KR101151790B1 - 혈구를 이용한 공초점 현미경 미세 입자영상유속계 - Google Patents
혈구를 이용한 공초점 현미경 미세 입자영상유속계 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 미세 입자영상유속계에 관한 것으로, 미세채널을 혈류 시료의 속도장 측정장치에 있어서, 레이저광을 발생하는 레이저 광원; 상기 발생된 광원을 반사시키거나 투과시켜 스캐너 역할을 수행하는 다이크로매틱 미러(dichromatic mirror); 상기 다이크로매틱 미러에서 반사된 레이저 광을 시료에 초점을 맞추기 위한 대물렌즈; 상기 대물렌즈를 통과한 레이저 광이 주사될 수 있도록 시료를 세팅하는 시료 세팅 장치 및 상기 시료에 주사되어 발생된 레이저광이 상기 대물렌즈와 상기 다이크로매틱 미러를 통과하여 받은 상기 시료에서 발생되는 광을 수집하는 디텍터 핀홀; 및 상기 시료에서 발생된 광을 측정하는 측정장치를 포함하여 구성하되, 상기 혈류내 포함된 적혈구 자체를 추적입자로 하여 혈류 유동의 속도장을 측정하는 것을 특징으로 한다.
이와 같은 본 발명을 제공하면, 종래의 외부의 추가적인 추적입자 또는 형광입자의 투입으로 혈류의 자체 특성의 변화를 가져올 수 있는 데이터의 정확성 내지 정밀성이 떨어지는 단점을 보완할 수 있을 뿐만 아니라, 선택적 입자추적에 맞는 해상도를 높이고, 추가 투입이라는 시료의 준비로 인한 시간을 단축하여 보다 빠르고 정밀한 측정이 가능하게 된다.
이와 같은 본 발명을 제공하면, 종래의 외부의 추가적인 추적입자 또는 형광입자의 투입으로 혈류의 자체 특성의 변화를 가져올 수 있는 데이터의 정확성 내지 정밀성이 떨어지는 단점을 보완할 수 있을 뿐만 아니라, 선택적 입자추적에 맞는 해상도를 높이고, 추가 투입이라는 시료의 준비로 인한 시간을 단축하여 보다 빠르고 정밀한 측정이 가능하게 된다.
Description
본 발명은 공초점 현미경 미세 입자영상유속계에 관한 것으로, 보다 상세하게는 추가적인 추적입자 또는 형광입자의 투입 없이 직접 혈구를 이용하여 상대적인 해상도가 높은 공초점 현미경을 이용하여 혈류의 속도장 또는 유속장을 측정 및 분석하는 시스템에 관한 발명이다.
현대의 광학 및 이미징 기술의 발달과 더불어 많은 미세 스케일의 유동장 및 생체 유동의 분석에 바이오광학 기술이 활용되어 지고 있다. 또한 인체의 질환 유발 및 임상적 필요로 인하여 그 중요성은 더욱 커지고 있는 질정이다. 이와 관련된 연구로서는 미세입자의 추적 형광을 통하여 마이크로 입자영상유속계가 마이크로채널 유속 계측에 활용되어 져 오고 있다.
일반적으로, 인체 내부에서 흐르는 혈액은 체온유지 및 병균 방어 등의 중요한 기능들을 수행한다. 이 혈액은 다양한 구성성분들과 혈장으로 이루어져 있으며, 역학적으로 고체와 액체의 성질을 동시에 지니는 유변학적 특성을 가지고 있다. 여기서, 혈액을 이루는 구성성분의 대부분은 적혈구로 이루어져 있다.
이와 같은 혈액의 특징과 중요성으로 인해, 혈류가 흐르는 통로의 역할을 하는 순환계에 관한 많은 연구들이 수행되어져 오고 있다. 이 혈류 유동에 대한 연구는 동맥경화와 같은 상대적으로 큰 혈과 내부 유동에 관한 연구와, 관성력과 맥동성의 영향이 매우 적은 미세 혈관계 유동에 관한 연구로 크게 구분된다. 이와 같은 연구에 있어서, 혈관 내부의 혈류 유동을 제대로 모사하기 위해 마이크로 유체공학(microfluidics) 기술을 적용한 마이크로채널 내부 유동 해석기법이 활용되고 있다. 상기한 혈관 내부에서뿐만 아니라, 소량의 혈액을 가지고 질환을 진단하는 DNA 칩이나 랩온어칩(Lab-on-a-chip)등의 질환 진단용 칩에 사용되는 미세 채널 내에서도 혈류 유동이 발생된다.
한편, 상기한 혈류 유동의 속도장 측정에 있어서는 일반적인 미세 입자영상 유속계(Micro-PIV): Micro-Particle Image Velocimetry)의 이용을 고려해 볼 수 있다.
여기서, 미세입자영상유속계를 이용한 유동장 측정방식은 추적입자에 레이저 빔을 조명하여 입자들로부터 산란된 입자 영상을 이용하는 방식이다. 따라서, 적혈구 등과 같은 구성요소가 포함된 혈류 유동의 속도장을 정확히 측정하기 어렵고, 혈구 형상이나 분포 양상등에 따라서 많은 오차가 존재하는 문제점이 있다. 특히, 적혈구나 백혈구는 도우넛 모양이나 원판 모양으로 점탄성(viscoelasticity) 특징을 가지고 있어 혈관 내에서 혈관 구조나 내피세포 등에 따라 다양한 형태로 변화하며, 주위 혈장(plasm)과는 다른 거동을 보이므로, 그 측정이 더욱 곤란하다.
상술한 문제를 해결하기 위한 본 발명의 과제는 혈관내 존재하는 혈구의 특징 및 혈류의 속도장 또는 유속장을 정밀하게 측정하고, 시료의 준비과정에서 발생하는 추적입자 또는 형광입자의 별도 투입 없이 혈구 자체의 속도장 등의 측정을 용이하게 할 수 있는 미세입자영상유속계를 제공하고자 함이다.
상술한 문제를 해결하기 위한 본 발명의 특징은 미세채널을 혈류 시료의 속도장 측정장치에 있어서, 레이저광을 발생하는 레이저 광원; 상기 발생된 광원을 반사시키거나 투과시켜 스캐너 역할을 수행하는 다이크로매틱 미러(dichromatic mirror); 상기 다이크로매틱 미러에서 반사된 레이저 광을 시료에 초점을 맞추기 위한 대물렌즈; 상기 대물렌즈를 통과한 레이저 광이 주사될 수 있도록 시료를 세팅하는 시료 세팅 장치 및 상기 시료에 주사되어 발생된 레이저광이 상기 대물렌즈와 상기 다이크로매틱 미러를 통과하여 받은 상기 시료에서 발생되는 광을 수집하는 디텍터 핀홀; 및 상기 시료에서 발생된 광을 측정하는 디텍터를 포함하여 구성하되, 상기 혈류내 포함된 적혈구 자체를 추적입자로 하여 혈류 유동의 속도장을 측정하는 것을 특징으로 한다.
여기서, 상기 레이저 광원과 상기 다이크로매틱 미러 사이에 상기 레이저 광을 집광 또는 분산시키기 위한 광원 핀홀을 더 구비하는 것이 바람직하고, 상기 레이저 광원은 가변파장 레이저인 것이 바람직하다.
또한, 바람직하게는 상기 다이크로매틱 미러는 빔 분리기 및 2개의 거울을 포함하여 구성하는 것일 수 있고, 상기 디텍터는, 상기 광을 검출하는 광검출기; 상기 광검출기에서 검출된 아날로그 신호를 디지털 신호로 변환하는 프레임 그레버(frame grabber); 및 상기 프레임 그레버(frame grabber)에서 변환된 디지털 신호를 통하여 영상을 획득 및 분석하는 단말기(PC)를 포함하는 것일 수 있다.
더하여, 상기 프레임 그레버와 상기 디텍터 핀홀 사이에 대역통과 필터를 더 포함하는 것이 바람직하고, 상기 시료 세팅 장치는, 상기 미세 혈류를 주입 또는 펌핑하는 시린지 펌프; 상기 혈류를 이동시키는 테프론 튜브; 및 중심부에 홀을 형성하고, 상기 홀의 중심을 통과하여 상기 테프론 튜브와 연결되는 미세 채널을 갖는 투명한 시료 플레이트를 포함하는 것이 바람직하다.
이와 같은 본 발명을 제공하면, 공초점 현미경 시스템을 이용하여 적혈구 입자를 직접 추적입자로 하여 영상 이미지를 스캔하고, 스캔된 다수의 영상이미지를 통하여 혈류의 속도장 또는 유속장의 분포를 측정하고 분석하는 시스템으로서, 종래의 외부의 추가적인 추적입자 또는 형광입자의 투입으로 혈류의 자체 특성의 변화를 가져올 수 있는 데이터의 정확성 내지 정밀성이 떨어지는 단점을 보완할 수 있을 뿐만 아니라, 선택적 입자추적에 맞는 해상도를 높이고, 추가 투입이라는 시료의 준비로 인한 시간을 단축하여 보다 빠르고 정밀한 측정이 가능하게 된다.
도 1은 본 발명에 따른 공초점 현미경 미세 입자영상유속계의 구성을 예시한 도면,
도 2는 본 발명에서 적용되는 공초점 현미경을 이용하여 미세채널에 흐르는 적혈구의 영상을 나타낸 사진,
도 3은 본 발명에 따른 공초점 현미경 미세 입자영상유속계를 통하여 미세 채널 내부를 유동하는 적혈구의 속도장을 구한 결과를 나타낸 도면이다.
도 2는 본 발명에서 적용되는 공초점 현미경을 이용하여 미세채널에 흐르는 적혈구의 영상을 나타낸 사진,
도 3은 본 발명에 따른 공초점 현미경 미세 입자영상유속계를 통하여 미세 채널 내부를 유동하는 적혈구의 속도장을 구한 결과를 나타낸 도면이다.
이하에서 도면을 참조하여 본 발명에 따른 바람직한 실시예를 상세히 설명하기로 한다.
도 1은 본 발명에 따른 공초점 현미경 미세 입자영상유속계의 구성을 예시한 도면이다. 도 1에 나타낸 바와 같이, 본 발명은 미세채널을 혈류 시료의 속도장 측정장치에 있어서, 레이저광을 발생하는 레이저 광원(10); 상기 발생된 광원(10)을 반사시키거나 투과시켜 스캐너 역할을 수행하는 다이크로매틱 미러(dichromatic mirror)(20); 상기 다이크로매틱 미러(20)에서 반사된 레이저 광을 시료에 초점을 맞추기 위한 대물렌즈; 상기 대물렌즈를 통과한 레이저 광이 주사될 수 있도록 시료를 세팅하는 시료 세팅 장치 및 상기 시료에 주사되어 발생된 레이저광이 상기 대물렌즈와 상기 다이크로매틱 미러(20)를 통과하여 받은 상기 시료에서 발생되는 광을 수집하는 디텍터 핀홀(40); 및 상기 시료에서 발생된 광을 측정하는 디텍터를 포함하여 구성하되, 상기 혈류내 포함된 적혈구 자체를 추적입자로 하여 혈류 유동의 속도장을 측정하는 것을 특징으로 한다.
이처럼 본 발명은 생명과학 분야에 사용되는 일반적인 광학 시스템보다 상대적으로 높은 해상도를 갖는 공초점 현미경을 이용하여, 추가적인 추적입자의 투입없이 혈구 자체를 추적입자로 하여 혈류의 속도장 또는 유속장 등을 측정하는 미세 입체영상유속계(M-PIV:Micro-Particle Imaging Velocimetry)에 관한 발명이다.
여기서 공초점 현미경(confocal microscopy)은 생명광학(biophotonics) 분야에서 활용되고 있는 대표적인 광학 계측 장비로써, 기존의 광학현미경(wide field microscopy)보다 매우 우수한 공간분해능을 가짐과 동시에 관찰물질(샘플)의 피하조직까지 관찰할 수 있는 첨단 광학 영상장비이다.
공초점 현미경(Confocal Microscopy)의 원리는 1957년 Minsky에 의해 일찍이 발표되었나, 이 방법이 최초로 적용된 것은 그로부터 10년 후로 1967년에 Egger와 Petran이 이 방법을 사용하여 염색되지 않은 신경조직을 관찰하는 데에 성공하였다.
공초점 현미경은 레이저에서 조사된 일정파장의 빛이 시료에 닿고 그에 의하여 여기(Excitation)되어 에미션(Emission)되는 빛이 공초점 구멍(aperture 또는 pinhole)를 통과하여 디텍터에 닿는 원리를 이용한다. 이것은 초점이 맞지 않는 에미션 빛을 공초점 구멍이라는 조리개를 통하여 차단시키므로 초점이 일치하는 부분의 빛만을 디텍터가 받아들여 콘트라스트(contrast) 차이를 증가시킴으로 전체적인 분해능의 향상을 나타내게 된다.
이 시스템은 점관원으로부터 나오는 레이저 광을 사용해서 시료의 초점과 디텍터 핀홀 상의 초점을 일치시켜(CONFOCAL) 초점면 이외의 부분은 현미경 상에 나타나지 않도록 함으로써 기존의 형광 현미경에서 나타나는 플래어(flare) 현상을 제거한 것이라 볼 수 있다. 이렇게 할 경우 일반 형광 현미경과 비교해 초점면에 대한 해상도가 이론적으로 상당히 많이 증가한다.
공초점 현미경의 작동원리는 도 1에 나타낸 바와 같이, 광원(10)으로 사용되는 레이저의 광은 빔 분리기(beam splitter)에서 반사가 된 뒤 두 개의 스캐닝 거울(dichromatic mirror)(20)로 구성된 스캐너를 통과한다. 스캐너를 통과한 광은 대물렌즈(30)를 통해 이미징 평면(imaging planes) 즉, 대물렌즈(30)의 초점 평면(focal planes)에 2차원으로 주사된다. 이미징 평면의 각 지점에서 발생한 빛은 입사광의 경로를 다시 되밟아가고 빔분리기를 통과한다. 이 빛은 접안렌즈와 핀 홀(pin-hole)(40)을 통과한 뒤 광센서 또는 광검출기에서 측정된다.
그리고, 핀홀(40) 뒤에는 일반적으로 형광빛만을 통과시키기 위해 대역통과필터(band-pass filter)가 놓여 있는 것이 바람직하다. 검출된 광을 측정하는 측정장치는 광검출기 프레임 그레버(frame grabber) 및 PC를 포함하여 구성되는데, 광센서에 의해 측정된 아날로그 신호는 프레임 그레버(frame grabber)를 거쳐서 컴퓨터가 처리할 수 있는 디지털신호로 전환된다. 이 신호는 영상 획득 및 분석 소프트웨어를 거쳐서 모니터에 표시된다. 3차원 영상은 샘플 스테이지(stage)를 다음 단면으로 순차적으로 움직이면서 촬영한 각 평면의 영상을 이미지 프로세싱을 통해 만들어진다.(도시하지 않음)
본 발명에서는 레이저 광원(10)으로 가변 파장 레이저를 사용하는 것이 바람직하고, 이를 이용하여 초당 30 프레임의 영상을 촬영할 수 있는 공초점 현미경을 구현한다. 빛의 산란과 형광을 이용한 대표적 비절개적 3차원 투시 광영상 시스템으로 마이크로 이하(sub-micron) 레벨의 우수한 공간 분해능을 가지고 있다.
이처럼 본 발명은 고 분해능을 갖는 공초점 현미경 시스템을 이용하여, 미세채널에 해당하는 혈류내의 혈 유변학적 특성을 연구하고 진단하기 위해 혈구의 유속장 또는 속도장 등의 데이터를 검출하기 위해 외부의 추가적 추적입자나 형광입자를 투입함이 없이 상대적으로 발광하는 적혈구 자체를 추적입자로 하여 속도장 등을 측정할 수 있기 때문에, 용이하게 측정할 수 있을 뿐만 아니라 보다 직접적이고 정밀한 데이터를 측정 및 분석할 수 있게 된다.
도 2는 본 발명에서 적용되는 공초점 현미경을 이용하여 미세채널에 흐르는 적혈구의 영상을 나타낸 사진이다. 도 2에 나타낸 바와 같이, 상기 영상 이미지는 작동유체로 쥐의 심장에서 추출한 혈액을 지름 300㎛ 유리관에 실린지 펌프로 1㎕/min의 일정한 유량을 흘려보냈을 때 적혈구가 가장 많이 분포하는 유리관의 중심부 즉 깊이 150㎛ 부분을 15kHz line scanning rate의 속도로 스캐닝하여 만들어낸 이미지이다. 따라서 이미지 영상 간의 시간 간격은 초당 30 프레임이다.
이미지에서 레이저에 반응하여 검출되는 적혈구뿐이며, 백혈구 및 다른 부유물들은 검출되지 않는다. 즉, 레이저광에 의해 반사되거나 발광 또는 형광이 다른 혈구 또는 부유물(세포)에 비하여 상대적으로 적혈구가 높다는 것을 확인할 수 있다. 측정 단면의 초점영상 초점두께(focal depth)는 6㎛이다. 이처럼, 도 2에 나타낸 것과 같은 스캐닝한 이미지 200장으로 평균 속도장을 구하고, 유동을 파악할 수 있게 된다.
이러한 공초점 현미경을 통해 나타나는 영상 이미지의 특성을 이용하여, 본 발명은 외부의 추가적인 추적입자 또는 형광입자를 투입하지 않고, 혈류내 다량 존재하는 적혈구를 직접 추적입자로 하여 이미지를 검출하고, 상기 이미지를 통하여 혈류의 속도장 또는 유속장 등을 검출하여 분석하는 시스템을 제안하는 것이다.
도 3은 본 발명에 따른 공초점 현미경 미세 입자영상유속계를 통하여 미세 채널 내부를 유동하는 적혈구의 속도장을 구한 결과를 나타낸 도면이다. 도 3에 나타낸 바와 같이, 혈액이 점성이 강하고, 비뉴튼 유동을 보인다고 하더라도, 유속이 느리기 때문에 층류유동을 보이며, 채널 중심부의 적혈구 속도가 채널 가장자리의 적혈구 속도보다 빠르게 나타난 것을 볼 수 있다. 그 외에도 적혈구의 속도가 흘러가면서 약간씩 떨어지는 경향이 보이는데, 이는 적혈구의 숫자가 많기 때문에 서로 간에 간섭을 주기 때문으로 판단된다.
조사구간이 가로방향으로 500㎛로 한정되어 있어서 그 후에 어떤 경향을 보이며, 속도의 감소는 어떻게 변화하는지는 본 발명에서 알 수는 없었지만, 지속적으로 속도가 떨어지는 경향을 보일 것이라 예측된다.
이처럼, 본 발명은 일반적인 투명한 유체가 아닌 불투명한 액체인 혈액을 작동 유체로 보고, 그 안에 포함되어 있는 적혈구를 추적입자로 인식하여 속도장을 측정하고, 유동을 관측할 수 있는 방법을 제공한다.
이와 같이, 본 발명은 공초점 현미경 시스템을 이용하여 적혈구 입자를 직접 추적입자로 하여 영상 이미지를 스캔하고, 스캔된 다수의 영상이미지를 통하여 혈류의 속도장 또는 유속장의 분포를 측정하고 분석하는 시스템으로서, 종래의 외부의 추가적인 추적입자 또는 형광입자의 투입으로 혈류의 자체 특성의 변화를 가져올 수 있는 데이터의 정확성 내지 정밀성이 떨어지는 단점을 보완할 수 있을 뿐만 아니라, 선택적 입자추적에 맞는 해상도를 높이고, 추가 투입이라는 시료의 준비로 인한 시간을 단축하여 보다 빠르고 정밀한 측정이 가능하게 된다.
이상의 설명에서 본 발명은 특정의 실시 예와 관련하여 도시 및 설명하였지만, 특허청구범위에 의해 나타난 발명의 사상 및 영역으로부터 벗어나지 않는 한도 내에서 다양한 개조 및 변화가 가능 하다는 것을 당 업계에서 통상의 지식을 가진 자라면 누구나 쉽게 알 수 있을 것이다.
10: 레이저 광원, 20: 다이크로매틱 미러, 30: 대물렌즈, 40: 디텍터 핀홀
50: 디텍터, 60: 투명 플레이트, 65: 시린지 펌프, 67: 테프론 튜브
69: 미세채널
50: 디텍터, 60: 투명 플레이트, 65: 시린지 펌프, 67: 테프론 튜브
69: 미세채널
Claims (7)
- 미세채널의 혈류 시료의 속도장 측정장치에 있어서,
레이저광을 발생하는 레이저 광원; 상기 발생된 광원을 반사시키거나 투과 시켜 스캐너 역할을 수행하는 다이크로매틱 미러(dichromatic mirror); 상기 다이크로매틱 미러에서 반사된 레이저 광을 시료에 초점을 맞추기 위한 대물렌즈; 상기 대물렌즈를 통과한 레이저 광이 주사될 수 있도록 시료를 세팅하는 시료 세팅 장치 및 상기 시료에 주사되어 발생된 레이저광이 상기 대물렌즈와 상기 다이크로매틱 미러를 통과하여 받은 상기 시료에서 발생되는 광을 수집하는 디텍터 핀홀; 및 상기 시료에서 발생된 광을 측정하는 디텍터를 포함하여 구성하되,
상기 혈류내 포함된 적혈구 자체를 추적입자로 하여 혈류 유동의 속도장을 측정하는 것을 특징으로 하는 공초점 현미경 미세 입자영상유속계.
- 제1항에 있어서,
상기 레이저 광원과 상기 다이크로매틱 미러 사이에 상기 레이저 광을 집광 또는 분산시키기 위한 광원 핀홀을 더 구비하는 것을 특징으로 하는 공초점 현미경 미세 입자영상유속계.
- 제1항에 있어서,
상기 레이저 광원은 가변파장 레이저인 것을 특징으로 하는 공초점 현미경 미세 입자영상유속계.
- 제1항에 있어서,
상기 다이크로매틱 미러는 빔 분리기 및 2개의 거울을 포함하여 구성하는 것을 특징으로 하는 공초점 현미경 미세 입자영상유속계.
- 제1항에 있어서,
상기 디텍터는,
상기 광을 검출하는 광검출기;
상기 광검출기에서 검출된 아날로그 신호를 디지털 신호로 변환하는 프레임 그레버(frame grabber); 및
상기 프레임 그레버(frame grabber)에서 변환된 디지털 신호를 통하여 영상을 획득 및 분석하는 단말기(PC)를 포함하는 것을 특징으로 하는 공초점 현미경 미세 입자영상유속계.
- 제5항에 있어서,
상기 프레임 그레버와 상기 디텍터 핀홀 사이에 대역통과 필터를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 공초점 현미경 미세 입자영상유속계.
- 제1항에 있어서,
상기 시료 세팅 장치는,
상기 혈류를 주입 또는 펌핑하는 시린지 펌프;
상기 혈류를 이동시키는 테프론 튜브;
중심부에 홀을 형성하고, 상기 홀의 중심을 통과하여 상기 테프론 튜브와 연결되는 미세 채널을 갖는 투명한 시료 플레이트를 포함하는 것을 특징으로 하는 공초점 현미경 미세 입자영상유속계.
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KR1020100020506A KR101151790B1 (ko) | 2010-03-08 | 2010-03-08 | 혈구를 이용한 공초점 현미경 미세 입자영상유속계 |
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KR1020100020506A KR101151790B1 (ko) | 2010-03-08 | 2010-03-08 | 혈구를 이용한 공초점 현미경 미세 입자영상유속계 |
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