CN108801863A - 可获取溶液中胶体粒子动力学及成像信息的飞秒光镊*** - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种可获取溶液中胶体粒子动力学及成像信息的飞秒光镊***，其特征在于该***包括：用于作为飞秒捕获激光为待测样品提供稳定捕获光阱的飞秒光镊捕获激光单元；用于探测被捕获待测样品在相对于光阱中心做受限布朗运动时位置分布的位置探测单元；用于作为激发光照射待测样品进行荧光激发的激发光源单元；用于将飞秒捕获激光收集到位置探测单元，且将激发光源单元出射的激发光引入到位于捕获光阱中的待测样品，使得待测样品的荧光染料分子受激发产生荧光信号的光学显微单元；用于收集待测样品产生的荧光信号，完成对荧光染料包被的单个胶体粒子的实时荧光成像，获得待测样品在不同粘弹性特征体系中的单个胶体粒子的动力学信息的单分子荧光成像单元。
Description
技术领域
本发明是关于一种可获取溶液中胶体粒子动力学及成像信息的飞秒光镊***，涉及胶体科学以及生物物理基础研究领域。
背景技术
光镊技术是一种可以捕获和操控微小粒子以及进行力学测量的重要单分子技术，自美国贝尔实验室的阿什金于1986年发明，经过三十多年的发展已经日益成熟，在理论以及应用方面都做了大量的研究工作，由单光镊逐步发展为双光镊、多光镊、飞秒光镊以及涡旋光镊等各类光镊，这一技术被广泛应用于生物物理、纳米加工、胶体科学以及物理学等多个领域，并且光镊由于易与其他一些技术相结合，例如单分子荧光成像，荧光共振能量转移等，使其成为相对于单一技术或测量手段的一大优势。飞秒光镊，是人们将光镊的捕获光源用飞秒激光代替连续波激光，飞秒激光具有飞秒的脉宽以及高重复频率，使其在满足连续波激光捕获要求的同时，还具备连续波激光不具备的性质，在较低的平均功率下就可实现捕获。毛方林等人2004年在理论上首次提出并计算了飞秒光镊的横向光学力，同年B.Agate等人用飞秒光镊实现了双光子荧光激发以及原位控制，发现其捕获所需的激光平均光强明显低于连续波激光；降雨强等在2010年首次发现由于强聚焦飞秒光镊的非线性捕获形成的光阱劈裂的现象；Goswami等人基于新的飞秒光镊的微流变方法在一个微小体积内直接原位测量了固-液界面处的温度等。相较于传统光镊，飞秒激光自身的复杂特性使得飞秒光镊的相关实验研究都还很有限，因此，将飞秒光镊与全内反射荧光成像相结合，一种可获取溶液中胶体粒子的动力学信息测量的高灵敏度高精度的成像测量方法的建立是非常有必要的。
发明内容
针对上述问题，本发明的目的是提供一种可获取溶液中胶体粒子动力学及成像信息的飞秒光镊***，能够对胶体体系、细胞进行精确主动操控的同时还能够进行高分辨率、高灵敏度的单分子测量与成像，进而得到胶体粒子或细胞在溶液中的动力学信息。
为实现上述目的，本发明采取以下技术方案：一种可获取溶液中胶体粒子动力学及成像信息的飞秒光镊***，该***包括：用于作为飞秒捕获激光为待测样品提供稳定捕获光阱的飞秒光镊捕获激光单元；用于探测被捕获待测样品在相对于光阱中心做受限布朗运动时位置分布的位置探测单元；用于作为激发光照射待测样品进行荧光激发的激发光源单元；用于将飞秒捕获激光收集到所述位置探测单元，且将所述激发光源单元出射的激发光引入到位于捕获光阱中的待测样品，使得待测样品的荧光染料分子受激发产生荧光信号的光学显微单元；用于收集待测样品产生的荧光信号，完成对荧光染料包被的单个胶体粒子的实时荧光成像，获得待测样品在不同粘弹性特征体系中的单个胶体粒子的动力学信息的单分子荧光成像单元。
进一步地，所述光学显微单元采用倒置荧光显微镜结构，包括显微物镜、第一～第三二向色镜和聚光镜；激发光经所述显微物镜聚焦到位于捕获光阱中的待测样品，经激发光激发待测样品产生的荧光经所述显微物镜收集后发射到第一二向色镜，经所述第一二向色镜出射的荧光信号发射到所述单分子荧光成像测量单元。
进一步地，所述飞秒光镊捕获激光单元包括飞秒脉冲激光器、扩束和准直镜以及偏转镜，所述飞秒脉冲激光器出射的飞秒脉冲激光经所述扩束和准直镜进行扩束和准直，扩束和准直后的飞秒脉冲激光经所述偏转镜进行偏转后发射到第二二向色镜，经所述第二二向色镜出射的光发射到所述显微物镜。
进一步地，所述位置探测单元包括会聚透镜、位置探测装置、数据采集卡和计算机；经所述显微物镜出射的前向散射光形成的干涉图样经所述聚光镜收集后发射到第三二向色镜，经所述第三二向色镜出射的光经所述会聚透镜聚焦所述位置探测装置，所述位置探测装置通过所述数据采集卡连接所述计算机获得待测样品所处光阱的刚度系数以及待测样品在不同粘弹性的体系中的粘度。
进一步地，所述位置探测装置采用位置敏感探测器或数字相机。
进一步地，所述激发光源单元包括固体激光器、格兰泰勒棱镜、四分之一波片、扩束和准直镜、透镜以及滤光片；所述固体激光器发出的连续波依次经所述格兰-泰勒棱镜和四分之一波片发射到所述扩束和准直镜，经所述扩束和准直镜出射的圆偏振光经依次经上所述透镜和滤光片聚焦所述显微物镜的后焦面上。
进一步地，所述固体激光器出口处设置中性密度滤波片。
进一步地，所述单分子荧光成像单元采用EMCCD相机和PCI数据采集卡，所述EMCCD相机经所述PCI数据采集卡连接所述计算机。
进一步地，所述待测样品为聚苯乙烯荧光小球、金纳米颗粒、无荧光的聚苯乙烯小球或二氧化硅小球、人体活性细胞。
本发明由于采取以上技术方案，其具有以下优点：1、本发明将高重复频率的飞秒脉冲光镊与单分子全内反射荧光成像相结合，能够获取溶液中被测量体系的动力学信息。2、本发明在能够实现捕获操控的同时，采用高灵敏度的EMCCD相机对待测样品进行激发光激发以及荧光信号的收集，进而实现包括双光子荧光信号以及普通多荧光信号的探测。3、本发明的待测样品为不同粘弹性体系中的胶体小球或金纳米颗粒等，因此可以实现不同粘弹性体系、不同尺寸的胶体粒子进行测量。本发明可以广泛地应用于纳米颗粒、胶体粒子、凝胶、细胞等多种体系的相关动力学研究，探索其各自特殊性质的基础物理根源。
附图说明
图1是本发明的飞秒光镊***测量原理示意图；
图2是本发明的飞秒激光捕获光源单元与激发光源单元光路示意图；
图3是本发明实施例的胶体粒子在光阱中运动的位移分布示意图；
图4是本发明实施例中被捕获的半径100nm的荧光PS小球的双光子激发成像图。
具体实施方式
以下结合附图来对本发明进行详细的描绘。然而应当理解，附图的提供仅为了更好地理解本发明，它们不应该理解成对本发明的限制。在本发明的描述中，需要理解的是，术语“第一”、“第二”等仅仅是用于描述的目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性。
如图1所示，本发明提供的可获取溶液中胶体粒子动力学及成像信息的飞秒光镊***，包括飞秒光镊捕获激光单元1、位置探测单元2、激发光源单元3、光学显微单元4和单分子荧光成像单元5，其中：
飞秒光镊捕获激光单元1用于作为飞秒捕获激光为待测样品提供稳定的捕获光阱；
位置探测单元2用于探测被捕获待测样品在相对于光阱中心做受限布朗运动时的位置分布；
激发光源单元3用于作为激发光照射待测样品进行荧光激发；
光学显微单元4用于将飞秒捕获激光收集到位置探测单元2，以及将激发光源单元3出射的激发光引入到位于捕获光阱中的待测样品，使得待测样品的荧光染料分子受激发产生荧光信号；
单分子荧光成像单元5用于收集待测样品产生的荧光信号，完成对荧光染料包被的单个胶体粒子的实时荧光成像，获得待测样品在不同粘弹性特征体系中的单个胶体粒子的动力学信息；另外，单分子荧光成像单元5也可用于满足柯勒照明条件的普通的明场成像。
在一个优选的实施例中，如图1所示，光学显微单元4可以采用倒置荧光显微镜结构，包括显微物镜40、三个二向色镜41、聚光镜42、反射镜43和光阑44；激发光经显微物镜40聚焦到位于捕获光阱中的待测样品，经激发光激发待测样品产生的荧光经显微物镜40收集后发射到二向色镜41c，经二向色镜41c出射的荧光信号经发射光高通滤波片发射到反射镜43，经反射镜43反射的荧光经光阑44发射到单分子荧光成像测量单元5。
在一个优选的实施例中，如图2所示，飞秒光镊捕获激光单元1包括提供飞秒捕获激光的飞秒脉冲激光器10、若干反射镜11、扩束和准直镜12、光阑13、偏转镜14和两带通滤光片15。飞秒脉冲激光器10可以采用TEM00模式的钛蓝宝石光纤激光器，飞秒脉冲激光器10出射的飞秒脉冲激光经反射镜11a反射到扩束和准直镜12进行扩束和准直，扩束和准直后的飞秒脉冲激光依次经光阑13和反射镜11b和11c发射到偏转镜14，经偏转镜14偏转出射的光经带通滤光片15a发射到二向色镜41a，经二向色镜41a出射的光经带通滤光片15b发射到显微物镜40，扩束后束径大小应等于或略大于显微物镜40后瞳大小，不同数值孔径的显微物镜40会略有差别，约5～6.3mm，这样能够保证获得尽可能大的梯度力，从而有利于实现并保持稳定的捕获，其中，偏转镜14可以采用压电驱动的高精度偏转镜，可以通过计算机控制驱动偏转镜14发生微弧度偏转，实现飞秒光镊的主动操控。
在一个优选的实施例中，如图1所示，位置探测单元2包括会聚透镜20、高通低阻滤光片21、位置敏感探测器22、NI数据采集卡23和计算机24；经显微物镜40出射的前向散射光形成的干涉图样经聚光镜42(condenser，使光束更好地照到样品上的部件，目的是尽可能的收集前向散射光)收集后发射到二向色镜41b，经二向色镜41b出射的光依次经会聚透镜20和高通低阻滤光片21聚焦位置敏感探测器22，位置敏感探测器22通过NI数据采集卡23连接计算机24。需要说明的是，位置敏感探测器22可以替换为数字相机，数字相机将探测接收的光强信号转换为电信号经NI数据采集卡23发送到计算机24也可以进行分析获得位置与电压的关系，进而获得待测样品所处光阱的刚度系数以及获得待测样品在不同粘弹性的体系中的粘度，其中，高通低阻滤光片21可以采用可见光和红外干涉滤光片。
在一个优选的实施例中，高重复频率的飞秒脉冲激光由于自身的非线性效应可以实现双光子激发，在捕获的同时又可以获得双光子激发，因此所选择荧光染料的激发波长要适当，本发明的激发光源单元3采用高稳定性TEM00模式连续波激光，连续波激光的波长需要与所激发的染料分子相匹配，激发光源单元3包括固体激光器30(本实施例采用532nm波长，以此为例，不限于此)、中性密度滤波片31(中性密度滤波片31可以采用激发光带通滤波片)、若干反射镜32、格兰泰勒棱镜33、四分之一波片34、扩束和准直镜35、透镜36以及两滤光片37；固体激光器30发出的连续波激光经中性密度滤波片31发射到反射镜32a，经反射镜32a出射的激光依次经格兰-泰勒棱镜33、四分之一波片34和反射镜32b发射到扩束和准直镜35，经扩束和准直镜出射的圆偏振光经依次经透镜36、滤光片37a、反射镜32c和滤光片37b聚焦到显微物镜40的后焦面上，由于高倍显微物镜40具有很高的数值孔径可以实现全内反射，能够实现比宽场荧光成像信噪比更高的全内反射荧光成像。其中，此处扩束的目的是用于将激发光束直径扩大以确保其尺寸大于显微物镜40的进光孔以确保激发光是高质量的圆偏振光。
在一个优选的实施例中，单分子荧光成像单元5可以采用EMCCD相机和PCI数据采集卡，EMCCD相机通过PCI数据卡连接计算机24，EMCCD相机具备单光子的极高灵敏度，可以获取单个聚合物分子的散焦图像。
在一个优选的实施例中，待测样品可以是聚苯乙烯荧光小球、金纳米颗粒、量子点、无荧光的聚苯乙烯小球或二氧化硅小球、人体活性细胞；其中，聚苯乙烯荧光小球半径约为100nm，金纳米颗粒和量子点的半径为25nm、30nm等，远小于飞秒脉冲激光器10的束腰半径，无荧光聚苯乙烯小球或二氧化硅小球半径为0.80μm、1.08μm、2.02μm等，接近或大于飞秒脉冲激光器10的束腰半径，人体活性细胞的半径为5μm，远大于飞秒脉冲激光器10的束腰半径，因此，本发明可以捕获不同尺寸的米氏粒子，获得直观的图像。
下面通过具体实施例详细说明采用本发明的可获取溶液中胶体粒子动力学及成像信息的飞秒光镊***的使用过程。
实施例1：采用本发明获取不同粘度下溶液中单个胶体粒子的动力学信息，具体过程为：
1、将本发明的飞秒光镊***放置在光学平台上，调整飞秒光镊***中的各光学器件的位置使得符合本发明飞秒光镊***的光路传播条件；
2、将半径为1.08μm聚苯乙烯微球作为待测样品放置于样品池中，样品池底部为0.17mm的盖玻片；
3、打开飞秒捕获激光光源单元1的飞秒脉冲激光器10，使得飞秒脉冲激光器10发出的激光经扩束和准直镜12扩大到束径满足显微物镜40的孔径要求，扩束后的激光经准直使之成为平行光；
4、将显微物镜40切换到油浸显微物镜，在显微物镜40上加入20～100μL镜油，并对其进行调节使之达到合适的聚焦位置；
5、打开显微镜40的卤素灯，并调节到合适的亮度，通过数字相机或EMCCD相机，初步找到在溶液中悬浮的胶体小球；
6、打开NI数据采集卡23采集数据；
7、结束数据集后将数据导出，做出位置的统计概率分布图(如图3所示)，通过Boltzmann统计法校准得到光阱刚度为0.800pN/μm，粘度为0.0013泊(室内温度22℃)。
8、根据斯托克斯-爱因斯坦公式计算得到待测样品的扩散系数D为0.016μm2/s。
实施例2：采用本发明完成光镊捕获下纳米荧光小球荧光成像，具体过程为：
1、将本发明的飞秒光镊***放置在光学平台上，将荧光染料包被的聚苯乙烯小球置于显微物镜4正上方，调整各光学器件使得符合本发明的光路传播条件，
2、将待测样品放置于样品池中，样品池底部使用0.17mm的盖玻片；
3、打开激发光源单元3的固体激光器30，使固体激光器30出射的连续波激光经扩束调整后使激发光在显微物镜40的后焦平面处聚焦，从而使得通过显微物镜40后出射为平行光；
4、将显微物镜40切换到油浸显微物镜，在显微物镜40上加入20-100μL镜油，并对其进行调节使之达到最佳聚焦位置；
5、打开飞秒捕获激光光源单元中1的飞秒脉冲激光器10并对其光强进行调节；
6、打开单分子荧光成像单元5对单个荧光小球进行实时荧光成像(如图4所示)，通过荧光信号强度随时间阶梯式的变化从而获取被捕获胶体粒子变化个数的信息。
上述各实施例仅用于说明本发明，其中各部件的结构、连接方式和制作工艺等都是可以有所变化的，凡是在本发明技术方案的基础上进行的等同变换和改进，均不应排除在本发明的保护范围之外。
Claims (9)
1.一种可获取溶液中胶体粒子动力学及成像信息的飞秒光镊***，其特征在于该***包括：
用于作为飞秒捕获激光为待测样品提供稳定捕获光阱的飞秒光镊捕获激光单元；
用于探测被捕获待测样品在相对于光阱中心做受限布朗运动时位置分布的位置探测单元；
用于作为激发光照射待测样品进行荧光激发的激发光源单元；
用于将飞秒捕获激光收集到所述位置探测单元，且将所述激发光源单元出射的激发光引入到位于捕获光阱中的待测样品，使得待测样品的荧光染料分子受激发产生荧光信号的光学显微单元；
用于收集待测样品产生的荧光信号，完成对荧光染料包被的单个胶体粒子的实时荧光成像，获得待测样品在不同粘弹性特征体系中的单个胶体粒子的动力学信息的单分子荧光成像单元。
2.根据权利要求1所述的飞秒光镊***，其特征在于，所述光学显微单元采用倒置荧光显微镜结构，包括显微物镜、第一～第三二向色镜和聚光镜；激发光经所述显微物镜聚焦到位于捕获光阱中的待测样品，经激发光激发待测样品产生的荧光经所述显微物镜收集后发射到第一二向色镜，经所述第一二向色镜出射的荧光信号发射到所述单分子荧光成像测量单元。
3.根据权利要求2所述的飞秒光镊***，其特征在于，所述飞秒光镊捕获激光单元包括飞秒脉冲激光器、扩束和准直镜以及偏转镜，所述飞秒脉冲激光器出射的飞秒脉冲激光经所述扩束和准直镜进行扩束和准直，扩束和准直后的飞秒脉冲激光经所述偏转镜进行偏转后发射到第二二向色镜，经所述第二二向色镜出射的光发射到所述显微物镜。
4.根据权利要求2所述的飞秒光镊***，其特征在于，所述位置探测单元包括会聚透镜、位置探测装置、数据采集卡和计算机；经所述显微物镜出射的前向散射光形成的干涉图样经所述聚光镜收集后发射到第三二向色镜，经所述第三二向色镜出射的光经所述会聚透镜聚焦所述位置探测装置，所述位置探测装置通过所述数据采集卡连接所述计算机获得待测样品所处光阱的刚度系数以及待测样品在不同粘弹性的体系中的粘度。
5.根据权利要求4所述的飞秒光镊***，其特征在于，所述位置探测装置采用位置敏感探测器或数字相机。
6.根据权利要求2所述的飞秒光镊***，其特征在于，所述激发光源单元包括固体激光器、格兰泰勒棱镜、四分之一波片、扩束和准直镜、透镜以及滤光片；所述固体激光器发出的连续波依次经所述格兰-泰勒棱镜和四分之一波片发射到所述扩束和准直镜，经所述扩束和准直镜出射的圆偏振光经依次经上所述透镜和滤光片聚焦所述显微物镜的后焦面上。
7.根据权利要求6所述的飞秒光镊***，其特征在于，所述固体激光器出口处设置中性密度滤波片。
8.根据权利要求4所述的飞秒光镊***，其特征在于，所述单分子荧光成像单元采用EMCCD相机和PCI数据采集卡，所述EMCCD相机经所述PCI数据采集卡连接所述计算机。
9.根据权利要求1所述的飞秒光镊***，其特征在于，所述待测样品为聚苯乙烯荧光小球、金纳米颗粒、无荧光的聚苯乙烯小球或二氧化硅小球、人体活性细胞。
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