KR101237857B1 - 신규한 알파-엘-아라비노퓨라노시데이즈 및 그 효소를 이용한 반섬유소 아라비난으로부터 아라비노스의 제조 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 신규한 알파-엘-아라비노퓨라노시데이즈 및 그 효소를 이용한 반섬유소 아라비난으로부터 아라비노스의 제조 방법에 관한 것으로 더욱 상세하게는 신규한 카디셀룰로시럽터 사카로라이티쿠스 DSM 8903(Caldicellulosiruptor saccharolyticus DSM 8903) 균으로부터 유래한 알파-엘-아라비노퓨라노시데이즈(α-L-arabinofuranosidase) 및 그 효소와 엔도-1,5-알파-엘-아라비난에이즈(endo-1,5-α-L-arabinanase)를 아라비난과 반응시켜 엘-아라비노스를 고수율로 생산하는 방법 및 그 생산용 조성물에 관한 것이다.본 발명에 따르면, 카디셀룰로시럽터 사카로라이티쿠스로부터 유래한 재조합 알파-엘-아라비노퓨라노시데이즈와 엔도-1,5-알파-엘-아라비난에이즈를 이용하여, 높은 특이성과 친환경적으로 기능성 단당인 엘-아라비노스를 생산할 수 있다.

Description

신규한 알파-엘-아라비노퓨라노시데이즈 및 그 효소를 이용한 반섬유소 아라비난으로부터 아라비노스의 제조 방법 {Novel α-L-arabinofuranosidase and Preparation method for arabinose from hemicellulose arabinan by using the same}

본 발명은 신규한 알파-엘-아라비노퓨라노시데이즈 및 그 효소를 이용한 반섬유소 아라비난으로부터 아라비노스의 제조 방법에 관한 것으로 더욱 상세하게는 신규한 카디셀룰로시럽터 사카로라이티쿠스 DSM 8903(Caldicellulosiruptor saccharolyticus DSM 8903) 균으로부터 유래한 알파-엘-아라비노퓨라노시데이즈(α-L-arabinofuranosidase) 및 그 효소와 엔도-1,5-알파-엘-아라비난에이즈(endo-1,5-α-L-arabinanase)를 아라비난과 반응시켜 엘-아라비노스를 고수율로 생산하는 방법 및 그 생산용 조성물에 관한 것이다.

일반적으로 헤미셀룰로오스(hemicellulose)는 지구에서 가장 풍부한 생물자원중에 하나이다. 이것은 최근에 에너지원천을 바꾸는 대안으로 많은 주목을 받고 있다. 그러나 헤미셀룰로오스를 에너지원천으로 사용하기에는 각가지 글라이코사이딕 하이드로레이시스(glycosidic hydrolylases)의 처리를 이용하여 단당류로 가수분해 하여야 한다. 그중 알파-엘-아라비노퓨라노시데이즈 (EC 3.2.1.55, α-L-arabinofuranosidase)와 엔도-1,5-아라비난에이즈 (endo-1,5-α-L-arabinanase, EC 3.2.1.99)를 이용하여 아라비난(arabinan)이나 아라비난자일란(arabinoxylan)에서 가수분해하여 엘-아라비노스(L-arabinose)를 얻는다.

엘-아라비노스가 비만, 당뇨병과 고지혈증 등의 성인병 예방에 효력이 있는 것으로 알려지면서 관심이 급증하고 있다. 엘-아라비노스는 소장에서 슈크레이즈(sucrase)의 활성을 저해하여 설탕이 분해되지 않고 배출되어 과잉 설탕섭취로부터 초래하는 비만, 당뇨병의 부작용을 예방할 수 있다. 또한 엘-아라비노스를 정기적으로 섭취하면 혈중 중성지방의 농도가 현격히 낮아지는 결과가 보고되면서 고지혈증 예방효과도 기대된다. 기존의 다이어트 식품소재는 팽만감을 주면서 칼로리가 낮은 화합물이거나 설탕대용으로 이용되는 저칼로리 감미료가 대부분이고 식욕을 감퇴시키는 약재화합물도 이용되고 있다. 당뇨병 환자용 식품은 총섭취 칼로리를 제한한 식품이 이용되는데, 이 경우 일반적으로 기호도가 낮아 환자가 장기적인 섭취를 기피하고 혈당치 상승을 억제하는 주사제와 약제를 함께 사용해야 하는 문제점이 있다. 엘-아라비노스는 이와 같은 문제점을 해결할 수 있는 기능성 당 중의 하나로 여겨진다. 설탕은 소장의 슈크레이즈에 의해 포도당과 과당으로 분해되어 흡수되므로 설탕의 과다섭취는 혈당치의 상승과 혈중 인슐린의 농도를 상승시키며 비만을 초래하게 된다. 엘-아라비노스의 맛은 설탕에 가깝고 소량의 첨가로는 감지가 어렵다. 따라서 설탕이 주성분으로 이용되는 식품군에 엘-아라비노스를 소량 첨가하면 감미성은 변화시키지 않고 건강에 좋은 제품을 제공할 수 있다.

엘-아라비노스는 디-자일로스와 더불어 식물체 구성 다당류인 헤미셀룰로오스의 구성당으로 자연계에 방대한 양이 존재하는데 식물체 조직으로부터 헤이셀룰로오스를 추출 분리하여 산가수분해 또는 효소가수분해 방법으로 생산한다. (Korean J. Food Sci. Technol. Vol 35 no 5 pp 757-763 (2003))

현재 사용되는 아라비노스의 생산방법에는 화학적·생물학적 합성법 및 효소법이 있다. 화학적 합성법은 촉매를 이용한 화학반응이나 생물학적 전환 과정을 통해 기질을 가수분해화시켜 아라비노스를 얻는 방법이다. 그러나 이 방법은 수율 측면에서는 우수한 반면, 정제 과정이 매우 까다롭기 때문에 대량 생산시 많은 시간과 노력을 필요로 하며, 강산·강알칼리를 사용하는 반응과정 및 고온·고압 조건의 화학공정을 필요로 하기 때문에 환경면과 비용면에서 부정적이다. 이들 방법은 경제성이나 생산 수율이 매우 낮고, 특정한 조건에서만 반응이 진행되는 비효율성을 비롯하여 산업폐기물의 유발 등 많은 문제점을 나타내어 아라비노스의 대량생산에는 적합하지 않은 것으로 여겨지고 있다.

하지만 생물학적 합성법 중에 효소법은 미생물로부터 아라비노스를 생산할 수 있는 효소를 분리하여 아라비노스를 생산하게 하는 방법으로, 상기 발효법, 합성법에 비해 친환경적이라는 장점이 있다. 그러나 아라비노스 가수분해효소는 자연에 존재하는 미생물에서는 매우 소량만이 존재하기 때문에 효소 정제 비용이 많이 들어 경제성이 없다. 이러한 문제점을 해결하기 위해, 아라비노스 가수분해효소를 도입한 재조합 균주가 제조된 바 있으나, 이전에 비해 그다지 큰 수율을 얻지 못하고 있는 실정이다. 또한 아라비노스 가수분해효소를 생산하는 것으로 알려진 균주들은 대부분 저온성·중온성 미생물로, 50℃ 이상의 온도 범위에서는 효소의 안정성이 급격하게 감소되어 대량생산에 적합한 정도의 활성을 나타낼 수 없다. 18∼40℃의 온도 범위에서 활성을 나타내는 저온성·중온성 미생물 유래의 효소에 비해, 내열성 아라비노스 가수분해효소는 50℃ 이상의 온도 범위에서 더 높은 활성을 나타내는 것으로 확인되었다. 현재까지 고온에서 안정적으로 높은 수율의 아라비노스 전환률을 나타내는 균주는 소수에 불과하여 산업적으로 이용된 예가 많지 않으며, 더욱이 70℃ 이상에서 높은 열안정성을 나타내는 균주의 효소에 대해서는 연구가 극히 부진한 상태이다.

이에 본 발명자들은 이미 고온에서 안정적으로 아라비노스를 생산할 수 있는 균주와 함께, 그로부터 분리한 내열성 엔도 및 엔소 형의 아라비노스 가수분해효소의 각각의 특성을 규명하였으며, 본 발명에서는 해당 효소 및 엔도와 엔소형의 두 효소의 혼합하여 아라비란에 반응하여 높은 수율 및 낮은 생산단가로 아라비노스를 생산하는 방법을 발명하였다.

본 발명은 상기의 문제점을 해결하고 상기의 필요성에 의하여 안출된 것으로서 본 발명의 목적은 엘-아라비노스(L-arabinose)를 고농도 고수율로 생산할 수 있는 효소를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 엘-아라비노스(L-arabinose)를 고농도 고수율로 생산할 수 있는 방법을 제공하는 것이다.

상기의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 서열번호 1의 알파-엘-아라비노퓨라노시데이즈(α-L-arabinofuranosidase)를 제공한다.

본 발명의 효소는 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열 및 이들 아미노산 서열을 가진 단백질이 표시하는 아라비노퓨라노시데이즈 활성이 손상되지 않는 범위 내에서, 1 이상의 아미노산의 결실, 치환 및 부가의 적어도 1종의 변이가 도입된 변이 아라비노퓨라노시데이즈를 포함한다.

본 발명의 아라비노퓨라노시데이즈를 코딩하는 유전자 서열이 예로서는 서열번호 2로 표시되는 것을 들 수 있다. 또한, 이들 서열번호 2의 염기서열을 변이시켜서 얻게 되는 상기 변이 아라비노퓨라노시데이즈를 코딩하는 아라비노퓨라노시데이즈 유전자도 본 발명에 관한 아라비노퓨라노시데이즈 유전자에 포함된다.

본 발명의 일 구현예에 있어서 상기 알파-엘-아라비노퓨라노시데이즈는 카디셀룰로시럽터 사카로라이티쿠스 균주로부터 유래한 것이 바람직하나 PCR 또는 화학적 합성 등의 방법을 통하여 수득할 수도 있다.

또한 본 발명은 본 발명의 상기 알파-엘-아라비노퓨라노시데이즈를 포함하는 엘-아라비노스(L-arabinose) 제조용 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 조성물은 엔도-1,5-알파-엘-아라비난에이즈를 더욱 포함하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.

본 발명의 일 구현예에서 상기 엔도-1,5-알파-엘-아라비난에이즈는 Biotechnol Lett (2009) 31:1439-1443에 자세하게 기재되어 있다.

또한 본 발명은 상기 본 발명의 알파-엘-아라비노퓨라노시데이즈 및 엔도-1,5-알파-엘-아라비난에이즈로 반섬유소(hemicellulose) 유래 아라비난(arabinan)의 기질로서 엘-아라비노스(L-arabinose)의 생산방법을 제공한다.

이하 본 발명을 설명한다.

본 발명의 알파-엘-아라비노퓨라노시데이즈 유전자는 카디셀룰로시럽터 사카로라이티쿠스로부터 분리된 것이다. 먼저, 알파-엘-아라비노퓨라노시데이즈 유전자를 가진 카디셀룰로시럽터 사카로라이티쿠스로부터 염색체 DNA를 취득한다. 다음에, 설계한 올리고뉴클레오타이드를 프라이머로 하고, 카디셀룰로시럽터 사카로라이티쿠스의 염색체 DNA를 주형으로 해서 폴리머라제 연쇄반응(PCR)을 행하여, 알파-엘-아라비노퓨라노시데이즈 유전자를 부분적으로 증폭한다. 이와 같이 해서 얻게 된 PCR 증폭 단편은 카디셀룰로시럽터 사카로라이티쿠스의 알파-엘-아라비노퓨라노시데이즈 유전자에 100% 가까운 상동성을 가진 단편으로서, 콜로니하이브리디제이션을 행할 때의 프로브로서 높은 S/N비를 기대할 수 있는 동시에, 하이브리디제이션의 스트린전시 (stringency)제어를 용이하게 한다. 상기의 PCR 증폭 단편을 적당한 시약을 사용해서 표지하고, 상기 염색체 DNA라이브러리에 대해서 콜로니 하이브리디제이션을 행하여 알파-엘-아라비노퓨라노시데이즈 효소 유전자를 선발한다 (Current Protocols in Molecular Biology, 1권, 603페이지, 1994년).

상기의 방법에 의해 선발된 대장균으로부터 알칼리법(Current Protocols in Molecular Biology, 1권, 161페이지, 1994년)을 사용해서 플라스미드를 회수함으로써,알파-엘-아라비노퓨라노시데이즈 유전자를 함유하는 DNA단편을 얻을 수 있다. 또한, 상기 방법에 의해 염기서열을 결정한 후에는, 상기 염기서열을 가진 DNA단편의 제한효소에 의한 분해에 의해 조제한 DNA단편을 프로브로 해서 하이브리다이즈함으로써 본 발명의 전체 유전자를 얻는 것이 가능하다.

서열번호 2에는 본 발명의 알파-엘-아라비노퓨라노시데이즈 유전자의 염기서열을 서열번호 1에는 상기 유전자가 코딩하는 아미노산 서열을 표시한다.

본 발명의 형질전환된 미생물은 본 발명의 재조합벡터를 상기 재조합벡터를 제작할 때에 사용한 발현벡터에 적합한 숙주 속에 도입함으로써 얻게 된다. 예를 들면 대장균 등의 세균을 숙주로서 사용하는 경우는, 본 발명에 관한 재조합벡터는, 그 자신이 숙주 속에서 자율복제 가능한 동시에 프로모터, 알파-엘-아라비노퓨라노시데이즈 유전자를 함유하는 DNA 및 전사종결서열 등의 발현에 필요한 구성을 가진 것임이 바람직하다. 본 발명에 사용된 발현벡터로서는 pTrc99A를 사용하였으나 상기의 요건을 만족하는 발현벡터이면 어느 것이나 사용가능하다.

본 발명에 관한 알파-엘-아라비노퓨라노시데이즈의 제조는 이것을 코딩하는 유전자를 가진 재조합벡터에 의해 숙주를 형질전환해서 얻은 형질전환체를 배양하고, 배양물(배양균체 또는 배양상청액)속에 유전자 산물인 알파-엘-아라비노퓨라노시데이즈를 생성 축적시켜, 배양물로부터 효소를 취득함으로써 행하여진다.

알파-엘-아라비노퓨라노시데이즈의 취득 및 정제는, 얻게 되는 배양물 중으로부터, 균체 또는 상청액을 원심 회수하여, 균체파쇄, 친화성크로마토그래피, 양이온 또는 음이온교환크로마토그래피 등을 단독으로 또는 조합함으로써 행할 수 있다.

본 발명에서는 고온에서 안정적으로 아라비노스를 생산할 수 있는 내열성 아라비노스 가수분해효소 엔도와 엔소형의 두 효소의 혼합하여 아라비노스를 생산할 수 있는 최적 반응 조건을 제시함으로써, 아라비노스를 높은 수율로 저렴하게 대량 생산할 수 있는 방법을 제공하고자 한다.이러한 결과를 토대로 카디셀룰로시럽터 사카로라이티쿠스부터 유래한 알파-엘-아라비노퓨라노시데이즈(α-L-arabinofuranosidase)와 엔도-1,5-알파-엘-아라비난에이즈(endo-1,5-α-L-arabinanase)를 대량으로 제조하며, 아라비난에서 엘-아라비노스를 고농도, 고수율로 얻는 최적 반응 조건을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.

이하, 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.

본 발명의 엘-아라비노스 생산방법은 카디셀룰로시럽터 사카로라이티쿠스 (Caldicellulosiruptor saccharolyticus)균으로부터 알파-엘-아라비노퓨라노시데이즈(α-L-arabinofuranosidase)와 엔도-1,5-알파-엘-아라비난에이즈 (endo-1,5-α-L-arabinanase)의 혼합반응으로 기질로서 디브랜치드 아라비난(debranched arabinan)과 슈가빗 아라비난(sugarbeet arabinan/branched arabinan)사용하는 단계로 구성된다.

상기 두 종류의 가수분해효소의 기질로서 디브랜치드 아라비난과 슈가빗 아라비난를 사용하는 것이 바람직하고, 상기 기질 농도는 10 g/L 내지 50 g/L 범위인 것이 바람직하며, 20 g/L 내외 범위인 것은 더욱 바람직하다.

또한 상기 효소의 혼합반응은 pH 5.0 내지 pH 7.5 범위에서 이루어지는 것이 바람직하고, 디브랜치드 아라비난의 경우 pH 6.5 슈가빗 아라비난의 경우 pH 6 내외 범위에서 이루어지는 것은 더욱 바람직하다.

또한 상기 효소의 혼합반응은 온도 60℃ 내지 90℃ 범위에서 이루어지는 것이 바람직하고, 온도 75℃ 내외 범위에서 이루어지는 것은 더욱 바람직하나, 상기 효소 반응 시간도 통상적인 방법에 따라 적절히 조절할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 두 효소 혼합반응에서 알파-엘-아라비노퓨라노시데이즈 및 엔도-1,5-알파-엘-아라비난에이즈는 각각 20 : 80 내지 80 : 20 범위의 비율(w/w)로 혼합하여 사용하는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명은 카디셀룰로시럽터 사카로라이티쿠스 균으로부터 알파-엘-아라비노퓨라노시데이즈와 엔도-1,5-알파-엘-아라비난에이즈 유전자를 분리하여 제작한 알파-엘-아라비노퓨라노시데이즈 및 엔도-1,5-알파-엘-아라비난에이즈를 혼합반응시켜 엘-아라비노스를 고농도 고수율로 생산하는 방법을 제공하는 효과가 있다.

본 발명에 따르면, 카디셀룰로시럽터 사카로라이티쿠스로부터 유래한 재조합 알파-엘-아라비노퓨라노시데이즈와 엔도-1,5-알파-엘-아라비난에이즈를 혼합반응을 이용하여, 높은 특이성과 친환경적으로 기능성 당인 엘-아라비노스를 생산할 수 있으며, 상기 엘-아라비노스는 다양한 저열량 감미료등으로 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 본 발명의 알파-엘-아라비노퓨라노시데이즈의 각 정제 단계의 SDS-PAGE 분석을 나타내는 사진. 도 1에서 Lane 1 마커 단백질; lane 2 조 추출물; lane 3 75℃에서 10분 간 열처리 후 상등액; lane 4 Hi-Trap Q HP 크로마토그래피 컬럼 산물(정제 효소)를 각각 나타냄.
도 2는 Caldicellulosiruptor saccharolyticus 알파-L-arabinofuranosidase 활성에 대한 pH 및 온도의 효과를 나타내는 그래프이다. (a) pH 효과: 반응은 1 mmol/L pNP-알파-L-arabinofuranoside (pNP-Araf) 및 0.1 U/ml 효소를 포함하는 50 mmol/L sodium acetate buffer (●,pH 4.5-5.5), 50 mmol/L maleic acid buffer (○, pH 5.5-6.5) 또는 50 mmol/L PIPES buffer (▲, pH 6.6-7.5)에서 80℃에서 10분간 수행되었다. (b) 온도 효과: 반응은 1mmol/L의 농도를 가지는 p-nitrophenyl-α-L-arabinofuranoside (pNP-Araf) 및 0.1 U/l의 효소를 포함하는 50mmol/L의 구연산 버퍼에서 10분간 수행되었다.데이터는 세 번의 독립적인 실험의 평균으로 나타내었고, 에러 바는 표준 편차를 나타낸다. PIPES, piperazine-N,N'-bis(2-ethanesulfonic acid)를 의미.
도 3은 Caldicellulosiruptor saccharolyticus 알파-L-arabinofuranosidase의 열 불활성화를 나타내는 그래프이다. 그 효소를 다른 시간 동안 65 (●), 70(□), 75 (■ ) 및 80℃(○)에서 배양하였다. 샘플을 매 시간 간격으로 취해서 상대적 활성을 결정하였다. 데이터는 세 번의 독립적인 실험의 평균으로 나타내었고, 에러 바는 표준 편차를 나타낸다.
도 4는 Caldicellulosiruptor saccharolyticus 알파-L-arabinofuranosidase의 n = 2에서 5까지의 아라비노-올리고당의 가수분해를 나타내는 그래프이다. (a) Arabinobiose.(b) Arabinotriose. (c) Arabinotetraose. (d) Arabinopentaose. = 2에서 5까지의 아라비노-올리고당의 농도는 1 mmol/L이다.그래프에서 심벌은 각각 L-arabinose (●), arabinobiose (○), arabinotriose (■ ), arabinotetraose (□) 및 arabinopentaose (▲)를 나타낸다.
도 5는 본 발명의 알파-엘-아라비노퓨라노시데이즈와 엔도-1,5-알파-엘-아라비난에이즈의 혼합비율에 따른 디브랜치드 아라비난(5a) 및 슈가빗 아라비난(5b) 에서 엘-아라비노스의 생산량을 나타낸 것이다.
도 6은 본 발명의 알파-엘-아라비노퓨라노시데이즈와 엔도-1,5-알파-엘-아라비난에이즈의 디브랜치드 아라비난(6a)과 슈가빗 아라비난(6b)에서의 최적비율의 pH 및 알파-엘-아라비노퓨라노시데이즈와 엔도-1,5-알파-엘-아라비난에이즈의 디브랜치드 아라비난(6a)과 슈가빗 아라비난(6b)에서의 최적 비율의 온도에 따른 효소 활성도를 비교하여 나타낸 것이다.
도 7은 본 발명의 알파-엘-아라비노퓨라노시데이즈와 엔도-1,5-알파-엘-아라비난에이즈의 디브랜치드 아라비난(7a)과 슈가빗 아라비난(7b)에서의 최적 비율의 온도에 따른 안정성 측정 결과를 나타낸 것이다.
도 8은 본 발명의 알파-엘-아라비노퓨라노시데이즈와 엔도-1,5-알파-엘-아라비난에이즈의 최적 비율에서 디브랜치드 아라비난 농도(8a) 및 슈가빗 아라비난 농도(8b)에 따른 엘-아라비노스의 생산량을 나타낸 것이다.
도 9는 본 발명의 알파-엘-아라비노퓨라노시데이즈와 엔도-1,5-알파-엘-아라비난에이즈의 최적비율에서 기질을 디브랜치드 아라비난(9a) 및 슈가빗 아라비난(9b)을 사용하여 효소량에 따른 엘-아라비노스의 생산량을 나타낸 것이다.
도 10은 최적조건에서 디브랜치드 아라비난에서 엘-아라비노스의 생산량(10a)과, 슈가빗 아라비난에서 엘-아라비노스의 생산량(10b)을 나타낸 것이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1: 균주, 플라즈미드 , 및 배양조건

본 발명에 사용된 Caldicellulosiruptor saccharolyticus DSM 8903 (DSMZ,Brauschweig, 독일로부터 구입), E. coli ER2566 (New England Biolabs, Herfordshire, UK) 및 플라즈미드 pTrc99A (Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, USA)를 본 발명의 알파-L-arabinofuranosidase 유전자, 숙주 세포 및 발현벡터로 각각 사용하였다. Caldicellulosiruptor saccharolyticus는 'Caldicellulosiruptor' 배지(DSM Media Formulation No. 640)에서 배양하였고, 100% N2 가스 하에서 혐기 조건하에서 70℃에서 5일간 배양하였다(Difco, Sparks, MD, USA). 효소의 단백질 발현을 위한 재조합 E. coli는 500 ml의 LB 배지와 50μg/ml의 앰피실린을 가지는 플라스크에서 200 rev/min의 통기조건 하에서 37℃에서 배양하였다. 박테리아의 흡광도가 600 nm에서 0.5에 도달할 때,IPTG를 α-L-arabinofuranosidase 발현을 유도하기 위하여 최종농도로 0.1 mmol/ml 첨가한 후 그 배양액을 4시간 동안 37℃에서 200 rev/min로 교반하면서 배양하였다.

실시예 2: 클로닝 및 유전자 발현

상기 C. saccharolyticus로부터 유래한 지노믹 DNA를 지노믹 DNA 추출 키트(Qiagen, Hilden,Germany)를 사용하여 추출하였다. α-L-arabinofuranosidase를 코딩하는 유전자(1518 bp) 주형으로 지노믹 DNA 및 Pfu DNA polymerase (Solgent, Daejeon,Korea)를 사용하여 PCR을 수행하였다.클로닝에 사용된 프라이머는 C. saccharolyticus (GenBank accession number, CP000679)에 기초하였다.

Forward (5'-TTTGGATCCATGAAAAAAGCAAAAGTCATCTA-3';서열번호 5) 및 reverse primers (5'-TTTCTGCAGTTAATTTTCTCTCTTCTTCAATCTG-3';서열번호 6) 를 BamHI 및 PstI (New England Biolabs) 제한효소 자리(밑줄)를 도입하기 위하여 고안하였다. PCR에 의하여 증폭된 DNA 절편을 정제하여 BamHI 및 PstI 제한효소로 절단하였다. 그 처리된 DNA 절편을 QIA quick 젤 추출 키트(Qiagen)를 사용하여 젤로부터 추출한 후 동일한 제한 효소로 처리된 pTrc99A 벡터에 삽입하엿다. E. coli ER2566 균주를 상기 라이게이션 혼합물로 형질전환하고 50 μg/ml의 앰피실린을 함유한 LB 아가 상에 플레이트하였다. 앰피실린-저항성 콜로니를 선택하여서 그 형질전환제로부터 플라즈미드 DNA를 플라즈미드 정제 키트 (Promega,Madison, WI)를 사용하여 분리하였다. DNA 시퀀싱을 마크로젠(Seoul, Korea)에서 수행하였다. α-L-arabinofuranosidase 유전자의 발현은 SDS-PAGE 및 효소 활성 분석에 의해서 결정하였다.

실시예 3: 효소 정제

배양된 E. coli 세포를 모아서 Sonic Dismembrator (Fisher Scientific Model 100, Pittsburgh, PA, USA)를 사용하여 18 watts, 얼음에서 단백질 저해제로 0.1 mmol/L의 phenylmethylsulfonyl fluoride를 함유한 50mmol/L Tris-HCl 버퍼(pH 7.0)에서 2분 동안 소니케이션하였다. 미파쇄 세포 및 세포 찌꺼기를 4℃, 13 000 g에서 20 분간 원심분리하여 제거하고 얻어진 상등액을 조 추출물로 사용하였다. 그 조추출물을 변성 대장균 단백질을 제거하기 위해서 75℃에서 10분간 가열하고 그 상등액을 13 000 g에서 20 분간 원심분리하였다. 그 상등액을 효소 용액을 Tris-HCl buffer (pH 7.0)로 평형화된 Hi-Trap Q HP 컬럼(Amersham Biosciences, Uppsala,Sweden) 상에 적용하였다. 그 컬럼을 50 mmol/L Tris-HCl buffer (pH 7.0)으로 물과 1 mol/L NaCl의 선형구배로 용출하였다. 각 분획을 SDS-PAGE로 분리하고, α-L-arabinofuranosidase를 가지는 분획을 수집하고 4℃에서 16시단 동안 투석한 후 정제 효소로 사용하였다. 컬럼을 사용한 정제단계는 fast protein liquid chromatography(FPLC) system (Bio-Rad, Hercules, CA, USA)에 의해서 4℃ 저온실에서 수행하였다.

표 1은 Caldicellulosiruptor saccharolyticus 알파-L-arabinofuranosidase의 정제를 나타내는 표이다.

실시예 4: 효소 분석

1 unit (U)의 효소 활성은 80℃, pH 5.5에서 1 μmol의 pNP/min를 해리하는데 필요한 효소의 양으로 정의하였다. 다른 언급이 없으면, 그 반응은 다음과 같이 수행되었다: 50mmol/L의 구연산 버퍼에 0.1mg/ml의 농도를 가지는 1 ml의 효소 용액을 50mmol/L의 구연산 버퍼에 2mmol/L의 농도를 가지는 p-nitrophenyl-α-L-arabinofuranoside (pNP-Araf) 1ml의 기질 용액과 혼합한 후 반응 용액으로 사용하였다. 그 효소 반응은 그 반응용액에서 80℃에서 10분간 수행되었고 그 활성은 p-nitrophenol (pNP)의 해리로 결정되었다. 415 nm에서 흡광도는 에서 0.2 mol/L Na₂CO₃ (Margolles and de los Reyes-Gavilan 2003)를 첨가하여 반응을 종료시킨 후에 측정하였다.

실시예 5: 분자량 결정

α-L-arabinofuranosidase의 서브유닛 분자량은 레퍼런스 단백질로 pre-stained ladder 단백질(MBI Fermentas, Hanover, MD, USA)을 사용하여 SDS-PAGE에 의하여 조사하였다. 0.5mg/ml 농도의 20 마이크로리터의 효소 용액을 5분간 가열 후에 SDS-PAGE 젤 상에 로딩하였다. 전기영동을 미니 polyacrylamide gel system (Bio-Rad)을 사용하여 150V에서 수행하였다. 모든 단백질 밴드를 Coomassie blue로 염색하여 시각화하였다. 천연 효소의 분자량은 Sephacryl S-300 HR 16/60 preparative-grade 컬럼(Amersham Biosciences)을 사용한 젤 여과 크로마토그래피에 의해서 결정하였다. 그 효소 용액을 그 컬럼에 로딩한 후 150 mmol/L NaCl을 함유하는 50 mmol/L의 구연산 버퍼(pH 5.5)로 1 ml/min 용출속도로 용출하였다. 그 컬럼은 레퍼런스 단백질(Amersham Biosciences)로 thyroglobulin (669 kDa),apoferritin (443 kDa), albumin (66 kDa) 및 ovalbumin(43 kDa)으로 조정하였고 천연 효소의 분자량은 레퍼런스 단백질의 이동 거리를 비교하여 계산하였다.

실험예 1: 온도 및 pH 에 대한 효과

α-L-arabinofuranosidase 활성에 대한 pH의 효과는 도 2a에 표시하였다.

도 2에서 알 수 있는 바와 같이 최대 활성은 pH 5.5에서 관찰되었다.

온도에 대한 효과는 60-90℃ 사이에서 수행되었고, 도 2b에 표시하였다.

도 2b에서 알 수 있는 바와 같이 최대 활성은 80℃에서 관찰되었다.

효소의 안정성에 대한 온도의 영향은 여러 온도 (65,70, 75 및 80℃)에서 효소 용액을 위치하여 배양 시간의 함수로 모니터하였다. 배양시간은 132 h for 65 및 70℃에서, 75에서 83 h, 그리고 80℃에서 1 h시간 이었다(도 3). 도 3에서 알 수 있는 바와 같이 재조합 α-L-arabinofuranosidase는 열 불활성에 대한 1차 카이네틱스를 나타내었고, 65, 70, 75 및 80℃에서 효소의 반감기는 각각 1700, 390, 49 및 0.4 h이었다.

실험예 2: 여러 기질에 대한 가수분해 반응

p-nitrophenyl-α-L-arabinofuranoside (pNP-Araf), pNP-α-L-arabinopyranoside (pNP-Arap), pNP-α-D-galactopyranoside, pNP-α-D-glucopyranoside, pNP-β-D-fucopyranoside,pNP-β-D-galactopyranoside, pNP-β-D-glucopyranoside,pNP-β-D-lactopyranoside, pNP-β-D-maltopyranoside, pNP-β-D-xylopyranoside, pNP-β-l-arabinopyranoside, o-nitro-phenyl-β-D-fucopyranoside, oNP-β-D-galactopyranoside 및 oNP-β-D-glucopyranoside를 포함하는 아릴-글리코사이드에 대한 가수분해 반응은 1 mmol/L aryl-glycoside 및 0.1 U/ml의 효소를 포함하는 50 mmol/L 구연산 버퍼(pH 5.5))에서 80℃에서 10 분간 수행하였고 그 활성은 pNP 또는 oNP의 해리로 결정하였다. 아라비노비오스, 아라비노트리오스, 아라비노테트라오스 및 아라비노펜타오스와 같은 아라비노-올리고당 및 녹말, 아라비난, 자일란, 디브랜치된 아라비난 및 밀 아라노비자일란과 같은 다당류에 대한 가수분해 반응은 1 mmol/L arabino-올리고당 또는 1% (w/v) 다당류를 포함하는 구연산 버퍼에서 80℃에서 30 분간 수행하였고 그 활성은 L-아라비노스의 해리 양에 의해서 결정하였다.

도 4에서 알 수 있는 바와 같이 α-L-Arabinofuranosidase는 pNP-Araf, pNP-Arap 및 2-5 모노머 단위를 가지는 아라비노-올리고당에 대한 가수분해 활성을 나타내었으나. pNP-α-D-galactopyranoside, pNP-α-D-gluco-pyranoside, pNP-β-D-fucopyranoside, pNP-β-D-galactopy-ranoside, pNP-β-D-glucopyranoside, pNP-β-D-lactopyrano-side, pNP-β-D-maltopyranoside, pNP-β-D-xylopyranoside,pNP-β-L-arabinopyranoside, o-nitrophenyl-β-D-fucopyrano-side, oNP-β-D-galactopyranoside, oNP-β-D-glucopyranoside, 녹말, 아라비난, 자일란, debranched 아라비난 또는 밀 아라비노자일란에 대해서는 활성을 나타내지 않았다.

실시예 6: 아라비노스의 생산에서 알파-엘- 아라비노퓨라노시데이즈와 엔도-1,5-알파-엘- 아라비난에이즈의 최적 혼합비율 조사

본 발명에 따른 아라비노스 생산에서 알파-엘-아라비노퓨라노시데이즈와 엔도-1,5-알파-엘-아라비난에이즈의 최적 혼합비율을 조사하기 위하여 10 g/L 디브랜치드 아라비난에 대해서 10 unit/mL 알파-엘-아라비노퓨라노시데이즈와 20 unit/mL 엔도-1,5-알파-엘-아라비난에이즈를 비율별(w/w)로 혼합하여 pH 6.5 및 효소활성이 절반으로 줄어든 시간을 고려한 온도(75℃)에서 2시간 동안 반응을 하였고, 슈가빗 아라비난에 대해서 36 unit/mL 알파-엘-아라비노퓨라노시데이즈와 18 unit/mL 엔도-1,5-알파-엘-아라비난에이즈를 비율별(w/w)로 혼합하여 pH 6.5 및 효소활성이 절반으로 줄어든 시간을 고려한 온도(75℃)에서 2시간 동안 반응을 수행하였다. 그 다음 디엔에스(DNS)용액을 1:1(v:v)으로 넣고 끓는물에 10분간 가열하여 상기 반응을 정지시켰다.

그 결과, 도 5에 나타난 바와 같이, 기질 디브랜치드 아라비난에 대한 최적 효소농도는 4 unit/mL 알파-엘-아라비노퓨라노시데이즈와 12 unit/mL 엔도-1,5-알파-엘-아라비난에이즈로 최적비율 1:3이었고, 슈가빗 아라비난에 대한 최적 효소농도는 28.8 unit/mL 알파-엘-아라비노퓨라노시데이즈와 3.6 unit/mL 엔도-1,5-알파-엘-아라비난에이즈로 최적비율 8:1이었다.

실시예 7: 알파-엘- 아라비노퓨라노시데이즈와 엔도-1,5-알파-엘- 아라비난에이즈의 최적 혼합비율에서 pH 및 온도가 엘- 아라비노스 생산 활성에 미치는 영향

상기 실시예 6에서 확인한 디브랜치드 아라비난과 슈가빗 아라비난에 대한 알파-엘-아라비노퓨라노시데이즈와 엔도-1,5-알파-엘-아라비난에이즈 각각의 최적 혼합비율에서 pH 및 온도 변화에 따른 엘-아라비노스 생산 활성변화를 다음과 같이 확인하였다. 다양한 pH 및 온도 조건 하에서 효소와 기질을 반응시키고 엘-아라비노스 생산을 비교하였다.

7-1: 알파-엘- 아라비노퓨라노시데이즈와 엔도-1,5-알파-엘- 아라비난에이즈의 최적 혼합비율에서 pH 가 엘- 아라비노스 생산 활성에 미치는 영향

상기 두 효소의 최적 혼합비율에서 엘-아라비노스 생산에 대한 pH 효과를 조사하기 위하여, 기질로서 1 g/L 디브랜치드 아라비난에 대하여 0.8 unit/mL알파-엘-아라비노퓨라노시데이즈와 2.4 unit/mL 엔도-1,5-알파-엘-아라비난에이즈(1:3)를 사용하였고, 기질로서 1 g/L 슈가빗 아라비난에 대하여 2.8 unit/mL 알파-엘-아라비노퓨라노시데이즈와 0.36 unit/mL 엔도-1,5-알파-엘-아라비난에이즈(8:1)를 사용한 50 mM 씨트레이트/포스페이트 (citrate/phosphate buffer) 완충용액에서 pH 6.5에서부터 8.5 범위까지 효소 반응을 실시하였다. 구체적으로, 효소반응은 75℃에서 10분 동안 수행하고 다시 디엔에스용액을 1:1(v:v)으로 넣고 끓는물에 10분간 가열하여 상기 반응을 정지시켰다. 그 결과, 도 6에 나타난 바와 같이, 최적 pH는 디브랜치드 아라비난와 슈가빗 아라비난에 대하여 각각 pH 6.5와 pH 6.0인 것을 알 수 있었다.

도 6a는 본 발명의 디브랜치드 아라비난을 기질로 했을 때 알파-엘-아라비노퓨라노시데이즈와 엔도-1,5-알파-엘-아라비난에이즈의 최적 혼합비율에서 pH에 따른 엘아라비노스의 생산를 조사하여 나타낸 것이고, 도 6b는 슈가빗 아라비난을 기질로 했을 때 알파-엘-아라비노퓨라노시데이즈와 엔도-1,5-알파-엘-아라비난에이즈의 최적 혼합비율에서 pH에 따른 엘아라비노스의 생산를 조사하여 나타낸 것이다.

7-2: 알파-엘- 아라비노퓨라노시데이즈와 엔도-1,5-알파-엘- 아라비난에이즈의 최적 혼합비율에서 온도가 엘- 아라비노스 생산 활성에 미치는 영향

상기 두 효소의 최적 혼합비율에서 엘-아라비노스 생산에 대한 온도 효과를 조사하기 위하여, 각각 효소 반응은 온도 55℃에서 80℃ 범위까지 상기 두 효소의 최적 혼합비율에서 엘-아라비노스 생산에 대한 pH 효과를 조사하기 위하여, 기질로서 1 g/L 디브랜치드 아라비난에 대하여 pH 6.5에서 0.8 unit/mL알파-엘-아라비노퓨라노시데이즈와 2.4 unit/mL 엔도-1,5-알파-엘-아라비난에이즈(1:3)를 사용하였고, 기질로서 1 g/L 슈가빗 아라비난에 대하여 pH 6.0에서 2.8 unit/mL 알파-엘-아라비노퓨라노시데이즈와 0.36 unit/mL 엔도-1,5-알파-엘-아라비난에이즈(8:1)를 사용한 50 mM 씨트레이트/포스페이트 (citrate/phosphate buffer) 완충용액에서 각각 10분 동안 반응을 실시하였다. 그 다음 디엔에스용액을 1:1(v:v)으로 넣고 끓는 물에 10분간 가열하여 상기 반응을 정지시켰다. 그 결과, 도 6에 나타난 바와 같이, 최적 온도는 두 효소 각각 75℃인 것을 알 수 있었다.

도 6c는 본 발명의 디브랜치드 아라비난을 기질로 했을 때 알파-엘-아라비노퓨라노시데이즈와 엔도-1,5-알파-엘-아라비난에이즈의 최적 혼합비율에서 온도에 따른 엘아라비노스의 생산를 조사하여 나타낸 것이고, 도 6d는 슈가빗 아라비난을 기질로 했을 때 알파-엘-아라비노퓨라노시데이즈와 엔도-1,5-알파-엘-아라비난에이즈의 최적 혼합비율에서 온도에 따른 엘아라비노스의 생산를 조사하여 나타낸 것이다.

7-3: 알파-엘- 아라비노퓨라노시데이즈와 엔도-1,5-알파-엘- 아라비난에이즈의 최적 비율로 혼합된 효소의 온도 안정성 조사

최적 혼합비율의 알파-엘-아라비노퓨라노시데이즈와 엔도-1,5-알파-엘-아라비난에이즈에서 디브랜치드 아라비난로부터 엘-아라비노스 생산에 대한 온도 안정성을 조사하기 위하여, 온도 65℃에서 85℃까지의 범위에서 기질로서 1 g/L 디브랜치드 아라비난에 대하여 pH 6.5에서 0.8 unit/mL알파-엘-아라비노퓨라노시데이즈와 2.4 unit/mL 엔도-1,5-알파-엘-아라비난에이즈(1:3)를 사용하였고, 기질로서 1 g/L 슈가빗 아라비난에 대하여 pH 6.0에서 2.8 unit/mL 알파-엘-아라비노퓨라노시데이즈와 0.36 unit/mL 엔도-1,5-알파-엘-아라비난에이즈(8:1)를 사용한 50 mM 씨트레이트/포스페이트(citrate/phosphate buffer) 완충용액에서 각각 효소 활성이 절반으로 줄어드는 시간까지 반응을 진행시켰다. 반응이 끝난 다음, 디엔에스 용액을 1:1(v:v)으로 넣고 끓는물에 10분간 가열하여 상기 반응을 정지시키고, 엘-아라비노스 생산에 대한 효소의 활성을 측정하였다.

도 7a은 본 발명의 최적 혼합비율의 알파-엘-아라비노퓨라노시데이즈와 엔도-1,5-알파-엘-아라비난에이즈에서 디브랜치드 아라비난로부터 엘-아라비노스 생산에 대한 온도 안정성 결과를 나타낸 것이다. 상기 도 7a의 그래프에서 온도 표기는 65℃(●), 70℃(○), 75℃(▼), 80℃(△) 및 85℃(■)로 각각 나타내었다.

그 결과 도 7a에 나타난 바와 같이, 온도 65℃는 1215 시간, 70℃는 347 시간, 75℃는 126 시간, 그리고 80℃에서는 12 시간 경과 시 상기 효소 활성이 절반으로 줄어드는 것을 확인할 수 있었다.

도 7b은 본 발명의 본 발명의 최적 혼합비율의 알파-엘-아라비노퓨라노시데이즈와 엔도-1,5-알파-엘-아라비난에이즈에서 슈가빗 아라비난로부터 엘-아라비노스 생산에 대한 온도 안정성 결과를 나타낸 것이다. 상기 도 7의 그래프에서 온도 표기는 65℃(●), 70℃(○), 75℃(▼), 80℃(△) 및 85℃(■)로 각각 나타내었다.

그 결과 도 7b에 나타난 바와 같이, 온도 65℃는 1296 시간, 70℃는 346 시간, 75℃는 80 시간, 80℃에서는 0.8 시간, 그리고 85℃에서는 0.1 시간 경과 시 상기 효소 활성이 절반으로 줄어드는 것을 확인할 수 있었다.

실시예 8. 아라비노스의 생산을 위한 기질 농도 및 효소농도의 최적화

8-1: 아라비노스의 생산을 위한 기질 농도의 최적화

아라비노스의 생산에 대한 기질 농도의 영향을 조사하기 위하여 1 g/L 내지 50 g/L의 디브랜치드 아라비난을 기질에 대하여 14 unit/mL의 알파-엘-아라비노퓨라노시데이즈와 42 unit/mL의 엔도-1,5-알파-엘-아라비난에이즈(1:3)를 사용하여 75℃에서 2시간 반응하였다. 그 결과, 디브랜치드 아라비난의 농도가 20 g/L 이상에서는 고점도로 인하여 반응에 어려움이 존재하여 최적농도를 20 g/L의 디브랜치드 아라비난으로 결정하였고 이 농도에서 7.1 g/L의 엘-아라비노스가 생산되었고, 이는 35.5%의 전환율에 해당한다.

또한, 기질 1 g/L 내지 50 g/L의 슈가빗 아라비난 기질에 대하여 알파-엘-아라비노퓨라노시데이즈와 엔도-1,5-알파-엘-아라비난에이즈 가수분해효소의 농도를 증가시키면서 2시간 반응 한 경과, 20.35 unit/mL의 알파-엘-아라비노퓨라노시데이즈와 3.12 unit/mL의 엔도-1,5-알파-엘-아라비난에이즈(8:1)를 사용하여 75℃에서 2시간 반응하였다. 그 결과, 슈가빗 아라비난의 농도가 20 g/L 이상에서는 엘-아라비노스의 생산이 크게 증가하지 않아 최적농도를 20 g/L로 하였고 이 농도에서 10.3 g/L의 엘-아라비노스가 생산되었고, 이는 51.5%의 전환율을 나타내었다.

도 8(a)와 도 8(b)는 기질인 디브랜치드 아라비난과 슈가빗 아라비난 농도에 따른 아라비노스의 생산을 각각의 최적 비율의 알파-엘-아라비노퓨라노시데이즈와 엔도-1,5-알파-엘-아라비난에이즈에서 살펴 본 것이다.

8-2: 아라비노스의 생산을 위한 효소농도의 최적화

아라비노스의 생산에 대한 효소 농도의 영향을 조사하기 위하여 20 g/L의 디브랜치드 아라비난을 기질에 대하여 최적 비율인 1:3으로 하여 알파-엘-아라비노퓨라노시데이즈와의 엔도-1,5-알파-엘-아라비난에이즈 농도를 0.7 unit/mL:2.1 unit/mL로부터 35 unit/mL:105 unit/mL로 변화시켜 75℃에서 2시간 반응하였다. 그 결과, 두효소의 농도가 14 unit/mL:42 unit/mL이상에서는 엘-아라비노스의 생산이 크게 증가하지 않아 두 효소의 최적농도를 14 unit/mL:42 unit/mL로 결정하였고 이 농도에서 7.1 g/L의 엘-아라비노스가 생산되었고, 이는 35.5%의 전환율에 해당한다.

또한, 20 g/L의 디브랜치드 아라비난을 기질에 대하여 최적 비율인 8:1으로 하여 알파-엘-아라비노퓨라노시데이즈와의 엔도-1,5-알파-엘-아라비난에이즈 농도를 2.49 unit/mL:0.31 unit/mL로부터 40.7 unit/mL:6.24 unit/mL로 변화시켜 75℃에서 2시간 반응하였다. 그 결과, 두 효소의 농도가 30.5 unit/mL:4.68 unit/mL이상에서는 엘-아라비노스의 생산이 크게 증가하지 않아 두 효소의 최적농도를 30.5 unit/mL:4.68 unit/mL로 결정하였고 이 농도에서 7.1 g/L의 엘-아라비노스가 생산되었고, 이는 35.5%의 전환율에 해당한다.

도 9(a)와 도 9(b)는 최적 비율의 알파-엘-아라비노퓨라노시데이즈와 엔도-1,5-알파-엘-아라비난에이즈에서 효소 농도에 따른 아라비노스의 생산을 20 g/L 디브랜치드 아라비난과 20 g/L 슈가빗 아라비난에서 살펴 본 것이다.

실시예 9. 최적조건에서 알파-엘- 아라비노퓨라노시데이즈와 엔도-1,5-알파-엘- 아라비난에이즈를 이용한 아라비난에서 엘- 아라비노스의 생산

알파-엘-아라비노퓨라노시데이즈와 엔도-1,5-알파-엘-아라비난에이즈를 이용한 아라비난으로부터 엘-아라비노스의 생산 방법을 개발하기 위하여, 상기에서 확인한 각 기질 최적조건에서 80분간 반응하였다. 20 g/l 디브랜치드 아라비난으로부터 pH 6과 75℃에서 14 unit/mL 알파-엘-아라비노퓨라노시데이즈와 42 unit/mL 엔도-1,5-알파-엘-아라비난에이즈를 사용하여 엘-아라비노스의 시간별 생산량을 측정하고, 20 g/l 슈가빗 아라비난으로부터 pH 6.5와 75℃에서 30.5 unit/mL 알파-엘-아라비노퓨라노시데이즈와 4.68 unit/mL 엔도-1,5-알파-엘-아라비난에이즈를 를 사용하여 엘-아라비노스의 시간별 생산량을 측정하였다.

도 10a는 최적조건에서 두 효소를 사용하여 기질로서 20 g/L의 디브랜치드 아라비난으로부터 엘-아라비노스의 생산량을 나타낸 그래프로, 20 g/L의 디브랜치드 아라비난으로부터 엘-아라비노스를 80분 후에 7.9 g/L 얻어 7.8 g L^-1 h^{- 1}생산성과 39.5% 전환수율을 확인할 수 있었다.

도 10b는 최적조건에서 두 효소를 사용하여 기질로서 20 g/L의 슈가빗 아라비난으로부터 엘-아라비노스의 생산량을 나타낸 그래프로, 20 g/L의 슈가빗 아라비난으로부터 엘-아라비노스를 80분 후에 10.3 g/L 얻어 10.1 g L^-1 h^{- 1}생산성과 51.5% 전환수율을 확인할 수 있었다.

이상으로 본 발명 내용의 특정부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 것은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

<110> Konkuk University Industrial Cooperation Corp. <120> Novel alpha-L-arabinofuranosidase and Preparation method for arabinose from hemicellulose arabinan by using the same <160> 6 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 506 <212> PRT <213> Caldicellulosiruptor saccharolyticus <400> 1 Met Lys Lys Ala Lys Val Ile Tyr Asp Lys Glu Phe Val Ile Gly Gln 1 5 10 15 Ile Asp Lys Arg Ile Tyr Gly Ser Phe Leu Glu His Met Gly Arg Ala 20 25 30 Ile Tyr Thr Gly Ile Tyr Glu Pro Asp His Pro Gln Ala Asp Glu Met 35 40 45 Gly Phe Arg Lys Asp Val Leu Glu Leu Val Arg Lys Leu Asn Val Pro 50 55 60 Ile Val Arg Tyr Pro Gly Gly Asn Phe Val Ser Gly Tyr Asn Trp Glu 65 70 75 80 Asp Gly Val Gly Pro Lys Glu Lys Arg Pro Arg Arg Leu Glu Leu Ala 85 90 95 Trp Arg Ala Ile Glu Thr Asn Glu Val Gly Ile Asn Glu Phe Val Glu 100 105 110 Trp Ala Lys Arg Ala Asn Thr Ser Val Met Met Thr Val Asn Leu Gly 115 120 125 Thr Arg Gly Ile Asp Ala Ala Arg Asn Leu Val Glu Tyr Cys Asn Phe 130 135 140 Pro Gly Gly Thr Tyr Tyr Ser Asp Leu Arg Arg Gln His Gly Tyr Glu 145 150 155 160 Gln Pro His Asn Ile Lys Val Trp Cys Leu Gly Asn Glu Met Asp Gly 165 170 175 Asp Trp Gln Ile Gly His Lys Thr Ala Tyr Glu Tyr Gly Arg Leu Ala 180 185 190 Arg Glu Ala Ala Lys Val Met Lys Trp Val Asp Pro Ser Ile Glu Leu 195 200 205 Val Ala Ala Gly Ser Ser Gly Pro Lys Met Pro Thr Phe Pro Glu Trp 210 215 220 Glu Ala Ile Val Leu Asp His Thr Tyr Asp Leu Val Asp Tyr Val Ser 225 230 235 240 Leu His Val Tyr Tyr Gly Asn Pro Glu Lys Asp Thr Lys Asn Phe Val 245 250 255 Ala Lys Ser Leu Glu Met Glu Glu Phe Ile Lys Thr Val Ile Ser Thr 260 265 270 Ile Asp Tyr Val Lys Ala Lys Lys Arg Ser Lys Lys Val Val Asn Ile 275 280 285 Ser Phe Asp Glu Trp Asn Val Trp Tyr His Ala His Leu Glu Gly Lys 290 295 300 Asp Glu Lys Ala Gln Pro Trp Ala Arg Ile Arg Ala Ile Ala Glu Glu 305 310 315 320 Asp Tyr Val Phe Glu Asp Ala Ile Leu Val Gly Cys Met Leu Ile Ala 325 330 335 Leu Leu Lys His Cys Asp Arg Val Arg Ile Ala Cys Met Ala Gln Leu 340 345 350 Val Asn Val Ile Ala Pro Ile Thr Thr Val Lys Gly Gly Ile Ala Tyr 355 360 365 Arg Gln Val Ile Tyr Tyr Pro Phe Met His Ala Ala Asn Tyr Gly His 370 375 380 Gly Val Ala Leu Leu Pro Lys Val Asn Ser Pro Lys Tyr Asp Ser Lys 385 390 395 400 Asp Phe Thr Asp Val Pro Tyr Ile Glu Thr Val Ala Thr Tyr Asn Glu 405 410 415 Glu Lys Gly Glu Ile Thr Val Phe Ala Val Asn Arg Asp Leu Glu Glu 420 425 430 Glu Met Gln Val Glu Phe Lys Leu Asp Gly Phe Glu Gly Phe Glu Val 435 440 445 Val Glu His Ile Val Tyr Glu Ser Asp Asp Ile Tyr Lys Gly Asn Thr 450 455 460 Gln Asp Lys Pro Asp Asn Ala Val Pro His Lys Gly Gly Ser Ser Lys 465 470 475 480 Ile Glu Gly Asn Ile Leu Thr Ser Ile Leu Pro Lys Phe Ser Trp Asn 485 490 495 Val Ile Arg Leu Lys Lys Arg Glu Asn Glx 500 505 <210> 2 <211> 1518 <212> DNA <213> Caldicellulosiruptor saccharolyticus <400> 2 atgaaaaaag caaaagtcat ctacgataag gagtttgtga ttgggcaaat agacaaaaga 60 atctatggtt catttttaga gcacatggga agagcaatat acacaggaat ctatgaaccc 120 gaccatccac aggctgatga aatgggattt agaaaagatg ttttagagct tgttcgaaag 180 cttaatgttc ctattgtaag atatcctggc ggcaattttg tgtcggggta taactgggaa 240 gatggagttg gcccaaaaga aaaaaggcca agaagacttg agcttgcgtg gagagcaatt 300 gagacaaatg aggtcggtat aaacgaattt gttgaatggg caaaaagagc aaacacctct 360 gttatgatga cagtaaacct tggcacgcgt ggaattgatg ctgcaagaaa cttagttgag 420 tattgcaact ttccaggtgg cacatattac agtgacctgc gtcgtcagca cggctatgag 480 cagccacaca atataaaggt gtggtgcttg ggcaatgaga tggatggtga ctggcagatt 540 ggccacaaaa ctgcatatga gtatggaagg cttgcaagag aagctgcaaa agttatgaaa 600 tgggtagacc caagtattga gcttgttgca gctggaagct cagggcccaa aatgcccaca 660 tttcctgagt gggaagcaat tgttttggac cacacatatg atcttgtaga ttatgtttct 720 ctacatgtgt actatggaaa tcctgaaaag gacacaaaga attttgttgc aaaatcactt 780 gaaatggaag agtttataaa gacagtaatt tccacaattg attatgtaaa ggctaaaaag 840 aggagtaaaa aggttgtcaa tatctcattt gacgaatgga atgtatggta ccacgcacat 900 cttgagggaa aagacgaaaa agcacagccc tgggcacgaa ttcgtgctat tgctgaagaa 960 gattatgtgt tcgaagatgc aattttggtg ggatgtatgc taattgcact cttaaagcat 1020 tgtgacaggg tcaggatagc atgtatggca caacttgtta atgtcattgc cccaattacc 1080 actgtaaaag gtggaattgc ttacagacag gtaatctatt atcctttcat gcatgctgca 1140 aactatggtc atggggttgc actgcttcct aaggtaaatt cccctaaata tgattcaaaa 1200 gactttactg atgttccata tattgaaaca gtcgcaacat acaatgagga aaagggtgaa 1260 ataacagttt ttgccgtcaa cagagattta gaagaggaga tgcaagttga atttaaactt 1320 gatggttttg aaggatttga ggttgtggag cacattgtat atgaaagtga tgatatttac 1380 aaaggaaaca ctcaagataa gcctgacaat gccgtgcccc acaaaggtgg aagttcaaaa 1440 atagaaggca atatcttaac atccatattg cctaaattct catggaatgt aatcagattg 1500 aagaagagag aaaattaa 1518 <210> 3 <211> 489 <212> PRT <213> Caldicellulosiruptor saccharolyticus <400> 3 Met Gly Lys Ile Ser Phe Arg Lys Leu Lys Leu Phe Ile Leu Val Thr 1 5 10 15 Ile Ile Ser Ile Ile Ile Val Asn Thr Asn Phe Ser Lys Gly Asp Asn 20 25 30 Ser Lys Met Asn Lys Ile Ile Tyr Pro Lys Ala Pro Pro Lys Val Thr 35 40 45 Leu Tyr Asp Leu Ser Ile Ile Asn Asp Glu Lys Lys Trp Thr Val Asn 50 55 60 Asn Val His Asp Pro Ala Ile Ile Lys Ala Asp Asn Gly Trp Tyr Tyr 65 70 75 80 Ile Tyr Ser Thr Asp Val Lys Val Gly Gly Val Pro Lys Pro Gly Ile 85 90 95 Gln Ile Arg Lys Ser Lys Asp Leu Ile Asn Trp Gln Phe Val Gly Tyr 100 105 110 Val Phe Asn Gly Lys Asp Tyr Val Tyr Gly Gly Ile Pro Lys Gly Ala 115 120 125 Tyr Glu Trp Thr Gln Ala Thr Asn Leu Trp Ala Pro Asp Ile Lys Lys 130 135 140 Met Asn Gly Lys Tyr Tyr Leu Tyr Tyr Ala Ala Ser Gln Phe Gly Lys 145 150 155 160 Asn Gln Ser Tyr Ile Gly Leu Ala Thr Ala Thr Asn Pro Glu Gly Pro 165 170 175 Trp Lys Asp Glu Gly Glu Val Ile Lys Thr Lys Gln Gly Asp Val Val 180 185 190 Asn Ala Ile Asp Pro Cys Leu Thr Phe Asp Ala Asn Gly Gln Pro Trp 195 200 205 Leu Val Tyr Gly Ser Phe Phe Gly Gly Ile Tyr Ile Ile Lys Ile Asp 210 215 220 Lys Lys Thr Gly Lys Pro Ala Glu Lys Gly Phe Gly Lys Leu Ile Ala 225 230 235 240 Arg Arg Asp Met Ser Val Gln Gly Ala Ile Glu Gly Pro Tyr Ile Ile 245 250 255 Tyr Asn Pro Lys Phe Lys Lys Tyr Tyr Leu Phe Val Ser Tyr Asp Ser 260 265 270 Leu Phe Asn Asp Tyr Asn Val Arg Val Gly Arg Ser Asp Lys Ile Thr 275 280 285 Gly Pro Tyr Val Asp Tyr Asn Gly Lys Leu Met Thr Asp Ile Glu Ser 290 295 300 Pro Pro Ser Glu Val Gly Thr Lys Ile Leu Gly Gly Tyr His Phe Glu 305 310 315 320 Asn Asp Asp Gly Trp Ile Ala Pro Gly His Asn Ser Val Leu Ile Asp 325 330 335 Gly Asn Asp Tyr Tyr Ile Ile His His Ala Arg Gly Ala Leu Asp Lys 340 345 350 Asn Trp Pro Tyr Leu His Val Arg Lys Ile Leu Trp Thr Asp Asp Gly 355 360 365 Trp Pro Val Val Ser Pro Glu Arg Tyr Ala Gly Glu Lys Glu Gln Val 370 375 380 Leu Ser Lys Asp Leu Val Val Gly Ser Trp Glu Arg Ile Val Leu Asp 385 390 395 400 Pro Tyr Asp Tyr Leu Gln Ser Glu Pro Val Lys Ile Thr Leu Leu Lys 405 410 415 Ser Gly Lys Ile Asn Ser Glu Asn Ser Ser Asp Phe Trp Thr Phe Ile 420 425 430 Ser Pro Asn Thr Ile Lys Leu Asn Trp Cys Lys Gly Lys Thr Lys Lys 435 440 445 Val Tyr Glu Val Glu Thr Val Lys Val Ile Pro Ala Trp Asp Trp Glu 450 455 460 Asn Trp Lys Pro Thr Leu Val Phe Thr Gly Leu Ser Asn Lys Gly Ile 465 470 475 480 Ala Val Trp Gly Lys Lys Val Lys Glx 485 <210> 4 <211> 1467 <212> DNA <213> Caldicellulosiruptor saccharolyticus <400> 4 atgggtaaaa tcagttttcg aaaactgaaa ctatttattt tggttactat tatctcaata 60 attattgtaa atactaattt ttcaaaaggt gataattcga aaatgaataa aattatttac 120 cccaaagcac ctccaaaagt aaccttatat gatctgtcaa ttataaacga tgaaaagaag 180 tggacggtca acaatgttca tgaccctgca attatcaaag ctgataacgg atggtactat 240 atatactcta ctgatgtaaa agttggaggt gtgccaaaac caggaataca aattcgaaaa 300 tcaaaagatt tgattaactg gcagtttgtt ggatatgtat tcaatggaaa agattatgtt 360 tatggtggta ttccaaaagg tgcttatgaa tggacccagg caacaaatct ttgggctcca 420 gatataaaaa agatgaatgg aaaatactac ctttattatg ctgcatctca atttggaaag 480 aatcaatcgt atattggttt agccacagct acaaatccag aagggccatg gaaagatgaa 540 ggtgaggtta taaaaacaaa acaaggtgat gttgtcaacg caattgaccc atgccttaca 600 tttgatgcca acggtcagcc ctggcttgtg tacggttctt tctttggtgg aatatatata 660 ataaaaattg acaaaaagac aggaaaacca gccgaaaaag gctttggcaa acttattgca 720 agaagagata tgagtgttca aggtgctatt gaaggacctt atataatcta caacccaaag 780 tttaagaagt attatctttt tgtctcatat gattcactgt ttaacgatta caatgttcgt 840 gttggaaggt cagacaaaat tactggacct tatgtggatt acaatggtaa acttatgact 900 gatattgaat ctcccccttc tgaagttgga actaagattt taggtggcta ccattttgaa 960 aatgatgatg gttggattgc accaggacat aattccgtac tgatagatgg aaacgattac 1020 tatataatcc atcatgcaag gggagctttg gataaaaact ggccttattt gcatgtgcga 1080 aaaatcctgt ggacagatga tggatggcct gttgtatcac ctgaaagata tgcgggtgaa 1140 aaagaacagg ttctgtctaa agacttggtt gttggaagtt gggaaaggat agtgcttgac 1200 ccgtatgact atctccagtc agagccagta aaaattactc ttcttaagag tggaaagata 1260 aattctgaaa atagtagcga cttttggaca tttatttccc caaatacaat aaaacttaac 1320 tggtgtaaag gcaaaaccaa aaaagtctat gaagttgaaa cagtcaaggt aataccggcg 1380 tgggattggg agaactggaa gccaaccttg gtcttcactg gtcttagcaa caaaggaatt 1440 gcagtgtggg gaaagaaagt aaaataa 1467 <210> 5 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 tttggatcca tgaaaaaagc aaaagtcatc ta 32 <210> 6 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 tttctgcagt taattttctc tcttcttcaa tctg 34

Claims (8)

1. 서열번호 1의 알파-엘-아라비노퓨라노시데이즈(α-L-arabinofuranosidase)와 서열번호 3에 기재된 아미노산 서열을 가지는 엔도-1,5-알파-엘-아라비난에이즈를 디브랜치드 아라비난에 처리하여 아라비난(arabinan) 기질로부터 엘-아라비노스(L-arabinose)를 생산하는 방법에 있어서, 디브랜치드 아라비난 기질의 경우에 상기 알파-엘-아라비노퓨라노시데이즈(α-L-arabinofuranosidase)와 엔도-1,5-알파-엘-아라비난에이즈의 최적 조합 비율은 1:3이고 pH 6.5, 및 75℃에서 수행하는 것을 특징으로 하는 아라비난(arabinan) 기질로부터 엘-아라비노스(L-arabinose)를 생산하는 방법.
   
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