KR101217866B1

KR101217866B1 - 혈관신생 억제용 약학 조성물 및 혈관신생 억제용 활성물질을 스크리닝하는 방법

Info

Publication number: KR101217866B1
Application number: KR1020100079858A
Authority: KR
Inventors: 이윤진; 이윤실; 이해준; 최서현; 김경중
Original assignee: 한국원자력의학원
Priority date: 2010-08-18
Filing date: 2010-08-18
Publication date: 2013-01-03
Also published as: US9149505B2; KR20120017265A; WO2012023811A3; US20130184336A1; WO2012023811A2

Abstract

본 발명은 HSP27(Heat Shock Protein 27) 또는 HSP27을 암호화 하는 핵산을 포함하는 혈관신생 억제용 약학 조성물을 제공한다. 또한, 본 발명은 HSP27(Heat Shock Protein 27) 또는 HSP27을 암호화 하는 핵산을 포함하는 암 치료용 약학 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 HSP27를 이용하여 in vitro에서 혈관내피세포의 성장을 억제하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은
혈관내피세포주를 시료들 각각으로 처리하는 단계;
혈관내피세포주 내의 HSP27의 함량을 측정하는 단계; 및
혈관내피세포주 내의 HSP27의 함량이 대조군에 비해 증가된 시료를 선택하는 단계를 포함하는 혈관신생 억제용 활성물질 또는 암 치료용 활성물질을 스크리닝하는 방법을 제공한다.

Description

혈관신생 억제용 약학 조성물 및 혈관신생 억제용 활성물질을 스크리닝하는 방법{A pharmaceutical composition for inhibiting angiogenesis and a method of screening an active material for inhibiting angiogenesis}

본 발명은 혈관신생 억제용 약학 조성물 및 혈관신생 억제용 활성물질을 스크리닝하는 방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 혈관내피세포 성장을 저해하는 것으로 밝혀낸 열충격 단백질(Heat Shock Protein)를 포함하는 혈관신생 억제용 약학 조성물, 암 치료용 약학 조성물, 그 열충격 단백질의 함량을 증가시키는 물질을 선택함으로써 혈관신생 억제용 활성물질을 스크리닝하는 방법, 및 그 열충격 단백질의 함량을 증가시키는 물질을 선택함으로써 암 치료용 활성물질을 스크리닝하는 방법에 관한 것이다.

혈관신생(angiogenesis)은 기존 혈관의 내피세포가 세포외 기질을 분해하고, 이동, 분열, 및 분화하여 새로운 모세혈관을 형성하는 현상으로, 성장과 생식, 상처치유 등의 특별한 경우를 제외하고는 발생하지 않는다. 그러나, 악성 종양의 성장과 전이, 연령관련 황반변성(age-related macular degeneration), 류마티스성 관절염(rheumatoid arthritis), 당뇨병성 망막변증(diabetic retinopathy), 건선(psoriasis), 및 만성염증(chronic inflammation)과 같은 질병에서 과도한 혈관신생이 보고되고 있으며(Cameliet and Jain, Nature, 407:249, 2000), 이러한 이유로 신생혈관 억제제를 이용하여 혈관신생관련 질병의 치료, 특히 악성 종양을 치료하기 위한 연구가 이루어지고 있다(한국특허공개 2008-0109417).

혈관형성은 혈관내피세포의 성장, 이동, 분화, 모세혈관 형성 등의 복잡한 일련의 과정이 필요하며, 이러한 과정에 관여하는 많은 혈관신생 촉진인자와 혈관신생 억제인자들이 발견되었다. 혈관신생 억제인자들은 혈관신생 시 필요한 혈관신생 촉진인자들의 활성에 반대하여 활성화된다. 체내에 자연적으로 존재하는 혈관신생 억제제들은 독성이 적어 병리적인 혈관신생 억제에 사용될 수 있으므로 이와 관련된 많은 약물들이 개발 중에 있다.

혈관내피세포성장인자(VEGF: vascular endothelial growth factor)는 혈관형성을 조절하는 대표적인 단백질이다. VEGF는 in situ에서 내피 전구체(혈관 모세포)의 분화로부터의 새로운 혈관형성을 조절하며, 배아조직, 대식세포, 상처치유 동안의 증식 상피 각질세포에서 발현되고, 염증과 결부된 조직부종의 원인이 될 수 있다. In situ 하이브리다이제이션 연구에 의하면, 다형성 아교 모세포종, 혈관모세포종, 중추신경계 신생물 및 에이즈-결부 카포시 육종을 포함하여 다수의 인간 종양주에서 VEGF가 고도로 발현된다는 것이 증명되었다(한국특허공개 2008-109417).

VEGF는 혈관내피세포에 존재하는 VEGF 수용체 1, 2, 또는 3(VEGFR1, VEGFR2, VEGFR3)과 결합하여 VEGF 수용체(VEGFR)의 타이로신 인산화를 유도하여 혈관내피세포의 활성화를 가져오며, 결국 혈관신생과정에 중요한 영향을 미치게 된다. 그 중 VEGFR2의 인산화는 신생혈관 신호전달기전에 있어서 가장 중요한 역할을 하는 수용체이다. VEGF는 혈관신생이 관여되는 악성 종양세포에서 상향조절되고, 그의 수용체가 종양 침윤 혈관내피세포에서 상향조절되지만, 혈관신생과 결부되지 않은 정상세포에서는 VEGF 및 그의 수용체의 발현은 낮다. 따라서, 이러한 정상세포는 VEGF와 그의 수용체 사이의 상호작용을 차단하여 혈관 신생이 억제되고, 따라서 종양성장이 일어나지 않는다.

고수준의 VEGFR2는 신경교종에 침윤하는 내피세포에 의해 발현되며, 인간 아교모세포종에 의해 생성된 VEGF에 의해 특이적으로 상향조절된다. VEGFR2 전사체는 정상 뇌 내피세포에서는 거의 검출되지 않기 때문에, 아교모세포종 관련 내피세포(GAEC)에서 고수준의 VEGFR2가 발현되는 것은 종양 형성 동안 수용체 활성이 유도된다는 것을 나타낸다.

그러므로, 종양성장부위에서 발현되는 VEGF의 활성을 억제하여 혈관신생을 억제함으로써, 종양성장을 억제하여 암 치료에 이용하고자 하는 연구가 활발하게 진행되고 있다. 이러한 VEGF를 타겟으로 하는 약물 중 임상적으로 사용되는 가장 대표적인 약물은 Avastin 이며, VEGF 중화항체에 해당하며 항종양제로서 FDA 승인을 받았다.

한편, 저분자 열충격 단백질 27(Heat Shock Protein 27)은 활성산소(free radical), 열(heat), 독소(toxins)와 같은 외부환경적인 요인에 대하여 스스로 군집을 형성하여 이러한 스트레스에 대한 방어 능력을 가지는 샤페론(Charperon) 기능을 가지는 저분자량을 가지는 단백질이다(NCBI Gene Bank Accession Number: NP_001531.1). 본 발명자들은 저분자량의 열충격 단백질 27(이하 사람에서는 HSP27, 쥐에서는 HSP25)이 분비되는 것을 확인한 바 있다. 이러한 HSP27은 암세포의 사멸을 유도하는 단백질과 결합하여 암세포의 방사선 및 항암제에 대한 저항력을 증가시키는 등의 여러 기능이 알려져 있다(Oncogene. 2005 26;24(23):3715-25). 그러나, HSP27의 VEGF의 기능 억제, 혈관신생 억제, 또는 암 치료 효과와의 상호관계에 대해서는 전혀 알려져 있는 바가 없다.

이에 본 발명자들은 혈관신생 억제에 효과적인 물질을 개발하기 위해 연구한 결과 HSP27이 VEGF에 의한 VEGFR2의 활성화를 저해하여 혈관내피세포의 성장을 저해한다는 것을 최초로 발견하였으며, 이에 기초하여 혈관신생 억제용 조성물 및 혈관신생 억제용 활성물질을 스크리닝 하는 방법을 개발하게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 새로운 혈관신생 억제용 약학 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 암 치료용 약학 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 in vitro에서 혈관내피세포의 성장을 억제하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 혈관신생 억제용 활성물질을 스크리닝하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 암 치료용 활성물질을 스크리닝하는 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 HSP27(Heat Shock Protein 27)을 포함하는 혈관신생 억제용 약학 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 HSP27을 포함하는 암 치료용 약학 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 HSP27(Heat Shock Protein 27)을 암호화하는 핵산을 포함하는 혈관신생 억제용 약학 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 HSP27(Heat Shock Protein 27)을 암호화하는 핵산을 포함하는 암 치료용 약학 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 HSP27를 이용하여 in vitro에서 혈관내피세포의 성장을 억제하는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은

혈관내피세포주를 시료들 각각으로 처리하는 단계;

혈관내피세포주 내의 HSP27의 함량을 측정하는 단계; 및

혈관내피세포주 내의 HSP27의 함량이 대조군에 비해 증가된 시료를 선택하는 단계를 포함하는 혈관신생 억제용 활성물질을 스크리닝하는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은

혈관내피세포주를 시료들 각각으로 처리하는 단계;

혈관내피세포주 내의 HSP27의 함량을 측정하는 단계; 및

혈관내피세포주 내의 HSP27의 함량이 대조군에 비해 증가된 시료를 선택하는 단계를 포함하는 암 치료용 활성물질을 스크리닝 하는 방법을 제공한다.

이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.

본 발명에서 사용되는 모든 기술용어는, 달리 정의되지 않는 이상, 본 발명의 관련 분야에서 통상의 당업자가 일반적으로 이해하는 바와 같은 의미로 사용된다. 또한 본 명세서에는 바람직한 방법이나 시료가 기재되나, 이와 유사하거나 동등한 것들도 본 발명의 범주에 포함된다. 본 명세서에 참고문헌으로 기재되는 모든 간행물의 내용은 전체가 본 명세서에 참고로 통합된다.

본 발명이 제공하는 혈관신생 억제용 약학 조성물 또는 암 치료용 약학 조성물은 HSP27을 포함하는 것을 특징으로 하며, 이는 본 발명자가 HSP27에 의해 VEGFR2의 인산화가 감소하며, HSP27의 기능을 저해시킬 경우 VEGFR2의 인산화가 증가하고, 실제 HSP27을 혈관내피세포에 처리한 결과 혈관내피세포의 성장이 감소하고, 암을 갖는 동물에게 투여할 경우 항암효과가 있다는 것을 최초로 발견한 것에 기초한 것이다.

본 발명자는 구체적으로, 인간의 혈관내피세포(HUVEC) 배양물에 VEGF를 단독으로 처리하거나, HSP27 단백 혹은 HSP27 중화항체를 처리한 후 VEGF를 처리한 경우, VEGF 단독 처리군은 대조군에 비해 혈관내피세포 성장율이 증가하였으며, HSP27과 VEGF의 조합 처리군이 VEGF 단독 처리군에 비해 혈관내피세포 성장률이 현저히 감소하였으며, HSP27 중화항체와 VEGF의 조합 처리군이 VEGF 단독 처리군에 비해 혈관내피세포 성장률이 현저히 증가하는 것을 확인하였다(도 1). 또한, 인간의 혈관내피세포(HUVEC) 배양물에 HSP27 단백 혹은 HSP27 중화항체를 처리한 후 VEGF를 처리한 다음, phsopho-VEGFR2, VEGFR2, 및 HSP27의 함량을 측정한 결과 HSP27 단백 처리군의 경우 phospho-VEGFR2의 함량이 대조군(IgG 투여)에 비해 현저히 감소하였고, VEGFR2 및 HSP27의 함량은 거의 변화가 없었으며(도 2), HSP27 중화항체 처리군의 경우 phospho-VEGFR2의 함량이 대조군(IgG 투여)에 비해 현저히 증가하였고, VEGFR2 및 HSP27의 함량은 거의 변화가 없는 것으로 나타났다(도 3). 또한, 마우스대퇴부에 대장암 세포주를 주입하여 종양을 성장시킨 다음, HSP25 단백을 투여한 결과 HSP25 단백은 종양혈관의 과도한 형성을 억제시키고 대장암세포주의 성장을 저해하는 것으로 확인되었다(도 4 및 도 5).

따라서, 이러한 실험 결과로부터 HSP27의 경우 혈관내피세포의 성장을 억제하며, HSP27의 기능 저해제(예: HSP27 중화항체)는 혈관내피세포의 성장을 촉진하는 것으로 확인되었다. 이는 HSP27이 VEGFR2의 인산화를 억제하는 작용에 의한 것이라는 것을 알 수 있다. 또한, HSP27은 혈관내피세포 성장의 억제를 통해 항암 효과가 있다는 것을 알 수 있다. 그러므로, HSP27 또는 HSP27의 발현을 증진시키는 물질은 혈관신생 억제에 효과가 있으며, 악성 종양의 치료에 효과가 있다고 할 수 있다.

따라서, 본 발명은 HSP27을 포함하는 혈관신생 억제용 약학 조성물을 제공한다.

상기 혈관신생은 종양의 성장과 전이, 연령관련 황반변성, 류마티스성 관절염, 당뇨병성 망막변증, 건선, 또는 만성염증에 수반하는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며, 혈관신생이 질병을 유발하거나 진행시키는 임의의 질환에 수반되는 것일 수 있다.

상기 암은 대장암, 췌장암, 대장직장암, 전립선암, 신장암, 흑색종, 전립선암의 골전이암, 난소암, 또는 혈액암일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며, 혈관신생이 관여되는 임의의 암을 포함한다.

상기 혈관신생 억제용 약학 조성물 및 암 치료용 약학 조성물에 함유되는 HSP27의 아미노산 서열 및 핵산 서열은 NCBI Gene Bank Accession Number: NP_001531.1 및 NM_001540.3 에 등재되어 있다. 본 발명의 약제학적 조성물에 포함되는 HSP27은 천연 기원의 HSP27, 재조합 기원의 HSP27, 또는 이러한 단백질들의 변이체를 포함하는 것이다.

아미노산 서열 변이체중 치환 변이체에서 하나 이상의 아미노산은 유사한 극성의 또 다른 아미노산 서열로 치환될 수 있다. 아미노산의 치환은 그 아미노산이 속하는 부류의 다른 아미노산으로 치환될 수 있으며, 이러한 아미노산의 부류는 비극성(소수성) 아미노산(예: 알라닌, 루이신, 이소루이신, 발린, 프롤린, 페닐알라닌, 트립토판, 메티오닌 등), 극성 중성 아미노산(예: 글리신, 세린, 트레오닌, 시스테인, 티로신, 아스파라긴, 글루타민 등), 양전하(염기성) 아미노산 (예: 아르기닌, 리신, 히스티딘 등), 음전하(산성) 아미노산(예: 아스파르트산, 글루탐산 등)을 예시할 수 있다.

또 다른 아미노산 서열 변이체로는 하나 이상의 아미노산의 결실, 삽입 또는 이들의 조합에 의한 변이체를 예시할 수 있다.

아미노산 서열 변이체는 통상의 카세트 돌연변이유발 또는 기타 당해 기술분야에 잘 알려진 기술을 이용하여 HSP27 단백질을 암호화 하는 DNA에서 뉴클레오티드의 부위 지정 돌연변이를 유발하여 변이체를 코딩하는 DNA를 제작한 후 이 DNA를 재조합 세포배양을 통해 발현시킴으로써 제조된다. 이러한 아미노산 서열 변이체는 전형적으로 천연형과 기능적으로 동일한 생물학적 활성을 나타내는 것이다. 아미노산의 치환은 전형적으로 단일 염기의 치환이나, 기능적으로 동일한 생물학적 활성을 나타내는 한 하나 이상의 치환도 가능하며, 삽입은 통상적으로 약 1 개 내지 20 개의 아미노산의 연속서열로 이루어질 수 있으나, 보다 큰 삽입 또한 가능할 수 있다. 결실의 범위는 통상 약 1 개 내지 30개의 잔기이나, 일부의 경우에는 도메인 중 하나가 결실될 수 있는 것과 같이 보다 큰 결실 또한 가능할 수 있다. 변이체는 전형적으로 천연형과 동일한 생물학적 활성을 나타내는 기능적 등가물이나, 필요에 따라서는 이의 단백질의 특성을 변형시킨 변이체가 선택될 수 있다.

또한, HSP27 단백질은 미리스틸화, 포스포릴화, 글리코실화, 단백 분해 절단 등을 포함한 해독 후 변형을 포함한다.

이러한 HSP27 단백질은 당해 기술분야에 통상적으로 알려진 방법을 이용하여 천연기원의 공급원으로부터 분리하거나 화학적 합성 방법을 이용하여 합성하거나 HSP27 단백질을 암호화하는 재조합 발현 벡터를 적합한 숙주 내로 도입하여 트랜스펙턴트를 배양한 후 이로부터 분리할 수 있다.

배양액 또는 세포 추출물을 함유한 HSP27 단백질의 분리 및 정제는 여러 공지된 방법에 따라 실시할 수 있다. 이러한 분리 및 정제 방법의 예로는 염 침전 및 용매 침전과 같은 용해성을 이용한 방법, 투석, 한외여과, 겔 여과, 및 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동과 같은 분자량의 차이를 이용한 방법, 이온-교환 컬럼 크로마토그래피와 같은 전하의 차이를 이용하는 방법, 역상 고성능 액체 크로마토그래피와 같은 친수성의 차이를 이용한 방법 및 등전점 포커싱 전기영동과 같은 등전점의 차이를 이용한 방법 등을 예시할 수 있다.

또한, 본 발명은 다른 측면에 있어서, HSP27을 암호화 하는 핵산을 포함하는 혈관신생 억제용 약학 조성물을 제공한다.

상기 혈관신생은 종양의 성장과 전이, 연령관련 황반변성, 류마티스성 관절염, 당뇨병성 망막변증, 건선, 또는 만성염증에 수반하는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며, 상기 혈관신생은 질병을 유발하거나 진행시키는 임의의 질환에 수반되는 것일 수 있다.

또한, 본 발명은 HSP27을 암호화 하는 핵산을 포함하는 암 치료용 약학 조성물을 제공한다.

상기 본 발명의 약학 조성물에 포함되는 핵산은 HSP27을 암호화 하는 서열로서, 자연에서 분리되거나 인위적으로 합성 변형된 것일 수 있다.

이러한 핵산 서열은 단일쇄 또는 이중쇄일 수 있으며, DNA 분자(게놈, cDNA 또는 합성) 또는 RNA 분자일 수 있다. RNA 분자는 인트론을 포함하는 DNA 분자에 상응하는 HnRNA 분자 및 인트론을 포함하지 않는 mRNA 분자를 포함할 수 있다. 또한, 추가의 암호화 서열 또는 비암호화 서열을 포함할 수도 있다.

상기 HSP27을 암호화하는 핵산은 하나 이상의 핵산 염기가 치환, 결실 또는 삽입에 의해 변형될 수 있으며, 이러한 변형에 의해 발현된 단백질은 이의 생물학적 작용성에 유의한 변화를 포함하지 않아야 한다. 상기 변형은 이종성의 상동성 유전자로의 변형을 포함한다.

상기 HSP27을 암호화하는 핵산은 이를 발현하는 벡터에 작동적으로 연결된 재조합 발현 벡터로서 제공될 수 있다. HSP27 유전자 발현 벡터는 플라스미드, 파아지, 코스미드, 바이러스 벡터 등을 포함한다. 벡터는 자가 복제하거나 숙주 DNA에 통합될 수 있다.

HSP27 핵산분자는 프로모터/인핸서 서열과 같은 발현 조절 서열 및 기타 전사, 해독 또는 프로세싱에 필요한 서열들과 함께 결합될 수 있다. 조절 서열은 뉴클레오티드의 구성적 발현(constitutive expression)을 지시하는 것뿐만이 아니라 조직-특이적 조절 및/또는 유도성 서열을 포함한다. 발현 벡터의 설계는 트랜스펙션 시킬 숙주 세포, 목적하는 발현 수준 등과 같은 요소에 의해 결정될 수 있다.

상기 HSP27을 발현하는 발현벡터는 바람직하게는 바이러스 벡터이며, 예를 들어 복제 결손 레트로바이러스, 아데노바이러스, 아데노바이러스-연관 바이러스 등이 포함된다. 바이러스 벡터는 다음의 기준을 충족해야 한다: (1) 목적하는 세포를 감염시킬 수 있어야 하며 이에 따라 적합한 숙주 범위를 갖는 바이러스 벡터가 선택되어야 하고, (2) 전달된 유전자가 적절한 기간 동안 세포에서 보존되고 발현될 수 있어야 하며, (3) 벡터가 숙주에 안전해야 한다. 세포내로 유전자 전달을 위해 사용할 수 있는 다른 바이러스 벡터로는 뮤린 백혈병 바이러스(MLV), JC, SV40. 폴리오마, 엡스타인-바 바이러스, 파필로마 바이러스, 백시니아, 폴리오바이러스, 헤르페스 바이러스, 신드비스 바이러스, 렌티 바이러스, 기타 사람 및 동물 바이러스가 포함될 수 있다.

본 발명의 HSP27을 포함하는 약학 조성물은 약제학적 분야에서 통상적인 방법에 따라 국소투여용 제제 또는 주사제로서 제형화시켜 투여할 수 있다.

이러한 국소 투여용 제제 또는 주사제는 당해 기술분야에 공지되어 있는 통상의 주사제 제조방법에 따라 제조될 수 있다.

국소 투여용 제제는 치료가 필요한 부위로의 피부를 통한 투과에 적합한 액상 또는 반액상 제제를 포함한다. 액상 제제의 예로는 국소 용액이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 반액상 제제의 예로는 리니멘트, 로숀, 크림, 연고, 또는 페이스트, 겔, 에뮤겔 등이 있으나, 이에 한정되지는 않는다. 이러한 약제학적 성분은 통상적으로 사용되며 약제학적 제제의 당해 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자들이 일반적으로 인식하고 있는 것들이다.

본 발명의 국소 용액은 수성 또는 유성의 용액 또는 현탁제로서 제조될 수 있다. 이러한 제제는 바람직하게는 계면활성제를 포함하는, 살균제(bactericidal agent) 및/또는 살진균제 및/또는 그 외의 적절한 보존제의 적절한 수성 용액에 약제학적 화합물을 용해함으로써 제조될 수 있다. 유성 용액의 제조에 적합한 용매로는 글리세롤, 희석된 알콜, 및 프로필렌 글리콜이 있다. 선택적으로는, L-메탄올을 국소 용액에 부가할 수 있다.

본 발명에 따른 로숀 및 리니멘트제는 멸균 수성 용액과 선택적으로 살균제를 함유하는 피부에 적용하기에 적절한 것을 포함한다. 또한, 알콜 또는 아세톤과 같은 피부의 건조와 냉각을 촉진하는 제제, 및/또는 글리세롤 또는 피마자유나 땅콩유와 같은 오일과 같은 보습제를 포함할 수 있다.

크림, 연고제, 또는 페이스트는 반고형 제제이다. 이러한 반고형 제제는 미세하게 분배된 또는 파우더 형태의 약제학적으로 허용 가능한 염을 혼합함으로써, 유지상의 또는 비유지상의 베이스와 함께 적절한 기계의 도움으로 단독으로 또는 수성이나 비수성의 유체에서의 용액이나 현탁액으로 제조될 수 있다. 상기 베이스는 탄화수소를 함유할 수 있다. 탄화수소의 예로는 경질, 연질, 또는 액상 파라핀, 글리세롤, 밀납, 금속 비누, 점액질, 천연 원료 오일(예: 아몬드유, 옥수수유, 땅콩유, 또는 올리브유), 울 지방, 또는 그 유도체, 및/또는 지방산(예: 스테아르산, 또는 올레산)이 있으나 이에 한정되지는 않는다. 상기 제제는 또한 음이온, 양이온, 또는 비이온성 계면활성제와 같은 계면활성제를 함유할 수 있다. 계면활성제의 예로는 소르비탄 에스테르 또는 그의 폴리옥시에틸렌 유도체(예: 폴리옥시에틸렌 지방산 에스테르), 및 그의 카르복시메틸렌 유도체(예: 카르보폴)가 있다. 천연 검과 같은 현탁화제, 규소 실리카와 같은 셀룰로오스 유도체 무기물, 및 라놀린과 같은 기타 성분이 포함될 수 있다. 연고제의 경우에는, 폴리에틸렌 글리콜 540, 폴리에틸렌 글리콜 3350, 및 프로필 글리콜 또한 약제학적 화합물과 함께 혼합하여 사용할 수 있다.

본 발명의 겔 또는 에뮤겔 제제는 약제학적 제제에 통상적으로 사용되는 임의의 겔 형성 시약을 포함한다. 겔 형성 제제의 예로는 메틸 셀룰로오스, 히드록시에틸 셀룰로오스, 및 카르복시메틸 셀룰로오스와 같은 셀룰로오스 유도체; 폴리비닐 알콜, 폴리비닐 피롤리돈과 같은 비닐 폴리머; 및 카르보폴과 같은 카르복시폴리-메틸렌 유도체가 있다. 본 발명에 사용될 수 있는 또 다른 겔 형성 제제는 펙틴, 검(예: 아라비아검, 트라가칸타검, 알긴산(alginate), 카라기네이트(carrageenate), 한천, 및 젤라틴)이다. 바람직한 겔 형성 제제는 카르보폴이다. 또한, 겔 또는 에뮤겔 제제는 보존제, 항산화제, 안정화제, 발색제, 및 향료와 같은, 이러한 종류의 제제에 통상적으로 사용되는 보조제를 함유할 수 있다.

상기 언급된 제제에 사용되는 부형제 및 보조제와 제제의 제조방법은 당해 기술분야에 널리 알려져 바에 따라 선택하고 제조할 수 있다(예를 들어 Remington's Pharmaceutical Science 최신판에 기재된 방법들).

본 발명의 HSP27을 포함하는 약학 조성물의 투여량 및 투여시기는 투여대상의 나이, 성별, 상태, 체중, 투여경로, 투여 횟수, 약의 형태에 따라서 달라진다. 일일 투여량은 약 0.01 ug/kg 내지 10g/kg이고, 바람직하게는 0.01 mg/kg 내지 100mg/kg 이다.

본 발명의 HSP27 단백질을 암호화하는 핵산을 포함하는 약학 조성물의 유효량은 대상자의 크기 및 체중, 질병의 진행 정도, 나이, 건강상태, 성별, 투여경로 및 국소 또는 전신 투여와 같은 인자를 고려하여 용이하게 결정할 수 있다. 일반적으로, 본 발명의 HSP27 단백질을 암호화하는 핵산의 유효량은 질병부위 또는 이와 인접한 부위에서 약 1 nM 내지 약 100 nM의 세포간 농도를 포함한다. 필요에 따라서 상기 농도보다 더 높게 또는 더 낮게 투여될 수 있다.

본 발명의 HSP27 단백질을 암호화하는 핵산은 직접 주사하거나 전달시약과 조합하여 그 자체로써 또는 이들을 발현하는 재조합 플라스미드 또는 바이러스 벡터로써 대상자에게 투여될 수 있다. 바이러스 벡터의 경우, 바이러스 벡터를 함유하는 재조합 바이러스의 양은 10³ 내지 10¹² pfu/kg 범위이다. 적절한 전달시약으로는 리포펙틴, 리포펙타민, 셀펙틴, 고분자양이온(예, 폴리리신) 또는 리포좀을 포함한다. 본 발명의 HSP27 단백질을 암호화하는 핵산을 포함하는 약학 조성물은 gene gun, 초음파 또는 전기충격 등을 이용하여 세포 내로 전달할 수 있다.

본 발명에 따르면, HSP27은 VEGFR2의 인산화를 억제하여 혈관내피세포의 성장을 저해하는 효과가 있으므로, 혈관내피세포의 성장을 억제시키는데 사용될 수 있다.

따라서, 본 발명은 다른 측면에 있어서, HSP27를 이용하여 in vitro에서 혈관내피세포의 성장을 억제하는 방법을 제공한다.

HSP27은 앞서 설명한 바와 같은 천연 기원의 HSP27, 재조합 기원의 HSP27, 또는 이러한 단백질들의 변이체가 이용될 수 있으며, 혈관내피세포의 성장 억제는 억제시키고자 하는 혈관내피세포에 천연 기원의 HSP27, 재조합 기원의 HSP27, 또는 이러한 단백질들의 변이체를 단지 부가함으로써 이루어질 수 있다.

또한, 본 발명에 따르면, HSP27 단백질은 VEGFR2의 인산화를 억제함으로써 혈관신생을 감소시키므로, 미지의 물질들 중에서 HSP27의 발현을 증가시키는 물질을 선택함으로써 혈관신생 억제용 활성물질을 선별할 수 있다.

따라서, 본 발명은 또 다른 측면에 있어서, 상기 HSP27 단백질이 VEGFR2의 인산화 억제 의해 혈관신생을 저해한다는 것을 발견한 것에 기초하여 혈관신생 억제용 활성물질을 스크리닝하는 방법을 제공한다.

상기 혈관신생 억제용 활성물질을 스크리닝하는 방법은

혈관내피세포주를 시료들 각각으로 처리하는 단계;

혈관내피세포주 내의 HSP27의 함량을 측정하는 단계; 및

혈관내피세포주 내의 HSP27의 함량이 대조군에 비해 증가된 시료를 선택하는 단계를 포함한다.

또한, 본 발명은 또 다른 측면에 있어서, 상기 HSP27 단백질이 VEGFR2의 인산화 억제 의해 혈관신생을 저해한다는 것을 발견한 것에 기초하여 암 치료용 활성물질을 스크리닝하는 방법을 제공한다.

상기 암 치료용 활성물질을 스크리닝하는 방법은

혈관내피세포주를 시료들 각각으로 처리하는 단계;

혈관내피세포주 내의 HSP27의 함량을 측정하는 단계; 및

상기 HSP27의 함량은 예를 들어 노던블롯방법으로 HSP27의 mRNA의 양을 측정하거나 또는 HSP27 단백질에 대한 항체를 사용하여 HSP27 단백질의 발현량을 측정하여 결정할 수 있으며, 이러한 방법은 당해 기술분야에 공지된 방법을 이용하여 실시할 수 있다.

상기 설명한 바와 같이, 본 발명에 따른 HSP27 또는 HSP27을 암호화 하는 핵산은 혈관신생을 억제하는데 효과가 있을 뿐만 아니라, 이러한 혈관신생 억제효과에 의해 혈관신생과 관련된 다양한 질환의 치료에 효과가 있다. 또한, 본 발명에 따른 HSP27 또는 HSP27을 암호화 하는 핵산은 혈관신생 억제 효과에 의해 암 치료에 효과적으로 이용될 수 있다.

또한, HSP27의 함량의 변화를 측정함으로써 혈관신생 촉진용 활성물질 및 암 치료용 활성물질을 스크리닝할 수 있다. 본 발명에 따른 기술은 세포내 단백질 간의 신호 전달 및 신호 맵핑의 체계적 연구에 의한 신의약 타겟을 발굴하는 진보된 기술이다.

도 1은 HSP27 단백 또는 HSP27 중화항체를 혈관내피세포(HUVEC)에 처리하였을 경우 VEGF에 의한 혈관내피세포의 성장 변화를 MTT 증식 어세이를 이용하여 확인한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 2는 HSP27 단백을 혈관내피세포(HUVEC)에 처리하였을 경우 VEGF에 의한 VEGFR2의 인산화 정도를 웨스턴 블랏팅으로 확인한 결과를 촬영한 사진이다.
도 3은 HSP27 중화항체를 혈관내피세포(HUVEC)에 처리하였을 경우 VEGF에 의한 VEGFR2의 인산화 정도를 웨스턴 블랏팅으로 확인한 결과를 촬영한 사진이다.
도 4는 마우스의 대퇴부에 대장암 세포주를 주입하여 종양을 형성시킨 후, 대조군과 HSP27 투여군의 마우스 대퇴부를 촬영한 사진이다.
도 5는 마우스의 대퇴부에 대장암 세포주를 주입하여 종양을 형성시킨 후, 대조군. HSP27 딘독 투여군, 방사선 단독 조사군, 및 HSP27 및 방사선 병용 투여군의 종양의 부피를 시간의 경과에 따라 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.

이하, 본 발명을 하기 실시예에 의해 더욱 구체적으로 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명에 대한 이해를 돕기 위한 것일 뿐, 어떤 의미로든 본 발명의 범위가 이들에 의해 제한되는 것은 아니다.

실험방법

1) 사용세포주의 배양: 사람의 혈관내피세포(HUVEC)를 Lonza 회사에서 구입하였으며, 혈관내피세포에 필요한 다양한 성장인자들이 포함되어 있는 EGM 배지를 이용하여, 섭씨 37℃, 5% CO₂ 조건의 배양기에서 배양하였다.

2) 혈관내피세포 성장 측정(proliferation assay): 세포를 24 well 세포배양접시에 각 well 당 7000 개의 세포를 깔아서 37℃ CO₂ 배양기에서 24 시간 배양하였다.

1% 우태아 혈청(FBS, GIBCO)를 첨가한 Opti-MEM 배지(GIBCO)에 HSP27(Stressgen, 캐나다)(1ug/ml) 또는 HSP27 중화항체(Stressgen, 캐나다)(0.5ug/ml)를 한 시간 처리한 후 VEGF(30ng/ml)를 첨가하여 3 일 후에 다음과 같이 MTT 어세이를 실시하였다. 배지를 제거하고 PBS 완충용액으로 두 번 세포를 세척한 후 5 mg/ml MTT(Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide) 용액을 각 웰에 100 ul 첨가하여 37℃에 4 시간 반응시켰다. MTT 용액을 제거한 후, 세포에 200 ul 4 mM HCl 용액을 첨가한 후 15 분 Shaker에서 흔들어 반응시킨 후 대조 파장 620 nm를 가진 590 nm에서 흡광도를 측정하였다.

3) 전기영동과 면역반응을 이용한 단백질 분석: 시료 속의 단백질을 분석하기 위하여 우선 PAGE(polyacrylamide gel electrophoresis)를 수행한 후, 웨스턴블랏을 수행하였다. 실험하고자 하는 세포들을 우선 용해용액 [120 mM NaCl, 40 mM Tris (pH 8.0), 0.1% NP40]에 현탁하여 세포들을 터뜨린 다음, 일정량의 단백질을 10% SDS-PAGE를 통해 분자량별로 분리한 다음, 단백질들을 니트로셀룰로오스 멤브레인에 옮긴 다음 면역블롯팅(immunoblotting)을 이용하여 분석하였다.

실시예 1: HSP27 중화항체의 혈관내피세포 성장 촉진 확인

사람의 혈관내피세포주 HUVEC에 HSP27(1ug/ml) 단백 또는 HSP27 중화항체(0.5ug/ml)를 한 시간 처리한 후 사람의 혈관내피세포성장인자(VEGF) 30 ng/ml를 처리한 후 3일 후에 MTT 분석법을 통해 세포성장 정도를 측정하였다. HSP27 단독 처리군, HSP27 중화항체 단독 처리군, VEGF 단독 처리군, VEGF 및 HSP27 조합 처리군, VEGF 및 HSP27 중화항체 조합 처리군에 대한 세포성장 정도를 측정한 결과를 도 1에 나타내었다.

도 1은 HSP27 단백 또는 HSP27 중화항체를 혈관내피세포(HUVEC)에 처리하였을 경우 VEGF에 의한 혈관내피세포의 성장 변화를 MTT 증식 어세이를 이용하여 확인한 결과를 나타낸 그래프이다.

도 1에 따르면, HSP27 및 VEGF 조합 처리군의 세포들은 VEGF 단독 처리군에서의 혈관내피세포 성장률보다 적었고, 반면 HSP27 중화항체 및 VEGF를 조합 처리군의 혈관내피세포성장률은 VEGF단독 처리군에 보다 현저히 증가히였다. HSP27 및 HSP27 중화항체 각각의 단독 처리군은 세포성장률에 변화를 주지 않았다.

실시예 2: HSP27 중화항체의 VEFGR2 인산화 촉진 효과 확인

사람의 혈관내피 세포주 HUVEC에 HSP27(1ug/ml)단백 또는 HSP27 중화항체(0.5ug/ml)를 한 시간 처리한 후 사람의 혈관내피세포성장인자(VEGF) 30 ng/ml를 5분 처리하여 세포를 분획하여, Phospho-VEGFR2, VEGFR2, HSP27중화항체(Stressgen, 캐나다)를 이용하여 웨스턴 블랏팅을 실시하였다. 단백질의 동량정량 확인을 위해 β-actin 항체로 웨스턴 블랏팅을 실시하였다. HSP27 단백을 처리한 군의 Phospho-VEGFR2, VEGFR2, HSP27의 정량 결과를 도 2에, HSP27 중화항체을 처리한 군의 Phospho-VEGFR2, VEGFR2, HSP27의 정량 결과를 도 3에 나타내었다.

도 2는 HSP27 단백을 혈관내피세포(HUVEC)에 처리하였을 경우 VEGF에 의한 VEGFR2의 인산화 정도를 웨스턴 블랏팅으로 확인한 결과를 촬영한 사진이다.

도 3은 HSP27 중화항체를 혈관내피세포(HUVEC)에 처리하였을 경우 VEGF에 의한 VEGFR2의 인산화 정도를 웨스턴 블랏팅으로 확인한 결과를 촬영한 사진이다.

도 2에 따르면, VEGF에 의한 VEGFR2의 인산화는 재조합 HSP27 단백질(1ug/ml, 3ug/ml)을 세포에 전처리하였을 경우 현저히 감소하는 것을 확인할 수 있었다. 이에 반해, VEGFR2 발현양과 HSP27 발현에는 영향을 주지 않는 것으로 확인되었다.

도 3에 따르면, VEGF에 의한 VEGFR2의 인산화는 HSP27 중화항체를 전처리하였을 경우 현저히 증가하는 것을 확인 할 수 있었다. 이에 반해, VEGFR2 발현량과 HSP27 발현량에는 영향을 주지 않는 것으로 확인되었다.

실시예 3: 마우스에서의 HSP27의 종양 형성 억제 효과 확인

Balb/C 누드 마우스 총 28마리를 한 군당 7 마리씩 4 개의 군으로 나누고, 각각 대조군, HSP25 단독투여군, 방사선 단독투여군, HSP25 및 방사선 병용 투여군으로 나누었다.

마우스 대장암 세포주 CT26 1X10⁶ 개를 Balb/C 누드 마우스의 대퇴부에 주입하여 종양의 크기가 200 mm³ 가 되었을 때, HSP25 단백(2.5ug)을 종양부위에 주입한 다음 하루 후에 8 Gy 방사선을 부분 조사하였다. 3일 간격으로 HSP25 단백을 두 번 더 주입한 후 마우스의 종양크기를 관찰하였다. 대조군은 HSP25 단백, 방사선을 전혀 주입하지 않고, 대신 BSA(우태아 혈청 알부민)을 HSP25 투여시 동량으로 주입하였으며, HSP25 단독투여군에는 방사선 조사 없이 HSP25만을 투여하였고, 방사선 단독투여군에는 HSP25 없이 방사선만을 조사하였다.

그런 다음, HSP25 투여 시작 후 10일 후의 대조군과 HSP25 단독 투여군의 마우스의 대퇴부 사진을 촬영한 결과를 도 4에 나타내었다.

또한, HSP25 투여 시작 후 날짜의 경과에 따라 각 투여군의 마우스의 종양의 부피를 측정한 결과를 도 5에 나타내었다.

도 4에 따르면 HSP25 단백은 종양혈관의 과도한 형성을 억제시키고 대장암세포주의 성장을 저해하는 것으로 확인되었다. 또한, 도 5에 따르면 HSP25를 방사선과 병용 투여 시 현저히 암세포 성장 억제 효과가 더 증가되는 것으로 확인되었다. 따라서, HSP25는 단독 투여 시에도 암성장 억제 효과가 있을 뿐만 아니라, 방사선과 병용 투여시에 항암 효과를 더욱 증진시킨다는 것을 알 수 있다.

Claims

HSP27(Heat Shock Protein 27)을 포함하는 혈관신생 억제용 약학 조성물.
HSP27을 포함하는 암 치료용 약학 조성물.
제1항 또는 제2항에 있어서, HSP27이 재조합 단백질인 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
HSP27(Heat Shock Protein 27)을 암호화하는 핵산을 포함하는 혈관신생 억제용 약학 조성물.
HSP27(Heat Shock Protein 27)을 암호화하는 핵산을 포함하는 암 치료용 약학 조성물.
제4항 또는 제5항에 있어서, 상기 HSP27을 암호화 하는 핵산이 재조합 벡터인 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
제1항 또는 제4항에 있어서, 상기 혈관신생은 종양의 성장과 전이, 연령관련 황반변성(age-related macular degeneration), 류마티스성 관절염(rheumatoid arthritis), 당뇨병성 망막변증(diabetic retinopathy), 건선(psoriasis), 또는 만성염증(chronic inflammation)에 수반하는 것임을 특징으로 하는 약학 조성물.
제2항 또는 제5항에 있어서, 상기 암은 대장암, 췌장암, 대장직장암, 전립선암, 신장암, 흑색종, 전립선암의 골전이암, 난소암, 또는 혈액암인 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
HSP27를 이용하여 in vitro에서 혈관내피세포의 성장을 억제하는 방법.
혈관내피세포주를 시료들 각각으로 처리하는 단계;
혈관내피세포주 내의 HSP27의 함량을 측정하는 단계; 및
혈관내피세포주 내의 HSP27의 함량이 대조군에 비해 증가된 시료를 선택하는 단계를 포함하는 혈관신생 억제용 활성물질을 스크리닝하는 방법.
혈관내피세포주를 시료들 각각으로 처리하는 단계;
혈관내피세포주 내의 HSP27의 함량을 측정하는 단계; 및
혈관내피세포주 내의 HSP27의 함량이 대조군에 비해 증가된 시료를 선택하는 단계를 포함하는 암 치료용 활성물질을 스크리닝 하는 방법.