KR101145508B1 - 자가 지방 이식의 증대에 있어서 지방 조직 유래의 세포를사용하는 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 유방확대, 연부 조직 결함 및 요실금 등과 같은 상태의 환자를 치료하는 방법에 관한 것이다. 상기 방법은, 환자로부터 지방 조직을 제거하는 단계, 지방 조직의 일부를 프로세싱하여 실질적으로 단리된 재생성 세포 집단을 수득하는 단계, 재생성 세포를 또다른 부분의 지방 조직과 혼합하여 조성물을 형성하는 단계, 및 상기 조성물을 상기 지방 조직을 제거하였던 환자에게 투여하는 단계를 포함한다.

프로세싱, 지방 조직, 재생성 세포 집단, 지방 이식, 유방확대, 연부 조직 결함, 요실금

Description

자가 지방 이식의 증대에 있어서 지방 조직 유래의 세포를 사용하는 방법{METHODS OF USING ADIPOSE TISSUE-DERIVED CELLS IN AUGMENTING AUTOLOGOUS FAT TRANSFER}

관련 출원

본 출원은 2002년 12월 9일자로 출원된 미국 출원 제10/316,127호 (발명의 영문 명칭: SYSTEMS AND METHODS FOR TREATING PATIENTS WITH PROCESSED LIPOASPIRATE CELLS)의 부분-계속 출원으로, 2001년 12월 7일에 출원된 미국 가출원 제60/338,856호의 잇점을 주장한다. 본 출원은 또한 2003년 6월 18일자로 출원된 미국 가출원 제60/479,418호 (발명의 영문 명칭: METHODS OF USING ADIPOSE TISSUE-DERIVED CELLS IN AUGMENTING AUTOLOGOUS FAT TRANSFER)를 우선권으로 주장한다. 상기 언급된 출원의 모든 내용은 본원에 참조로 완전히 도입된다.

1. 발명의 분야

본 발명은 일반적으로 지방 조직으로부터 유래된 세포, 더욱 특히는, 지방세포 유래의 재생성 세포 (예를 들어, 줄기 세포 및(또는) 선조 세포), 지방세포 유래의 재생성 세포의 사용 방법, 지방세포 유래의 재생성 세포를 함유하는 조성물, 및 지방 이식을 증대시키는 데 사용되는 지방세포 유래의 재생성 세포의 제조 및 사용을 위한 시스템에 관한 것이다.

2. 관련 기술의 설명

지방 이식은, 어느 한 부위로부터 지방 조직 (지방)을 수거하여 또다른 부위에 재이식하는 것을 포함하는, 비교적 흔한 미용상 절차, 치료 절차 및 구조적 절차이다 ([Coleman 1995]; [Coleman 2001]). 지방 이식은 안면 주름, 주름살, 곰보자국 및 디보트(divot)와 같은 미용상의 작은 결함을 복구하는 데 널리 이용되고 있으며, 이는 또한 미용상 유방확대 및 재건에도 이용되고 있다 ([Bircoll and Novack 1987]; [Dixon 1988]). 둔부의 확대 또한 지방 이식 접근법을 이용하여 수행하고 있다 ([Cardenas-Camarena, Lacouture et al. 1999]; [de Pedroza 2000]; [Peren, Gomez et al. 2000]).

그러나, 기존의 지방 이식 방법은 감염 ([Castello, Barros et al. 1999]; [Valdatta, Thione et al. 2001]), 및 유방 X-선 촬영법 및 다른 유방 영상화 방법에 방해가 될 수 있는 칼슘침착 및 상흔 ([Huch, Kunzi et al. 1998])을 비롯한 실재 부작용과 연관되어 있다. 최근의 지방 이식 방법은 또한, 예를 들어 이식된 물질이 상흔 조직에 의해 완전하게 또는 부분적으로 흡수되거나 또는 재배치되는 불일치 생착(生着)(engraftment)과도 연관되어 있다 ([Eremia and Newman 2000]). 유방확대성형술에서, 예를 들어, 지방 조직의 사용은 새로운 혈관이 이식물을 형성하여 공급하는 데 소요되는 시간 동안 이식된 지방 조직의 괴사에 부분적으로 기여할 수 있는 조직의 기능 상실을 초래하기도 한다 ([Saunders, Keller et al. 1981]; [Eppley, Smith et al. 1990]; [Nishimura, Hashimoto et al. 2000]). 이 와 마찬가지로, 연부 조직 결함을 장기간에 걸쳐 고치기 위해, 자가 지방을 비롯한 수많은 물질이 상흔, 주름살 및 다른 연부 조직 결함의 충전에 사용되고 있다 ([Coleman 2001]; [Maas and Denton 2001]). 그러나, 상기 기재된 바와 같이, 이러한 지방 조직 이식은 또한 혈관신생 및 괴사의 결핍을 초래하는 문제가 있다.

자가 지방 이식은 또한 연부 조직 충전재 또는 지지체 구조물이 필요한 비-미용상의 임상적 세팅에도 적용된다. 그 일례는 이식된 지방이 요도벽 및 비뇨기 괄약근 구조를 지지하도록 하는 스트레스성 요실금이다 ([Palma, Riccetto et al. 1997]; [Lee, Kung et al. 2001]). 그러나, 상기 기술은 이식된 지방의 내구성이 부족하기 때문에 널리 수용되지 않고 있다. 유사한 접근법이 또다른 괄약근 장애인 대변실금에 이용되고 있다 ([Shafik 1995]; [Bernardi, Favetta et al. 1998]). 지방 이식이 비-미용상의 임상적 세팅에 적용되는 또다른 예로는 성대 마비, 성대 위축, 삽관에 의한 외상, 및 반후두절제술후 결함, 및 성대 이식 ([Koufman 1991]; [Mikaelian, Lowry et al. 1991]; [Hsiung, Woo et al. 2000]; [Perie, Ming et al. 2002]), 방사선 요법에 의해 초래된 연부 조직 결함의 복구 ([Jackson, Simman et al. 2001]) 및 전쟁 중 부상 ([Ghobadi, Zangeneh et al. 1995]), 허리 디스크 수술 ([Bernsmann, Kramer et al. 2001]; [Kanamori, Kawaguchi et al. 2001]), 및 발바닥 발 패드 (plantar foot pad)의 위축된 조직의 복구 ([Chairman 1994]; [Lauf, Freedman et al. 1998])가 있다. 이러한 접근법들 모두는 상기 미용상 적용의 경우에 대해 기재된 문제점에 직면하게 된다.

다수의 군에서 장기 생존력 및 보유력을 개선시키는 방식으로 이식편을 보충 하는 방법을 조사하고 있다. 한 군에서는 무혈청 세포 배양 배지를 이용하여 동물 모델에서 이식편 생존률을 향상시킨 결과가 보고되었으며 ([Ullmann, Hyams et al. 1998]), 다른 군에서는 이식된 조직을 성장 인자로 증대시켜 또다른 모델 시스템에서 이식편 생존률을 향상시킬 수 있다는 것이 밝혀졌다 ([Eppley, Snyders et al. 1992]; [Yuksel, Weinfeld et al. 2000]; [Yuksel, Weinfeld et al. 2000]).

세포가 생존하여 상처로부터 새로운 지방 조직이 생성되도록 하기 위해 지방세포 전구 세포를 피브린 접착제 내에 삽입한 후에 이식하는 다른 접근법이 쇼엘러 (Schoeller) 등에 의해 제안되었다 ([Schoeller, Lille et al. 2001]). 인공 중합체를 상기 세포와 함께 시딩하는 것을 포함하는 유사한 접근법도 사용되고 있다 ([Patrick, Chauvin et al. 1999]). 이러한 접근법들과 관련된 문제는 이들이 새로운 혈관 생성 (혈관형성(angiogenesis)) 기능을 상실한 지방 조직의 한 가지 성분 (지방세포)만을 내인성 메카니즘으로 유도할 수 있다는 것이다. 또한, 전지방세포의 자가-재생 능력이 제한되어 지방세포의 장기 생산력이 전달될 수 없을 수 있다.

따라서, 기존의 방법과 관련된 문제점을 감소시키면서 환자에게 지방 조직을 투여하는 개선된 방법이 여전히 요구되고 있다.

발명의 요약

본 발명은, 적어도 부분적으로는, 본 발명의 지방세포 유래의 재생성 세포 (예를 들어, 내피 전구 세포)가 혈관형성 지지체를 제공할 수 있으며 혈관 내피 세포 및 지방세포 둘 모두를 장기간 생산할 수 있다는 발견에 기초한다. 따라서, 본 발명은 지방 이식, 예를 들어 자가 지방 이식의 증대 방법을 제공한다. 본 발명은 또한, 지방 조직으로부터 추출한 후에 조작할 필요가 감소되거나 또는 필요가 없는 증가된 수율, 경도 및 순도로 성숙한 재생성 세포를 제조하는 데 이용되는 빠르고 신뢰할 수 있는 장치, 시스템 및 방법을 제공한다. 본 발명은 무손상 지방 조직과 혼합하여 치료상, 구조상 또는 미용상의 유익성을 촉진, 발생 또는 지지하기 위해 필요한 첨가제와 함께 수용자에게 직접 배치할 수 있는 지방 조직으로부터 유래된 세포를 사용하는 조성물, 방법 및 시스템을 추가로 제공한다.

한 실시양태에서, 본 발명에 따라 제조되는 재생성 세포는 제조 후, 무손상 (비-해리된 또는 비-프로세싱된) 지방 조직 단편과 혼합되어 조성물을 형성한다. 따라서, 상기 조성물은 지방 조직과 재생성 세포의 혼합물을 포함한다. 상기 조성물은 수용자에게 이식되어, 외형적 결함 (주름살, "디보트", 곰보자국 및 큰 결손)의 수정을 위해 또는 요도와 같은 손상된 구조체에 지지체를 제공하기 위해 자가 연부 조직 충전재를 제공할 수 있다. 상기 조성물은 또한 유방확대 수술 및 연부 조직 결함과 관련된 유방 영역에 투여될 수 있다.

지방 조직 프로세싱은 밀폐된 멸균 액체/조직 경로를 유지하는 시스템에서 일어난다. 이는 밀폐된 멸균 용기 및 밀폐된 경로내에서 조직과 액체를 전달하는 튜브의 미리 조립된 연결 세트의 사용에 의해 달성된다. 상기 시스템은 시약의 첨가, 온도, 및 프로세싱 시기를 자동화할 수 있는 프로세싱 장치에 연결될 수 있어서, 상기 프로세싱을 수동으로 조작하기 위해 필요한 작동기의 필요를 덜어준다. 바람직한 실시양태에서, 조직 추출에서부터 프로세싱을 거쳐 수용자에게 배치하는 전체 절차는 모두 동일한 설비에서, 실제로는 상기 수술을 받고 있는 환자의 동일한 실내에서 수행될 수 있다.

특정 실시양태에서, 환자의 치료 방법은,

a) 조직 제거 시스템을 제공하는 단계;

b) 상기 조직 제거 시스템을 사용하여 환자로부터 재생성 세포가 밀집된 지방 조직을 제거하는 단계;

c) 상기 지방 조직의 적어도 일부를 프로세싱하여, 프로세싱 이전의 지방 조직의 재생성 세포와는 밀집도가 다른 재생성 세포를 수득하는 단계; 및

d) 환자에게 투여하기 전에 상기 조직 제거 시스템으로부터 상기 재생성 세포를 제거함이 없이, 재생성 세포를 환자에게 투여하여 그 환자를 치료하는 단계

를 포함한다.

다른 실시양태에서, 환자의 치료 방법은,

a) 조직 제거 시스템을 제공하는 단계;

b) 상기 조직 제거 시스템을 사용하여 환자로부터 재생성 세포가 밀집된 지방 조직을 제거하는 단계;

c) 지방 조직을 프로세싱하여, 지방 조직 중 재생성 세포의 밀집도를 증가시키는 단계;

d) 재생성 세포가 농축된 지방 조직과 지방 조직의 또다른 단위 부분을 혼합하는 단계; 및

e) 재생성 세포의 밀집도가 증가된 지방 조직을 환자에게 투여하여 그 환자 를 치료하는 단계

를 포함한다.

특별한 실시양태에서, 환자는 연부 조직 결함에 대해 치료된다. 다른 실시양태에서, 환자의 유방을 치료한다. 또다른 실시양태에서, 환자는 요실금에 대해 치료된다. 본원에 개시된 치료 방법은 자가 및 비-자가 지방 이식 둘 다를 요하는임의의 미용상의 또는 비-미용상의 장애를 치료하기 위해 사용될 수 있다.

바람직한 실시양태에서, 환자를 치료를 위해 사용되는 재생성 세포는 줄기 세포 또는 선조 세포이다. 다른 실시양태에서, 재생성 세포는 내피 선조 세포이다. 또다른 실시양태에서, 재생성 세포는 본원에 기재한 재생성 세포의 임의의 집단이다. 추가로, 본 발명에 포함되는 치료 방법에 사용되는 재생성 세포 집단은 동종 또는 이종 세포 집단이다.

본 발명의 또다른 측면에 따라, 재생성 세포는 다른 세포, 조직, 조직 단편, 또는 세포 성장 및(또는) 분화의 다른 자극 인자와 조합되어 수용자에게 배치된다. 예를 들어, 재생성 세포는 성장 인자 및(또는) 사이토카인, 예를 들어 혈관형성 또는 동맥형성 성장 인자와 조합될 수 있다. 재생성 세포는 또한 면역억제 약물과 조합될 수 있다. 이들 첨가제는, 재생성 세포를 본 발명의 시스템 및 방법을 이용하여 농축시키는 동안 또는 농축시킨 후에 투여될 수 있다. 본 발명의 또다른 측면에서, 상기 재생성 세포는 수용자에게 배치되기 전에 이식 물질, 수술 장치, 세포 배양 장치 또는 정제 장치와 같은 다른 표적으로 표적화될 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 수용자의 치료상, 구조상 또는 미용상의 유익성을 유도하도록 의도 된 단일 수술 절차의 면에서 상기 세포는 그가 수득된 사람에게 임의의 상기 언급한 첨가제와 함께 배치된다.

본원에 기재한 임의의 특징 또는 특징들의 조합은 본 발명의 범위내에 있으며, 그러한 임의의 조합에 포함된 특징들은 본 명세서 및 당업자의 지식의 면에서 명백한 바와 같이 서로 상반되지 않는다. 본 발명의 추가의 장점 및 측면은 하기하는 발명의 상세한 설명으로부터 명백해진다.

도 1은 필터 조립체를 1개 포함하는, 조직으로부터 재생성 세포를 분리하는 시스템을 예시한다.

도 2는 복수개의 필터 조립체를 직렬 구조로 포함하는, 도 1과 유사한 시스템을 예시한다.

도 3은 복수개의 필터 조립체를 일렬 구조로 포함하는, 도 1과 유사한 시스템을 예시한다.

도 4는 원심분리 챔버를 포함하는, 조직으로부터 재생성 세포를 분리하는 시스템을 예시한다.

도 5는 조직으로부터 재생성 세포를 분리하는 시스템에 이용된 미리 고정된 필터를 포함하는 수집 챔버의 단면도이다.

도 6은 침출식(percolative) 여과 시스템을 이용하여 조직으로부터 재생성 세포를 분리하는 시스템의 프로세싱 챔버의 단면도이다.

도 7은 재생성 세포를 농축시키는 원심분리 장치를 이용하여 재생성 세포를 분리하는 시스템의 프로세싱 챔버의 단면도이다.

도 8은 도 7의 프로세싱 챔버의 또다른 단면도이다.

도 9.1, 9.2 및 9.3은 본 발명의 시스템에 이용되는 수력분급(elutriation) 성분을 예시한다.

도 10은 시스템을 통한 액체의 이동을 위해 진공 압력을 이용하는, 조직으로부터 재생성 세포를 분리하는 시스템을 예시한다. 진공 시스템은 시스템의 출구에 진공 펌프 또는 진공원을 적용함으로써 구축되어, 미리 결정된 제어된 속도로 시스템을 통해 조직 및 액체를 끌어낼 수 있으며, 시스템에 잠금꼭지, 통풍구 및 클램프을 이용하여 유동 방향 및 시기를 제어할 수 있다.

도 11은 시스템을 통한 액체의 이동을 위해 가압을 이용하는, 조직으로부터 재생성 세포를 분리하는 시스템을 예시한다. 가압 시스템은 연동식 펌프와 같은 기계적 수단을 이용하여, 결정된 속도로 시스템을 통해 액체 및 조직을 끌어내거나 추진시킬 수 있으며, 밸브, 잠금꼭지, 통풍구 및 클램프를 이용하여 유동 방향 및 시기를 제어할 수 있다.

도 12A는 액체의 공급물 스트림이 필터의 공극에 대해 접선방향으로 유동하는 여과 공정을 예시한다. 도 12B는 액체의 공급물 스트림이 필터의 공극에 대해 수직방향으로 유동하는 여과 공정을 예시한다.

도 13은 본 발명의 시스템을 위한 예시적인 일회용 세트를 예시한다.

도 14는 본 발명의 시스템을 위한 예시적인 재사용가능한 성분을 예시한다.

도 15는 도 13과 유사한 일회용 세트 및 도 14와 유사한 재사용가능한 성분 을 이용하여 조립된 본 발명의 예시적인 장치를 예시한다.

도 16A 및 16B는 배양된 지방세포 유래의 줄기 세포에 의한 VEGF 단백질 (5A) 및 PIGF 단백질 (5B)의 발현을 도시한다.

도 17은 지방세포 유래의 줄기 세포 집단 내의 내피 선조 세포의 검출을 도시한다.

도 18A 및 18B는 정상 마우스 (7A) 및 스트렙토조토신-처리된 마우스 (7B) 의 혈관 구조의 시험관내 개발을 도시한다.

도 19는 음성 대조군에 비해 지방세포 유래의 줄기 세포로 처리된 뒷발 허혈 마우스에서 혈류 복원의 평균의 증가를 도시한다.

도 20A 및 20B는 지방세포 유래의 줄기 세포 투여량의 증가에 의해 이식 생존율 및 혈관형성이 개선된다는 것을 보여주고 (20A), 조직학적 시편에서 지방 조직 구조의 보유를 도시한다 (20B).

본 발명은 지방세포 유래의 재생성 세포 ("ADC")를 사용하여 자가 지방 이식을 증대시키는 방법을 제공한다. 예를 들어, 본 발명은 본 발명의 지방세포 유래의 재생성 세포가 (1) PIGF, VEGF, bFGF, IGF-II, 에오탁신(Eotaxin), G-CSF, GM-CSF, IL-12 p40/p70, IL-12 p70, IL-13, IL-6, IL-9, 렙틴(Leptin), MCP-1, M-CSF, MIG, PF-4, TIMP-1, TIMP-2, TNF-α 및 트롬보포에틴(Thrombopoetin)을 비롯한 혈관형성 성장 인자 및 사이토카인을 발현하고, (2) 혈관 형성에서의 기능이 잘 확립된 내피 선조 세포 (EPC)를 포함하고, (3) 시험관내에서 혈관을 발달시키고, (4) 생체내 허혈성 조직 생존을 지원한다는 것을 입증하고 있다. 따라서, 재생성 세포는 예를 들어 투여 부위에서 혈관신생을 촉진시킴으로써 자가 지방 이식을 증대시킬 수 있다.

본 발명을 보다 용이하게 이해할 수 있도록 하기 위해, 먼저 특정 용어를 정의한다. 추가의 정의는 상세한 설명 전반에 걸쳐 설명되어 있다.

본원에서 사용된 바와 같이, "재생성 세포"는 기관, 조직, 또는 생리학적 단위 또는 시스템의 구조 또는 기능의 완전 또는 부분적 재생, 복원 또는 대체를 유발하거나 이에 기여함으로써 치료상, 구조상 또는 미용상의 유익성을 제공하는 본 발명의 시스템 및 방법을 사용하여 수득된 임의의 세포를 지칭한다. 재생성 세포의 예로는 ASC, 내피 세포, 내피 전구 세포, 내피 선조 세포, 대식세포, 섬유아세포, 혈간주위세포, 평활근 세포, 지방전구세포, 분화되거나 미분화된 지방세포, 각질세포, 단일분화성(unipotent) 및 다능성(multipotent) 선조 세포 및 전구 세포 (및 이들의 자손) 및 림프구를 들 수 있다.

재생성 세포가 치료상, 구조상 또는 미용상의 유익성을 제공할 수 있는 한 가지 메카니즘은, 이들 또는 그의 자손을 신생의, 기존의, 또는 복구된 조직 또는 조직 성분에 혼입하는 것이다. 예를 들어, ASC 및(또는) 그의 자손은 신생의 골, 근육 또는 다른 구조적 또는 기능적 조직에 혼입되어 치료성, 구조상 또는 미용상의 개선을 유발하거나 이에 기여할 수 있다. 유사하게, 내피 세포 또는 내피 전구 세포 또는 선조 세포 및 이들의 자손은 기존의, 신생의, 복구된, 또는 확장된 혈관에 혼입되어 치료상, 구조상 또는 미용상의 유익성을 유발하거나 이에 기여할 수 있다.

재생성 세포가 치료상, 구조상 또는 미용상의 유익성을 제공할 수 있는 또다른 메카니즘은, 주어진 조직 또는 조직 성분의 구조 또는 기능의 생성, 유지, 복원 및(또는) 재생을 촉진시키는 분자, 예를 들어 성장 인자를 발현시키고(거나) 분비시키는 것이다. 예를 들어, 재생성 세포는 조직 또는 세포의 성장을 향상시키는 분자를 발현하고(거나) 분비하여, 구조 또는 기능의 개선에 직접적 또는 간접적으로 참여할 수 있다. 재생성 세포는 새로운 혈관의 발달을 자극시키고, 즉 혈관형성을 촉진시키고; 혈액 운반 용량을 확대시킴으로써 기존의 소혈관 (곁가지)의 산소 공급을 개선시키고; 손상 부위로부터 먼 부위로부터의 재생성 세포의 이동을 유도함으로써 이러한 세포의 손상 부위로의 귀환 및 이동을 향상시키고; 성장을 촉진시키고(거나) 손상 부위 내의 세포 생존을 촉진시킴으로써 기능 또는 구조의 유지를 촉진시키고; 항-세포자멸성을 갖는 분자를 전달함으로써 세포사의 속도 또는 가능성 및 기능의 영구 손실을 감소시키고; 내인성 재생성 세포 및(또는) 다른 생리학적 메카니즘과 상호작용하는 기능 중 하나 이상의 기능을 수행할 수 있는, 예를 들어 혈관 내피 성장 인자 (VEGF), 태반 성장 인자 (PIGF) 및 이들의 이소형(isoform)을 비롯한 성장 인자 또는 사이토카인을 발현 및(또는) 분비할 수 있다.

재생성 세포는 존재하는 대로의 그 '천연' 형태로 사용하거나, 본 발명의 시스템 및 방법을 사용하여 조직으로부터 추출할 수 있거나, 또는 이들은 성장 인자 또는 다른 생물학적 반응 변형제를 사용한 자극 또는 프라이밍(priming)에 의해, 유전자 전달 (일시적 또는 안정적인 전달)에 의해, 추가로 물성 (예를 들어 크기 또는 밀도)을 기준으로 한 생성된 집단의 준파편화, 고체상 물질에의 차동 부착, 세포 표면 또는 세포내 분자의 발현, 세포 배양 또는 다른 생체외 또는 생체내 조작, 변형, 또는 추가로 본원에 기재한 바와 같은 파편화에 의해 변형될 수 있다. 재생성 세포는 또한 추가로 본원에 기재한 바와 같이 세포의 관련 특징을 변형하거나 향상시키는 인자, 약물, 화학물질 또는 다른 작용제를 전달하는 다른 세포 또는 합성 또는 생물학적 스캐폴드(scaffold), 물질 또는 장치와 조합으로 사용될 수 있다.

본원에서 사용된 바와 같이, "재생성 세포 조성물"은 조직, 예를 들어 지방 조직을 세척하고 적어도 부분적으로 해리(disaggregation)한 후에 다량의 액체에 전형적으로 존재하는 세포의 조성물을 지칭한다. 예를 들어, 본 발명의 재생성 세포 조성물은 ASC, 내피 세포, 내피 전구 세포, 내피 선조 세포, 대식세포, 섬유아세포, 혈간주위세포, 평활근 세포, 지방전구세포, 분화되거나 미분화된 지방세포, 각질세포, 단일분화성 및 다능성 선조 세포 및 전구 세포 (및 이들의 자손) 및 림프구를 비롯한, 다양한 여러가지 종류의 재생성 세포를 포함한다. 또한, 재생성 세포 조성물은 조직 단편에 존재할 수 있는 콜라겐, 또는 본원에 기재한 조직 해리 과정에 사용되거나 이로부터 생성된 잔류의 콜라게나제 또는 다른 효소 또는 작용제와 같은 1종 이상의 오염체를 함유할 수 있다.

본원에서 사용된 바와 같이, "재생 의학"은 재생성 세포를 직접적 또는 간접적으로 대상체에 배치함으로써 유래된 임의의 치료상, 구조상 또는 미용상의 유익성을 지칭한다. 본원에서 사용된 바와 같이, "지방 이식"이라는 용어는 재생 의학의 한 형태이며, 신체의 한 영역으로부터 과잉 지방 세포를 제거하고 신체의 또다른 영역으로 이를 재삽입하는 모든 절차를 포함하는 것으로 의도된다. 지방 이식은 자가 및 비-자가 지방 이식 둘다를 포함한다. "자가 지방 이식"이라는 용어는 지방 제거 및 재삽입을 동일한 대상체에서 수행하는 모든 절차를 포함하는 것으로 의도된다. 미용상의 지방 이식 수술의 예로는 입술, 비순 (입에서 코 주름까지), 주름살 및 다른 안면 주름 (눈 주위, 눈썹 사이 뿐만 아니라 나머지 안면상의 처짐), 눈밑, 볼, 턱, 관자놀이, 유방, 대퇴부, 종아리, 팔, 복부, 둔부 뿐만 아니라 신체의 임의의 다른 영역에 대한 지방 이식술 또는 삽입술을 들 수 있다. 미용상의 지방 이식 수술은 안면 이식술, 안검성형술, 눈썹 올림술, 안면 당김술, 목 당김술, 보톡스 적용, 화학 박피 및 레이저 재표술(resurfacing)과 같은 다른 미용상의 적용과 조합될 수 있다. 비-미용상의 지방 이식 수술은 위식도, 요도 및 직장 조임근에서의 지방 삽입술을 비롯한 조임근 장애 치료를 위한 삽입술을 들 수 있다. 또한, 지방 이식 수술은 외상 (예를 들어 방사선) 또는 질환 유도성 연부 조직 결함 (예를 들어 복벽 탈장), 편측 안면소체증, 성대 손상 및 요추 장애의 치료에 사용될 수 있다. 또한, 지방 이식 수술은 지혈이상증(dyslipidimia), 하이포아디포넥티네미아(hypoadiponectinemia), 고지혈증(hyperlipidemia), 지방위축증(lipatrophy) 및 지방비대증(lipohypertrophy)을 포함하나 이에 제한되지 않는 지방-관련 질환 또는 장애의 치료에 사용될 수 있다.

본원에서 사용된 바와 같이, "줄기 세포"는 다양한 다른 세포 유형으로 분화될 잠재력이 있는 다분화성 재생성 세포를 지칭하며, 이는 하나 이상의 특정 기능을 수행하고 자체-재생되는 능력을 보유한다. 본원에 개시된 줄기 세포의 일부는 다능성이다.

본원에서 사용된 바와 같이, "선조 세포"는 하나 초과의 세포 유형으로 분화될 잠재력이 있는 다분화성 재생성 세포를 지칭한다. 본원에서 사용된 바와 같이, "선조 세포"는 또한 단지 단일 세포 유형으로만 분화될 잠재력이 있는 단일분화성 재생성 세포를 지칭하며, 이는 하나 이상의 특정 기능을 수행하고 자체-재생되는 능력이 없거나 제한되어 있다. 특히, 본원에서 사용된 바와 같이, "내피 선조 세포"는 혈관 내피 세포로 분화될 잠재력이 있는 다분화성 또는 단일분화성 세포를 지칭한다.

본원에서 사용된 바와 같이, "전구 세포"는 하나의 세포 유형으로 분화될 잠재력이 있는 단일분화성 재생성 세포를 지칭한다. 전구 세포 및 그의 자손은 광범위한 증식능을 보유할 수 있고, 예를 들어 적절한 조건 하에 증식될 수 있는 림프구 및 내피 세포이다.

본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "혈관형성"은 기존의 혈관계 및 조직으로부터 새로운 혈관을 생성하는 과정을 지칭한다 (문헌 [Folkman, 1995]). 어구 "복구 또는 리모델링"은 기존의 혈관계의 재형성을 지칭한다. 조직 허혈의 완화은 결정적으로 혈관형성에 의존한다. 새로운 혈관의 자발적 성장은 허혈 영역 내에서와 그 주위에서의 측부 순환을 제공하여, 혈류를 개선시키고, 허혈에 기인하는 증상을 완화시킨다. 혈관형성 매개되는 질환 및 장애는, 급성 심근 경색증, 허혈성 심근병증, 말초 혈관 질환, 허혈성 뇌졸중, 급성 세뇨관 괴사, 허혈성 상처 포함 AFT, 패혈증, 허혈성 장 질환, 당뇨병성 망막증, 신경병증 및 신병증, 혈관염, 허혈성 뇌병증, 생리적 발기기능장애, 허혈성 또는 외상성 척수 손상, 다발성 기관계 부전, 허혈성 잇몸 질환 및 이식 관련 허혈을 포함한다.

본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "혈관형성 인자" 또는 "혈관형성 단백질"은 기존의 혈관계로부터 새로운 혈관의 성장을 촉진 ("혈관형성")시킬 수 있는 임의의 공지된 단백질, 펩티드 또는 다른 작용제를 지칭한다. 본 발명에 사용하기에 적합한 혈관형성 인자는, 태반 성장 인자 (문헌 [Luttun et al., 2002]), 대식세포 콜로니 자극 인자 (문헌 [Aharinejad et al., 1995]), 과립구 대식세포 콜로니 자극 인자 (문헌 [Buschmann et al., 2003]), 혈관 내피 성장 인자 (VEGF)-A, VEGF-A, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D, VEGF-E (문헌 [Mints et al., 2002]), 뉴로필린 (문헌 [Wang et al., 2003]), 섬유아세포 성장 인자 (FGF)-1, FGF-2 (bFGF), FGF-3, FGF-4, FGF-5, FGF-6 (문헌 [Botta et al., 2000]), 안지오포이에틴 1, 안지오포이에틴 2 (문헌 [Sundberg et al., 2002]), 에리트로포이에틴 (문헌 [Ribatti et al., 2003]), BMP-2, BMP-4, BMP-7 (문헌 [Carano and Filvaroff, 2003]), TGF-베타 (문헌 [Xiong et al., 2002]), IGF-1 (문헌 [Shigematsu et al., 1999]), 오스테오폰틴 (문헌 [Asou et al., 2001]), 플레이오트로핀 (문헌 [Beecken et al., 2000]), 액티빈 (문헌 [Lamouille et al., 2002]), 엔도텔린-1 (문헌 [Bagnato and Spinella, 2003]) 및 이들의 조합을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 혈관형성 인자는 독립적으로, 또는 서로 조합되어 작용할 수 있다. 조합되는 경우, 혈관형성 인자는 또한 상승작용적으로 작용할 수도 있고, 이로 인해 조합된 인자의 효과는 별도로 작용하는 개별적 인자의 효과의 합보다 크다. 용어 "혈관형성 인자" 또는 "혈관형성 단백질"은 또한 이러한 인자의 기능적 동족체를 포함한다. 기능적 동족체는, 예를 들어 인자의 기능적 부분을 포함한다. 기능적 동족체는 또한 인자의 수용체에 결합되어 혈관형성 및(또는) 조직 리모델링을 촉진시키는 데 있어 인자의 활성을 모방하는 항-이디오타입 항체를 포함한다. 이러한 항-이디오타입 항체를 생성하는 방법은 당업계에 공지되어 있고, 예를 들어 그의 내용이 본원에 참고로 도입된 WO 97/23510에 기재되어 있다.

본 발명에 사용되는 혈관형성 인자는 임의의 적합한 공급원으로부터 제조하거나 수득할 수 있다. 예를 들어, 상기 인자는 그의 천연 공급원으로부터 정제하거나, 합성에 의해 또는 재조합 발현에 의해 제조할 수 있다. 상기 인자는 단백질 조성물로서 환자에게 투여할 수 있다. 별법으로, 상기 인자는 상기 인자를 코딩하는 발현 플라스미드 형태로 투여할 수 있다. 적합한 발현 플라스미드의 구축은 당업계에 공지되어 있다. 발현 플라스미드를 구축하기에 적합한 벡터는, 예를 들어 아데노바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡트, 아데노 관련 바이러스 벡터, RNA 벡터, 리포솜, 양이온성 지질, 렌티바이러스 벡터 및 트랜스포손을 포함한다.

본원에서 사용된 바와 같이, "줄기 세포수" 또는 "줄기 세포 빈도수"는 지방세포 유래의 세포 (ADC)를 낮은 세포 밀도 (10,000개 미만 세포/웰)에서 플레이팅하고 MSC 성장을 지지하는 성장 매질 (예를 들어, 10% 소태아 혈청, 5% 말 혈청 및 항생제/항진균제가 보충된 DMEM/F12 매질)에서 성장시키는 클론원성 검정에서 관찰되는 콜로니의 수를 지칭한다. 세포를 2주 동안 성장시킨 후, 배양물을 헤마톡실린으로 염색하고 50개 초과의 세포의 콜로니를 CFU-F로서 카운팅한다. 줄기 세포 빈도수를 플레이팅된 유핵 세포 100개 당 관찰된 CFU-F의 수로서 계산한다 (예를 들어, 1,000개의 유핵 ADC 세포로 개시된 플레이트에서 카운팅된 15개의 콜로니의 경우 줄기 세포 빈도수는 1.5%가 된다). 줄기 세포수는 줄기 세포 빈도수에 수득된 유핵 ADC 세포의 총 수를 곱하여 계산한다. ADC 세포로부터 성장한 CFU-F는, 높은 비율(%) (약 100%)로 세포 표면 분자인 CD105를 발현하며, CD105는 골수 유래의 줄기 세포에 의해서도 발현되는 것이다 (문헌 [Barry et al., 1999]). CD105는 또한 지방 조직 유래의 줄기 세포에 의해서도 발현된다 (문헌 [Zuk et al., 2002]).

본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "지방 조직"은 지방을 저장하는 결합 조직을 포함하는 지방을 지칭한다. 지방 조직은 ASC 및 내피 선조 세포 및 전구 세포를 비롯한 다수의 재생성 세포 유형을 함유한다.

본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "지방 조직의 단위"는 분리된 또는 측정가능한 양의 지방 조직을 지칭한다. 지방 조직의 단위는 단위의 중량 및(또는) 부피를 결정함으로써 측정할 수 있다. 상기에서 확인된 데이타를 기초로 하여, 환자로부터 제거된 프로세싱된 지방 조직의 단위는 세포 성분의 0.1% 이상이 줄기 세포인, 즉 상기한 바와 같이 결정되는 줄기 세포 빈도수가 0.1% 이상인 세포 성분을 보유한다. 본원의 개시와 관련하여, 지방 조직의 단위는 환자로부터 제거한 지방 조직의 전체 양 또는 환자로부터 제거한 지방 조직의 전체 양 미만의 양을 지칭할 수 있다. 따라서, 지방 조직의 단위는 또다른 지방 조직의 단위와 조합되어, 중량 또는 부피가 개별 단위의 중량 또는 부피의 합이 되는 지방 조직의 단위를 형성할 수 있다.

본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "부분"은 전체보다 적은 물질의 양을 지칭한다. 소량 부분은 50% 미만의 양을, 다량 부분은 50% 초과의 양을 지칭한다. 따라서 환자로부터 제거한 지방 조직의 전체 양보다 적은 지방 조직의 단위는 제거된 지방 조직의 부분이 된다.

본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "프로세싱된 지방흡인물"은 성숙된 지방세포 및 결합 조직으로부터 활성 세포 성분 (예를 들어, 줄기 및 선조 세포를 함유하는 성분)을 분리하도록 프로세싱된 지방 조직을 지칭한다. 이 분획은 본원에서 "지방세포 유래의 세포" 또는 "ADC"로서 지칭된다. 전형적으로, ADC는 지방 조직으로부터 세포를 세척 및 분리함으로써 수득되는 재생성 세포의 펠렛을 지칭한다. 상기 펠렛은 전형적으로 세포의 현탁액을 원심분리하여 세포가 원심분리 챔버 또는 세포 농축기의 하부에서 응집되도록 함으로써 수득된다.

본원에서 사용되는 용어 "투여", "도입", "전달", "배치" 및 "이식"은 본원에서 상호 교환가능하게 사용되며, 원하는 부위에서 ADC의 적어도 부분적 국부화를 유발하는 방법 또는 경로를 통해 본 발명의 ADC를 대상체에 배치시키는 것을 지칭한다. ADC는 세포 또는 세포의 성분의 적어도 일부분이 여전히 생존하고 있는 대상체의 원하는 위치로 전달되게 하는 임의의 적절한 경로에 의해 투여될 수 있다. 대상체에 투여된 후 세포의 생존 기간은 몇 시간, 예를 들면 24시간, 내지 몇 일 정도로 짧거나 수년 정도로 길 수 있다.

본원에서 사용되는 용어 "대상체"는 온혈 동물, 바람직하게는 인간을 비롯한 포유류를 포함한다. 바람직한 일 실시양태에서, 대상체는 영장류이다. 보다 바람직한 일 실시양태에서, 대상체는 인간이다.

이제, 본 발명의 바람직한 실시양태에 대해 자세히 설명할 것이며, 그 예는 첨부된 도면에 예시되어 있다. 가능한 곳이라면, 동일하거나 또는 유사한 참조 번호가 도면 및 명세서에 사용되어 동일하거나 또는 같은 부분을 지칭한다. 도면은 간소화된 형태이며 정확한 비율이 아님을 주지하여야 한다. 본원과 관련하여, 단지 편리함과 명확함을 위해, 상부, 하부, 좌, 우, 위, 아래, 넘어, 위쪽, 아래쪽, 밑, 뒤 및 앞과 같은 방향 관련 용어가 첨부된 도면에 대해서 사용된다. 이러한 방향 관련 용어가 어떠한 식으로든 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되지 말아야 한다.

본원은 몇몇 예시된 실시양태를 참조하지만, 이들 실시양태는 단지 예를 위해 제시된 것이며 제한을 목적으로 제시된 것이 아니라는 것을 이해하여야 한다. 하기 상세한 설명은 예시적 실시양태에 대해 논의하고 있지만 첨부된 특허청구범위에 의해 정의되는 발명의 사상 및 범위 내일 수 있는 실시양태의 모든 변형, 대안 및 균등물을 포함하는 의도로서 해석되어야 한다. 본 발명은 당업계에서 통상적으로 사용되는 각종 세포 또는 조직 분리 기술과 함께 실시될 수 있으며, 통상 실시되는 많은 공정 단계가 단지 본 발명의 이해를 위해 필요하기 때문에 본원에 포함된다.

상기한 바와 같이, 재생성 세포, 예를 들면 줄기 및 선조 세포가 폭넓게 다양한 조직으로부터 수거될 수 있다. 본 발명의 시스템은 이러한 모든 조직에 대해 사용될 수 있다. 그러나, 지방 조직은 재생성 세포의 특히 풍부한 공급원이다. 따라서, 본원에서는 재생성 세포의 공급원으로서 지방 조직을 사용하여 본 발명의 시스템을 예시하나, 이는 단지 예를 위한 것이며 이에 제한되지 않는다.

지방 조직은 통상의 당업자에게 공지된 임의의 방법에 의해 수득될 수 있다. 예를 들면, 지방 조직은 (주사기 또는 동력에 의한) 지방흡입술에 의해 또는 지방절제술에 의해, 예를 들면 흡입 조력 흡인술(suction-assisted lipoplasty), 초음파 조력 흡인술, 및 적출 지방절제술(excisional lipectomy) 또는 이들의 조합에 의해 환자로부터 제거될 수 있다. 지방 조직은 재생성 세포를 분리하고 농축할 목적으로 본원에 개시된 발명의 시스템에 의해 제거되고 수집되고 프로세싱된다. 수집된 조직의 양은 공여자의 체질량지수(body mass index) 및 연령, 수집할 수 있는 시간, 이용할 수 있는 지방 조직 수거 부위의 이용성, 부수적이며 선재하는 약물처리 및 조건(예를 들면, 항응혈 요법), 및 조직을 수집하는 임상적 목적을 비롯한 수많은 인자에 따라 달라진다. 예를 들면, 마른 개체로부터 추출한 지방 조직 100 ml의 줄기 세포 비율(％)은 살찐 공여자로부터 추출한 것보다 높다 (표 1). 이는 아마도 살찐 개체의 증가된 지방 함량의 희석 효과를 반영한다. 따라서, 본 발명의 일 면에 따라, 보다 마른 환자로부터 회수될 양에 비해 과체중 공여자로부터 보다 많은 양의 조직을 수득하는 것이 바람직할 수 있다. 또한, 이러한 관찰 결과는 본 발명의 유용성이 다량의 지방 조직을 갖는 개체에만 제한되는 것이 아님을 나타낸다.

조직 및 세포 수율에 대한 체질량지수의 영향

체질량지수 상태	수득된 조직의 양 (g)	전체 세포 수율 (x 10 7 )
보통	641±142	2.1±0.4
비만	1,225±173	2.4±0.5
p값	0.03	0.6

지방 조직이 프로세싱된 후, 생성된 재생성 세포에는 실질적으로 성숙 지방세포 및 결합 조직이 존재하지 않는다. 따라서, 본 발명의 시스템은 조사 및(또는) 치료 목적을 위해 사용될 수 있는 이질의 복수 지방 유래 재생성 세포를 생성시킨다. 바람직한 일 실시양태에서, 세포는 수용자의 체내로의 배치 또는 재수혈에 적합하다. 다른 실시양태에서, 세포는 조사를 위해 사용될 수 있다. 예를 들면, 세포는 연장된 기간 동안 생존할 수 있어 추가 연구를 위해 사용될 수 있는 줄기 또는 선조 세포주를 확립하는데 사용될 수 있다.

이제, 본 발명의 바람직한 실시양태에 대해 자세히 설명할 것이며, 그 예는 첨부된 도면에 예시되어 있다. 가능한 곳이라면, 동일하거나 또는 유사한 참조 번호가 도면 및 명세서에 사용되어 동일하거나 또는 같은 부분을 지칭한다. 도면은 간소화된 형태이며 정확한 비율이 아님을 주지하여야 한다. 본원과 관련하여, 단지 편리함과 명확함을 위해, 상부, 하부, 좌, 우, 위, 아래, 넘어, 위쪽, 아래쪽, 밑, 뒤, 앞, 먼 및 인접과 같은 방향 관련 용어가 첨부된 도면에 대해서 사용된다. 이러한 방향 관련 용어가 어떠한 식으로든 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되지 말아야 한다.

본원은 몇몇 예시된 실시양태를 참조하지만, 이들 실시양태는 단지 예를 위해 제시된 것이며 제한을 목적으로 제시된 것이 아니라는 것을 이해하여야 한다. 하기 상세한 설명은 예시적 실시양태에 대해 논의하고 있지만 첨부된 특허청구범위에 의해 정의되는 발명의 사상 및 범위 내일 수 있는 실시양태의 모든 변형, 대안 및 균등물을 포함하는 의도로서 해석되어야 한다. 본 발명은 당업계에서 통상적으로 사용되는 각종 의학 절차와 함께 이용될 수 있다.

이제 도면을 참조하면, 본 발명의 시스템 (10)은 일반적으로 하나 이상의 조직 수집 챔버 (20), 프로세싱 챔버 (30), 폐기물 챔버 (40), 배출 챔버 (50) 및 샘플 챔버 (60)으로 구성된다. 상기 여러 챔버는 하나 이상의 도관 (12)을 통해 서로 연결되어, 밀폐된 멸균 유체/조직 통로를 유지하면서 생물학적 물질을 함유하는 유체가 한 챔버로부터 다른 챔버로 통과할 수 있다. 도관은 본원에서 루멘(lumen) 또는 튜브로도 상호 교환가능하게 언급되는 강성 또는 가요성 물체를 포함할 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 도관은 임상적 상황(clinical setting)에서 통상적으로 사용되는 폴리에틸렌 튜브와 같은 가요성 튜브의 형태이다. 다른 실시양태에서, 튜브는 실리콘으로 구축될 수 있다. 사용되는 가요성 튜브는 붕괴의 가능성이 감소되도록 감압을 견딜 수 있어야 한다. 또한, 사용되는 가요성 튜브는 시스템에서 사용될 수 있는, 예를 들면 용적형 펌프(positive displacement pump)에 의해 생성되는 가압을 견딜 수 있어야 한다.

시스템의 모든 챔버는 1개 이상의 포트, 예를 들어 표준 IV를 받아들이는 배출구 (22) 또는 주입구 (21), 주사기 및 흡입 튜브 연결부로 구성될 수 있다. 포트는 밀폐된 포트, 예컨대 고무 격막으로 폐쇄된 주사기 바늘 진입 포트 (51)일 수 있다. 주입구는 도관에 의해 1개 이상의 캐뉼라 (도시하지 않음)에 연결될 수 있다. 예를 들어, 조직 주입구 (21)은 통합된 단독 사용 지방흡입 캐뉼라에 연결될 수 있고, 도관은 가요성 튜브일 수 있다. 도관은 일반적으로 시스템의 한 챔버에서 또다른 챔버로의 액체 통로를 제공하도록 위치한다. 상기 말단 쪽으로, 도관 및 포트는 예를 들면 수동 또는 자동으로 작동할 수 있는 흡입 장치 (도시하지 않음)에 연결될 수 있다. 흡입 장치는 예를 들어, 주사기 또는 전기 펌프일 수 있다. 흡입 장치는 환자로부터 조직을 흡인하기에 충분한 감압을 제공할 수 있어야 한다. 일반적으로, 당업자, 예를 들어 외과의사에게 공지된 임의의 적합한 흡입 장치를 사용할 수 있다.

도관 (12)는 시스템의 다양한 성분들 중에서 물질의 흐름을 제어하는 1개 이상의 클램프 (도시하지 않음)를 추가로 포함할 수 있다. 클램프는 시스템의 상이한 영역을 효과적으로 밀폐함으로써 시스템의 무균상태를 유지하는데 유용하다. 별법으로, 도관 (12)는 시스템을 통해 물질의 흐름을 제어하는 1개 이상의 밸브 (14)를 포함할 수 있다. 밸브 (14)는 도면에서 빈 원으로 확인된다. 바람직한 실시양태에서, 밸브는 전기화학적 핀치 밸브일 수 있다. 또다른 실시양태에서, 밸브는 공기 밸브일 수 있다. 또다른 실시양태에서, 밸브는 수압 밸브 또는 기계적 밸브일 수 있다. 상기 밸브는 바람직하게는 레버에 연결될 수 있는 제어 시스템으로 작동된다. 레버는 수동으로 조작되어 작동될 수 있다. 자동화 실시양태에서, 제어 시스템은 레버뿐 아니라 예정된 작동 조건에서 밸브를 작동시킬 수 있는 프로세싱 장치에 연결될 수 있다. 특정 자동화 실시양태에서, 밸브의 작동은 프로세스가 최적화될 수 있도록 부분적으로 자동화되고 부분적으로는 사용자의 선호도에 맞춰질 수 있다. 또다른 실시양태에서, 특정 밸브는 수동으로 작동되고 다른 밸브들은 프로세싱 장치를 통해 자동으로 작동될 수 있다. 밸브 (14)는 또한 1개 이상의 펌프, 예를 들어 연동 펌프 (34) 또는 용적형 펌프 (도시하지 않음)와 함께 사용될 수도 있다. 도관 (12) 및(또는) 밸브 (14)는 센서 (29), 예를 들어 광학 센서, 초음파 센서, 압력 센서, 또는 시스템을 통해 흐르는 다양한 액체 성분 및 액체 수준 중에서 구별할 수 있는 당업계에 공지된 기타 모니터 형태로 구성될 수도 있다. 바람직한 실시양태에서, 센서 (29)는 광학 센서일 수 있다.

시스템은 또한 복수개의 필터 (36)을 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 필터는 시스템의 챔버 (28)내에 있을 수 있다. 시스템 내의 상이한 챔버는 상이한 필터로 구성될 수 있다. 필터는 바람직하지 못한 세포 및 시스템에 따라 사용될 수 있는 해리제로부터 재생성 세포, 예를 들어 줄기 세포 및(또는) 선조 세포를 분리하는데 효과적이다. 한 실시양태에서, 필터 조립체 (36)은 중공사 여과 장치를 포함한다. 또다른 실시양태에서, 필터 조립체 (36)은 침강 프로세스와 함께 사용될 수 있거나 사용될 수 없는 침출식 여과 장치를 포함한다. 추가의 실시양태에서, 필터 조립체 (36)은 수력분급 장치 및 프로세스와 함께 사용될 수 있거나 사용될 수 없는 원심분리 장치를 포함한다. 또다른 실시양태에서, 시스템은 상기 필터 장치의 조합을 포함한다. 본 발명의 여과 기능은, 콜라겐, 유리 지질, 유리 지방세포 및 잔류 콜라게나제와 같은 최종 농축물로부터 제거하는 일부 필터 및 최종 생성물을 농축하는데 사용되는 기타 필터에 의해 2배가 될 수 있다. 시스템의 필터는 직경 및(또는) 길이가 20 내지 800 ㎛ 범위인 복수개의 공극으로 구성될 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 수집 챔버 (20)은 80 내지 400 ㎛ 범위인 복수개의 공극을 갖는 앞서고정된 필터 (28)을 갖는다. 또다른 바람직한 실시양태에서, 수집 챔버 (20)은 복수개의 265 ㎛ 공극을 갖는 앞서고정된 필터 (28)을 갖는다. 다른 실시양태에서, 필터는 분리가능하고(하거나) 처치가능하다.

시스템은 또한 시스템의 1개 이상의 챔버내에 함유된 물질의 온도를 조절하도록 위치하는 1개 이상의 온도 제어 장치 (도시하지 않음)로 구성될 수도 있다. 온도 제어 장치는 가열기, 냉각기 또는 이들 둘 다일 수 있다, 즉 가열기와 냉각기 사이에서 전환될 수 있다. 온도 장치는 조직, 해리제, 재현탁제, 세정제, 세척제 또는 첨가제를 비롯한 시스템을 통과하는 임의의 물질의 온도를 조절할 수 있다. 예를 들어, 지방 조직을 가열하는 것은 해리를 용이하게 하며, 이때 재생성 세포 배출물을 냉각하는 것이 생존력 유지에 바람직하다. 또한, 미리 가온된 시약이 최적의 조직 프로세싱에 필요한 경우에, 온도 장치의 역할은 온도를 상승 또는 하강시키는 것보다는 예정된 온도를 유지하는 것이다.

폐쇄된 멸균 액체/조직 경로를 유지하기 위하여, 모든 포트 및 밸브는 시스템의 밀폐된 구조를 유지하는 클로저(closure)를 포함할 수 있다. 클로저는 액체, 공기 및 기타 오염물에 불투과성인 막일 수 있거나, 당업계에 공지된 임의의 기타 적합한 클로저일 수 있다. 또한, 시스템의 모든 포트는, 시스템의 무균상태를 손상하지 않으면서 챔버내 물질을 배출하기 위해 주사기, 바늘 또는 기타 장치를 수용할 수 있도록 고안될 수 있다.

본원에 기재한 바와 같이, 조직은 임의의 당업계에 인식된 방법을 통해 환자로부터 추출될 수 있다. 흡인된 조직은 조직이 세정 및 분해되는 (12a)와 같은 도관을 경유하여 수집 챔버 (20)으로 옮겨진다. 흡인된 조직은 전형적으로 밀폐된 출입 포트, 예컨대 고무 격막으로 밀폐된 주사기 바늘 진입 포트 (수집 챔버내에 도시하지 않음)를 경유하여 수집 챔버 (20)으로 도입된다.

수집 챔버 (20)은 복수개의 가요성 또는 경질의 캐니스터 또는 실린더 또는 이들의 조합으로 구성될 수 있다. 예를 들어, 수집 챔버 (20)은 다양한 크기의 1개 이상의 경질 캐니스터로 구성될 수 있다. 수집 챔버 (20)은 또한 1개 이상의 가요성 주머니로 구성될 수도 있다. 상기 시스템에서, 주머니는 주머니에 흡입을 적용할 때 주머니가 붕괴될 가능성을 감소시키는 것을 돕는 내부 또는 외부 프레임과 같은 지지체를 갖는 것이 바람직하다. 수집 챔버 (20)은 프로세싱 챔버 (30)에서 수행된 프로세스의 세척 및 농축 단계 이전에 조직을 적절하게 세정시키고 분해시키는데 필요한 양의 염수를 수용하도록 크기조절된다. 바람직하게는, 수집 챔버 (20)에 존재하는 조직 또는 액체의 부피가 맨눈으로 쉽게 확인가능하다. 예를 들어, 지방 조직으로부터 재생성 세포를 분리하고 농축하기 위해, 적합한 수집 챔버는 지방흡인물 800 ml 및 염수 1200 ml를 수용하는 능력을 갖는다. 따라서, 한 실시양태에서, 수집 챔버 (20)은 적어도 2 리터의 보유량을 갖는다. 또다른 실시양태에서, 혈액으로부터 적혈구 세포를 분리하고 농축하기 위해, 수집 챔버 (20)은 적어도 1.5 리터의 보유량을 갖는다. 일반적으로, 수집 챔버 (20)의 크기는 환자로부터 수집된 조직의 종류 및 양에 따라 크게 달라진다. 수집 챔버 (20)은 조직을 약 5 ml 내지 최대 약 2 리터만큼 적은 양으로 수용하도록 크기조절될 수 있다. 더 작은 조직 부피, 예를 들어 5 ml 내지 100 ml를 위해, 조직은 수집 챔버 (20)으로 옮겨지기 전에 주사기에 모여질 수 있다.

수집 챔버 (20)는 멸균될 수 있는 임의의 적합한 생체적합성 물질을 사용하여 구축될 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 수집 챔버 (20)는 ISO 10993 표준에 기재된 혈관내 접촉을 위한 생체적합성 요건을 충족하는 일회용 물질로 구축된다. 예를 들어, 폴리카르보네이트 아크릴 또는 ABS를 사용할 수 있다. 수집 챔버 (20)의 액체 경로에는 바람직하게는 발열원이 없으며, 즉 질환 전달의 위험 없이 혈액 사용에 적합하다. 한 실시양태에서, 수집 챔버 (20)는 사용자가 챔버 중에 존재하는 조직의 대략적인 부피를 육안으로 측정할 수 있게 하는 물질로 구축된다. 다른 실시양태에서, 수집 챔버 (20) 중의 조직 및(또는) 액체의 부피는 자동화 센서 (29)에 의해 측정된다. 수집 챔버 (20)는 바람직하게는 자동화 시스템이 적당한 정도의 정확성으로 챔버내에서 조직 및(또는) 액체의 부피를 측정할 수 있도록 고안된다. 바람직한 실시양태에서, 시스템은 ±15％의 정확성으로 수집 챔버내의 부피를 감지한다.

예로만 제공되는 특정 실시양태에서, 수집 챔버 (20)는 경질 챔버 형태, 예를 들어 265 ㎛의 메쉬 크기를 갖는 의료 등급 폴리에스테르의 대략 원뿔형의 미리고정시킨 필터 (28)를 함유하는 의료 등급 폴리카르보네이트로 구축된 챔버이다. 경질 조직 수집 용기는 높이 약 8 인치 및 직경 약 5 인치의 크기를 가지며, 벽 두께는 약 0.125 인치일 수 있다. 실린더의 내부는, 예를 들어 흡입 튜브용 1개 이상의 포트, 멸균 도킹 기술을 통한 연결용 튜브를 갖는 1개 이상의 포트 및(또는) 고무 격막을 통한 바늘 구멍 평가용 1개 이상의 포트를 통해 평가될 수 있다. 수집 챔버 (20)의 내부에 미리고정시킨 필터 (28)는 바람직하게는 지방조직을 보유하고, 예를 들어, 조직이 환자로부터 제거되는 것처럼 비-지방 조직을 통과시키도록 구조화된다. 더욱 구체적으로, 필터 (28)는 유리 지질, 혈액 및 염수를 통과시키는 한편, 지방 조직의 초기 수거 동안, 또는 또다른 실시양태에서는 지방 조직의 초기 수거 후에, 지방 조직의 단편을 보유할 수 있다. 이와 관련하여, 필터 (28)는 동일하거나 상이한 크기이지만, 약 20 ㎛ 내지 5 mm 크기 범위의 복수개의 공극을 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 필터 (28)는 복수개의 400 ㎛ 공극을 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 필터 (28)는 약 265 ㎛의 공극 크기 및 약 47％ 개방 영역을 갖는 두께 약 200 ㎛의 의료 등급 폴리에스테르 메쉬이다. 이러한 물질은 세정 동안 조직을 보유하지만 세포를 메쉬를 통해 통과시킨 후 조직을 해리시킨다. 따라서, 조직이 환자로부터 흡인될 경우, 비-지방 조직은 지방 조직으부터 분리될 수 있다. 동일한 기능이 물질, 메쉬 크기 및 포트의 갯수 및 유형이 상이한 것으로 달성될 수 있다. 예를 들어, 100 ㎛보다 작거나 수천 미크론 만큼 큰 메쉬 공극 크기가, 지방 조직 응집체 및 단편을 보유하는 동안 염수 및 혈액 세포를 통과시키는 동일한 목적을 달성할 수 있다. 유사하게, 동일한 목적이 대안적인 경질 플라스틱 물질의 사용에 의해, 또는 당업자에게 공지되어 있는 수많은 다른 변형에 의해 달성될 수 있다.

수집 챔버 (20)는 추가로 조직을 세척하는 수단 뿐만 아니라, 조직을 혼합 및(또는) 분해하는 수단으로 구성될 수 있다. 조직을 세척하고, 진탕에 의해 혼합 또는 분해시켜 세포 생존력을 최대화하고 유리 지질의 방출량을 최소화할 수 있다. 한 실시양태에서, 전체 수집 챔버 (20)를 다양한 각도의 아크(arc)를 통해 (예를 들어, 약 45도 내지 약 90도를 통해) 다양한 속도, 예를 들어 1분당 약 30 회전수로 회전시킴으로써 조직을 진탕시킨다. 다른 실시양태에서, 수집 챔버의 내부 표면에 단단하게 부착된 1개 이상의 패들 또는 돌출부로 구성된 수집 챔버 (20) 전체를 다양한 각도의 아크를 통해 (예를 들어, 약 45도 내지 약 90도를 통해) 다양한 속도, 예를 들어 1분당 약 30 회전수로 회전시킴으로써 조직을 진탕시킨다. 특정 실시양태에서, 패들 (25a) 또는 돌출부가 단단하게 부착된 수집 챔버 (20)의 내부 표면은 미리고정시킨 필터 (28)이다. 다른 실시양태에서, 패들 (25a) 또는 돌출부가 단단하게 부착된 수집 챔버 (20)의 내부 표면은 미리고정시킨 필터 (28)의 필터 케이지 (27)이다.

수집 챔버 (20)의 회전은 수집 챔버 (20)에 부착된 또는 근접한 구동 기계 장치에 의해 수행될 수 있다. 구동 기계 장치는 단순한 벨트 또는 기어 또는 당업계에 공지된 다른 구동 기계 장치일 수 있다. 회전 속도는, 예를 들어 1분당 30 회전수일 수 있다. 일반적으로, 높은 속도는 큰 부피의 유리 지질을 생성하는 것으로 알려져 있으며, 최적이 아닐 수 있다. 다른 실시양태에서, 회전되는 축으로서 혼합물을 통해 통과하는 회전축 (25)에 단단하게 부착된 1개 이상의 패들 (25a) 또는 돌출부로 구성된, 수집 챔버 (20) 내부의 회전축 (25)에 조직을 배치시킴으로써 진탕시킨다. 특정 실시양태에서, 단단하게 부착된 패들 (25a)을 갖는 회전축 (25)을 수집 챔버 (20)의 바닥에 위치시킬 수 있다. 이것은, 예를 들어 패들형 장치를 회전 자기장 (예를 들어, 자기 교반기)에 배치함으로써 수행될 수 있다. 별법으로, 조직의 진탕은 당업계에 공지된 단순한 진탕기, 즉 회전없이 위 아래로 흔드는 장치를 사용하여 수행될 수 있다.

도 5에 예시된 시스템의 대표적인 수집 챔버 (20)는 사용자가 사용자에게 제공된 캐뉼라로 조직을 제거할 수 있게 챔버로부터 공기를 배출시키는 데 사용될 수 있는 진공관 (11); 주입구 (21); 폐기물을 배수하거나 제거하는 배출구 (22); 및 자기 교반기 (도시되지 않음)를 사용한 조직 진탕용의 미리고정시킨 필터 (28)의 필터 케이지 (27)에 1개 이상의 패들 (25a)이 단단하게 부착된 패들형 장치를 갖는 회전축 (25)으로 구성된다.

또한 시스템 (10)은 1개 이상의 세척 용액 공급원 (22)으로 구성될 수 있다. 세척 용액 공급원은 염수 (23)의 공급원 및 조직 해리제 (24)의 공급원, 예컨대 콜라게나제를 포함할 수 있다. 세척 용액은 염수, 또는 다른 완충된 또는 완충되지 않은 전해질 용액을 비롯한, 당업자에게 공지된 임의의 용액일 수 있다. 사용될 수 있는 해리제로는 중성 프로테아제, 콜라게나제, 트립신, 리파제, 하이알루로니다제, 데옥시리보뉴클레아제, 블렌드자임(Blendzyme) 효소 혼합물 군의 구성원, 예를 들어 리베라제(Liberase) H1, 펩신 및(또는) 이들의 조합물을 들 수 있다. 프로세싱될 수 있는 조직의 유형은 사용되는 세척 용액의 유형 또는 조합을 지시할 것이다. 전형적으로, 염수 등의 세척 용액은 환자로부터 지방 조직을 제거한 후에 수집 챔버 (20)에 도입한다. 그러나, 세척 용액을 수집 챔버 (20)로 전달한 후 지방 조직을 추출하거나, 지방 조직과 함께 수집 챔버 (20)로 전달할 수 있다. 수집 챔버 (20)에서, 세척 용액 및 추출된 지방 조직을 상기 기재된 방법을 비롯한 임의의 수단에 의해 혼합할 수 있다.

염수 (23) 및(또는) 해리제 (24)용 용기는 멸균 방식으로 내용물을 보유할 수 있는 임의의 적합한 용기, 예를 들어 접을 수 있는 백, 예컨대 임상적 설치에 사용되는 IV 백일 수 있다. 이러한 용기는 염수 및(또는) 해리제를 수집 챔버 (20)의 내부에 전달할 수 있도록 수집 챔버 (20)에 연결된 도관 (12), 예컨대 도관 (12e)을 갖는다. 염수 및(또는) 해리제는 염수 (23) 및(또는) 해리제 (24)용 용기의 외부에 적용되는 단순한 중력을 비롯한 임의의 당업계에 공지된 방식을 통해, 또는 도관, 예를 들어 도 4에서의 도관 (12d) 상에 용적형 펌프를 배치시킴으로써 수집 챔버 (20)의 내부로 전달될 수 있다.

수집 챔버 내부 조직 및(또는) 액체는 30℃ 내지 40℃의 온도 범위에서 유지되어야 한다. 바람직한 실시양태에서, 수집 챔버 내부 현탁액의 온도는 37℃로 유지된다. 특정 실시양태에서, 수술 진행 또는 치료 용도에서 지연이 필요한 경우, 선택 조직을 이후 사용을 위해 수집 챔버 내에 저장할 수 있다. 상기 조직은 (약) 실온 또는 약 4℃에서 96시간까지 저장될 수 있다.

분리 및 농축 공정을 돕기 위해, 수집 챔버 (20)은 챔버 내부 부유액과 비-부유액의 구별을 고려한다. 시스템의 자동화된 실시양태에서, 수집 챔버는 부유액과 비-부유액 사이에 계면이 형성되는 경우 이를 검출할 수 있는 센서 (29)로 구성될 수 있다. 예를 들어, 상기 센서 (29)는 수집 챔버의 배출 액체 통로에서 흘러 나오는 방출물이 빛 굴절을 변화시키는 것을 검출하고, 시스템의 프로세싱 장치에 신호를 전달하여 시스템과 연관된 프로세싱 장치에 따른 하나 이상의 펌프 및(또는) 밸브를 작동시키거나 비작동시킬 수 있는 광학 센서일 수 있다.

부유층은 추가 세척 및 농축이 필요한 재생성 세포로 구성되어 있으므로, 수집 챔버 (20)은 바람직하게는 조직의 혈액 및 기타 비-부유 성분이 폐기물 용기로 배수될 수 있도록 챔버의 최저점에 위치한 배출구 (22)로 구성되어 있다. 이에 따라, 수집 챔버 (20)을 본원에 기재된 하나 이상의 도관 (12)를 통해 하나 이상의 폐기물 용기 (40)과 커플링하여 수집 챔버의 폐기물을 시스템으로부터 배수하거나 제거할 수 있게 한다. 상기 배수는 수동 또는 능동일 수 있다. 예를 들어, 상기에 기재된 비-부유 성분은 중력을 이용, 가압 또는 감압의 적용, 펌프 (34) 또는 통풍구 (32)를 사용하여 배수될 수 있다. 수집 챔버를, 배출구 (22)가 수집 챔버의 바닥 또는 그 근처에 위치하도록 둘 수 있다. 수집 챔버는 바람직하게는 지방 조직 단편을 예컨대 15초 내지 수 분 이상 부유하게 하는 방향에 위치한다. 자동화된 실시양태에서, 시스템의 프로세싱 장치는 사용자가 초기에 입력한 정보 (예를 들어, 프로세싱할 조직의 양)를 기준으로 다양한 파라미터, 예컨대 조직 세척에 필요한 염수의 양 및 시간을 산정한다. 프로세싱 장치의 제어 논리에 따라 특정 밸브 및(또는) 펌프를 작동시키거나 비-작동시켜 수집 챔버 (20)의 폐기물을 시스템으로부터 제거한다. 센서 (29), 예컨대 광학 센서는 시스템의 프로세싱 장치를 신호화하여 조직 프로세싱의 다음 단계를 진행하도록 배치될 수 있다.

바람직한 실시양태, 수집 챔버 (20)은 염수 및 시약을 무균 방식으로 조직에 첨가할 수 있게 하는 폐쇄된 액체 경로로 구성되어 있다. 이에 따라, 수집 챔버 (20)은 조직 및 액체의 자유로운 통과가 가능한 적절한 크기의 도관 (12), 예를 들어 가요성 또는 경직성 도관으로 추가 구성되어 있다. 바람직한 실시양태에서, 도관 (12)는 튜브형이다. 도관 (12)는 액체 또는 조직의 통과를 원하는지 여부에 따라 크기를 다양하게 할 수 있다. 도관 (12)는 또한 시스템을 순환하는 조직 또는 액체의 양에 따라 크기를 다양하게 할 수 있다. 예를 들어, 액체 통과를 위해 상기 도관은 약 0.060 내지 약 0.750 인치 범위의 직경, 및 조직 통과를 위해 상기 도관은 0.312 내지 0.750 인치 범위의 직경을 가질 수 있다. 일반적으로, 도관의 크기는 도관이 수용할 수 있는 양 및 상기 도관을 통해 조직 또는 액체를 이동하는 데 필요한 시간이 균형을 이루도록 선택된다. 시스템의 자동화된 실시양태에서, 상기 파라미터, 즉, 이동량 및 시간은 적합한 신호를 시스템의 프로세싱 장치에 보낼 수 있는지 확인되어야 한다. 이는 상기 장치가 한 챔버로부터 또다른 챔버로 액체 및 조직의 정확한 양을 이동 가능하게 한다.

수집 챔버 (20)은 또한 프로세싱 챔버 (30)으로 세척된 지방 조직을 제거한다. 이에 따라, 수집 챔버 (20)은 세척된 지방 조직의 이동 및 저장을 위해 필수적인 튜브 (12), 밸브 (14) 및 펌프 (34)와 연결되어야 한다. 또한, 수집 챔버 (20)은 전형적으로 세척 용액이 챔버 내부로 전달되도록 하기 위해 1개 이상의 포트 (21), 및 폐기물 및 기타 물질이 수집 챔버 (20)으로부터 유출되도록 하기 위해 1개 이상의 포트 (22)를 포함한다. 예를 들어, 수집 챔버는 본원에 기재된 바와 같이 하나 이상의 밀봉된 입구 포트를 포함할 수 있다. 수집 챔버 (20)은 또한 세척 용액이 수집 챔버 내로 전달되고(거나) 폐기물이 유출되는 동안 시스템을 멸균 상태로 유지하기 위해 하나 이상의 캡 (도시되지 않음), 예컨대 상부 캡 및 하부 캡을 포함할 수 있다. 포트 (21)은 수집 챔버의 캡 또는 수집 챔버의 측벽에 제공될 수 있다.

신선한 세척 용액으로 세척하는 공정은 용액 내 비-부유 오염 물질의 잔류량이 사전-측정 수준에 도달할 때까지 반복될 수 있다. 즉, 지방 조직 단편을 비롯한 상기에 기재된 혼합물의 부유 물질을 포함하는 수집 챔버 (20) 내 잔류 물질을, 원하지 않는 물질의 양이 원하는 사전-측정 수준에 도달할 때까지 1회 이상 추가로 세척할 수 있다. 세척의 종점을 결정하는 한가지 방법은 조직 용액 내 적혈구의 양을 측정하는 것이다. 이는 540 nm 파장에서 흡수되는 빛을 측정하여 수행할 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 약 0.546 내지 약 0.842 사이의 범위가 허용되는 것으로 간주된다.

원하는 횟수의 세척 후, 남은 지방 조직 성분을 분해시키기 위해 조직 해리제를 수집 챔버 (20)에 전달할 수 있다. 예를 들어, 염수, 예컨대 상기에 기재된 바와 같이 염수 공급원 (23)으로부터 전달된 염수를 콜라게나제, 예컨대 상기에 기재된 바와 같이 콜라게나제 공급원 (24)로부터 전달된 콜라게나제와 함께 또는 콜라게나제 첨가 직전에 지방 조직에 첨가할 수 있다. 이어서, 세척된 지방 조직 및 조직 해리제를 세척된 지방 조직이 해리될 때까지 상기에 기재된 진탕 방법과 유사한 방식으로 진탕할 수 있다. 예를 들어, 세척된 지방 조직 및 조직 해리제를 대략 90 도의 아크를 통해 수집 챔버 전체를 회전시키거나, 회전되는 축으로서 용액을 통해 통과하는 하나 이상의 패들로 구성된 축을 가짐으로써, 및(또는) 수집 챔버의 내부 표면 상에 패들 또는 돌출부로 구성된 수집 챔버 전체를 회전시켜 진탕할 수 있다.

한 실시양태에서, 지방 조직 단편을 37℃ 또는 약 37℃에서 약 20 내지 60분 동안 콜라게나제-함유 효소 용액과 혼합시킨다. 다른 실시양태에서, 보다 고농도의 콜라게나제 또는 유사 작용제를 첨가하여 분해 시간을 감소시킬 수 있다. 상기에 기재된 바와 유사하게, 수집 챔버 (20)을 이어서 수직 위치로 배치시켜, 배출 포트 (22)가 부유 세포 및 조직 단편을 부유시키기에 충분한 시간 동안 수집 챔버의 바닥에 위치하게 할 수 있다. 전형적으로, 시간은 약 15초 내지 수 분의 범위일 수 있지만, 변형된 실시양태에서 다른 시간을 수행할 수 있다.

목적하는 바를 위해 어떤 지방세포 유래의 세포를 사용할 것인지에 따라서, 지방 조직은 부분적으로 분해되거나, 또는 완벽하게 분해될 수 있다. 예를 들어, 지방세포 유래의 세포가 지방 조직 단위와 조합되어 있는 실시양태에서는, 수거된 지방 조직을 부분적으로 분해하고, 상기 부분 분해된 지방 조직의 일부를 제거한 후, 수집 챔버 내 남아있는 지방 조직의 잔여 부분을 계속하여 분해하는 것이 바람직하다. 별법으로, 세척된 지방 조직의 일부를 제거하고, 임의로 분해시키기 전에 샘플 용기 내에 둔다. 또다른 실시양태에서는, 수거된 지방 조직을 부분적으로 분해하여 환자에게 다시 도입하기 전에 세포를 농축시킨다. 한 실시양태에서, 지방 조직을 일반적으로 약 20 분 미만의 시간 동안 조직 해리제와 혼합한다. 이어서 부분 분해된 조직의 일부를 수집 챔버로부터 제거할 수 있으며, 또다른 40 분 동안 지방 조직을 조직 해리제와 혼합하여 남아있는 부분 분해된 조직을 추가로 분해할 수 있다. 지방세포 유래의 세포로서 재생성 세포의 본질적으로 순수한 집단을 사용한 경우, 지방 조직은 완전히 분해될 수 있다.

결과를 향상시키기 위해 필요한 경우, 세척 및 (또는) 해리하는 동안, 1종 이상의 첨가제를 다양한 용기에 첨가할 수 있다. 첨가제의 몇몇 예로는 세척 및 해리를 최적화하는 작용제, 프로세싱 동안에 활성 세포 집단의 생존력을 향상시키는 첨가제, 항균제 (예를 들어 항생제), 지방세포 및(또는) 적혈구 세포를 용해하는 첨가제, 또는 관심 세포 집단을 풍부하게 하는 첨가제 (고상 부분 또는 세포 집단의 상당한 감소 또는 증가를 촉진하는 다른 것으로의 차별적 부착에 의함) 등이 있다. 다른 가능한 첨가제로는 재생성 세포의 회수 및 생존력을 촉진하는 것들 (예를 들어, 카파아제 억제제) 또는 주입 또는 정치 상의 역반응의 가능성을 감소시키는 것들 (예를 들어, 세포 또는 결합 조직의 재응집 억제제)이 있다.

충분한 정착 시간이 경과한 후, 세척된 지방 조직 단편 및 조직 해리제의 최종 혼합물의 비-부유 분획은 재생성 세포, 예를 들어 줄기 세포 및 기타 지방세포 유래의 선조 세포를 함유할 것이다. 본원에 기재된 바와 같이, 재생성 세포를 함유하는 비-부유 분획은 프로세싱 챔버 (30)로 전달되어, 상기 챔버 내에서 관심 재생성 세포, 예컨대 지방세포 유래의 줄기 세포가 혼합물의 비-부유 분획 내에 존재하는 다른 세포 및 물질들로부터 분리될 것이다.

따라서, 프로세싱 챔버 (30)를 시스템 내에 위치시켜서 세정하고 분해시킨 조직 현탁액을 수집 챔버 (20)로부터 튜브 (12), 밸브 (14) 및 펌프 (34)를 통해 프로세싱 챔버 (30)로 이동시킨다. 프로세싱 챔버는 lO mL 내지 1.2 L 범위의 조직/액체 혼합물을 수용할 수 있는 크기이다. 바람직한 실시양태에서, 프로세싱 챔버는 800 mL를 수용할 수 있는 크기이다. 특정 실시양태, 수집 챔버 (20)로부터의 총 재생성 세포 조성물을 프로세싱 챔버 (30)로 보낸다. 그러나 다른 실시양태에서, 재생성 세포 조성물의 일부를 프로세싱 챔버 (30)로 보내고, 또다른 부분은 시스템의 다른 영역, 예를 들어 샘플 챔버 (60)로 보내어, 이후에 프로세싱 챔버 (30) 내에서 프로세싱된 세포들과 재혼합시킨다. 앞서 본원에 기재된 바와 같이, 본 발명의 재생성 세포 조성물은 전형적으로 조직, 예를 들어 지방 조직을 세척하고 적어도 부분적으로 분해한 후의 다량의 액체로 존재하는 세포 조성물이다. 즉, 조직 해리제와 혼합된 후 수집 챔버 (20)로부터 전달된 재생성 세포 조성물은, 줄기 세포, 선조 세포, 내피 전구 세포, 지방세포 및 본원에 기재한 기타 재생성 세포를 비롯한 각종 상이한 유형의 세포들을 포함한다. 또한 재생성 세포 조성물은 지방 조직 단편 내에 존재하는 콜라겐 및 기타 결합 조직 단백질 및 이들의 단편, 또는 조직 해리 과정으로부터의 잔류 콜라게나제와 같은 오염물을 하나 이상 함유할 수 있다.

프로세싱 챔버 (30)는 멸균될 수 있는 임의의 적합한 친생물학적 물질을 사용하여 구축할 수 있다. 바람직한 실시양태에서, ISO 10993 기준에 기재된 바와 같은 혈관내 접촉을 위한 친생물적 조건들을 만족하는 폐기가능한 물질로 프로세싱 챔버 (30)를 구축한다. 예를 들어, 폴리카르보네이트, 아크릴산, ABS, 에틸렌 비닐 아세테이트 또는 스티렌-부타디엔 공중합체 (SBC)를 사용할 수 있다. 또다른 실시양태에서, 폐기가능한 프로세싱 챔버의 액체 경로에는 발열원이 부재한다. 프로세싱 챔버는 플라스틱 주머니, 예컨대 혈액은행에서 혈액을 프로세싱하는데 통상적으로 사용하는 것들의 형태로 존재할 수 있고, 또는 다른 실시양태에서는, 프로세싱 챔버가 구조적으로 고정된 것일 수 있다 (도 6). 한 실시양태에서, 프로세싱 챔버 (30)는 그의 전문이 본원에 참고로 도입된, 본원과 공동명의의 미국 출원 제10/316,127호 (2001년 12월 7일 출원) 및 동 제10/325,728호에 개시된 프로세싱 챔버와 유사할 수 있다.

특정 실시양태에서, 수집 챔버 (20)로부터의 재생성 세포 조성물을 프로세싱 챔버 (30) 내로 도입하고, 상기 챔버에서 용액을 여과하여 특정 재생성 세포 조성물을 분리하고 (하거나) 농축할 수 있다. 세포 여과란 다른 상이한 성분 또는 상이한 유형의 세포들로부터 특정 성분 및 세포를 분리하는 방법이다. 예를 들어, 본 발명의 재생성 세포 조성물은 줄기 세포, 선조 세포 및 지방세포 뿐만 아니라 지방 조직 단편 중에 존재하는 콜라겐, 또는 조직 해리 과정으로부터의 잔류 콜라게나제와 같은 하나 이상의 오염물을 비롯한 각종 상이한 유형의 세포를 포함한다. 프로세싱 챔버 (30) 내에 존재하는 필터 (36)으로 재생성 세포의 특정 아집단, 예를 들어 줄기 세포 또는 내피 선조 세포 등의 분리 및 농축을 할 수 있다.

액체로부터의 세포의 여과와 관련된 일부 변수들에는 필터 매체의 공극 크기, 공극의 형상 (형태), 필터의 표면적, 여과시키는 용액의 유동 방향, 막횡단 압력, 특정 세포 집단의 희석, 미립자 크기 및 형태 뿐만 아니라 세포 크기 및 세포 생존력이 포함되나 이에 제한되지 않는다. 본원의 개시 내용에 따르면, 분리하거나 여과하길 원하는 특정 세포는 전형적으로 지방세포 유래의 줄기 세포이다. 그러나, 특정 실시양태에서, 상기 특정 세포에는 지방세포 유래의 선조 세포, 예컨대 내피 전구 세포가 단독으로 또는 줄기 세포와 조합하여 포함될 수 있다.

재생성 세포 조성물을 필터 조립체, 예컨대 필터 조립체 (36)를 통과시킬 수 있다. 특정 실시양태에서, 필터 조립체 (36)은 상이한 기능을 수행하여 재생성 세포 조성물을 별개의 부분 또는 성분으로 분리하도록 구성된 복수개의 필터로 구성된다. 예를 들어, 필터 중 하나는 재생성 세포 조성물로부터 콜라겐을 분리하고, 다른 하나는 재생성 세포 조성물로부터 지방세포 및 (또는) 지질 성분를 분리하고, 다른 하나는 재생성 세포 조성물로부터 잔류 효소들, 예컨대 조직 해리제를 분리하도록 구성될 수 있다. 특정 실시양태에서, 필터 중 하나가 조성물로부터의 콜라겐 및 조직 해리제의 분리와 같은 2개의 기능을 수행할 수 있다. 복수개의 필터들은 전형적으로 직렬 배치되나, 필터의 일부 이상이 일렬로 배치될 수도 있다. 필터 조립체 (36)의 필터들의 직렬 배열을 도 2에 나타낸다. 필터 조립체 (36)의 필터들의 직렬 배열은 도 3에 나타낸다.

한 실시양태에서, 필터 조립체 (36)은 제1 필터, 제2 필터 및 제3 필터를 포함한다. 제1 필터는 재생성 세포 조성물 중에 존재하는 콜라겐 입자를 제거하도록 구성된다. 상기 콜라겐 입자는 전형적으로 직경이 대략 0.1 미크론이고 길이는 20 미크론까지일 수 있다. 콜라겐 입자는 분해에 따라 다양한 크기일 수 있다. 이들은 또한 피브릴일 수 있으며, 이는 이들이 꼬임과 회전을 가짐을 의미한다. 본원에 기재한 모든 필터는 폴리에테르술폰, 폴리에스테르, PTFE, 폴리프로필렌, PVDF, 또는 가능하게는 셀룰로스로부터 제조될 수 있다. 콜라겐을 필터링하기 위한 두 가지 가능성이 존재한다. 그 하나는 큰 입자를 먼저 제거하여 세포가 통과하도록 시도하는 것으로, 이는 예를 들어 아마도 10 미크론 범위의 필터가 요구될 것이다. 두 번째 방법은 콜라겐이 잘 분해될 것이라는 목적으로, 예컨대 4.5 미크론의 작은 크기의 필터를 사용하여 세포를 잘 포획하고, 콜라겐이 통과되도록 하게 하는 것이다. 이에는 세포가 필터로부터 떨어져 부유하도록 하는 수단이 요구될 것이다. 또한 콜라겐 섬유를 끌어당겨 유지시키는 필터를 장치하는 가능성도 있을 수 있다.

제2 필터는 재생성 세포 조성물 중에 부유하지 않는 유리 미성숙 지방세포를 제거하도록 구성된다. 한 실시양태에서, 제2 필터는 폴리에스테르로 구축될 수 있으며, 약 30 내지 약 50 미크론, 바람직하게는 약 40 미크론의 공극 크기를 갖는다. 제2 필터로 지칭되었으나, 그러한 장치의 배치는 보다 큰 세포 및 입자의 초기 제거를 용이하게 하기 위해 두 번째가 아닌 첫 번째 위치일 수 있다. 제3 필터는 조성물 중에 존재하는 미사용 또는 잔류 콜라게나제 또는 다른 조직 해리제를 제거하도록 구성된다. 바람직한 실행에 있어서, 콜라게나제는 시간 경과에 따라 퇴화될 수 있다. 한 실시양태에서, 제3 필터는 직경 또는 길이가 1 ㎛ 미만인 복수개의 공극을 포함한다. 특정 실시양태에서, 공극의 직경은 1 ㎛ 미만일 수 있다. 다른 실시양태에서, 공극의 직경은 10 kD 내지 5 미크론이다. 특정 실시양태에서, 제3 필터는 본원에 논의된 바와 같이 작은 부피의 염수 또는 다른 세척 용액으로 재생성 세포 집단을 농축시키도록 구성될 수 있다. 본 발명에서 바람직한 바와 같이, 단지 최종 필터만이 중공사 단위이다. 필터의 모두가 중공사 유형의 것일 필요는 없다. 중공사 단위는 바람직한 실행에서 최종 필터에 사용되는데, 이는 재생성 세포에 최소한의 악영향을 미치면서 콜라게나제를 제거하는 데 가장 효율적이기 때문이다. 장치가 기성품의 수집물인 실시양태에서 세 필터는 별개의 하우징에 존재한다. 중공사 단위가 제3 필터에 사용되는 경우, 제1 및 제2 필터를 하나의 하우징으로 조합하는 것이 가능하다. 최종 필터가 중공사 구조가 아닌 경우 세 필터 모두가 한 하우징 내에 존재할 수 있다.

필터 조립체 (36)의 필터는 프로세싱 챔버 (30) 내에 위치하거나, 프로세싱 챔버 (30)과는 별도 성분으로 제공될 수 있다. 또한, 필터 조립체 (36)의 필터는 다중 프로세싱 챔버에, 또는 직렬 방식으로 제공될 수 있다. 특정 실시양태에서, 도관 또는 튜브는 프로세싱 챔버 또는 챔버들로서 기능할 수 있다. 프로세싱 챔버는 필터들을 연결하는 도관의 내부 부피에 알맞도록 크기를 줄일 수 있다. 이러한 유형의 시스템은 조직 용액의 부피를 적절하게 크기 조절한다면 올바르게 기능할 것이다. 따라서, 도관은 액체가 필터를 통해 유동하면서 세포와 함께 액체를 함유함으로써 프로세싱 챔버로서 기능할 수 있다. 시스템을 프라이밍 및 운전하는 공정 중 세포/조직이 불필요하게 손실되지 않도록 도관의 부피를 최소화시키도록 주의해야 한다.

상기 실시양태를 참조하면, 세척된 세포 및 잔류 콜라겐, 지방세포 및(또는) 분해되지 않은 조직 해리제를 함유하는 재생성 세포 조성물은 제1 필터를 통해 보내져 조성물로부터 콜라겐 입자를 적어도 일부, 바람직하게는 실질적으로 모두 제거함으로써, 여과된 용액 중에 콜라겐 입자가 더 적게, 바람직하게는 없도록 한다. 지방세포 및(또는) 분해되지 않은 조직 해리제를 함유하는 여과된 재생성 세포 조성물은 이어서 제2 필터를 통해 보내져 여과된 재생성 세포 조성물로부터 유리 지방세포를 적어도 일부, 바람직하게는 실질적으로 모두를 제거할 수 있다. 이어서, 분해되지 않은 조직 해리제를 함유하는 2회 여과된 재생성 세포 조성물은 본원에 논의된 바와 같이 중공사 여과 장치와 같은 제3 필터를 통해 보내져, 재생성 세포 조성물로부터 분해되지 않은 조직 해리제를 제거하거나 감소시킬 수 있다.

3회 여과된 재생성 세포 조성물 (즉, 제1, 제2 및 제3 필터를 통과한 후에 남는 조성물)은 이어서 다중 배출구를 포함하는 프로세싱 챔버 (30)의 부분을 포함할 수 있는 다중 배출구로 보내질 수 있다. 상기 배출구는 필요한 압력을 유지할 뿐만 아니라, 도관을 통한 수집 챔버 (20), 배출 챔버 (50), 및(또는) 폐기물 용기 (40)을 포함할 수 있는 다른 용기로의 연결부를 제공할 수 있다.

한 실시양태에서, 필터 조립체 (36)의 필터는 중공사 여과 부재를 포함한다. 또는, 즉, 필터는 필터 매체로 형성된 중공 튜브의 수집을 포함한다. 개시된 시스템 (10)에 사용될 수 있는 필터 매체의 예로는 폴리술폰, 폴리에테르술폰 또는 혼합 에스테르 물질 등을 들 수 있다. 상기 필터 매체의 중공사 또는 중공 튜브는 필터 조립체 (36)의 원통형 카트리지 내에 함유될 수 있다. 필터 매체의 개개의 튜브 또는 섬유는 전형적으로 내부 직경이 약 0.1 mm 내지 약 1 mm이며, 바람직한 값은 약 0.5 mm이다. 적합한 원통형 카트리지의 직경 및 길이는 카트리지의 내부에 배치될 수 있는 필터 매체의 개개의 튜브의 수를 결정할 것이다. 적합한 중공사 필터 카트리의 일례는 파이버플로 (FiberFlo; 등록상표) 접선방향 유동 필터, 카탈로그 번호 M-C-050-K (민테크(Minntech), 미국 미네소타주 미네아폴리스 소재)이다. 필터 매체의 공극 크기는 약 10 kDa 내지 약 5 미크론 범위일 수 있으며, 바람직한 공극 크기는 약 0.5 미크론이다.

중공사 필터에서, 각각의 중공 튜브는 제1 연부, 제2 연부, 및 몸체 내에 위치하고 제1 연부와 제2 연부 사이에서 연장되는 루멘을 갖는다. 각각의 중공 튜브의 몸체는 복수개의 공극을 포함한다. 공극은 도 12A에 나타낸 바와 같이 일반적으로 재생성 세포 조성물이 몸체의 루멘을 통해 유동함으로써 여과되고, 여과할 생성물이 공극을 접선방향으로 통과하도록 몸체 내에 배향된다. 즉, 액체 중 작은 입자는 몸체의 루멘을 통해 액체의 흐름에 대해 공극을 접선방향으로 통과한다. 재생성 세포를 함유하는 조성물은 조성물이 여과될 때 각각의 중공 튜브의 루멘을 통과한다. 바람직하게는, 조성물의 유동은 각각의 중공 튜브의 몸체의 공극에 대해 접선방향이다.

액체의 접선 방향 유동을 이용함으로써, 줄기 세포의 여과 효율은 다른 여과 기술에 비해 향상될 수 있다. 예를 들어, 몇몇 여과 기술에 따라, 필터 매질의 공극은 필터가 액체의 유동에 대해 수직으로 배향되는 방식으로 위치하기 때문에, 필터 매질이 여과되는 액체의 경로를 차단하게 된다 (도 12B에 예시됨). 이러한 유형의 여과에 있어서, 재생성 세포 조성물 (예컨대, 줄기 세포)로부터 여과되는 입자는 필터의 한쪽 면에 축적되어 공극을 통한 액체의 유동을 차단하는 경향이 있다. 이러한 차단은 필터의 효율을 저하시킬 수 있다. 또한, 세포는 액체 유동의 압력, 및 필터의 상류쪽에 축적되는 세포의 중량에 의해 지속적으로 압착된다. 이는 줄기 세포의 용해를 증가시킬 수 있다. 따라서, 액체의 유동이 필터 공극의 배향과 평행한 여과 기술에서는, 액체가 공극을 통과할 때 커다란 세포 및 작은 입자 둘 다가 원치않게 필터 매질에 대항하여 이동될 수 있다. 따라서, 액체 중에서 세포와 같은 더 큰 생성물은 공극을 차단할 수 있고, 이에 따라 여과 효과를 감소시키고 세포 파쇄 또는 손상의 발생율을 증가시킬 수 있다.

이와 반대로, 본 발명의 시스템 (10)에 따른 중공사 구조에서는 여과되는 액체가 중공 튜브의 루멘 내부에서 유동하게 된다. 필터 몸체의 공극을 통과할 수 있는 액체 부분은, 상기 몸체 내부에 있는 액체의 가압 및 상기 몸체의 외부에서 가해지는 감압의 도움을 받아 상기와 같이 된다. 본 실시양태에서, 세포는 전형적으로 액체 유동의 압력 또는 다른 세포 중량의 압력을 받지 않게 되고, 이에 따라 줄기 세포에 대한 전단력이 감소된다. 따라서, 막힘(clogging) 비율의 감소 및 재생성 세포의 용해 감소에 의해 여과의 효율 및 효과가 향상될 수 있다. 염수 및 원치않는 단백질 분자의 크기로 인해, 이들 분자 및 다른 작은 성분들은 여과시에 중공 튜브 몸체의 공극을 통과해서 중공 튜브 밖으로 나가, 폐액 용기 (40)으로 이동한다. 한 실시양태에서, 중공 튜브 필터 매질 외부에 진공을 생성함으로써 여과가 향상된다. 재생성 세포 (예컨대, 줄기 세포 또는 선조 세포)의 크기로 인해, 이들 세포는 전형적으로 상기 몸체의 공극을 통과할 수 없고, 따라서 중공 튜브 필터의 내부 (예컨대, 튜브의 루멘 내)에 잔류하게 되고, 필터와 프로세싱 챔버 (30) 사이의 도관을 통해 프로세싱 챔버로 다시 이동하거나 배출 챔버 (50)으로 다시 이동한다.

한 구체적인 실시양태에서, 중공사 필터의 공극 크기는 약 0.05 미크론이고, 중공사 필터의 표면적은 필터 매질 중 약 550 cm²이다. 각 매질 튜브의 직경은 전형적으로 약 0.5 mm이다. 재생성 세포 조성물 130 ml를 프로세싱함에 있어, 대략 120 ml의 추가 염수가 조성물에 첨가될 수 있다. 프로세싱 또는 여과 시간은 대략 8분일 수 있다. 중공사 튜브의 몸체 중 어느 한쪽의 압력차 (예컨대, 몸체 루멘 내부 및 몸체 외부의 압력)는 막-횡단 압력으로 간주된다. 막-횡단 압력은 약 1 mmHg 내지 500 mmHg의 범위일 수 있으며, 바람직한 압력은 약 200 mmHg이다. 중공사 여과를 이용한 유핵 세포의 회수율 및 생존율의 평균은 대략 생존 세포의 80％일 수 있다.

그러한 시스템에서 전형적으로 제거되는 콜라게나제의 양은 3의 대수 감소치와 동등하다. 예를 들어, 수집 챔버에서 프로세싱 챔버로 전달되는 재생성 세포 조성물 중의 초기 콜라게나제 농도가 0.078 U/ml인 경우, 최종 재생성 세포 조성물의 콜라게나제 농도는 0.00078 U/ml일 것이다. 콜라게나제는 중공사 필터에서 제거되고, 중공사 필터는 하기 논의되는 제3 필터에 해당한다.

상기 설명된 하나 이상의 세포 여과 방법을 예시하는 프로세싱 챔버는 도면 (특히, 도 1 내지 3)에 도시되어 있다. 도 1 내지 3을 참조하면, 프로세싱 챔버 (30)과 필터 조립체 (36)의 여과 챔버 사이에 펌프 (34)와 같은 펌프가 제공될 수 있다. 또한, 통풍구 (32) 및 압력 센서 (39)와 같은 통풍구 및 압력 센서가 프로세싱 챔버 (30) 및 필터 조립체 (36)과 일렬로 제공될 수 있다. 배출 챔버 (50)를 위한 부속품이 제공될 수도 있다. 이들 임의 성분 (예컨대, 펌프 (34), 통풍구 (32), 압력 센서 (39), 및 배출 챔버 (50)을 위한 부속품)은 프로세싱 챔버 (30)과 필터 조립체 (36) 사이에 제공될 수 있으며, 이에 따라 프로세싱 챔버 (30)에 함유된 액체는 이들 임의 성분으로 유동된 후에 필터 조립체 (36)을 통해 유동할 수 있다. 예를 들어, 액체는 필터 조립체 (36)으로 통과하기 전에 펌프 (34)를 통해 유동할 수 있다. 또는, 액체는 필터 조립체를 통과하기 전에, 시스템의 예비필터 액체 압력을 수득하도록 압력 센서 (39)를 통과할 수 있다. 특정 상황에서는, 하나 이상의 이들 성분이 통풍구 (32)와 같이 프로세싱 챔버 (30)의 요소로서 제공될 수도 있다 (도 6에 예시됨). 예시된 실시양태에서, 압력 센서 (39)는 재생성 세포 조성물이 필터 조립체 (36)의 여과 챔버로 들어갈 때 펌프 (34)에 의해 생성되는 상기 조성물의 압력을 측정하기 위해 일렬로 배열된다. 이러한 구성은 필터 막을 통한 막-횡단 압력의 모니터링을 용이하게 할 수 있다. 추가의 염수 또는 기타 완충액 및 세척 용액이 재생성 세포 조성물에 첨가되어, 조성물이 필터 조립체 (36)을 통해 여과될 때 원치않는 단백질의 제거를 도울 수 있다. 이러한 반복 세척을 다수회 수행하여 재생성 세포 조성물의 순도를 향상시킬 수 있다. 특정 실시양태에서, 염수는 여과를 향상시키는데 필요하다고 간주되는 어떠한 단계에서도 첨가될 수 있다.

본 발명을 제한하려는 의도가 아니라 단지 예로써 제공되는 한 구체적인 실시양태에서, 원치않는 단백질 및 염수 또는 기타 세척 용액은 다음과 같은 방식으로 제거된다. 재생성 세포 뿐만 아니라, 콜라겐 및 결합 조직 입자 또는 단편, 지방세포, 및 콜라게나제를 포함하는 조성물은, 최소 부피에 도달할 때까지 직렬 필터를 통해 순환된다. 최소 부피는 시스템의 총 정체(hold up) 부피와 몇몇 예정된 상수에 대한 함수이다. 정체 부피는, 모든 프로세싱 챔버가 비어있는 경우에 튜브 및 도관에 함유되어 있는 액체의 부피이다. 한 실시양태에서, 최소 부피는 15 ml이다. 최소 부피에 도달했을 때, 예정된 부피의 세척 용액이 재생성 세포 조성물과 혼합될 시스템으로 도입된다. 이어서, 세척 용액과 재생성 세포 조성물의 혼합물은, 최소 부피에 다시 도달할 때까지 필터를 통해 순환된다. 이 순환을 다수회 반복하여 재생성 세포의 순도를 향상시킬 수 있다 (즉, 조성물 중의 다른 물질에 비해 조성물 중의 재생성 세포 비율을 증가시킴). 도 10 및 11을 참조한다.

재생성 세포 조성물에서 원치않는 단백질이 제거되었고 상기 조성물이 충분히 농축 (예시적 실시양태에서는 약 1×10⁵ 내지 약 1×10⁷개 세포/ml 범위의 최소 농도가 이용될 수 있고, 바람직한 실시양태에서는 최소 농도가 약 1×10⁷개 세포/ml일 수 있음)되었다고 결정된 후에는, 배출 백과 같은 배출 챔버 (50)이 특정 실시양태에 따라 프로세싱 챔버 (30) 및(또는) 필터 조립체 (36)의 배출구에 연결될 수 있다. 이어서, 통풍구 (32)와 같은 통풍구가 개방되어 농축된 재생성 세포의 배출을 용이하게 할 수 있다. 한 실시양태에서, 언제 최소 농도에 도달했는지는, 실험을 실시하여 전자 제어 장치에 프로그래밍한 후에 경험적으로 결정하였다. 이러한 결정은 얻고자하는 것이 무엇인지 (즉, 얼마나 많은 줄기/선조 세포를 원하는지), 또는 세포 농도의 범위가 얼마인지에 대한 프로세스로의 투입일 수 있다. 과학적 데이타에 근거하여, 미리 정해진 양의 지방 조직을 수득하여, 원하는 결과를 달성하기 위해 시스템에 위치시킬 필요가 있다. 통풍구 (32)가 개방되면, 펌프 (34)와 같은 펌프는 농축된 재생성 세포를 배출 백으로 전달하는 기능을 할 수 있다. 한 실시양태에서, 배출 백 (50)은 한쪽 말단에 부속품이 있는 튜브가 설치된, 비어있는 혈액 백과 유사하다. 멸균 방식으로, 배출 백의 부속품은 배출구에 부착될 수 있고, 농축된 재생성 세포는 배출 백으로 전달될 수 있다.

도 1 내지 3에 예시된 바와 같이, 진공 펌프 (26)을 시스템 (10) 내에 제공하여 다른 것들 중에서 시스템 내의 압력을 변화시킬 수 있다. 예를 들면, 진공 펌프 (26)은 도관 (12b)와 같은 도관을 통해 수집 챔버 (20)으로 커플링되어 수집 챔버 (20) 내의 압력 감소를 유발할 수 있다. 또한, 진공 펌프 (26)은 도관 (12g)와 같은 도관에 의해 프로세싱 챔버 (30)으로 커플링될 수 있다. 펌프 (34)와 연결된 진공 펌프 (26)의 작동과 관련해서, 2개의 별개의 진공 펌프 또는 공급원을 사용할 수 있거나, 공정 중의 특정 지점에서 진공 인력을 필요로 하는 여러가지 도관으로 이를 향하게 하는 밸브를 이용하여 단일의 것을 사용할 수 있다. 또한, 진공 펌프 (26)은 도관 (12f)와 같은 도관을 통하여 폐기물 용기 (40)으로 커플링될 수 있다.

도 10 및 11에 대하여, 진공 펌프 (26)에 의해 발생한 압력을 이용하여 재생성 세포를 포함하는 액체의 흐름을 도관 (12)를 통하여 향하도록 할 수 있다. 상기 압력은 예를 들면, 시스템 (10) 중 하나 이상의 밸브 (14)의 위치를 자동으로 또는 수동으로 제어함으로써 여러 방향으로 공급할 수 있다. 시스템 (10)은 가압 또는 감압을 사용하거나 이의 조합을 통해 적절하게 기능하게 할 수 있다. 예를 들면, 재생성 세포를 상기 기재된 제1 및 제2 필터를 통해 제3 필터와 연결된 연질 측면의 용기로 끌어들일 수 있다. 연질 측면의 용기는 제3 필터의 앞에 일렬로 (직렬) 연결될 수 있다. 마지막 배출 챔버는 제3 필터의 다른 쪽 (예를 들어 하류쪽)에 있는 연질 측면의 용기일 수 있다. 상기 실시양태에서, 압력을 사용하여 재생성 세포를 한 연질 측면의 용기에서 제2 연질 측면의 용기로 필터를 통해 이동시킨다.

시스템 (10)의 또다른 실시양태에서, 줄기 세포 및(또는) 지방세포 유래의 선조 세포의 여과는 침출식 여과 및 침강의 조합을 이용하여 수행할 수 있다. 예를 들면, 이러한 시스템은 조직 재생성 세포 조성물 (예를 들어 줄기 세포 및(또는) 지방세포 유래의 선조 세포를 함유하는 조성물)을 통과한 후 필터를 통과한 염수를 사용한다. 재생성 세포 조성물로부터의 세포의 침출식 여과와 연관된 변수 중 몇몇으로는 필터 매체의 공극 크기, 공극 기하 또는 형태, 필터의 표면적, 여과될 재생성 세포 조성물의 흐름 방향, 주입된 염수의 유속, 막통과 압력, 세포 집단의 희석, 세포 크기 및 생존력이 포함되나 이에 제한되지 않는다.

시스템 (10)의 한 실시양태에서, 프로세싱 챔버 (30)은 침출식 여과 및 침강을 이용하는 필터 조립체 (36)를 사용하여 재생성 세포를 분리하고 농축시킨다. 이에 제한되지 않는 예를 들면, 프로세싱 챔버 (30)은 도 6d에 나타난 바와 같이, 일반적으로 측벽 (30a), 최상부 표면 (30b) 및 최하부 표면 (30c)를 갖는 원통형체로서 정의된다. 멸균 통풍구 (32)는 최상부 표면 (30b)에 제공된다.

도 6의 실시양태에서, 프로세싱 챔버 (30)은 큰 공극 필터 (36a) 및 작은 공극 필터 (36b)와 같은 2개의 필터를 포함하는 필터 조립체 (36)를 포함하는 것으로 예시된다. 필터 (36a) 및 (36b)의 공극 크기는 전형적으로 약 0.05 미크론 내지 약 10 미크론의 범위이다. 큰 공극 필터 (36a)는 직경이 약 5 ㎛인 공극을 포함할 수 있고, 작은 공극 필터 (36b)는 직경이 약 1 내지 3 ㎛인 공극을 포함할 수 있다. 한 실시양태에서, 필터의 표면적은 약 785 mm²이다. 필터 (36a) 및 (36b)는 프로세싱 챔버 (30)의 내부를 분할하여 제1 챔버 (37a), 제2 챔버 (37b) 및 제3 챔버 (37c)를 포함한다. 도 6에 나타난 바와 같이, 제1 챔버 (37a)는 제2 챔버 (37b)와 제3 챔버 (37c) 사이에 위치한다. 또한, 제1 챔버 (37a)는 주입구 (31a) 및 배출구 (31b)를 갖는 프로세싱 챔버 (30)의 영역인 것으로 나타난다. 예시된 프로세싱 챔버 (30)는 프로세싱 챔버 (30)의 외부에서 프로세싱 챔버 (30)의 내부로 소통 통로를 제공하는 복수개의 포트, 예를 들어 포트 (31a), (31b) 및 (31c)를 포함한다. 포트 (31a), (31b) 및 (31c)는 프로세싱 챔버 (30)의 몸체의 측벽 (30a)에 위치하는 것으로 예시된다. 그러나, 포트 (31a), (31b) 및 (31c)는 또한 다른 영역에 위치할 수도 있다. 포트 (31a)는 재생성 세포를 함유하는 조성물이 프로세싱 챔버 (30)의 내부로 지나갈 수 있도록 도관에 커플링되도록 구축된 샘플 주입구로서 예시된다. 포트 (31b)는 분리되고 농축된 세포가 프로세싱 챔버 (30)의 내부로부터 제거될 수 있도록 도관으로 커플링되도록 구축된 배출구로서 예시된다. 포트 (31c)는 염수와 같은 신선한 세척 용액을 프로세싱 챔버 (30)의 내부로 전달하기 위해 도관에 커플링되도록 구축된 주입구로서 예시된다.

사용시에, 재생성 세포는 주입구 (31a)를 통해 중앙 챔버 (37a)로 도입될 수 있다. 염수 또는 다른 완충액을 주입구 (31c)를 통해 하부 챔버 (37b)로 도입한다. 염수는 약 10 ml/분의 속도로 챔버 (37a) 내의 재생성 세포 조성물을 통하여 향할 수 있다. 염수의 유속은 중력을 거스르는 정도이다. 염수의 흐름으로 인해 챔버 내의 셀은 세포의 밀도를 기준으로 분리되는 능력을 갖는다. 전형적으로, 염수를 조성물을 통해 밀어 올릴수록, 조성물 내의 보다 큰 세포들은 중앙 챔버 (37a)의 하부로 가라앉을 것이고, 보다 작은 세포 및 단백질은 제2 필터 (36b)를 통해 최상부 챔버 (37c)로 운반될 것이다. 상기 여과는 보다 큰 세포는 제자리에서 구르고, 보다 작은 입자는 자유로워져 염수와 함께 쓸려 나가도록 염수의 유속을 조정함으로써 달성된다. 멸균 통풍구 (32)는 올바른 압력 구배가 프로세싱 단위 내의 3개의 챔버 내에서 확실히 유지되도록 챔버 (30) 내에 포함된다. 상부 챔버 (37c)은 흡착 매질 (33)을 포함할 수 있다. 흡착 매질의 목적은 예를 들면 염수 유속이 감소될 때, 용액 중의 원치않는 단백질을 포획하여 이들이 다시 프로세싱 용액으로 필터 매체를 횡단하지 않도록 보장하는 것이다. 흡착 매질은 여과해 낼 물질 또는 성분을 흡착하거나 유인하는 일종의 필터 물질일 수 있다. 유출 포트를 최상부 필터의 상부에 첨가하여 폐기물 배출을 보조할 수 있다. 이의 또다른 실시양태는 최상부로부터 완만한 진공을 적용하여 폐기물 인출을 보조하는 것일 수 있다. 흡착 매질은 예시된 실시양태에서와 같이, 유속이 비교적 작은 경우 이용할 수 있다. 그 후, 과량의 염수 및 단백질을 폐기물 용기로 빼낼 수 있다.

보다 큰 세포 (예를 들어, 지방 세포 유래의 줄기 세포 및(또는) 선조 세포)를 보다 작은 세포 및 단백질로부터 충분히 분리해 낸 경우, 본원에 논의된 바와 같이 분리된 세포를 함유하는 조성물은 농축될 수 있다. 조성물은 배출구 (31b)를 통해 챔버 (37a)로부터 제거된 후, 또는 챔버 (37a) 내에 있는 동안에 추가로 농축될 수 있다. 한 실시양태에서, 조성물 중 세포의 농축도는 하기의 방식으로 증가한다. 세포를 충분히 분리해 낸 후, 필터, 예컨대 필터 (36a 및 36b)는 서로 가까이 접근될 수 있다. 이러한 접근은 2개의 필터 사이의 부피 (예를 들어 챔버 (37a)의 부피)를 감소시키는 효과가 있다. 진동 부재는 또한 조성물 중 세포의 농축을 용이하게 하기 위한 프로세싱 챔버 (30)와 연결되어 제공될 수 있다. 한 실시양태에서, 진동 부재는 필터 (36b) (예를 들어 소공극 필터)에 커플링되어 있을 수 있다. 진동은 필터 내에 갇히게 되는 세포의 발생수를 감소시킬 수 있다. 조성물의 부피 감소는 과잉의 염수를 폐기물로서 제거하고, 세포를 보다 작은 부피로 농축시킨다.

또다른 실시양태에서, 재생성 세포의 농축은 하기의 방식으로 수행된다. 세포를 충분히 분리해 낸 후, 재생성 세포 조성물을 과잉의 염수를 중력을 사용하여 여과 제거하는 또다른 챔버 (도시하지 않음)로 옮길 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 침강은 침출과 동시에 발생할 수 있다. 이 침강은 공극 크기가 약 10 kD 내지 약 2 미크론인 필터의 상부에 조성물을 도입하여 수행될 수 있다. 한 실시양태에서, 적합한 필터의 공극 크기는 약 1 미크론이다. 중력은 조성물 내의 세포가 필터를 통해 흘러나가는 것을 방지하면서 염수 및 보다 작은 입자들은 필터를 통과하도록 할 것이다. 원하는 농축도의 세포를 수득한 후, 여과된 보다 작은 입자들을 필터 밑으로부터 제거하고 나서, 재생성 세포 조성물을 진탕하여 필터로부터 세포를 제거하고, 후속하여 농축된 재생성 세포를 배출 백으로 옮긴다. 보다 작은 입자들은 배출구를 통해 폐기물로서 버려질 수 있다.

본 발명의 특정 실시양태에서, 프로세싱 챔버는 재생성 세포 조성물로부터 재생성 세포의 분리를 용이하게 하는 원심분리 챔버 또는 세포 농축기 (도 4,7 및 8)로 구성된다. 예를 들면, 세포 농축기는 예컨대 크기 또는 밀도에 근거하여, 재생성 세포 조성물로부터 재생성 세포를 분리할 수 있는 원심분리 장치 또는 그 장치의 일부일 수 있다 (도 7 및 8). 세포 농축기는 또한 회전 막 필터일 수 있다.

원심분리는 여러 밀도의 다중 성분을 갖는 용액을 분리 및 농축하기 위한 수단으로서 종래 기술에 인정되고 있다. 이는 용액에 구심력, 예컨대 중력보다 큰 구심력을 부여하여 행해진다. 부여된 힘은 세포 및 또는 입자 밀도에 근거하여 조직 용액을 분리시킨다. 세포를 충분히 분리해 낸 후, 과잉의 염수 및 단백질을 제거할 수 있다. 용액으로부터의 세포의 원심분리와 관련된 변수의 일부로는 로터의 속도, 회전 중심으로부터의 용액의 거리 및 시간을 들 수 있지만, 이들로 한정되지는 않는다.

원심분리 장치는 프로세싱 챔버 (30)의 구성 요소이거나, 프로세싱 챔버로부터 분리되어 있을 수 있다. 원심분리 장치는 또한 부분적으로는 프로세싱 챔버 내에 있고, 부분적으로는 프로세싱 챔버로부터 분리되어 있을 수 있다 (도 14 및 15 참조). 전형적으로, 원심분리 장치는 세포 용액이 들어 있는 용기, 예를 들어 배출 챔버 (50)가 축 주위를 회전하도록 하여 용액 내의 세포에 인가되는 힘을 중력보다 크도록 증가시킨다. 용액 내에 더욱 치밀하거나 더욱 무거운 물질은 전형적으로 배출 챔버 (50)의 일 연부에 침강하여 펠릿을 형성한다. 그 후, 펠릿은 재현탁되어 원하는 농축도의 세포 및(또는) 원하는 부피의 세포 및 배지를 수득할 수 있다.

또다른 실시양태에서, 프로세싱 챔버 (30) 그 자체는 원심분리 챔버 또는 세포 농축기의 형태일 수 있다. 일반적으로, 이러한 프로세싱 챔버는 원심력 및 중력 모두를 사용하여 세포를 분리 및 농축하도록 구축되어 있다. 구체적으로, 원심분리 도중, 원심력은 재생성 세포 조성물의 더욱 치밀한 성분, 예를 들어 재생성 세포를 원심분리 챔버의 최외곽으로 보낸다. 원심분리 챔버가 속도를 줄이면서 마침내 멈추었을 때, 중력은 재생성 세포가 원심분리 챔버의 최외곽에 남아 세포 펠릿을 형성하도록 돕는다. 따라서, 세포 펠릿을 저해하지 않고 재생성 세포 조성물의 원치않는 성분, 즉 폐기물을 제거할 수 있다.

원심분리 공정의 추가의 실시양태에서, 또한 원심 수력분급을 적용할 수도 있다. 본 실시양태에서, 원심분리에 의해 인가된 방향성 (예컨대 외향성) 힘이 세포 및 용질을 서로 다른 속도로 침강시키도록 개별적인 세포 침강 속도에 근거하여 세포를 분리할 수 있다. 수력분급시, 표적 세포 집단의 침강 속도는 원심력과 반대 방향으로 용액을 펌핑하여 인가되는 반대 방향 (예컨대 내향성) 유속과는 반대된다. 역류를 조절하여 용액 내의 세포 및 입자들이 분리되도록 한다. 수력분급은 다양한 경우의 세포 분리 (문헌 [Inoue, Carsten et al. 1981; Hayner, Braun et al. 1984; Noga 1999])에 적용되어 왔으며, 흐름을 최적화하는 데 사용되는 원리와 실습 및 원심 파라미터는 본원 명세서에 비추어 당업자에 의해 본원에 적용가능할 수 있다.

도 9는 본 발명과 관련하여 수력분급 실행과 연관된 원리를 예시한다. 수력분급의 실시양태는 회전 로터를 사용하여 용액에 힘을 인가할 수 정도로 원심분리를 실행하는 것과 유사할 수 있다. 실제로 구현된 수력분급과 연관된 변수의 일부로는 회전 챔버의 크기 및 형태, 로터의 직경, 로터의 속도, 역류 튜브의 직경, 역류의 유속뿐만 아니라 입자의 크기 및 밀도, 및 용액으로부터 제거되는 세포를 들 수 있지만, 이들로 한정되는 것은 아니다. 원심분리에 있어서, 재생성 세포를 개별적인 세포 밀도에 근거하여 분리할 수 있다.

한 실시양태에서, 도 9.1에 도시하는 바와 같이 재생성 세포 조성물, 예를 들어 재생성 세포 조성물 및 콜라게나제를 함유하는 용액을 회전하는 로터의 챔버 내로 도입한다. 용액을 챔버에 첨가한 후, 추가의 염수를 소정의 유속으로 챔버에 첨가한다. 염수의 유속은 로터의 속도, 세포 직경 및 실험적으로 수립되는 챔버 상수의 함수로서 미리 결정할 수 있다. 유속은, 예를 들어 IV 펌프와 유사한 장치로 제어될 것이다. 추가 염수의 목적은 도 9.2에 도시한 바와 같이 더 큰 입자들이 챔버의 한 면으로 움직이고, 더 작은 입자들이 다른 한 쪽으로 움직이는 로터 챔버의 내부 조건을 제공하기 위한 것이다. 본 출원에서는 도 9.3에 나타나있는 바와 같이 유속을 조절하여 더 작은 입자들이 챔버를 빠져 나와 폐기물 용기로 들어갈 것이다. 이러한 움직임은 실질적으로 세로, 예컨대 줄기 세포의 균질한 집단을 갖는 로터 챔버 내의 용액을 유발한다.

줄기 세포가 용액 중의 나머지 물질들로부터 분리되는 것으로 측정된 뒤에는 (챔버로부터 제거되는 원치않는 단백질 및 유리 지질과 함께) 역류를 정지시킨다. 이어서, 챔버 내의 세포는 챔버의 외벽 상에 농축된 펠릿을 형성한다. 역류를 역행시키고 세포 펠릿은 배출 백으로 옮긴다.

도 7 및 8에 나타낸, 원심분리 챔버 또는 세포 농축기 형태의 대표적인 프로세싱 챔버 (30)는 외부 하우징 (30.2)을 포함하는 회전 밀폐부 (30.1), 1개 이상의 밀폐부 (30.3), 1개 이상의 베어링 (30.4) 및 프로세싱 챔버를 시스템의 원심분리 장치로 부착하기 위한 부착 지점 (30.6); 회전 밀폐부로부터 연장되어, 1개 이상의 포트 (52) 및 수동으로 배출 챔버 (50)를 재배치시키기 위한 핸들로 구성되는 프래임 (53) 중에 하우징된 배출 챔버 (50)의 형태인 각 단부 상의 원심분리 챔버에서 끝나는 도관 형태인 1개 이상의 액체 통로 (30.5)로 구성된다.

특정 실시양태에서, 원심분리 챔버 형태인 프로세싱 챔버 (30)에는 프로세싱 챔버, 예를 들어 배출 챔버 (50)의 여러 성분들이 출입하는 1개 이상의 액체 통로 (30.5)가 포함된다. 한 실시양태에서, 한 액체 통로 (30.6)는 프로세싱 챔버 (30)의 중앙축으로부터 바깥으로 뻗어있고, 프로세싱 챔버 (30)의 외부 연부, 즉 배출 챔버 (50)를 하우징하는 원심분리 챔버 내에서 종결된다. 이러한 액체 통로는, 예를 들어 재생성 세포 조성물을 수집 챔버 (20)로부터 프로세싱 챔버 (30)로 운반하는 데 사용될 수 있다. 액체 통로는 또한 원심분리 후에 형성된 세포 펠릿을 재현탁하는 데 사용될 수 있다. 따라서, 액체 통로의 배치 및 크기는 최적화되어야 한다. 프로세싱 챔버는 또한 프로세싱 챔버의 바닥 중앙 부분에서 종결되는 액체 통로 (30.5)를 포함할 수 있다. 이러한 액체 통로는 배출 챔버 (50)로부터 상등액 또는 폐기물을 제거하는 데 사용될 수 있다. 별법으로, 프로세싱 챔버는 프로세싱 챔버 (30) 자체에 의해 생성된 상등액 또는 폐기물을 제거하기 위해 사용되는 프로세싱 챔버의 바닥 중앙 부분에서 종결되는 액체 통로를 포함한다.

특정 실시양태에서, 프로세싱 챔버 (30)는 2개의 액체 통로를 갖는다. 두 액체 통로는 프로세싱 챔버의 상부를 통과한다 (즉, 회전 밀폐부 중의 축의 중앙). 한 액체 통로는 프로세싱 챔버의 바닥으로 일직선으로 내려가고, 다른 하나는 두 갈래로 갈라져 프로세싱 챔버의 외부 연부를 향해, 즉 배출 챔버를 하우징하는 원심분리 챔버를 향해 연장된다. 재구성된 실시양태에서, 프로세싱 챔버 (30)는 동일한 일반적인 형태이지만, 액체 통로 중 하나는 이동되거나 변화된다. 이 실시양태에서, 한 액체 통로는 회전 밀폐부 중의 축으로부터 프로세싱 챔버의 바닥으로 일직선으로 계속된다. 그러나, 제2 액체 통로는 프로세싱 챔버 바깥에서 갈라진 후, 프로세싱 챔버의 외부 연부와 결합된다. 이 실시양태에서, 액체 통로가 원심분리 챔버 및(또는) 배출 챔버로 첨가제 및 재현탁액을 직접 첨가하는 데 사용될 수 있기 때문에, 큰 배출구 부피가 생성될 수 있다.

상기 기재된 원심분리 장치를 포함하는 프로세싱 챔버를 도 4, 7-9 및 14-15에 나타내었다. 도 4 및 7-9를 참조하면, 수집 챔버 (20) 및 프로세싱 챔버 (30) 사이에 펌프 (34) 및 1개 이상의 밸브 (14)가 제공될 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 밸브 (14)는 전기기계적 밸브이다. 추가로, 프로세싱 챔버 (30) 및 수집 챔버 (36)가 장착된 라인에 압력 센서 (29)와 같은 센서가 제공될 수 있다. 도 7 및 8에 나타낸 프로세싱 챔버 (30)를 이용하기 위해, 재생성 세포 조성물이 외부 하우징 (30.2), 1개 이상의 밀폐부 (30.3) (예를 들어 립 밀폐부) 및 1개 이상의 베어링 (30.4)을 포함하는 회전 밀폐 네트워크 (30.1)를 통과하는 경로에 따른 수집 챔버 (20)로부터 펌핑될 수 있다.

바람직한 실시양태에서, 회전 축를 포함하는 회전 밀폐 네트워크 (30.1)는 추가로 2개 이상의 베어링 (30.4), 3개 이상의 립 밀폐부 (30.3) 및 외부 하우징 (30.2)을 포함한다. 이 실시양태에서, 베어링 (30.4)은 본원에서 레이스(race)로서 지칭되는 외부 및 내부 축 (도시하지 않음)을 추가로 포함한다. 상기 레이스는 정밀한 기초 구(ground sphere)에 의해 분리될 수 있다. 베어링을 포함하는 레이스 및 구는 바람직하게는 신체의 액체와 접촉하기에 적합한 물질로 제조되거나, 또는 신체의 액체와 접촉하기에 적합한 물질로 코팅된다. 바람직한 실시양태에서, 레이스 및 구는, 예를 들어 질화 실리콘 또는 지르코니아로 제조된다. 추가로, 이 실시양태에서, 3개의 립 밀폐부는 고리형 스프링 (도시하지 않음)과 함께 고리 "U" 모양의 채널 (도시하지 않음)로 구성된다. 고리 "U" 모양의 채널은, 회전 밀폐 네트워크 (30.1)의 회전 축를 갖는 누출 프루프 결합부가 형성되도록, 바람직하게는 가요성 물질을 사용하여 제조된다. 또한, 립 밀폐부는 바람직하게는 프로세싱 챔버를 통해 흐르는 재생성 세포 조성물로부터의 압력이 밀폐 조립체를 야기하여 증가된 신장에 의한 회전 축를 갖는 결합부를 조이는 방식으로 배향된다. 밀폐부는 회전 밀폐 네트워크 (30.1)의 외부 하우징 (30.2) 중의 글루브를 고정시키기 위해 요구되는 연장 및(또는) 붕괴될 수 있는 1개 이상의 고리형 클립 (도시하지 않음)에 의해 그 위치에서 보호될 수 있다. 일반적으로, 회전 밀폐 네트워크 (30.1)는 바람직하게는, 예를 들어 액체 경로 (30.5)와 같은 다중 액체 경로가 멸균 상태로 유지될 수 있고, 프로세싱 챔버의 원심분리 챔버가 회전하고 있는 동안 평가될 수 있다. 따라서, 이 실시양태의 장점은 도 7 및 8에 나타낸 프로세싱 챔버의 모든 구역이 시스템의 분리 및 농축 기간 동안 임의의 주어진 시간에서 평가될 수 있다는 점이다. 최종적으로, 회전 밀폐 네트워크 (30.1) 옆 또는 근방에서 발생하는 열은 통과를 통해 이동되는 용액 중의 세포 용해를 방지하기 위해 제어될 수 있다. 이것은, 예를 들어 회전 축를 구성하기 위해 경질 재료를 선택하고, 밀폐부와 접촉하게 되는 회전 축 영역을 연마하고, 회전 축과 밀폐부 간의 접촉을 최소화함으로써 달성될 수 있다.

한 실시양태에서, 회전 밀폐 네트워크 (30.1)는 단일 고무 밀폐부 (30.3) 및 공기 가스켓 (도시하지 않음)으로 구성된다. 이 밀폐부 및 가스켓은 시스템의 멸균성을 보장할 수 있는 임의의 생물학적 물질을 위한 비틀린 경로를 제공한다. 또다른 실시양태에서, 회전 밀폐 네트워크 (30.1)는 각각의 액체 통로를 단리하는 밀폐부가 로딩된 다중 스프링 (30.3)으로 구성된다. 밀폐부 (30.3)은 회전 축처럼 윤활제 없이 멸균화될 수 있는 물질로 제조된다. 또다른 실시양태에서, 회전 밀폐 네트워크 (30.1)는 상이한 액체 통로를 만들 수 있는 한 짝의 세라믹 디스크 (도시하지 않음)를 포함하고, 시스템의 회전을 견딜 수 있고, 세포 용해를 야기하지 않을 수 있다. 또다른 실시양태에서, 액체 경로는 가요성이고, 프로세싱 챔버에 대해 감기거나 풀릴 수 있다. 이것은 프로세싱 챔버 (30)의 매 2 회전마다 한번 회전 하는 가요성 액체 경로를 가짐으로써 달성된다. 이것은 회전 밀폐부에 대한 요구를 완전히 제거한다.

본 발명의 한 실시양태에서, 프로세싱 챔버 (30)은 액체 경로가 회전 밀폐 네트워크 (30.1)의 회전 축을 통해 진입한 후에 최소한 2개의 액체 경로 (30.5)로 나뉘도록 고안되었으며, 각각의 액체 경로는 프로세싱 챔버 (30)에서 반대쪽 끝부분의 배출 챔버 (50)으로 향한다. 따라서, 바람직한 실시양태에서, 프로세싱 챔버 (30)은 도 7 및 8에서 나타낸 바와 같이 2개 이상의 배출 챔버 (50)을 포함한다. 이러한 배출 챔버 (50)은 프로세싱 동안에는 한쪽 방향 (30.7)에 있고 농축된 재생성 세포의 회수를 위해서는 다른 방향 (30.8)에 있도록 위치시킨다. 프로세싱 챔버 (30)에서 돌출된 핸들 (53)을 통해서 배출 챔버 (50)의 2가지 위치를 수동 조작할 수 있다. 일단 재생성 세포 조성물이 도 4의 프로세싱 챔버로 수송되면, 조성물은 대략 5분 동안 예를 들어 중력의 대략 400배의 하중을 받는다. 배출 챔버 (50)은, 챔버의 바깥쪽 끝부분이 조밀한 입자 및 세포를 위한 작은 저장소를 형성하도록 구축한다. 배출 챔버 (50)은 '세포 펠렛'이라고 불리는 조밀한 입자를 보유하면서, 좀 더 가벼운 상등액은 제2 액체 경로를 통해 제거되도록 한다 (도시하지 않음). 또한, 배출 챔버는 세포 펠렛을 건들지 않고 상등액이 제거될 수 있도록 구축된다. 이는, 상등액의 제거를 보조하는 밸브 (14) 및 펌프 (34)로 제어되는 액체 경로를 통해 수행될 수 있다. 제2 액체 경로는 회전 밀폐 네트워크 (30.1)의 회전축을 따라 간다. 이러한 액체 경로는 프로세싱 챔버 (30)의 중심 내 낮은 지점에서부터 회전 밀폐부를 통해 폐기물 용기 (40)으로 이동한다.

세포 펠렛은 본 발명의 농축된 재생성 세포를 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 상등액을 제거하여 폐기물 챔버 (40)으로 보낸 후, 추가의 용액 및(또는) 다른 첨가제를 상기 기재된 방식으로 수집 챔버 (20)으로부터 프로세싱 챔버 (30)에 가하여, 세포 펠렛을 재현탁시킬 수 있다. 이러한 방식으로 세포 펠렛을 재현탁시키는 것은, 재생성 세포를 추가로 세척해서 원치않는 단백질 및 화학적 화합물을 제거하며, 세포로의 산소 흐름을 증가시킬 수 있다. 생성된 현탁액은 다시 대략 5분 동안 중력의 대략 400배의 하중을 다시 받게 된다. 제2 '세포 펠렛'이 형성되고 생성된 상등액이 폐기물 챔버 (40)으로 제거된 후, 염수 또는 몇몇 다른 적절한 완충 용액으로 상기 기재된 방식으로의 최종 세척이 수행될 수 있다. 이어서, 배출 챔버 (50)을 세포 제거에 적절한 방향으로 위치시킨 후에, 배출 챔버 (50)에 존재하는 최종 펠렛을 적절한 주사기를 사용하여 회수할 수 있다. 다른 실시양태에서, 최종 펠렛은 배출 챔버 (50) 내 용기에 자동적으로 이동될 수 있으며, 이 용기는 필요에 따라 없애거나 넣어두거나 사용할 수 있다. 이러한 용기는 임의의 적절한 형태 또는 크기일 수 있다. 예를 들어, 용기는 주사기일 수 있다. 모든 실시양태에서, 최종 펠렛은 무균 방식으로 제거된다. 예를 들어, 본원에서 기재된 바와 같이 사적인 치료 용도에서는 이후의 회수 및 사용을 위해서 배출 용기 (50)을 자동적으로 가열 밀폐시키고 프로세싱 챔버의 다른 성분들로부터 떼어놓을 수 있다.

도 4에 예시된 실시양태에서, 재생성 세포 조성물이 프로세싱 챔버 (30)으로 진입함에 따라 펌프 (34)에 의해 그에 부가되는 압력을 측정하기 위한 압력 센서 (29)가 일렬로 배치된다. 추가의 염수 또는 다른 완충 용액 및 세척 용액이 재생성 세포 조성물에 가해져서 프로세싱 챔버 (30)에서 용액이 프로세싱될 때 불필요한 단백질의 제거를 보조할 수 있다. 재생성 세포 용액의 순도를 향상시키기 위해서는 이러한 반복적 세척을 여러 번 수행할 수 있다. 특정 실시양태에서, 프로세싱의 향상이 필요하다고 생각되면, 임의의 단계에서 염수를 첨가할 수 있다.

다른 실시양태에서, 프로세싱 챔버 (30) 또는 배출 챔버 (50)에는 1개 이상 포트, 예를 들어 포트 (51) 또는 (52)를 포함할 수 있다. 재생성 세포 또는 그의 일부가 다른 표적, 예컨대 이식 물질 (예를 들어, 스캐폴드 또는 구조물 단편), 수술 장치, 세포 배양 장치 또는 정제 장치로 향하도록 이러한 포트 1개 이상을 고안할 수 있다. 이러한 실시양태에서, 프로세싱 챔버 (30) 또는 배출 챔버 (50)은 재생성 세포 및 첨가제를 혼합할 장치를 추가로 포함할 수 있다. 혼합은, 진탕, 진동, 반전 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는 당업계 공지의 임의의 수단이나 압축 펄프 롤러 또는 이동 롤러에 의해 수행될 수 있다. 또한, 포트를 이용하여 1종 이상의 다른 첨가제, 예를 들어 성장 인자, 재현탁액, 세포 배양 시약, 세포 팽창 시약, 세포 보존 시약 또는 유전자를 세포로 전달하는 작용제 등을 비롯한 세포 변형 시약을 첨가할 수 있다. 첨가제의 다른 예로는 세척 및 해리를 최적화하는 작용제, 프로세싱 동안에 활성 세포 집단의 생존력을 향상시키는 첨가제, 항균제 (예를 들어 항생제), 지방세포 및(또는) 적혈구 세포를 용해하는 첨가제, 또는 관심 세포 집단을 풍부하게 하는 첨가제 (고상 부분 또는 세포 집단의 상당한 감소 또는 증가를 촉진하는 다른 것으로의 차별적 부착에 의함) 등이 있다.

예를 들어, 균일한 재생성 세포 집단을 얻기 위해, 특정 유형의 재생성 세포를 분리하는데 적합한 임의의 방법, 예를 들어 줄기 세포 또는 선조 세포 (예를 들어 내피 전구 세포)에 존재하는 항원을 인식하고 결합하는 세포-특이적 항체를 사용하는 방법을 이용할 수 있다. 이러한 방법에는 포지티브 선별 (표적 세포의 선별)과 네가티브 선별 (원치않는 세포의 선택적 제거) 둘다, 또는 이들의 조합이 포함된다. 효소 등과 같은 세포내 마커를 특정 효소에 의해 활성화될 때 형광을 내는 분자를 사용하는 선별에 사용할 수도 있다. 추가로, 최종 세포 펠렛 내의 재생성 세포 특정 집단이 차별적 부착되고(되거나) 그 집단이 용출되도록 선택된 접착성을 갖는 고상 물질을 상기 시스템의 배출 챔버에 삽입할 수도 있다.

이러한 차별적 부착 방법의 다른 실시양태는 표적 재생성 세포 및 원치않는 세포에서 차별적으로 발현되는 표면 분자를 인식하는 항체 및(또는) 항체 조합물의 사용을 포함할 것이다. 특정 세포 표면 마커 (또는 이들의 조합물) 발현을 기준으로 한 선별은, 고상 지지 구조물에 항체를 부착시키는 (직접 또는 간접적 부착) 또다른 통상적 기술이다 ([Geiselhart et al., 1996], [Formanek et al., 1998], [Graepler et al., 1998], [Kobari et al., 2001], [Mohr et al., 2001]).

또다른 실시양태에서, 세포 펠렛을 재현탁하여 연속적 또는 불연속 밀도 구배가 형성된 액체 물질 위 (또는 밑)에서 층을 이루게 할 수 있으며, 원심분리기에 위치시켜 세포 밀도에 따라 세포 집단을 분리할 수 있다. 유사한 실시양태에서, 연속 유동법, 예컨대 성분채집술 [Smith, 1997] 및 수력분급법 (역류의 존재 또는 부재) (문헌 [Lasch et al., 2000], [Ito and Shinomiya, 2001])을 이용할 수도 있다.

전술한 모든 실시양태에서, 2001년 9월 14일자로 출원된 미국 특허 가출원 제60/332,070호의 이점을 청구하며 본원과 공동 명의인, 2002년 9월 12일자로 출원된 미국 특허 출원 제10/242,094호 (발명의 영문 명칭: PRESERVATION OF NON EMBRYONIC CELLS FROM NON HEMATOPOIETIC TISSUES) (상기 문헌의 내용은 그 전문이 완전히 본원에 참고로 도입됨)에 기재되어 있는 바와 같이, 분리된 지방세포 유래의 세포 중 적어도 일부는 저온 보관할 수 있다.

바람직한 실시양태에서는 전체 시스템이 자동화된다. 또다른 실시양태에서, 상기 시스템은 자동화 부품 및 수동 부품 둘다를 갖는다. 상기 시스템은 재사용가능한 하드웨어 부품 또는 모듈 상에 탑재된 하나 이상의 일회용 부품으로 구성될 수 있다. 본 발명의 자동화 시스템은 시스템의 적절한 조작을 촉구하는 스크린 디스플레이를 제공한다 (도 16 참조). 상기 자동화 시스템은 또한 시스템의 일회용 부품의 적절한 셋업에 따라서 절차 및(또는) 단계의 상황을 단계 지시에 의해 제공하는 스크린을 제공할 수 있다. 상기 스크린은 또한 시스템에서의 문제나 고장이 발생하는 경우 이를 나타내고, 적절하다면 "문제 해결(troubleshooting)" 지침을 제공할 수 있다. 한 실시양태에서, 사용자와 시스템의 접속 연결을 허용하는 스크린은 터치 스크린(touch screen)이다..

부분 및 완전 자동화 시스템은 프로세싱 장치 (예를 들어 마이크로프로세서 또는 개인용 컴퓨터)를 포함하고 시스템을 위한 제어 논리를 제공하는 소프트웨어 프로그램과 연관되어 있어 사용자의 선택에 따라 하나 이상의 공정 단계를 조작하고 자동화할 수 있다. 프로세싱 장치는 시스템의 하나 이상의 부품 또는 단계에 조작가능하게 연결될 수 있다. 예를 들어, 이러한 자동화에 부합하는 단계에는는 시스템 또는 프로세싱 장치의 펌프 및 밸브를 제어함으로써 특정 튜브 경로에 따라 액체 및 조직의 진입 및 배출을 제어하는 단계; 적절한 활성화 순서 및(또는) 방향을 제어하는 단계; 압력 센서로 차단 상태를 검출하는 단계; 부피측정 메카니즘을 이용하여 특정 경로에 따라 이동시키고자 하는 조직 및(또는) 액체의 양을 측정하는, 메카니즘과 혼용하는 단계; 열 제어 장치를 이용하여 다양한 부품의 온도를 유지하는 단계; 세포를 세척하고 농축하는 단계; 및 시기 및 소프트웨어 메카니즘으로 공정을 통합하는 단계를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 자동화 시스템은 또한 차단 상태의 검출 및 유사 안전을 위한 압력 센서를 포함하고, 제어 메카니즘을 정량화할 수 있다. 한 실시양태에서, 소프트웨어는 공정 파라미터를 제공하여 구체적인 조작자-한정 파라미터로 제조되는 세포 집단의 생성을 허용할 수 있다. 예를 들어, 프로세싱 장치는 프로세싱되는 조직의 유형 및(또는) 수거되는 세포 집단 또는 하위-집단에 근거하여 원심분리 속도를 제어할 수 있다. 따라서, 자동화 장치 또는 장치들은 절차의 성능을 개선시키고, 환자에게 투여하기 위한 지방 조직의 자동 수거 및 지방 조직의 프로세싱을 제공한다. 프로세싱 장치는 또한 표준 일렬 또는 직렬 포트, 또는 다른 컴퓨터 또는 네트워크와 연결시키는 다른 수단을 포함할 수 있다. 따라서, 프로세싱 장치는 스탠드 단독 유닛일 수 있거나 또는 또다른 장치와 연결될 수 있다.

특정 실시양태에서, 상기 시스템의 하나 이상의 측면은 프로세싱 장치 내에 속해 있는 소프트웨어를 통해 사용자가 프로그램가능한 것일 수 있다. 프로세싱 장치는 리드 온리 메모리(Read Only Memory) (ROM)에 있는 하나 이상의 예비-프로그램된 소프트웨어 프로그램을 가질 수 있다. 예를 들어, 프로세싱 장치는 프로세싱 혈액에 적합한 예비-프로그램된 소프트웨어, 지방 조직을 프로세싱하여 적은 부피의 재생성 세포를 수득하기 위한 또다른 프로그램 및 지방 조직을 프로세싱하여 보다 큰 부피의 재생성 세포를 수득하기 위한 또다른 프로그램을 가질 수 있다. 프로세싱 장치는 또한 사용자에게 적절한 파라미터를 제공하여, 요구되는 재생성 세포의 양, 프로세싱하고자 하는 조직의 유형, 프로세싱 후 요구되는 조작의 유형, 치료 방법의 유형 등과 같은, 사용자가 입력한 관련 정보에 기초하여 공정을 최적화하는 예비-프로그램된 소프트웨어를 가질 수 있다. 상기 소프트웨어는 일회용 부품의 제품 번호, 온도 및 부피 척도, 조직 부피 및 세포수 파라미터, 사용된 효소의 양, 인큐베이션 시간, 항등 연산자(operator identity), 날짜 및 시간, 환자 신원 등을 비롯한 "런 데이타(run data)"의 수집을 자동화할 수 있다.

장치의 바람직한 실시양태에서, 바 코드 판독 시스템은 상기 변수 데이타 (예를 들어 일회용 세트의 제품 번호 및 만기일, 콜라게나제, 환자/샘플 식별자의 제품 번호 및 만기일 등)의 프로세싱 장치로의 입력을 승인하여 프로세싱의 문서화 부분으로서 통합될 수 있다. 이는 데이타 입력 에러에 대한 기회를 감소시킨다. 이러한 바 코드 판독 시스템은 USB 또는 당업계에 공지된 다른 인터페이스 포트 및 시스템을 사용하여 프로세싱 장치로 쉽게 혼입될 수 있다. 이러한 방법으로, 본 발명의 장치는 공정의 데이타 입력과 문서화의 통합된 제어를 제공한다. 인쇄되어 나온 이러한 파라미터의 보고는 시스템의 프로그램된 조작의 사용자-한정 파라미터의 부분일 수 있다. 자연적으로, 이로 인해 장치의 하드웨어에 있는 프린터용 인터페이스 배출구 (예를 들어 USB 포트)에 더해진 소프트웨어에 있는 프린터 부품 (하드웨어 및 드라이버) 또는 프린터 드라이버의 통합이 요구될 것이다.

특정 실시양태에서, 상기 시스템은 분리 및 농축 공정의 다양한 단계를 수행하기 위한 사용자 개입 또는 장치 분리를 요구하지 않는 단일 통합 시스템이다. 다른 실시양태에서, 상기 시스템은 사용자 입력 없이 완전 자동 모드로 가동될 수 있다. 상기 시스템은 또한 사용자 개입 없이 특정 단계를 통해 시스템이 진행되는 동안, 그러나 특정 프로세싱이 수행될 수 있기 전에, 사용자 개입이 요구되는 반자동 모드로 가동될 수도 있다. 다른 실시양태에서, 상기 시스템은 소정 시간에 소정의 조작을 수행하도록 사용자를 인도하는 지시를 나타내는 단일 통합 시스템이다. 예를 들어, 프로세싱 장치는 시스템의 튜브, 챔버 및 다른 부품의 적절한 삽입을 필요로 하는 단계를 통해 사용자를 촉진할 수 있다. 따라서, 사용자는 적절한 조작 순서가 수행되고 있는지 확인할 수 있다. 이러한 시스템에서 사용자는 각 조작 단계의 확인하여 추가적으로 공정에서 단계의 부주의한 활성화 및 종결을 방지할 수 있다. 추가 실시양태에서, 상기 시스템은 자동화 시험을 개시하여 튜브, 챔버의 올바른 삽입, 차단 상태의 부재 등을 확인할 수 있다. 또다른 실시양태에서, 본 발명의 시스템은 다중 분리 및 농축 프로세싱을 시스템을 통한 조직 흐름의 자동화 제어를 통하여 수행하기 위해 프로그램될 수 있다. 이러한 특징은, 예를 들어, 환자 수술 동안 달리 떨어져 나오는 조직을 상기 시스템 내로 수집하고 조직으로부터의 재생성 세포를 분리하고 농축하여 환자에게 복귀시키는 데 중요할 수 있다.

상기 설명과 같이, 상기 시스템의 부품은 일회용 ("일회용 세트(들)"로 본원에서 지칭됨)일 수 있어서, 이러한 시스템의 부분은 단일 사용후에 처분될 수 있다. 이러한 구현은 환자의 조직과 접촉하게 되는 임의의 표면이 사용된 후에 적절하게 처분될 것으로 확보하는 것을 보조할 것이다. 일회용 세트의 예는 도 13에 예시되어 있다. 바람직한 실시양태에서, 상기 시스템의 일회용 부품은 미리 멸균되고 패키징되어, 사용하기 쉽고 적재하기 쉬우며 다수의 튜브 연결의 필요성 및 튜브 연결의 복잡한 경로를 제거하는 사용가능한 "상용품(off the shelf)"이 된다. 이러한 일회용 부품은 상대적으로 저렴하게 제조되고, 따라서 이들의 소비로 인한 추후 비용을 발생시키지 않는다. 한 실시양태에서, 일회용 시스템 (본원에서 "일회용 세트(들)"과 호환적으로 나타냄)은 수집 챔버 (20), 프로세싱 챔버 (30), 폐기물 챔버 (40), 배출 챔버 (50), 필터 조립체 (36), 샘플 백 (60) 및 연관된 도관 (12) 또는 튜브를 포함하거나, 이들을 필수 요소로 하거나, 이들로 이루여져 있다. 본 발명의 시스템의 일회용 세트의 바람직한 실시양태에서, 수집 챔버 (20) 및 프로세싱 챔버 (30)은 강성 프레임에 하우징되어 있는 도관 (12)에 의해 연결된다. 프로세싱 챔버 (30)의 회전 밀봉 네트워크 (도 7 & 8)는 또한 동일한 강성 프레임에 하우징될 수 있다. 또다른 바람직한 실시양태에서, 일회용 세트의 다양한 챔버 및 용기는 시스템을 자동화하는 펌프, 밸브, 센서 및 다른 장치가 사용자 개입 없이 필요에 따라 적절하게 활성화되거나 탈활성화되도록 시스템의 프로세싱 장치와 연결될 수 있는 필수적인 인터페이스로 구성된다. 상기 인터페이스는 또한 시스템을 셋업하는 데 요구되는 시간 및 전문 지식을 감소시키고, 또한 시스템을 어떻게 적절하게 셋업할 것인지 나타내고 잘못된 셋업의 경우에 사용자를 주의시킴으로써 실수를 줄일 수 있다.

1회용 세트는 환자로부터 지방 또는 다른 조직을 수득하고 재생성 세포를 환자에게 되돌리는데 적합한 하나 이상의 바늘 또는 주사기를 추가로 포함할 수 있다. 포함된 유형별 및 각종 바늘 및 주사기는 프로세싱할 조직의 종류 및 양에 따라 달라질 것이다. 1회용 세트는 시스템에서 사용되는 세척용 액체 및 다른 프로세싱 시약을 담기 위한 하나 이상의 경직성 또는 가요성 용기를 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, 1회용 세트는 수술에 필요한 염수, 효소 및 임의의 다른 처리용 또는 대체용 액체를 담는 용기를 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 시스템 및 발명에 사용하기에 적합한 세척 용액, 재-현탁 액체, 첨가제, 작용제 또는 이식 물질을 1회용 세트에 제공할 수 있다.

시스템의 재사용 성분은 수집 챔버용 교반 장치, 펌프, 및 밸프 및 펌프 제어를 활성화시키는 구분된 센서, 원심분리 모터, 원심분리 모터의 회전틀, 사용자 보호막 및 USB 포트, 및 기타 결합 장치를 포함하거나, 본질적으로 상기로 이루어져 있거나, 이로 이루어진다. 예시적인 재사용 성분은 도 14에 예시되어 있다. 재사용 하드웨어는 각종 1회용 세트에 사용할 수 있다. 예를 들어, 본원에 기재한 매우 다양한 조직으로부터 재생성 세포를 분리하고 농축하기 위해 재사용 하드웨어를 1회용 세트와 함께 사용할 수 있다.

한 실시양태에서, 시스템에 사용하는 1회용 세트는 조직 약 800 mL를 수용할 수 있는 수집 챔버 (20); 수집 챔버 (20)에서 세척하고 분해된 조직 약 800 mL에 의해 생성된 재생성 세포 조성물을 프로세싱할 수 있는 프로세싱 챔버 (30); 재생성 세포 0.5 mL 이상을 수용할 수 있는 배출 챔버 (50); 및 폐기물 약 10 L를 수용할 수 있는 폐기물 용기 (40)로 구성되어 있다. 이러한 실시양태에서, 하드웨어 장치는 24"L X 18"W X 36"H보다 크지 않다. 1회용 세트 뿐만 아니라 하드웨어 장치의 각종 성분의 별도 치수는 필요시 구축할 수 있고, 제한되지 않으면서 본 발명에 포함되는 것으로 이해되어야 한다.

시스템의 1회용 성분을 장치에 배치시키는 것은 용이하다. 상응하는 재사용 성분과 함께 조립에 사용된 1회용 세트의 예시는 도 15에 예시되어 있다. 이러한 시스템은 바람직하게는 부당하게 적재된 1회용 성분을 검출할 수 있도록 고안된다. 예를 들어, 각 1회용 세트의 성분은 색상-표시 마크를 가져서 튜브, 챔버 등을 시스템 내 적절한 위치에 적당히 정렬시키고 삽입할 수 있다. 추가의 실시양태에서, 본원에 개시된 시스템은 휴대용 장치이다. 예를 들어, 휴대용 장치는 지방 조직 수거가 일어나는 한 위치에서 지방 조직이 수거되는 또다른 위치로 옮길 수 있다. 특정 수행에서, 휴대용 장치는 환자의 침대 곁에서 지방 조직을 수거하고 프로세싱하기에 적합하다. 이와 같이, 휴대용 장치는 환자에서 환자에게로 이동시킬 수 있는 시스템 일부일 수 있다. 따라서, 휴대용 장치는 위치에 고정시키는 바퀴를 가질 수 있어서 쉽게 위치시키고, 수술을 통해 안정하고 안전한 위치에서 편리한 위치선정에 사용될 수 있다. 다른 실시양태에서, 휴대용 장치는 테이블 상단과 같은 평면에 설치되어 작동하도록 고안된다. 휴대용 장치는 또한 하우징 단위로 동봉될 수 있다. 휴대용 장치는 행거, 후크, 라벨, 저울 및 수술을 보조하는 기타 장치로 추가로 구성될 수 있다. 원심분리, 프로세싱 장치, 디스플레이 스크린과 같은 본원에 기재된 시스템의 모든 재사용 성분은 시스템의 휴대용 장치에 설치될 수 있다.

재생성 세포를 수득하기 위한 별도의 수동 실시양태는 또한 본 발명의 범위 내에 존재한다. 예를 들어, 한 실시양태에서, 지방 조직은 본원에 기재한 시스템의 성분, 설비 및(또는) 비품의 임의의 조합을 이용하여 프로세싱할 수 있다.

상기의 방법에 의해 수득된 재생성 세포는 지방 조직 단편과 혼합하고, 추가의 프로세싱없이 환자에게 투여될 수 있거나, 또는 다른 조직, 세포, 임플란트 또는 장치와 함께 혼합한 후에 환자에게 투여할 수 있다. 특정 실시양태에서, 재생성 세포를 유사하게 프로세싱하지 않은 하나 이상의 단위의 지방 조직과 함께 혼합한다. 이와 같이, 본 발명의 방법을 실행함으로써, 지방 조직을 향상된 농도의 재생성 세포와 함께 포함하는 조성물을 환자에게 투여할 수 있다. 지방 조직의 다양한 단위의 용량은 상이할 수 있다. 예를 들어, 한 용량은 지방 조직의 또다른 단위의 용량보다 25% 이상 클 수 있다. 또한, 한 용량은 지방 조직의 또다른 단위의 용량보다 50% 이상, 예컨대 100% 이상, 및 150% 이상 보다 훨씬 클 수 있다. 또한, 원하는 조성물은 지방 조직의 제1 단위를 농축된 재생성 세포 집단 (이는 재생성 세포를 함유한 세포 펠렛일 수 있음) 및 지방 조직의 하나 이상의 또다른 단위와 혼합하여 수득할 수 있다. 특정 실시양태에서, 이들 다른 단위는 재생성 세포의 증가된 농도를 갖지 않을 것이며, 즉 지방 조직의 제1 단위에 함유된 농도 미만의 재생성 세포 농도를 가질 것이다. 다른 실시양태에서, 단위 중 하나는, 예를 들어 재생성 세포의 증가된 농도를 함유하는 동결보존된 물질이다.

프로세싱 종료시, 농축된 세포를 주사기와 같은 전달 장치에 적재하여 수용자에게 피하 투여하거나, 근육내 투여하거나, 또는 세포/조직 혼합물을 환자의 표적 부위 (예를 들어, 요도주위 영역, 주름살 아래의 피하 공간 또는 유방 내의 피하 공간)로 전달가능케하는 다른 기술로 투여할 수 있다. 즉, 세포를 당업자에게 공지된 임의의 수단으로 환자에게 투여할 수 있다. 바람직한 실시양태는 바늘 또는 카테터로, 또는 직접 수술 이식으로 투여하는 것을 포함한다. 수술 이식의 실시양태에서, 세포 및 조직 혼합물은 미리 형성된 매트릭스와 같은 첨가제와 함께 적용시킬 수 있다.

활성 세포 집단은 단독으로 또는 다른 세포, 조직, 조직 단편, 성장 인자, 예컨대 VEGF 및 혈관형성 또는 동맥형성 성장 인자로 공지된 다른 것들, 생활성 또는 불활성 화합물, 재흡수가능한 플라스틱 스캐폴드, 상기 집단의 전달, 효능, 관용성 또는 기능을 향상시키기 위해 계획된 기타 첨가제와 함께 적용시킬 수 있다. 구조 또는 치료 목적 유래용 세포의 기능을 변화시키거나 향상시키거나 보충시키기 위해 상기 방식으로 DNA를 삽입하거나 세포 배양액 내에 위치시킴으로써 세포 집단을 또한 변형시킬 수 있다. 예를 들어, 줄기 세포용 유전자 전달 기술은 문헌 ([Morizono et al., 2003] 및 [Mosca et al., 2000])에 기재된 바와 같이 당업자에게 공지되어 있으며, 문헌 [Walther and Stein, 2000] 및 [Athanasopoulos et al., 2000])에 기재된 바와 같은 바이러스 형질감염 기술, 더욱 구체적으로는 아데노-관련 바이러스 유전자 전달 기술을 포함할 수 있다. 비-바이러스 기재 기술은 또한 문헌 [Muramatsu et al., 1998]에 기재되어 있는 바와 같이 수행할 수 있다.

또다른 측면에서, 세포를 유전자 코팅 성장인자, 예를 들어 세포가 그들 자신의 성장 인자 공급원으로서 작용할 수 있게 하는 혈관형성 성장 인자(들)과 조합할 수 있다. 추가의 유전자 (또는 유전자의 조합물)는 비제한적인 아데노바이러스 형질도입, "유전자 총", 리포좀-매개 형질도입, 및 레트로바이러스 또는 렌티바이러스-매개 형질도입, 플라스미드, 아데노-관련 바이러스를 비롯한 당업계에 공지된 임의의 기술에 의할 수 있다. 시간에 걸쳐 세포에 유전자를 방출하고(하거나) 제공할 수 있는 유전자 전달 비히클을 함유한 담체 물질과 함께 세포를 이식할 수 있으며, 이와 같이 계내에 형질도입이 지속되거나 개시될 수 있다.

세포 및(또는) 세포를 함유하는 조직을 세포 및(또는) 조직이 적출된 환자 이외의 환자에게 투여하는 경우에, 1종 이상의 면역억제제를 세포 및(또는) 조직을 수여받은 환자에게 투여하여 이식의 거부 반응을 감소시키고, 바람직하게는 예방할 수 있다. 본원에서 사용된, 용어 "면역억제 약물 또는 면역억제제"는 정상 면역 기능을 억제하거나 또는 방해하는 제약 작용제를 포함하는 것을 의도한다. 본원에 개시된 방법에 적합한 면역억제제의 예로서 T-세포/B-세포 공동자극 경로를 억제하는 작용제, 예컨대 미국 특허 공보 제20020182211호에 개시된 바와 같이, CTLA4 및 B7 경로를 통해 T-세포와 B-세포의 결합(coupling)을 방해하는 작용제를 들 수 있다. 바람직한 면역억제제는 시클로스포린(cyclosporine) A이다. 다른 예로서 미오페닐레이트 모페틸(myophenylate mofetil), 라파미신(rapamicin), 및 항-흉선세포 글로불린을 들 수 있다. 한 실시양태에서, 면역억제 약물은 1종 이상의 다른 치료제와 함께 투여된다. 면역억제 약물은 투여 경로와 상용성인 제형 형태로 투여되고 원하는 치료 효과를 달성하기에 충분한 투여량으로 대상체에 투여된다. 또다른 실시양태에서, 면역억제 약물은 본 발명의 재생성 세포에 대한 내성을 유발하기 위해 충분한 시간 동안 일시적으로 투여된다.

본 발명의 특정 실시양태에서, 세포는 1종 이상의 세포 분화제, 예컨대 사이토카인 및 성장 인자와 함께 환자에게 투여된다. 다양한 세포 분화제의 예는 문헌 ([Gimble et al., 1995], [Lennon et al., 1995], [Majumdar et al., 1998], [Caplan and Goldberg, 1999], [Ohgushi and Caplan, 1999], [Pittenger et al., 1999], [Caplan and Bruder, 2001], [Fukuda, 2001], [Worster et al., 2001], [Zuk et al., 2001])에 개시되어 있다.

또다른 측면에서, 세포 집단을 수용자에게 배치시키고 재흡수가능한 플라스틱 쉬쓰(sheath) 또는 마크로포어 바이오서저리, 인크.(MacroPore Biosurgery, Inc.)에 의해 제조된 것과 같은 다른 물질로 포위할 수 있다 (예를 들어 미국 특허 제6,269,716호; 제5,919,234호; 제6,673,362호; 제6,635,064호; 제6,653,146호; 제6,391,059호; 제6,343,531호; 제6,280,473호). 이러한 환경에서, 쉬쓰는 지방 조직-유래의 세포로 프로세싱된 결함 영역으로의 근육 및 다른 연부 조직의 탈수를 예방하여 결함의 복구를 제어하는 것을 촉진할 수 있다. 상기 접근법은 쉬쓰를 원하는 최종 형태로 예비성형하여 조직이 생체내 원하는 형태로 성형되도록 하는 재건 수술에서 사용될 수 있다. 이러한 측면에서, 유익한 효과는 추가 성분 예컨대 전-지질형성(pro-adipogenic) 또는 혈관형성 단백질 성장 인자 또는 생물학적 또는 인공 스캐폴드를 보충함으로써 향상될 수 있다.

본원에 기재한 바와 같이, 수많은 결함 및 장애는 본 발명의 시스템 및 방법을 사용하여 수득된 재생성 세포로 치료될 수 있다. 예를 들어, 유방확대성형술, 연부 조직 결함 보정, 및(또는) 요실금의 치료에서, 재생성 세포로 향상된 지방 조직은 혈관신생을 개선시키고 이식부위의 괴사를 감소시켜, 생착을 개선시키고 지질 괴사 가성낭종 형성의 위험을 감소시킬 수 있다. 상기에 기재된 바와 같이, 재생성 세포-향상된 지방 조직은 연부 조직 결함 등을 보정하는데 사용될 수 있다. 정상 지방 조직 이식편에 상기 농축된 재생성 세포 집단을 부가하는 것은 보완적인 미소 서식 환경의 제공을 통해서 이식편의 수명을 개선시킬 수 있다. 또한, 본원에 기재된 조성물은 각각 위식도 역류 질환 (GERD) 및 대변실금 치료를 위해 외항문 괄약근뿐만 아니라 식도 괄약근 하부의 구조적 지지체 제공에 사용될 수 있다 (문헌 [Bernardi, Favetta et al. 1998]).

전형적으로, 통상적인 유방성형확대술을 위한 후보로 여겨지는 사람은 지방 조직-유래의 세포가 증대된 자가 지방 이식에 의한 유방확대를 위한 후보이다. 통상적인 유방성형확대술에 적합하다고 여겨지는 상기 후보들 이외에, 상기 방법은 현존하는 이식 기술을 사용하여 기술적으로 불가능하거나 미적으로 허용할 수 없는, 유방 또는 유방들의 소형/중간 정도의 확대, 형태 변화 또는 윤곽 변경을 요구하는 사람 집단에 적용할 수 있다. 연부 조직 증대를 위한 후보는 세포 향상된 자가 지방 조직을 사용하는 자가 지방 이식 수술을 위한 후보와 유사하다. 연부 조직 증대 수술의 예는 안면 (예를 들어 미간, 비순) 주름, 구강 주위 라인, 망석중 라인, 진피 디보트; 둔부; 장딴지; 생식기; 눈뒤, 및 발바닥 지방 패드를 포함하되, 이에 제한되지 않는 안면 윤곽 기형을 포함하되, 이에 제한되지 않는다. 요도 확장 주입을 위한 후보로 여겨지는 사람은 또한 본원에 개시한 세포-향상된 지방 조직으로 자가 지방 이식을 하기 위한 후보이다. 상기 수술은 여성에게는 요도 주위뿐만 아니라 요도 경유 주입, 및 남성에게는 요도 주위 또는 전방향 주입을 포함할 수 있다. 예비-수술 평가는 전형적으로 수술의 모든 관련된 위험 및 잇점을 개시하는 것을 철저하게 알리는 것 이외에 정기적인 내력 및 신체 실험을 포함한다.

환자 후보의 확인 후에, 환자에게 전형적으로 지방 조직 수집을 행한다. 지방 조직 수집에 적합한 부위에 대해 환자의 체형을 실험할 수 있다. 수술은 환자의 임상적 상태에 적절하게 머리맡에서 또는 혈류역학 모니터링이 장착된 수술복을 착용한 상태에서 수행할 수 있다. 일부 바람직한 수거 부위(들)은 정상 해부학적 구조에 의해 제한되는 가능성 있는 공간(들), 손상 위험이 있는 비 주요 혈관 또는 내장 구조, 및 입수의 용이성을 특징으로 할 것이다. 손대지 않은 수거 부위가 전형적으로 바람직하지만, 이미 손을 댄 수거 부위는 추가 지방 조직 수거를 방해하지 않는다.

상기 바람직한 부위는 양쪽 팔다리 하부의 측면 대퇴부와 안쪽 대퇴부 영역, 앞쪽 복부 벽 판누스, 및 양 옆구리 영역을 포함하되, 이에 제한되지 않는다. 상기 수술은 종종 지방흡입과 수반하여 수행될 수 있다. 지방 조직 수집의 부위는 또한 내과 의사에 의해 결정된 안전 프로파일뿐만 아니라 환자의 미적 바램에 의해서 결정될 수 있다. 수거될 영역에 예를 들어, 표준 팽대성 액체 용액을, 피하 주입하며, 상기 용액은 상이한 표준화된 투입 요법의 리도카인, 염수, 및(또는) 에피네프린의 배합을 함유하거나 함유하지 않을 수 있다. 11-블레이드 외과용 메스 (또는 다른 표준 블레이드)를 사용하여, 수거 영역 주변에 진피를 가르기 위해서 작은 구멍의 상처를 낸다. 블레이드를 360도로 돌리는 것과 같이 회전시켜, 완전한 상처를 낸다. 이어서, 뭉뚝한 팁의 14-게이지 (또는 적절한 크기의) 캐뉼라를 피하 지방 조직 면으로 삽입할 수 있다. 캐뉼라를 전원 보조된 흡입 장치 또는 수동 흡인을 위한 주사기에 연결할 수 있다. 이어서 캐뉼라를 면에 걸쳐 움직임으로써 결합 조직 구조를 분쇄시킨다. 수득한 흡인 부피는 약 0 cc 내지 약 1500 cc의 범위일 수 있다. 이러한 방식으로 수집된 지방 조직의 분획 또는 부분은 본원에 기재한 방법을 사용하여 재생성 세포의 단리 및 농축을 위해 프로세싱될 것이다. 나머지 지방 조직은 현재 수용된 관리 표준에 따라서 환자에게 재이식하기 위해 프로세싱될 것이다. 별법으로, 환자는 지방제거술 수술을 통해 지방이 제거될 수 있다. 지방 조직의 제거 후에, 표준 수술 기술을 사용하여 지혈시키고 우선 상처를 덮는다.

지방 조직의 수집은 이식 시술 1 내지 2시간 전에 수행될 수 있다. 그러나, 수집 타이밍은 달라질 수 있으며, 품질 관리 표준에 따를 수 있다. 최종적으로는, 환자를 관리하는 담당 의사가 수집 타이밍을 결정할 것이다. 다른 실시양태에서, 지방 조직-유래 세포의 은행 시설에 저온 보존된 지방 조직-유래 세포가 사용될 수 있다.

수집된 지방 조직의 부피는 통상적으로 약 1 내지 약 1500 cc의 범위일 것이다. 바람직한 조직 수집 방법은 허용된 품질 관리 표준에 따를 것이다. 분리되는 지방의 부피는 환자마다 다를 수 있으며, 유방 확대 성형술에 필요한 지방 조직의 양, 미적 가능성, 연령, 체질, 응고 프로파일, 혈역학적 안정성, 동반이환율 및 의사의 기호 (이에 제한되는 것은 아님)를 비롯한 많은 인자에 좌우될 것이다.

조직 프로세싱이 완료된 후, 환자는 유방 확대 성형술과 관련된 지방 조직 이식, 연부 조직 확대 및(또는) 요실금 치료를 받도록 준비될 수 있다. 이식을 둘러싼 특정 이슈로는 타이밍, 세포량, 경로, 방법, 장소 및 모니터링이 포함된다.

본 발명의 특정 실시양태에서, 이식 시술시, 재생 세포-증강된 지방 조직이 환자에게 투여된다. 이 방법은 시간 경과에 따른 물질의 다중 주입에 대한 요구를 벗어나지 않는다. 최종적으로는, 이용되는 타이밍은 품질 관리 표준을 따를 것이다. 추가의 실시양태에서, 적용될 세포에 상기 논의된 바와 같은 변형, 정제, 자극 또는 다른 조작이 가해지는 경우에는 또다른 타이밍 계획이 존재할 수 있다.

각 환자에게 도입될 세포량은 통상적으로 지방 조직 프로세싱 후의 세포 수율에 따라 결정될 것이다. 특정 방법에는 수거된 모든 세포가 필요하지 않을 수 있으며, 세포의 남은 부분은 본원에 기재된 바와 같이 저온 보존될 수 있다. 한 실시양태에서, 환자에게 도입될 세포의 최소 개수는 이식 지방 50 cc 당 5.5 × 10⁵로 예상된다. 그러나, 이 수치는 원하는 효과를 달성하도록 상당히 달라질 것으로 예상될 수 있다. 주입된 부피의 분율이 시간에 따라 감소할 것으로 예상되므로, 추가의 증강된 지방 조직의 주입 (과잉교정)은 비통상적인 실시가 아니다. 또한, 본원에서 개시된 방법은 일련의 용량에 대한 요구를 벗어나지 않으므로, 상기 언급된 것보다 많은 세포가 환자에게 투여될 수가 있다.

유방 확대 수술에서, 도입 경로는 겨드랑이, 유륜 주위, 유방밑을 통해 유방 조직으로 삽입된 뭉뚝한 팁의 표준 14-게이지 캐뉼라를 통한 개방형 도입을 포함할 수 있다. 연부 조직 확대 수술에서, 도입 경로는 적절한 위치의 절개를 통해 연부 조직으로 삽입된 뭉뚝한 팁의 표준 14-게이지 캐뉼라를 통한 개방형 도입을 포함할 수 있다. 요실금 수술에서, 도입 경로는 방광경에 의한 시각화를 통한 방광목 및 근접 요도에서의 직접 주입을 포함할 수 있다. 별법으로 또는 추가로, 이식물은 선행 경로를 통해 도입될 수 있다. 별법으로 또는 추가로, 세포-증강된 조직은 현재 허용되는 방법을 통해 접근될 정맥내 경로를 통해 도입될 수 있다. 정맥내 방법에서, 이식 물질의 방향성 유동의 제어는 외과적 개입에 의해 개시된 염증 과정으로부터 유도된 내분비 및 측분비 수송을 통해 달성될 수 있다. 본원에서 언급된 경로는 원하는 임상 효과를 달성하기 위한 여러 경로 또는 배꼽 절개를 사용하는 것을 벗어나지 않는다. 별법으로 또는 추가로, 세포-증강된 조직은 겨드랑이를 통한 내시경 흉근하 접근법을 통해 도입될 수 있다.

한 실시양태에서, 지방 프로세싱으로부터 얻어진 재생 세포는 이식될 지방과 상기 기재된 비율로 혼합된다. 상기 혼합은 자동화 수단 (예를 들어, 장치-제어 진탕 또는 원심분리)을 통해 또는 수동식 방법 (예를 들어, 루어-락 주사기, 볼텍싱)을 통해 수행될 수 있다. 재생 세포-증강된 지방 조직은 표면적대 부피의 비율을 최대화시키기 위해 인열식 방식으로 투여되는 것이 바람직하다. 다른 실시양태에서, 재생 세포는 인공 또는 천연 매질 또는 조직 스캐폴드에 재현탁된 후에 이식 부위, 예를 들어 유방 부위 및(또는) 내인성 괄약근 부위로 삽입되어 원하는 효과가 얻어질 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 배합된 세포와 조직은 일반적으로 '콜맨 기술 (Coleman Technique)' (문헌 [Coleman 1991]; [Coleman 1995]; [Coleman 2001])로 지칭되는 방법에 따라 주입될 수 있다.

지방 조직 수집은 임의의 적절한 임상 환경, 예를 들어 하기 장소에서 수행될 수 있다: 진료실, 임상실, 응급실, 병실, 집중치료실, 수술실, 카테터실 및 방사선실. 유방 확대 성형술은 통상적으로 외래환자 환경에서 수행되나, 입원환자 환경에서 수행될 수도 있다. 요도 팽화 주입은 통상적으로 외래환자 환경에서 수행되나, 입원환자 환경에서 수행될 수도 있다.

유방 확대 수술에서, 재생 세포-증강된 자가 지방 전이술의 효과는 하기 임상적 척도 중 하나 이상에 의해 입증될 수 있다: 증가된 유방 크기, 변형된 유방 형태, 변형된 유방 윤곽, 지속적인 생착, 지방괴사성 낭의 감소된 형성율, 향상된 환자 만족도 및 이식가능한 이물질의 감소된 사용량. 다른 연부 조직 확대 수술에서, 재생 세포-증강된 자가 지방 전이술의 효과는 하기 임상적 척도 중 하나 이상에 의해 입증될 수 있다: 개선된 연부 조직 형태, 개선된 조직 기능, 개선된 연부 조직 윤곽, 지속적인 생착, 환자의 개선된 삶의 질 및 이식가능한 이물질의 감소된 사용량. 요실금 수술에서, 괄약근 지지를 위한 재생 세포-증강된 자가 지방 전이술의 효과는 하기 임상적 척도 중 하나 이상에 의해 입증될 수 있다: 감소된 실금 빈도, 지속적인 생착, 환자의 개선된 삶의 질 및 이식가능한 이물질의 감소된 사용량. 세포 요법의 효과는 수일 내지 수주에 걸쳐 발생한다. 그러나, 몇 시간 만에 일찍부터 이로운 효과가 관찰될 수 있으며 수년간 지속될 수 있다.

이식 지방 조직의 도입 이전, 도중 및 이후의 환자 모니터링은 하기 것들을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다: 응고 검사, 산소 포화도, 혈역학적 모니터링 및 상처 상태. 형성되는 석회화가 유방의 악성 석회화 검출 능력을 왜곡할 수 있는 우려가 있으므로, 수술전 진단 검사, 예를 들어 유방조영술을 받아야 함을 환자에게 통지할 수 있다. 그러나, 자기 공명 영상을 이용함으로써 이러한 제한을 극복할 수 있으므로 상기 통지는 임의적일 수 있다. 추가의 모니터링은 원하는 임상 효과에 대해 특이적일 것이다. 이식 지방 조직의 도입 이전, 도중 및 이후의 환자 모니터링은 하기 것들을 포함할 수 있다: 검뇨, 골반 검사, 방광경 검사, 요역학 평가, 응고 검사, 산소 포화도, 혈역학적 모니터링 및 상처 상태. 추가의 모니터링은 원하는 임상 효과에 대해 특이적일 것이다.

하기 실시예는 이 기술을 적용할 수 있는 특정 상황 및 설정을 나타내기 위해 제공하는 것이지 본 발명의 범위 및 본 개시내용에 포함되는 청구의 범위를 한정하는 것으로 의도하지는 않는다.

실시예 1: ADC 에 의한 혈관형성 성장 인자 VEGF 의 발현

혈관 내피 성장 인자 (VEGF)는 혈관형성의 중요한 조절기 중 하나이다 ([Nagy et al., 2003]; [Folkman, 1995]). VEGF 족의 또다른 구성원인 태반 성장 인자는 혈관형성 뿐만 아니라 동맥형성 모두에서 유사한 역할을 수행한다. 구체적으로, PIGF 녹아웃 마우스 내로의 야생형 (PIGF +/+) 세포의 이식은 뒷발 허혈로부터의 신속한 회수를 유도하는 능력을 회복시킨다 [Scholz et al., 2003].

혈관재형성 프로세스에 대해 혈관형성 및 동맥형성이 중요하기 때문에, 본 발명의 재생성 세포에 의한 PIGF 및 VEGF 발현은 3명의 공여자로부터의 지방세포 유래의 재생성 세포를 사용하며 ELISA 검정 (미국 미네소타주 미니애폴리스 알 앤드 디 시스템즈(R & D Systems))로 시험하였다. 1명의 공여자는 고혈당증 및 제2형 당뇨병의 병력 (미세혈관 및 거대혈관 질환과 높게 관련된 상태)이 있다. 각 공여자로부터의 재생성 세포는 10% FCS 및 5% HS로 보충된 DMEM/F-12 배지 1 ㎠ 당 1,000개의 세포로 플레이팅하고, 전면성장 때까지 성장시켰다. 상등액 샘플을 취하고, PIGF 및 VEGF 단백질의 발현에 대해 검정하였다. 도 16A 및 16B에 나타난 바와 같이, 결과는 본 발명의 지방세포 유래의 재생성 세포에 의한 VEGF (도 16A) 및 PIGF (도 16B)의 왕성한 발현을 나타낸다.

개별 연구에서, 정상 성숙 마우스로부터의 재생성 세포를 배양함으로써 분비된 혈관형성 관련 사이토카인의 상대적 양을 측정하였다. 재생성 세포는 10% FBS를 갖는 알파-MEM에서 세포 전면성장 후 5일까지 배양하고, 이때 세포 배양 배지를 수거하고, 항체 어레이 분석 (레이바이오(RayBio (등록상표)) 마우스 사이토카인 안티바디 어레이 II(Mouse Cytokine Antibody Array II)) (레이바이오텍, 인크 .(RayBiotech, Inc.))으로 평가하였다. 하기 혈관형성 관련 성장 인자를 검출하였다: 혈관 내피 성장 인자(VEGF), bFGF, IGF-11, 에토탁신, G-CSF, GM-CSF, IL-12 p40/p70, IL-12 p70, IL-13, IL-6, IL-9, 렙틴, MCP-1, M-CSF, MIG, PF-4, TIMP-1, TIMP-2, TNF-α, 및 트롬보포에틴.

이들 데이타는 본 발명의 재생성 세포가 혈관형성 및 동맥형성 성장 인자의 넓은 어레이를 발현한다는 것을 나타낸다. 더욱이, 당뇨병 환자가 VEGF 및 PIGF를 정상 환자에 대한 동등한 수준까지 발현하였다는 발견은 당뇨병 환자가 자가 지방세포 유래의 재생성 세포에 의한 혈관형성 요법에 대한 후보일 수 있음을 제안한다.

실시예 2: ADC 는 혈관형성에 참여하는 세포 집단을 함유함

내피 세포 및 그의 전구 세포, 내피 선조 세포(EPC)는 혈관형성에 참여하는 것으로 공지되어 있다. EPC가 지방세포 유래의 재생성 세포에 존재하는지 여부를 결정하기 위해, 인간 지방세포 유래의 재생성 세포를 EPC 세포 표면 마커, 예를 들어 CD-34에 대해 평가하였다.

ADC를 인간 피하 지방 조직의 효소 분해에 의해 단리하였다. ADC (100 ul)를 0.2% 소 태아 혈청 (FBS)을 함유한 인산염 염수 완충액 (PBS)에서 인큐베이션하고, 20 내지 30분 동안 4℃에서 인간 내피 마커 CD-31 (분화된 내피 세포 마커) 및 CD-34 (EPC 마커), 뿐만 아니라 인간 ABCG2 (ATP 결합 카세트 전달체)(다능성 세포 상에서 선택적으로 발현됨)에 결합하는 형광 표지된 항체와 인큐베이션하였다. 세척 후에, 세포를 FACSAria 소터(Sorter) (벡톤 디켄손-이뮤노사이토미터리(Beckton Dickenson-Immunocytometry)) 상에서 분석하였다. 데이타 획득 및 분석을 이어서 FACSDiva 소프트웨어 (미국 캘리포니아주 소재의 비디-이뮤노사이토미터리(BD-Immunocytometry))에 의해 수행하였다. 결과 (도시하지 않음)는 건강한 성인으로부터의 지방세포 유래의 재생성 세포가 EPC 마커 CD-34 및 ABCG2를 발현하지만, 내피 세포 마커 CD-31을 발현하지 않았음을 나타냈다. EPC 마커 CD-34를 발현하는 세포가 당뇨병 병력을 갖는 공여자로부터 유래한 재생성 세포에서 유사한 빈도수로 검출되었다.

내피 세포 분화 배지에서 인간 지방세포 유래의 재생성 세포의 배양 후에 그의 EPC의 빈도수를 측정하기 위해, ADC를 섬유결합소-코팅 플레이트 상으로 플레이팅하고, 내피 세포 배지에서 3일 동안 배양하여 성숙 내피 세포를 제거하였다. 비접착 세포를 제거하고 다시 플레이팅하였다. 14일 후에, 콜로니를 FITC-접합 울렉스 에우로파에우스 아글루티닌-1(Ulex europaeus Agglutinin-1) (미국 캘리포니아주 벌링게임 소재의 벡터 랩스(Vector Labs)) 및 DiI-표지 아세틸화 LDL (미국 오레곤주 유진 소재의 몰리큘러 프로브즈(Molecular Probes))로 염색함으로써 확인하였다. 도 17에 나타난 바와 같이, 결과는 대략 500개 EPC 세포/10⁶개 ADC 세포의 EPC 빈도수를 나타낸다.

지방 조직 유래 재생성 세포 내의 EPC의 존재는 이들 세포가 새로운 혈관의 발생에 직접적으로 참여하고, 혈관형성 및 재관류를 향상시킬 수 있다는 것을 나타낸다.

실시예 3: ADC 중의 혈관 구조의 시험관내 발생

당업계에 인지되는 혈관형성에 대한 검정 중 하나는 섬유아세포의 공급자층 상에서 성장한 내피 세포가 신생 모세관 네트워크의 CD31-양성 튜브 회상의 복합 네트워크를 발생시키는 것이다 [Donovan et al., 2001]. 지방세포 유래의 재생성 세포가 내피 세포, EPC 및 기타 간질 세포의 전구 세포를 함유하기 때문에, 본 발명자들은 공급자층의 부재에서 모세관-유사 구조를 형성하는 이들 재생성 세포의 능력을 시험하였다. 재생성 세포를 2주 배양 후에 모세관 네트워크 발생 정상 마우스의 사타구니 지방 패드로부터 수득하였다 (도 18A). 특히, STZ를 투여한 8주 후에 스트렙토조토신 (STZ)-유도 제1형 당뇨병을 앓는 고혈당 마우스로부터의 재생성 세포는 정상 마우스로부터의 세포에 의해 형성되는 것과 동등한 모세관 네트워크를 형성하였다 (도 18B).

차후 연구에서, 지방세포 유래의 재생성 세포를 추가 성장 인자 없이 완전 배양 배지 (10% FCS로 보충된 α-MEM)에서 배양하였다. 이들 재생성 세포는 또한 모세관 네트워크를 형성하였다. 또한, 혈관 구조는 내피 세포 마커 CD31, CD34, VE-카드헤린 및 폰 빌레브란트 인자/인자 VIII에 대해 염색 양성을 나타내지만, 팬(pan)-림프구 마커 CD45에 대해서는 그렇지 않았다.

청년기 마우스 대 노년기 마우스로부터의 모세관 네트워크를 형성하는 재생성 세포의 능력을 비교하기 위해, 정상 청년기 마우스 및 노년기 마우스로부터의 재생성 세포 (1, 12, 또는 18령)를 2주 동안 추가 성장 인자 없이 완전 배양 배지 (10% FCS로 보충된 α-MEM)에서 배양하였다. 동등한 모세관-유사 네트워크를 모든 공여자로부터의 재생성 세포의 배양물에서 관찰하였다 (도시하지 않음).

상기 데이타는 정상인 및 당뇨병 환자, 뿐만 아니라 청년기 환자 및 노년기 환자로부터의 지방세포 유래의 재생성 세포가 신생 모세관 네트워크의 형성에 일치된 혈관 구조를 형성할 수 있다는 것을 나타낸다. 따라서, 본 발명의 재생성 세포는 혈관형성 결점을 치료하기 위해 사용할 수 있다.

실시예 4: ADC 에서 혈관 구조의 생체내 발달

시험관내 혈관형성 잠재력은, 장래성이 있긴 하지만, 세포가 생체내 혈관형성 작용을 하지 않는다면 그 가치가 낮다. 수술로 인한 뒷발 허혈은 해당 요법의 혈관형성 잠재력을 확인할 수 있는 생체내 모델이다. 이 모델을 인간 세포가 재관류를 유발하는 능력을 관찰할 수 있는 면역결핍 (NOD-SCID) 마우스에서 발생시켰다.

수술 전의 혈류 값을 하기 기술한 바와 같이 양쪽 뒷발에서 측정하였다. 마취 상태의 마우스의 맥관구조를 다음 부위에서 4-0 실크 봉합사로 묶었다: 1) 분지 근위의 장골 동맥, 2) 내재 대퇴 동맥의 기시점 원위, 3) 표재 대퇴 동맥의 분기 근위. 결찰 후에, 맥관구조를 총괄적으로 제거하였다. 창상을 봉합하기 전에, 결찰된 대퇴 동맥으로부터 분기된 덩어리로 관찰가능한 곁가지 또한 결찰하였다. 24시간 후에, 129S 마우스에 5 × 10⁶개의 유전적 동계의 마우스 지방세포 유래의 재생성 세포를 주사하고, NOD SCID 마우스에 꼬리 정맥을 통해 인간 지방세포 유래의 재생성 세포를 주사하였다. 혈류를 레이저 도플러 혈류 영상출력기 (Laser Doppler Flow Imager, 미국 델라웨어주 윌밍톤에 소재한 무어 인스트루먼츠 인크. (Moor Instruments Inc.))를 사용하여 수술 직후 및 처치 후 소정의 간격을 두고 영상촬영하였다. 24일간 주마다 3회 측정한 것을 상기 사지의 수술 전의 값으로 표준화하고 대조군 (수술하지 않음) 사지에 대한 것으로 표시하였다.

뒷발 허혈의 모델은 사용된 마우스 계통에 대해 매우 민감하다. NOD SCID 마우스는, 급성 염증성 반응을 개시하는 능력이 결여된 면역결핍 동물이다. 이들 마우스에 있어서, 이 수술적 접근법은 심각한 허혈을 유발하고 처치하지 않은 동물의 2/3가 대퇴 절제 부위보다 아래에서 뒷발 구조를 상실하게 되었다. 세포-처치한 동물은 발가락보다 높은 곳에서의 임의 구조를 상실하지 않았다. 그러나, 면역적격 129S 마우스에 있어서, 처치하지 않은 동물은 족지골보다 높은 곳에서의 임의 구조를 상실하지 않고 부분적으로 재관류를 재생하는 내인성 능력을 보였다. 이는 급성 염증성 반응과 관련있는 내재성 혈관형성에 기인한 것일 수 있다. 이는 상이한 계통의 처치 동물과 대조군 동물을 비교하였을 때 재관류가 왜 덜 비정상적인지를 설명할 수 있다.

그러나, 상기 결과로부터 지방세포 유래의 재생성 세포로 처치한 마우스가 두 계통 모두의 처치하지 않은 마우스와 비교하였을 때 상당히 향상된 관류를 나타낸다는 것을 알 수 있었다. 12일 째까지, 혈류는 처치하지 않은 마우스에서 10 ± 10％인 것에 비하여, 인간 재생성 세포로 처치한 NOD-SCID 마우스에서 50 ± 11％까지 복원되었다 (p＜0.05). 유사하게, 처치하지 않은 마우스에서 56 ± 4％인 것에 비하여, 면역적격 129S 마우스는 14일 째에 80 ± 12％의 혈류 복원을 나타냈 다. 또한, 마우스의 전체 해부시 재생성 세포로 처치한 마우스의 뒷발에서 곁가지 맥관이 나타났지만, 처치하지 않은 마우스 또는 임의 마우스의 건강한 사지에서는 관찰되지 않았다.

실시예 5: ADC 투여량을 증가시키는 것은 개선된 이식 생존률 및 혈관형성과 관련이 있음

자가 지방 조직의 이식은 성형 수술 및 재건 수술에서 비교적 통상적인 수술이다 (문헌 [Fulton, 1998; Shiffman, 2001]). 그러나, 이 수술은 지방 조직 단편이 혈관 공급 없이 이식되고, 그에 따라 이식 생존률이 혈관신생에 좌우된다는 점에 있어서 한계가 있다 (문헌 [Coleman, 1995; Eppley et al., 1990]). 따라서, 제한된 방식으로, 이식된 조직은 허혈 조직에 해당된다.

지방 조직 단편을 대퇴부 바깥쪽 근육에 걸쳐 피하 공간에 이식하는, Fisher 래트를 사용하는 연구를 행하였다. 오른쪽 다리에 지방 조직 단편 0.2 g을 단독으로 이식하고, 왼쪽 다리에 3가지 상이한 투여량 (1.7 × 10⁵ 내지 1.3 × 10⁶개 세포/이식편; 투여량마다 3마리 동물)으로 지방세포 유래의 줄기 세포를 가하여 보충한 지방 조직 단편 0.2 g을 이식하였고; 이러한 방법에서 반대쪽 다리가 대조군으로 기능하였다. 그 후에, 동물을 1개월간 유지한 후에 조직학적 분석을 위해 동물을 안락사시켜 이식편을 회수하고, 중량을 측정하고, 포르말린으로 고정시키고 파라핀에 포매하였다.

도 9A에 도시되어 있는 결과로부터 대조군 다리에서는 이식된 조직이 최소로 보존되고 처치된 다리에서는 이식편 중량의 보존이 투여량-의존성으로 증가하는 것을 알 수 있었다. 추가로, 이식편의 면역조직화학적 분석으로 지방세포 유래의 줄기 세포 처치된 이식편에서 상당한 신혈관형성 및 관류가 확인되었다 (도 20B, 화살표). 이 또한 지방 조직 형태의 보존과 관련있다 (도 20B).

따라서, 실시예 1 내지 5는 본 발명의 지방세포 유래의 재생성 세포가 혈관형성 및 동맥형성 성장 인자를 분비하며; 발생기의 모세혈관망을 시험관내 형성하며; 지방 이식편의 생존을 향상시키며; 허혈성 재관류를 향상시킨다는 것을 입증하였다. 따라서, 본 발명의 재생성 세포는 혈관형성 및 동맥형성을 촉진할 수 있고, 잠재적인 순환 장애로 인한 복합 질환을 치료하는 데 있어서 기능성일 수 있다.

실시예 6: 마우스에서 지방세포 유래의 재생성 세포에 의한 자가 지방 이식의 증대

지방세포 유래의 재생성 세포 (ADC)가 자가 지방 이식을 증대시키는 잠재력을 마우스에서 시험하였다. ADC를 lacZ 트랜스진(transgene)을 운반하는 마우스로부터 수득하였다 (Rosa 26 마우스 (B6;129S-Gt(ROSA)26Sor); 통상 Rosa26 마우스라고 알려짐). ADC를 본원에 개시된 방법에 따라 조직적합성 C57 B16/S129 F1 마우스의 사타구니 지방 패드로부터 수득한 지방 조직과 혼합하고 추가의 F1 마우스의 두개골의 배면에 피하 공간에 이식하였다.

1개월 후에, 이식편을 회수하고 X-gal 용액으로 밤새 염색하였다. lacZ 트랜스진을 발현하는 세포 (ADC)는 X-gal에 노출되었을 때 청색으로 염색될 것이다. 이식물은 조직 전체에서 청색 염색을 나타냈다. 그 후에, 이식편을 파라핀에 포매 하고, 절개하고, 마우스 혈관 내피 성장 인자 1 (VEGFR 1)의 수용체에 대한 항체로 염색하였다.

도 19로부터 이식편이 청색 미립 (화살표)을 함유하고 또한 VEGFR1-양성 (세포질 상에 진한 착색)인 세포로 구성된 수많은 원형 구조를 함유하는 것으로 보이는 염색 결과를 알 수 있었다. 이 데이타로 프로세싱된 지방흡인물이 이식편에서 새로운 혈관의 형성을 유도하는 능력을 확인하였다.

실시예 7: 래트에서 지방세포 유래의 재생성 세포에 의한 자가 지방 이식의 증대

동종 번식의 Wistar 래트로부터 추출된 지방 조직 단편을 본원에 개시된 방법에 따라 지방세포 유래의 재생성 세포와 혼합하였다. 그 후에 상기 조성물을 수용 래트의 대퇴부 및 두피 아래에 피하 이식하였다. 대조군으로서 동수의 동물에 두피 아래로 지방 조직만 (ADC 없음)을 주사하였고, 반면 대퇴부에 이식편을 이식한 동물의 반대쪽 대퇴부에 지방 조직만을 이식하였다. 이식편을 이식후 1개월에 수거하였다.

그 결과 (도 20)로부터 지방조직 유래의 재생성 세포의 투여량이 증가함에 따라 대퇴부 이식편의 중량이 증가하는 경향을 알 수 있었다. 이식편의 조직학적 시험으로 ADC를 보충한 이식편의 개선된 혈관분포상태를 확인하였다. 유사한 상관관계가 이들 래트에서 배측 두개골의 낮은 혈관분포상태로 인해 보다 낮은 총 보존률이기는 하지만 두피 이식편에서도 관찰되었다.

실시예 8: 유방 확대 유방성형술에서의 자가 지방 이식

한 사람이 유방의 형태를 변형하기를 원했다. 환자의 수술전 평가는 수술의 모든 관련 위험 및 잇점을 개시하는 내용설명 동의서에 의한 것 외에 일반적인 병력 및 건강 진찰을 포함하였다.

수술을 시작하기 위해, 환자에게 지방 조직 수집을 수행하였다. 지방 조직 수집에 적합한 부위에 대해 환자의 체형을 시험하였다. 상기 수술을 환자의 머리맡에서 수행하였다. 지방 조직은 환자의 측면 대퇴부와 안쪽 대퇴부 영역으로부터 수거하여 선택하였다. 수거하는 영역에 상이한 표준화된 투여 처방으로 리도카인, 염수 및(또는) 에피네프린의 배합을 함유하거나, 또는 함유하지 않은 표준 투메센스 액체 용액을 피하 주사하였다.

11-블레이드 스캘펠 (또는 기타 표준 블레이드)을 사용하여, 진피를 가르기 위해 작은 구멍의 상처를 만들었다. 블레이드를 360도로 돌려 상처를 완전하게 하였다. 그 다음, 뭉뚝한 팁의 14-게이지 (또는 적절한 크기의) 캐뉼라를 피하 지방 조직 면으로 삽입하였다. 상기 캐뉼라는 전원 보조된 흡인 장치 또는 수동 흡인을 위한 주사기에 연결하였다. 그 다음, 캐뉼라를 면에 결쳐 움직임으로써 결합 조직 구조를 파쇄하였다. 수득한 흡인 부피는 700 cc 내지 1000 cc였다. 이러한 방식으로 수집한 지방 조직의 분획을 상기 기재한 방법을 사용하여 지방 조직-유래의 재생성 세포의 단리 및 농축을 위해 프로세싱하였다. 나머지 지방 조직은 유방으로의 재이식을 위해 프로세싱하였다. 별법으로, 환자는 지방절제술 수술을 통해 지방 조직을 제거할 수 있었다.

지방 조직의 제거 이후, 표준 수술 기술을 사용하여 환자를 지혈시키고, 우선적으로 상처를 덮었다. 지방 조직의 수집은 임상 의원에서의 유방성형 확대술의 약 1 내지 2시간 전에 수행하였다. 그러나, 수집의 시기는 다양할 것으로 예상되며, 품질 관리 표준에 따를 것이다. 궁극적으로, 환자에게 관리 감독에 대해 책임이 있는 의료인이 수집의 시기를 결정할 것이다.

지방 조직 프로세싱으로부터 수득한 재생성 세포를 이식되는 지방 조직의 단위 (대략 100 내지 300 cc)와 함께 상기 기재한 비율로 혼합하였다. 조직 프로세싱을 완료한 후에, 환자를 유방성형 확대술을 시행하도록 준비하였다. 환자에게 전달되는 세포 투여량은 지방 조직 프로세싱 후의 세포 수율로부터 결정하였다. 자가 지방 50 cc 당 대략 5.5 × 10⁵개의 세포를 유방으로 이식하였다. 조성물을 유륜둘레 절개부를 통해 유방 조직으로 삽입된 뭉뚝한 팁의 표준 14-게이지 캐뉼라를 통해 전달하였다. 재생성 세포 증강된 지방 조직을 부피비에 대한 표면적을 증가시키는 인열식 방식으로 투여하였다.

환자를 모니터링하고, 수술의 대략 7일 후에 이식은 세포 요법의 효과가 주치의에게 분명하도록 성공적으로 생착된 것으로 나타내었다.

실시예 9: 자가 지방 이식 및 연부 조직 결함

환자는 연부 조직 확대술, 특히 진피 디보트의 치료에 대한 요구를 나타내었다. 주치의는 환자를 병력 및 건강 진찰을 수행하여 환자를 평가하고, 환자를 자가 지방 이식을 위한 후보로 결정하였다.

수술을 시작하기 위해, 환자에게 지방 조직 수집을 수행하였다. 지방 조직 수집에 적합한 부위에 대해 환자의 체형을 시험하였다. 상기 수술을 환자의 머리 맡에서 수행하였다. 지방 조직을 환자의 앞쪽 복부 벽 판누스로부터 수거하였다. 수거하는 영역에 상이한 표준화된 투여 처방으로 리도카인, 염수 및(또는) 에피네프린의 배합을 함유하거나, 또는 함유하지 않은 표준 투메센스 액체 용액을 피하 주사하였다.

11-블레이드 스캘펠 (또는 기타 표준 블레이드)을 사용하여, 진피를 가르기 위해 작은 구멍의 상처를 만들었다. 블레이드를 360도로 돌려 상처를 완전하게 하였다. 그 다음, 뭉뚝한 팁의 14-게이지 (또는 적절한 크기의) 캐뉼라를 피하 지방 조직 면으로 삽입하였다. 상기 캐뉼라는 전원 보조된 흡인 장치 또는 수동 흡인을 위한 주사기에 연결하였다. 그 다음, 캐뉼라를 면에 결쳐 움직임으로써 결합 조직 구조를 파쇄하였다. 수득한 흡인 부피는 약 400 cc 내지 약 800 cc의 범위였다. 이러한 방식으로 수집한 지방 조직의 분획을 상기 기재한 방법을 사용하여 지방 조직-유래의 재생성 세포의 단리 및 농축을 위해 프로세싱하였다. 나머지 지방 조직은 연부 조직으로의 재이식을 위해 프로세싱하였다.

지방 조직의 제거 이후, 표준 수술 기술을 사용하여 환자를 지혈시키고, 우선적으로 상처를 덮었다. 수집은 연부 조직 확대술의 약 1 내지 2시간 전에 수행할 수 있다.

지방 조직 프로세싱으로부터 수득한 재생성 세포를 이식되는 지방 조직의 단위와 함께 상기 기재한 방식 및 비율로 혼합하였다. 조직 프로세싱을 완료한 후에, 환자를 연부 조직 확대술을 시행하도록 준비하였다. 환자에게 전달되는 세포 투여량은 지방 조직 프로세싱 후의 세포 수율로부터 결정하였다. 자가 지방 50 cc 당 대략 5.5 × 10⁵개의 세포를 연부 조직으로 이식하였다. 조성물을 적절하게 위치된 절개부를 통해 연부 조직으로 삽입된 뭉뚝한 팁의 표준 14-게이지 캐뉼라를 통해 전달하였다. 바람직하게는, 재생성 세포 증강된 지방 조직을 부피비에 대한 표면적을 증가시키는 인열식 방식으로 투여하였다.

환자를 이식된 지방 조직의 전달하기 전, 전달 동안 및 전달 후에 모니터링하였다. 2일 후에, 환자는 진피 디보트의 거의 완료된 제거를 확인하였다.

실시예 10: 스트레스 요실금을 위한 자가 지방 이식

요실금을 앓고 있는 사람이 주치의로부터의 치료를 요청하였다. 환자의 수술전 평가는 수술의 모든 관련 위험 및 잇점을 개시하는 내용설명 동의서에 의한 것 외에 일반적인 병력 및 건강 진찰이 포함하였다.

수술을 시작하기 위해, 환자에게 지방 조직 수집을 수행하였다. 지방 조직 수집에 적합한 부위에 대해 환자의 체형을 시험하였다. 상기 수술을 환자의 임상적 상태에 적절한 혈류역학 모니터링을 하는 수술 환경에서 수행할 수 있다. 지방 조직을 환자의 양쪽 팔다리 하부의 측면 대퇴부와 안쪽 대퇴부 영역 및 앞쪽 복부 벽 판누스로부터 수거하였다. 수거하는 영역에 상이한 표준화된 투여 처방으로 리도카인, 염수 및(또는) 에피네프린의 배합을 함유하거나, 또는 함유하지 않은 표준 투메센스 액체 용액을 피하 주사하였다.

11-블레이드 스캘펠 (또는 기타 표준 블레이드)을 사용하여, 진피를 가르기 위해 작은 구멍의 상처를 만들었다. 블레이드를 360도로 돌려 상처를 완전하게 하 였다. 그 다음, 뭉뚝한 팁의 14-게이지 (또는 적절한 크기의) 캐뉼라를 피하 지방 조직 면으로 삽입하였다. 상기 캐뉼라는 전원 보조된 흡인 장치 또는 수동 흡인을 위한 주사기에 연결하였다. 그 다음, 캐뉼라를 면에 결쳐 움직임으로써 결합 조직 구조를 파쇄하였다. 수득한 흡인 부피는 약 1200 cc였다. 이러한 방식으로 수집한 지방 조직의 분획을 상기 기재한 방법을 사용하여 지방 조직-유래의 재생성 세포의 단리 및 농축을 위해 프로세싱하였다. 나머지 지방 조직은 환자의 방광목의 근접부 및 근접 요도로의 재이식을 위해 프로세싱하였다. 별법으로, 환자는 지방절제술 수술을 통해 지방 조직을 제거할 수 있었다. 지방 조직의 제거 이후, 표준 수술 기술을 사용하여 환자를 지혈시키고, 우선적으로 상처를 덮었다. 지방 조직의 수집은 수술하기 약 1 내지 2시간 전에 수행하였다.

지방 조직 프로세싱으로 수득한 재생성 세포를 지방 조직 단위와 혼합하여 상기 기재한 비율로 이식하였다. 조직 프로세싱이 완료된 후, 환자가 이식을 받도록 준비하였다. 환자에게 전달된 세포 투여량은 지방 조직 프로세싱 후에, 특히 세포 수율로부터 측정하였다. 자가 지방 대략 50 cc 당 5.5 × 10⁵개 세포를 방광경에 의한 시각화를 통해 환자의 방광 경부 및 근위 요도 내에 인접하게 이식하였다.

상기 수술 후에 환자를 모니터링하였다. 대략 이식 3일 후, 상기 환자는 요실금의 빈도가 감소한 것을 체험하였다. 상기 수술 후 대략 1개월 뒤에, 환자는 삶의 질이 개선된 것으로 나타났다. 의사는 생착된 조직을 평가하고, 장기 생착이 성공적인지를 결정하였다.

수많은 간행물과 특허 문헌을 상기한 본원에 언급하였다. 언급된 각각의 간행물 및 특허 문헌은 그 전문이 본원에 참고로 도입된다.

균등물

당업자는 더 이상의 일상적인 실험을 하지 않고도 본원에 기재한 본 발명의 구체적인 실시양태에 대한 여러 균등물을 인지하거나 확인할 수 있을 것이다. 이러한 균등물은 하기하는 청구의 범위에 포함되는 것으로 한다.

Claims (28)

1. 지방세포 유래의 줄기 세포를 포함하는 농축된 지방세포 유래 세포 집단을 제공하는 단계;

   프로세싱되지 않은 지방 조직을 제공하는 단계; 및

   상기 지방세포 유래의 줄기 세포를 포함하는 농축된 지방세포 유래 세포 집단을 상기 프로세싱되지 않은 지방 조직과 혼합하여 조성물을 생성하는 단계

   를 포함하는, 연부 조직 충전재의 생체외 제조 방법.
2. 제1항에 있어서, 상기 지방세포 유래의 줄기 세포를 포함하는 농축된 지방세포 유래 세포 집단이,

   지방 조직을 수용하도록 형상화된 조직 수집 챔버 (여기서 조직 수집 챔버는 폐쇄된 시스템에 의해 한정됨);

   지방 조직을 보유하고 액체, 혈액 및 염수를 통과시키도록 형상화된 조직 수집 챔버 내에 배치된 제1 필터;

   상기 조직 수집 챔버로부터 지방세포 유래의 줄기 세포를 포함하는 지방 조직의 세포 집단을 수용하고 농축시키도록 형상화된 프로세싱 챔버(여기서 프로세싱 챔버는 원심분리 장치, 중공사 여과 장치, 침출식 여과 장치, 또는 다수의 필터, 또는 이들의 임의 조합을 포함하며, 상기 폐쇄된 시스템 내에 있음); 및

   지방세포 유래의 줄기 세포를 포함하는 상기 지방 조직의 세포의 무균 제거를 허용하도록 형상화된 출구

   를 포함하고 폐쇄된 경로를 유지하도록 형상화되는 자가-함유(self-contained) 지방세포 유래의 줄기 세포 프로세싱 유닛에, 지방세포 유래의 줄기 세포를 포함하는 세포 집단을 포함하고 있는 지방 조직 부분을 제공하고,

   지방세포 유래의 줄기 세포를 포함하는 농축된 지방세포 유래 세포 집단을 수득하기 위한 상기 폐쇄된 경로를 유지하면서, 상기 자가-함유 세포 프로세싱 유닛 내 상기 제거된 지방 조직의 제1 부분으로부터 지방세포 유래의 줄기 세포를 포함하는 상기 지방 조직의 세포를 분리 및 농축시킴으로써

   수득되는 것인 방법.
3. 제2항에 있어서, 상기 조성물에 첨가제를 첨가하는 단계를 더 포함하는 방법.
4. 제3항에 있어서, 상기 첨가제가 면역억제제인 방법.
5. 제4항에 있어서, 상기 면역억제제가 시클로스포린, 미오페닐레이트 모페틸, 라파미신 및 항-흉선세포 글로불린으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
6. 제3항에 있어서, 상기 첨가제가 세포 분화제인 방법.
7. 제6항에 있어서, 상기 세포 분화제가 사이토카인인 방법.
8. 제6항에 있어서, 상기 세포 분화제가 성장 인자인 방법.
9. 제3항에 있어서, 상기 첨가제가 항균제인 방법.
10. 제3항에 있어서, 상기 첨가제가 혈관형성 인자인 방법.
11. 제3항에 있어서, 상기 첨가제가 동맥형성 인자인 방법.
12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 지방세포 유래의 줄기 세포를 포함하는 농축된 지방세포 유래 세포의 집단을 프로세싱되지 않은 지방 조직과 혼합시키기 전에 세포 배양물에서 성장시키는 것인 방법.
13. 제12항에 있어서, 세포 배양 조건이 내피 표현형으로의 분화를 촉진시키는 것인 방법.
14. 제12항에 있어서, 세포 배양을 스캐폴드(scaffold) 물질에서 수행하여, 2차원 또는 3차원 구조물을 생성하는 것인 방법.
15. 제14항에 있어서, 스캐폴드 물질이 생체내 재흡수가능한 것인 방법.
16. 제12항에 있어서, 지방세포 유래의 줄기 세포를 포함하는 농축된 지방세포 유래 세포 집단을 유전자 전달에 의해 지방세포 유래 세포 내의 하나 이상의 유전자 발현이 변경되도록 변형시키는 것인 방법.
17. 제16항에 있어서, 상기 변형이 혈관형성 수준을 변경시키는 것인 방법.
18. 제16항에 있어서, 상기 변형이 동맥형성 수준을 변경시키는 것인 방법.
19. 제16항에 있어서, 상기 변형이 세포자멸(apoptosis) 수준을 변경시키는 것인 방법.
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