CN101278829A - 便携式在体流式细胞仪 - Google Patents

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刘光大
谭渊
郭进
杨维初
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Abstract

本发明涉及一种便携式在体流式细胞仪，包括光源照射***，分光***，信号探测分析处理***，定位用照明***，定位用观测***和样品平台；光源照射***对经标记的感兴趣的细胞流进行激光照射，激发得到所标记的荧光的发射信号，经显微物镜聚焦后，通过分光***进入到信号探测分析处理***，进行信号探测、处理和输出。本发明采用半导体激光作为光源，结构小巧，便于携带，可选激发波长多；探测的信号提供感兴趣的细胞的详细信息如细胞计数等。根据探测细胞类型或标记荧光剂的不同可以更换光源、分光和滤光光学元件，增加***的使用范围。

Description

便携式在体流式细胞仪
技术领域
本发明涉及一种用于生物医学检测的细胞仪，尤其是一种可以实现在体、实时，无创地分析血管内细胞流动特性的-在体流式细胞仪。
背景技术
当前检测和量化各种样本血液中循环细胞的方法主要是从病人体内或动物体内取出，作荧光标记后在体外进行测量。例如，标准的流式细胞仪对血液中各种细胞的分析就是如此。这种检测方法的缺点是，不能在体、实时检测血管中各种细胞的流动特性，检测时，需要对样品进行标记等制样过程，操作复杂，费时费力；因为制样和检测需要一定的时间和额外的试剂，所以对测量结果的精度很难保证；每次测量只能给出单一时间点上的结果，所以很难得到一组随时间变化的细胞分布特性；而且这样的处理需要的经费较多。
当前在体探测组织特性的装置也有很多，如激光共聚焦显微镜，光学层析成像等设备但这两种设备只能对体表较浅(100~300um)范围内对组织成像，而且由于其成像的速度，很难对血液中的细胞特别是动脉中的细胞进行跟踪。
因此，为了能对血管中细胞实施在体、实时、便携的分析，有必要提供一种可以便携的在体流式细胞分析仪。
发明内容
本发明是要解决在体、实时检测血管中各种细胞的流动特性技术问题，而提供一种便携式在体流式细胞仪。
本发明是通过以下技术方案实现的：本发明的一种便携式在体流式细胞仪，包括光源照射***，分光***，信号探测分析处理***，定位用照明***，定位用观测***和样品平台；光源照射***对经标记的感兴趣的细胞流进行激光照射，激发得到所标记的荧光的发射信号经光源照射***中的显微物镜聚焦后，通过分光***进入到信号探测分析处理***进行信号探测与分析并处理和输出，由定位用照明***发出的聚焦光照到样品平台上由光源照射***照射的定位光点，定位光点经光源照射***中的显微物镜成像，再经分光***进入定位用观测***成像，在显示屏上显示。
所述的光源照射***由作为光源的半导体激光二极管LD、扩束透镜、空间滤波器、准直透镜、反射镜和将扩束准直后的光束聚焦的显微物镜组成。光源照射***将半导体激光二极管LD发射的椭圆形光束通过扩束透镜扩束进入空间滤波器滤出光束高阶成分后再经准直透镜使光束平行进入聚焦用得显微物镜将光束聚焦成10×70μm的长条形光斑。这样的有益效果是可以减少光束整形的光学元件，降低成本和***的复杂度，提高***的可靠性。同时这个光束也是流式细胞仪分析所需要的，主要是为了能在单个细胞流过血管时进行光的照射，避免对多个细胞的照射。
所述的分光***包括双色分光滤光片，双色分光滤光片的放置于光源照射***的反射镜与显微物镜之间，使光源的光波与光源照射在感兴趣的单细胞上激发出来的荧光信号分离。
所述的信号探测分析处理***由探测器、模数转换处理电路A/D、计算机、滤光片、聚焦耦合透镜及空间滤波器组成；滤光片为一个只通过激发产生的荧光信号，阻断其它波段的光学信号的带通滤光片，滤光片滤除其它光波信号的纯净的荧光信号经聚焦耦合透镜会聚到空间滤波器，空间滤波器与显微物镜的焦点共轭，形成共聚焦***；荧光信号通过空间滤光器进入探测器D将光信号转换成电信号，电信号再经模数转换处理电路A/D处理成可以显示的数据经计算机显示输出。
所述的定位用照明***由照明光源LED和聚焦透镜组成；照明光源LED发出的光线经聚焦透镜聚焦到样品中激发光源照射的位置，用于定位用观测***的观测。
所述的定位用观测***由显微物镜、滤光片、聚焦物镜、成像CCD和显示屏组成，滤光片放置在分光***的双色滤光片的后面，聚焦透镜耦合显微物镜的LED光波，使光波的焦点落在成像CCD平面上，使其成像。
所述的样品平台是一个可以三维移动的平台，平台移动精度为微米量级，样品平台上设有可以控制动物在平台上固定不动的约束装置。
本发明的有益效果是：
本发明包括作为光源的半导体激光器(LD)、将光源能量聚焦对微血管中单细胞进行的照射聚焦光学***、用于观测LD照射位置的CCD成像***、分光***以及对血管内特殊细胞检测的检测光学***。
光源照射***中采用半导体激光器的有益效果是此种光源一般发射的光束即为椭圆形光束，减少了许多光束整形所需的光学元件，节约了成本，降低了***体积和重量。照明光源采用LED的有益效果是体积小，重量轻，发热量低，不会对样品产生不利的影响；采用绿色LED照射更有益的效果是绿色光是血液主要的吸收波段，所以对组织中的血管成像良好。
本发明采用半导体激光作为光源，其它光学元件体积也控制体积，所以整个***结构小巧，便于携带。探测的信号提供感兴趣的细胞的详细信息如细胞计数等。根据探测细胞类型或标记荧光剂的不同可以更换光源和分光、滤光光学元件。增加***的使用范围。
本发明能对血管中细胞实施在体、实时、便携的分析。并且具有体积小巧，能对感兴趣的体内微血管内流动的单细胞进行详细的分析，如感兴趣的细胞(癌细胞)计数、细胞流动速度等。
附图说明
图1是本发明的结构框图；
图2是本发明的***图；
图3是本发明的数据处理框图。
具体实施方式
下面结合附图与实施例对本发明作进一步的说明。
本发明包括：照射微血管内标记过的单细胞辐射光源***，光源***将半导体光源的光能聚焦成10×70μm的光点用于激发微血管内经标记的细胞来辐射出荧光信号；观测光源照射位置的CCD成像***；用于将激发光、观察光和经激发辐射出来的荧光区分开的分光***；探测经激光照射在单细胞上辐射出来的荧光的探测光路以及分析***。
所述的光源***中，各种光源和各种发射波长的光源都可以应用于激发标记的细胞，在本发明中为了减小***的体积采用半导体激光器，半导体激光器输出的椭圆形的光斑正是流式细胞仪中采用的光斑形式，减少了许多光束整形的光学元件，为***的小型化创造了条件。而且对于半导体激光器的控制也比较容易，可以使其光波输出为连续和脉冲两种方式。光源***中还包括激光光束的聚焦***，这个***中采用显微物镜将光斑聚焦成一个10×70μm的光斑以便照射微血管中单个感兴趣的细胞。同时这个显微物镜也是CCD成像***和探测***的物镜。整个光源***中包括两个光学透镜和一个显微物镜，两个光学透镜的作用是将激光束扩束准直，再经显微物镜聚焦成一个10×70μm的光斑。
所述的CCD成像***包括一个用于照明的绿光LED光源、聚光镜、滤光片和CCD成像单元及显示屏或电脑显示器等。具体工作过程是绿光LED所发光经激光镜聚焦到样品被光源***照射的光点定位后经光源***中的显微物镜成像，再经分光***进入到CCD成像单元，CCD成像单元包括像耦合镜和CCD相机，经CCD成像后在显示屏上显示来确保激光光点的位置。
所述的分光***包括两片双色滤光片，这两个滤光片的功能是一个滤除激发光源光波透过荧光光波将经显微物镜收集来的绿光反射到CCD成像单元用于观测；另一个是滤除激光光波将细胞被照射后激发出来的荧光反射到探测***用于探测；
所述的探测光路和分析***包括一个带通滤光片，一个光学透镜，一个空间滤波器，使荧光信号聚焦，光电探测元件和计算机***；具体的工作过程为带通滤光片纯化信号经荧光信号收集用的光学透镜再经过空间滤波器入射到光电探测元件如光电倍增管等；这个荧光信号被接收后再被计算机内软件***分析并显示。
本***的工作原理是，对研究对象(动物、或人体某体表部位)感兴趣的细胞进行标记，经标记的感兴趣的细胞流经激光照射的微血管时，必然得到所标记的荧光的发射信号，这个荧光信号被反射回***，经显微物镜聚焦后，通过分光***进入到探测光路，探测器探测到这个信号后经分析***，如计数或强度的分析来获得感兴趣细胞在体内的流动和驻留特性；更进一步地可以分析癌细胞的转移、扩散特性；根据研究对象和标记方式的不同，本发明中的激光光源和分光***和滤光***可以更换，这样可以扩大整套仪器的使用范围。
如图1所示，本发明从功能上分，包括光源照射***1；分光***2；信号探测分析处理***3；定位用照明***4；定位用观测***5和样品平台6。
由图2所示，所述的光源照射***1由作为光源的半导体激光二极管LD、扩束透镜10、空间滤波器11、准直透镜12、为了减小***尺寸的反射镜13和将扩束准直后的光束聚焦的显微物镜14组成。光源照射***1将光源LD发射的椭圆形光束通过扩束透镜10扩束进入空间滤波器11滤出光束高阶成分后再经准直透镜12使光束平行进入聚焦用得显微物镜14将光束聚焦成10×70μm的长条形光斑，这样的光斑的有益效果是可以保证照射单个微血管内的单个感兴趣的标记细胞。而且光源照射***1中采用半导体激光器的有益效果是此种光源一般发射的光束即为椭圆形光束，减少了许多光束整形所需的光学元件，节约了成本，降低了***体积和重量。
由图2所示，所述的分光***包括双色分光滤光片20和21两个光学元件，双色分光滤光片20的放置于光源照射***1反射镜13的与显微物镜14之间，作用是使光源的光波与光源照射在感兴趣的单细胞上激发出来的荧光信号分离，即屏蔽光源的光信号，使荧光信号进入到探测分析处理***3进行信号探测与分析。
由图2所示，所述的信号探测分析处理***3由探测器D、模数转换处理电路A/D、计算机Computer、滤光片31、聚焦耦合透镜32及空间滤波器33组成；滤光片31为一个带通滤光片，只通过激发产生的荧光信号，阻断其它波段的光学信号；经滤光片31滤除其它光波信号的纯净的荧光信号经聚焦耦合透镜32会聚到空间滤波器33，空间滤波器33与显微物镜14的焦点共轭，形成共聚焦***，这样做的有益效果是降低背景噪声，提高***的分辨率；荧光信号通过空间滤光器33进入探测器D将光信号转换成电信号，电信号再经模数转换处理电路A/D处理成可以显示的数据经计算机Computer显示输出。
如图3所示，探测的荧光信号经探测器D转换成电信号后经数据采集卡采集后进入模数转换处理电路A/D，再经数据处理单元形成可以经计算机数据卡处理的数据类型在计算机上显示处理。
由图2所示，所述的定位用照明***4由照明光源LED和聚焦透镜40组成；照明光源采用LED的有益效果是体积小，重量轻，发热量低，不会对样品产生不利的影响；采用绿色LED照射更有益的效果是绿色光是血液主要的吸收波段，所以对组织中的血管成像良好。聚焦透镜40的作用是使照明LED发出的光线聚焦到样品中激发光源照射的位置。以便定位用观测***5观测。
由图2所示，定位用观测***5由显微物镜14、滤光片42、聚焦物镜43、成像CCD和显示屏Screen组成，滤光片42放置在分光***2种双色滤光片21的后面，其作用是只通过LED发射的光波，阻断其它光波信号进入CCD；有利于成像的清晰度；聚焦透镜43耦合显微物镜14的LED光波，使光波的焦点落在成像CCD平面上，使其成像。
由图2所示，样品平台6是一个可以三维移动的平台，移动精度控制在微米量级，更有利于照射光源***1的聚焦，找到合适的微血管进行探测。样品平台6设置有动物约束装置，可以控制动物在平台6上固定不动。
以上***中的光源、分光滤光片等元件可以根据所研究的感兴趣的细胞类别的不同已经标记荧光的特点进行更换；使***功能更强大。此外，为了降低成本，便于***的产业化，所有元件都采用标准或可以在一般厂家购买的元件。

Claims (7)

1.一种便携式在体流式细胞仪，其特征在于，包括光源照射***(1)，分光***(2)，信号探测分析处理***(3)，定位用照明***(4)，定位用观测***(5)和样品平台(6)，所述的光源照射***(1)对经标记的感兴趣的细胞流进行激光照射，激发得到所标记的荧光的发射信号，经显微物镜聚焦后，通过分光***(2)进入到信号探测分析处理***(3)进行信号探测、处理和输出分析结果；由定位用照明***(5)发出的聚焦光照到样品平台(6)上由光源照射***(1)照射的定位光点，定位光点经光源照射***(1)中的显微物镜成像，再经分光***进入定位用观测***成像，在显示屏上显示。
2.根据权利要求1所述的便携式在体流式细胞仪，其特征在于，所述的光源照射***(1)由半导体激光二极管(LD)、扩束透镜(10)、空间滤波器(11)、准直透镜(12)、反射镜(13)和将扩束准直后的光束聚焦的显微物镜(14)组成；半导体激光二极管(LD)发射的椭圆形光束通过扩束透镜(10)扩束进入空间滤波器(11)滤除光束高阶成分后再经准直透镜(12)使光束平行进入聚焦用的显微物镜(14)将光束聚焦成10×70μm的长条形光斑。
3.根据权利要求1所述的便携式在体流式细胞仪，其特征在于，所述的分光***(2)包括双色分光滤光片(20，21)，双色分光滤光片(20)的放置于光源照射***(1)的反射镜(13)与显微物镜(14)之间，使光源的光波与光源照射在感兴趣的单细胞上激发出来的荧光信号分离。
4.根据权利要求1所述的便携式在体流式细胞仪，其特征在于，所述的信号探测分析处理***(3)由探测器(D)、模数转换处理电路(A/D)、计算机、滤光片(31)、聚焦耦合透镜(32)及空间滤波器(33)组成；滤光片(31)为一个只通过激发产生的荧光信号，阻断其它波段的光学信号的带通滤光片，滤光片(31)滤除其它光波信号的纯净的荧光信号经聚焦耦合透镜(32)会聚到空间滤波器(33)，空间滤波器(33)与显微物镜(14)的焦点共轭，形成共聚焦***；荧光信号通过空间滤光器(33)进入探测器(D)将光信号转换成电信号，电信号再经模数转换处理电路(A/D)处理成可以显示的数据经计算机显示输出。
5.根据权利要求1所述的便携式在体流式细胞仪，其特征在于，所述的定位用照明***(4)由照明光源LED和聚焦透镜(40)组成；照明光源LED发出的光线经聚焦透镜(40)聚焦到样品中激发光源照射的位置，用于定位用观测***(5)的观测。
6.根据权利要求1所述的便携式在体流式细胞仪，其特征在于，所述的定位用观测***(5)由显微物镜(14)、滤光片(42)、聚焦物镜(43)、成像CCD和显示屏组成，滤光片(42)放置在分光***(2)的双色滤光片(21)的后面，聚焦透镜(43)耦合显微物镜(14)的LED光波，使光波的焦点落在成像CCD平面上，使其成像。
7.根据权利要求1所述的便携式在体流式细胞仪，其特征在于，所述的样品平台(6)是一个可以三维移动的平台，平台移动精度为微米量级，样品平台(6)上设有可以控制动物在平台(6)上固定不动的约束装置。
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