CN107375329A - 一种治疗犬关节炎的干细胞制剂及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明所述一种治疗犬关节炎的干细胞制剂及其制备方法，包括：犬间充质干细胞、犬血清白蛋白、透明质酸及其要用盐。巧妙地运用间充质干细胞的注射液，借助B超定位膝关节腔，将细胞更准确地注入患肢关节腔内，打破了犬关节炎传统治疗方法，其稳定性高，疗效好、使用安全，适于较长时间的保存及运输，无毒副作用，为临床大规模使用奠定了基础。

Description

一种治疗犬关节炎的干细胞制剂及其制备方法
技术领域
本发明属于生物医药领域，尤其涉及一种治疗犬关节炎的干细胞制剂及其制备方法。
背景技术
如今，随着伴侣动物犬类逐年增多，犬OA也日益被人类重视。OA使犬关节肿胀疼痛、变形、积液，从而引发一系列影响运动功能的障碍。根据OA病因可分为原发性和继发性OA。老年犬多因运动过度、骨骼老化患原发性OA。而继发性OA可由外伤、磨损等任何影响关节正常活动功能的原因都可导致关节病变。复杂的现实状况使OA的治疗方案受限，目前还没有药物或非手术治疗对逆转或停止该病的进展有明确疗效，也没有疗法能控制由于长期的加重因素引起的疼痛。
影像学常用于临床上直观的检查关节病变，包括X线、MRI、B超、关节镜和UR等。X线可评估关节的骨质方面及关节间隙，是关节病变的常规检査； B超可观察关节积液的关节周边组织的情况，定位关节腔的位置，借助B超还可更好地将治疗用的细胞定点注射至关节腔内；MRI能很好显示关节软组织病变，成像质量好，能清晰显示关节腔内关节滑液、关节软骨、及关节周围软组织层次，是诊断骨科疾病的精确仪器。
间充质干细胞(MSC)已被提出是用于退行性肌肉骨骼病症如OA的最佳再生细胞治疗剂。这些细胞在各种组织中被发现，并且具有快速增殖和分化为肌肉骨骼谱系的能力，包括骨和软骨。大批研究也有证明这些细胞通过调节局部炎症反应来协调重要的免疫功能。这些因素为MSC阻止关节退化的能力提供理论基础。目前研究工作侧重于确定用于MSC衍生的理想的来源，因为这种细胞型存在于广泛的组织中；使用支架等优化MSCs的适当定位来最优化其再生能力和局部免疫调节作用。
MSC是一类起源于中胚层的非造血干细胞，具有多向分化的潜能，能够为细胞治疗提供理想的种子细胞，同时也能作为基因治疗的载体细胞，目前已从骨髓、胎盘、脂肪、脐血、脐带、滑膜等组织器官中分离出间充质干细胞。体外培养的MSC形态均一，平行生长或漩涡状生长，能够表达多种表面抗原，如高表达***标志(CD44、CD90、CD105)，不表达造血干细胞标志(CD34、 CD45、CD14)、内皮细胞标志(CD31、CD33)等。在特定条件下MSC可以分化为成骨细胞、神经细胞、软骨细胞、脂肪细胞、成纤维细胞及肝细胞等。相比其他MSC，选用的犬脐带间充质干细胞(Umbilical cord mesenchymal stem cells， UC-MSCs)具有种子细胞的很多优良特性，如增殖活性高、免疫原性低、无致瘤性等，且来源充足，无伦理问题，对犬只造成的损伤较少。
MSC分化为关节内所有组织的能力并调节局部炎症反应的能力为OA提供潜在的再生解决方案，这些特点表明了MSC提供理想的组件来修复损坏的关节，强大的证据证明MSC通过旁分泌刺激天然组织来引导再生。因此为了更好的提高宠物犬的医疗水平，加大犬的干细胞的研究，并借助B超的影像学观察技术将细胞准确注射至犬患肢的膝关节腔内，且通过影像学直观检查关节病变，减少手术对宠物犬造成的伤害，有助于加强对犬的疾病治疗的研究。
发明内容
本发明克服了现有技术中的缺点，提供了一种治疗犬关节炎的干细胞制剂及其制备方法，具有更高的安全性和更小的创伤性，且对关节炎的疗效显著，适用于大规模使用，应用前景广阔，为宠物犬的骨关节炎的治疗开辟了新的道路。
为了解决上述技术问题，本发明是通过以下技术方案实现的：
一种治疗犬关节炎的干细胞制剂，包括：犬间充质干细胞、犬血清白蛋白、透明质酸及其要用盐。
进一步，间充质干细胞为来源于犬脐带、胎盘、骨髓或脂肪组织，经体外分离、培养和鉴定为纯净的第1至第3代间充质干细胞。
进一步，所述犬间充质干细胞的浓度为(1～5)×106个/ml。
进一步，在犬间充质干细胞的基础上，按以下比例添加犬血清白蛋白、透明质酸及其要用盐，犬血清白蛋白的体积百分比8-18％，透明质酸及其要用盐的体积百分比为6-8％。
进一步，包括以下步骤：以犬脐带组织为来源，取脐带华通胶，Ⅰ型胶原酶方法消化后过滤，离心，完全培养基重悬细胞后移至35mm培养皿中，置37℃、 5％CO2培养箱，培养2d后PBS洗涤换液；每3d换液一次，待细胞铺满培养皿的80％～90％时进行细胞传代，取生长状况良好的第3代UC-MSCs制成所述干细胞制剂的注射液。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明所述一种治疗犬关节炎的干细胞制剂及其制备方法，巧妙地运用间充质干细胞的注射液，借助B超定位膝关节腔，将细胞更准确地注入患肢关节腔内，打破了犬关节炎传统治疗方法，其稳定性高，疗效好、使用安全，适于较长时间的保存及运输，无毒副作用，为临床大规模使用奠定了基础。
附图说明
附图用来提供对本发明的进一步理解，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制，在附图中：
图1是膝关节腔注射部位的B超图示；
图2是实验犬治疗后第3、7、14、28天核磁共振图；
图3是实验犬治疗后第3、7、14、28天B超图；
图4是实验犬治疗后第3、7、14、28天X-RAY图。
具体实施方式
以下结合附图对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。
一、犬UC-MSCs的制备
取脐带华通胶，Ⅰ型胶原酶方法消化后过滤，离心，完全培养基重悬细胞后移至35mm培养皿中，置37℃、5％CO2培养箱，培养2d后PBS洗涤换液；每3d换液一次，待细胞铺满培养皿的80％～90％时进行细胞传代，取生长状况良好的第3代UC-MSCs，制成干细胞注射液；
二、实验动物OA模型构建
1.分组处理：选取8只健康犬(年龄体重相近、品种性别统一)，随机分组为2组，每组4只实验犬。先将全部实验犬制作退行性关节炎模型，之后将第1 组作为模型组，第2组作为治疗组，分别进行生理盐水和含干细胞的生理盐水的注射治疗与处理，试验期共28天，试验期间实验犬自由进食、饮水。
2.术前准备：术前8小时实验犬禁水禁食，双前肢埋置24G静脉留置针，建立静脉双通道，术前15分钟，注射镇静药乙酰丙嗪，每公斤0.02mg。注射镇痛药痛立定，每公斤0.1ml。选择合适的气管插管，丙泊酚每公斤4mg静脉注射，诱导麻醉，并插管，连接麻醉机，异氟烷维持麻醉3％，连接监护仪，血压仪，等动物进去麻醉平台期，开始常规消毒程度，穿戴手术无菌用品，铺设无菌创巾、贴膜，开始手术。
3.模型制作：打开左膝关节通路，暴露滑车关节面，将髌骨推出膝关节，使用关节打磨钻，高速档，夹持刷钻钻头，对膝关节软骨面，进行打磨，直至将滑车脊，滑车槽软骨面全部打磨掉为止，缝合膝关节，调整髌骨位置。
三、动物模型术后治疗及护理
1.注射治疗：患肢膝关节关节内注射：以髌骨下缘为中心备皮，局部剪毛，碘伏消毒3遍，酒精脱碘3遍；助手握住患肢股骨和跖关节，伸直膝关节，操作者手持含注射液的注射器，将针头沿髌骨下缘刺入皮肤，入针时针头略向股骨侧倾斜，有轻度针尖突破感即进入关节，B超观察患犬膝关节外侧，可见针尖到达低回声区域(图1)，即含有关节液的关节腔内时，将注射液注入关节腔。术后第一天和第三天模型组每只注射1ml生理盐水，治疗组每只注射1ml含 1×106个细胞的干细胞制剂。
2.术后护理：试验中的动物实验犬术后正常使用抗菌消炎、镇痛药物，每天对伤口进行清洁消毒。
四、主要检测指标：
1.临床体征和运动机能评估：试验期间每天观察实验犬精神状态、大小便、运动及体温等情况。
2.影像学观察：干细胞治疗后3天、7天、14天、28天，进行核磁共振扫查、B超和X-RAY扫描。
结果显示，试验期间实验犬精神状况良好，大小便正常，除左膝疼痛不能着地外，运动正常。造模一周内，模型组实验犬的体温显著高于治疗组的体温。
对实验犬左膝进行影像学观察：
(1)核磁共振扫查发现：治疗组的股骨远端及关节周边高信号区域持续减少，髌骨腹侧逐步光滑，髌骨及滑车槽中间逐步软骨新生；而模型组股骨远端及关节周边高信号区域未见减少，髌骨腹侧未见明显好转，髌骨及滑车槽中间未见明显好转(图2)。
(2)B超检查结果发现：治疗组关节积液情况逐步改善，而模型组关节积液28天后未见明显减少，关节炎后期并发关节积液是关节炎炎性程度的一个评估指标，积液好转提示炎症水平较低，即治疗组的炎症水平比模型组低；治疗组缺失的关节软骨逐步再生形成，而模型组的关节软骨28天后未见明显好转，提示干细胞治疗有助于犬关节损伤后软骨的修复；治疗组关节周边组织从开始回声杂乱到28天后关节组织逐步形成影像解剖结构，而模型组关节周边组织回声杂乱且28天后关节组织未见明显好转(图3)。
(3)X线扫描结果发现：治疗组髌骨腹侧缺损逐步恢复，滑车脊缺损也逐步恢复，低密度区域(软骨)也逐步增加，关节内其他结构未受明显影响。模型组的膝关节未见明显好转，锯齿状缺损稍平滑，但未见明显平滑，从X线来看，髌骨腹侧缺损恢复缓慢，滑车脊缺损未见明显恢复，低密度区域(软骨) 未见明显增长(图4)。
最后应说明的是：以上仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换，但是凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (5)

1.一种治疗犬关节炎的干细胞制剂，其特征在于，包括：犬间充质干细胞、犬血清白蛋白、透明质酸及其要用盐。
2.根据权利要求1所述一种治疗犬关节炎的干细胞制剂，其特征在于，间充质干细胞为来源于犬脐带、胎盘、骨髓或脂肪组织，经体外分离、培养和鉴定为纯净的第1至第3代间充质干细胞。
3.根据权利要求1所述一种治疗犬关节炎的干细胞制剂，其特征在于，所述犬间充质干细胞的浓度为(1～5)×106个/ml。
4.根据权利要求1所述一种治疗犬关节炎的干细胞制剂，其特征在于，在犬间充质干细胞的基础上，按以下比例添加犬血清白蛋白、透明质酸及其要用盐，犬血清白蛋白的体积百分比8-18％，透明质酸及其要用盐的体积百分比为6-8％。
5.根据权利要求1所述一种治疗犬关节炎的干细胞制剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：以犬脐带组织为来源，取脐带华通胶，Ⅰ型胶原酶方法消化后过滤，离心，完全培养基重悬细胞后移至35mm培养皿中，置37℃、5％CO2培养箱，培养2d后PBS洗涤换液；每3d换液一次，待细胞铺满培养皿的80％～90％时进行细胞传代，取生长状况良好的第3代UC-MSCs制成所述干细胞制剂的注射液。
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