JP7369347B2 - インスリン産生細胞の製造方法 - Google Patents
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Description
この出願は、2018年11月14日に日本国特許庁に出願された日本国出願番号第2018-213448号の利益を主張するものである。当該日本国出願は、その出願書類(明細書、特許請求の範囲、図面、要約書)の全体が本明細書に明示されているかのように全ての目的で参照により本明細書に援用される。
本発明は、人為的な遺伝子導入を行うことなく、低分子化合物の組み合わせにより体細胞からインスリン産生細胞を効率的に直接分化誘導する方法、即ち、一定の低分子化合物により体細胞からインスリン産生細胞を直接製造することができる新たな製造方法を提供することを主な課題とする。
[1]体細胞から直接分化誘導することによりインスリン産生細胞を製造する方法であって、RSK阻害剤の存在下で体細胞を培養する工程を含むことを特徴とする、インスリン産生細胞の製造方法。
[2]前記工程が、さらにGSK3阻害剤の存在下で体細胞を培養する工程である、上記[1]に記載のインスリン産生細胞の製造方法。
[3]前記工程が、さらにcAMP誘導剤及び/又はPI3K阻害剤の存在下で体細胞を培養する工程である、上記[1]又は[2]に記載のインスリン産生細胞の製造方法。
[4]RSK阻害剤がBRD7389又はBI-D1870である、上記[1]~[3]のいずれか一項に記載のインスリン産生細胞の製造方法。
[5]GSK3阻害剤がCHIR99021である、上記[2]~[4]のいずれか一項に記載のインスリン産生細胞の製造方法。
[6]cAMP誘導剤がフォルスコリン、又はPI3K阻害剤がLY294002である、上記[3]~[5]のいずれか一項に記載のインスリン産生細胞の製造方法。
[7]前記体細胞が線維芽細胞又は間葉系幹細胞である、上記[1]~[6]のいずれか一項に記載のインスリン産生細胞の製造方法。
[8]上記[1]~[7]のいずれか一項に記載のインスリン産生細胞の製造方法から製造される、インスリン産生細胞。
[10]さらにGSK3阻害剤を含む、上記[9]に記載の組成物。
[11]さらにcAMP誘導剤及び/又はPI3K阻害剤を含む、上記[9]又は[10]に記載の組成物。
[12]RSK阻害剤がBRD7389又はBI-D1870である、上記[9]~[11]のいずれか一項に記載の組成物。
[13]GSK3阻害剤がCHIR99021である、上記[10]~[12]のいずれか一項に記載の組成物。
[14]cAMP誘導剤がフォルスコリン、又はPI3K阻害剤がLY294002である、上記[11]~[13]のいずれか一項に記載の組成物。
[15]前記体細胞が線維芽細胞又は間葉系幹細胞である、上記[9]~[14]のいずれか一項に記載の組成物。
本発明に係る、インスリン産生細胞の製造方法(以下、「本発明製法」という。)は、体細胞から直接分化誘導することによりインスリン産生細胞を製造する方法であって、RSK阻害剤の存在下で体細胞を培養する工程を含むことを特徴とする。
上記阻害剤や誘導剤は、それぞれにおいて、1種を用いても2種以上を併用してもよい。
具体的な上記阻害剤等においては、2種類以上の阻害作用等を有するものもあり得るが、その場合、一つで複数の阻害剤等が存在しているとみなすことができる。
生物の細胞は、体細胞と生殖細胞とに分類できる。本発明製法には、その出発材料として任意の体細胞を使用することができる。体細胞には特に限定はなく、生体から採取された初代細胞、又は株化された細胞の何れでもよい。本発明製法では、分化の種々の段階にある体細胞、例えば、最終分化した体細胞(例、線維芽細胞、臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)、肝細胞(Hepatocytes)、胆管細胞(Biliary cells)、膵α細胞(Pancreatic α cells)、膵腺房細胞(Acinar cells)、膵管腺細胞(Ductal cells)、小腸腺窩細胞(Intestinal crypt cells)など)、最終分化への途上にある体細胞(例、間葉系幹細胞、神経幹細胞、内胚葉前駆細胞など)、又は初期化され多能性を獲得した体細胞を使用することができる。本発明製法に使用できる体細胞としては、任意の体細胞、例えば、造血系の細胞(各種のリンパ球、マクロファージ、樹状細胞、骨髄細胞等)、臓器由来の細胞(肝細胞、脾細胞、膵細胞、腎細胞、肺細胞等)、筋組織系の細胞(骨格筋細胞、平滑筋細胞、筋芽細胞、心筋細胞等)、線維芽細胞、神経細胞、骨芽細胞、軟骨細胞、内皮細胞、間質細胞、脂肪細胞(白色脂肪細胞等)、胚性幹細胞(ES細胞)等が挙げられる。また、これらの細胞の前駆細胞、癌細胞にも本発明製法を適用できる。好ましくは、線維芽細胞又は間葉系幹細胞を使用することができる。
1.2.1 RSK阻害剤
RSK(Ribosomal S6 Protein Kinase)は、広く細胞に発現しており、様々な成長因子に応答するセリン・スレオニンキナーゼの一つである。分子量が70kDaと90kDaのサブファミリーに分かれており、特に90kDaのRSKサブファミリーは、MAPKシグナル伝達経路に属するERKによってリン酸化されることで活性化し、哺乳類では4つの遺伝子が存在している。活性化した90kDaのRSKは、Ribosomal protein S6を含む下流の様々なタンパク質のリン酸化を行い、細胞の生存、細胞増殖、分化などを多様に制御している。
BI-D1870(CAS No.:501437-28-1)
LJH685(CAS No.:1627710-50-2)
LJI308(CAS No.:1627709-94-7)
FMK(CAS No.:821794-92-7)
RMM46(CAS No.:1307896-46-3)
CMK(CAS No.:821794-90-5)
Carnosol(CAS No.:5957-80-2)
Bix 02565(CAS No.:1311367-27-7)
GSK3(glycogen synthase kinase-3、グリコーゲン合成酵素キナーゼ3)は、グリコーゲン合成酵素をリン酸化して不活性化するプロテインキナーゼとして見いだされた。哺乳類では、GSK3は51kDaのα(GSK3α)と47kDaのβ(GSK3β)の二つのアイソフォームに分類される。GSK3は種々のタンパク質をリン酸化する活性を有しており、グリコーゲン代謝のみならず、細胞***、細胞増殖等の生理現象にも関わっている。
Kenpaullone(CAS No.:142273-20-9)
A1070722(CAS No.:1384424-80-9)
SB216763(CAS No.:280744-09-4)
CHIR98014(CAS No.:556813-39-9)
TWS119(CAS No.:601514-19-6)
Tideglusib(CAS No.:865854-05-3)
SB415286(CAS No.:264218-23-7)
Bikinin(CAS No.:188011-69-0)
IM-12(CAS No.:1129669-05-1)
1-Azakenpaullone(CAS No.:676596-65-9)
LY2090314(CAS No.:603288-22-8)
AZD1080(CAS No.:612487-72-6)
AZD2858(CAS No.:486424-20-8)
AR-A014418(CAS No.:487021-52-3)
TDZD-8(CAS No.:327036-89-5)
Indirubin(CAS No.:479-41-4)
cAMP(環状アデノシン1リン酸)は、セカンドメッセンジャーとして種々の細胞内シグナル伝達に関わっている物質である。cAMPは、細胞内ではアデニル酸シクラーゼ(adenylate cyclase)によりアデノシン3リン酸(ATP)が環状化されることで生成する。
NKH477(CAS No.:138605-00-2)
PACAP1-27(CAS No.:127317-03-7)
PACAP1-38(CAS No.:137061-48-4)
PI3K(Phosphoinositide 3-kinase)は、イノシトールリン脂質をリン酸化する酵素であり、産生されるホスホイノシチドはPDK1を活性化する。PDK1はさらにAKTをリン酸化し、PDK1/AKTシグナル経路が活性化される。LY294002は、PI3Kに選択的な阻害剤であり、ホスホイノシチドの産生を抑えることでPDK1/AKTシグナル経路の活性化を阻害する。
TGR-1202(CAS No.:1532533-67-7)
PI-103(CAS No.:371935-74-9)
IC-87114(CAS No.:371242-69-2)
Wortmannin(CAS No.:19545-26-7)
ZSTK474(CAS No.:475110-96-4)
AS-605240(CAS No.:648450-29-7)
PIK-90(CAS No.:677338-12-4)
AZD6482(CAS No.:1173900-33-8)
Duvelisib(CAS No.:1201438-56-3)
TG100-115(CAS No.:677297-51-7)
CH5132799(CAS No.:1007207-67-1)
CAY10505(CAS No.:1218777-13-9)
PIK-293(CAS No.:900185-01-5)
CZC24832(CAS No.:1159824-67-5)
Pilaralisib(CAS No.:934526-89-3)
AZD8835(CAS No.:1620576-64-8)
本発明製法における体細胞の培養は、使用する体細胞の種類に応じた培地、温度、その他の条件を選択し、上記の各種の阻害剤(及び、場合により誘導剤ないし活性化剤)の存在下において実施することができる。
本発明製法においては、上記した各種の阻害剤等を含む誘導用培地において体細胞を培養することにより、一段階の培養によって体細胞からインスリン産生細胞を製造することができる。
また、使用する体細胞として培養が容易なものを選択することにより、あらかじめ細胞数を増加させほぼコンフルエントの状態に達した体細胞をインスリン産生細胞に転換することも可能である。従って、スケールアップしたインスリン産生細胞の製造も容易である。
本発明製法の一態様において、分化誘導用培地にインスリンを多く含有して体細胞を培養することが好ましいが、その量としては、例えば5μg/mL以上を挙げることができ、好ましくは20μg/mL以上ないし25μg/mL以上であり、より好ましくは80~120μg/mLの範囲内である。
基礎となる公知の又は市販の誘導用培地に予め一定のインスリンが含まれている場合には、インスリンが上記の量含有されるようインスリンを添加して調整することができる。
上記した本発明製法により、インスリン産生細胞を含有する細胞集団を得ることができる。本発明製法により製造されるインスリン産生細胞も本発明の範囲内である。本発明製法で製造されるインスリン産生細胞は、最終分化した細胞の他、インスリン産生細胞に分化することが運命づけられた前駆細胞でもよい。
本発明製法により製造されるインスリン産生細胞は、低分子化合物により体細胞から直接誘導される、いわゆる低分子化合物誘導性インスリン産生細胞(ciIPCs)であって、遺伝子導入により分化誘導されるものとは区別される。
本発明製法で製造されるインスリン産生細胞は、さらに、インスリン産生細胞の機能発揮や生着性向上に有効な他の細胞や成分と組み合わせた組成物とすることもできる。
本発明に係る組成物(以下、「本発明組成物」という。)は、体細胞から直接分化誘導することによりインスリン産生細胞を製造するための組成物であって、RSK阻害剤を含むことを特徴とする。
本発明組成物においては、少なくとも上記阻害剤等を含んでいればよく、必要に応じて、任意にさらに他の阻害剤や誘導剤等を含むことができる。
上記阻害剤や誘導剤等は、それぞれにおいて、1種を用いても2種以上を併用してもよい。
具体的な上記阻害剤等においては、2種類以上の阻害作用等を有するものもあり得るが、その場合、一つで複数の阻害剤等を含んでいるとみなすことができる。
上記した阻害剤や誘導剤等の具体例や好ましい例などは、前記と同義である。
本発明組成物に係る培地の一態様において、インスリンを多く含有することが好ましいが、その量としては、例えば5μg/mL以上を挙げることができ、好ましくは20μg/mL以上ないし25μg/mL以上であり、より好ましくは80~120μg/mLの範囲内である。
基礎となる公知の又は市販の誘導用培地に予め一定のインスリンが含まれている場合には、インスリンが上記の量含有されるようインスリンを添加して本発明組成物を作製することができる。
~ヒト線維芽細胞からインスリン産生細胞への直接誘導~
(1)ヒト線維芽細胞
材料としたヒト線維芽細胞はDSファーマバイオメディカル株式会社から購入した。38才のヒト皮膚に由来する線維芽細胞である。
ヒト線維芽細胞を、ゼラチン(Cat#:190-15805,和光純薬工業社製)でコーティングされた35mmディッシュに5×104個ずつ播種し、10%ウシ胎児血清(Fetal bovine serum;FBS)、100U/mLペニシリン、100μg/mLストレプトマイシンを添加したDMEM培地(Gibco社製)で、37℃、5%CO2条件下でコンフルエントになるまで培養した。なおDMEMは、ダルベッコ改変イーグル培地(Dulbecco’s Modified Eagle Medium)を示す。
・分化誘導用培地:10%ウシ胎児血清(FBS、Hyclone社製)を添加又は添加せずに、ITS-X(Cat#:51500056、Gibco社製)、非必須アミノ酸(NEAA:Non-essential amino acids;Cat#:11140050、Gibco社製)、Glutamine(Gibco社製;終濃度2mmol/L)、ニコチンアミド(Cat#:72340-100G、Sigma-Aldrich社製;終濃度10mmol/L)、Exendin-4(Cat#:av120214、Abcam社製;終濃度100ng/mL)、100U/mLペニシリン、100μg/mLストレプトマイシン、インスリン(Cat#:093-06351;Wako社製)、及び下記の低分子化合物を添加したAdvanced DMEM/F-12(Cat#:12634010;Gibco社製)。
その後、3日毎に同組成の培地へ培地交換を行いながら、37℃、5% CO2条件下で培養した。
3μM CHIR99021(Cat#:13122,Cayman Chemical)
7.5μM フォルスコリン(Cat#:063-02193,Wako)
1.5μM BRD7389(Cat#:ab146161,Abcam)
5μM LY294002(Cat#:70920,Cayman Chemical)
上記(2)に従って14日間培養した結果を図1~4に示す。
図中、「4C」は上記4つの低分子化合物を意味し、「3C」は上記4つの低分子化合物の中、CHIR99021、BRD7389、及びフォルスコリンの3種を意味する。「+FBS」は培地中にFBSを存在させたことを示し、「-FBS」は培地中にFBSを存在させなかったことを示す。「+LY294002(20μM)」は培地中にLY294002を終濃度20μMで存在させたことを示し、「-LY294002」は培地中にLY294002を存在させなかったことを示す(即ち、「4C-LY294002」は3Cと同義)。また、「No Compound」は上記4つの低分子化合物を培地中に存在させなかったことを示す。従って、例えば「No Compound-FBS」は、4Cを存在させず、かつFBSも存在さなかった場合の実験結果を、「4C-FBS-LY294002」は、4Cの中、LY294002を存在させず、かつFBSも存在させなかった場合の実験結果を、それぞれ表す。
なお、分化誘導用培地にウシ胎児血清(FBS)を含まない方が、ヒト線維芽細胞から分泌能の高いインスリン産生細胞が得られた。
~ヒト間葉系幹細胞からインスリン産生細胞への直接誘導~
(1)ヒト間葉系幹細胞
脂肪組織から単離されたヒト間葉系幹細胞はタカラバイオ株式会社から購入した。
ヒト間葉系幹細胞を、ゼラチン(Cat#:190-15805,和光純薬工業社製)でコーティングされた35mmディッシュに5×104個ずつ播種し、100U/mLペニシリン、100μg/mLストレプトマイシンを添加したMesenchymal Stem Cell Growth Medium 2(Cat#:C-28009;タカラバイオ社製)で、37℃、5%CO2条件下でほぼコンフルエントになるまで培養した。
・分化誘導用培地:10%ウシ胎児血清(FBS、Hyclone社製)を添加又は添加せずに、ITS-X(Cat#:51500056、Gibco社製)、非必須アミノ酸(NEAA:Non-essential amino acids;Cat#:11140050、Gibco社製)、Glutamine(Gibco社製;終濃度2mmol/L)、ニコチンアミド(Cat#:72340-100G、Sigma-Aldrich社製;終濃度5mmol/L)、Exendin-4(Cat#:av120214、Abcam社製;終濃度50ng/mL)、100U/mLペニシリン、100μg/mLストレプトマイシン、及び下記の低分子化合物を添加したAdvanced DMEM/F12(Cat#:12634010;Gibco社製)。
なお、誘導用培地にインスリンを120μg/mL含む実験においては、インスリンが120μg/mL含まれるようヒト組換え体インスリン(Cat#:093-06351; Wako)を添加し調整した。
0.5μM CHIR99021(Cat#:13122,Cayman Chemical)
3.75μM フォルスコリン(Cat#:063-02193,Wako)
0.2μM BRD7389(Cat#:ab146161,Abcam)
2.5μM LY294002(Cat#:70920,Cayman Chemical)
上記(2)に従って14日間培養した結果を図5及び図6に示す。
図中、「4C」は上記4つの低分子化合物を意味する。「+FBS」は培地中にFBSを存在させたことを示し、「-FBS」は培地中にFBSを存在させなかったことを示す。「-LY294002」は培地中にLY294002を存在させなかったことを示す(即ち、「4C-LY294002」は3Cと同義)。また、「No compound」は上記4つの低分子化合物を培地中に存在させなかったことを示す。従って、例えば「No Compound-FBS」は、4Cを存在させず、かつFBSも存在させなかった場合の実験結果を、「4C-FBS-LY294002」は、4Cの中、LY294002を存在させず、かつFBSも存在させなかった場合の実験結果を、それぞれ表す。
また、分化誘導用培地にウシ胎児血清(FBS)を含まない方がヒト間葉系幹細胞から分泌能の高いインスリン産生細胞を直接誘導することができた。更に、高濃度(120μg/mL)のインスリンを分化誘導用培地に含有して誘導すると、インスリン分泌量が顕著に増加し、より分泌能の高いインスリン産生細胞がヒト間葉系幹細胞から直接効率的に誘導された。
Claims (12)
- 線維芽細胞から直接分化誘導することによりインスリン産生細胞を製造する方法であって、(1)RSK阻害剤としてのBRD7389又はBI-D1870、及び(2)GSK3阻害剤の存在下で、出発材料としての線維芽細胞を培養する工程を含むことを特徴とする、インスリン産生細胞の製造方法。
- 前記工程が、さらにcAMP誘導剤及び/又はPI3K阻害剤の存在下で体細胞を培養する工程である、請求項1に記載のインスリン産生細胞の製造方法。
- RSK阻害剤がBI-D1870である、請求項1又は2に記載のインスリン産生細胞の製造方法。
- GSK3阻害剤がCHIR99021である、請求項1~3のいずれか一項に記載のインスリン産生細胞の製造方法。
- cAMP誘導剤がフォルスコリン、又はPI3K阻害剤がLY294002である、請求項2に記載のインスリン産生細胞の製造方法。
- 前記線維芽細胞がヒト線維芽細胞又は皮膚線維芽細胞である、請求項1~5のいずれか一項に記載のインスリン産生細胞の製造方法。
- 線維芽細胞から直接分化誘導することによりインスリン産生細胞を製造するための組成物であって、(1)RSK阻害剤としてのBRD7389又はBI-D1870、及び(2)GSK3阻害剤を含むことを特徴とする、線維芽細胞からインスリン産生細胞を製造するための組成物。
- さらにcAMP誘導剤及び/又はPI3K阻害剤を含む、請求項7に記載の組成物。
- RSK阻害剤がBI-D1870である、請求項7又は8に記載の組成物。
- GSK3阻害剤がCHIR99021である、請求項7~9のいずれか一項に記載の組成物。
- cAMP誘導剤がフォルスコリン、又はPI3K阻害剤がLY294002である、請求項8に記載の組成物。
- 前記線維芽細胞がヒト線維芽細胞又は皮膚線維芽細胞である、請求項7~11のいずれか一項に記載の組成物。
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