KR101438802B1 - 스노우플레이크 및 히아신스 혼합추출물을 함유하는 화장료 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 스노우플레이크 및 히아신스 혼합추출물을 함유하는 화장료조성물에 관한 것으로서, 구체적으로는 스노우플레이크 및 히아신스 혼합추출물을 유효성분으로 함유하여 항산화활성, 항염활성, 미백활성 및 피부주름개선활성을 나타내는 화장료조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따르면, 스노우플레이크 및 히아신스 혼합추출물을 화장료조성물 전체중량에 대하여 0.001%~10중량% 함유하는 화장료조성물이 제공된다.

Description

스노우플레이크 및 히아신스 혼합추출물을 함유하는 화장료 조성물{Cosmetic composition containing snowflake extract and hyacinth extract}

본 발명은 스노우플레이크 및 히아신스 혼합추출물을 함유하는 화장료조성물에 관한 것으로서, 구체적으로는 스노우플레이크 및 히아신스 혼합추출물을 유효성분으로 함유하여 항산화, 항염, 미백 및 피부주름개선 활성을 나타내는 화장료 조성물에 관한 것이다.

염증반응은 체내에 기질적 변화를 가져오는 화학적 물질, 세균 감염 및 물리적 작용에 의해 발생된 손상 부위를 재생하려는 기전이다. 유해한 자극, 감염 및 외상 등에 의한 염증이 발현되면 국소적으로 염증성 성분과 같은 혈관 활성 물질이 유리되어 염증을 유발하는데, 이와 같은 염증반응이 지속되면 오히려 점막손상을 촉진함에 따라 발적, 발열, 종창, 동통, 기능장애 등의 여러 질환을 발생시키는 원인이 된다. 대식세포는 선천면역뿐만 아니라 획득면역 등 다양한 숙주반응에 대하여 항상성 유지에 관여하며, 염증 반응 시에는 nitric oxide(NO) 및 다양한 싸이토카인을 생산하여 감염 초기에 생체방어에 중요한 역할을 하는 세포이다. RAW 264.7과 같은 대식세포 또는 단핵구는 그람 음성균의 세포외막에 존재하는 내독소인 lipopolysaccharide(LPS)의 자극에 의해 tumor necrosis factor-α(TNF- α), interleukin-1β(IL-1β) 및 IL-6와 같은 염증매개성 cytokine들의 분비를 촉진한다. 이러한 염증 매개 물질들의 형성은 arachidonic acid가 cyclooxygenase(COX)의 작용을 거쳐 leukotriene, thromboxane, prostaglandin 등으로 바뀌는 과정 및 NO의 대량 생성에 관여함으로써 염증매개에 큰 역할을 하며, 숙주에 치명적 결과를 초래한다고 알려져 있다.

멜라닌은 세포 내의 소기관인 리보솜(ribosome)에서 타이로시네이즈라는 효소의 생합성에서 합성되기 시작한다. 이 효소의 작용으로 아미노산의 일종인 티로신(tyrosine)에서 몇 단계를 거쳐 합성되어, 멜라노사이트라는 흑색소포 표면에 침착하여 멜라노솜(melanosome)이라는 멜라닌 과립이 생긴다. 완성된 멜라닌 과립의 형태나 크기, 멜라닌의 침착 정도는 유전적인 지배를 받아 동물의 종류나 장기에 따라서 달라진다. 물 및 대부분의 유기용매에 녹지 않으며, 화학적으로는 극히 비활성이다. 피부에 자외선을 조사하면 타서 갈색이 되는데, 이것은 멜라닌이 생성되어 과잉광선을 흡수하여 생체를 보호하기 위한 것으로 추측된다.

현재까지 개발된 대부분의 미백제는 하이드로퀴논(hydroquinone)이나 코직애시드(kojic acid)와 같은 타이로시네이즈의 저해제이다. 현재 화장품에 많이 사용되고 있는 미백 화장품 원료인 알부틴은 타이로시네이즈의 기질로서 작용하며, 또 다른 미백제인 코직애시드는 타이로시네이즈의 활성자리에 있는 구리를 킬레이트화함으로써 타이로시네이즈 활성을 저해한다. 그 외에도 미백 작용이 우수한 천연물로 글라브리딘, 엘라직산, 카지놀 F 등이 알려져 있다. 천연물 유래의 성분과 관련된 최근 미백제 연구로는 DL-alphatocopheryl ferulate, 안정형 비타민 C 유도체들, ellagic acid, alpha-hydroxy acids(AHAs) 등이 있다. 미백 효과가 있는 기능성원료로 많이 이용되고 있는 것으로는 비타민 C, 상지(뽕나무의 어린 가지)에서 추출한 미백물질, 대나무 속살 추출물, 고농축 박 추출물, Mitracarpe라는 식물에서 추출한 미백물질인 etiolin 등의 식물추출물이 주를 이루고 있으며, 기저세포에서 생성되는 티로신을 멜라닌으로 변환하는 촉매역할을 하는 효소인 타이로시네이즈를 불활성화 함으로써 색소 침착을 억제하고 세포분열을 촉진시켜 잔류하고 있는 색소를 기저세포와 함께 이동을 원활하게 한다. 이처럼 미백 효과를 나타내는 천연물에 대한 많은 연구가 진행되고 있다.

주름이 형성되는 원인은 자연적 노화에 의한 주름의 생성과 자외선 노출(광노화)에 의한 주름의 생성으로 크게 나눌 수 있는데, 두 가지 원인에 의한 주름 형성 메커니즘은 아직까지 정확하게 밝혀져 있지 않은 상태이다. 자연적 노화와 광노화에 의한 피부변화와 관련되어 발견되는 공통적인 현상은 진피 내의 주 구성단백질인 콜라겐 및 엘라스틴의 감소 및 변형, 진피의 기질인 히아루론산의 감소에 의한 피부 탄력 감소이다. 특히 지금까지의 연구결과에 의하면 진피 내 주 단백질인 콜라겐 및 엘라스틴의 감소 및 변형이 주름의 생성 및 피부의 탄력저하에 직접적으로 관여하는 것으로 알려져 있다.

콜라겐은 피부의 섬유아세포에서 생성되는 주요 기질 단백질로서 세포외 간질에 존재하고, 중요한 기능으로는 피부의 기계적 견고성, 결합조직의 저항력과 조직의 결합력, 세포 접착의 지탱, 세포분할과 분화(유기체의 성장 혹은 상처 치유시)의 유도 등이 알려져 있다. 이러한 콜라겐은 연령 및 자외선 조사에 의한 광노화에 의해 감소하며, 이는 피부의 주름 형성과 밀접한 연관이 있다고 알려져 있다. 또한 근래에 들어 피부 노화에 대한 광범위한 연구 결과가 보고되면서 피부에서의 콜라겐의 중요한 기능이 밝혀지고 있다. 콜라겐 합성을 촉진하여 주름개선효과를 나타내는 유효성분들이 알려져 있다. 예를 들어, 레티노산(retinoic acid), TGF(Transforming growth factor), 동물 태반 유래의 단백질, 베툴린산(betulinic acid), 클로렐라 추출물 등이 콜라겐 합성 촉진 물질로서 알려져 있다.

자유 라디칼들은 피부 콜라겐 등의 결합 조직 형성 파괴, 세포막 기능 저해, DNA 변이 촉진, 단백질 작용 변형, 세포 간 에너지 전이, 신진 대사와 관련된 분자들의 변형 등을 유발하는 것으로 알려져 있다(Lavker RM 및 Kligman AM, J. Invest. Dermatol., 1988, 90, 325). 노화에 자유 라디칼이 관여한다는 사실은 자유 라디칼을 불활성화시키는 항산화제 또는 여러 가지 화학적 소거제들을 사용하여 노화 과정을 지연시킬 수 있다는 것을 의미한다.

한편, 정상적인 세포에서도 대사과정 중 어느 정도의 자유 라디칼 (free radical)과 기타 활성산소 및 과산화물이 생성되고 있으나, 생체 내에는 이들에 대한 방어기구로서 슈퍼옥사이드디스뮤타제(SOD), 카탈라아제(catalase), 퍼록시다제(peroxidase) 등의 항산화성 효소와 함께, 비타민 C, 비타민 E, 글루타치온(glutathione), 유비퀴논(ubiquinone), 요산(uric acid) 등의 항산화 물질이 존재하여 스스로를 보호하고 있다. 그러나, 이와 같은 생체방어기구에 이상이 초래되거나 각종 물리적, 화학적 요인들에 의하여 활성산소의 생성이 생체방어계의 용량을 초과하게 될 경우, 산화적 스트레스(oxidative stress)가 야기된다. 그러므로 활성산소를 억제하는 것은 피부노화 화장료에 중요한 요소이다.

종래 천연물을 소재로 하며, 항염활성, 항산화활성 또는 미백활성을 가지는 다양한 화장료들이 개발되어왔다. 대한민국 공개특허 제2010-0031068호 "피부 보습 및 피부 진정용 허브 화장료 조성물 및 그 제조방법"에는 '보리지 추출물, 수레국화 추출물, 라벤더 추출물, 캐모마일 추출물, 클라리세이지 추출물 및 히야신스 추출물을 포함하는 피부 보습 및 피부 진정용 화장료 조성물'이 개시되어 있으며, 대한민국 공개특허 제2011-0124916호 "생약식물 복합추출액을 함유하는 아토피 피부개선용 화장료조성물"에는 '인체에 안전한 천연 생약재인 마카, 타마린드, 연자육, 아마씨, 참다래로부터 얻은 예비 생약식물 복합추출물에 아마씨 오일 추출액을 혼합한 생약식물 복합추출액을 배합한 것으로써, 항균 및 보습효과, 피부막 보호 효과뿐 아니라 면역세포 생육활성 증진 효과 및 피부 1차 자극 후 홍반완화 효과가 우수한 생약식물 복합추출액을 함유하는 아토피 피부 개선용 화장료 조성물'이 개시되어 있다.

본 발명자들은 다양한 천연물에 대하여 연구하던 중 스노우플레이크와 히아신스의 혼합추출물이 그 상승작용에 의하여 우수한 항염효과 등의 피부보호 효과를 나타내는 것을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 천연 소재 원료인 스노우플레이크 및 히아신스 혼합추출물을 유효성분으로 함유하여, 항염활성, 미백활성 및 주름개선활성을 가지는 화장료조성물을 제공하는 것을 그 목적으로 한다.

본 발명에 따르면, 스노우플레이크 및 히아신스 혼합추출물을 화장료조성물 전체중량에 대하여 0.001%~10중량% 함유하는 화장료조성물이 제공된다.

상기 혼합추출물은 스노우플레이크 및 히아신스 추출물이 1~3:3~1의 중량비율로 혼합된 것이다.

상기 혼합추출물은 물, 탄소수 1 내지 4의 무수 또는 함수알코올, 에틸아세테이트, 아세톤, 글리세린, 에틸렌글리콜, 프로필렌글리콜 및 부틸렌글리콜로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 용매로 추출한 추출물이다.

상기 화장료조성물은 항염, 항산화, 미백 또는 주름개선용 화장료로 사용될 수 있다.

스노우플레이크 및 히아신스 혼합추출물을 포함하는 상기 화장료조성물은 화장수, 영양로션, 영양크림, 마사지크림, 영양세럼, 에센스, 팩, 유화형 화운데이션, 고체형 화운데이션 또는 자외선 차단 크림의 제형으로 제조된다.

본 발명의 스노우플레이크 및 히아신스 추출물을 함유하는 화장료 조성물은 항염 효과가 가장 우수하며, 항산화, 미백 및 주름개선 효과를 나타낸다.

본 발명은 스노우플레이크 및 히아신스 혼합추출물을 함유하는 화장료조성물에 관한 것이다.

스노우플레이크(Leucojum aestivum L.)는 외떡잎식물 백합목 수선화과의 스노플레이크속 식물로 서머 스노플레이크(Summer Snowflake)라고도 불린다. 높이 30∼50㎝정도 자라며 인경은 직경이 2.5∼4㎝ 크기의 난형이다. 잎은 길이가 30∼45㎝, 폭 1.5㎝ 정도이며 녹색이다. 꽃대는 양편에 능선이 있으며 꽃대 속은 비어 있다. 꽃은 종 모양으로 은방울꽃같이 아래로 숙여 핀다. 꽃잎 길이는 12∼20㎜, 폭은 6∼8㎜의 넓은 타원형으로 꽃은 흰색이고 꽃잎 끝에는 녹색의 점무늬가 있다. 원산지는 중부 유럽과 지중해 지방이며 약 9종이 난다.

히아신스(Hyacinthus orientalis L.)는 발칸반도 및 터키 원산이며 가을에 심는 화초이다. 알뿌리는 비늘줄기로 달걀 모양이고 길이 3cm 정도이며 겉은 흑갈색이다. 잎은 뿌리에서 4~5개가 착생하여 비스듬히 벌어지고, 선형이며 길이 15~30cm로 안쪽으로 굽어 든다. 이른 봄 잎 사이에서 꽃줄기가 자라서 잎보다 약간 길어지며, 윗부분에 꽃이 총상으로 달린다. 꽃은 총상꽃차례로 옆을 향해 달리며 깔때기 모양이며 지름 2~3cm로서 청자색이지만 여러 가지 빛깔이 있다. 화피의 윗부분은 6개로 갈라지고 갈래조각은 육질(肉質)이며 수평으로 벌어진다. 수술은 6개로서 화관통부 위쪽에 붙지만 밖으로 나타나지는 않는다. 열매는 삭과(殼果)로 달걀 모양의 원형이고 종자는 겉에 잔 돌기가 있다.

본 발명에 있어서 스노우플레이크 및 히아신스는 정제수로 깨끗이 세척하여 사용하며, 추출 방법에 따라 건조시켜 세절하거나 가루로 만들어 사용하는 것이 바람직하다. 본 발명에 있어서 스노우플레이크 및 히아신스 추출물은 스노우플레이크 및 히아신스의 줄기, 꽃 또는 지상부, 바람직하게는 줄기를 추출한 추출물이다. 본 발명에 있어서, 스노우플레이크 및 히아신스 혼합추출물은 각각의 추출물의 혼합이거나, 스노우플레이크 및 히아신스 혼합물에 대한 추출물일 수 있다.

추출용매로는 물, 탄소수 1 내지 4의 무수 또는 함수알코올, 에틸아세테이트, 아세톤, 글리세린, 에틸렌글리콜, 프로필렌글리콜, 부틸렌글리콜 및 이들의 혼합용매(예를들어, 함수알코올, 함수글리세린 등 2개의 용매혼합 또는 2개 이상의 용매혼합)중에서 선택된 용매로 추출하여 제조되며, 물, 및 탄소수 1 내지 4의 무수 또는 함수알코올로 이루어지는 군으로부터 선택된 적어도 하나의 용매로 추출되는 것이 바람직하다. 탄소수 1 내지 4의 알코올로는 메탄올, 에탄올, n-프로판올, iso-프로판올, n-부탄올, tert-부탄올 등을 들 수 있다. 이들 추출용매 중 함수 에탄올이 가장 바람직하며, 함유된 물의 양은 30 내지 90(wt/wt)% 이내가 바람직하며, 70(wt/wt)%가 보다 더 바람직하다.

본 발명의 스노우플레이크 및 히아신스 추출물은 통상의 기술자에게 알려진 공지의 추출법에 의해 제조될 수 있다. 예를 들어, 스노우플레이크 및 히아신스 건조물을 세절하고, 그 건조 중량의 1~50배 부피량의 물, 탄소수 1~4의 무수 알코올 또는 함수 알코올과 같은 용매들 중에서 선택된 추출용매를 부가하여 4∼30℃에서 3∼20일간 침적시켜 유효성분을 추출한 후, 추출용매를 감압농축기로 농축하여 수득한다.

또 다른 구체예에 의하면, 스노우플레이크 및 히아신스 건조물을 분쇄하여, 그 건조 중량의 1~30배 부피량의 물, 탄소수 1~4의 무수 알코올 또는 함수알코올로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 용매를 사용하며, 이어서 용매가 증발되는 것을 방지하기 위하여 냉각 콘덴서를 구비한 추출기로 30∼100℃에서 1∼48시간 동안 가열 추출하거나 5∼30℃에서 1~10일간 침적시켜 유효성분을 추출하고, 추출 용매를 감압농축기로 농축하여 수득된다. 또한, 위에서 열거한 용매추출에 공지된 초음파 추출법 등을 이용하여 제조할 수 있다.

본 발명의 스노우플레이크 및 히아신스 추출물은 추출 용매로 추출한 추출액을 감압 농축한 농축액 또는 농축액을 동결건조하거나, 농축액을 분무 건조하여 건조한 분말일 수 있다.

본 발명의 화장료조성물에서 스노우플레이크 및 히아신스 혼합추출물은 화장료 조성물의 총 중량에 대하여 분말형태 또는 액상 형태로 0.001%~10중량%의 양으로 첨가될 수 있으며, 바람직하게는 화장료 조성물 총 중량에 대하여 0.01∼5중량%의 양으로 첨가될 수 있다. 이때, 상기 스노우플레이크 추출물 및 히아신스 추출물은 1~3:3~1의 중량비율로 혼합될 수 있으며, 바람직하게는 2~3:1, 더욱 바람직하게는 3:1의 비율로 혼합되는 것이다.

본 발명의 화장료 조성물은 그 제형에 있어서 특별히 한정되는 바가 없으며, 예를 들면, 화장수, 영양로션, 영양크림, 마사지크림, 에센스, 팩, 유화형 화운데이션, 고체형 화운데이션, 자외선 차단 크림 등의 제형을 가질 수 있다. 또한, 목욕세정제, 샴푸, 비누 등의 제형일 수도 있다.

또한, 각 제형의 화장료 조성물에 있어서, 상기의 스노우플레이크 및 히아신스 추출물 외에 다른 성분들을 기타 화장료의 제형 또는 사용목적 등에 따라 임의로 선정하여 배합할 수 있다. 예를 들어, 착색제(색소), 착향제(향료), 현탁화제, 유화제, 용해보조제, 안정제, 등장제, pH조절제, 점도조절제, 용제 등을 포함할 수 있다. 본 발명의 화장료 조성물은 스노우플레이크 및 히아신스 추출물 이외에 항산화, 미백, 주름개선 및 항염 효과를 나타내는 다른 유효성분을 1가지 이상 포함할 수 있다.

본 발명 화장료조성물의 유효성분으로 포함되는 스노우플레이크 및 히아신스 혼합추출물은 항산화활성, 항염활성, 주름개선효과 및 미백효과가 우수하였다. 하기의 시험예들을 통하여 확인되는 바와 같이, 스노우플레이크 추출물과 히아신스 추출물을 혼합하여 사용하는 경우, 그 상승작용에 의하여 각각의 추출물들에 비하여 매우 향상된 효과를 나타내는 것을 확인할 수 있었다.

[실시예]

이하, 실시예 및 시험예를 들어 본 발명을 상세히 설명하나, 본 발명이 이들에만 한정되는 것은 아니다.

실시예 1 : 스노우플레이크 추출물 분말의 제조

정제수로 세척한 후, 건조시킨 스노우플레이크 줄기 50g에 증류수 1㎏을 넣고 냉각 콘덴서가 달린 추출기에서 80~100℃로 2시간 끓여서 추출하였다(이 과정을 3회 반복하여 추출하였다). 이 후 300메쉬 여과지로 여과하고, 1 주일간 실온에서 방치하여 침전물을 에드벤텍 5번 여과지와 와트만 GFC 150mm 여과지로 2번 여과하였다. 그리고 감압 농축기를 이용하여 40~50℃의 온도에서 농축한 후, 스프레이드라이어(모델명:B-290, BUCHI사 제품)를 다음 조건으로 이용하여 건조시켜, 표제의 추출 분말 10g을 얻었다.

- Inlet 온도 : 180 ℃

- Aspirator 효율 : 100% (35㎤/hr)

- Pump 효율 : 25% (7.5㎖/min)

- Nozzle Cleaner 4

- Rotameter : 30㎜ (357Liter/hr)

실시예 2 ~ 5 : 추출 용매에 따른 스노우플레이크 추출물 분말의 제조

추출 용매를 달리하여 실시예 1의 방법과 동일한 방법으로 스노우플레이크 추출물 분말을 제조 하였다. 추출 용매 비율은 아래 표 1과 같다.

구분	추출 용매	분말 (g)
실시예 2	30% 에탄올	6.5
실시예 3	50% 에탄올	7.7
실시예 4	70% 에탄올	9.0
실시예 5	100% 에탄올	7.0

실시예 2 내지 5의 결과 70% 에탄올로 추출하였을 때, 분말 수득률이 높은 것을 확인하였다.

실시예 6 : 히아신스 추출물 분말의 제조

정제수로 세척한 후, 건조시킨 히아신스 줄기 50g에 증류수 1㎏을 넣고 냉각 콘덴서가 달린 추출기에서 80~100℃로 2시간 끓여서 추출하였다(이 과정을 3회 반복하여 추출하였다). 이 후 300메쉬 여과지로 여과하고, 1 주일간 실온에서 방치하여 침전물을 에드벤텍 5번 여과지와 와트만 GFC 150mm 여과지로 2번 여과하였다. 그리고 감압 농축기를 이용하여 40~50℃의 온도에서 농축한 후, 스프레이드라이어(모델명:B-290, BUCHI사 제품)를 다음 조건으로 이용하여 건조시켜, 표제의 추출 분말 10g을 얻었다.

- Inlet 온도 : 180 ℃

- Aspirator 효율 : 100% (35㎤/hr)

- Pump 효율 : 25% (7.5㎖/min)

- Nozzle Cleaner 4

- Rotameter : 30㎜ (357Liter/hr)

실시예 7 ~ 10 : 추출 용매에 따른 히아신스 추출물 분말의 제조

추출 용매를 달리하여 실시예 6의 방법과 동일한 방법으로 히아신스 추출물 분말을 제조하였다. 추출 용매 비율은 아래 표와 같다.

구분	추출 용매	분말 (g)
실시예 7	30% 에탄올	5.0
실시예 8	50% 에탄올	6.5
실시예 9	70% 에탄올	8.5
실시예 10	100% 에탄올	6.0

실시예 7 내지 10의 결과 70% 에탄올로 추출하였을 때, 분말 수득률이 높은 것을 확인하였다.

실시예 11 ~ 15 : 스노우플레이크 및 히아신스 혼합 비율에 따른 혼합 추출물 분말의 제조

추출되는 스노우플레이크 및 히아신스의 혼합 비율을 달리하여 실시예 9의 방법과 동일한 방법으로 혼합 추출물 분말을 제조하였다. 혼합 비율은 아래 표와 같다.

구분	혼합 비율 (스노우플레이크 : 히아신스)	분말
실시예 11	1 : 1 (25.0g : 25.0g)	4.0
실시예 12	2 : 1 (33.3g : 16.7g)	4.3
실시예 13	3 : 1 (37.5g : 12.5g)	5.1
실시예 14	1 : 2 (16.7g : 33.3g)	4.1
실시예 15	1 : 3 (12.5g : 37.5g)	3.7

실시예 11 내지 15의 결과 스노우플레이크 및 히아신스의 혼합비율이 3:1일 때, 분말 수득률이 가장 높은 것을 확인하였다.

시험예 1 : Xanthine Oxidase 저해 효과 확인

Xanthine oxidase에 의해 생성된 superoxide radical의 소거 활성을 측정하는 방법으로 Nitro-Blue Tetrazolium(NBT) 환원법을 사용하여 측정하였다.

0.4mM xanthine과 0.24mM NBT를 포함하는 0.1M potassium phosphate buffer(pH7.5) 1㎖과 0.1M potassium phosphate buffer(pH7.5) 0.6㎖에 시료 0.1㎖을 혼합한 후 xanthine oxidase(0.05U/㎖) 1㎖을 가하여 37℃에서 20분간 반응시킨다. 1M HCl 1㎖을 첨가하여 반응을 종결시킨 후, 520㎚에서 흡광도를 측정하였다. XO 억제율은 하기 식에 의해 산출되었고, 그 결과는 하기 표 4에 나타내었다.

B (Blank) : 0.4mM xanthine을 포함한 0.1M potassium phosphate buffer (pH7.5)와 1M HCl만 첨가한 반응액의 흡광도

C (Control) : 시료 대신 0.24mM NBT를 첨가한 반응액의 흡광도

S (Sample) : 시료를 첨가한 반응액의 흡광도

구분	NBT 환원 저해능 (%)
	0.1%	0.2%	0.5%	1.0%	2.0%	5.0%
Ascorbic acid	25	50	66	88	96	99
실시예 1	9	11	17	31	40	52
실시예 2	10	12	21	33	48	63
실시예 3	11	17	29	45	57	71
실시예 4	32	44	58	73	85	91
실시예 5	5	10	17	28	38	51
실시예 6	9	12	15	24	33	42
실시예 7	10	14	20	27	40	51
실시예 8	10	23	30	41	54	65
실시예 9	21	37	47	59	71	89
실시예 10	12	23	28	41	52	66
실시예 11	23	43	51	61	72	86
실시예 12	25	44	50	62	71	87
실시예 13	31	49	60	71	80	93
실시예 14	18	35	46	58	70	84
실시예 15	15	33	42	56	68	82

그 결과 스노우플레이크 및 히아신스의 3:1 혼합추출물인 실시예 13이 Xanthine Oxidase 저해 효과가 다른 실시예보다 우수함을 알 수 있었다.

시험예 2 : Superoxide Dismutase(SOD) 유사 활성 효과 확인

SOD 유사활성은 마크룬드 등(Marklund S. et al. Eur. J. Biolchem., 47, p468, 1975)의 방법에 따라 과산화수소로 전환시키는 반응을 촉매하는 피로갈롤(pyrogallol)의 생성량을 측정하여 SOD 유사활성으로 나타내었다. 시료 0.2㎖에 Tris-HCl buffer (50mM Tris [hydroxymethyl] amino methane, 10mM EDTA, pH 8.5) 3㎖과 7.2mM 피로갈롤 0.2㎖을 첨가하여 25℃에서 10분간 반응 후, 1N HCl 1㎖을 가하여 반응을 정지시켰다. 반응액 중 산화된 피로갈롤 양은 420nm에서 흡광도를 측정하였다.

SOD 유사활성은 하기 식에 의해 산출되었고, 그 결과는 하기 표 5에 나타내었다.

구분	SOD 유사활성 (%)
	0.1%	0.2%	0.5%	1.0%	2.0%	5.0%
Ascorbic acid	96	99	99	99	99	99
실시예 1	5	6	10	17	26	37
실시예 2	7	11	20	28	39	50
실시예 3	9	18	37	49	64	71
실시예 4	14	29	42	56	70	77
실시예 5	4	6	9	15	20	29
실시예 6	5	5	8	13	22	34
실시예 7	7	14	21	29	36	51
실시예 8	5	18	27	35	49	60
실시예 9	13	28	41	54	68	77
실시예 10	8	12	17	24	33	49
실시예 11	16	21	32	46	60	73
실시예 12	11	20	33	49	61	78
실시예 13	20	37	50	65	79	88
실시예 14	8	13	27	41	54	70
실시예 15	7	11	28	37	51	67

상기 표 5에서 확인되는 바와 같이, 스노우플레이크 및 히아신스 혼합추출물에서 전반적으로 우수한 효과를 나타내었으며, 스노우플레이크 및 히아신스의 3:1 혼합추출물인 실시예 13이 SOD 유사 활성 효과가 다른 실시예보다 우수함을 알 수 있었다.

시험예 3 : 아질산염 (NO) 소거 활성 효과 확인

아질산염(NaNO₂) 소거작용은 카토 등(Kato H. et al., Agric. Biol. Chem. 51, p1333, 1987)의 방법에 따라 측정하였다. 1mM의 아질산나트륨(NaNO₂) 용액 2㎖에 시료를 첨가하고, 0.1N HCl (pH 1.2)과 0.2M 구연산염 완충용액(Citrate buffer)를 사용하였다. 반응 용액의 pH를 각각 1.2, 3.0, 6.0으로 조정한 후, 반응 용액의 부피를 10㎖로 하여 37℃에서 1시간 반응시킨 후 각각 1㎖씩 취하여 2% 아세트산(acetic acid) 5㎖을 첨가하였다. 그리고 그리스시약(Griess Reagent, A:B=1:1, A:1% sulfanilic acid in 30% acetic acid, B:1% naphthylamine in 30% acetic acid) 0.4㎖ 첨가한 후 실온에서 15분간 반응시켰다. 반응 후 520nm에서 흡광도를 측정하였다. 아질산염 소거 활성은 하기 식에 의해 산출되었고, 그 결과는 하기 표 6에 나타내었다.

구분	아질산염 소거 활성 (%)
	0.1%	0.2%	0.5%	1.0%	2.0%	5.0%
Ascorbic acid	90	95	99	99	99	99
실시예 1	10	12	20	28	37	52
실시예 2	12	13	20	33	45	67
실시예 3	9	21	27	57	72	85
실시예 4	19	31	48	66	80	92
실시예 5	11	22	38	50	71	79
실시예 6	8	12	17	24	33	50
실시예 7	10	19	36	48	61	73
실시예 8	10	22	40	51	68	80
실시예 9	22	33	48	65	79	93
실시예 10	9	12	21	28	40	61
실시예 11	23	35	47	59	64	79
실시예 12	19	30	44	51	69	80
실시예 13	30	43	59	70	83	95
실시예 14	15	19	30	49	67	84
실시예 15	10	15	27	42	60	81

상기 표 6에서 확인되는 바와 같이, 스노우플레이크 및 히아신스 혼합추출물에서 전반적으로 우수한 효과를 나타내었으며, 스노우플레이크 및 히아신스의 3:1 혼합추출물인 실시예 13이 아질산염(NO) 소거 효과가 다른 실시예보다 우수함을 확인하였다.

시험예 4 : NO 생성 억제 효과 확인

항염 활성 효과를 확인하기 위해 염증 유발에 중요한 역할을 하는 것으로 알려진 NO(Nitric Oxide) 생성 억제에 대한 효과를 알아보았다. 일반적인 NO의 형성은 박테리아를 죽이거나 종양을 제거시키는 중요한 역할을 하지만, 염증상태에서 iNOS에 의해 생성된 NO는 혈관 투과성, 부종 등의 염증반응을 촉진시킬 뿐만 아니라 염증매개체의 생합성을 촉진하여 염증을 심화시키는 것으로 알려져 있다.

Raw 264.7 세포를 10% FBS가 첨가된 DMEM 배지를 이용하여 5×10⁵ cell/well로 조절한 후 24 well plate에 접종하고, 시료를 처리하고 30분 배양 후 LPS(Lipopolysaccharide, 1㎍/㎖)를 첨가하여 24시간 배양하였다. 생성된 NO의 양은 NO detection kit(iNtRON)를 이용하여 측정한 값을 하기 계산식으로 계산하여 나타내었다. 대조군은 LPS를 단독으로 처리한 실험군으로 하였다. NO 생성 억제율은 하기 식에 의해 산출되었고, 그 결과는 하기 표 7에 나타내었다.

구분	NO 생성 억제율 (%)
	0.5%	1.0%	2.0%	5.0%
대조군	0	0	0	0
실시예 1	4	10	21	46
실시예 2	7	16	29	54
실시예 3	10	19	40	66
실시예 4	16	32	55	75
실시예 5	8	15	23	51
실시예 6	11	20	29	44
실시예 7	18	33	45	60
실시예 8	15	28	50	69
실시예 9	24	39	58	79
실시예 10	12	25	39	51
실시예 11	25	34	50	70
실시예 12	22	36	57	74
실시예 13	37	45	63	84
실시예 14	27	40	58	78
실시예 15	17	32	52	70

상기 표 7에 나타난 바와 같이, 스노우플레이크 및 히아신스의 3:1 혼합추출물에 관한 실시예 13이 NO 생성억제효과가 다른 실시예보다 우수함을 확인하였다.

시험예 5 : 프로스타글란딘 생성 억제 효과 확인

염증 유발에 중요한 역할을 하는 것으로 알려진 프로스타글란딘 E₂(prostaglandin E₂, PGE₂) 생성억제효과를 알아보았다. Cyclooxygenase(COX)는 아라키돈산(arachidonic acid)을 프로스타글란딘으로 전환하는 효소로 COX-1과 COX-2로 분류된다. COX-1은 체내에서 혈소판의 형성, 위벽보호, 신장기능의 유지 등 정상적인 생체기능에 작용하며, COX-2는 염증매개 물질인 PGE₂를 형성시킨다. PGE₂는 염증반응, 면역반응 그리고 혈관형성(angiogenesis)을 촉진하는 등 암 발생에도 깊이 관여하고 있는 것으로 알려져 있다.

Raw 264.7 세포를 10% FBS가 첨가된 DMEM 배지를 이용하여 5×10⁵ cell/well로 조절한 후, 24 well plate에 접종하고, 시료를 처리하고 30분 배양 후 LPS(Lipopolysaccharide, 1㎍/㎖)를 첨가하여 24시간 배양하였다. 생성된 PGE₂의 양은 PGE₂ ELISA kit (R&D systems, Inc, USA)를 이용하여 측정한 값을 하기 계산식으로 계산하여 나타내었다. 대조군은 LPS를 단독으로 처리한 실험군으로 하였다.

PGE₂ 생성 억제율은 하기 식에 의해 산출되었고, 그 결과는 하기 표 8에 나타내었다.

구분	PGE2 생성 억제율 (%)
	0.5%	1.0%	2.0%	5.0%
대조군	0	0	0	0
실시예 1	9	12	19	43
실시예 2	14	25	30	47
실시예 3	21	34	48	61
실시예 4	30	36	56	71
실시예 5	12	14	31	49
실시예 6	20	31	40	49
실시예 7	24	37	48	61
실시예 8	28	41	52	64
실시예 9	27	37	50	70
실시예 10	22	30	39	51
실시예 11	21	35	51	71
실시예 12	28	40	59	72
실시예 13	35	49	65	79
실시예 14	20	38	51	70
실시예 15	22	36	47	70

PGE₂ 생성 억제 효과가 실시예 12, 13에서, 다른 실시예보다 우수하게 나타났다.

시험예 6 : TNF-α 생성 억제 효과 확인

항염 활성 효과를 확인하기 위해 초기 염증성 분자 중 하나인 TNF-α 생성 억제 효과를 확인하였다. TNF-α와 같은 염증성 사이토카인(pro-inflammatory cytokine)의 형성은 포스포리파제 A2(phospholipase A2)의 활성으로 인해 아라키돈산(arachidonic acid)이 프로스타글란딘(prostaglandin)으로 바뀌는 과정 및 NO 형성과정으로 이어지게 된다.

Raw 264.7 세포를 10% FBS가 첨가된 DMEM 배지를 이용하여 5×10⁵ cell/well로 조절한 후 24 well plate에 접종하고, 시료를 처리하고 30분 배양 후 LPS(Lipopolysaccharide, 1㎍/㎖)를 첨가하여 24시간 배양하였다. 생성된 TNF-α의 양은 TNF-α ELISA kit(eBioscience, Inc, USA)를 이용하여 측정한 값을 하기 계산식으로 계산하여 나타내었다. 대조군은 LPS를 단독으로 처리한 실험군으로 하였다.

TNF-α 생성 억제율은 하기 식에 의해 산출되었고, 그 결과는 하기 표 9에 나타내었다.

구분	TNF-α 생성 억제율 (%)
	0.5%	1.0%	2.0%	5.0%
대조군	0	0	0	0
실시예 1	9	11	24	39
실시예 2	11	20	27	51
실시예 3	19	34	50	64
실시예 4	21	32	57	75
실시예 5	13	21	36	50
실시예 6	28	41	56	66
실시예 7	30	44	58	70
실시예 8	33	50	62	77
실시예 9	40	54	63	80
실시예 10	10	19	31	48
실시예 11	44	51	67	81
실시예 12	44	55	70	83
실시예 13	48	60	75	89
실시예 14	40	53	69	82
실시예 15	33	47	61	80

표 9에서 확인되는 바와 같이 실시예 11~13의 혼합추출물에서 우수한 TNF-α 생성 억제 효과를 나타내었다.

시험예 7 : 자외선에 의해 유발되는 염증반응 억제 확인

사람 피부각질세포(human keratinocyte)를 페니실린(100 IU/ml), 스트렙토마이신(100 g/ml), 10% FBS(fetal bovine serum)를 함유하는 DMEM배지를 넣고 37℃를 유지하며 5% 이산화탄소를 포함하는 배양기 내에서 배양하였다. 수득된 피부각질세포를 6 well plate에 각 웰당 3×10⁵ 개로 분주한 다음 24시간 배양하였다. 배양 후 세포에 25mJ/㎠ 량의 자외선을 조사한 후 시료를 첨가한 후 24시간 추가 배양하였다. 생성된 TNF-α와 IL-1α의 양은 ELISA kit(eBioscience, Inc, USA)를 이용하여 측정한 값을 하기 계산식으로 계산하여 나타내었다. 대조군은 자외선을 단독으로 처리한 실험군으로 하였다.

TNF-DMEM배지를 넣고 37℃를 유지하며 5% 이산화탄소를 포함하는 배양기 내에서 배양하였다. 수득된 피부각질세포를 6 well plate에 각 웰당 3×10⁵ 개로 분주한 다음 24시간 배양하였다. 배양 후 세포에 25mJ/㎠ 량의 자외선을 조사한 후 시료를 첨가한 후 24시간 추가 배양하였다. 생성된 TNF-α와 IL-1α의 양은 ELISA kit(eBioscience, Inc, USA)를 이용하여 측정한 값을 하기 계산식으로 계산하여 나타내었다. 대조군은 자외선을 단독으로 처리한 실험군으로 하였다.

TNF- DMEM배지를 넣고 37℃를 유지하며 5% 이산화탄소를 포함하는 배양기 내에서 배양하였다. 수득된 피부각질세포를 6 well plate에 각 웰당 3×10⁵ 개로 분주한 다음 24시간 배양하였다. 배양 후 세포에 25mJ/㎠ 량의 자외선을 조사한 후 시료를 첨가한 후 24시간 추가 배양하였다. 생성된 TNF-α와 IL-1α의 양은 ELISA kit(eBioscience, Inc, USA)를 이용하여 측정한 값을 하기 계산식으로 계산하여 나타내었다. 대조군은 자외선을 단독으로 처리한 실험군으로 하였다.

TNF-α및 IL-1α 생성 억제율은 하기 식에 의해 산출되었고, 그 결과는 하기 표 10과 표 11에 나타내었다.

구분	TNF-α 생성 억제율 (%)
	0.5%	1.0%	2.0%	5.0%
대조군	0	0	0	0
실시예 1	5	10	18	31
실시예 2	6	11	23	46
실시예 3	10	21	30	51
실시예 4	22	29	44	59
실시예 5	10	15	25	47
실시예 6	7	12	21	33
실시예 7	8	19	30	44
실시예 8	10	21	34	48
실시예 9	21	30	41	55
실시예 10	6	11	19	30
실시예 11	16	32	50	61
실시예 12	20	30	51	63
실시예 13	31	41	55	67
실시예 14	15	29	43	60
실시예 15	12	25	41	57

상기 표 10에서 확인되는 바와 같이, 스노우플레이크 및 히아신스의 3:1 혼합추출물인 실시예 13이 TNF-α생성 억제 효과가 다른 실시예보다 우수함을 확인하였다.

구분	IL-1-α 생성 억제율 (%)
	0.5%	1.0%	2.0%	5.0%
대조군	0	0	0	0
실시예 1	7	20	31	42
실시예 2	20	28	35	50
실시예 3	18	29	48	61
실시예 4	23	36	54	67
실시예 5	19	26	41	53
실시예 6	22	31	39	50
실시예 7	20	32	44	58
실시예 8	24	39	50	66
실시예 9	41	52	66	75
실시예 10	20	30	41	51
실시예 11	31	46	63	76
실시예 12	32	48	62	78
실시예 13	42	55	70	83
실시예 14	38	49	61	78
실시예 15	34	47	61	77

표 11에 나타나는 바와 같이, 실시예 13이 IL-1α 생성 억제 효과가 다른 실시예보다 우수함을 확인 하였다.

시험예 8 : 세포 내 콜라겐 생성 효과 확인

Humanneonatal foreskin에서 유래한 Normal Human Primary Dermal Fibroblasts-Neonatal(HDF-N)를 이용하여 procollagen 합성정도를 측정함으로써 주름개선 효과를 판단하였다.

1)세포 배양 실험방법

HDF-N (ATCC PCS-201-010)를 배양접시 바닥에 접종한 후 0.1% insulin, 0.1% rhFGF, 0.1% gentamicin, 2% FBS를 함유하는 Fibroblast Basal Medium (FBM, Lonza, CC-3131) 배지를 넣고, 37℃를 유지하여 5% CO₂를 포함하는 배양기내에서 배양하였다.

2) 세포 독성 측정 실험 방법 (MTT assay)

HDF-N 세포를 96 well plate에 well당 6 X 10³ 개의 농도로 분주한 다음 세포 배양조건에서 24시간 배양하였다. 배지를 제거하고 DPBS로 세척한 뒤, 12시간의 기아상태를 유지시킨 후 검액 및 새로운 배지(media supplement 제외)를 넣고, 24시간 동안 배양하였다. 또 검액 및 배지를 제거하고 PBS로 세척한 후, 세포의 생존율을 측정하기 위해 WST-1 반응액을 supplement가 제외된 배지에 1/10로 희석하고 이를 각 well당 100㎕씩 처리하여 1시간 동안 반응시킨 후, 450㎚에서 흡광도를 측정하였다.

3) Procollagen 합성능 측정 실험 방법

HDF-N 세포를 48 well plate에 1.4 X 10⁴ cell/well로 분주하고 세포배양 조건에서 24시간 배양하였다. 그 후, 배지를 제거하고 24시간 세포의 기아상태를 유지하며 이 후 시험 물질을 세포 배양 배지인 FBM(media supplement 제외)에 희석하여 농도 별로 세포에 처리한 후 24시간 배양하였다. 24시간 후에 배양된 세포의 배지를 수거하여 procollagen type c-peptide(PIP) EIA kit(TAKARA, MK101)를 사용하여 procollagen 양을 측정하였다. 한편, 바닥에 부착되어 있는 세포는 PBS로 세척한 후, 1N NaOH로 lysis시켜 총 단백질 양을 측정하여 일정 단백질 당 procollagen 합성 양을 측정하였다. 각각의 procollagen 양과 단백질 양은 검량선에 따라 계산하였다.

단백질양 측정법

단백질 측정법 중 Lowry method를 기본으로 한 Bio-rad DC protein kit를 사용하여 측정하였다.

⑴ cell lysate(상층액)을 각각 5㎕씩 96 well plate에 넣는다.

⑵ protein standard 제조 : 1.5㎎/㎖ 농도의 Bovine Serum Albumin (BSA, Bio-rad, 500-0007)을 cell lysis buffer에 8가지 농도로 희석하여 5㎕씩 96 well plate에 넣는다.

⑶ kit에 포함된 reagent A와 reagent S를 40:1의 비율로 섞어서 각 well에 25㎕씩 넣는다.

⑷ kit에 포함된 reagent B를 각각 200㎕씩 넣는다.

⑸ 상온에서 15분간 반응시킨 뒤 750㎚에서 흡광도를 측정한다.

⑹ BSA 검량선에 따라 cell의 총 단백질 양을 계산한다.

4) 세포 독성 실험 결과

세포생존률은 하기 식에 의해 산출되었고, 그 결과는 하기 표 12에 나타내었다.

구분	세포 생존율 (%)
	0.5%	1.0%	2.0%	5.0%
대조군	100	100	100	100
실시예 1	100	100	100	99
실시예 2	99	100	101	102
실시예 3	98	100	101	100
실시예 4	100	99	101	102
실시예 5	99	101	100	101
실시예 6	100	99	101	100
실시예 7	99	99	100	101
실시예 8	101	100	102	101
실시예 9	99	100	101	101
실시예 10	100	100	101	99
실시예 11	100	100	101	102
실시예 12	99	100	100	99
실시예 13	100	99	100	101
실시예 14	101	100	99	99
실시예 15	100	99	100	100

실시예 1 내지 15 모두 세포독성을 나타내지 않았다.

구분	Procollagen/Protein
	0.5%	1.0%	2.0%	5.0%
대조군	4.0	4.0	4.0	4.0
실시예 1	4	5	6	10
실시예 2	4	5	9	12
실시예 3	4	7	11	14
실시예 4	5	7	11	15
실시예 5	4	6	6	11
실시예 6	5	5	7	12
실시예 7	4	5	5	10
실시예 8	5	6	10	14
실시예 9	6	9	13	18
실시예 10	4	7	11	15
실시예 11	10	13	11	15
실시예 12	8	11	13	17
실시예 13	11	15	17	21
실시예 14	5	9	10	16
실시예 15	4	8	10	15

스노우플레이크 및 히아신스 혼합추출물에 관한 실시예 12, 13에서 Procollagen 생성 효과가 다른 실시예보다 우수하게 나타났음을 확인 하였다.

시험예 9 : 세포 내 멜라닌 생성 억제 효과 확인

B16F10 멜라노사이트에 대한 멜라닌 생성 억제 정도에 근거하여 미백 효과를 판단하였다. 본 실험예에 사용된 B16F10 멜라노사이트는 마우스에서 유래한 세포주이며, 멜라닌이라는 흑색색소를 분비하는 세포이다. 이 세포의 인공 배양중에 시료를 처리하여 멜라닌 흑색색소가 감소하는 정도를 비교평가 하였다.

1) 세포 배양 실험방법

B16F10 melanoma cell은 37℃, 5% CO₂의 조건 하에서 10% fetal bovine serum(FBS, Gibco Co), 100 ㎍/㎖ streptomycin, 100U/㎖ penicillin이 첨가된 DMEM 배지가 사용되었다. B16F10 melanoma cell은 75㎠ flask (Falcon, USA) 에서 충분히 증식시킨 후 배양 2~3일 간격으로 배양세포 표면을 phosphate buffer saline(PBS) 용액으로 씻어 준 후, 0.25% trypsin-EDTA 용액을 넣고 incubator에서 1~2분 처리 하여 세포를 탈착시켰다. 탈착된 세포는 10% FBS가 포함된 DMEM 배지 15㎖을 새로운 배양용기에 옮겨 1:20 split ratio로 37℃, 5% CO₂의 조건에서 배양하였다

2) 세포 독성 측정 실험 방법 (MTT assay)

MTT assay법은 MTT [3-(4,5-dimethythiasol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide] 시약이 세포 내로 흡수된 후 미토콘드리아의 succinate dehydrogenase에 의해 formazan을 형성하는데 이 물질의 세포내 축적은 미토콘드리아의 활성, 넓게는 세포의 활성을 의미하는 것으로써 세포의 생장율을 측정하는 대표적인 방법이다.

B16F10 melanoma 세포를 5 X 10⁴ cell/well의 밀도로 96well에 200㎕ 배지와 함께 분주한 뒤, 37℃, 5% CO₂ incubator에서 24시간 배양한 후 배지를 버리고 PBS로 씻어준 다음 같은 양의 배지와 PBS에 녹인 시료를 0.1%에서 5.0%까지 다양한 농도에 따라 각 well에 처리하여 72시간 배양하였다. 배양이 끝나기 4시간 전에 PBS에 녹인 5㎎/㎖ MTT를 20㎕씩 각 well에 첨가하고 알루미늄 호일로 차광시킨 후 4시간 동안 37℃, 5% CO₂ incubator에서 배양하였다. 배양액을 제거하고 DMSO용액 200㎕를 첨가하여 37℃ incubator에서 1시간 반응 시킨 후 ELISA reader를 이용하여 570 nm에서 흡광도를 측정하여 비교하였다.

3) 멜라닌 생성 억제 효과 측정 실험 방법

B16F10 melanoma 세포를 24 well plate에 1.4 X 10⁶ cell/well의 밀도로 분주한 뒤, 37℃, 5% CO₂ incubator에서 24시간 배양한 후 배지를 버리고 PBS로 씻어준 다음 배양액을 모두 버리고 같은 양의 배지와 PBS에 녹인 시료를 0.1%에서 5.0%까지 다양한 농도에 따라 각 well에 처리하여 48시간 배양하였다. 배양이 끝난 후 배양액을 제거하고 1X PBS로 2회 세척한 다음 1N NaOH 400㎕를 가하고 60℃ incubator에 넣어서 2시간 동안 반응시켜 melanin을 완전히 용해시킨 후 490 nm에서 흡광도를 측정하였다.

4) 세포 독성 실험 결과

세포생존률은 하기 식에 의해 산출되었고, 그 결과는 하기 표 14에 나타내었다.

구분	세포 생존율 (%)
	0.5%	1.0%	2.0%	5.0%
대조군	100	100	100	100
실시예 1	99	100	99	100
실시예 2	100	100	101	102
실시예 3	100	99	101	100
실시예 4	100	99	101	102
실시예 5	100	101	99	101
실시예 6	99	100	101	100
실시예 7	100	100	100	101
실시예 8	101	99	102	101
실시예 9	100	100	101	101
실시예 10	100	100	101	99
실시예 11	101	100	101	103
실시예 12	100	99	100	99
실시예 13	100	100	100	101
실시예 14	101	99	100	101
실시예 15	99	100	100	100

실시예 1 내지 15 모두 세포독성을 나타내지 않음을 확인 하였다.

5) 세포 내 멜라닌 생성 억제 실험 결과

멜라닌 생성 억제율은 하기 식에 의해 산출되었고, 그 결과는 하기 표 15에 나타내었다.

구분	멜라닌 생성 억제율(%)
	0.5%	1.0%	2.0%	5.0%
대조군	0	0	0	0
실시예 1	6	12	27	43
실시예 2	8	19	31	45
실시예 3	14	20	39	51
실시예 4	19	30	41	56
실시예 5	15	22	38	50
실시예 6	7	20	34	48
실시예 7	9	24	37	51
실시예 8	12	29	42	55
실시예 9	16	32	48	60
실시예 10	18	33	47	59
실시예 11	35	49	61	70
실시예 12	23	37	60	74
실시예 13	40	55	70	85
실시예 14	22	38	62	76
실시예 15	21	36	61	74

표 15에서 확인되는 바와 같이 스노우플레이크 및 히아신스의 혼합추출물에 관한 실시예 11~15가 멜라닌 생성 억제 효과가 다른 실시예보다 우수함을 알 수 있었다.

제형 실시예 1 : 스노우플레이크 및 히아신스 혼합추출물을 함유한 화장수 제조

스노우플레이크 및 히아신스 혼합추출물 분말(실시예 13)을 함유한 화장수(스킨로션)를 하기의 표 16의 함량으로 하기 제조 방법을 이용하여 1kg을 제조하였다.

번호	원 료	함량(중량%)
1	스노우플레이크 및 히아신스 혼합추출물 분말 (실시예 13)	1.0
2	글리세린	3.0
3	부틸렌글리콜	2.0
4	프로필렌글리콜	2.0
5	폴리옥시에칠렌 경화피마자유	1.0
6	에탄올	10.0
7	트리에탄올아민	0.1
8	방부제	미량
9	색소	미량
10	향료	미량
11	정제수	잔량

상기 표 16에서 11번 물질에 2, 3, 4, 8번 물질을 순서대로 반응용기에 투입하고 교반하여 용해시킨 후, 5번 물질을 60℃ 정도로 가열하여 용해시켰다. 이 후, 10번 물질을 투입하여 용해한 후 11번 물질에 투입하였다. 마지막으로 1, 6, 7, 9번 물질을 투입하여 충분히 교반시킨 뒤 25℃에서 3일간 숙성시켜 표제의 화장수를 제조하였다.

제형 실시예 2 : 스노우플레이크 및 히아신스 혼합추출물을 함유한 영양 로션 제조

스노우플레이크 및 히아신스 혼합추출물 분말(실시예 13)을 함유한 하이드로좀 영양로션을 하기의 표 17의 함량으로 하기 제조 방법을 이용하여 1kg을 제조하였다.

번호	원 료	함량(중량%)
1	스노우플레이크 및 히아신스 혼합추출물 분말 (실시예 13)	1.0
2	밀납	1.0
3	폴리솔베이트 60	1.5
4	솔비탄 세스퀴올레이트	0.5
5	유동 파라핀	10.0
6	소르비탄 스테아레이트	1.0
7	친유형 모노스테아린산 글리세린	0.5
8	스테아린산	1.5
9	글리세릴스테아레이트/피이지-400 스테아레이트	1.0
10	프로필렌글리콜	3.0
11	카르복시폴리머	0.1
12	트리에탄올아민	0.2
13	방부제	미량
14	색소	미량
15	향료	미량
16	정제수	잔량

상기 표 17에서 10, 11, 13, 16번 물질을 혼합 교반하면서 80 ~ 85℃ 사이로 가열하여 제조부에 투입한 후 유화기를 작용시키고 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 12번 물질을 80 ~ 85℃사이로 가열 용해한 후 유화시켰다. 유화가 끝나면 교반기를 이용하여 교반하면서 50℃까지 냉각한 뒤 15번 물질을 투입하고 45℃까지 냉각한 뒤 14번 물질을 투입하고 35℃에서 1번 물질을 투입하여 25℃까지 냉각한 뒤 25℃에서 3일간 숙성시켜 표제의 영양로션을 제조하였다.

제형 실시예 3 : 스노우플레이크 및 히아신스 혼합추출물을 함유한 영양 세럼 제조

스노우플레이크 및 히아신스 혼합추출물 분말(실시예 13)을 함유한 하이드로좀 영양세럼을 하기의 표 18의 함량으로 하기 제조 방법을 이용하여 1kg을 제조하였다.

번호	원 료	함량(중량%)
1	스노우플레이크 및 히아신스 혼합추출물 분말 (실시예 13)	1.0
2	잔탄검	0.02
3	부틸렌글리콜	10.0
4	포스포리피드	10.0
5	하이드록시에틸셀룰로오즈	0.1
6	소디움히아루로네이트	5.0
7	정제수	잔량

상기 표 18에서 2, 3, 5번 물질을 혼합 교반 하면서 40 ~ 45℃ 사이로 가열하여 제조부에 투입한 후 유화기를 작용시키고 4, 6, 7번 물질을 제조부에 투입하고 유화시켰다. 유화가 끝나면 교반기를 이용하여 교반하면서 35℃까지 냉각하고 1번 물질을 투입하여 25℃까지 냉각한 뒤 25℃에서 3일간 숙성시켜 표제의 영양 세럼을 제조하였다.

제형 실시예 4 : 스노우플레이크 및 히아신스 혼합추출물을 함유한 에센스 제조

스노우플레이크 및 히아신스 혼합추출물 분말(실시예 13)을 함유한 하이드로좀 에센스를 하기의 표 19의 함량으로 하기 제조 방법을 이용하여 1kg을 제조하였다.

번호	원 료	함량(중량%)
1	스노우플레이크 및 히아신스 혼합추출물 분말 (실시예 13)	1.0
2	시토 스테롤	1.7
3	폴리글리세릴 2-올레이트	1.5
4	세라마이드	0.7
5	스테아레스-4	1.2
6	콜레스테롤	1.5
7	디세틸포스페이트	0.4
8	농글리세린	5.0
9	마카다미아 오일	15.0
10	카르복시비닐폴리머	0.2
11	산탄검	0.2
12	방부제	미량
13	향료	미량
14	정제수	잔량

상기 표 19에서 2, 3, 4, 5 및 6번 물질을 일정한 온도에서 균질화하여 비이온계 양친매성 지질을 제조하였다. 이 비이온계 양친매성 지질과 1, 7, 8 및 14번 물질을 혼합하고 일정한 온도에서 균질화하여 마이크로플루이다이져를 통과시키고, 이어 9번 물질을 50 ~ 60℃로 가온하여 서서히 첨가하여 균질화한 후 다시 마이크로플루이다이져에 재차 통과시켰다. 그 후, 10, 11, 12, 13번 물질을 투입하여 분산시켜 안정화하고 숙성시켜 표제의 에센스를 제조하였다.

시험예 10 : 제형 안정도 확인

스노우플레이크 및 히아신스 혼합추출물을 포함하는 상기 제형 실시예 1 내지 4에서 제조한 제형에 대하여 실내(25℃), 냉장(4℃) 및 항온(45℃)로 일정하게 유지되는 실내, 냉장고 및 인큐베이터에서 불투명 초자 용기에 담아 12주 동안 보관 및 관찰(변색, 변취 및 상 분리)하며, 안정성을 확인 하였다. 그 결과를 하기 표 20에 나타내었다.

온도조건	안정성 확인 (변색, 변취 및 분리)
	제형 실시예 1	제형 실시예 2	제형 실시예 3	제형 실시예 4
실내(25℃)	0	0	0	0
냉장(4℃)	0	0	0	0
항온(45℃)	0	0	0	0

<제형 안정 등급>

0 : 변화 없음, 1 : 미세한 변화, 2 : 변화, 3: 극심한 변화

상기 표 20에서 나타난 바와 같이, 제형 실시예 1 내지 4 제형 모두 , 25℃, 4℃ 및 45℃ 온도 조건하에서 변색, 변취 및 분리 현상이 나타나지않고 안정하였다.

Claims (7)

1. 스노우플레이크 및 히아신스 혼합추출물을 화장료조성물 전체중량에 대하여 0.001%~10중량% 함유하는 화장료조성물.
2. 제1항에 있어서, 상기 혼합추출물은 스노우플레이크 및 히아신스 추출물이 1~3:3~1의 중량비율로 혼합된 것임을 특징으로 하는 화장료조성물.
3. 제1항에 있어서, 상기 혼합추출물은 물, 탄소수 1 내지 4의 무수 또는 함수알코올, 에틸아세테이트, 아세톤, 글리세린, 에틸렌글리콜, 프로필렌글리콜 및 부틸렌글리콜로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 용매로 추출한 추출물인 것임을 특징으로 하는 화장료조성물.
4. 제1항에 있어서, 상기 화장료조성물은 항염활성을 가지는 화장료조성물인 것임을 특징으로 하는 화장료조성물.
5. 제1항에 있어서, 상기 화장료조성물은 미백용임을 특징으로 하는 화장료조성물.
6. 제1항에 있어서, 상기 화장료조성물은 피부주름개선용임을 특징으로 하는 화장료조성물.
7. 제1항에 있어서, 상기 화장료조성물은 화장수, 영양로션, 영양크림, 마사지크림, 영양세럼, 에센스, 팩, 유화형 화운데이션 또는 고체형 화운데이션의 제형을 가지는 것임을 특징으로 하는 화장료조성물.