KR101135636B1 - 인간 만능줄기세포로부터 중배엽 줄기세포를 생산하는 방법 및 이에 의해 생성된 중배엽 줄기세포 - Google Patents

Abstract

본 발명은 인간 만능줄기세포로부터 중배엽 줄기세포를 생산하는 방법에 관한 것으로, 인간 만능줄기세포에서 배아체를 형성하는 단계; 상기 배아체를 조직배양접시에 부착 후 자연적으로 중배엽 줄기세포로 분화를 유도하는 단계; 및 상기 중배엽 줄기세포의 동일성을 유지하면서 계속 증식 배양하는 단계를 포함한다.

본 발명은 그 유전적 배경의 상이함과 무관하게 모든 인간 만능줄기세포에 광범위하게 적용될 수 있는 규정화된 중배엽 줄기세포 분화유도방법을 제공한다. 궁극적으로, 본 발명은 인간 만능줄기세포를 사용하여 재생의학 및 세포치료분야에서 필요로 하는 중배엽 줄기세포를 지속적으로 대량 공급함으로써 세포치료제의 실용화를 가능하게 하고, 나아가 심혈관계질환, 신경계질환 등의 난치병 치료에 크게 기여할 수 있을 것으로 기대된다.

인간 만능줄기세포, 배아체, 사이토카인, 중배엽 줄기세포, 세포표면 표지자

Description

인간 만능줄기세포로부터 중배엽 줄기세포를 생산하는 방법 및 이에 의해 생성된 중배엽 줄기세포 {Method for producing mesenchymal stem cells from human pluripotent stem cells and mesenchymal stem cells produced by thereof}

본 발명은 인간 만능줄기세포로부터 중배엽 줄기세포를 유도하는 방법, 상기 방법에 의해 제조된 중배엽 줄기세포, 상기 중배엽 줄기세포를 포함하는 세포치료제 등에 관한 것이다.

줄기세포(stem cell)는 생물 조직을 구성하는 다양한 세포들로 분화(differentiation)할 수 있는 세포로서 배아, 태아 및 성체의 각 조직에서 얻을 수 있는 분화되기 전 단계의 미분화 세포들을 총칭한다. 줄기세포는 분화 자극(환경)에 의하여 특정 세포로 분화가 진행되며, 분화가 완료되어 세포분열이 정지된 세포와는 달리 세포분열에 의해 자신과 동일한 세포를 생산(self-renewal)할 수 있어 증식(proliferation; expansion)하는 특성이 있으며, 다른 환경 또는 다른 분화 자극에 의해 다른 세포로도 분화될 수 있어 분화에 유연성(plasticity)을 가지고 있는 것이 특징이다.

줄기세포는 그 분화능에 따라 만능(pluripotency), 다분화능(multipotency) 및 단분화능(unipotency) 줄기세포로 나눌 수 있다. 만능줄기세포(pluripotent stem cells)는 모든 세포로 분화될 수 있는 잠재력(totiportent)을 지닌 전분화능(pluripotency)의 세포로서 배아줄기세포 (embryonic stem cell, ES cell) 및 유도만능줄기세포(induced pluripotent stem cells, iPS) 등이 이에 해당된다. 다분화능 및/또는 단분화능 줄기세포로는 성체줄기세포를 예로 들 수 있다.

배아줄기세포는 배아발생초기인 포배기(blastocyte)의 세포내괴(inner cell mass)로부터 형성되며, 모든 세포로 분화가능한 잠재력(totipotent)을 가지고 있어 어떠한 조직 세포로도 분화될 수 있으며, 또한 사멸하지 않고(immortal) 미분화상태에서 배양가능하며, 성체줄기세포와 달리 배세포(germ cell)의 제조도 가능하므로 다음 세대로 유전될 수 있는 특징을 가지고 있다(Thomson et al., Science, 282: 1145-1147, 1998; Reubinoff et al., Nat. Biotechnol., 18: 399-404, 2000).

인간 배아줄기세포는 인간 배아 형성시 세포내괴(inner cell mass) 만을 분리하여 배양함으로써 제조되는데, 현재 전 세계적으로 만들어진 인간 배아줄기세포는 불임시술 뒤 남은 냉동배아로부터 얻어진 것이다. 모든 세포로 분화될 수 있는 전분화능을 가진 인간 배아줄기세포를 세포치료제로 이용하기 위한 다양한 시도가 이루어져 왔지만 아직 암발생의 위험과 면역거부반응의 높은 벽을 완전히 제어하지 못하고 있는 실정이다.

이에 대한 보완책으로 최근 보고 되고 있는 것으로 유도만능줄기세포 (iPS) 가 있다. 만능줄기세포의 개념으로 포함되고 있는 iPS 는 분화가 끝난 성체세포를 여러 가지 방법으로 역분화시켜, 분화 초기 단계인 배아줄기세포로의 상태로 회귀 시킨 세포이다. 현재까지 역분화 세포는 유전자 발현과 분화능에서 만능줄기세포인 배아줄기세포와 거의 동일한 성격을 나타내는 것으로 보고 되어 있다. 하지만 이러한 iPS의 경우도 자가 세포를 이용하여 면역거부반응의 위험성은 배제할 수 있으나, 암발생의 위험성은 여전히 해결해야 할 과제로 남아있다.

최근 이러한 문제점을 극복하기 위한 대안으로 면역조절기능과 함께 암발생의 위험성이 없는 중배엽 줄기세포가 제시되고 있다. 중배엽 줄기세포는 지방세포, 골세포, 연골세포, 근육세포, 신경세포, 심근세포 등으로의 분화가 가능한 다능성을 가진 세포로 면역 반응을 조절하는 기능도 가지고 있는 것으로 보고되어 있다. 중배엽 줄기세포는 다양한 조직에서 분리 및 배양이 가능하나 각 기원에 따른 능력 및 세포표면 표지자가 조금씩 다르기 때문에 중배엽 줄기세포를 명확히 정의하는 것은 용이하지 아니하다. 다만 골세포, 연골세포, 근육세포로 분화가 가능하며, 소용돌이 모양의 형태를 가지고, 기본적인 세포표면 표지자인 CD73(+), CD105(+), CD34(-) 및 CD45(-)를 발현하는 경우 일반적으로 중배엽 줄기세포로 규정하고 있다.

한편, 중배엽 줄기세포가 세포치료제로 이용되기 위해서는 재생의학 및/또는 세포치료분야에서 요구되는 최소 세포수(약 1X10^9 정도)를 만족시켜야 하는데, 적정조건을 잡고 기준을 정하는 실험까지 고려한다면 필요한 세포수는 더욱 늘어나게 된다. 따라서 기존의 다양한 기원의 중배엽 줄기세포로부터 이 정도의 양을 공급하려면 in vitro(시험관내) 실험에서 최소 10번 이상의 계대가 필요하게 되는데 이 경우 세포가 노화되고 변형되어 더 이상 세포치료제로서의 목적을 달성하기에는 적 합하지 아니할 수 있다. 설령 이러한 세포로 조건과 기준을 잡았다 하더라도 정작 세포치료 목적으로 사용할 시점에는 이미 그 세포가 바닥이 나서 다른 사람의 중배엽 줄기세포를 써야 하고 그럴 경우 또 다른 세포이용에 따른 부가적인 실험을 다시 거처야 하는 문제가 발생할 수 있다.

종래의 중배엽 줄기세포 배양시스템이 가지고 있는 이러한 문제점들을 해결하기 위한 가장 이상적인 대안은 인간 만능줄기세포를 이용하여 중배엽 줄기세포를 생산하는 것이다. 그러나, 현재까지 인간 만능줄기세포에서 중배엽 줄기세포로의 분화 유도는 많은 비용과 농도 조절이 필요한 특정 사이토카인(예를 들어 BMP, bFGF)에 의한 유도과정 또는 xeno pathogen 의 위험이 있는 xono feeder(OP9 마우스 세포주)로의 유도와 이후 특정 마커(예를 들어 CD73)로의 분류(sorting)를 필요로 하였다.

또한, 이러한 방법으로 생산된 중배엽 줄기세포는 그 근본적 상태의 유지가 곤란하고, 생산 효율이 높지 않다. 더욱이 각기 다른 유전적 배경을 가지는 인간 만능줄기세포는 그 생리학적 기전이 상이하여 기존의 특정 라인에서 확립된 중배엽 줄기세포 분화유도방법을 이용할 수 없으므로, 각기 상이한 유전적 기원을 가지는 인간 만능줄기세포로부터 중배엽 줄기세포를 유도하기 위해서는 각각 별도의 분화유도방법을 개발 적용하여야만 하는 어려움이 있었다. 따라서, 중배엽 줄기세포가 재생의약 및 세포치료 분야에서 이상적인 세포치료제로 사용되기 위해서는 한계가 있었다.

본 발명은 다양한 유전적 배경을 가지는 인간 만능줄기세포에 일반적으로 적용할 수 있는 고효율의 중배엽 줄기세포 대량 생산방법을 제공하고자 한다. 또한 본 발명은 상기 방법에 의해 생산된 중배엽 줄기세포, 상기 중배엽 줄기세포를 포함하는 세포치료제, 및 인간 만능줄기세포로부터 중배엽 줄기세포를 생산하는 규정화된 배양 시스템을 제공하고자 한다.

상기와 같은 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 인간 만능줄기세포에서 배아체를 형성하는 단계; 상기 배아체를 조직배양접시에 부착 후 자연적으로 중배엽 줄기세포로 분화를 유도하는 단계; 및 상기 중배엽 줄기세포의 동일성을 유지하면서 계속 증식배양하는 단계를 포함하는, 인간 만능줄기세포로부터 중배엽 줄기세포를 생산하는 규정화된 방법을 제공한다. 구체적으로, 상기 분화유도단계는 자가 유래 사이토카인 고리 (loop) 형성에 의해 자연적으로 분화를 유도하는 단계를 포함하며, 분화유도된 중배엽 줄기세포의 유지 및 증식 배양을 위해서는 hEGF(human Epidermal Growth Factor), VEGF(Vascular Endothelial Growth Factor), hFGF-B(human Fibroblast Growth Factor-basic), IGF-1(Insulin-like Growth Factor), 히드로코르티손(hydrocortisone) 및 아스코르브산(ascorbic acid) 등을 포함하는 배지를 사용하는 것을 특징으로 한다.

본 발명은 그 유전적 배경의 상이함과 무관하게 모든 인간 만능줄기세포에 광범위하게 적용될 수 있는 규정화된 중배엽 줄기세포 분화유도 및 증식 배양방법을 제공한다. 본 발명에 따르면, 세포치료제의 가장 좋은 자원인 중배엽 줄기세포를 그 동일성을 유지하면서 지속적으로 대량생산할 수 있다. 이에 더하여, 본 발명은 xeno feeder 유도로 인한 xeno pathogen 의 위험, 형광세포분석기(FACS) 에 의한 분류 (sorting) 로 인해 초래될 수 있는 세포 상해(damage)의 문제가 없으며, 저렴한 비용으로 고효율의 중배엽 줄기세포생산을 가능하게 한다. 궁극적으로, 본 발명은 인간 만능줄기세포를 사용하여 재생의학 및 세포치료분야에 이상적으로 사용될 수 있는 중배엽 줄기세포를 보다 용이하게 대량으로 공급함으로써 세포치료제의 실용화를 가능하게 하고 나아가 심혈관계질환, 신경계질환 등의 난치병 치료에 크게 기여할 수 있을 것으로 기대된다.

본 발명은 인간 만능줄기세포를 이용하여 중배엽 줄기세포를 생산하는 방법에 관한 것으로, a) 인간 만능줄기세포에서 배아체를 형성하는 단계; 및 b) 상기 배아체를 조직배양접시에 부착 후 자연적으로 중배엽 줄기세포로 분화를 유도하는 단계; 및 c) 상기 분화유도된 중배엽 줄기세포를 유지 및 증식 배양하는 단계를 포함한다. 구체적으로, 본 발명은 인간 만능줄기세포에서 배아체를 형성하는 단계를 포함하는데, 이는 당업계에 공지된 일반적인 방법에 따라 수행할 수 있다. 예를 들면, 인간 만능줄기세포를 단백질 분해 효소 처리 후, bFGF(basic Fibroblast Growth Factor)가 없는 배아줄기세포 배지에서 부유 상태로 배양할 수 있다.

본 발명에서 사용된 용어 '줄기세포'는 조직 및 기관의 특수화된 세포를 형성하도록 비제한적으로 재생할 수 있는 마스터 세포를 지칭한다. 줄기세포는 발달가능한 만능성 또는 다능성 세포이다. 줄기세포는 2개의 딸줄기세포, 또는 하나의 딸줄기세포와 하나의 유래('전이(transit)') 세포로 분열될 수 있으며, 이후에 조직의 성숙하고 완전한 형태의 세포로 증식된다. 이러한 줄기세포는 다양한 방법으로 분류할 수 있다. 그 중 가장 흔히 이용되는 방법 중 하나는 줄기세포의 분화능에 따른 것으로 3배엽으로의 분화가 가능한 만능줄기세포(pluripotent stem cells)와 특정 배엽 이상으로의 분화로 한정되는 다분화능 줄기세포(mutipotent stem cells) 및 특정배엽만으로의 분화가 가능한 단분화능 줄기세포(unipotent stem cells)로 나눌 수 있다.

본 발명에서 사용된 용어 '만능줄기세포'라 함은 생체를 구성하는 3가지 배엽(germ layer) 모두로 분화될 수 있는 다기능성을 지닌 줄기세포를 지칭하며, 일반적으로 배아줄기세포와 유도만능줄기세포(iPS)가 이에 해당된다. 성체줄기세포는 다분화능 또는 단분화능 줄기세포로 구분할 수 있다.

본 발명에서 사용된 용어 "분화(differentiation)"는 세포가 분열 증식하여 성장하는 동안에 서로 구조나 기능이 특수화되는 현상, 즉 생물의 세포, 조직 등이 각각에게 주어진 일을 수행하기 위하여 형태나 기능이 변해가는 것을 말한다. 일반적으로 비교적 단순한 계(系)가 둘 이상의 질적으로 다른 부분계(部分系)로 분리되는 현상이다. 예를 들면, 개체발생에서 처음에 동질적이었던 알 부분 사이에 머리나 몸통 등의 구별이 생기거나 세포에도 근세포라든가 신경세포 등의 구별이 생기 는 것과 같이 처음에 거의 동질이었던 어떤 생물계의 부분 사이에 질적인 차이가 생기는 것, 또는 그 결과로서 질적으로 구별할 수 있는 부분 또는 부분계로 나누어져 있는 상태를 분화라고 한다.

본 발명에서 사용된 용어 ‘배아체 (embryonic body, EB)’ 는 만능줄기세포의 분화를 유발시켜 생성된 응집체이다. 만능줄기세포를 bFGF(basic Fibroblast Growth Factor)를 제거한 배아줄기세포 배양배지에서 지지체 없이 부유 상태로 배양시키면 배아체가 생성될 수 있다. 이러한 방법으로 만들어지는 배아체는 내배엽, 중배엽, 외배엽의 개체 형성시 필요한 모든 세포로의 분화가 가능함이 보고된 것으로 만능줄기세포의 전능성을 나타내는 체외에서의 증명 방법 중의 하나이다.

본 발명은 배양 14일째의 배아체를 선택하여 중배엽 줄기세포로 분화를 유도하는 단계를 포함할 수 있다. 구체적으로, 본 발명에서는 bFGF가 없는 배아줄기세포 배지에서 부유 상태로 인간 만능줄기세포를 배양하여 형성된 배양 14일째의 배아체를 선택하여 중배엽 줄기세포의 생산에 사용할 수 있다. 종래의 인간 만능줄기세포(일반적으로는 인간 배아줄기세포)로부터 중배엽 줄기세포로 분화를 유도하는 방법에서는 일반적으로 배양 7일째의 배아체를 사용하였다. 그러나 본 발명자는 배양 7일째의 배아체 대신 배양 14일째의 배아체를 선택할 경우, 인간 만능줄기세포로부터 중배엽 줄기세포를 생산하는 데 있어서 그 분화유도효율을 증가시킬 수 있다는 사실을 발견하였다. 구체적으로, 배양 7일째 및 14일째 배양체의 유전자 발현을 조사한 결과, 기존의 7일 배아체와 비교시 14일 배아체에서 중배엽 분화 초기 관련 유전자(brachyury, BMPR 등)와 초기 심장 중배엽세포에서 중요한 유전자인 Sox 17 가 현저히 높게 발현됨을 확인하였다(도 1b 참조). 상기 결과로부터, 배양 14일째의 배아체를 선택하는 경우, 우선적으로 중배엽 줄기세포로 분화가 유도될 수 있음을 알 수 있다.

또한 본 발명은 상기 배양 14일째의 배아체를 조직배양접시에 부착한 후 자연적으로 분화를 유도하는 단계를 포함한다. 인간 만능줄기세포에서 중배엽 줄기세포로 분화를 유도하는 경우, 일반적으로 외부에서 BMP(bone morphogenic protein)-2 등을 주입하여 분화 유도를 개시하는 것이 일반적이다. 본 발명자는 외부에서 BMP-2 등의 주입 없이 일반적인 세포배양배지인 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium) 등을 사용하여 상기 배아체를 배양시, 중배엽 줄기세포로 분화가 자연스럽게 유도됨을 발견하였다(도 2b 참조). 본 발명자는 이에 대한 기전과 관련하여 기존에 알려진 중배엽 줄기세포 유도 인자인 BMP의 자가 고리(loop)형성의 가능성을 생각하고, 이에 대한 증명을 위해 BMP의 길항제(antagonist)인 Noggin 을 처리 하여 중배엽 줄기세포의 분화유도과정를 관찰하였다(도 2c 및 도 2d 참조). Noggin 미처리군에서는 중배엽 줄기세포로 분화가 유도되는 반면(도 2c 참조), Noggin 처리군에서는 중배엽 전구세포가 나타나지 않음을 관찰하였으며(도 2d 참조), 아울러 계대배양시 다시 세포가 부착되지 않아 세포배양이 불가능하였다. 상기 결과로부터, 배양 14일째의 배아체 부착 후 일반적인 배양배지에서 배양했을 때, 외부의 사이토카인 주입없이도 자연적으로 중배엽 세포로 분화가 유도되는 것은 자체적 BMP loop 시스템에 의한 조절에 기인한 것임을 알 수 있다.

또한 본 발명은 상기 분화유도된 중배엽 줄기세포를 사이토카인이 포함된 배 지를 사용하여 유지 및 증식 배양하는 단계를 포함한다. 본 발명에서는 중배엽 줄기세포의 배양액으로 hEGF(human Epidermal Growth Factor), VEGF(Vascular Endothelial Growth Factor), hFGF-B(human Fibroblast Growth Factor-basic), IGF-1(Insulin-like Growth Factor), 히드로코르티손(hydrocortisone) 및 아스코르브산(ascorbic acid) 등이 포함된 Microvascular Endothelial Cell Media-2 (EGM-2MV, Lonza; Basel, Switzerland) 배지를 사용하였다. 본 발명자는 기존의 중배엽 줄기세포 배양 배지로 많이 사용되어 온 α-MEM 배지 대신 상기 EGM-2MV 배지를 사용하는 경우, 체외배양시 중배엽 줄기세포의 활성이 상대적으로 더욱 오래 유지되는 장점이 있음을 발견하였다.

중배엽 줄기세포를 세포치료제로 사용하기 위해서는 상기에서 설명한 바와 같이 충분한 양의 세포를 공급하는 것이 우선되어야 하는데, 이를 위해서는 중배엽 줄기세포의 계대배양이 필요하다. 그러나 계대배양을 계속하게 되면 중배엽 줄기세포가 노화되어 분열능력이 없어지고 그 활성(분화능)을 잃어버리게 되는 문제가 있다. 이와 관련하여 본 발명의 EGM-2MV 배지는 종래에 사용되던 중배엽 줄기세포 배양배지인 α-MEM 배지에 비하여 탁월한 활성유지 능력이 있음을 확인하였다(도 3 참조). 구체적으로 세포의 노화(senescence)시 염색 되는 beta gal 염색을 실시한 결과, α-MEM 배지를 사용하여 배양한 중배엽 줄기세포의 경우, EGM-2MV 배지로 배양한 중배엽 줄기세포에 비하여 beta gal 염색이 훨씬 더 많이 되며, 세포의 크기 또한 현저히 커져 있음을 알 수 있었다. 일반적으로 줄기세포의 체외 배양시 세포의 노화에 따른 생장 불능은 크기의 비대와 함께 오는 사실이 알려져 있다. 이는 α-MEM 배지를 사용하여 배양한 경우 중배엽 줄기세포의 노화가 더 빠르게 진행되어 중배엽 줄기세포의 분화능이 소실됨을 의미한다.

또한 본 발명은 본 발명의 방법에 의해 생산된 중배엽 줄기세포를 제공한다. 중배엽 줄기세포는 골세포, 연골세포, 근육세포 등으로 분화가 가능하며, 소용돌이 모양의 형태와 기본적인 세포표면 표지자 SH2(+), SH3(+), CD34(-), CD45(-)의 발현 정도로 규정하고 있다. 본 발명의 방법을 통해 얻어진 서울대병원 인간 배아줄기세포(동양인#1, 남성, STO feeder) 유래 중배엽 줄기세포는 각기 다른 3번의 시도에서도 동일한 결과를 도출하였으며, 이것은 형광세포분석기 및 기능적 분화 유도 방법(functional differentiation) 으로 확인하였다.

본 발명은 다양한 유전적 기원을 가지는 인간 만능줄기세포로부터 중배엽 줄기세포를 생산하는데 일반적으로 사용할 수 있는 규범화된 분화유도및 증식 배양방법을 제공한다. 이와 관련하여 서울대병원 인간 배아줄기세포와 그 유전적 기원을 달리하는 차병원 인간 배아줄기세포(동양인#2, 남성, MEF feeder) 및 H9 인간 배아줄기세포(서양인, 여성, MEF feeder)에 대하여 본 발명의 방법을 실시한 결과 동일한 결과를 도출하였다. 즉, 본 발명의 규정화된 방법은 다양한 유전적 배경 및/또는 배양 환경을 가지는 만능줄기세포로부터 중배엽 줄기세포를 분화 유도하기 위해 일반적으로 사용할 수 있는 방법이다.

또한 본 발명은 본 발명의 방법에 의해 얻어진 중배엽 줄기세포를 포함하는 세포치료제를 제공한다. 구체적으로, 상기 세포치료제는 지방세포, 골세포, 연골세포, 근육세포, 신경세포, 심근세포 형성 및 환경에 따라 다양한 세포로의 분화에 이용될 수 있다.

본 발명에서 사용된 용어 '세포치료제'는 사람으로부터 분리, 배양 및 특수한 조작을 통해 제조된 세포 및 조직으로 치료, 진단 및 예방의 목적으로 사용되는 의약품(미국 FDA규정)으로서, 세포 혹은 조직의 기능을 복원시키기 위하여 살아있는 자가, 동종, 또는 이종세포를 체외에서 증식, 선별하거나 다른 방법으로 세포의 생물학적 특성을 변화시키는 등의 일련의 행위를 통하여 치료, 진단 및 예방의 목적으로 사용되는 의약품을 지칭한다. 세포치료제는 세포의 분화정도에 따라 크게 체세포치료제, 줄기세포치료제로 분류되며 본 발명은 특히 줄기세포치료제에 관한 것이다.

또한 본 발명은 다양한 유전적 기원을 가지는 인간 만능줄기세포로부터 중배엽 줄기세포를 생산하는 시스템(system)을 제공한다. 상기 시스템은 인간 만능줄기세포를 배양하여 배양 14일째의 배아체를 선택하는 단계; 상기 배아체를 조직배양접시에 부착하여 DMEM + FBS 배지로 배양하여 분화를 유도하는 단계; 및 hEGF(human Epidermal Growth Factor), VEGF(Vascular Endothelial Growth Factor), hFGF-B(human Fibroblast Growth Factor-basic), IGF-1(Insulin-like Growth Factor), 히드로코르티손(hydrocortisone) 및 아스코르브산(ascorbic acid)을 포함하는 배지로 중배엽 줄기세포를 유지 및 증식 배양시키는 단계를 포함한다.

또한 본 발명은 인간 만능줄기세포를 배양하는 지지체(feeder)를 제공한다. 인간 만능줄기세포를 배양하는데 있어서 그 미분화 상태를 계속 유지시키기 위해서는 지지체를 필요로 한다. 종래의 인간 만능줄기세포 지지체로는 생쥐 배아 유래 섬유모세포가 우선적으로 이용되어 왔다. 그러나, 이종간의 각종 병원체의 유입이 임상학적으로 만능줄기세포를 사용하고자 할 때 문제점으로 인식됨으로 인해 그에 대한 대안책으로 인간 유래 여러 세포에 대하여 지지체로써의 가능성이 보고된 바 있다. 그러나 이 또한 타가 유래 병원체의 절대적 배제가 불가능하고, 미분화 상태의 유지를 위한 외래 인자(예를 들어, bFGF, IGF, ACTIVIN 등)가 필수적으로 필요한 점과 장기 배양을 위한 계속적 세포의 공급이 불가능한 단점 등을 극복할 수 없다. 이에 비하여, 본 발명에 의해 만들어진 인간 만능줄기세포 유래 중배엽 줄기세포는 계속적으로 동일 배경의 세포를 공급할 수 있고, 또한 자가 유래 지지체로서 면역거부반응문제 및/또는 기타 병원체 유입 위험 등을 배제할 수 있다. 또한 본 발명자는 본 발명에 의해 만들어진 인간 만능줄기세포 유래 중배엽 줄기세포를 지지체로 사용하는 경우, 외래 미분화 유지 인자가 필요하지 아니한 장점이 있음을 발견 하였다. 즉, 미분화 유지 인자 첨가 없이 30 계대 이상 미분화 상태가 유지됨을 확인 하였으며(도 10 참조), 이러한 “장기적 미분화 상태 유지”라는 탁월한 효과는 종래의 여러 인간 유래 지지체를 과량의 미분화 유지 인자 첨가하에서 사용한 경우에도 얻을 수 없었던 효과이다.

이하, 하기 실시예를 통하여 본 발명에 대하여 더욱 구체적으로 설명하고자 한다. 다만 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 기술적 사상 내에서 당 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의하여 이루어질 수 있는 다양한 변형을 모두 포함한다는 것은 명백하다.

[ 실시예 ]

실시예 1. 서울대병원 인간 배아줄기세포로부터 중배엽 줄기세포 생산

(1) 배아체 형성

미분화 상태로 유지되던 서울대병원 인간 배아줄기세포(동양인#1, 남성, STO feeder)에 대하여 단백질분해효소(dispase, 2mg/ml)로 처리하고 미세 작업으로 분리한 다음 bFGF가 없는 배아줄기세포 배지에서 부유 상태로 14일간 배양하였다.

배양 7일째 및 14일째 배아체에 대하여 유전자 분석을 실시하고, 각 배아체의 중배엽 분화관련 유전자의 발현 차이를 중합연쇄반응(PCR)을 이용하여 정량화 하였다. 종래에 사용되던 7일째 배아체와 비교시, 14일 배아체에서 중배엽 분화 초기 관련 유전자인 brachyury 및 BMPR, 초기 심장 중배엽세포에 중요한 유전자인 Sox 17 가 현저히 높게 발현됨을 확인하였고(도 1b 참조), 아울러 14일 배아체 염색을 통하여 brachyury 단백질 발현 및 그 위치를 확인하였다(도 1c 참조).

(2) 중배엽 줄기세포로의 분화 유도

14일간의 부유 배양으로 만들어진 배아체를 조직배양접시에 부착시킨 다음 자연적으로 중배엽 줄기세포의 분화를 유도하였다. 14일 배아체 부착시 선별을 도 2a 에 나타내었다. 배아체 중 부착 후 잘 성장하는 것도 있고(도 2a 의 왼쪽그림), 부착 후 잘 자라지 않는 것도 있었다(도 2a 의 오른쪽 그림). 상기 배아체를 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium)에 FBS(fetal bovine serum)를 첨가(10% v/v)한 배지에서 16일간 배양하면서 중배엽 줄기세포의 분화유도를 관찰하였다. 배 아체 부착 후 3일째(D3) 및 7일째(D7)의 관찰 결과를 도 2b 에 나타내었다.

도 2b 에서 알 수 있는 바와 같이, 사이토카인이 포함되어 있지 아니한 일반적인 배양 배지(DMEM +FBS)에서 배아체를 배양시 자연적으로 중배엽 줄기세포로의 분화유도가 개시된다는 것을 확인하였다. 상기 분화유도의 기전을 밝히기 위하여 BMP의 길항제(antagonist)인 Noggin 을 처리 하여 중배엽의 분화 유도 과정를 비교관찰 하였다(도 2c 및 도 2d 참조). Noggin 미처리군에서는 중배엽 줄기세포로 분화가 유도되는 반면(도 2c), Noggin 처리군에서는 중배엽 전구세포가 나타나지 않음을 확인하였다(도 2d). 상기 결과로부터 외부의 사이토카인 주입없이 일반 배양배지에서 배아체를 배양하였을 때 자연적으로 중배엽 줄기세포로 분화가 유도되는 것은 자체적 BMP loop 시스템에 의한 조절에 기인한 것임을 알 수 있다.

(3) 분화유도된 중배엽 줄기세포의 유지 및 증식 배양

상기 실시예 1 (2)에서 배아체 부착 후 16일간 배양하여 분화유도된 중배엽 줄기세포에 대하여 효소(Trypsin-EDTA, 0.25% Trypsin with EDTA 4Na) 를 처리하고 단일 세포로 해체시킨 다음 다시 조직배양접시에 부착시켰다. 이 후 배양액 총 500㎖ 중 hEGF 0.5㎖ (human Epidermal Growth Factor), VEGF 0.5㎖ (Vascular Endothelial Growth Factor), hFGF-B 2㎖ (human Fibroblast Growth Factor-basic), IGF-1 0.5㎖ (Insulin-like Growth Factor), 히드로코르티손 (hydrocortisone) 0.2㎖ 및 아스코르브산 0.5㎖ 과 기본 배지 470㎖이 첨가된 배지 (EGM-2MV, CC4147, Lonza) 를 이용하여 37℃에서 유지 및 증식 배양시켰다.

상기 증식 배양시 중배엽 줄기세포의 활성 유지여부와 관련하여 본 발명에서 사용한 EGM-2MV 배지 및 종래의 중배엽 줄기세포 배양 배지인 α-MEM 배지의 활성유지능력을 비교하는 실험을 실시하였다. 구체적으로, 상기 각각의 배지로 배양한 세포군에 대하여 세포의 노화(senescence)시 염색 되는 beta gal 염색을 하였으며, 그 결과를 도 3에 나타내었다(한달 동안 배양 비교를 진행 하여 7번째 계대 배양한 세포를 사용하였다).

도 3 에 나타난 바와 같이 EGM-2MV 배지를 사용하여 배양한 중배엽 줄기세포에 비하여, α-MEM 배지를 사용하여 배양한 중배엽 줄기세포의 경우 beta gal 염색이 훨씬 더 많이 된 것을 알 수 있다. 이는 α-MEM 배지를 사용하여 배양한 경우 중배엽 줄기세포의 노화가 더 빠르게 진행되어 중배엽 줄기세포의 분화능이 소실되고 궁극적으로 세포치료제로서의 기능을 할 수 없게 된다는 것을 의미한다. 이에 반하여 본 발명의 EGM-2MV 배지를 사용한 경우 계속적인 계대배양를 하더라도 중배엽 줄기세포의 활성이 오래도록 유지될 수 있어 α-MEM 배지에 비하여 상대적으로 세포치료제로서의 실용성을 증가시킬 수 있음을 의미한다.

이에 더하여, EGM-2MV 배지를 사용하여 장기간 배양하는 경우 중배엽 줄기세포의 동일성 및 그 활성이 계속 유지될 수 있는 지를 조사하여 그 결과를 도 4에 나타내었다. 도 4a는 EGM-2MV 배지를 사용하여 140일 이상 배양한 후의 세포를 나타낸 것으로, 여전히 중배엽 줄기세포의 전형적인 패턴인 finger printing 패턴(pattern)의 성장 모양을 나타내고 있음을 알 수 있다. 도 4b는 배양 140일 까지 계속적으로 세포분열이 왕성하게 일어나고 있음을 보여주는 것으로 중배엽 줄기세포의 활성이 지속적으로 유지됨을 알 수 있다. 결론적으로, 분화유도된 중배엽 줄 기세포를 본 발명의 EGM-2MV 배지로 유지 및 증식 배양시 중배엽 줄기세포의 동일성 및 활성이 장기간 지속될 수 있음을 명확히 알 수 있다.

실시예 2. 중배엽 줄기세포의 특성 분석

(1) 세표표면 표지자 분석

실시예 1에서 얻어진 중배엽 줄기세포에 대하여 특이적인 세포표면 표지자의 발현 유무를 분석하였다. 항원-항체 반응을 실시 후 형광세포분석기를 이용하여 얻은 결과를 도 5에 나타내었다. 비교대조군으로 IgG를 사용하였다.

도 5a 에서 알 수 있는 바와 같이, 배양 95일째(D95) 및 배양 129일째 (D129) 세포에서 중배엽 줄기세포의 특이 표지자인 CD73 및 CD105가 여전히 많은 양 발현됨을 확인하였다. 이에 더하여 배양 129일째의 중배엽 줄기세포에 대하여 세포표면 표지자 분석을 실시한 결과를 도 5b에 나타내었다. 도 5b에서 알 수 있는 바와 같이, 인간 중배엽 줄기세포 표지자(hMSCs markers)인 CD29, CD44 및 CD90 은 발현되었으나, 인간 만능줄기세포 표지자(hESCs markers)인 SSEA1, SSEA4, TRA-1-60 및 OCT-4 는 발현되지 아니하였고, 내배엽 및 외배엽 표지자(other lineage markers) 또한 발현되지 않음을 확인하였다.

궁극적으로, 본 발명의 방법에 따르면 인간 만능줄기세포로부터 선택적으로 중배엽 줄기세포만을 분화유도하고 아울러 장기간의 증식 배양시 여전히 중배엽 줄기세포의 동일성을 유지할 수 있음을 명확히 알 수 있다.

(2) 핵형 분석

G-banding 방법(Saccone et al ., Proc. Natl . Acad. Sci. USA, 89 : 4913-4917, 1992)을 이용하여 상기 실시예 1에서 얻어진 중배엽 줄기세포(배양 160일째)의 핵형을 분석하여 그 결과를 도 6에 나타내었다. 도 6에서 알 수 있는 바와 같이, XY+44 의 정상 핵형을 유지하고 있음을 확인하였다.

(3) 중배엽 줄기세포의 기능( 분화능 ) 확인

실시예 1에서 얻어진 중배엽 줄기세포(배양 129 일째)의 분화능을 확인하기 위하여 기존의 보고된 방법(Tiziano Barberi et al ., PLoS Medicine, 2:0554-0560, June 2005; 및 Kitsie J. Penick et al ., Biotechniques, 39:687-691, 2005)을 이용하여 분석을 실시하였다. 구체적으로, 상기 중배엽 줄기세포로부터 지방세포(adipocyte), 연골세포(chondrocyte), 골세포(osteocyte) 및 근육세포(myocyte) 로의 분화를 유도하고 각각의 세포에 특이적인 유전자 발현을 면역염색반응으로 조사하여 그 세포분화결과를 도 7a에 나타내었다.

지방세포의 분화는 지방소적을 염색하는 Oil red O 로 염색 하였으며, 연골세포는 특이적 발현 단백질인 aggrecan과 collagen II 로 항원-항체 반응을 이용하여 염색하였다. 또한 골세포는 미네랄형성을 확인 할 수 있는 von kossa 염색으로 확인하였으며, 근육세포는 특이적 발현 단백질인 MYF 5 를 항원-항체 반응을 이용하여 염색하여 분화를 확인하였다.

또한 상기 중배엽 줄기세포로부터 지방세포, 연골세포, 골세포 및 근육세포로의 분화시 각각의 세포에 특이적인 유전자발현을 중합연쇄반응으로 정량화 한 결 과를 도 7b 에 나타내었다. 도 7b로부터 알 수 있는 바와 같이, 지방세포에서는 Serbf 및 PPARγ, 골세포에서는 ALP, Osteocalcin 및 Osteopontin, 연골세포에서는 Aggrecan, 근육세포에서는 MyoD 가 각각 발현됨을 확인하였다. 상기 결과로부터 본 발명의 방법에 따라 얻어진 중배엽 줄기세포는 지방세포, 연골세포, 골세포 및 근육세포로 분화할 수 있는 다능성을 보유하고 있음을 명확히 알 수 있다.

(4) 면역 결핍생쥐를 이용한 발암성 여부 확인

면역결핍생쥐를 사용하여 실시예 1에서 얻어진 본 발명의 중배엽 줄기세포의 발암성 여부를 확인하였다. 대조실험을 위해 인간 배아줄기세포를 사용하였다. 구체적으로, 상기 중배엽 줄기세포 1X10^7 개, 서울대병원 인간배아줄기세포 3X10^6개를 면역결핍생쥐에 주사하고, 12주 후 검시한 결과를 도 8a에 나타내었다. 도 8a에서 알 수 있는 바와 같이, 서울대병원 인간 배아줄기세포를 주사한 곳에서는 기형종(teratoma)이 형성되었으나, 본 발명의 중배엽 줄기세포를 주사한 곳에서는 teratoma 가 형성되지 않음을 확인하였다. 이에 더하여, 면역유발관련 인자가 발현이 되지 않음을 FACS 로 확인하여 그 결과를 도 8b 에 나타내었다. 대조군(control)으로 IgG 를 사용되었다. 도 8b에서 알 수 있는 바와 같이, 면역원성을 가질 때 발현되는 MHC II 인 HLA-DR, HLA-DQ 는 표면인자로 발현되지 않음을 확인하였고, 면역 유발 co-stimulator 인 B7-2 및 B7-1 도 발현되지 않음을 확인하였다.

결론적으로, 본 발명의 중배엽 줄기세포는 대조군인 배아줄기세포의 약 3배 이상의 세포수를 주입한 경우에도 암을 유발시키지 아니하였으며, 12 주간의 장기 배양 후에도 면역유발인자자 발현되지 않음을 확인하였다. 따라서 본 발명의 중배엽 줄기세포는 암 발생의 위험이 없음을 명확히 알 수 있다.

(5) 허혈성 심혈관 질환 모델을 이용한 기능성 평가

실시예 1에서 얻어진 본 발명의 중배엽 줄기세포의 심혈관 질환에 대한 기능성을 평가하기 위하여 허혈성 심혈관 질환 생쥐 모델을 이용하였다. 상기 중배엽 줄기세포(배양 129일째)를 상기 질환 생쥐 1마리당 5X10^4 개 주사한 후 8주 동안 그 기능성을 평가하고 그 결과를 도 9에 나타내었다.

도 9a 및 9b는 각각 상기 중배엽 줄기세포를 주입한 심장 및 주입하지 않은 심장을 나타낸다. 섬유화는 MT 염색을 통하여 가시화 하였으며 그림에서 푸른 부분이 섬유화를 표시한다. 도 9a 및 도 9b를 비교관찰해 보면, 세포를 주입한 심장조직(도 9a)의 경우, 세포를 주입하지 않은 심장조직(도9b)에 비하여 심장벽의 섬유화로 인한 얇아짐이 작은 것을 알 수 있다. 즉 허혈성 심장 질환이 있는 경우 심장벽의 섬유화가 일어나고 이로 인해 그 벽이 얇아지게 되는데 본 발명의 중배엽 줄기세포를 주입한 경우 섬유화로 인한 심장벽의 얇아짐을 억제시키는 것을 알 수 있다. 이에 더하여, 도 9c는 손상을 유도한 지역에서 심장벽의 섬유화된 부분을 수치화 하여 정량화한 결과를 나타낸 것으로 세포주입(cell transplantation)시 세포를 주입하지 아니한 대조군에 대하여 섬유화 부분이 줄어든 것을 명확히 알 수 있다. 도 9d 는 8주의 follow-up에서 Echo 심전도 측정 결과를 나타낸 것이다. 4주 및 8주 두차례에 걸친 심전도 측정기록으로부터, 대조군에 비하여 세포주입군에서 심장벽의 운동이 좋아진 것을 확인할 수 있다. LVEDD 는 심장의 확장, LVFS 는 심장의 수축을 나타내는 것으로 LVEDD 는 그 수치가 작을 수록, LVFS 는 그 수치가 클수록 좋은 심장 기능을 나타낸다.

상기 결과로부터, 허혈성 심혈관 질환 모델에 본 발명의 중배엽 줄기세포를 주입할 경우, 심장의 벽이 얇아지지 아니하고, 또한 죽은 조직을 대체하지만 기능성을 가지고 있지 않아 결국 심부전을 유발하는 섬유화(fibrosis)면적을 작게하여 궁극적으로 허혈성 심혈관 질환을 개선시킨다는 사실을 확인하였다.

(6) 자가세포 유래 지지체로서의 가능성 시험

실시예 1에서 얻어진 본 발명의 중배엽 줄기세포가 인간 만능줄기세포를 미분화상태로 유지할 수 있는 지지체로서 사용할 수 있는 지 그 가능성 여부를 조사하였다. 본 실험에서는 인간 만능줄기세포의 미분화 유지인자인 bFGF 없이 배양을 수행하였다.

구체적으로, 본 발명의 방법에 의하여 서울대병원 인간 배아줄기세포 3번(SNUhES3)에서 분화 유도되어 얻어진 중배엽 줄기세포(SNU3MSC-1)를 지지체로 사용하여 서울대병원 인간 배아줄기세포 3번을 배양하였다. 미분화 유지 인자인 bFGF 없이 상기 배아줄기세포를 배양하였을 때, 30 회 이상의 계대배양을 하더라도 상기 인간배아줄기세포의 미분화 상태가 유지됨을 확인하였다(도 10 참조). 도 10에서 알 수 있는 바와 같이, 30번 계대배양 후에도 인간 만능줄기세포 표지자인 OCT-4, SSEA-4, TRA-1-60 을 발현함을 알 수 있으며 이는 미분화능이 그대로 유지되고 있음을 입증하는 결과이다. 결론적으로 본 발명의 중배엽 줄기세포를 인간 만능줄기세포 배양시 자가 유래 지지체로 사용하는 경우, 종래의 인간 만능줄기세포 배양시 그 미분화능의 유지를 위해 필요로 하였던 bFGF 를 주입하지 아니하여도 만능줄기세포의 미분화능을 계속적으로 유지할 수 있다는 것을 확인하였다.

실시예 3. 차병원 인간 배아줄기세포 및 H9 인간 배아줄기세포로부터 중배엽 줄기세포 생산 및 그 특성분석

본 발명의 중배엽 줄기세포 생산방법이 유전적 배경 및/또는 배양환경이 상이한 인간 만능줄기세포에 대하여도 일반적으로 적용될 수 있는 지 그 재현성 여부를 확인하는 실험을 수행하였다. 서울대병원 인간 배아줄기세포 대신 그 유전적 배경 및 배양환경이 상이한 차병원 인간 배아줄기세포 3번(CHA3-hESC) 및 H9 인간 배아줄기세포를 사용한 것을 제외하고는 본 발명의 실시예 1 과 동일하게 실험을 수행하였다. 구체적으로, 배양 14일째 배아체 부착 후 외부의 사이토카인 주입없이 일반 배양배지에서 자연적으로 중배엽 줄기세포로 분화를 유도하였으며, EGM-2MV 배지를 사용하여 유지 및 증식 배양하여 중배엽 줄기세포를 얻었다.

도 11은 서울대병원 인간 배아줄기세포와 유전적 배경이 다르고 배양 환경이 다른 상기 차병원 인간 배아줄기세포 및 H9 인간 배아줄기세포를 사용하여 본 발명의 중배엽 줄기세포 생산방법의 재현성을 검증한 결과를 나타낸 것이다.

도 11a 및 도 11b 에서 알 수 있는 바와 같이, 차병원 세포 유래 중배엽 줄기세포(배양 90일째) 및 H9 세포 유래 중배엽 줄기세포(배양 90일째) 모두 중배엽 줄기세포의 전형적인 표현형을 나타내었다. 이에 더하여, 형광세포분석기로 유전자발현을 분석한 결과, 중배엽 줄기세포의 특이적인 유전자인 CD105, CD73, CD29, CD44 및 CD90 이 양성으로 인지되며, 배아줄기세포의 특이 표지자(SSEA-1, SSEA-4, TRA-1-60) 및 다른 배엽 유래의 표지자(CD45, CD34)는 음성으로 인지됨을 확인하였다 [도 11c (차병원 세포 유래 중배엽 줄기세포, D90), 및 도 11d (H9 세포 유래 중배엽 줄기세포, D90) 참조].

또한 G-banding 방법(Saccone et al ., Proc. Natl . Acad. Sci. USA, 89 : 4913-4917, 1992)을 이용하여 상기 차병원 세포에서 유래된 중배엽 줄기세포(배양 90일째) 및 H9 세포로부터 유래된 중배엽 줄기세포(배양 90일째)의 핵형을 분석한 결과, XY+44 의 정상 핵형을 유지하고 있음을 확인하였다(각각 도 11e 및 도 11f 참조).

상기 결과로부터, 본 발명의 인간 만능줄기세포로부터 중배엽 줄기세포를 생산하는 방법은 유전적 배경 및/또는 배양환경이 상이한 인간 만능줄기세포에 대하여도 일반적으로 적용될 수 있는 규정화된 중배엽 줄기세포 배양 방법임이 입증되었다.

도 1a는 인간 만능줄기세포에서 중배엽 줄기세포로의 분화유도 및 증식 배양 과정을 도식화한 것이다.

도 1b는 중합연쇄반응을 이용하여 7일 배아체와 14일 배아체의 중배엽 분화 관련 유전자의 발현 차이를 정량화한 것이다.

도 1c는 중배엽 분화 초기 유전자의 단백질 발현을 14일 배아체 염색을 통하여 확인한 것이다.

도 2a는 14일째 배아체 부착시 선별을 나타낸 것이다.

도 2b는 사이토카인이 포함되지 아니한 일반적인 배양배지에서 배아체 배양시 자연적으로 중배엽 줄기세포로의 분화유도가 개시됨을 나타낸 것이다.

도 2c 및 2d는 각각 BMP 의 길항제(antagonist)인 Noggin 미처리군 및 처리군에서의 중배엽 줄기세포의 분화 유도 과정를 나타낸 것이다.

도 3은 EGM-2MV 배지와 기존 중배엽 줄기세포 배양 배지인 a-MEM의 효율 차이를 세포의 노화(senescence)시 염색 되는 beta gal 염색을 통해 확인한 것이다.

도 4a는 EGM-2MV 배지에서 140일 이상 배양한 중배엽 줄기세포의 성장 패턴을 나타낸 것이다.

도 4b는 본 발명의 중배엽 줄기세포의 체외 배양시 장기간 활성을 유지하며 성장함을 보여주는 생장 곡선이다.

도 5a 및 5b는 본 발명의 방법에 의하여 얻어진 중배엽 줄기세포가 중배엽 특이적 마커를 발현함을 나타낸 것이다.

도 6은 본 발명의 중배엽 줄기세포에 대하여 체외 장기 배양 후 염색체 분석 결과를 나타낸 것이다.

도 7a 및 7b는 본 발명의 방법으로 얻어진 중배엽 줄기세포의 분화능을 분석한 결과를 나타낸 것이다.

도 8a 및 8b 는 각각 본 발명의 방법으로 얻어진 중배엽 줄기세포의 teratoma 형성여부 및 면역유발관련인자의 발현여부를 나타낸 것이다.

도 9는 본 발명의 방법으로 얻어진 중배엽 줄기세포의 기능성을 평가하기 위하여 허혈성 심혈관 질환 생쥐 모델을 이용하여 그 기능을 살펴본 결과를 나타낸 것이다.

도 10은 본 발명의 방법으로 얻어진 중배엽 줄기세포의 자가 세포 유래 지지체로서의 가능성을 시험한 결과를 나타낸 것이다.

도 11은 서울대병원 인간 배아줄기세포와 유전적 배경이 다르고 배양 환경이 다른 차병원 인간 배아줄기세포 3번(CHA3-hESC) 및 H9 인간 배아줄기세포를 이용하여 본 발명의 재현성을 검증한 결과를 나타낸 것이다.

Claims (16)

1. a) 인간 만능줄기세포를 12 내지 16일 간 배양하여 배아체를 형성하는 단계;

   b) 상기 배아체를 FBS (fetal bovine serum) 가 첨가된 basal DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium) 성분을 포함한 배지로 배양하여 중배엽줄기세포로 분화를 유도하는 단계; 및

   c) 상기 중배엽 줄기세포의 동일성을 유지하면서 증식 배양시키는 단계를 포함하는 인간 만능줄기세포로부터 중배엽 줄기세포를 생산하는 방법으로, 상기 중배엽 줄기세포는 지방세포, 골세포, 연골세포, 근육세포, 신경세포, 및 심근세포를 포함하는 세포로 분화할 수 있는 다능성을 보유한 중배엽 줄기세포인 것을 특징으로 하는 방법.
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10. 인간 중배엽 줄기세포를 세포 배양 지지체(feeder)로 사용하는 방법으로,

    a) 인간 만능줄기세포를 12 내지 16일 간 배양하여 배아체를 형성하는 단계;

    b) 상기 배아체를 FBS (fetal bovine serum) 가 첨가된 basal DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium) 성분을 포함한 배지로 배양하여 중배엽줄기세포로 분화를 유도하는 단계;

    c) 상기 중배엽 줄기세포의 동일성을 유지하면서 증식 배양시키는 단계; 및

    d) 상기 증식 배양된 중배엽 줄기세포를 세포 배양 지지체로 사용하는 단계를 포함하며, 상기 중배엽 줄기세포는 지방세포, 골세포, 연골세포, 근육세포, 신경세포, 및 심근세포를 포함하는 세포로 분화할 수 있는 다능성을 보유한 중배엽 줄기세포이고, 미분화유지인자의 주입 없이 미분화상태를 유지시키는 것을 특징으로 하는 방법.
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