述抗体与两个或更多个本文所述的多肽是免疫上反应性的,或由包含在本文公开的多核苷酸序列中的连续多核苷酸序列编码的两个或更多个多肽或其免疫原片段或变体,或与这些多核苷酸序列中的两个或更多个在中严紧性至高严紧性的条件下杂交的两个或更多个多核苷酸序列编码的两个或更多个多肽。
本发明还提供包含K26、K29和/或K9多肽的片段的融合多肽,所述片段包括抗原/免疫原片段,所述抗原/免疫原片段包含利什曼原虫属K26、K39和/或K9抗原的至少约5、10、15、20、25、50、75、100、150、200、250,300或350个连续氨基酸或更多并且包括所有中间的长度,所述抗原/免疫原片段例如本文所示的那些片段或由本文所示的多核苷酸序列所编码的那些片段。
在另一方面,本发明的融合多肽包含多肽片段的多拷贝,多肽片段的重复或多亚基多肽片段,包括以任何顺序包含至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个连续片段的、诸如利什曼原虫属K26、K39和/或K9多肽的抗原/免疫原片段,并且包括所有长度的本文所示的多肽组合物或由本文所示的多核苷酸序列编码的那些。在另一方面,本发明的融合多肽可以包含两个或更多个如SEQ ID NOs:5-7和9-11中所示的利什曼原虫属抗原片段。在相关方面,所述融合多肽包含如SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:8的10-262位氨基酸所示的氨基酸序列。
在仍然另一方面,本发明提供包含两个或更多个本文所述的利什曼原虫属K26、K29和/或K9多肽的变体的融合多肽。本发明通常所包括的多肽变体与本文所示的多肽序列通常,沿着其长度,表现出至少约70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%或更高的一致性(按照下文所述测定)。优选地,相对于天然K26、K29和/或K9序列,这些变体会具有相同的、相似的或提高的免疫活性。
如本文所用的术语多肽“变体”是通常与本文具体公开的多肽(例如利什曼原虫属K26、K29和/或K9多肽)的区别在于一个或多个取代、缺失、添加和/或***的多肽。这些变体可以是天然存在的或可以是合成生成的,例如,通过使用许多本领域公知的技术中的任何技术修饰一个或多个本发明的以上多肽序列并评估其如本文所述的免疫原活性。
在很多情况下,变体会包含保守型取代。“保守型取代”是氨基酸被具有相似性质的另一氨基酸取代的一种取代,以使肽化学领域技术人员会期望多肽的二级结构和亲水性质基本上不改变。如上文所述,可以在本发明的多核苷酸和多肽的结构中进行修饰并且仍获得编码具有诸如免疫原特性的所需特性的变体或衍生物多肽的功能性分子。当希望改变多肽的氨基酸序列以产生等同的或甚至改进的本发明多肽的免疫原变体或部分时,本领域技术人员通常会按照表1改变编码DNA序列的一个或多个密码子。
例如,在蛋白结构中,某些氨基酸可以被其他氨基酸取代,而没有与诸如抗体的抗原结合区或底物分子上的结合位点的结构的相互作用结合能力的明显丢失。因为蛋白的相互作用能力和性质限定该蛋白的生物功能活性,可以在蛋白序列中并且当然,在其根本的DNA编码序列中进行某些氨基酸序列取代,并且仍然获得具有相似性质的蛋白。因此,预期可以在公开的组合物的肽序列或编码所述肽的对应的DNA序列中进行各种改变,而没有它们生物效用或活性的明显丢失。
表1
在进行这些改变时,可以考虑氨基酸的亲水指数。在本领域中通常理解在赋予蛋白上的相互作用生物学功能时亲水氨基酸指数的重要性(Kyte and Doolittle,1982,通过引用并入本文)。已公认的是,氨基酸的相对亲水特性贡献于得到的蛋白的二级结构,所述二级结构随后限定该蛋白与其他分子的相互作用,所述其他分子例如酶、底物、受体、DNA、抗体、抗原等。根据氨基酸的疏水性和带电特性,已对每种氨基酸给定亲水指数(Kyte and Doolittle,1982)。这些值为:异亮氨酸(+4.5)、缬氨酸(+4.2)、亮氨酸(+3.8)、苯丙氨酸(+2.8)、半胱氨酸/胱氨酸(+2.5)、甲硫氨酸(+1.9)、丙氨酸(+1.8)、甘氨酸(-0.4)、苏氨酸(-0.7)、丝氨酸(-0.8)、色氨酸(-0.9)、酪氨酸(-1.3)、脯氨酸(-1.6)、组氨酸(-3.2)、谷氨酸(-3.5)、谷氨酰胺(-3.5)、天冬氨酸(-3.5)、天冬酰胺(-3.5)、赖氨酸(-3.9)和精氨酸(-4.5)。
本领域内已知,某些氨基酸可以被具有相似亲水指数或评分的其他氨基酸取代并且仍导致具有相似生物活性的蛋白,即仍获得生物功能上等同的蛋白。在进行这些改变时,亲水指数在±2之内的氨基酸的取代是优选的,在±1之内的那些是特别优选的并且在±0.5之内的那些是更加特别优选的。本领域内还理解的是,根据亲水性可以有效进行相似氨基酸的取代。
如美国专利第4,554,101号中详述,已指定氨基酸残基以下亲水性值:精氨酸(+3.0)、赖氨酸(+3.0)、天冬氨酸(+3.0±1)、谷氨酸(+3.0±1)、丝氨酸(+0.3)、天冬酰胺(+0.2)、谷氨酰胺(+0.2)、甘氨酸(0)、苏氨酸(-0.4)、脯氨酸(-0.5±1)、丙氨酸(-0.5)、组氨酸(-0.5)、半胱氨酸(-1.0)、甲硫氨酸(-1.3)、缬氨酸(-1.5)、亮氨酸(-1.8)、异亮氨酸(-1.8)、酪氨酸(-2.3)、苯丙氨酸(-2.5)、色氨酸(-3.4)。理解的是,氨基酸可以被具有相似亲水性值的另一氨基酸取代并且仍获得生物学等同的并特别是免疫上等同的蛋白。在这些改变中,亲水性值在±2之内的氨基酸的取代是优选的,在±1之内的那些是特别优选的并且在±0.5之内的那些是更加特别优选的。
如上文所述,因此,氨基酸取代通常是基于氨基酸侧链取代基的相对相似度,例如它们的疏水性、亲水性、电荷、大小等。将各种上述特性考虑在内的示例性的取代对于本领域技术人员是熟知的并且包括:精氨酸和赖氨酸;谷氨酸和天冬氨酸;丝氨酸和苏氨酸;谷氨酰胺和天冬酰胺;以及缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸。
此外,可以进一步修饰任何多核苷酸以增加体内稳定性。可能的修饰包括,但不限于,位于5′和/或3′末端的侧翼序列的添加;在主链中使用磷硫酰或2′O-甲基而不是磷酸二酯酶连接;和/或包含非常规碱基,例如次黄嘌呤核苷、Q苷(queosine)和怀丁苷(wybutosine),以及乙酰基-、甲基-,硫-和其他修饰形式的腺嘌呤、胞苷、鸟嘌呤、胸腺嘧啶和尿苷。
还可以根据残基的极性、电荷、溶解性、疏水性、亲水性和/或两性性质中的相似性进行氨基酸取代。例如,带负电的氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸;带正电的氨基酸包括赖氨酸和精氨酸;并且带有具有相似亲水性值的不带电极性头基团的氨基酸包括亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸;甘氨酸和丙氨酸;天冬酰胺和谷氨酰胺;以及丝氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸。可以代表保守型改变的氨基酸的其他组包括:(1)ala、pro、gly、glu、asp、gln、asn、ser、thr;(2)cys、ser、tyr、thr;(3)val、ile、leu、met、ala、phe;(4)lys、arg、his;和(5)phe、tyr、trp、his。变体也可以,或可选择地,包含非保守型改变。在优选的实施方案中,变体多肽与天然序列区别在于5个氨基酸或更少氨基酸的取代、缺失或添加。也可以(或可选择地)通过例如对于多肽的免疫原性、二级结构和亲水性质具有最小影响的氨基酸的缺失或添加来修饰变体。
如上文所述,多肽可以包含位于蛋白的N末端的信号(或前导)序列,该序列在翻译同时或翻译后指导所述蛋白的转移。多肽也可以与接头或其他序列结合以便于所述多肽的合成、纯化或鉴定(例如,聚组氨酸标签(6×His)、GST、MBP、TAP/TAG、FLAG表位、MYC表位、V5表位、VSV-G表位等)或以增强所述多肽与固体支持物的结合。例如,多肽可以与免疫球蛋白Fc区结合。
当比较多肽序列时,如下文所述,当对两个序列进行最大对应比对时,如果两个序列中的氨基酸序列是相同的,则两个序列被认为是“一致的”。通常通过在比较窗比较序列以鉴定和比较序列相似性的局部区进行两个序列之间的比对。如本文所用的“比较窗”是指至少约20个连续位置的节段、通常为30-约75、40-约50的节段,其中在两个序列被最佳比对后,序列可以与相同数目连续位置的参比序列进行比较。
可以使用生物信息学软件的Lasergene套件中的Megalign程序(DNASTAR,Inc.,Madison,WI)、使用默认参数构建用于比较的序列的最佳比对。该程序收录以下参考资料中所描述的数个比对方案:Dayhoff,M.O.(1978)A model of evolutionary change in proteins-Matrices fordetecting distant relationships(用于测定远缘关系的蛋白矩阵中进化变异的模型)。In Dayhoff,M.O.(ed.)Atlas of Protein Sequence and Structure(蛋白质序列和结构图集),National Biomedical Research Foundation,Washington DC Vol.5,Suppl.3,pp.345-358;Hein J.(1990)UnifiedApproach to Alignment and Phylogenes pp.626-645 Methods in Enzymology(酶学方法)vol.183,Academic Press,Inc.,San Diego,CA;Higgins,D.G.andSharp,P.M.(1989)CABIOS 5:151-153;Myers,E.W.and Muller W.(1988)CABIOS 4:11-17;Robinson,E.D.(1971)Comb.Theor 11:105;Santou,N.Nes,M.(1987)Mol.Biol.Evol.4:406-425;Sneath,P.H.A.and Sokal,R.R.(1973)Numerical Taxonomy-the Principles and Practice of NumericalTaxonomy(数值分类法-数值分类法的原理与实践),Freeman Press,SanFrancisco,CA;Wilbur,W.J.and Lipman,D.J.(1983)Proc.Nat’l Acad.,Sci.USA 80:726-730。
可选择地,可以通过以下构建用于比较的序列的最佳比对:Smith andWaterman(1981)Add.APL.Math 2:482的局部一致性比对,Needleman andWunsch(1970)J.Mol.Biol.48:443的一致性比对算法,Pearson and Lipman(1988)Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 85:2444的相似性搜索方法,这些算法的计算机工具(Wisconsin Genetics Software Package中的GAP、BESTFIT、BLAST、FASTA和TFASTA,Genetics Computer Group(GCG),575 ScienceDr.,Madison,WI);或通过检查构建用于比较的序列的最佳比对。
适于测定序列一致性百分比和序列相似性百分比的算法的一个优选的实例是BLAST和BLAST 2.0算法,其分别描述于Altschul et al.(1977)Nucl.Acids Res.25:3389-3402和Altschul et al.(1990)J.Mol.Biol.215:403-410。例如,可以以本文所述的参数使用BLAST和BLAST 2.0来测定本发明多核苷酸和多肽的序列一致性百分比。用于进行BLAST分析的软件可以通过国立生物技术信息中心(National Center forBiotechnology Information)公开获得。对于氨基酸序列,评分矩阵可以用于计算累积评分。当累积比对评分从其最高达到值降低X量、由于一个或多个负评分残基比对的累加使累积评分等于0或低于0或任一序列达到末端时,停止每个方向的字码命中的延伸。BLAST算法参数W、T和X决定比对的敏感度和速度。
在一个优选的方法中,通过在至少20个位置的比较窗比较两个最佳比对的序列测定“序列一致性百分比”,其中与用于两个序列的最佳比对的参比序列(不包含添加或缺失)相比,比较窗中部分的多肽序列可以包含20%或更少的,通常为5-15%或10-12%的添加或缺失(即空位)。通过以下计算百分比:测定在两个序列中都出现的相同的氨基酸残基的位置数以产生匹配的位置数,用匹配的位置数除以参比序列(即窗大小)中的总位置数并将结果乘以100以产生序列一致性百分比。
在本发明的某些优选实施方案中,提供了利什曼原虫属融合多肽和编码融合多肽的多核苷酸,其中所述融合多肽包含K26、K39和/或K9多肽序列中的两个或更多个或其免疫原部分。融合多肽和融合蛋白是指具有至少两个共价连接的诸如杜氏利什曼原虫多肽的异源利什曼原虫多肽,所述连接为直接连接或通过氨基酸接头连接。K26、K39和/或K9抗原序列可以,但不需要,来源于同一利什曼原虫属种。形成融合蛋白的多肽通常是C末端至N末端连接,尽管它们也可以是C末端至C末端、N末端至N末端连接或N末端至C末端连接。融合蛋白的多肽可以按照任何顺序并且可以包含每个或任何组成所述融合蛋白的多肽的多拷贝、重复或多聚体。融合多肽或融合蛋白也可以包括组成所述融合蛋白的抗原的保守修饰的变体、多态性变体、等位基因、突变体、亚序列、种间同系物和免疫原片段。在具体实施方案中,本发明的融合多肽可以包含一个或多个如SEQ ID NOs:5-7和9-11所示的利什曼原虫属抗原片段。在相关实施方案中,所述融合多肽包含SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:8的10-262位氨基酸中所示的氨基酸序列。
也可以使用对应于杜氏利什曼原虫抗原的来自其他利什曼原虫属种的抗原并且可以例如使用如本文所述的序列比较算法或诸如杂交检测和抗体结合检测的本领域技术人员已知的其他方法鉴定所述抗原。
本发明的融合多肽通常包含至少两个来自如本文所述的K26、K39和/或K9多肽的抗原/免疫原部分或片段并且还可以包含其他不相关序列,例如协助提供T辅助表位的序列(免疫融合伴侣),优选为被人识别的T辅助表位的序列,或协助以比天然重组蛋白更高的得率表达蛋白的序列(表达增强剂)。某些优选的融合伴侣同时是免疫和表达增强融合伴侣。可以选择其他融合伴侣,以增加蛋白的溶解度或使蛋白能够靶向于所需的细胞内部分。其他融合伴侣可以包括便于蛋白的纯化的亲和力标签,例如V5、6×HIS、MYC、FLAG和GST。本领域技术人员会理解到,那些不相关序列可以,但不需要,存在于按照本发明使用的融合多肽中。
通常可以使用标准技术制备融合蛋白。优选地,融合蛋白被表达为重组蛋白。例如,可以分别组装编码所需融合物的多肽组分的DNA序列,并连接到合适的表达载体中。编码一个多肽组分的DNA序列的3′末端被,用或不用肽接头,连接到编码第二多肽组分的DNA序列的5′末端,以使序列的读码框是同相的。这允许翻译为保留两个组分多肽的生物活性的单一融合蛋白。
如果需要,可以使用肽接头序列使第一和第二多肽组分分离一定距离,所述距离足以确保每个多肽折叠成其二级和三级结构。使用本领域熟知的标准技术将这样的肽接头序列并入融合蛋白。可以根据以下因素选择某些肽接头序列:(1)它们采取柔韧延展构象的能力;(2)它们不采取能与第一和第二多肽上的功能表位相互作用的二级结构的能力;和(3)可能与多肽功能表位反应的疏水或带电残基的缺乏。优选的肽接头序列包含Gly、Asn和Ser残基。其他接近中性的氨基酸,例如Thr和Ala,也可以用于接头序列。可作为接头有效使用的氨基酸序列包括Maratea etal.,Gene 40:3946(1985);Murphy et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83:82588262(1986);美国专利第4,935,233号和美国专利第4,751,180号中公开的那些序列。接头序列长度通常可以为1-约50个氨基酸。当第一和第二多肽具有非必需N末端氨基酸区时,不需要接头序列,所述非必需N末端氨基酸区可以用于分离功能结构域并防止空间干扰。
将连接的DNA序列可操作地连接到适合的转录或翻译调节元件。负责DNA表达的调节元件仅位于编码第一多肽的DNA序列的5′。相似地,终止翻译所需要的终止密码子和转录终止信号仅存在于编码第二多肽的DNA序列的3′。
在优选的实施方案中,用于本发明的融合多肽的免疫融合伴侣来源于蛋白D,其为革兰氏阴性细菌B型流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzaB)的表面蛋白(WO 91/18926)。优选地,蛋白D衍生物包含该蛋白的约前三分之一(例如,前N末端100个、110个氨基酸),并且蛋白D衍生物可以是脂化的。在某些优选的实施方案中,在N末端包括脂蛋白D融合伴侣的前109个残基,从而向该融合多肽提供额外的外源T细胞表位并增加在大肠杆菌中的表达水平(因此作为表达增强剂发挥功能)。脂质尾部确保抗原最佳呈递至抗原呈递细胞。其他融合伴侣包括来自流感病毒的非结构蛋白,NS1(血红细胞凝集素)。通常,使用N末端81个氨基酸,虽然可以使用包括T辅助表位的不同片段。在另一实施方案中,免疫融合伴侣包含来源于称为LYTA的蛋白或其部分(优选为C末端部分)的氨基酸序列。LYTA来源于肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae),肺炎链球菌合成称为酰胺酶LYTA(由LytA基因编码;Gene 43:265-292(1986))的N-乙酰基-L-丙氨酸酰胺酶。LYTA是自溶素,其特异性地降解肽聚糖主链中的某些键。LYTA蛋白的C末端结构域负责与胆碱或诸如DEAE的某些胆碱类似物的亲和力。该性质已被用于开发对于融合蛋白的表达有用的大肠杆菌C-LYTA表达质粒。在氨基末端包含C-LYTA片段的杂交蛋白的纯化已有描述(参见Biotechnology 10:795-798(1992))。在优选的实施方案中,如本文所述,可以将LYTA的重复部分并入本发明的融合多肽。重复部分见于起始于178位残基的C末端区。特别优选的重复部分合并188-305位残基。
通常,多肽和融合多肽(及其编码多核苷酸)是分离的。“分离的”多肽或多核苷酸是从其原始环境中移除的多肽或多核苷酸。例如,如果天然存在的蛋白与天然***中的部分或全部共存物质分离,则所述天然存在的蛋白是分离的。优选地,这些多肽为至少约90%纯的,更优选为至少约95%纯的以及最优选为至少约99%纯的。例如,如果多核苷酸被克隆到不是天然环境部分的载体中,则该多核苷酸被视为是分离的。
在某些实施方案中,本发明的融合多肽会包含至少一个来自K26、K39和K9中每一个的表位。通常可以通过以下确定表位:生成包含序列的部分或片段的多肽并使用例如酶联免疫吸附检测(ELISA)评价所述多肽与来自利什曼原虫属感染的个体的血清的反应性。适于评价多肽与利什曼原虫属感染的血清的反应性的检测在下文详细描述。在这些代表性的检测中,以基本相似于全长的方式产生区分阳性和阴性血清的信号的序列的部分被视为包含表位。换言之,包含表位的抗原的部分在基本上所有(即,至少约80%和优选地至少约90%)使用全长抗原会指示这类感染的生物样品中会产生指示利什曼原虫属感染的信号,并且在基本上所有使用全长多肽会是阴性的那些样品中会产生指示利什曼原虫属感染不存在的信号。
在相关方面,公开了包含多利什曼原虫属多肽表位的融合多肽。在某些具体实施方案中,不同利什曼原虫属多肽的表位、重复或其变体通过肽连接被连接到单一氨基酸链。可以直接连接所述表位(即没有中间氨基酸)或可以通过接头序列(例如,Gly-Cys-Gly)的方式连接所述表位,所述接头序列不会显著改变所述表位的抗原性质。在具体实施方案中,融合多肽来源于两个或更多个抗原/免疫原部分或片段。在另一方面,本发明的融合多肽可以包含两个或更多个如SEQ ID NOs:5-7和9-11所示的利什曼原虫属抗原片段。在相关方面,所述融合多肽包含如SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:8的10-262位氨基酸残基所示的氨基酸序列。
可以使用本领域技术人员熟知的技术产生本发明的融合多肽。可以使用例如Merrifield固相合成法合成具有少于约100个氨基酸并通常少于约50个氨基酸的本发明的多肽,其中氨基酸被按顺序添加到延长的氨基酸链(Merrifield,J.Am.Chem.Soc.85:2149-2146,1963)。用于多肽自动合成的设备可商购自诸如Applied Biosystems,Inc.,Foster City,Calif的供应商。因此,可以通过该方法合成例如利什曼原虫属K26、K39和K9抗原或其部分。
可选择地,可以通过在培养的宿主细胞中表达编码多肽的重组DNA制备本发明的多肽。优选地,所述宿主细胞是大肠杆菌、酵母、昆虫细胞系(例如灰翅夜蛾属(Spodoptera)或粉纹夜蛾属(Trichoplusia))或哺乳动物细胞系,所述哺乳动物细胞系包括(但不限于)CHO、COS、HEK-293T和NS-1。以该方式表达的DNA序列可以编码天然存在的蛋白和融合蛋白,所述融合蛋白包含诸如K26、K9和/或K39的利什曼原虫属抗原、其部分和这些蛋白的重复或其他变体。本发明的表达的融合多肽通常被分离为基本纯的形式。优选地,所述融合多肽被分离为以重量计至少80%的纯度,更优选地为以重量计至少95%的纯度并最优选地为以重量计至少99%的纯度。通常,可以使用诸如硫酸铵分级、SDS-PAGE电泳和亲和色谱的标准技术实现该纯化。
多核苷酸组合物
本发明还提供分离的多核苷酸,特别是编码本发明的融合多肽的那些核苷酸,以及包含这些多核苷酸的组合物。如本文所用的术语“DNA”和“多核苷酸”以及“核酸”是指从特定物种的总基因组DNA分离出的DNA分子。因此,编码多肽的DNA节段是指包含一个或多个编码序列同时从所述DNA节段所获自的物种的总基因组DNA基本分离出的或纯化出的DNA节段。术语“DNA节段”和“多核苷酸”中包括DNA节段和这些节段的较小的片段以及重组载体,所述重组载体包括,例如质粒、粘粒、噬粒、噬菌体、病毒等。
正如本领域技术人员会理解的,本发明的多核苷酸序列可以包括基因组序列,基因组外序列和质粒编码的序列和较小的改造的基因节段,所述基因节段表达或可以被适应表达蛋白、融合多肽、肽等。这些节段可以是天然分离的、重组的或通过人工合成修饰的。
正如本领域技术人员所公认的,多核苷酸可以是单链的(编码或反义)或双链的,并且可以是DNA(基因组、cDNA或合成的)或RNA分子。其他编码或非编码序列可以,但不需要,存在于本发明的多核苷酸内,并且多核苷酸可以,但不需要,与其他分子和/或支持物材料连接。
多核苷酸可以包含天然序列(即编码利什曼原虫属抗原或其部分的内源序列)或可以包含该序列的变体或生物学或抗原功能性等同物。在具体实施方案中,多核苷酸可以编码来源于利什曼原虫属K26、K39和/或K9抗原的两个或更多个抗原/免疫原部分、片段或变体。在某些实施方案中,编码本发明的融合多肽的多核苷酸可以编码两个或更多个如SEQ IDNOs:5-7和9-11所示的利什曼原虫属抗原片段。在相关方面,所述融合多肽由编码SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:8的10-262位氨基酸所示的氨基酸序列的多核苷酸所编码。
如下文进一步描述的,多核苷酸变体可以包含一个或多个取代、添加、缺失和/或***,优选地使得所编码的多肽的免疫原性相对于天然蛋白不减少。通常可以如本文所述评价对于所编码的多肽的免疫原性的影响。术语“变体”还包括异体来源的同源基因。
在其他的实施方案中,分离的融合多核苷酸会包含序列的不同长度的连续延伸,所述延伸与两个或更多个K26、K39和或K9,例如本文公开的那些序列,其部分或变体一致或互补。例如,本发明提供的多核苷酸包含两个或更多个本文所公开的序列的至少约15、20、30、40、50、75、100、150、200、300、400、500或1000或更多的连续核苷酸以及之间的所有中间长度。会容易理解到,在本文背景中,“中间长度”表示列举的值之间的任何长度,例如16、17、18、19等;21、22、23等;30、31、32等;50、51、52、53等;100、101、102、103等;150、151、152、153等;包括遍及200-500;500-1000的所有整数等。
本发明的融合多核苷酸或其片段,不考虑编码序列自身的长度,可以与诸如启动子、多腺苷酸化信号、另外的限制酶位点、多克隆位点、其他编码节段等的其他DNA序列组合,使得其总长度可以显著改变。因此,考虑到可以使用几乎任何长度的多核苷酸片段;优选地,由制备的方便和预期的重组DNA流程中的用途限制总长度。
此外,本领域技术人员会理解到,作为遗传密码的简并性的结果,存在很多编码如本文所述的多肽的核苷酸序列。部分的这些多核苷酸具有与任何天然基因的核苷酸序列的最小的同源性。虽然如此,本发明特别考虑到由于密码子使用中的差异而变化的多核苷酸,例如对于人和/或灵长类密码子选择进行优化的多核苷酸。此外,包含本文提供的多核苷酸序列的基因的等位基因在本发明的范围内。等位基因是作为一个或多个突变的结果而改变的内源基因,所述突变例如核苷酸的缺失、添加和/或取代。得到的mRNA和蛋白可以,但不需要,具有改变的结构或功能。可以使用标准技术(例如杂交、扩增和/或数据库序列比较)鉴定等位基因。
可以使用任何本领域内已知和可用的多种被认可的技术制备、操控和/或表达利什曼原虫属多核苷酸及其融合物。例如,编码本发明的多肽或其融合蛋白或功能等同物的多核苷酸序列或其片段可以被用于重组DNA分子中以在合适的宿主细胞中指导多肽的表达。由于遗传密码的固有简并性,可以产生编码基本相同的或功能上等同的氨基酸序列的其他DNA序列并且这些序列可以用于克隆和表达本发明的给定多肽。
正如本领域技术人员会理解的,在某些情况下,产生具有非天然存在密码子的编码融合多肽的核苷酸序列可以是有利的。例如,可以选择特定原核或真核宿主所优选的密码子以增加蛋白表达率或产生具有所需性质的重组RNA转录本,所述所需性质例如比从天然存在的序列生成的转录本更长的半衰期。
此外,可以使用本领域内公知的方法改造本发明的多核苷酸序列,目的是为了多种原因而改变融合多肽编码序列,所述原因包括但不限于,修饰基因产物的克隆、加工、表达和/或免疫原性的变化。
为了表达包含两个或更多个K26、K39和/或K9多肽的抗原/免疫原片段或部分的所需融合多肽,可以将编码所述融合多肽或功能等同物的核苷酸序列***合适的表达载体中,即包含所***的编码序列的转录和翻译必需的元件的载体。本领域技术人员熟知的方法可以用于构建包含编码目的多肽的序列和合适的转录和翻译控制元件的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、合成技术和体内遗传重组。这些技术描述于Sambrook et al.,Molecular Cloning,A Laboratory Manual(分子克隆:实验手册)(2001)和Ausubel et al.,Current Protocols in Molecular Biology(现代分子生物学实验方法)(2008年1月更新版)。
多种表达载体/宿主***是已知的并且可以用于容纳并表达多核苷酸序列。这些包括但不限于,诸如用重组噬菌体、质粒或粘粒DNA表达载体转化的细菌的微生物;用酵母表达载体转化的酵母;用病毒表达载体(例如杆状病毒)感染的昆虫细胞***;用病毒表达载体(例如,花椰菜花叶病毒,CaMV;烟草花叶病毒,TMV)或细菌表达载体(例如Ti或pBR322质粒)转化的植物细胞***;或动物细胞***。
表达载体中存在的“控制元件”或“调节序列”是载体的那些非翻译区(增强子、启动子、5′和3′非翻译区),其与宿主细胞蛋白相互作用以进行转录和翻译。这些元件在其强度和特异性中可以变化。根据所用的载体***和宿主,可以使用任意数量的适合的转录和翻译元件,包括组成型启动子和诱导型启动子。例如,当克隆入细菌***时,可以使用诱导型启动子,例如PBLUESCRIPT噬菌粒的杂交lacZ启动子(Stratagene,La Jolla,Calif.)或PSPORT1质粒(Gibco BRL,Gaithersburg,Md.)等。在哺乳动物细胞***中,来自哺乳动物基因或哺乳动物病毒的启动子通常是优选的。如果需要产生包含编码多肽的序列的多拷贝的细胞系,则基于SV40或EBV的载体可以有利地与合适的选择标记同时使用。
在细菌***中,可以根据表达的多肽所意图的用途选择许多表达载体。例如,当大量需要时,可以使用指导容易纯化的融合蛋白的高水平表达的载体。这类载体包括,但不限于,多功能大肠杆菌克隆和表达载体,例如PBLUESCRIPT(Stratagene),其中编码目的多肽的序列可以与氨基末端的Met和后续的β半乳糖苷酶的7个残基的序列在同一读框内连接到载体中,从而产生杂交蛋白;pIN载体(Van Heeke & Schuster,J.Biol.Chem.264:5503-5509(1989))等。pGEX载体(Promega,Madison,Wis.)也可以用于将外源多肽表达为具有谷胱甘肽S-转移酶(GST)的融合蛋白。通常,这类融合蛋白是可溶的并且可以通过吸附到谷胱甘肽-琼脂糖珠上、然后在游离谷胱甘肽的存在下洗脱从溶解的细胞容易地进行纯化。这类***中产生的蛋白可以设计为包含肝素、凝血酶或因子XA蛋白酶切割位点,使得克隆的目的多肽可以随意从GST部分释放。
在酵母中,在酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中,可以使用包含诸如α因子、醇氧化酶和PGH的组成型或诱导型启动子的许多载体。对于综述,参见Ausubel et al.(同上)和Grant et al.,Methods Enzymol.153:516-544(1987)。
在使用植物表达载体的情况下,许多启动子中的任何启动子可以驱动编码多肽的序列的表达。例如,诸如CaMV的35S和19S启动子的病毒启动子可以单独使用或与来自TMV的Ω前导序列联合使用(Takamatsu,EMBO J.6:307-311(1987))。可选择地,可以使用植物启动子,例如RUBISCO的或小亚基热休克启动子(Coruzzi et al.,EMBO J.3:1671-1680(1984);Broglie et al.,Science 224:838-843(1984)和Winter et al.,ResultsProbl.Cell Differ.17:85-105(1991))。可以通过直接DNA转化或病原体介导的转染将这些构建体引入植物细胞。这类技术描述于许多通常可获得的综述(参见,例如,Hobbs in McGraw Hill,Yearbook of Science andTechnology,pp.191-196(1992))。
昆虫***也可以用于表达目的多肽。例如,在一个这样的***中,苜蓿银纹夜蛾(Autographa californica)核型多角体病毒(AcNPV)被用作载体以在草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)细胞或粉纹夜蛾属幼虫中表达外源基因。可以将编码多肽的序列克隆到诸如多角体蛋白基因的病毒的非必需区中,并且置于多角体蛋白启动子的控制下。编码多肽的序列的成功***会使多角体蛋白基因失活并产生缺乏包被蛋白的重组病毒。然后,所述重组病毒可以被用于感染例如草地贪夜蛾细胞或粉纹夜蛾属幼虫,其中可以表达目的多肽(Engelhard et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.91:3224-3227(1994))。
在哺乳动物宿主细胞中,许多基于病毒的表达***通常是可用的。例如,在腺病毒被用作表达载体的情况下,可以将编码本发明的多肽的序列连接到由后期启动子和三联前导序列组成的腺病毒转录/翻译复合物中。病毒基因组的非必需E1或E3区中的***可以用于获得能够在感染的宿主细胞中表达多肽的有活力的病毒(Logan & Shenk,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.81:3655-3659(1984))。此外,诸如劳斯肉瘤病毒(RSV)增强子的转录增强子可以用于增加哺乳动物宿主细胞中的表达。
特异性起始信号也可以用于实现编码目的融合多肽的序列的更有效的翻译。这类信号包括ATG起始密码子和邻近序列。在编码多肽的序列、其起始密码子和上游序列被***到合适的表达载体中的情况下,可以不需要另外的转录或翻译控制信号。然而,在仅有编码序列或其部分被***的情况下,应当提供包括ATG起始密码子的外源翻译控制信号。此外,起始密码子应当在正确的读码框中以确保整个***物的翻译。外源翻译元件和起始密码子可以是多种来源的,天然的和合成的。可以通过包含适于所用的具体细胞***的增强子来增强表达的效率,例如文献中所述的那些增强子(Scharf.et al.,Results Probl.Cell Differ.20:125-162(1994))。
此外,可以根据宿主细胞株调节所***的序列表达的能力或以所需方式加工表达的融合蛋白的能力来选择宿主细胞株。多肽这些修饰的包括,但不限于,乙酰化、羧化、糖基化、磷酸化、脂质化和酰化。裂解“前…原(prepro)”形式蛋白的翻译后加工也可以用于促进正确的***、折叠和/或功能。可以选择诸如CHO、HeLa、MDCK、HEK293和W138的具有对于这些翻译后活性的特异细胞结构和特征机制的不同宿主细胞,以确保外源蛋白的正确的修饰和加工。
对于重组蛋白的长期高产量产生,稳定表达通常是优选的。例如,可以使用表达载体转化稳定表达本发明的融合多核苷酸的细胞系,所述表达载体可以包含病毒来源的复制和/或内源表达元件以及在相同的或分开的载体上的选择性标志物基因。引入载体后,在将细胞转到选择培养基之前,可以允许细胞在富集培养基中生长1-2天。选择性标志物的目的是赋予对于选择的抗性并且选择性标志物的存在允许成功表达所引入的序列的细胞的生长和恢复。可以使用适于所述细胞类型的组织培养技术增殖稳定转化的细胞的抗性克隆。
任意数目的选择***可以用于恢复转化的细胞系。这些***包括,但不限于,可以分别用于tk-或aprt-细胞中的单纯疱疹病毒胸苷激酶(Wigler et al.,Cell 11:223-232(1977))和腺嘌呤磷酸核糖转移酶(Lowy etal.,Cell 22:817-823(1990))基因。同样地,抗代谢抗性、抗生素抗性或除草剂抗性可以被用作选择的基础;例如,赋予对于甲氨蝶呤的抗性的dhfr(Wigler et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.77:3567-70(1980));赋予对于氨基葡糖苷、新霉素和G-418的抗性的npt(Colbere-Garapin et al.,J.Mol.Biol.150:1-14(1981));和分别赋予对于氯磺隆和草铵膦乙酰转移酶的抗性的als或pat(Murry,同上)。其他的选择基因已有描述,例如允许细胞利用吲哚来代替色氨酸的trpB或允许细胞利用组胺醇(histinol)来代替组氨酸的hisD(Hartman & Mulligan,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.85:8047-51(1988))。可视标志物的使用已获得普及,诸如花青素、β葡糖苷酸酶及其底物GUS和荧光素酶及其底物荧光素的标志物不仅广泛用于鉴定转化体,还用于定量归功于特定载体***的瞬时或稳定蛋白表达的量(Rhodeset al.,Methods Mol.Biol.55:121-131(1995))。
使用对于产物特异性的多克隆或单克隆抗体的、用于检测和测定多核苷酸编码产物的表达的多种流程是本领域已知的。实例包括酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫测定(RIA)和荧光活化细胞分选(FACS)。这些检测和其他检测描述于Hampton et al.,Serological Methods,aLaboratory Manual(血清学方法,实验手册)(1990)和Maddox et al.,J.Exp.Med.158:1211-1216(1983)等。
多种标记和结合技术已被本领域技术人员所知并且可以用于各种核酸和氨基酸检测。产生用于检测多核苷酸相关序列的标记杂交或PCR探针的手段包括寡标记(oligolabeling)、缺口转译、末端标记或使用标记的核苷酸的PCR扩增。可选择地,序列或其任何部分可以被克隆到载体中用于产生mRNA探针。这些载体是本领域已知的,是可商购的并且通过添加诸如T7、T3或SP6的合适的RNA聚合酶和标记的核苷酸可以用于体外合成RNA探针。可以使用多种可商购的试剂盒进行这些操作。可以使用的合适的报告分子或标记包括放射性核素、酶、荧光、化学发光或生色剂以及底物、辅助因子、抑制剂、磁性颗粒等。
可以在适于蛋白从细胞物表达和回收的条件下培养用目的多核苷酸序列转化的宿主细胞。根据使用的序列和/或载体,重组细胞产生的蛋白可以被分泌或细胞内包含。正如本领域技术人员会理解的,包含本发明的多核苷酸的表达载体可以被设计为包含信号序列,所述信号序列指导编码的多肽通过原核或真核细胞膜的分泌。其他重组构建体可以用于连接编码目的多肽的序列和编码会使可溶蛋白便于纯化的多肽结构域的核苷酸序列。
除重组产生方法外,可以通过使用固相技术(Merrifield,J.Am.Chem.Soc.85:2149-2154(1963))的直接肽合成产生本发明的融合多肽及其片段。可以使用手动技术或通过自动化进行蛋白合成。例如,可以使用AppliedBiosystems 431A肽合成器(Perkin Elmer)实现自动化的合成。可选择地,可以分别化学合成不同片段,例如两个或更多个来自利什曼原虫属K26、K39和/或K9抗原的抗原/免疫原片段,并且使用化学方法进行组合以产生全长分子。
诊断方法和试剂盒
在另一方面,本发明提供用于检测个体和血液供应中的利什曼病的化合物和方法。在具体实施方案中,所述个体是哺乳动物。在更具体的实施方案中,所述哺乳动物是人或犬。
在一方面,提供了检测生物样品中无症状或亚临床内脏利什曼病的方法,所述方法包括:(a)使生物样品与如本文所述的融合多肽接触,所述融合多肽例如包含至少两种异源利什曼原虫属抗原,其中所述利什曼原虫属抗原选自K39、K26和/或K9或其变体,所述变体仅具有保守型取代和/或修饰的不同;以及(b)检测所述生物样品中与所述融合多肽结合的抗体的存在,从而检测所述生物样品中的无症状或亚临床内脏利什曼原虫属感染。
在具体方面,本发明提供检测生物样品中无症状或亚临床内脏利什曼病的方法,所述方法包括:(a)使生物样品与如本文所述的融合多肽接触,所述融合多肽例如包含至少两种异源利什曼原虫属抗原,其中所述利什曼原虫属抗原选自SEQ ID NOs:5-7和9-11中任意的K39、K26和/或K9多肽序列,其任意组合或其变体,所述变体仅具有保守型取代和/或修饰的不同;以及(b)检测所述生物样品中与所述多肽结合的抗体的存在,从而检测所述生物样品中无症状或亚临床内脏利什曼原虫属感染。在相关实施方案中,利什曼原虫属抗原K26、K39和K9中的至少一个来自杜氏利什曼原虫种。
在某些方面,本发明提供检测生物样品中内脏利什曼原虫属感染的方法,所述方法包括:(a)使生物样品与如本文所述的融合多肽接触,所述融合多肽例如包含至少两种异源利什曼原虫属抗原,其中所述融合蛋白包含SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:8的10-262位氨基酸所示的氨基酸序列或其变体,所述变体仅具有保守型取代和/或修饰的不同;以及(b)检测所述生物样品中与所述多肽结合的抗体的存在,从而检测所述生物样品中的内脏利什曼原虫属感染。
在仍然另一相关方面,提供了鉴定受可能发展为急性内脏利什曼病的无症状或亚临床内脏利什曼病侵袭的患者的方法。在一个实施方案中,所述方法包括:(a)使获自受无症状或亚临床内脏利什曼病侵袭的患者的生物样品与如本文所述的融合多肽接触,所述融合多肽例如包含至少两种异源利什曼原虫属抗原,其中所述利什曼原虫属抗原选自K39、K26和/或K9或其变体,所述变体仅具有保守型取代和/或修饰的不同;(b)检测获自患者的生物样品中与步骤(a)中的融合多肽结合的抗体的存在,从而鉴定受可能发展为急性内脏利什曼病(VL)的无症状或亚临床内脏利什曼病侵袭的患者。
在相关方面中,提供了用于诊断利什曼病的诊断试剂盒。在一个实施方案中,例如,提供了用于检测生物样品中内脏利什曼病的试剂盒,其包含:(a)如本文所述的融合多肽,所述融合多肽例如包含至少两种异源利什曼原虫属抗原,其中所述利什曼原虫属抗原选自K39、K26和/或K9或其变体,所述变体仅具有保守型取代和/或修饰的不同;以及(b)检测所述生物样品中与所述多肽结合的抗体的存在,从而检测所述生物样品中的内脏利什曼病。
在仍然另一相关方面,提供了鉴定受可能发展为急性内脏利什曼病的无症状或亚临床内脏利什曼病侵袭的患者的方法。在一个实施方案中,所述方法包括:(a)使获自受无症状或亚临床内脏利什曼病侵袭的患者的生物样品与如本文所述的融合多肽接触,所述融合多肽例如包含至少两种异源利什曼原虫属抗原,其中所述利什曼原虫属抗原选自SEQ IDNOs:5-7和9-11中任意的K39、K26和/或K9多肽序列,其任意组合或其变体,所述变体仅具有保守型取代和/或修饰的不同;以及(b)检测获自患者的生物样品中与步骤(a)中的融合多肽结合的抗体的存在,从而鉴定受可能发展为急性内脏利什曼病(VL)的无症状或亚临床内脏利什曼病侵袭的患者。
在相关方面中,提供了用于诊断利什曼病的诊断试剂盒。在一个实施方案中,提供了用于检测生物样品中内脏利什曼病的试剂盒,其包含:(a)如本文所述的融合多肽,所述融合多肽例如包含至少两种异源利什曼原虫属抗原,其中所述利什曼原虫属抗原选自SEQ ID NOs:5-7和9-11中任意的K39、K26和/或K9多肽序列,其任意组合或其变体,所述变体仅具有保守型取代和/或修饰的不同;或其变体,所述变体仅具有保守型取代和/或修饰的不同;以及(b)检测所述生物样品中与所述多肽结合的抗体的存在,从而检测所述生物样品中的内脏利什曼病。
在仍然另一相关方面,提供了鉴定受可能发展为急性内脏利什曼病的无症状或亚临床内脏利什曼病侵袭的患者的方法。在一个实施方案中,所述方法包括:(a)使获自受无症状或亚临床内脏利什曼病侵袭的患者的生物样品与如本文所述的融合多肽接触,所述融合多肽例如包含至少两种异源利什曼原虫属抗原,其中所述融合蛋白包含SEQ ID NO:8或SEQID NO:8的10-262位氨基酸所示的氨基酸序列或其变体,所述变体仅具有保守型取代和/或修饰的不同;以及(b)检测所述生物样品中与所述多肽结合的抗体的存在,从而检测所述生物样品中的内脏利什曼病。
在相关方面中,提供了用于诊断利什曼病的诊断试剂盒。在一个实施方案中,提供了用于检测生物样品中内脏利什曼病的试剂盒,其包含:(a)如本文所述的融合多肽,所述融合多肽例如包含至少两种异源利什曼原虫属抗原,其中所述融合蛋白包含SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:8的10-262位氨基酸所示的氨基酸序列或其变体,所述变体仅具有保守型取代和/或修饰的不同;以及(b)检测所述生物样品中与所述多肽结合的抗体的存在,从而检测所述生物样品中的内脏利什曼病。
在本发明的另一方面,公开了在个体和血液供应中检测和监测利什曼原虫属感染以及辨别利什曼原虫属感染种类的方法。通常,可以在任何包含抗体的生物样品中检测到利什曼原虫属感染。优选地,所述样品为血液、血清、血浆、唾液,脑脊液、粪便或尿液。更优选地,所述样品为获自患者或血液供应的血液或血清样品。
在另一方面,可以使用包含两个或更多个多肽的融合多肽检测利什曼原虫属感染,所述多肽包含一个或多个上文所讨论的表位、重复或其变体。如果使用多个表位,这些表位可以存在于一个或多个利什曼原虫属抗原上。例如,在一方面,本发明的融合多肽包含两个或更多个K26、K29和/或K9抗原多肽。然后,将融合多肽用于相对于预定截断值确定样品中相同抗原多肽的抗体存在或不存在。
对于使用融合多肽检测样品中的抗体,存在多种本领域技术人员已知的检测形式。参见,例如,Harlow and Lane,Antibodies.A LaboratoryManual(抗体,实验手册),Cold Spring Harbor Laboratory Press,1988,通过引用将其并入本文。在优选的实施方案中,所述检测涉及使用固定在固体支持物上的融合多肽与抗体结合并且从样品中去除抗体。然后,可以使用与抗体/肽复合物结合并包含可检测的报告基团的检测试剂检测结合的抗体。合适的检测试剂包括与抗体/多肽复合物结合的抗体和用报告基团标记的游离多肽(例如,在半竞争性检测中)。合适的报告基团包括荧光标记、酶标记、放射性同位素、化学发光标记、电化学发光标记、生物发光标记、聚合物、聚合物颗粒、金属颗粒、半抗原和染料。可选择地,可以使用竞争性检测,其中用报告基团标记与本发明的融合多肽结合的抗体并且在融合多肽与样品孵育后,允许所述抗体与固定的融合多肽结合。样品的组分抑制标记的抗体与融合多肽结合的程度指示出所述样品与固定的融合多肽的反应性。
所述固体支持物可以是本领域技术人员已知的可以连接融合多肽的任何材料。例如,所述支持物可以是微量滴定板中的测试孔或硝化纤维或其他适合的膜。可选择地,所述支持物可以是珠或盘,例如玻璃、玻璃纤维、胶乳或诸如聚苯乙烯或聚氯乙烯的塑料材料。所述支持物也可以是磁性颗粒或纤维光学传感器,例如美国专利第5,359,681号中公开的那些。
可以使用本领域技术人员已知的多种技术将融合多肽与固体支持物结合,所述技术详细描述于专利和科学文献。在本发明的背景下,术语“结合”是指诸如吸附的非共价关联和共价连接(其可以是抗原和支持物上的功能性基团之间的直接连接或可以是通过交联剂形式的连接)。通过吸附与微量滴定板中的孔或膜结合是优选的。在这些情况下,通过将多肽在适合的缓冲液中与固体支持物接触适当量的时间可以实现吸附。接触时间根据温度而不同,但通常为约1小时至1天。通常,将塑料微量滴定板(例如聚苯乙烯或聚氯乙烯)的孔与一定量的融合多肽接触足以结合足够量的抗原,所述融合多肽范围为约10ng至约1μg并优选为约100ng。每cm3的硝化纤维会结合约100μg的蛋白。
通常可以通过首先将支持物与双功能试剂反应实现融合多肽与固体支持物的共价连接,所述双功能试剂与所述支持物和融合多肽上诸如羟基或氨基基团的功能性基团均反应。例如,可以将融合多肽与具有合适的聚合物包被的支持物结合,所述包被使用苯醌或通过支持物上的醛基基团与多肽上的胺和活性氢的缩合(参见,例如,Pierce ImmunotechnologyCatalog and Handbook(皮尔斯免疫技术目录和手册)(1991),位于A12-A13)。
在某些实施方案中,所述检测是酶联免疫吸附测定(ELISA)。可以通过以下进行该检测,首先将已经被固定在固体支持物上的本发明的融合多肽与样品接触,从而允许对于样品中融合多肽的利什曼原虫属抗原的抗体与固定的融合多肽结合,所述固体支持物通常为微量滴定板的孔。然后,从固定的融合多肽去除未结合的样品并添加能够与固定的抗体-多肽复合物结合的检测试剂。然后,使用适于特异性检测试剂的方法测定仍然与固体支持物结合的检测试剂的量。
一旦融合多肽被固定在支持物上,支持物上剩余的蛋白结合位点通常被封闭。可以使用本领域技术人员已知的任何适合的封闭剂,例如牛血清白蛋白(BSA)或Tween 20TM(Sigma Chemical Co.,St.Louis,Mo.)。然后,将固定的多肽与样品孵育,并且允许抗体(如果存在于样品中)与抗原结合。孵育前可以用适合的稀释剂稀释样品,所述稀释剂例如磷酸盐缓冲盐溶液(PBS)。通常,合适的接触时间(即孵育时间)为这样的时间段,其足以允许利什曼原虫属感染的样品中抗体存在的检测。优选地,所述接触时间足以达到结合的和未结合的抗体之间的平衡时达到的结合水平的至少95%的结合水平。本领域技术人员会认识到,通过检测在一段时间发生的结合的水平可以容易地确定实现平衡所必需的时间。在室温下,约30分钟的孵育时间通常是足够的。
然后,可以通过用合适的缓冲液洗涤固体支持物去除未结合的样品,所述缓冲液例如包含0.1%Tween 20TM的PBS。然后,可以将检测试剂添加到固体支持物。合适的检测试剂是与固定的抗体-多肽复合物结合的并且可以通过本领域技术人员已知的多种手段中的任何手段进行检测的任何化合物。优选地,所述检测试剂包含与报告基团结合的结合剂(例如,蛋白A、蛋白G、免疫球蛋白、凝集素或游离抗原)。优选的报告基团包括酶(例如辣根过氧化物酶)、底物、辅助因子、抑制剂、染料、放射性核素、发光基团、荧光基团和生物素。使用本领域技术人员已知的标准方法可以实现结合剂与报告基团的结合。也可以购买连接多种来源的多种报告基团的常见结合剂(例如,Zymed Laboratories,San Francisco,Calif.和Pierce,Rockford,Ill.)。
然后,将检测试剂与固定的抗体多肽复合物孵育一定量的时间,该时间足以检测结合的抗体。通常可以从生产商的使用说明或通过检测在一段时间发生的结合的水平确定合适量的时间。然后,去除未结合的检测试剂并且使用报告基团检测结合的检测试剂。用于检测报告基团的方法取决于报告基团的性质。对于放射性基团,闪烁计数或放射自显影法通常是合适的。光谱法可以用于检测染料、发光基团和荧光基团。可以使用与不同报告基团(通常为放射性或荧光基团或酶)偶联的抗生物素蛋白检测生物素。通常可以通过添加底物(通常持续特定的时间段)、随后通过反应产物的光谱或其他分析来检测酶报告基团。
为了确定样品中抗利什曼原虫属抗体存在或不存在,通常将从仍然与固体支持物结合的报告基团检测的信号与对应于预定截断值的信号进行比较。在一个优选实施方案中,截断值优选为固定的多肽与来自未感染的患者的样品孵育时获得的平均信号。通常,生成高于预定截断值三倍标准误差的信号的样品被视为阳性(即与多肽为反应性)。在可选的优选实施方案中,使用根据Sackett et al.,Clinical Epidemiology:A Basic Sciencefor Clinical Medicine(临床流行病学:临床医学的基础科学),p.106-7(Little Brown and Co.,1985)的方法的接受者工作曲线(Receiver OperatorCurve)确定截断值。简要而言,在该实施方案中,可以从对应于每个诊断测试结果的可能的截断值的真阳性率(即敏感性)和假阳性率(100%-特异性)对的曲线确定截断值。曲线上最接近于上方左手角落(即包围最大面积的值)的截断值是最准确的截断值并且产生高于通过该方法确定的截断值的信号的样品可以视为阳性。可选择地,截断值可以沿曲线左移以最小化假阳性率或右移以最小化假阴性率。
在相关实施方案中,以流动通过形式或试纸测试形式进行检测,其中抗原被固定在诸如硝化纤维的膜上。在流动通过测试中,当样品通过膜时,所述样品中的抗体与固定的多肽结合。然后,当包含检测试剂的溶液流动通过所述膜时,所述检测试剂(例如,蛋白A-胶体金)与抗体-多肽复合物结合。然后,可以如上文所述进行结合的检测试剂的测定。在试纸测试形式中,膜的一个末端被浸入包含样品的溶液中,多肽与所述末端结合。样品沿膜移行通过包含检测试剂的区域并到达固定的融合多肽的区域。融合多肽上检测试剂的浓度指示样品中利什曼原虫属抗体的存在。通常,该位点上的检测试剂的浓度产生可以可视地读取的图形,例如线形。不存在该图形指示阴性结果。通常,将固定在膜上的融合多肽的量选择为,当生物样品包含在如上文所讨论的ELISA中足以产生阳性信号的抗体水平时,产生视觉上可辨认的图形。优选地,固定在膜上的融合多肽的量范围为约25ng至约1μg并更优选地为约50ng至约500ng。通常可以使用非常少量(例如一滴)的患者血清或血液进行这些测试。
当然,存在很多适于使用本发明融合多肽的其他检测流程。以上描述仅意图为示例性的。
在本发明的一方面,上文讨论的检测可以用于特异性地检测内脏利什曼病。在该方面,使用包含两个或更多个利什曼原虫属K26、K39和/或K9抗原的抗原/免疫原片段或表位的氨基酸序列的融合多肽可以检测样品中的抗体。在另一方面,使用包含两个或更多个如SEQ ID NOs:5-7和9-11中任意所示的免疫原片段或表位的氨基酸序列的融合多肽可以检测样品中的抗体。在另一方面,使用包含SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:8的10-262位氨基酸所示的氨基酸序列的融合多肽可以检测样品中的抗体。优选地,粗略相似的量的利什曼原虫属抗原通过吸附固定于诸如如上文所述的微量滴定板的孔或膜的固体支持物,使得与支持物接触的融合多肽的总量范围为约10ng至约100μg。通常可以如上文所述进行该检测中剩余的步骤。对于本领域技术人员显而易见是,通过将本文所述的多肽与可以检测皮肤和粘膜利什曼病的其他多肽组合,本文公开的多肽可以用于检测所有类型的利什曼病的方法。
在本发明的另一方面,患有无症状或亚临床VL的、其疾病可能进展为急性内脏利什曼病的患者可以区别于感染的、其疾病不太可能进展的患者。对于亚临床疾病,该进展可以在1年(并通常在5-12个月内)内发生或对于无症状患者,在很多年内发生。使用数种方法中的任何方法可以进行该测定。在一个实施方案中,使用如本文所述的多肽进行检测,例如,所述多肽包含至少一个如SEQ ID NOs:6、10或11所示的K39抗原的重复单元。在相关实施方案中,所述多肽包含SEQ ID NOs:2、14或15中所示的多核苷酸序列编码的K39重复单元抗原。虽然K39重复单元抗原当与来自超过97%的患有急性内脏利什曼病的患者的血清反应时产生阳性结果(相对于预定截断值),但患有无症状利什曼病的患者与该抗原即使能反应也是非常弱地反应。微弱反应的那些血清可能指示处于向急性内脏利什曼病进展的过程中或可能进展为急性内脏利什曼病的感染(或者处于缓和或对治疗的反应中的感染,这可以根据患者病史区别)。
在另一实施方案中,使用本发明的融合多肽和包含至少一个K39抗原的重复单元的多肽分别进行检测,例如,所述融合多肽包含两个或更多个利什曼原虫属K26、K39和/或K9抗原的抗原/免疫原片段或表位的氨基酸序列,例如K28。在该实施方案中,将使用K28融合多肽的检测中获得的光学密度(OD)与使用K39多肽获得的值比较。当与使用K39多肽的检测中的OD相比时,使用K28融合多肽的检测中的显著更高的OD指示无症状或亚临床VL感染的更坚定、更可靠的检测。两个值都相对高的那些无症状或亚临床患者可能处于发展为急性内脏利什曼病(或者处于从感染恢复的进展中)的进展中。在另一方面,使用包含两个或更多个如SEQ ID NOs:5-7和9-11中任意所示的免疫原片段或表位的氨基酸序列的融合多肽和包含至少一个K39抗原的重复单元的多肽分别进行检测。在另一方面,使用包含SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:8的10-262位氨基酸中所示的氨基酸序列的融合多肽和包含至少一个K39抗原的重复单元的多肽分别进行检测。
在另一实施方案中,可以使用在一段时期进行的分别的融合多肽(例如K28)和K39多肽检测(如上文所述)鉴定可能发展为急性内脏利什曼病的无症状或亚临床患者。例如,对于数月或数年的时期,可以每1、2、3、4、5或6个月进行检测。如上文所讨论的,可能保持无症状或亚临床的无症状或亚临床患者通常会在每个时间点具有表现出与K28的高反应性和与K39多肽的低反应性的血清。然而,向急性内脏利什曼病进展的患者在检测的时期中会表现出与K28和K39多肽两者的反应性的升高。通过以该方式监测个体患者,在其它症状变得可见之前可以鉴定急性内脏利什曼病的发展。该早期鉴定允许仅对那些倾向于发展更严重形式的疾病的无症状患者的选择性治疗。
在本发明的另一方面,固定的融合多肽可以用于纯化与其结合的抗体。可以通过本领域技术人员已知的多种技术中的任何技术制备这些抗体。参见,例如,Harlow and Land,Antibodies.A Laboratory Manual(抗体-实验手册),Cold Spring Harbor Laboratory Press,1988。在一个这类技术中,将包含本发明的融合多肽的免疫原初始注射到多种哺乳动物中的任意动物(例如小鼠、大鼠、兔、绵羊和山羊)。在该步骤中,多肽可以作为免疫原而无需修饰。可选择地,特别是对于相对短的多肽,如果将多肽连接于诸如牛血清白蛋白或钥孔虫戚血兰素的载体蛋白,可以引发高免疫应答。优选地按照合并了一次或多次加强免疫的预定计划将免疫原注射入动物宿主并且周期性对动物取血。然后,可以通过例如使用与适合的固体支持物偶联的多肽的亲和色谱,从这些抗血清中纯化对于多肽特异性的多克隆抗体。
例如使用Kohler and Milstein,Eur.J.Immunol.6:511-519,1976的技术及其改进技术可以制备对于目的抗原融合多肽特异性的单克隆抗体。简言之,这些方法涉及制备能够产生具有所需特异性(即,与目的多肽的反应性)的抗体的永生化细胞系。例如可以从获自如上文所述免疫的动物的脾细胞产生这些细胞系。然后,例如通过与骨髓瘤细胞融合伴侣融合使脾细胞永生化,所述骨髓瘤细胞融合伴侣优选为与免疫的动物为同基因型。可以使用多种融合技术。例如,可以使用非离子去垢剂将脾细胞和骨髓瘤细胞结合数分钟并然后以低密度接种于支持杂交细胞生长的、不支持骨髓瘤细胞生长的选择性培养基。优选的选择技术使用HAT(次黄嘌呤、氨喋呤、胸苷)选择。足够的时间后,通常为约1-2周,观察到杂交的克隆。选择单克隆并测试针对多肽的结合活性。具有高反应性和特异性的杂交瘤是优选的。
单克隆抗体可以分离自生长的杂交瘤克隆的上清。在该过程中,可以使用各种技术增加产出,例如将杂交瘤细胞系注射入诸如小鼠的合适的脊椎动物宿主的腹腔。然后,可以从腹水或血液收获单克隆抗体。可以通过诸如色谱、凝胶过滤、沉淀和提取的常规技术从抗体中去除污染物。一种或多种多肽可以被用于纯化过程中,例如,在亲和色谱步骤中。
可以使用与包含两个或更多个利什曼原虫属K26、K39和/或K9抗原的免疫原部分的融合多肽结合的单特异性抗体,例如使用多种免疫检测之一来检测生物样品中的利什曼原虫属感染,所述免疫检测可以是直接的或竞争性的。简言之,在一个直接检测形式,可以将单特异性抗体固定于固体支持物(如上文所述)上并与待测试的样品接触。去除未结合的样品后,可以添加已用报告基团标记的第二单特异性抗体并用于检测结合的抗原。在示例性的竞争性检测中,样品可以与已用合适的报告基团标记的单克隆或多克隆抗体结合。然后,可以将样品和抗体的混合物与固定于合适的固体支持物上的多肽抗原结合。未与样品中的抗原结合的抗体被允许与固定的抗原结合并且去除样品和抗体的残余部分。与固体支持物结合的抗体的水平反向相关于样品中抗原的水平。因此,与固体支持物结合的抗体的较低水平指示样品中利什曼原虫属的存在。使用单特异性抗体检测样品中利什曼原虫属的其他形式对于本领域技术人员是显而易见的并且仅为了示例性的目的而提供以上形式。
药物组合物和疫苗组合物
在另一方面,本发明涉及药学可接受的或生理学可接受的溶液中的一个或多个本文公开的多核苷酸、融合多肽或其他组合物的制剂,所述制剂用于单独或与一种或多种其他治疗形式联合给予细胞或动物。当这些药物组合物与合适的免疫刺激剂/佐剂***一起配制时,所述药物组合物特别优选被用作疫苗。组合物也适合于用在诊断环境中。
还应当理解到,如果需要,本发明的组合物也可以与其他试剂联合给药,所述其他试剂例如其他蛋白或多肽或各种药学活性剂。如果另外的试剂对于本发明的目的不造成显著负面影响,则几乎不存在对于还可以包括在内的其他组分的限制。
在某些实施方案中,本发明的组合物被用作疫苗并且与一种或多种免疫刺激剂联合配制。免疫刺激剂可以是增强或强化对于外源抗原的免疫应答(抗体和/或细胞介导的)的任何物质。免疫刺激剂的实例包括佐剂、生物可降解的微球(例如polylactic galactide)和脂质体(化合物被合并入其中;参见,例如,Fullerton,美国专利第4,235,877号)。疫苗制剂通常描述于,例如,Powell & Newman,eds.,Vaccine Design(疫苗设计)(亚基和佐剂途径)(1995)。
多种免疫刺激剂中的任何种可以用于本发明的疫苗中。例如可以包括佐剂。很多佐剂包含诸如氢氧化铝或矿物油的设计用于保护抗原免于快速分解代谢的物质和诸如脂质A(天然的或合成的)、百日咳杆菌(Bortadella pertussis)或分歧杆菌(Mycobacterium)种或分歧杆菌来源的蛋白的免疫应答刺激剂。合适的佐剂是可商购的,例如,弗氏不完全佐剂和完全佐剂(Difco Laboratories,Detroit,Mich.);默克佐剂65(Merck andCompany,Inc.,Rahway,N.J.);AS-2及其衍生物(SmithKline Beecham,Philadelphia,Pa.);CWS、TDM、Leif、铝盐例如氢氧化铝凝胶(alum)或磷酸铝;钙盐、铁盐或锌盐;酰基化的酪氨酸的不溶悬液;酰基化的糖;阳离子或阴离子衍生的多糖;聚磷腈;生物可降解的微球;单磷酰脂质A和quil A。诸如GM-CSF或白介素2、白介素7或白介素12的细胞因子也可以被用作佐剂。
在本发明的背景中有用的其他示例性的佐剂包括Toll样受体激动剂,例如TLR7激动剂、TLR7/8激动剂等。仍然其他示例性的佐剂包括咪喹莫特(imiquimod),gardiquimod,瑞喹莫德(resiquimod)及相关化合物。
某些疫苗使用设计为主要诱导Th1型免疫应答的佐剂***。高水平的Th1型细胞因子(例如,IFN-γ、TNF-α、IL-2和IL-12)倾向于促进诱导对于给予的抗原的细胞介导的免疫应答。相比之下,高水平的Th2型细胞因子(例如,IL-4、IL-5、IL-6和IL-10)倾向于促进诱导体液免疫应答。施用如本文提供的疫苗后,患者会支持包括Th1型和Th2型应答的免疫应答。在一个实施方案中,其中应答主要为Th1型,Th1型细胞因子的水平会增加至高于Th2型细胞因子的水平的程度。使用标准测定可以容易地检测这些细胞因子的水平。对于细胞因子家族的综述,参见Mossman& Coffman,Ann.Rev.Immunol.7:145-173(1989)。
用于主要引起Th1型应答的某些佐剂包括,例如,单磷酰脂质A,优选为3-脱-O-酰基化单磷酰脂质A(3D-MPLTM)与铝盐(美国专利第4,436,727号、第4,877,611号、第4,866,034号和第4,912,094号)的组合。包含CpG的寡核苷酸(其中CpG二核苷酸是未甲基化的)也主要诱导Th1应答。这些寡核苷酸是公知的并描述于,例如,WO 96/02555、WO99/33488和美国专利第6,008,200号和第5,856,462号。免疫刺激DNA序列还描述于,例如,Sato et al.,Science 273:352(1996)。另一示例性的佐剂包含皂甙,例如Quil A或其包括QS21和QS7(Aquila BiopharmaceuticalsInc.,Framingham,Mass.)在内的衍生物、七叶皂苷、洋地黄皂甙或丝石竹属或藜属昆诺阿藜皂甙。其他示例性的制剂包含本发明的佐剂组合中的多于一种皂甙,例如QS21、QS7、Quil A、七叶皂苷或洋地黄皂甙中至少两种的组合。
在具体实施方案中,佐剂***包括单磷酰脂质A和皂甙衍生物的组合,例如如WO 94/00153所述的QS21和3D-MPLTM佐剂的组合,或如WO 96/33739所述的较低致反应发生的组合物,其中用胆固醇淬灭QS21。其他制剂包含水包油乳剂和生育酚。使用QS21、3D-MPLTM佐剂和水包油乳剂中的生育酚的另一佐剂制剂描述于WO 95/17210。
另一增强的佐剂***涉及WO 00/09159中公开的包含CpG-的寡核苷酸和皂甙衍生物的组合。
其他示例性的佐剂包括Montanide ISA 720(Seppic,France)、SAF(Chiron,Calif.,United States)、ISCOMS(CSL)、MF-59(Chiron)、SBAS系列佐剂(例如可获自SmithKline Beecham,Rixensart,Belgium的SBAS-2、AS2′、AS2″、SBAS-4或SBAS6)、Detox、RC-529(Corixa,Hamilton,Mont.)和其他氨烷基氨基葡萄糖苷4-磷酸盐(AGPs),例如审查中的美国专利申请系列第08/853,826号和第09/074,720号中描述的那些,以上申请的公开通过引用其全文并入本文,以及聚氧乙烯醚佐剂,例如WO 99/52549A1中描述的那些。
本发明的组合物也可以或可选择地包含对于遍及本文所述的利什曼原虫属融合多肽特异性的T细胞。通常可以使用标准操作体外或离体制备这些细胞。例如,T细胞可以分离自患者的骨髓、外周血液或骨髓或外周血液的组分。可选择地,T细胞可以来源于相关的或不相关的人、非人哺乳动物、细胞系或培养物。
可以使用包含两个或更多个利什曼原虫属K26、K39和/或K9抗原的免疫原部分的融合多肽、编码该融合多肽的多核苷酸和/或表达该融合多肽的抗原呈递细胞(APC)刺激T细胞。在足以允许对于所述融合多肽特异性的T细胞产生的条件和时间下进行该刺激。优选地,所述融合多肽或多核苷酸存在于诸如微球的递送媒介中,以促进特异性T细胞的产生。
如果T细胞特异性地增殖、分泌细胞因子或杀伤被所述多肽包被的靶细胞或表达编码所述多肽的基因的靶细胞,则认为T细胞对于本发明的融合多肽是特异性的。可以使用多种标准技术中的任何技术评价T细胞特异性。例如,在铬释放检测或增殖检测中,与阴性对照相比,溶解和/或增殖中增加大于2倍的刺激指数指示T细胞特异性。例如可以按照Chen et al.,Cancer Res.54:1065-1070(1994)中所述的进行这些检测。可选择地,可以通过多种已知技术实现T细胞增殖检测。例如,可以通过测定增加的DNA合成速率(例如,用氚标记的胸苷通过脉冲标记T细胞的培养物并测定合并入DNA的氚标记的胸苷的量)检测T细胞增殖。与本发明的多肽(100ng/ml-100μg/ml,优选为200ng/ml-25μg/ml)接触3-7天应当导致T细胞增殖的至少2倍的增加。按照使用标准细胞因子检测所测定的,如上文所述接触2-3小时应当导致T细胞的活化,其中细胞因子释放(例如TNFα或IFN-γ)水平的2倍增加指示T细胞活化(参见Coliganet al.,Current Protocols in Immunology,vol.1(1998))。应答于融合多肽、多核苷酸或表达融合多肽的APC而活化的T细胞可以是CD4+和/或CD8+。可以使用标准技术扩增蛋白特异性T细胞。在优选的实施方案中,T细胞来源于患者、相关供体或不相关供体,并且在刺激和扩增后被给予患者。
在本发明的药物组合物中,药学可接受的赋形剂和载体溶液的制剂对于本领域技术人员是公知的,同样是公知的还有用于在多种治疗方案中使用本文所述的具体组合物的合适的配量和治疗方案的开发,包括例如,口服给药、肠胃外给药、静脉内给药、鼻内给药和肌肉内给药以及制剂。
在某些应用中,可以通过口服给药将本文公开的药物组合物递送至个体。如此,这些组合物可以与惰性稀释剂或可同化的可食用的载体一起配制,或它们可以被封装在硬壳或软壳明胶胶囊中,或它们可以被压制为片剂,或它们可以直接与饮食中的食物合并。
在某些情况下,例如如美国专利第5,543,158号、美国专利第5,641,515号和美国专利第5,399,363号(通过引用每个专利将其全文特别并入本文)中所述,肠胃外、静脉内、肌肉内或甚至腹膜内递送本文公开的药物组合物是可取的。可以在水中与诸如羟丙纤维素的表面活性剂适当混合制备作为游离碱或药学可接受的盐的活性化合物溶液。也可以在甘油,液态聚乙二醇及其混合物以及油中制备分散液。在保存和使用的通常条件下,这些制剂包含防腐剂以防止微生物生长。
适合于注射使用的药物形式包括无菌水性溶液或分散液和用于无菌可注射溶液或分散液的即用制备的无菌粉末(美国专利第5,466,468号,通过引用将其全文特别并入本文)。在所有情况下,所述形式必须是无菌的并且必须是流动性达到具有容易的可注射性的程度。所述形式在生产和保存条件下必须是稳定的并且针对诸如细菌和真菌的微生物的污染作用进行保护。载体可以是包含诸如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液态聚乙二醇等)、其合适的混合物和/或植物油的溶剂或分散介质。例如通过使用诸如卵磷脂的包被、在分散液的情况下通过保持所需颗粒大小和通过使用表面活性剂,可以保持适当的流动性。各种抗细菌和抗真菌剂可以促进微生物作用的预防,所述抗细菌和抗真菌剂例如对羟苯甲酸酯、三氯叔丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等。在很多情况下,优选包括等渗剂,例如糖或氯化钠。通过在组合物中使用诸如单硬脂酸铝和明胶的延迟吸收的试剂可以实现可注射组合物的延长的吸收。
对于水性溶液中的肠胃外给药,例如,如果需要,所述溶液应当适当缓冲并且应当首先用足够的盐溶液或葡萄糖使液体稀释剂等渗。这些特定的水性溶液特别适合于静脉内给药、肌肉内给药、皮下给药和腹膜内给药。关于这点,根据本公开,可以使用的无菌水性介质会是本领域技术人员已知的。例如,一次的剂量可以溶解于1ml等渗NaCl溶液中并将其添加到1000ml皮下输注液中或在打算输注的部位进行注射(参见,例如,Remington′s Pharmaceutical Sciences(雷明顿药物科学),第15版,第1035-1038页和第1570-1580页)。根据所治疗的个体的状况必然会发生剂量的某些变化。负责给药的人员在任何情况下都应当确定对于单独个体的合适剂量。此外,对于人的给药,制剂应当满足如FDA生物制品部标准所规定的无菌性、致热原性和普遍的安全性和纯度标准。
通过以下制备无菌可注射溶液:将所需量的活性化合物合并入具有上文列举的各种其他成分的合适的溶剂,如果需要,然后过滤灭菌。通常,通过将各种无菌活性成分合并入无菌媒介制备分散液,所述无菌媒介包含基本分散介质和来自上文列举的那些成分的所需其他成分。对于用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末,优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥技术,所述技术从活性成分和任何其他所需成分的预先过滤灭菌的溶液产生它们的粉末。
本文公开的组合物可以配制为中性形式或盐形式。药学可接受的盐包括酸加成盐(与蛋白的游离氨基基团形成的)并且所述酸加成盐是与诸如盐酸或磷酸的无机酸或诸如乙酸、草酸、酒石酸、扁桃酸等的有机酸形成的。与游离羧基基团形成的盐也可以来源于诸如氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、氢氧化钙或氢氧化三铁的无机碱和诸如异丙胺、三甲胺、组氨酸,普鲁卡因等的有机碱。通过配制,可以以与剂型相容的方式和治疗有效的量给予溶液。以诸如可注射溶液、药物释放胶囊等的多种剂型容易地给予制剂。
如本文所用的“载体”包括任何和所有溶剂、分散介质、媒介、包被、稀释剂、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂、缓冲液、载体溶液、悬液、胶体等。用于药物活性物质的这些介质和试剂的使用是本领域公知的。除非任何常规介质或试剂与活性成分不相容,否则考虑其在治疗组合物中的使用。也可以将补充活性成分并入组合物。
短语“药学可接受的”是指当给予人时,不产生变应性或相似不良反应的分子实体和组合物。包含作为活性成分的蛋白的水性组合物的制剂是本领域熟知的。通常,将这样的组合物制备为液体溶液或悬液的可注射剂;也可以制备适合于在注射前溶解于液体中或悬浮于液体中的固体形式。也可以将制剂乳化。
在某些实施方案中,可以通过鼻内喷雾、吸入和/或其他气溶胶递送媒介递送药物组合物。通过鼻腔气溶胶喷雾将基因、多核苷酸和肽组合物直接递送至肺的方法已有描述,例如,美国专利第5,756,353号和美国专利第5,804,212号(通过引用将每个专利的全文特别并入本文)。同样,使用鼻内微粒树脂(Takenaga et al.,1998)和溶血磷脂酰甘油化合物(美国专利第5,725,871号,通过引用将其全文特别并入本文)的药物递送也是药学领域公知的。同样,以聚四氟乙烯支持物基质的形式的跨粘膜药物递送描述于美国专利第5,780,045号(通过引用将其全文特别并入本文)。
在某些实施方案中,可以通过使用脂质体、纳米胶囊、微粒、微球、脂质颗粒、囊泡等用于将本发明的组合物引入到合适的宿主细胞而发生递送。特别是,可以将本发明的组合物配制为用于封装在脂质颗粒、、脂质体、囊泡、纳米球、纳米颗粒等中的递送。可以使用已知和常规技术进行这些递送媒介的配制和使用。
在本发明的另一方面,提供了用于在哺乳动物中,优选在人或犬中预防利什曼原虫属感染及其并发症的疫苗和药物组合物。药物组合物通常包含一个或多个如本文所述的融合多肽和生理学可接受的载体。疫苗包含一个或多个上述融合多肽和用于增强免疫应答的佐剂。
给药途径和频率以及融合多肽剂量在个体之间会不同并且可以对比当前在对抗其他原生动物感染的免疫接种中正使用的那些。通常,可以通过注射(例如肌肉内、静脉内或皮下)、鼻内(例如通过抽吸)或口服给予药物组合物和疫苗。在2-6周的时间可以给予1-4个剂量。优选地,给予2个剂量,第二剂量比第一剂量晚2-4周。合适的剂量是能在处理的哺乳动物中有效产生足以保护哺乳动物在一段时间免受利什曼原虫属感染的抗体的融合多肽的量。通常,剂量中存在的融合多肽的量范围从约1pg-约100mg每公斤宿主,通常约10pg-约1mg并且优选为约100pg-约1μg。合适的剂量大小根据动物的大小会不同,但对于10-60kg动物通常为约0.01mL-约5mL。
尽管任何本领域技术人员已知的合适的载体可以用于本发明的药物组合物,载体的类型根据给药模式会不同。对于诸如皮下注射的肠胃外给药,载体优选包括水、盐溶液、醇、脂肪、蜡或缓冲液。对于口服给药,可以使用任何以上载体或固体载体,例如甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、滑石粉、纤维素、葡萄糖、蔗糖和碳酸镁。也可以使用生物可降解的微球(例如,polylactic galactide)作为本发明的药物组合物的载体。
可以在本发明的疫苗中使用多种佐剂中的任何佐剂以非特异性地增强免疫应答。大部分佐剂包含诸如氢氧化铝或矿物油的设计用于保护抗原免于快速分解代谢的物质和非特异性免疫应答的刺激剂,例如脂质A、百日咳杆菌或结核分歧杆菌(Mycobacterium tuberculosis)。这些佐剂是可商购的,例如,弗氏不完全佐剂和完全佐剂(Difco Laboratories,Detroit,Mich.)和默克佐剂65(Merck and Company,Inc.,Rahway,N.J.)。
上文所述的多种实施方案可以进行组合以提供其他实施方案。本说明书中引用的和/或申请数据表中列出的所有美国专利、美国专利申请公布、美国专利申请、外国专利、外国专利申请和非专利出版物通过引用整体并入本文。如果必须使用多个专利、申请和出版物的构想,可以改动实施方案的各方面以提供其他实施方案。
实施例
实施例1
利什曼原虫属融合多肽的克隆和表达
本发明涉及称为K28的合成基因构建体,其包含来源于3个杜氏利什曼原虫基因的序列。所述合成基因包含K26和K39基因的部分DNA序列和K9基因的完整DNA序列。此外,所述合成基因包含9个氨基酸的N末端基序,其包括6个组氨酸(例如,6×HIS表位标签)。将所述合成DNA构建体克隆至质粒pCRX2.1的NdeI/XhoI位点以表达该基因的融合蛋白。所述合成基因包含3个SEQ ID NO:1编码的K26的14个氨基酸的重复、2个SEQ ID NO:2编码的K39的39个氨基酸的重复和SEQ IDNO:3编码的K9基因的完整开放读码框。该融合构建体设计用于提高一个分子中的每个这些单一蛋白的诊断可能性并且提供较宽的覆盖范围、增加的敏感性以及由于制备单一蛋白而不是所有三种蛋白而降低的费用。
实施例2
使用K28多肽检测人中无症状和亚临床内脏利什曼原虫属感染
该实施例表明在ELISA方法中,使用按照实施例1中所述制备的本发明的融合多肽,人中利什曼原虫属感染的增加的检测敏感性。
按照以下进行ELISA检测。将三组Polysorp 96孔板(Nunc,Rochester,NY)中的每组用2μg/ml碳酸氢盐缓冲液中的不同重组抗原在4℃包被过夜,并且在平板振荡器上用具有1%(w/v)BSA的PBST室温封闭2小时。将血清在具有0.1%BSA的PBST中1/200适度稀释,添加到每个孔并且将板在振荡下室温孵育2小时。用具有0.1%BSA的PBST洗涤板并然后将以1∶10000稀释在PBST和0.1%BSA中的HRP结合的IgG免疫球蛋白(Sigma,St.Louis,MO)添加到每个孔并且在振荡下室温孵育60分钟。洗涤后,用过氧化氢酶有色底物(KPL,Baltimore MD)使板显影,10分钟后通过添加1N H2SO4终止反应。使用VERSAmax微板读取器(MolecularDevices,Sunnyvale,CA)读取每个孔在450-570nm下校正的光学密度。通过计算酶结合物阴性对照的平均值加三倍的标准误差(EC)确定对于每个测试的截断值。
鉴定患有内脏利什曼病(VL)的委内瑞拉个体是基于血清学(例如,IFAT或IHA免疫荧光或血细胞凝集)、临床症状(例如,不适、腹泻、脾肿大和肝肿大)和全溶解物ELISA。在来自患有VL的患者的52个血清样品中,使用以上检测94%测试为阳性。然而,在单独使用K39抗原的弱或临界检测样品中的33%中,K28抗原测试显示出显著较高的OD。此外,使用K28抗原检测可靠地检测出使用K39检测初始表征为阴性3个样品。
图2中描述这些结果,该结果显示用K26、K28和K39检测的52个VL血清样品在450-570nm下吸收值的分布。这些结果表明,使用K28提供超过单独使用K39的检测无症状或亚临床内脏利什曼病的增加的敏感性。
实施例3
使用K28多肽检测犬中无症状和亚临床内脏利什曼原虫属感染
该实施例表明在ELISA方法中,使用按照实施例1中所述制备的本发明的融合多肽,犬中利什曼原虫属感染的增加的检测敏感性。
除使用4种不同的重组抗外,如实施例2中所述进行该ELISA检测。将4组Polysorp 96孔板各自用2μg/ml的K9、K26、K28或K39重组抗原包被。鉴定患有内脏利什曼病(VL)的委内瑞拉犬是基于血清学(例如,IFAT或IHA免疫荧光或血细胞凝集)、临床症状(例如,不适、腹泻、脾肿大和肝肿大)和全溶解物ELISA。
图3所示的结果证实,K28比其他三个单独使用的抗原中的任何一个鉴定出显著更高的病例数。这表明使用K28提供了犬中检测无症状或亚临床利什曼病的增加的敏感性,并且此外,K28提供了超过单独使用K9,K26和K39抗原的增加的检测敏感性。
实施例4
在双重途径快速测试方法使用K28多肽或K39多肽检测人中内脏利什曼原虫属感染与直接凝集检测的比较
该实施例表明,与使用来自苏丹的血清的直接凝集检测(DAT)相比,在双重途径快速测试方法中,使用按照实施例1中所述制备的本发明的融合多肽(K28)对单一抗原(K39),人中利什曼原虫属感染的增加的检测敏感性。
基本上按照美国专利第7,189,522号中所述进行双重途径快速测试,将该专利通过引用整体并入本文。简而言之,将K28或K39包被在硝化纤维条上。将一滴适度稀释的人血清添加到包含浸透抗原的硝化纤维的测试盒中的样品孔。然后,将2滴样品缓冲液添加到样品孔并允许样品通过毛细作用迁移,直至测试盒的检测窗中的线消失。然后,将2滴缓冲液添加到测试盒中的检测试剂孔以恢复固定的检测试剂(胶体金结合的葡萄球菌蛋白A)。
检测试剂通过毛细流动迁移至检测窗。如果样品包含针对测试抗原的抗体,则它们与检测窗中固定的抗原结合,从而通过检测试剂的结合将它们可视化为两条粉色线。单一粉色线表明样品中没有抗体并且检测试剂与检测窗中固定的对照免疫球蛋白(Ig)结合。没有任何粉色线指示错误测试。
基本按照Sundar和Rai在Clin Diag Lab Immunol 9:951-958,2002中所述进行DAT测试。
该分析结果表明K28比单独K39鉴定显著更高的人VL病例数。更具体而言,当在双重途径快速测试方法中使用时,K28与K39单独(61/69样品,88.4%)相比,提供了人中检测内脏利什曼病的增加的敏感性(66/69样品,95.6%)。此外,通过K28快速测试准确鉴定出具有非常低DAT滴度(<3200)的4个患者样品,而通过K39快速测试仅准确鉴定出4个中的2个。
根据以上详细描述,可以对实施方案进行这些改变和其他改变。通常,在下文权利要求中,使用的术语不应解释为将权利要求限制到本说明书和权利要求中公开的具体实施方案,而应解释为包括所有可能的实施方案以及这些权利要求有权要求的等同物的全部范围。因此,公开内容不限制权利要求。
可以将上文描述的各种实施方案进行组合以提供其他实施方案。本说明书中引用的和/或申请数据表中列出的所有美国专利、美国专利申请公布、美国专利申请、外国专利、外国专利申请和非专利出版物通过引用整体并入本文。如果必须使用多种专利、申请和出版物的构想,可以改动实施方案的各方面以提供其他实施方案。
Claims (22)
1.分离的融合多肽,其由SEQ ID NO:5所示的利什曼原虫属(Leishmania)K26序列、SEQ ID NO:6所示的利什曼原虫属K39序列和SEQ ID NO:7所示的利什曼原虫属K9序列组成。
2.分离的融合多肽,其由SEQ ID NO:8的10-262位所示的氨基酸序列组成。
3.分离的融合多肽,其由SEQ ID NO:8的10-262位所示的氨基酸序列和MHHHHHHTS(SEQ ID NO:21)的N末端氨基酸序列组成。
4.分离的融合多肽,其由SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列组成。
5.如权利要求1-4中任一项所述的融合多肽,其中所述融合多肽与固体支持物结合。
6.如权利要求5所述的融合多肽,其中所述固体支持物包括硝化纤维、胶乳或塑料材料。
7.分离的多核苷酸,其编码权利要求1-4中任一项所述的融合多肽。
8.分离的抗体或抗原结合片段,其特异性地结合权利要求1-4中任一项所述的融合多肽。
9.药物组合物,其包含:
(a)权利要求1-4中任一项所述的融合多肽,或
(b)权利要求8所述的分离的抗体或抗原结合片段,或
(c)权利要求7所述的多核苷酸;和
生理学可接受的载体。
10.疫苗,其包含:
(a)权利要求1-4中任一项所述的融合多肽,或
(b)权利要求8所述的分离的抗体或抗原结合片段,或
(c)权利要求7所述的多核苷酸;和
非特异性免疫应答增强剂。
11.用于检测生物样品中无症状或亚临床内脏利什曼病的诊断试剂盒,所述生物样品选自血清、血液和唾液,所述试剂盒包含:
(a)权利要求1-4中任一项所述的融合多肽;和
(b)检测试剂。
12.如权利要求11所述的试剂盒,其中所述检测试剂包含与结合剂结合的报告基团。
13.如权利要求12所述的试剂盒,其中所述结合剂选自抗免疫球蛋白、蛋白G、蛋白A和凝集素。
14.如权利要求12所述的试剂盒,其中所述报告基团选自放射性同位素、荧光基团、发光基团、酶、生物素和染料颗粒。
15.如权利要求11所述的试剂盒,其中所述融合多肽与固体支持物结合。
16.如权利要求15所述的试剂盒,其中所述固体支持物包括硝化纤维、胶乳或塑料材料。
17.用于鉴定受可能发展为急性内脏利什曼病的无症状或亚临床内脏利什曼病侵袭的患者的诊断试剂盒,其包含:
(a)第一多肽,所述第一多肽是权利要求1-4中任一项所述的融合多肽;
(b)第二多肽,其包含如SEQ ID NO:10或11所示的氨基酸序列;和
(c)检测试剂。
18.如权利要求17所述的试剂盒,其中所述检测试剂包含与结合剂结合的报告基团。
19.如权利要求18所述的试剂盒,其中所述结合剂选自抗免疫球蛋白、蛋白G、蛋白A和凝集素。
20.如权利要求18所述的试剂盒,其中所述报告基团选自放射性同位素、荧光基团、发光基团、酶、生物素和染料颗粒。
21.如权利要求17所述的试剂盒,其中所述第一和第二多肽各自与分别的固体支持物结合。
22.如权利要求21所述的试剂盒,其中所述固体支持物包括硝化纤维、胶乳或塑料材料。
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