KR101133910B1 - Anti-influenza type a virus monoclonal antibody and immunoassay instrument using the antibody - Google Patents
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Abstract
특이성이 높은 항-인플루엔자 A형 바이러스 모노클로날 항체 및 그것을 이용한, 인플루엔자 A형 바이러스를 특이적으로 검출할 수 있는 면역 측정 기구가 개시되어 있다. 본 발명의 항-인플루엔자 A형 바이러스 모노클로날 항체는, 인플루엔자 A형 바이러스의 분자량 55 내지 70 kD의 핵 단백질과 항원 항체 반응하고, 인플루엔자 B형 바이러스와는 실질적으로 항원 항체 반응하지 않는다. An anti-influenza type A virus monoclonal antibody having high specificity and an immunoassay apparatus capable of specifically detecting an influenza type A virus using the same are disclosed. The anti-influenza type A virus monoclonal antibody of the present invention reacts with a nuclear protein having a molecular weight of 55 to 70 kD of an influenza type A virus and does not substantially react with the influenza type B virus.
Description
본 발명은 항-인플루엔자 A형 바이러스 모노클로날 항체 및 상기 항체를 이용하는 면역 측정 기구에 관한 것이다. The present invention relates to an anti-influenza type A virus monoclonal antibody and an immunoassay instrument using the antibody.
인플루엔자는 옛부터 세계적인 유행을 주기적으로 반복하고, 그 때마다 많은 사망자를 내었지만, 1931년에 원인 바이러스가 검출되어 원인 해명에의 길이 열렸다. 인플루엔자 병원체의 바이러스는 바이러스 내부에 있는 가용성의 핵 단백질(nucleoprotein; NP)의 항원성에 의해서 A형, B형 또는 C형의 3종의 유형으로 분류되고 있다. 인플루엔자 A형은, 또한 바이러스 표면에 존재하는 적혈구 응집소(헤마글루티닌(hemagglutinin); HA)와 뉴라미니다제(neuraminidasc: NA)라는 2개의 외막 단백질의 항원성에 의해서 아형으로 분류되어 있다. Influenza has periodically repeated a worldwide epidemic and caused many deaths every time, but in 1931, the cause virus was detected and the way to the cause was opened. Viruses of influenza pathogens are classified into three types, type A, type B, or type C, by antigenicity of soluble nuclear protein (NP) inside the virus. Influenza A is also classified as a subtype by the antigenicity of two outer membrane proteins, hemagglutinin (HA) and neuraminidasc (NA), which are present on the virus surface.
1972년부터 인플루엔자의 예방에는, 에테르 처리 후 포르말린으로 불활성화한 백신이 사용되어 왔다. 근래, 예방에 사용되는 백신 이외에 치료약으로서 항-인플루엔자 약이 발견되어 널리 사용되었다. 이들 치료약으로서는, 인플루엔자 A형 바이러스에 적응하는 염산 아만타딘이나, 인플루엔자 A형 바이러스와 B형에 적 응하는 자나빌, 인산 오셀타미빌 등이다. Since 1972, for the prevention of influenza, vaccines inactivated with formalin after ether treatment have been used. Recently, anti-influenza drugs have been found and widely used as therapeutic drugs in addition to vaccines used for prevention. These therapeutic drugs include amantadine hydrochloride, which adapts to influenza A virus, zanabi, and oseltamibil phosphate, which respond to influenza A virus and B.
이들 치료약을 선택하는 데에 있어서는, 검체 중의 인플루엔자 바이러스를 검출하고, 감염이 인플루엔자 바이러스에 의한 것이며 바이러스의 유형이 A형 또는 B형인 가를 특정하는 것이 중요하다. 또한, 인플루엔자 A형 바이러스는, 인플루엔자 바이러스 B형에 비해 감염력이 강하여 중증의 증상을 야기하기 때문에, 조기 치료에는 감염 바이러스의 특정이 더욱 중요하다. In selecting these therapeutic drugs, it is important to detect influenza virus in the sample and to specify whether the infection is caused by influenza virus and the type of virus is type A or B. In addition, since influenza type A viruses have a stronger infectivity than influenza virus type B and cause severe symptoms, the specification of infectious viruses is more important for early treatment.
종래, 인플루엔자 바이러스를 항-인플루엔자 바이러스 항체에 의해서 검출하는 것이 행해져 왔다. 지금까지 인플루엔자 A형 바이러스에 대한 항체로서는, 유행이 예상되는 바이러스의 아형을 판별하여 백신 제조에 사용하기 위해서, 바이러스의 HA나 NA를 특이적으로 인식하고, 바이러스의 아형을 식별하기 위한 항체가 알려져 있었다(예를 들면, 특허 문헌 1 및 특허 문헌 2 참조). 또한, 인플루엔자 바이러스 A형 아형에 대하여 핵 단백질의 아미노산 서열이 결정되어, [National Library of Medicine; Entrez Nucleotides datebase] 등에 보고되어 있다. Conventionally, detection of influenza viruses with anti-influenza virus antibodies has been performed. Until now, antibodies for influenza type A viruses have been known to specifically recognize HA or NA of viruses and to identify subtypes of viruses in order to determine the subtypes of viruses that are expected to be used for vaccine production. (For example, refer
또한, 인플루엔자 바이러스를 검출하는 장치로서는, 예를 들면 인플루엔자 바이러스 항원을 결합할 수 있는 고상(固相)을 준비하고, 검체 중의 인플루엔자 바이러스를 반응시킨 후, 또한 제1 효소가 결합되어 있는 인플루엔자 A형 바이러스 항체 및 제2 효소가 결합되어 있는 인플루엔자 바이러스 B형 항체를 상기 고상과 반응시키고, 기질을 첨가하여 반응을 행하며, 고상 상의 발색을 육안으로 관찰하는 플로우ㆍ스루(flow-through)형 장치가 알려져 있었다(특허 문헌 3 참조). 이 장치는, 시약 중의 항체에는 인플루엔자 바이러스의 핵 단백질에 대한 항체를 사용하지 만, 측정 감도가 낮고, 측정 조작이 번잡하여 간편한 측정 장치는 아니었다. 또한, 인플루엔자 바이러스 핵 단백질에 대한 모노클로날 항체를 사용한 면역 측정 기구(이하 「면역 크로마토 기구」라 함)가 알려져 있다(비특허 문헌 1 참조).In addition, as an apparatus for detecting influenza virus, for example, influenza type A, in which a solid phase capable of binding influenza virus antigens is prepared, the influenza virus in a sample is reacted, and then the first enzyme is bound. A flow-through device is known in which a virus antibody and an influenza virus B antibody to which a second enzyme is bound are reacted with the solid phase, the substrate is added, and the reaction is visually observed. (See Patent Document 3). Although this apparatus uses an antibody against a nuclear protein of influenza virus as the antibody in the reagent, it is not a simple measuring apparatus because of low measurement sensitivity and complicated measurement operation. In addition, an immunoassay instrument (hereinafter referred to as an "immune chromatographic instrument") using a monoclonal antibody against influenza virus nuclear protein is known (see Non-Patent Document 1).
한편, 수액(輸液) 가능한 벨트상의 매트릭스를 사용하는 면역 측정 기구가 개발되어, 소정의 부분에 검체를 점착시킴으로써, 특별한 검출 장치 및 숙련된 측정 기술을 필요로 하지 않고 단시간에 간편하게 검체 중의 항원 또는 항체의 측정을 할 수 있게 되었다. 면역 크로마토 기구에는, 그 측정 대상 물질에 따라서, 예를 들면 검출 존(zone)에 복수개의 매독 트레포네마 항원(TP 항원)을 결합하고, 검체 중의 복수개의 항 TP 항체를 따로따로 검출 존에서 검출할 수 있는 면역 크로마토 기구가 개발되어 있다(특허 문헌 4 참조). 이 기구의 검출 존에는, 다른 TP 항원을 결합시킨 복수개의 존을 가지고, 다른 항 TP 항체를 따로따로 검출하여 감염 시기를 특정하며, 치료약의 선택 등에 이용되고 있다. On the other hand, an immunoassay apparatus using an infusion belt-like matrix has been developed, and by adhering a sample to a predetermined portion, an antigen or an antibody in the sample can be easily and conveniently in a short time without requiring a special detection device and an expert measurement technique. Can be measured. In the immunochromatography apparatus, for example, a plurality of syphilic treponema antigens (TP antigens) are bound to a detection zone according to the substance to be measured, and a plurality of anti-TP antibodies in the sample are separately detected in the detection zone. An immunochromatography apparatus capable of doing this has been developed (see Patent Document 4). The detection zone of this instrument has a plurality of zones in which different TP antigens are bound, detects different anti-TP antibodies separately, specifies infection time, and is used for selecting a therapeutic drug.
특허 문헌 1: 일본 특허 공개 (평)6-100594호 Patent Document 1: Japanese Patent Publication No. 6-100594
특허 문헌 2: 일본 특허 공개 (평)7-304799호 Patent Document 2: Japanese Patent Publication No. 7-304799
특허 문헌 3: 일본 특허 공개 2001-124775호 Patent Document 3: Japanese Patent Laid-Open No. 2001-124775
특허 문헌 4: 일본 특허 공개 (평)9-229938호Patent Document 4: Japanese Patent Application Laid-Open No. 9-229938
비특허 문헌 1: 감염증지 2001; 75; 792-799 Non Patent Literature 1: Infectious Disease 2001; 75; 792-799
<발명의 개시><Start of invention>
<발명이 해결하고자 하는 과제>Problems to be Solved by the Invention
종래의 항-인플루엔자 A형 바이러스 모노클로날 항체는 핵 단백질에 대한 항체가 면역 크로마토법 등에서 이용되지만, 인플루엔자 A형 바이러스에 대한 특이성 및 반응성이 낮고, 고감도의 면역 측정에는 만족할 수 있는 것은 아니었다. 또한, 인플루엔자 치료약을 선택하기 위해서 인플루엔자 B형 바이러스와는 반응하지 않지만, 인플루엔자 바이러스의 HA와 NA가 변이된 아형을 포함하는 모든 인플루엔자 A형 바이러스에 반응하는 항체가 요구되었다. Conventional anti-influenza type A virus monoclonal antibodies have been used in immunochromatography and the like for antibodies against nuclear proteins, but they have low specificity and reactivity against influenza type A viruses and are not satisfactory for high sensitivity immunoassay. In addition, in order to select an influenza therapeutic drug, an antibody that does not react with influenza B virus, but which responds to all influenza type A viruses including subtypes in which the HA and NA of the influenza virus is mutated, is required.
또한, 인플루엔자 A형 바이러스 또는 B형 바이러스의 판별을 특별한 진단 기기 설비나 측정 장치를 이용하지 않고서, 단시간에 측정 결과가 얻어지며, 1회의 조작으로 A형 또는 B형을 판별할 수 있는 장치가 요구되었다. In addition, a measurement result can be obtained in a short time without the use of a special diagnostic apparatus or a measuring device for discriminating influenza type A virus or type B virus, and a device capable of discriminating type A or type B by one operation is required. It became.
따라서, 본 발명의 목적은, 특이성이 높은 항-인플루엔자 A형 바이러스 모노클로날 항체를 제공하는 것이다. 또한, 본 발명은 인플루엔자 A형 바이러스를 특이적으로 검출할 수 있는 면역 측정 기구를 제공하는 것이다. Accordingly, an object of the present invention is to provide an anti-influenza type A virus monoclonal antibody with high specificity. The present invention also provides an immunoassay apparatus capable of specifically detecting influenza type A virus.
<발명을 해결하기 위한 수단>Means for Solving the Invention
본원 발명자들은 예의 연구한 결과, 인플루엔자 A형 바이러스의 핵 단백질을 항원으로 하고, 인플루엔자 A형 바이러스와 특이적으로 반응하는 항-인플루엔자 A형 바이러스 모노클로날 항체를 제조하는 것에 성공하여, 본 발명을 완성하였다. 또한, 이 인플루엔자 A형 바이러스 모노클로날 항체를 이용함으로써, 인플루엔자 A형 바이러스를 인플루엔자 B형 바이러스와 식별하여 검출하는 것이 가능한 면역 측정 기구를 제공할 수 있기에 이르렀다. As a result of intensive studies, the present inventors have succeeded in producing an anti-influenza type A virus monoclonal antibody that specifically uses a nuclear protein of influenza type A virus as an antigen and specifically reacts with an influenza type A virus. Completed. Moreover, the use of this influenza type A virus monoclonal antibody has led to the provision of an immunoassay apparatus capable of distinguishing and detecting influenza type A viruses from influenza type B viruses.
즉, 본 발명은 인플루엔자 A형 바이러스의 분자량 55 내지 70 kD의 핵 단백질과 항원 항체 반응하고, 인플루엔자 B형 바이러스와는 실질적으로 항원 항체 반응하지 않는, 항-인플루엔자 A형 바이러스 모노클로날 항체 또는 그의 항원 결합성 단편을 제공한다. 또한, 본 발명은 이동 가능한 표지 항-인플루엔자 A형 바이러스 항체를 갖는 표지 시약 존(zone), 검체 점착 존, 전개액 공급 존, 전개액 흡수 존, 및 항-인플루엔자 A형 바이러스 항체를 매트릭스에 부동화시킨 인플루엔자 A형 바이러스 검출 존을 매트릭스에 설치한 기구이며, 상기 표지 항-인플루엔자 A형 바이러스 항체 및 검출 존에 부동화한 항-인플루엔자 A형 바이러스 항체 중 하나 이상의 항체가 상기 본 발명의 모노클로날 항체인 면역 측정 기구를 제공한다. That is, the present invention provides an anti-influenza type A virus monoclonal antibody or an antigen antibody that reacts with a nuclear protein having a molecular weight of 55 to 70 kD of an influenza type A virus and does not substantially react with an influenza type B virus. Provide antigen binding fragments. In addition, the present invention immobilizes a label reagent zone, a sample adhesion zone, a developer supply zone, a developer absorption zone, and an anti-influenza A virus antibody with a movable label anti-influenza A virus antibody on a matrix The above-described influenza type A virus detection zone is provided in a matrix, and at least one antibody of the labeled anti-influenza type A virus antibody and the anti-influenza type A virus antibody immobilized in the detection zone is the monoclonal antibody of the present invention. It provides an immunoassay apparatus.
<발명의 효과>Effect of the Invention
본 발명에 의해, 인플루엔자 A형 바이러스와 면역 반응하지만, 인플루엔자 B형 바이러스와는 반응하지 않는, 항-인플루엔자 A형 바이러스 모노클로날 항체가 제공되었다. 본 발명의 항-인플루엔자 A형 바이러스 모노클로날 항체를 이용하는 면역 측정에 의해, 인플루엔자 A형 바이러스를 인플루엔자 B형 바이러스와 식별하여 검출 또는 정량할 수 있다. 본 발명에 의해, 또한 상기 본 발명의 항-인플루엔자 A형 바이러스 모노클로날 항체를 이용한 면역 측정 기구가 제공되었다. 본 발명의 면역 측정 기구를 이용함으로써, 인플루엔자 A형 바이러스를 간편하게, 또한 인플루엔자 B형 바이러스와 식별하여 검출할 수 있다. 따라서, 본 발명은 인플루엔자의 진단 및 치료에 대단히 공헌할 것으로 기대된다. According to the present invention, an anti-influenza type A virus monoclonal antibody has been provided, which is immune to influenza type A virus but not to influenza type B virus. By immunoassay using the anti-influenza type A virus monoclonal antibodies of the present invention, influenza type A viruses can be identified and identified or quantified with influenza type B viruses. According to the present invention, there is also provided an immunoassay instrument using the anti-influenza type A virus monoclonal antibody of the present invention. By using the immunoassay apparatus of the present invention, influenza type A virus can be easily identified and detected from influenza type B virus. Therefore, the present invention is expected to greatly contribute to the diagnosis and treatment of influenza.
도 1은 웨스턴 블롯법에 의해서 분획한 항원에 대하여 본 발명의 모노클로날 항체를 반응시킨 결과를 나타낸 도면이다. 1 is a diagram showing the result of reacting a monoclonal antibody of the present invention with an antigen fractionated by Western blot.
도 2는 실시예 4에서 이용한 발현용 플라스미드(pW6A)의 제한 효소 지도를 나타낸 도면이다. Fig. 2 shows the restriction map of the expression plasmid (pW6A) used in Example 4;
도 3은 인플루엔자 H1N1의 A 단편을 더욱 세분화한 단편 A1 내지 A7의 아미노산을 나타낸 도면이다. 3 is a diagram showing amino acids of fragments A1 to A7 further subdivided the A fragment of influenza H1N1.
도 4는 FVA2-11과의 반응성을 확인하는 CBB 염색 패턴과 웨스턴 블롯을 나타낸 도면이다. Figure 4 is a diagram showing the CBB staining pattern and Western blot to confirm the reactivity with FVA2-11.
도 5는 인플루엔자 A형 바이러스 아형의 핵 단백질 아미노산 서열(80 내지 140)을 나타낸 도면이다. Fig. 5 shows the nuclear protein amino acid sequences (80 to 140) of influenza A virus subtypes.
도 6은 본 발명의 측정 기구 양태의 일례를 모식적으로 나타낸 단면도이다. It is sectional drawing which showed typically an example of the measuring mechanism aspect of this invention.
도 7은 본 발명의 측정 기구를 카세트에 셋팅하였을 때의 일례를 나타내는 평면도이다. 7 is a plan view showing an example when the measuring instrument of the present invention is set in a cassette.
도 8은 A-A'의 단면도이다. 8 is a cross-sectional view of AA ′.
<발명을 실시하기 위한 최선의 형태>Best Mode for Carrying Out the Invention
상기와 같이, 인플루엔자 A형 바이러스의 분자량 55 내지 70 kD의 핵 단백질과 항원 항체 반응하는 것이다. 인플루엔자 A형 바이러스의 분자량 55 내지 70 kD의 핵 단백질과 항원 항체 반응하는 것은, 인플루엔자 A형 바이러스를 시료로 하고, 도데실황산나트륨-폴리아크릴아미드 겔 전기 영동(SDS-PAGE)을 조합한 웨스턴 블롯법에 의해 확인할 수 있다. 웨스턴 블롯(하기 실시예 참조)을 행하면, 본 발명의 모노클로날 항체는 분자량 55 내지 70 kD의 핵 단백질을 인식한다. As described above, the antibody reacts with a nuclear protein having a molecular weight of 55 to 70 kD of an influenza A virus. The antigen antibody reaction with a nuclear protein having a molecular weight of 55 to 70 kD of an influenza type A virus is based on the influenza type A virus and a Western blot method combining sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). It can be confirmed by. Western blots (see Examples below) show that the monoclonal antibodies of the invention recognize nuclear proteins of molecular weight 55-70 kD.
상기한 대로, 본 발명의 모노클로날 항체는 인플루엔자 B형 바이러스와는 실질적으로 항원 항체 반응하지 않는다. 여기서, 「실질적으로 항원 항체 반응 하지 않는다」란, 검출 가능한 수준에서 항원 항체 반응하지 않거나 또는 항원 항체 반응을 일으키더라도, 그의 반응 정도가 인플루엔자 A형 바이러스와의 항원 항체 반응보다 분명히 약하고, 인플루엔자 B형 바이러스와 항원 항체 반응하지 않는 것이 당업자에게 명료한 정도로밖에 반응하지 않는 것을 의미한다. 또한, 여기서 「인플루엔자 B형 바이러스와는 실질적으로 항원 항체 반응하지 않는다」란, 인플루엔자 B형 바이러스의 핵 단백질을 비롯하여, 상기 바이러스의 각 구성 요소의 단백질과 실질적으로 항원 항체 반응하지 않는다는 의미이다. 바람직한 형태에서는, 본 발명의 모노클로날 항체는 인플루엔자 C형 바이러스와도 실질적으로 반응하지 않는다. As mentioned above, the monoclonal antibodies of the present invention do not substantially react with antigenic antibodies against influenza B virus. The term "substantially does not react with antigen antibody" means that the degree of response is clearly weaker than that of the antigen antibody with influenza type A virus, even if the antibody does not react with the antibody or generates an antigen antibody reaction at a detectable level. Not reacting the virus with the antigen antibody means that it only reacts to the extent apparent to those skilled in the art. In addition, "an antigen antibody does not react substantially with influenza B virus" here means that it does not react substantially with the antibody of the protein of each component of the said virus, including the nuclear protein of the influenza B virus. In a preferred form, the monoclonal antibodies of the invention do not substantially react with influenza C virus.
바람직한 형태에서는, 본 발명의 모노클로날 항체는, 인플루엔자 A형 바이러스의 핵 단백질의 아미노산 서열의 59번째의 아미노산 잔기(이하, 「59aa」와 같이 기재)로부터 130aa의 아미노산 영역 내의 에피토프와 반응한다. 인플루엔자 A형 바이러스의 핵 단백질의 아미노산 서열은 이미 공지되어 있고, 예를 들면 진뱅크 (GeneBank) 등록 번호 ITY238021 등으로 기재되어 있다. 인플루엔자 A형 바이러스의 다양한 아형 핵 단백질의 59aa 내지 140aa의 아미노산 서열을 도 5에 나타낸다. 또한, 바람직한 형태에서는, 본 발명의 모노클로날 항체는 각 아형의 인플루엔자 A형 바이러스의 핵 단백질과 항원 항체 반응하기 때문에, 도 5에 나타내는 아미노산 서열 중 공통되는 배열을 가지고, 친수성 구조를 갖는, 예를 들면 90aa 내지 95aa, 111aa 내지 115aa 또는 120aa 내지 123aa 등의 영역 또는 이들 각 영역을 포함하고, 또한 공통되는 배열을 갖는 영역을 에피토프로 하는 것이다. In a preferred embodiment, the monoclonal antibody of the present invention reacts with an epitope within the amino acid region of 130aa from the 59th amino acid residue (hereinafter described as "59aa") of the amino acid sequence of the nuclear protein of influenza type A virus. The amino acid sequences of nuclear proteins of influenza A viruses are already known and are described, for example, in GeneBank Accession No. ITY238021 and the like. The amino acid sequences of 59aa to 140aa of various subtype nuclear proteins of influenza A virus are shown in FIG. 5. In a preferred embodiment, since the monoclonal antibody of the present invention reacts with the nuclear protein of each subtype of influenza A virus, the antibody has a common sequence among the amino acid sequences shown in FIG. 5 and has a hydrophilic structure. For example, a region including 90aa to 95aa, 111aa to 115aa, or 120aa to 123aa, or each of these regions and having a common arrangement is used as an epitope.
바람직한 형태에서는, 본 발명의 모노클로날 항체는, 인플루엔자 A형 바이러스의 각 아형의 핵 단백질과 항원 항체 반응한다. 즉, 인플루엔자 A형 바이러스는 그 바이러스 입자 표면에 헤마글루티닌(H)과 뉴라미니다제(N)를 갖지만, 이들 H 및 N의 구조의 차이에 의해 다양한 아형으로 분류되어 있다. 본 발명의 모노클로날 항체는, 바람직하게는 적어도 다음의 아형 핵 단백질과 항원 항체 반응하는 것이고, 더욱 바람직하게는 공지된 모든 인플루엔자 A형 바이러스의 아형의 핵 단백질과 항원 항체 반응한다. H1N1, H2N2, H3N2, H3N8, H4N6, H5N2, H6N2, H7N7, H8N4, H9N2, H10N7, H11N6, H12N5, H13N6, H14N5, H15N8, H5N1. In a preferred embodiment, the monoclonal antibody of the present invention reacts with the nuclear protein of each subtype of influenza A virus and the antigen antibody. That is, influenza type A viruses have hemagglutinin (H) and neuraminidase (N) on the surface of the virus particles, but are classified into various subtypes due to differences in the structures of these H and N. The monoclonal antibody of the present invention is preferably an antigen antibody reaction with at least the following subtype nuclear proteins, and more preferably antigen antibody reactions with nuclear proteins of all known subtypes of influenza type A virus. H1N1, H2N2, H3N2, H3N8, H4N6, H5N2, H6N2, H7N7, H8N4, H9N2, H10N7, H11N6, H12N5, H13N6, H14N5, H15N8, H5N1.
또한, 바람직한 형태에서는, 본 발명의 모노클로날 항체는 인플루엔자와 증상이 적어도 부분적으로 유사한 다른 감염증의 병원체와도 실질적으로 항원 항체 반응하지 않는다. 예를 들면, 아데노 바이러스(1 내지 7형), 코쿠사키 바이러스(A16, B1 내지 B6형), 단순 헤르페스 바이러스 1형, 에코 바이러스(3형, 4형, 7형, 22형, 30형), 엔테로 바이러스(71형), 문프스 바이러스, 폴리오 바이러스(1 내지 3형), RS 바이러스(서브그룹 A, 서브그룹 B), 파라인플루엔자 바이러스(1 내지 3형), 대장균, 폐렴간균, 녹농균, 영균, 표피 포도 구균, 변형균, 황색 포도 구균, 코리네 박테리아, 디프테리아, 칸디다ㆍ알비칸스, 화농 연쇄 구균, 스트렙토코커스속(그룹 B, C, G, F), 폐렴 연쇄 구균, 헤모필루스속 인플루엔자, 리스테리아ㆍ모노사이토게네스, 폐렴 마이코플라즈마, 클라미디아ㆍ트라코마티스, 클라미디아ㆍ뉴모 니에와 실질적으로 항원 항체 반응하지 않는다. Furthermore, in a preferred form, the monoclonal antibodies of the invention do not substantially react with the antigenic antibodies of influenza and other infectious agents, at least in part, having similar symptoms. For example, adenovirus (1-7), Kokusaki virus (A16, B1-B6),
또한, 주지된 바와 같이, 항체를 파파인 분해나 펩신으로 분해함으로써, Fab 단편이나 F(ab')2 단편과 같은, 대응 항원과의 결합성을 갖는 항체 단편(본 발명 명세서에 있어서 「항원 결합성 단편」이라 함)이 얻어지는 것이 알려져 있으며, 본 발명의 모노클로날 항체의 항원 결합성 단편도 본 발명의 모노클로날 항체와 동일하게 사용할 수 있고, 본 발명의 범위 내에 포함된다 .In addition, as is well known, antibody fragments having binding to a corresponding antigen, such as Fab fragments or F (ab ') 2 fragments, by digesting the antibody with papain digestion or pepsin ("antigen binding" Fragments ”, and the antigen-binding fragments of the monoclonal antibodies of the present invention can be used in the same manner as the monoclonal antibodies of the present invention and are included within the scope of the present invention.
본 발명의 모노클로날 항체는 인플루엔자 A형 바이러스의 핵 단백질을 면역원으로 하여 통상법인 하이브리도마법에 의해 제조할 수 있다. 면역원로서 이용되는 인플루엔자 A형의 핵 단백질로서는, 핵 단백질이 다량으로 존재하고, 그 면역원 작용을 발휘할 수 있으면, 배양 바이러스액, 인플루엔자 HA 백신, HI용 HA 항원, 재조합 항원이 모두 사용 가능하다. 항원에 포함되는 면역원성이 높은 HA나 NA의 작용을 억제하기 위해서, 초원심에 의한 핵 단백질 정제(예를 들면 문헌[J. Biochem.; 102: 1241-1249, 1987] 참조)나 프로테아제 처리(예를 들면 문헌[J. Immunol. Methods; 180: 107-116, 1995] 참조)를 한 항원을 사용할 수 있다. The monoclonal antibody of the present invention can be produced by the hybridoma method, which is a common method, using a nuclear protein of an influenza type A virus as an immunogen. As a nuclear protein of influenza type A used as an immunogen, if a large amount of nuclear protein is present and the immunogenic effect can be exerted, culture virus fluid, influenza HA vaccine, HI antigen for HI, and recombinant antigen can be used. In order to suppress the action of high immunogenic HA or NA contained in the antigen, ultracentrifugal nuclear protein purification (see, eg, J. Biochem .; 102: 1241-1249, 1987) or protease treatment ( For example, the antigen of J. Immunol. Methods; 180: 107-116, 1995) can be used.
상기 모노클로날 항체는, 상기 인플루엔자 A형 바이러스의 핵 단백질을 포함하는 항원을 면역원으로서 이용하여 동물을 면역시키고, 그 인플루엔자 A형 바이러스 모노클로날 항체 생산 세포와 종양 세포를 세포 융합시킴으로써 얻어지는 하이브리도마에 의해 생산할 수 있다. The monoclonal antibody is a hybrid obtained by immunizing an animal using an antigen containing a nuclear protein of the influenza type A virus as an immunogen, and cell fusion of the influenza type A virus monoclonal antibody producing cell with a tumor cell. Can be produced by cutting board.
상기 하이브리도마는 하기의 방법으로 얻을 수 있다. 즉, 상술한 바와 같이 하여 얻은 상기 항원의 인플루엔자 A형 바이러스 핵 단백질을 프로인트의 완전 보조제와 함께 수회로 나누어 마우스 등의 동물에게, 2 내지 3 주의 간격으로 복강 내 또는 정맥 투여함으로써 면역시킨다. 계속해서, 비장 등에서 유래하는 항체 생산 세포와, 골수종 라인에서의 세포(미엘로마 세포) 등의 시험관 내에서 증식 가능한 종양 세포를 융합시킨다. The hybridoma can be obtained by the following method. That is, the influenza A virus nuclear protein of the antigen obtained as described above is divided into several times with Freund's complete adjuvant and immunized to animals such as mice by intraperitoneal or intravenous administration at intervals of 2 to 3 weeks. Subsequently, antibody-producing cells derived from the spleen and the like and tumor cells that can proliferate in vitro, such as cells (myeloma cells) in the myeloma line, are fused.
상기 융합 방법으로서는, 케러와 밀슈타인의 통상법(문헌[네이쳐(Nature), 256권, 495 페이지, 1975년])에 따라서 폴리에틸렌글리콜에 의해 행하거나, 또는 센다이 바이러스에 의해 행할 수 있다. As said fusion method, it can carry out by polyethyleneglycol or Sendai virus according to the conventional method of Kerr and Milstein (Nature, 256, 495 pages, 1975).
상기 융합한 세포로부터 인플루엔자 A형 바이러스 핵 단백질을 인식하는 항체를 생산하는 하이브리도마를 선택하는 방법으로서는, 예를 들면 이하와 같이 하여 행할 수 있다. 즉, 상기 융합한 세포로부터, 한계 희석법에 의해서 HAT 배지 및(또는) HT 배지 중에서, 생존하고 있는 세포를 하이브리도마로서 선택할 수 있다. 계속해서, 상기 하이브리도마의 배양 배지를, 고순도로 정제한 인플루엔자 A형 바이러스 핵 단백질을 고정화한 분석 플레이트 상에서 반응시킨 후, 항 마우스 면역 글로불린(Ig) 등과 더욱 반응시키는 EIA법 등에 의해서, 인플루엔자 A형 바이러스 핵 단백질을 특이적으로 인식하는 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마를 선택할 수 있다. As a method of selecting the hybridoma which produces the antibody which recognizes the influenza type A viral nuclear protein from the said fusion cell, it can carry out as follows, for example. That is, the living cells can be selected as hybridomas from the fused cells in the HAT medium and / or the HT medium by the limiting dilution method. Subsequently, influenza A is reacted with the hybridoma culture medium on an assay plate immobilized with high purity purified influenza A virus nuclear protein, followed by further reaction with anti-mouse immunoglobulin (Ig) or the like. Hybridomas that produce monoclonal antibodies that specifically recognize type viral nuclear proteins can be selected.
하기 실시예에서, 본 발명의 바람직한 모노클로날 항체가 복수개 얻어지고, 그 중 3종을 각각 하이브리도마 FVA2-3, 하이브리도마 FVA2-6 및 하이브리도마 FVA2-11이라고 명명하였다. 이들 하이브리도마는 독립 행정 법인 산업 기술 종합 연구소 특허 생물 기탁 센터(일본 이바라끼껭 쯔꾸바시 히가시 1쪼메 1반지 1,주오우 다이6)에, 하이브리도마 FVA2-3은 식별 표시 FVA2-3, 수탁 번호 FERM BP-1 0066(수탁일; 2003년 7월 18일, 2004년 7월 14일에 국내 기탁 FERM P-19437로부터 국제 기탁으로 이관)으로서, 하이브리도마 FVA2-6은 식별 표시 FVA2-6, 수탁 번호 FERM BP-10067(수탁일; 2003년 7월 18일, 2004년 7월 14일에 국내 기탁 FERM P-19438로부터 국제 기탁으로 이관)로서, 및 하이브리도마 FVA2-11은 식별 표시 FVA2-11, 수탁 번호 FERM BP-10068(수탁일; 2003년 7월 18일, 2004년 7월 14일에 국내 기탁 FERM P-19439로부터 국제 기탁으로 이관)로서 각각 부다페스트 조약에 기초하여 국제 기탁되어 있다. In the following examples, a plurality of preferred monoclonal antibodies of the present invention were obtained, three of which were named hybridoma FVA2-3, hybridoma FVA2-6, and hybridoma FVA2-11, respectively. These hybridomas are independence administrative corporation industrial technology synthesis institute patent biological deposit center (1, 1, 1 Higashi, Tsukubashi-shi, Ibaraki,
상기 각 하이브리도마는 통상 세포 배양에 이용되는 배지에서 배양하여 배양 상청으로부터 모노클로날 항체를 회수할 수 있다. 또한, 하이브리도마가 유래하는 동물에게 투여함으로써, 복수(復水)를 저류(貯留)시켜 이 복수로부터 회수할 수도 있다. Each of the hybridomas can be cultured in a medium usually used for cell culture to recover monoclonal antibodies from the culture supernatant. In addition, by administering to an animal from which hybridomas are derived, the ascites can be stored and recovered from the ascites.
상기 모노클로날 항체의 회수 방법으로서는, 통상 행해지는 정제 방법을 사용할 수 있고, 예를 들면 겔 여과 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 단백질 A에 의한 친화성 크로마토그래피 등을 예로 들 수 있다. As a recovery method of the said monoclonal antibody, the purification method normally performed can be used, For example, gel filtration chromatography, ion exchange chromatography, affinity chromatography by Protein A, etc. are mentioned.
상기 방법에 따라서 제조된 모노클로날 항체는 인플루엔자 A형 바이러스의 핵 단백질과 반응하고, 인플루엔자 A형 바이러스의 각종 바이러스주와 반응하는 것이 확인되었다. 현재 보존되며 입수 가능한, 인간, 말, 오리, 칠면조, 바다표범, 닭, 갈매기, 청둥오리 등의 인플루엔자 A형 바이러스 보존주 38종(이하의 표 3을 참조)와는 반응하고, 본 발명의 모노클로날 항체로 검출 가능하였다. 한편, 교차 반응성을 생각할 수 있는 미생물로서, 예를 들면 아데노 바이러스(1 내지 7형), 코쿠사키 바이러스(A16, B1 내지 B6형), 단순 헤르페스 바이러스 1형, 에코 바이러스(3형, 4형, 7형, 22형, 30형), 엔테로 바이러스(71형), 문프스 바이러스, 폴리오 바이러스(1 내지 3형), RS 바이러스(서브그룹 A, 서브그룹 B), 파라인플루엔자 바이러스(1 내지 3형), 대장균, 폐렴간균, 녹농균, 영균, 표피 포도 구균, 변형균, 황색 포도 구균, 코리네 박테리아, 디프테리아, 칸디다ㆍ알비칸스, 화농 연쇄 구균, 스트렙토코커스속(그룹 B, C, G, F), 폐렴 연쇄 구균, 헤모필루스속 인플루엔자, 리스테리아ㆍ모노사이토게네스, 폐렴 마이코플라즈마, 클라미디아ㆍ트라코마티스, 클라미디아ㆍ뉴모니에 등과의 반응성을 확인하였지만, 반응은 확인되지 않았다. The monoclonal antibodies prepared according to the above method were confirmed to react with nuclear proteins of influenza A virus and to react with various virus lines of influenza A virus. Reacts with 38 species of influenza type A virus stocks (see Table 3 below), such as humans, horses, ducks, turkeys, seals, chickens, gulls and mallards, which are currently conserved and available Detectable with raw antibody. On the other hand, as microorganisms that can be considered cross-reactive, for example, adenoviruses (
본 발명의 모노클로날 항체는 인플루엔자 A형 바이러스의 검출 또는 정량을 위한 면역 측정에 사용할 수 있다. 면역 측정 방법 자체는 주지되어 있고, 주지된 어느 면역 측정 방법도 채용할 수 있다. 즉, 측정 형식으로 분류하면, 샌드위치법, 경합법, 응집법, 웨스턴 블롯법 등이 있고, 사용되는 표지로 분류하면, 형광법, 효소법, 방사법, 비오틴법 등이 있으며, 이들 모두 사용할 수 있다. 또한, 면역 조직 염색에 의해서 진단할 수도 있다. 면역 측정 방법에 표지 항체를 이용하는 경우, 항체의 표지 방법 자체는 주지되어 있고, 주지된 어떤 방법도 채용할 수 있다. 또한, 주지된 바와 같이, 항체를 파파인 분해나 펩신으로 분해함으로써, Fab 단편이나 F(ab')2 단편과 같은, 대응 항원과의 결합성을 갖는 항체 단편(본 발명 명세서에 있어서 「항원 결합성 단편」이라 함)이 얻어지는 것이 알려져 있으며, 본 발명의 모노클로날 항체의 항원 결합성 단편도 본 발명의 항체와 동일하게 사용할 수 있다. The monoclonal antibodies of the invention can be used for immunoassays for the detection or quantification of influenza type A viruses. The immunoassay method itself is well-known, and any well-known immunoassay method can be employ | adopted. That is, when classified into the measurement format, there are a sandwich method, a competition method, an aggregation method, a western blot method, and the like, and when classified by the label used, there are a fluorescence method, an enzyme method, a radiation method, a biotin method, and the like. It can also be diagnosed by immunohistostaining. When a labeling antibody is used for the immunoassay method, the labeling method of the antibody itself is well known, and any well-known method can be adopted. In addition, as is well known, antibody fragments having binding to a corresponding antigen, such as Fab fragments or F (ab ') 2 fragments, by digesting the antibody with papain digestion or pepsin ("antigen binding" Fragments ”are known, and antigen-binding fragments of the monoclonal antibodies of the present invention can be used in the same manner as the antibodies of the present invention.
또한, 이들 면역 측정법 자체는 주지되어 있고, 본 명세서에서 설명할 필요는 없지만, 간단하게 기재하면, 예를 들면 샌드위치법에서는, 본 발명의 항체 또는 그의 항원 결합성 단편을 제1 항체로서 고상에 부동화하여, 검체와 반응시키고, 세정 후, 본 발명의 효소와 항원 항체 반응하는 제2 항체를 반응시키며, 세정 후, 고상에 결합된 제2 항체를 측정한다. 제2 항체를 효소, 형광 물질, 방사성 물질, 비오틴 등으로 표지해 둠으로써 고상에 결합된 제2 항체를 측정할 수 있다. 예정된 농도의 복수개의 표준 시료에 대하여 상기 방법에 의해 측정하고, 측정된 표지량과 표준 시료 중의 본 발명의 효소의 관계에 기초하여 검량선을 작성하며, 미지 농도의 피검 시료에 대한 측정 결과를 이 검량선에 적용시킴으로써, 피검 시료 중의 본 발명의 효소를 정량할 수 있다. 또한, 제1 항체와 제2 항체를 상기 설명으로 대체할 수도 있다. 또한, 응집법에서는, 라텍스 등의 입자에 본 발명의 항체 또는 그의 항원 결합성 단편을 부동화하고, 검체와 반응시켜 흡광도를 측정한다. 예정된 농도의 복수개의 표준 시료에 대하여 상기 방법에 의해 측정하고, 측정된 표지량과 표준 시료 중의 본 발명의 효소의 관계에 기초하여 검량선을 작성하며, 미지 농도의 피검 시료에 대한 측정 결과를 이 검량선에 적용시킴으로써, 피검 시료 중의 본 발명의 효소를 정량할 수 있다. In addition, these immunoassays themselves are well known and need not be described herein, but simply described, for example, in the sandwich method, the antibody or antigen-binding fragment thereof of the present invention is immobilized on a solid phase as a first antibody. The reaction is carried out with the sample, and after washing, the second antibody reacting with the enzyme of the present invention and the antigen antibody is reacted. After washing, the second antibody bound to the solid phase is measured. The second antibody bound to the solid phase can be measured by labeling the second antibody with enzymes, fluorescent materials, radioactive materials, biotin, and the like. A plurality of standard samples of predetermined concentrations were measured by the above-described method, and a calibration curve was prepared based on the relationship between the measured labeled amount and the enzyme of the present invention in the standard sample, and the measurement results for the test sample having an unknown concentration were measured. By applying to, the enzyme of the present invention in the test sample can be quantified. In addition, the first antibody and the second antibody may be replaced by the above description. In the aggregation method, the antibody or antigen-binding fragment thereof of the present invention is immobilized on particles such as latex, and reacted with a sample to measure absorbance. A plurality of standard samples of predetermined concentrations were measured by the above-described method, and a calibration curve was prepared based on the relationship between the measured labeled amount and the enzyme of the present invention in the standard sample, and the measurement results for the test sample having an unknown concentration were measured. By applying to, the enzyme of the present invention in the test sample can be quantified.
본 발명은 또한, 상기 본 발명의 모노클로날 항체를 이용하여, 인플루엔자 A형 바이러스를 간편하게, 또한 인플루엔자 B형 바이러스와 식별하여 검출할 수 있는 면역 측정 기구도 제공한다. The present invention also provides an immunoassay apparatus capable of identifying and detecting influenza type A virus simply and influenza type B virus using the monoclonal antibody of the present invention.
본 발명의 면역 측정 기구는, 이동 가능한 표지 항-인플루엔자 A형 바이러스 항체를 갖는 표지 시약 존, 검체 점착 존, 전개액 공급 존, 전개액 흡수 존, 및 항-인플루엔자 A형 바이러스 항체를 매트릭스에 부동화시킨 인플루엔자 A형 바이러스 검출 존을 매트릭스에 설치한 기구이며, 상기 표지 항-인플루엔자 A형 바이러스 항체 및 검출 존에 부동화한 항-인플루엔자 A형 바이러스 항체 중 하나 이상의 항체가 상기 본 발명의 모노클로날 항체인 면역 측정 기구이다. 검체 점착 존에 점착된 검체는 표지 시약 존에 함유되는 표지 항체와 항원 항체 반응하여, 표지된 항원 항체 복합물이 형성된다. 상기 항원 항체 복합물은 전개액 공급 존에서 공급된 전개액에 의해 흘러, 인플루엔자 A형 바이러스 검출 존에 이른다. 여기서, 매트릭스에 부동화된 항-인플루엔자 A형 바이러스 항체와, 상기 표지 항원 항체 복합물이 항원 항체 반응하여, 상기 표지 항원 항체 복합물이 매트릭스에 부동화된다. 인플루엔자 A형 바이러스 검출 존에 표지 항원 항체 복합물이 부동화되었는가 아닌가는, 표지의 유무에 의해 판정된다. 또한, 인플루엔자 A형 바이러스 검출 존을 통과한 전개액은 전개액 흡수 존에 흡수된다. 또한, 검체 점착 존과 표지 시약 존은 동일할 수도 있다(이 경우, 검체는 표지 시약 존에 점착됨). 본 발명의 면역 측정 기구에서는, 표지 항체 또는 인플루엔자 A형 바이러스 검출 존에 부동화된 항체 중 어느 하나 이상이 본 발명의 모노클로날 항체이다. 또한, 하나의 항체는 폴리클로날 항체일 수도 있다. 또한, 인플루엔자 A형 바이러스의 핵 단백질은 통상, 복수개의 분자가 회합 내지 부착되어 있기 때문에, 표지 항체 또는 인플루엔자 A형 바이러스 검출 존에 부동화된 항체의 양자(兩者)가 동일한 모노클로날 항체라도 인플루엔자 A형 바이러스를 검출할 수 있다. The immunoassay apparatus of the present invention immobilizes a label reagent zone, a sample adhesion zone, a developer supply zone, a developer absorbing zone, and an anti-influenza A virus antibody with a movable label anti-influenza A virus antibody on the matrix. The above-described influenza type A virus detection zone is provided in a matrix, and at least one antibody of the labeled anti-influenza type A virus antibody and the anti-influenza type A virus antibody immobilized in the detection zone is the monoclonal antibody of the present invention. It is an immunoassay instrument. The sample adhering to the sample adhesion zone reacts with the labeled antibody contained in the labeling reagent zone and the antigen antibody, thereby forming a labeled antigen antibody complex. The antigen antibody complex flows by the developing solution supplied from the developing solution supply zone to reach the influenza type A virus detection zone. Here, an anti-influenza type A virus antibody immobilized on a matrix and the labeled antigen antibody complex react with an antigen antibody, and the labeled antigen antibody complex is immobilized on the matrix. Whether or not the labeled antigen antibody complex is immobilized in the influenza A virus detection zone is determined by the presence or absence of a label. In addition, the developing solution having passed through the influenza A virus detection zone is absorbed into the developing solution absorption zone. Also, the sample sticking zone and the labeling reagent zone may be the same (in this case, the sample sticks to the labeling reagent zone). In the immunoassay apparatus of the present invention, any one or more of the labeled antibody or the antibody immobilized in the influenza A virus detection zone is the monoclonal antibody of the present invention. In addition, one antibody may be a polyclonal antibody. In addition, since nuclear molecules of influenza type A viruses are usually associated with or attached to a plurality of molecules, even in the case of monoclonal antibodies having the same immobilized label antibody or antibody immobilized in the influenza type A virus detection zone, influenza Type A viruses can be detected.
이하, 본 발명의 면역 측정 기구의 각 구성 요건에 대하여 나누어 설명한다. Hereinafter, each structural requirement of the immunoassay apparatus of this invention is demonstrated separately.
매트릭스matrix
본 발명의 면역 측정 기구에 있어서의 벨트상의 매트릭스는 모세관 작용에 의해서 액체를 수액 가능한 흡수성 재료로 구성된다. 이 흡수성 재료로서는, 예를 들면 셀룰로오스, 니트로셀룰로오스 등의 셀룰로오스 또는 그의 유도체, 유리 섬유 등을 단독 또는 혼합하여 제조한 여과지, 막, 다공성 재료이다. 이 매트릭스의 크기에 제한은 없지만, 폭 3 mm 내지 10 mm 정도, 길이 30 mm 내지 100 mm 정도의 스트립상의 것이 취급이 용이하여 바람직하다. 매트릭스의 두께는 100 ㎛ 내지 1 mm인 것을 사용할 수 있다. 또한, 매트릭스는 그의 일부 또는 전체를 측정시에 검체 유래의 단백질의 매트릭스에의 비특이 반응에 의한 흡착을 방지하기 위해서, 예를 들면 소혈청 알부민(BSA) 등의 동물 혈청, 카제인, 수크로오스 등으로 블로킹하여 사용할 수 있다. The belt-like matrix in the immunoassay device of the present invention is composed of an absorbent material capable of injecting liquid by capillary action. As this absorbent material, it is a filter paper, a film | membrane, and a porous material which produced the cellulose, such as cellulose and nitrocellulose, its derivatives, glass fiber, etc. individually or in mixture. There is no limitation on the size of the matrix, but strips having a width of about 3 mm to 10 mm and a length of about 30 mm to 100 mm are preferable because they are easy to handle. The thickness of the matrix may be 100 μm to 1 mm. In order to prevent adsorption by nonspecific reaction of the sample-derived protein to the matrix at the time of measuring a part or the whole thereof, the matrix is made of animal serum such as bovine serum albumin (BSA), casein, sucrose or the like. It can block and use.
검출 존Detection zone
검출 존에는, 상기 매트릭스 상에 항-인플루엔자 A형 바이러스 항체를 부동화한 인플루엔자 A형 바이러스 검출부를 설치할 수 있다. 이 검출부에 부동화되는 항-인플루엔자 A형 바이러스 항체는, 후술하는 표지 항-인플루엔자 A형 바이러스 항체와 함께, 하나 이상이 본 발명의 항-인플루엔자 A형 바이러스 모노클로날 항체이고, 양방(兩方)의 항체가 항-인플루엔자 A형 바이러스 모노클로날 항체인 것이 바람직하다. 검출부의 상기 인플루엔자 A형 바이러스 항체는 매트릭스 상에 있고, 매트릭스를 전개하는 액체의 수액 방향(매트릭스의 길이 방향)에 직교하는 방향으로 라인상으로 설치하는 것이 양호한 감도로 측정하기 위해서는 바람직하다. 항-인플루엔자 A형 바이러스 폴리클로날 항체로서는, 시판되며 쉽게 입수 가능한 폴리클로날 항체로부터 적절하게 선택하여 사용할 수 있다. In the detection zone, an influenza type A virus detection unit immobilized with an anti-influenza type A virus antibody can be provided on the matrix. The anti-influenza type A virus antibody immobilized to this detection part is an anti-influenza type A virus monoclonal antibody of the present invention, together with a labeled anti-influenza type A virus antibody described below, and both It is preferred that the antibody of is an anti-influenza type A virus monoclonal antibody. The influenza A virus antibody on the detection unit is preferably on a matrix, and it is preferable to provide a line with a direction orthogonal to the transfusion direction (the longitudinal direction of the matrix) of the liquid that develops the matrix, in order to measure with good sensitivity. As the anti-influenza A virus polyclonal antibody, it is possible to appropriately select and use from commercially available and readily available polyclonal antibodies.
이 검출 존의 항-인플루엔자 A형 바이러스 항체는 상기한 항체이고, 모노클로날 항체를 단독 또는 혼합하여 사용할 수도 있다. 항-인플루엔자 A형 바이러스 항체는 IgG 항체, IgM 항체, 또한 이들 항체의 항원 결합성 단편인 Fab, F(ab')2 등일 수도 있다. The anti-influenza A virus antibody in this detection zone is the above-mentioned antibody, and monoclonal antibodies may be used alone or in combination. The anti-influenza type A virus antibody may be an IgG antibody, an IgM antibody, or Fab, F (ab ') 2, and the like, which are antigen binding fragments of these antibodies.
검출부에 부동화되는 항-인플루엔자 A형 바이러스 항체는 직접 매트릭스의 검출 존에 물리 흡착시킬 수도 있지만, 공유 결합 등의 화학 결합에 의해서 고정함으로써 설치할 수도 있다. 또한, 항-인플루엔자 A형 바이러스 항체를 수불용성의 담체에 결합시키고, 이것을 매트릭스 내에 함유시킬 수도 있다. 이 불용성의 담체로서는, 젤라틴, 아라비아 고무 및 헥사메타인산나트륨을 포함하는 혼합물을 불용화하여 얻어지는 입자(일본 특허 공고 (소)63-29223), 폴리스티렌 라텍스 입자, 유리 섬유 등을 들 수 있다. 불용성의 담체와 항-인플루엔자 A형 바이러스 모노클로 날 항체를 결합시키기 위해서는, 상기 화학 결합 또는 물리 흡착에 의해 결합시킬 수 있다. The anti-influenza A virus antibody immobilized on the detection unit may be physically adsorbed directly to the detection zone of the matrix, or may be installed by immobilization by chemical bonds such as covalent bonds. It is also possible to bind an anti-influenza A virus antibody to a water insoluble carrier and to contain it in a matrix. Examples of this insoluble carrier include particles obtained by insolubilizing a mixture containing gelatin, gum arabic and sodium hexametaphosphate (Japanese Patent Publication No. 63-29223), polystyrene latex particles, glass fibers and the like. In order to bind an insoluble carrier and an anti-influenza type A virus monoclonal antibody, it may be bound by the above chemical bonding or physical adsorption.
검출 존에는, 항-인플루엔자 A형 바이러스 항체에 의한 인플루엔자 A형 바이러스 검출부 이외에, 항-인플루엔자 B형 바이러스 항체에 의한 인플루엔자 B형 바이러스 검출부를 설치할 수 있다. 이 인플루엔자 B형 바이러스 검출부는, 상기 인플루엔자 A형 바이러스 검출부의 근방이면, 전개액의 수액 방향에서 상기 인플루엔자 A형 바이러스 검출부 상류측 또는 하류측 중 어느 것일 수도 있다. 인플루엔자 B형 바이러스 검출 존에 부동화되는 항-인플루엔자 B형 바이러스 항체는 폴리클로날 항체 또는 모노클로날 항체일 수 있으며, 상기 항-인플루엔자 A형 바이러스 항체와 동일하게 화학 결합 또는 물리 흡착에 의해서 매트릭스에 부동화될 수 있다. In addition to the influenza type A virus detection unit by the anti-influenza type A virus antibody, the detection zone can be equipped with the influenza type B virus detection unit by the anti-influenza B virus antibody. The influenza B virus detection unit may be either upstream or downstream of the influenza A virus detection unit in the transfusion direction of the developing solution as long as the influenza B virus detection unit is in the vicinity of the influenza A virus detection unit. The anti-influenza B virus antibody immobilized in the influenza B virus detection zone may be a polyclonal antibody or a monoclonal antibody, and in the same manner as the anti-influenza A virus antibody, may be added to the matrix by chemical bonding or physical adsorption. Can be immobilized.
상기한 바와 같이, 매트릭스 상의 검출 존에는, 적어도 항-인플루엔자 A형 바이러스 항체에 의한 인플루엔자 A형 바이러스의 검출부를 설치하고, 또한 인플루엔자 B형 바이러스의 검출부를 설치하는 것이, 인플루엔자 A형 바이러스 및 인플루엔자 B형 바이러스를 동시에 측정하는 데에 바람직하다. 이들 검출부는, 매트릭스의 수액 방향에서, 효소 표지 시약 존, 검체 점착 존 및 전개액 공급 존의 하류측이며, 첨가액 흡수 존의 상류측이다. 검출부는, 매트릭스에 폭 0.5 mm 내지 5 mm 정도의 라인상으로 근접하여 복수개의 라인을 설치할 수 있다. 폭 5 mm 정도의 매트릭스이면, 상기 항체 및 항원을 통상 각각 0.1 ㎍ 내지 10 ㎍ 정도 점착하여, 건조시킴으로써 검출부를 제조할 수 있다. As described above, at least a detection unit for influenza A virus by an anti-influenza A virus antibody and a detection unit for influenza B virus are provided in the detection zone on the matrix. Influenza A virus and influenza B It is desirable to measure virus simultaneously. These detection parts are downstream of the enzyme labeling reagent zone, the sample adhesion zone, and the developing solution supply zone in the aqueous solution direction of the matrix, and are upstream of the additive liquid absorption zone. The detection unit may provide a plurality of lines in proximity to the matrix on a line having a width of about 0.5 mm to about 5 mm. If it is a matrix about 5 mm wide, a detection part can be manufactured by adhering said antibody and antigen normally about 0.1 microgram-10 micrograms, respectively, and drying them.
표지 시약 존Labeling Reagent Zone
표지 시약 존은, 매트릭스 상에 설치된 존에 표지 항-인플루엔자 A형 바이러스 항체를 이동 가능하게 점착하여 설치할 수 있다. 이 존은 전개액 공급 존에서의 전개액의 수액 방향에서 상기 검출 존의 상류측에 설치할 수 있다. 이 존은, 매트릭스에 효소 표지 시약을 점착하는 방법, 효소 표지 시약을 포함하는 흡수성 패드를 매트릭스 상에 적층하는 방법, 또는 패드와 밀착하는 매트릭스 부분의 일부 또는 전부에 패드와 함께 효소 표지 시약을 함유시킴으로써 구성된다. 흡수성 패드로서는, 후술하는 검체 점착 존의 패드를 사용할 수 있다. The labeled reagent zone can be installed by movably attaching a labeled anti-influenza A virus antibody to a zone provided on the matrix. This zone can be provided upstream of the detection zone in the transfusion direction of the developing solution in the developing solution supply zone. This zone contains the enzyme labeling reagent along with the pad in a method of adhering the enzyme labeling reagent to the matrix, laminating an absorbent pad containing the enzyme labeling reagent on the matrix, or in part or all of the portion of the matrix that adheres to the pad. It is configured by. As a water absorbing pad, the pad of the sample adhesion zone mentioned later can be used.
표지 항-인플루엔자 A형 바이러스 항체의 항체로서는, 상기 검출 존에 설치되는 항체와 함께, 적어도 하나가 항-인플루엔자 A형 바이러스 모노클로날 항체이고, 양방의 항체가 항-인플루엔자 A형 바이러스 모노클로날 항체인 것이 바람직하다. 표지 항-인플루엔자 A형 바이러스 항체의 항체로서는, 상기 검출 존의 항체와 동일하게 그의 단편을 사용할 수도 있다. As an antibody of a label anti-influenza type A virus antibody, at least one is an anti-influenza type A virus monoclonal antibody, and both antibodies are anti-influenza type A virus monoclonal with the antibody provided in the said detection zone. It is preferable that it is an antibody. As an antibody of a labeled anti-influenza A virus antibody, its fragment can be used similarly to the antibody of the said detection zone.
상기 표지 항-인플루엔자 A형 바이러스 항체는 상기 항체와 표지물을 결합시켜 제조할 수 있다. 표지물로서는, 효소, 금속 콜로이드 입자, 착색 라텍스 입자, 발광 물질, 형광 물질 등을 들 수 있다. 효소로서는 효소 면역 측정법(EIA)에 사용되는 각종 효소이고, 그 효소로서는 예를 들면 알칼리 포스파타제, 퍼옥시다제, β-D-갈락토시다아제 등을 들 수 있다. 또한, 금속 콜로이드 입자로서는, 예를 들면 금 콜로이드 입자, 셀레늄 콜로이드 입자 등을 사용할 수 있다. The labeled anti-influenza type A virus antibody can be prepared by combining the antibody with a label. Examples of the label include enzymes, metal colloidal particles, colored latex particles, light emitting substances, fluorescent substances, and the like. Examples of the enzymes include various enzymes used in the enzyme immunoassay (EIA), and examples of the enzymes include alkali phosphatase, peroxidase, β-D-galactosidase, and the like. As the metal colloidal particles, for example, gold colloidal particles, selenium colloidal particles and the like can be used.
또한, 표지물과 항-인플루엔자 A형 바이러스 항체와의 결합 방법은 공지된 공유 결합 또는 비공유 결합을 만드는 방법을 이용하여 제조할 수 있다. 결합 방 법에는, 예를 들면 글루타르알데히드법, 과요오드산법, 말레이미드법, 피리딜ㆍ디술피드법, 각종 가교제를 사용하는 방법 등을 들 수 있다(예를 들면 문헌[「단백질 핵산 효소」 별책 31호, 37 내지 45 페이지(1985)] 참조). 가교제를 사용하는 결합 방법으로서는, 가교제로서, 예를 들면 N-숙신이미딜-4-말레이미드부티르산(GMBS), N-숙신이미딜-6-말레이미드헥산산, N-숙신이미딜-4-(N-말레이미드메틸)시클로헥산-1-카르복실산 등을 사용할 수 있다. 공유 결합에 의한 방법에서는, 항체에 존재하는 관능기를 사용할 수 있을 뿐 아니라, 예를 들면 티올기, 아미노기, 카르복실기, 수산기 등의 관능기를 통상법에 의해 도입한 후, 상기 결합법에 의해 표지 항-인플루엔자 A형 바이러스 항체를 제조할 수 있다. 또한, 비공유 결합에 의한 방법으로서는 물리 흡착법 등을 들 수 있다. In addition, the method of binding a label with an anti-influenza type A virus antibody can be prepared using a known method of making a covalent or non-covalent bond. Examples of the binding method include a glutaraldehyde method, a periodic acid method, a maleimide method, a pyridyl disulfide method, a method using various crosslinking agents, and the like (for example, "protein nucleic acid enzymes"). Ex. 31, pages 37-45 (1985)). As a bonding method using a crosslinking agent, for example, N-succinimidyl-4-maleimidebutyric acid (GMBS), N-succinimidyl-6-maleimidehexanoic acid, N-succinimidyl-4- (N-maleimide methyl) cyclohexane-1-carboxylic acid and the like can be used. In the method by covalent bonding, not only the functional group existing in an antibody can be used, but also functional groups, such as a thiol group, an amino group, a carboxyl group, and a hydroxyl group, are introduce | transduced by a conventional method, and then labeled anti-influenza by the said binding method. Type A viral antibodies can be prepared. Moreover, the physical adsorption method etc. are mentioned as a method by non-covalent bond.
상기와 같이 인플루엔자 A형 바이러스를 검출하는 것 이외에, 동시에 인플루엔자 B형 바이러스를 검출하는 경우에는, 표지 시약 존에 표지 항-인플루엔자 B형 바이러스 항체를 첨가하여 기구를 제조한다. 표지 시약 존에 함유되는 표지 항-인플루엔자 A형 바이러스 항체 및 표지 항-인플루엔자 B형 바이러스 항체는, 매트릭스 또는 흡수성 패드의 어느 한쪽에 함유시키는 방법, 또는 매트릭스와 흡수성 패드의 양방에 표지 항-인플루엔자 A형 바이러스 항체 및 표지 항-인플루엔자 B형 바이러스 항체를 함유시킬 수 있다. 인플루엔자 A형 바이러스 및 인플루엔자 B형 바이러스의 동시 측정을 행하는 경우에는, 표지 시약을 많이 사용하기 때문에, 매트릭스와 패드의 양방에 효소 표지 시약을 단독 또는 혼합하여 함유시키는 것이 고감도 측정을 행하는 데에 유리하다. 표지 항-인플루엔자 A형 바이러스 항체 및 표지 항-인플루엔자 B형 바이러스 항체량은, 통상 검사 대상물의 예측되는 양에 따라서 적절하게 변경할 수 있지만, 통상 건조 중량으로 0.01 ㎍ 내지 5 ㎍ 정도이다. 표지 항-인플루엔자 A형 바이러스 항체 및 표지 항-인플루엔자 B형 바이러스 항체는, 효소 표지존에 함유시키는 경우에 시약의 안정화제, 용해 조절제 등과 함께 도포할 수 있다. In addition to detecting influenza A virus as described above, when detecting influenza B virus at the same time, a labeled anti-influenza B virus antibody is added to the labeled reagent zone to prepare a device. The labeled anti-influenza A virus antibody and the labeled anti-influenza B virus antibody contained in the labeled reagent zone are contained in either the matrix or the absorbent pad, or the labeled anti-influenza A in both the matrix and the absorbent pad. Type virus antibodies and labeled anti-influenza B virus antibodies can be contained. In the case of simultaneous measurement of influenza type A virus and influenza type B virus, since many labeling reagents are used, it is advantageous to carry out high-sensitivity measurement by including the enzyme labeling reagent alone or in a mixture of both the matrix and the pad. . Although the amounts of the labeled anti-influenza A virus antibody and the labeled anti-influenza B virus antibody can be appropriately changed depending on the expected amount of the test object, they are usually about 0.01 µg to 5 µg in dry weight. The labeled anti-influenza A virus antibody and the labeled anti-influenza B virus antibody can be applied together with a stabilizer of a reagent, a dissolution regulator, and the like when contained in an enzyme labeled zone.
검체 점착 존Sample adhesion zone
검체 점착 존은, 전개액 공급 존의 전개액의 수액 방향의 하류측에서 검출 존의 상류측의 매트릭스에 특별히 시약 등을 포함하지 않고 설치할 수 있다. 또한, 검체 점착 존은, 1) 전개액존의 전개액 수액 방향의 하류측에서 효소 표지 시약 존의 상류측의 소정 부분, 2) 표지 시약 존의 하류측에서 검출 존의 상류측의 소정 부분, 3) 표지 시약 존 상의 소정 부분 등에 설치할 수 있다. 또한, 상기 효소 표지 시약 존에 검체 점착 존을 설치한 장치에서는, 상기한 바와 같이 효소 표지를 함유하는 흡수성 패드를 부설하는 것이 효율적으로 분석을 하는 데에 바람직하다. 이 패드를 부가하는 장치에서는, 다량의 검체액을 점착할 수 있기 때문에, 검체 중의 미량 성분을 양호한 검출 감도로 측정을 행할 수 있다. 이 흡수성 패드로서는, 표지 시약이나 검체 중의 인플루엔자 바이러스를 흡착하는 것이 적은 재료로부터 선택되고, 예를 들면 폴리비닐알코올(PVA), 부직포, 셀룰로오스 등의 다공질의 합성 또는 천연 고분자 화합물을 포함하는 재료를 단독 또는 조합하여 구성할 수 있다. 이 패드의 크기, 두께, 밀도 등은 한정되지 않지만, 통상 세로와 가로가 3 mm 내지 10 mm 정도이며 두께가 0.5 mm 내지 4 mm 정도인 패드를 사용하는 것이 효율적으로 측정을 행하기 위해서는 바람직하다. The sample adhesion zone can be provided in the matrix on the upstream side of the detection zone on the downstream side of the developing solution of the developing solution supply zone without including a reagent or the like. In addition, the sample adhesion zone is 1) a predetermined portion upstream of the enzyme-labeled reagent zone on the downstream side of the developing solution fluid direction of the developing solution zone, 2) a predetermined portion upstream of the detection zone on the downstream side of the labeling reagent zone, 3 ) In a predetermined portion or the like on the labeled reagent zone. Moreover, in the apparatus which provided the sample adhesion zone in the said enzyme labeling reagent zone, as mentioned above, it is preferable to lay the absorbent pad containing an enzyme label for efficient analysis. In the apparatus to which the pad is added, a large amount of sample liquid can be adhered, so that the trace component in the sample can be measured with good detection sensitivity. The absorbent pad is selected from materials that adsorb the influenza virus in the labeling reagent and the sample, and includes materials containing porous synthetic or natural high molecular compounds such as polyvinyl alcohol (PVA), nonwoven fabric, and cellulose, for example. Or in combination. Although the size, thickness, density, etc. of this pad are not limited, Usually, it is preferable to use the pad which is about 3 mm-10 mm in length and width, and about 0.5 mm-4 mm in thickness, in order to measure efficiently.
전개액 공급 존Developing solution supply zone
전개액 공급 존은, 매트릭스의 길이 방향의 일단에 설치되어 전개액이 공급되는 존이다. 측정을 개시하기 위해서는, 이 존을 적어도 전개액 흡수 존에 도달하는 양의 전개액 포함 용기에 침지하여 행할 수 있다. 또한, 전개액의 공급에는 전개액존에 전개액 포함 액조(液槽)를 부가하고, 이 액조의 커버를 부수어 전개액과 매트릭스를 접촉시킴으로써 측정을 개시할 수도 있다. 전개액에는, 계면활성제, 완충제, 안정화제, 항균제 등을 적절하게 함유할 수 있다. 또한, 표지물로서 효소도 사용하는 경우에는, 후술하는 기질 시약 존과 함께 전개액에 기질을 첨가할 수도 있다. 완충제를 포함하는 완충액으로서는, 예를 들면 아세트산 완충액, 붕산 완충액, Tris-염산 완충액, 디에탄올아민 완충액 등을 들 수 있다. 또한, 전개액 공급 존에는 전개액의 매트릭스에의 공급을 안정적이며 연속적으로 실시하기 위해서 전개액 패드를 부설할 수 있다. 전개액 패드로서는, 예를 들면 셀룰로오스 또는 셀룰로오스 유도체 등의 여과지를 사용할 수 있다. The developing solution supply zone is a zone provided at one end in the longitudinal direction of the matrix and supplied with the developing solution. In order to start a measurement, this zone can be immersed in the container containing the developing liquid of the quantity which reaches at least the developing liquid absorption zone. In addition, the supply of the developing solution can also be started by adding a developing solution containing a developing solution to the developing solution zone, breaking the cover of the working tank and bringing the developing solution into contact with the matrix. The developing solution may suitably contain a surfactant, a buffer, a stabilizer, an antibacterial agent, and the like. In addition, when an enzyme is also used as a label, a substrate may be added to the developing solution together with the substrate reagent zone described later. As a buffer containing a buffer, an acetic acid buffer, a boric acid buffer, a Tris hydrochloric acid buffer, a diethanolamine buffer, etc. are mentioned, for example. In addition, a developing solution pad can be provided in the developing solution supply zone in order to stably and continuously supply the developing solution to the matrix. As a developing solution pad, filter paper, such as a cellulose or a cellulose derivative, can be used, for example.
전개액 흡수 존Developing solution absorption zone
전개액 흡수 존은, 매트릭스의 일단에 설치된 상기 전개액존에 대하여 다른 말단에 설치된다. 이 존은 매트릭스에 공급되는 전개액을 흡수하여 분석을 원활하게 행하기 위해서 설치된다. 전개액 흡수 존은 매트릭스를 길게 형성하여 이 존을 확보할 수도 있다. 또한, 매트릭스에 흡수성 재료를 부설하여 전개를 촉진할 수도 있다. 이 흡수성 재료에는, 천연 고분자 화합물, 합성 고분자 화합물 등으로 제조 되는, 보수성이 높은 여과지, 스폰지 등을 사용할 수 있다. 전개액 흡수 존은 전개액을 전부 흡수하는 용적을 갖은 패드상의 흡수성 재료이지만, 흡수성 재료를 매트릭스 위 또는 아래에 적층함으로써, 소형화된 면역 측정 기구를 제조할 수 있다. The developing solution absorption zone is provided at the other end with respect to the developing solution zone provided at one end of the matrix. This zone is provided in order to absorb the development liquid supplied to a matrix and to perform an analysis smoothly. The developing solution absorption zone can also form a matrix to secure this zone. In addition, an absorbent material may be added to the matrix to promote development. As this absorbent material, filter paper, sponge, etc. which are made of a natural high molecular compound, a synthetic high molecular compound, etc. with high water retention property can be used. The developing solution absorption zone is a pad-like absorbent material having a volume to absorb all of the developing solution, but by minimizing the absorbent material on or below the matrix, a miniaturized immunoassay device can be manufactured.
기질 시약 존Substrate reagent zone
또한, 표지 시약 존의 표지물로서 효소를 사용하는 경우에는, 상기한 대로 전개액에 기질을 함유시키거나, 기질 시약 존을 매트릭스의 상기 전개액 공급 존 근방에 설치할 수 있다. 기질 시약 존은, 전개액 공급 존에 부설한 상기 전개액 패드에 함유시켜 설치하는 것이 기질량을 많게 하여 고감도 측정을 행하는 데에 바람직하다. In addition, when using an enzyme as a label of a labeling reagent zone, a substrate can be contained in a developing solution as above-mentioned, or a substrate reagent zone can be provided in the vicinity of the said developing solution supply zone of a matrix. The substrate reagent zone is preferably contained in the developing solution pad attached to the developing solution supply zone so as to increase the mass and perform high sensitivity measurement.
기질로서는 표지 시약의 효소에 대응하여 이하에 나타내는 각종 발색 기질, 형광 기질, 발광 기질 등을 사용할 수 있다. As the substrate, various chromogenic substrates, fluorescent substrates, luminescent substrates and the like shown below can be used corresponding to the enzymes of the labeling reagents.
(a) 발색 기질 퍼옥시다제용: 과산화수소와 조합한 2,2'-아지노-비스(3-에틸벤조티아졸린-6-술폰산)(ABTS), 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘(TMB), 디아미노벤지딘(DAB) 알칼리 포스파타제용: 5-브로모-4-클로로-3-인돌릴인산(BCIP)(a) For chromogenic substrate peroxidase: 2,2'-azino-bis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) (ABTS) in combination with hydrogen peroxide, 3,3 ', 5,5'-tetramethyl For benzidine (TMB), diaminobenzidine (DAB) alkaline phosphatase: 5-bromo-4-chloro-3-indoleylphosphate (BCIP)
(b) 형광 기질 알칼리 포스파타제용: 4-메틸움벨리페릴-포스페이트(4MUP) β-D-갈락토시다제용: 4-메틸움벨리페릴-β-D-갈락토시드(4MUG)(b) Fluorescent Substrate For Alkali Phosphatase: 4-Methylumbeliferyl-Phosphate (4MUP) For β-D-galactosidase: 4-Methylumbeliferyl-β-D-Galactosid (4MUG)
(c) 발광 기질 알칼리 포스파타제용: 3-(2'-스피로아다만탄)-4-메톡시-4-(3''-포스포릴옥시)페닐-1,2-디옥세탄ㆍ2나트륨염(AMPPD) β-D-갈락토시다제용: 3-(2'-스피로아다만탄)-4-메톡시-4-(3''-β-D-갈락토피라노실)페닐-1,2-디옥세탄(AMGPD) 퍼옥시다제용: 과산화수소와 조합한 루미놀, 이소루미놀(c) For luminescent substrate alkaline phosphatase: 3- (2'-spiroadamantane) -4-methoxy-4- (3 ''-phosphoryloxy) phenyl-1,2-dioxetane-disodium salt ( AMPPD) for β-D-galactosidase: 3- (2'-spiroadamantane) -4-methoxy-4- (3 ''-β-D-galactopyranosyl) phenyl-1,2- For dioxetane (AMGPD) peroxidase: luminol, isoluminol in combination with hydrogen peroxide
상기 기질을 기질존으로서 설치하는 경우에는, 통상 상기 기질을 수용액에 용해시켜 전개액 패드에 라인상으로 도포한 후, 건조시킴으로써 형성할 수 있고, 목적에 따라서 기질의 시그널 증강제, 안정화제, 용해 조절제 등을 첨가할 수도 있다. 기질존은, 매트릭스의 단부에 부설한 전개액 패드 내라면, 특별히 한정되지 않는다. 전개액 및 전개액 패드에 첨가하는 기질량은 측정 조건에 의해 결정할 수 있지만, 1개의 기구당 통상 5 내지 500 ㎍ 정도를 사용할 수 있다. In the case where the substrate is provided as a substrate zone, it is usually formed by dissolving the substrate in an aqueous solution and applying it in a line to a developing pad, followed by drying, and depending on the purpose, a signal enhancer, stabilizer, and dissolution regulator of the substrate. Etc. can also be added. The substrate zone is not particularly limited as long as it is in a developing solution pad attached to an end of the matrix. Although the base mass added to the developing solution and the developing pad can be determined by the measurement conditions, about 5 to 500 µg is usually used per apparatus.
각 존의 배치Placement of Each Zone
본 발명의 면역 측정 기구의 바람직한 일례를 도 6 내지 도 8에 모식적으로 나타낸다. 도 6 중, 참조 번호 2가 매트릭스, 4가 표지 시약 존, 8이 검체 점착 존, 3이 전개액 공급 존, 5가 전개액 흡수 존, 6a가 인플루엔자 A형 바이러스 검출 존, 7이 기질 시약 존, 9가 검체이다. 이 예에서는, 검체 점착 존 (8)과 표지 시약 존 (4)가 동일하다. 또한, 참조 번호 6b는 인플루엔자 B형 바이러스 검출 존, 10은 전개액 확인 존, 11은 전개액조이다(하기 실시예 4 참조). Preferable examples of the immunoassay device of the present invention are schematically shown in Figs. In Fig. 6, reference numeral divalent matrix, tetravalent labeling reagent zone, octal sample adhesion zone, trivalent developing solution supply zone, pentavalent developing solution absorption zone, 6a influenza A virus detection zone, and 7 substrate reagent zone , 9 is the sample. In this example, the
측정 기구의 사용 방법How to use the measuring instrument
본 발명의 측정 기구에 의해 각종 검체 시료 중의 인플루엔자 A형 바이러스의 측정을 행할 수 있다. 측정은, 우선 검체를 본 발명의 측정 기구의 검체 점착 존에 공급한 후, 전개액을 전개액 패드에 공급하고, 매트릭스로 전개하여 행한다. 또한, 검체의 희석액으로서, 시료 희석액으로서, 계면활성제를 포함하는 완충액을 사용할 수 있다. 전개액은 모세관 작용에 의해 매트릭스를 이동하여 전개액 흡수 존에 도달하고, 검출 존에 결합되지 않은 검체 중의 성분, 효소 표지 시약 등이 흡 수되어 전개가 완료된다. 소정 시간(통상 10 분 내지 20 분) 경과 후, 검출 존을 관찰하여, 검체액 중의 인플루엔자 A형 바이러스에 의해 검출부에 고정화된 표지물을 측정함으로써, 인플루엔자 A형 바이러스의 측정을 행할 수 있다. 이 검출은 표지물 또는 표지물로 사용되는 효소에 따라서 각각 대응하는 육안 또는 비색계, 형광 광도계, 포톤 카운터, 감광 필름 등의 측정 장치를 사용하여 실시할 수 있다. 측정에서는, 예를 들면 검출 존의 발색을 육안으로 측정하는 방법이 간편하다. 또한, 이 방법에서는 인플루엔자 A형 바이러스의 농도에 대응한 색표(컬러 차트)를 사용함으로써 반정량적인 분석이 가능해진다. 또한, 비색계 등에 의해 검출 존의 발색을 수치화하여 정량을 행할 수도 있다. The influenza A virus in various sample samples can be measured by the measuring instrument of the present invention. The measurement is performed by first supplying a sample to the sample adhesion zone of the measuring instrument of the present invention, then supplying the developing solution to the developing solution pad and developing the matrix. As the sample diluent, a buffer containing a surfactant can be used as the sample diluent. The developing solution moves through the matrix by capillary action to reach the developing solution absorption zone, and components in the sample that are not bound to the detection zone, enzyme labeling reagents, and the like are absorbed to complete development. After the lapse of a predetermined time (usually 10 to 20 minutes), the influenza A virus can be measured by observing the detection zone and measuring the label immobilized on the detection unit by the influenza A virus in the sample liquid. This detection can be performed using measuring apparatuses, such as a visual or colorimeter, a fluorescence photometer, a photon counter, and a photosensitive film, respectively, depending on the label or the enzyme used as the label. In the measurement, for example, a method of visually measuring the color development of the detection zone is simple. In this method, semi-quantitative analysis becomes possible by using a color table (color chart) corresponding to the concentration of influenza A virus. In addition, the coloration of the detection zone can be quantified by a colorimeter or the like to quantify the color.
도 6 내지 도 8에 나타내는 본 발명의 면역 측정 기구의 바람직한 일례를 예로서 측정 원리를 더욱 설명한다. 검체 (9)를 검체 점착 존 (8)에 점착함과 동시에, 전개액조 (11) 내의 전개액을 전개액 공급 존 (3)에 공급한다. 전개액은 모세관 현상에 의해 매트릭스 (2) 내를 횡 방향의 흰색 화살표의 방향으로 이동해간다. 기질 시약 존 (7)에 함유된 기질이 전개액에 용해되어, 전개액과 함께 이동해간다. 한편, 검체 (9)는 표지 시약 존 (4) 내의 표지 항체와 반응하여, 표지 항원 항체 복합물이 형성된다. 여기에 전개액이 도착하면, 표지 항원 항체 복합물은 전개액 중의 기질과 반응하면서 매트릭스 (2)를 이동하고, 인플루엔자 A형 바이러스 검출 존 (6a)에 도달하면, 인플루엔자 A형 바이러스 검출 존 (6a)에 부동화되어 있는 항-인플루엔자 A형 바이러스 항체와 반응하여, 인플루엔자 A형 바이러스 검출 존 (6a)에 부동화된다. 검체 중에 인플루엔자 A형 바이러스가 포함되어 있는 경우에 는, 표지 효소와 기질과의 반응에 의해 발색이 일어난다. 한편, 검체 중에 인플루엔자 A형 바이러스가 포함되어 있지 않은 경우에는, 표지 항체는 항원 항체 반응할 수 없고, 표지가 인플루엔자 A형 바이러스 검출 존 (6a)에 부동화되지 않기 때문에 발색이 일어나지 않는다. 따라서, 인플루엔자 A형 바이러스 검출 존 (6a)가 발색하는가 하지 않는가로 검체 중에 인플루엔자 A형 바이러스 포함 여부를 알 수 있다. 전개액 확인 존 (10)에는, 전개액 중의 시약과 반응하여 발색하는 효소가 부동화되어 있고, 전개액 확인 존 (10)이 발색하면, 거기까지 전개액이 도달되었음을 알 수 있다. 또는, 전개액 확인 존 (10)에는, 표지 효소에 대한 항체가 부동화되어 있고, 전개액 확인 존 (10)에 도달한 표지 시약이 상기 항체에 포획되며, 또한 전개액이 도달하면, 포획된 표지와 전개액 중의 기질이 반응하여 발색하도록 할 수도 있다(하기 실시예에서는 항 알칼리 포스파타제 항체를 부동화). 또한, 표지 시약 존 (4) 내에, 표지 항-인플루엔자 B형 바이러스 항체를 포함해 두고, 한편 항-인플루엔자 B형 바이러스 항체를 부동화한 항-인플루엔자 B형 바이러스 검출 존 (6b)를 설치해 두면, 인플루엔자 B형 바이러스의 검출도 동시에 할 수 있으며, 인플루엔자 바이러스가 A형인가 B형인가를 단일의 측정 조작으로 조사할 수 있다. The measurement principle is further described by way of example as a preferred example of the immunoassay instrument of the present invention shown in FIGS. 6 to 8. The
또한, 상기 매트릭스는 플라스틱, 금속, 종이 등의 지지 부재 상에 적층하여 고정하여 사용할 수도 있다. 상기 매트릭스는 플라스틱 등의 케이스에 고정하고, 전개액을 포함하는 액조를 전개액 공급 존에 부설하여 상기 각 존 부분에 구멍이 개방된 케이스로 커버링함으로써 취급이 용이한 기구를 구성할 수 있다. 본 발명의 면역 측정 기구에 사용되는 검체로서는, 인간, 동물 등으로부터 채취한 인플루 엔자가 포함된다고 생각되는 검체이고, 각종 체액, 예를 들면 비강 추출액(비강 스와브), 비강 흡인액, 인두 추출액(인두 스와브) 등의 체액 추출액을 들 수 있다. In addition, the matrix may be laminated and fixed on a supporting member such as plastic, metal, paper, or the like. The matrix is fixed to a case such as plastic, and a liquid tank containing a developing solution is placed in a developing solution supply zone and covered with a case in which holes are opened in each of the zone portions to constitute a mechanism that is easy to handle. As a sample used for the immunoassay apparatus of this invention, it is a sample considered to contain influenza collected from humans, animals, etc., and various body fluids, such as nasal extract (nasal swab), nasal aspirate, pharyngeal extract Body fluid extracts, such as a pharyngeal swab, are mentioned.
이하 참고예, 실시예에 의해 본 발명을 더욱 상세히 설명하지만, 발명을 본 실시예로 한정하는 것은 아니다. Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples and Examples, but the present invention is not limited to the Examples.
실시예 1: 항-인플루엔자 A형 바이러스 모노클로날 항체의 제조 Example 1 Preparation of Anti-Influenza A Virus Monoclonal Antibodies
면역원으로는 인플루엔자 핵 단백질 항원을 함유하는 인플루엔자 HA 백신(카케쯔겐 제조:A/뉴 칼레도니아/20/99(H1N1)(IVR-116)주, A/파나마/2007/99(H3N2)(NIB-41)주를 사용하였다. 면역원에 등량의 프로인트 완전 보조제(야토론사 제조)를 첨가하여 완전히 혼합한 후, Balb/c 마우스에게 2 주 간격으로 총 4회 면역시켰다. 세포 융합 3 일 전에 마우스 복강 내에 면역원을 주사하고, PEG를 사용하여 마우스 비장 세포와 미엘로마 세포(P3U1)를 융합하였다. 배양액에는 HAT 선택 배지를 사용하고, 약 2 주 후에 배양 상청을 채취하여 스크리닝에 사용하였다. 1차 스크리닝에는, 인플루엔자 핵 단백질 항원을 함유하는 인플루엔자 HA 백신, 인플루엔자 A형 재조합 핵 단백질 항원(A/뉴 칼레도니아/20/99 유래(r-NP/H1N1), A/키타큐슈/159/93 유래(r-NP/H3N2); DDBJ/진뱅크 데이타베이스)를 고상화한 효소 결합 면역흡착 분석법(Enzyme Linked Immunosobent Assay; ELISA법)를 사용하였다. 즉, 인플루엔자 HA 백신은 0.1 M 탄산 완충액 pH 9.6으로 300배 희석하고, 동일하게 A형 재조합 핵 단백질 항원은 1 ㎍/㎖의 농도로 희석하여, 마이크로플레이트 모듈(Nunc사 제조)의 각 웰에 100 ㎕씩 첨가하고, 4 ℃에서 밤새 배양 하여 고상화하였다. 다음에, 0.1 ％의 Tween 20(상품명)을 포함하는 PBS(PBS-Tween)로 각 웰을 세정 후, PBS로 희석한 1 ％의 소혈청 알부민(BSA) 300 ㎕를 첨가하여 4 ℃에서 밤새 블로킹을 행하였다. 블로킹액을 제거한 후, 배양 상청을 100 ㎕씩 첨가하여 37 ℃에서 1 시간 동안 반응시켰다. PBS-Tween으로 충분히 세정한 후, 0.2 ％ BSA, 0.2 ％ 에멀겐 985, 1 ％ 수크로오스, 1 ％ KCl을 포함하는 0.05 M 인산 완충액 pH 7.5(반응 용액)로 2000배 희석한 효소 표지 항 마우스 Igs 항체(DAKO사 제조)를 각 웰에 100 ㎕씩 첨가하여 37 ℃에서 1 시간 동안 반응시켰다. 반응 후 PBS-Tween으로 충분히 세정하고, 2.2'-아지노-비스-3-에틸벤조티아졸린-6-술폰산(ABTS)을 각 웰에 100 ㎕씩 첨가하여 실온에서 30 분간 반응시킨 후, 반응 정지액을 각 웰에 100 ㎕씩 첨가하여 주파장 415 nm, 부파장 490 nm에서 발색 수준을 측정하였다. Influenza HA vaccine containing influenza nuclear protein antigen as an immunogen (Made by Kaketzgen: A / New Caledonia / 20/99 (H1N1) (IVR-116) strain, A / Panama / 2007/99 (H3N2) (NIB-41 An equal amount of Freund's complete adjuvant (manufactured by Yatoron Corporation) was added to the immunogen, mixed thoroughly, and Balb / c mice were immunized a total of four times at two week intervals. Immunogens were injected into the mice and PEG was used to fuse mouse spleen cells with myeloma cells (P3U1) Culture medium was used with HAT selection medium and culture supernatants were harvested and used for screening after about 2 weeks. Influenza HA vaccine containing influenza nuclear protein antigen, influenza type A recombinant nuclear protein antigen (derived from A / New Caledonia / 20/99 (r-NP / H1N1), A / Kitakyushu / 159/93) (r- NP / H3N2); DDBJ / Ginbank Database) Enzyme Linked Immunosobent Assay (ELISA) was used, that is, the influenza HA vaccine was diluted 300-fold with 0.1 M carbonic acid buffer pH 9.6, and the same type of recombinant A protein was 1 μg / ml. 100 μl was added to each well of the microplate module (manufactured by Nunc Corporation), incubated overnight at 4 ° C., and then solidified, followed by PBS containing 0.1% of Tween 20 (trade name). Each well was washed with PBS-Tween), and 300 µl of 1% bovine serum albumin (BSA) diluted with PBS was added to block overnight at 4 ° C. After removing the blocking solution, 100 µl of the culture supernatant was removed. And reacted for 1 hour at 37 ° C. After washing sufficiently with PBS-Tween, 0.05 M phosphoric acid buffer pH 7.5 containing 0.2% BSA, 0.2
양성이라고 판정된 배양 상청에 대해서는, 인플루엔자 B형 재조합 핵 단백질 항원(B/야마나시/166/98(r-NP/B)DDBJ/진뱅크 데이타베이스)을 항원으로 한 ELlSA로 2차 스크리닝을 행하고, 최종적으로 인플루엔자 A형 핵 단백질 항원에 반응하며, 인플루엔자 B형 핵 단백질 항원과는 반응하지 않는 항체를 생산하는 하이브리도마 3 주(하이브리도마 FVA2-3, 하이브리도마 FVA2-6 및 하이브리도마 FVA2-11)를 얻었다. 이들 하이브리도마는 상술한 대로 특허 미생물 기탁 센터에 기탁되어 있다. 상기 하이브리도마 3 주로부터 얻어진 모노클로날 항체의 서브클래스는 전부 IgG1이었다. 표 1에 하이브리도마의 반응성의 결과를 나타내었다. About the culture supernatant determined to be positive, secondary screening is performed by ELlSA which used the influenza type B recombinant nuclear protein antigen (B / YAMANASHI / 166/98 (r-NP / B) DDBJ / Ginbank database) as an antigen, Finally, three hybridomas (hybridoma FVA2-3, hybridoma FVA2-6, and hybridoma) that produce antibodies that respond to influenza type A nuclear protein antigen and not to influenza type B nuclear protein antigen. FVA2-11). These hybridomas have been deposited in the patent microbial deposit center as described above. The subclasses of monoclonal antibodies obtained from the 3 weeks of hybridoma were all IgG1. Table 1 shows the results of the reactivity of the hybridomas.
실시예 2: 모노클로날 항체의 웨스턴 블롯팅법에 있어서의 반응성 Example 2: Reactivity in Western blotting of monoclonal antibodies
재조합 항원, 인플루엔자 HA 백신(핵 단백질 항원 함유)을 사용하여 웨스턴 블롯팅법에 의해 반응성을 확인하였다. 각 시료를, 0.001 M EDTA, 1 ％ SDS, 5 ％ 2ME(2-머캅토에탄올), 10 ％ 글리세롤, 0.005 ％ BPB(Bromophenol Blue)를 포함하는 0.01 M Tris-HCl(pH 8.0)에 용해시키고, 100 ℃로 가열 처리한 후, 전기 영동에 사용하였다. 도데실황산나트륨-폴리아크릴아미드 겔 전기 영동(SDS-PAGE)은, e-파젤 10 ％ 겔 농도(아트사 제조)를 사용하여 통상법에 따랐다. 영동 후 PVDF막(아트사 제조)에 전사하고, 블록에이스(다이닛본 세이야꾸 제조)로써 4 ℃에서 밤새 블로킹을 행하였다. 블로킹액을 제거하고, PBS-Tween으로 세정 후, 10 ㎍/㎖의 농도로 조정한 모노클로날 항체를 첨가하여 실온에서 45 분간 반응시켰다. PBS-Tween으로 충분히 세정한 후, 반응 용액으로 4000배 희석한 효소 표지 항 마우스 IgG 항체(Cappel사 제조)를 실온에서 45 분간 반응시켰다. PBS-Tween으로 충분히 세정 후, ECL 웨스턴 블롯팅 검출 시스템(아머샴 바이오사이언스사 제조)을 사용하여 X선 필름(코닥사 제조)에 1 내지 15 분간 노광시켜 시그널을 검출하였다. Reactivity was confirmed by western blotting using a recombinant antigen, influenza HA vaccine (containing nuclear protein antigen). Each sample was dissolved in 0.01 M Tris-HCl (pH 8.0) containing 0.001 M EDTA, 1% SDS, 5% 2ME (2-mercaptoethanol), 10% glycerol, 0.005% Bromophenol Blue (BPB), After heating to 100 ° C., it was used for electrophoresis. Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) followed the conventional method using the e-Pazel 10% gel concentration (made by Art Corporation). After electrophoresis, it was transferred to a PVDF film (manufactured by Art Co., Ltd.) and blocked overnight at 4 ° C with a block ace (manufactured by Dainippon Seiyaku). The blocking solution was removed, washed with PBS-Tween, and then monoclonal antibodies adjusted to a concentration of 10 µg / ml were added to react for 45 minutes at room temperature. After sufficient washing with PBS-Tween, the enzyme-labeled anti mouse IgG antibody (manufactured by Cappel) diluted 4000-fold with the reaction solution was allowed to react for 45 minutes at room temperature. After sufficient washing with PBS-Tween, signals were detected by exposing the X-ray film (Kodak Co., Ltd.) for 1 to 15 minutes using an ECL western blotting detection system (manufactured by Amersham Bioscience).
모노클로날 항체 FVA2-3, FVA2-6, FVA2-11에서는, 전체 항원에 대하여 55 내지 70 kD 부근을 중심으로 밴드가 확인되었다. 이 결과를 도 1에 나타내었다. In monoclonal antibodies FVA2-3, FVA2-6, and FVA2-11, bands were confirmed around 55 to 70 kD with respect to all antigens. This result is shown in FIG.
실시예 3: 모노클로날 항체를 사용한 ELlSA에 의한 항원 측정Example 3: Antigen Measurement by ELlSA Using Monoclonal Antibodies
3종의 정제 모노클로날 항체를 0.1 M 인산 완충액 pH 7.5에서 2 ㎍/㎖의 농도로 마이크로플레이트 모듈(Nunc사 제조)의 각 웰에 100 ㎕씩 첨가하고, 4 ℃에서 밤새 배양하여 고상화하였다. 다음에, 0.1 ％의 Tween 20(상품명)을 포함하는 PBS(PBS-Tween)로 각 웰을 세정 후, PBS로 희석한 1 ％의 BSA 300 ㎕를 첨가하여 4 ℃에서 밤새 블로킹을 행하였다. 반응 용액으로 희석한 인플루엔자 A형 바이러스액을 각 웰에 100 ㎕씩 첨가하여 37 ℃에서 1 시간 반응시켰다. PBS-Tween으로 충분히 세정한 후, 반응 용액으로 희석 조정한 3종의 알칼리 포스파타제 표지 모노클로날 항체를 각 웰에 100 ㎕씩 첨가하여 37 ℃에서 1 시간 동안 반응시켰다. 반응 후 PBS-Tween으로 충분히 세정하고, 4-니트로페닐포스페이트(4-NPP)를 각 웰에 100 ㎕씩 첨가하여 실온에서 30 분간 반응시킨 후, 반응 정지액을 각 웰에 100 ㎕씩 첨가하고, 주파장 415 nm, 부파장 490 nm에서 발색 수준을 측정하였다. 양성은 완충액 블랭크의 발색 수준의 2.1배 이상으로 하고, 양성이 되는 최종 희석 배율로 반응성의 강도를 나타내었다. Three purified monoclonal antibodies were added to each well of the microplate module (manufactured by Nunc) at a concentration of 2 μg / ml in 0.1 M phosphate buffer pH 7.5, and cultured at 4 ° C. overnight to solidify. . Next, each well was washed with PBS (PBS-Tween) containing 0.1% Tween 20 (trade name), and then 300 µl of 1% BSA diluted with PBS was added, and blocking was performed at 4 ° C overnight. 100 μl of influenza A virus solution diluted with the reaction solution was added to each well and allowed to react at 37 ° C. for 1 hour. After sufficiently washing with PBS-Tween, three kinds of alkaline phosphatase-labeled monoclonal antibodies diluted with the reaction solution were added to each well and reacted at 37 ° C for 1 hour. After the reaction, the solution was sufficiently washed with PBS-Tween, 100 μl of 4-nitrophenylphosphate (4-NPP) was added to each well, followed by reaction at room temperature for 30 minutes, and then 100 μl of the reaction stopper was added to each well. The color development was measured at 415 nm and 490 nm. Positive was at least 2.1 times the color development level of the buffer blank, indicating the intensity of reactivity at the final dilution factor that became positive.
취득한 3종의 모노클로날 항체에 의한 조합 총 9 종류에 있어서, 시판 항-인플루엔자 A형 바이러스 모노클로날 항체에 대하여 2 내지 8배 높은 반응성을 나타내었다. 이 결과를 표 2에 나타내었다. The combination of three of the three monoclonal antibodies obtained showed a 2 to 8 times higher reactivity to the commercial anti-influenza type A virus monoclonal antibodies. The results are shown in Table 2.
실시예 4: 인플루엔자 A형 바이러스 모노클로날 항체의 반응 부위의 측정 Example 4 Measurement of Reaction Sites of Influenza A Virus Monoclonal Antibodies
4-1 플라스미드의 제조4-1 Preparation of Plasmid
모노클로날 항체 FVA2-11의 인식 부위를 결정하기 위해서, 498 아미노산을 포함하는 인플루엔자 H1N1주(뉴 칼레도니아/20/99)를, PCR법으로 1 내지 159 아미노산(A 단편), 162 내지 327 아미노산(B 단편) 및 327 내지 498 아미노산(C 단편)의 3단편을 증폭하였다. In order to determine the recognition site of the monoclonal antibody FVA2-11, influenza H1N1 strain containing 498 amino acids (New Caledonia / 20/99), 1 to 159 amino acids (A fragment), 162 to 327 amino acids (by PCR) B fragment) and three fragments of 327-498 amino acids (C fragment) were amplified.
프라이머에는 미리 EcoRI, BamHI 부위를 부가하였다. 증폭 단편을 퀴아젠(QIAGEN) 사의 PCR 정제 키트로 정제하고, 도 2에 나타내는 발현용 플라스미드 pW6A의 NdeI-EcoRI 부위에 GST를 조합한 발현용 플라스미드 pWG6A의 EcoRI-BanHI 부위에 삽입하여 플라스미드 pWGInf.H1N1-A, pWGInf.H1N1-B 및 pWGInf.H1N1-C를 제조하였다. 이들을 이용하여 대장균 BL21(DE3)(Brookhaven National Laboratory로부터 입수)을 형질 전환시켜 암피실린 내성의 형질 전환체 대장균 EcoRI and BamHI sites were previously added to the primer. The amplified fragment was purified by a QIAGEN PCR purification kit, and inserted into the EcoRI-BanHI site of the expression plasmid pWG6A, in which the GST was combined with the NdeI-EcoRI site of the expression plasmid pW6A shown in FIG. 2, to plasmid pWGInf.H1N1. -A, pWGInf.H1N1-B and pWGInf.H1N1-C were prepared. These were used to transform Escherichia coli BL21 (DE3) (obtained from the Brookhaven National Laboratory) to transform ampicillin-resistant transformant Escherichia coli.
BL21(DE3)pWGInf.H1N1-A, BL21(DE3)pWGInf.H1-B 및 BL21(DE3)pWGInf.H1N1-C를 얻었다. BL21 (DE3) pWGInf.H1N1-A, BL21 (DE3) pWGInf.H1-B and BL21 (DE3) pWGInf.H1N1-C were obtained.
4-2 재조합 단백질(GST+H1N1-A, GST+H1N1-B 및 GST+H1N1-C)의 발현4-2 Expression of Recombinant Proteins (GST + H1N1-A, GST + H1N1-B and GST + H1N1-C)
4-1에서 제조한 형질 전환체를, 50 ㎍/㎖의 암피실린을 포함하는 LB 배지 2 ㎖ 중에 37 ℃에서 배양하였다. 예비 배양으로 600 nm에서의 OD를 0.6 내지 0.8로 만든 후, 0.4 mM IPTG를 첨가하여 발현 유도를 행하고, 3 시간 더 배양하였다. 1.5 ㎖량의 균체 배양액을 5000 rpm에서 2 분간 원심 분리하여 균체를 모으고, 100 ㎕의 완충액(10 mM Tris-염산, pH 8.0, 0.1 M 염화나트륨, 1 mM EDTA)에 현탁시키고, 15 분간의 초음파 파쇄에 의해 완전히 균체를 파쇄하였다. 이것을 균체 시료로 하였다. The transformant prepared in 4-1 was incubated at 37 ° C. in 2 ml of LB medium containing 50 μg / ml of ampicillin. After pre-culture, the OD at 600 nm was made 0.6 to 0.8, followed by induction of expression by addition of 0.4 mM IPTG, and further incubated for 3 hours. The cells were collected by centrifugation of 1.5 ml of the cell culture medium at 5000 rpm for 2 minutes, suspended in 100 μl of buffer (10 mM Tris-hydrochloric acid, pH 8.0, 0.1 M sodium chloride, 1 mM EDTA), and sonication for 15 minutes. The cells were completely crushed by This was used as a cell sample.
균체 시료 8 ㎕에 3배 농도의 SDS 폴리아크릴아미드 완충액(0.15 M Tris-염산, pH 6.8, 6 ％ SDS, 24 ％ 글리세롤, 6 mM EDTA, 2 ％ 2-머캅토에탄올, 0.03 ％ 브로모페놀 블루) 4 ㎕를 첨가하여 충분히 교반한 후, SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기 영동을 행하였다. 니트로셀룰로오스 필터에 웨스턴 블롯을 행하여 전사를 행하고, 1 ％ BSA로 블록킹시킨 후, 인산 완충액(10 mM 인산, pH 7.4, 0.15 M 염화나트륨)으로 1000배 희석한 모노클로날 항체 FVA2-11을 반응시켰다. 또한, 퍼옥시다아제 효소 표지된 항 마우스 면역 글로불린 토끼 폴리클로날 항체(다코사 제조)를 반응시키고, 세정 후 10 ㎖의 기질 발색액(0.01 ％ 과산화수소수, 0.6 mg/㎖ 4-클로로-1-나프톨)을 첨가하여 발색시켰다. 그 결과, 모노클로날 항체 FVA2-11은 GST+H1N1-A와만 반응하는 것으로 판명되었다. In 8 μl of cell samples, SDS polyacrylamide buffer (0.15 M Tris-hydrochloric acid, pH 6.8, 6% SDS, 24% glycerol, 6 mM EDTA, 2% 2-mercaptoethanol, 0.03% bromophenol blue) ) 4 µl was added and sufficiently stirred, followed by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis. Western blotting was performed on the nitrocellulose filter to perform transcription, blocking with 1% BSA, followed by reaction of monoclonal antibody FVA2-11 diluted 1000-fold with phosphate buffer (10 mM phosphoric acid, pH 7.4, 0.15 M sodium chloride). In addition, the peroxidase enzyme-labeled anti mouse immunoglobulin rabbit polyclonal antibody (manufactured by Dako) was reacted, and after washing, 10 ml of substrate chromophore (0.01% hydrogen peroxide, 0.6 mg / ml 4-chloro-1-naphthol) ) Was added. As a result, the monoclonal antibody FVA2-11 was found to react only with GST + H1N1-A.
4-3 플라스미드의 제조4-3 Preparation of Plasmid
다음에 인플루엔자 H1N1의 A 단편을 더욱 세분화한 단편 A1(1 내지 90 아미노산), A2(85 내지 159 아미노산), A3(44 내지 130 아미노산), A4(59 내지 103 아미노산), A5(44 내지 103 아미노산), A6(59 내지 130 아미노산) 및 A7(1 내지 130 아미노산)(도 3))을 PCR법으로 증폭하였다. 증폭 단편을 퀴아젠사의 PCR 정제 키트로 정제하고, 상기 발현용 플라스미드 pWG6A의 EcoRI-BamHI 부위에 삽입하여 플라스미드 pWGInf.H1N1-A1, pWGInf.H1N1-A2, pWGInf.H1N1-A3, pWGInf.H1N1-A4, pWGInf.H1N1-A5, pWGInf.H1N1-A6을 제조하였다. A7 단편은 도 2에 나타내는 pW6A의 EcoRI-BamHI 부위에 삽입하여 플라스미드 pWInf.H1N1-A7을 제조하였다. 이들을 이용하여 대장균 BL21(DE3)(Brookhaven National Laboratory로부터 입수)을 형질 전환시키고, 암피실린 내성의 형질 전환체 대장균 Next, fragments A1 (1 to 90 amino acids), A2 (85 to 159 amino acids), A3 (44 to 130 amino acids), A4 (59 to 103 amino acids), and A5 (44 to 103 amino acids) were further subdivided into A fragments of influenza H1N1. ), A6 (59-130 amino acids) and A7 (1-130 amino acids) (FIG. 3)) were amplified by PCR. The amplified fragment was purified by QIAGEN PCR purification kit, inserted into the EcoRI-BamHI site of the expression plasmid pWG6A, and then plasmids pWGInf.H1N1-A1, pWGInf.H1N1-A2, pWGInf.H1N1-A3, pWGInf.H1N1-A4 , pWGInf.H1N1-A5, pWGInf.H1N1-A6 were prepared. The A7 fragment was inserted into the EcoRI-BamHI site of pW6A shown in FIG. 2 to prepare plasmid pWInf.H1N1-A7. These were used to transform Escherichia coli BL21 (DE3) (obtained from Brookhaven National Laboratory) and transformed into ampicillin resistant E. coli
BL21(DE3)pWGInf.H1N1-A1,BL21 (DE3) pWGInf.H1N1-A1,
BL21(DE3)pWGInf.H1N1-A2,BL21 (DE3) pWGInf.H1N1-A2,
BL21(DE3)pWGInf.H1N1-A3,BL21 (DE3) pWGInf.H1N1-A3,
BL21(DE3)pWGInf.H1N1-A4, BL21 (DE3) pWGInf.H1N1-A4,
BL21(DE3)pWGInf.H1N1-A5,BL21 (DE3) pWGInf.H1N1-A5,
BL21(DE3)pWGInf.H1N1-A6 및 BL21(DE3)pWInf.H1N1-A7을 얻었다. BL21 (DE3) pWGInf.H1N1-A6 and BL21 (DE3) pWInf.H1N1-A7 were obtained.
4-4 재조합 단백질(GST+H1N1-A1, GST+H1N1-A2, GST+H1N1-A3, GST+H1N1-A4, GST+H1N1-A5, GST+H1N1-A6 및 GST+H1N1-A7)의 발현Expression of 4-4 Recombinant Proteins (GST + H1N1-A1, GST + H1N1-A2, GST + H1N1-A3, GST + H1N1-A4, GST + H1N1-A5, GST + H1N1-A6 and GST + H1N1-A7)
4-3에서 제조한 형질 전환체를, 50 ㎍/㎖의 암피실린을 포함하는 LB 배지 2 ㎖ 중에 37 ℃에서 배양하였다. 예비 배양으로 600 nm에서의 OD를 0.6 내지 0.8로 만든 후, 0.4 mM IPTG를 첨가하여 발현 유도를 행하고, 3 시간 더 배양하였다. 1.5 ㎖량의 균체 배양액을 5000 rpm에서 2 분간 원심 분리하여 균체를 모으고, 100 ㎕의 완충액(10 mM Tris-염산, pH 8.0, 0.1 M 염화나트륨, 1 mM EDTA)에 현탁시키며, 15 분간의 초음파 파쇄에 의해 완전히 균체를 파쇄하였다. 이것을 균체 시료로 하였다. The transformant prepared in 4-3 was incubated at 37 ° C in 2 ml of LB medium containing 50 µg / ml of ampicillin. After pre-culture, the OD at 600 nm was made 0.6 to 0.8, followed by induction of expression by addition of 0.4 mM IPTG, and further incubated for 3 hours. The cells were collected by centrifugation of 1.5 ml of the cell culture solution at 5000 rpm for 2 minutes, suspended in 100 μl of buffer (10 mM Tris-hydrochloric acid, pH 8.0, 0.1 M sodium chloride, 1 mM EDTA), and ultrasonic disruption for 15 minutes. The cells were completely crushed by This was used as a cell sample.
균체 시료 8 ㎕에 3배 농도의 SDS 폴리아크릴아미드 완충액(0.15 M Tris-염산, pH 6.8, 6 ％ SDS, 24 ％ 글리세롤, 6 mM EDTA, 2 ％ 2-머캅토에탄올, 0.03 ％ 브로모페놀 블루, 분자량 마커(117.6, 113.9, 81.2, 60.7, 47.4, 36.1, 25.3, 19.0, 14.7, 6.1 KD)) 4 ㎕를 첨가하여 충분히 교반한 후, SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기 영동을 행하였다. 니트로셀룰로오스 필터에 웨스턴 블롯을 행하여 전사를 행하고, 1 ％ BSA로 블록킹시킨 후, 인산 완충액(10 mM 인산, pH 7.4, 0.15 M 염화나트륨)으로 1000배 희석한 모노클로날 항체 FVA2-11을 반응시켰다. 또한, 퍼옥시다아제 효소 표지된 항 마우스 면역 글로불린 토끼 폴리클로날 항체(다코사 제조)를 반응시키고, 세정 후 10 ㎖의 기질 발색액(0.01 ％ 과산화수소수, 0.6 mg/㎖ 4-클로로-1-나프톨)을 첨가하여 발색시켰다. 각 단편을 도 3에 나타내었다. 영동 후의 CBB 염색 패턴과 웨스턴 블롯의 결과를 도 4에 나타내었다. 이상의 결과로부터 항-인플루엔자 A형 바이러스 모노클로날 항체(FVA2-11)의 인식 부위는, 인플루엔자 H1N1의 아미노산 59 내지 130 영역인 것을 알 수 있었다. 또한, 도 5에 나타내는 인플루엔자 A형 아형의 핵 단백질 아미노산 서열로부터, 아미노산 번호 59 내지 130번째의 반응 부위에서 공통되는 배열을 가지고, 친수성 구조를 갖는 예를 들면 90 내지 95번째, 111 내지 115번째 또는 120 내지 123번째 등의 아미노산 서열이 에피토프인 것으로 예상된다. In 8 μl of cell samples, SDS polyacrylamide buffer (0.15 M Tris-hydrochloric acid, pH 6.8, 6% SDS, 24% glycerol, 6 mM EDTA, 2% 2-mercaptoethanol, 0.03% bromophenol blue) , 4 µl of molecular weight markers (117.6, 113.9, 81.2, 60.7, 47.4, 36.1, 25.3, 19.0, 14.7, 6.1 KD)) were added, followed by sufficient stirring, followed by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis. Western blotting was performed on the nitrocellulose filter to perform transcription, blocking with 1% BSA, followed by reaction of monoclonal antibody FVA2-11 diluted 1000-fold with phosphate buffer (10 mM phosphoric acid, pH 7.4, 0.15 M sodium chloride). In addition, the peroxidase enzyme-labeled anti mouse immunoglobulin rabbit polyclonal antibody (manufactured by Dako) was reacted, and after washing, 10 ml of substrate chromophore (0.01% hydrogen peroxide, 0.6 mg / ml 4-chloro-1-naphthol) ) Was added. Each fragment is shown in FIG. 3. The result of CBB staining pattern and Western blot after the electrophoresis is shown in Figure 4. The above result showed that the recognition site of anti-influenza type A virus monoclonal antibody (FVA2-11) is the amino acid 59-130 area | region of influenza H1N1. Furthermore, from the nuclear protein amino acid sequence of the influenza type A subtype shown in FIG. 5, for example, having the arrangement common in the reaction sites of
참고예 1: 알칼리 포스파타아제 표지 항-인플루엔자 A형 바이러스 모노클로날 항체의 제조Reference Example 1 Preparation of Alkali Phosphatase Labeled Anti-Influenza Type A Virus Monoclonal Antibodies
상기 항-인플루엔자 A형 바이러스 모노클로날 항체(FVA2-11)을 펩신 처리하여 Fc 영역을 절단하여 F(ab')2를 얻고, 다음에 2ME(2-머캅토에탄올, 나카라이테스크사 제조)를 사용하여 디술피드 결합을 절단하고, 유리 티올기를 노출시킨 F(ab')를 얻었다. 다음에, 말레이미드기를 도입한 알칼리 포스파타아제와 F(ab')를 커플링하고, 겔 여과로 정제 알칼리 포스파타아제 표지 항-인플루엔자 A형 바이러스 항체를 얻었다. The anti-influenza type A virus monoclonal antibody (FVA2-11) was pepsin-treated to cleave the Fc region to obtain F (ab ') 2 , followed by 2ME (2-mercaptoethanol manufactured by Nakaray Tesque Co., Ltd.). The disulfide bond was cleaved using to obtain F (ab ') exposing the free thiol group. Next, alkaline phosphatase incorporating a maleimide group and F (ab ') were coupled to each other to obtain purified alkaline phosphatase-labeled anti-influenza A virus antibody by gel filtration.
참고예 2: 항-인플루엔자 B형 바이러스 모노클로날 항체의 제조Reference Example 2 Preparation of Anti-Influenza B Virus Monoclonal Antibodies
면역원으로는 인플루엔자 핵 단백질 항원을 함유하는 인플루엔자 HA 백신(B/야마나시/166/98주) 또는 인플루엔자 A형 재조합 핵 단백질 항원(A/뉴 칼레도니아/20/99 유래(r-NP/H1N1), A/키타큐슈/159/93 유래(r-NP/H3N2))을 사용하였다. Immunogens include influenza HA vaccines containing influenza nuclear protein antigens (B / Yanana City / 166/98) or influenza A recombinant nuclear protein antigens (A / New Caledonia / 20/99 derived (r-NP / H1N1), A / Kitakyushu / 159/93 derived (r-NP / H3N2)) was used.
면역원에 등량의 프로인트 완전 보조제(야토론사 제조)를 첨가하여 완전히 혼합한 후, Balb/c 마우스에 2 주 간격으로 총 4회 면역시켰다. 세포 융합 3 일 전에 마우스 복강 내에 면역원을 주사하고, PEG를 사용하여 마우스 비장 세포와 미엘로마 세포(P3U1)를 융합하였다. 배양액에는 HAT 선택 배지를 사용하고, 약 2 주 후에 배양 상청을 채취하여 스크리닝에 사용하였다. 1차 스크리닝에는, 인플루엔자 HA 백신, 인플루엔자 B형 재조합 핵 단백질 항원(r-NP/B)을 고상화한 효소 결합 면역흡착 분석법(ELISA법)을 사용하였다. 즉, 인플루엔자 HA 백신은 0.1 M 탄산 완충액 pH 9.6으로 300배 희석하고, 동일하게 B형 재조합 핵 단백질 항원은 1 ㎍/㎖의 농도로 희석하여 마이크로플레이트 모듈(눈크사 제조)의 각 웰에 100 ㎕씩 첨가하고, 4 ℃에서 밤새 배양하여 고상화하였다. 다음에, 0.1 ％의 Tween 20(상품명)을 포함하는 PBS(PBS-Tween)로 각 웰을 세정 후, PBS로 희석한 1 ％의 소혈청 알부민(BSA) 300 ㎕를 첨가하여 4 ℃에서 밤새 블록킹을 행하였다. 블록킹액을 제거한 후, 배양 상청을 100 ㎕씩 첨가하여 37 ℃에서 1 시간 동안 반응시켰다. PBS-Tween으로 충분히 세정한 후, 0.2 ％ BSA, 0.2 ％ 에말겐 985, 1 ％ 수크로오스, 1 ％ KCl을 포함하는 0.05 M 인산 완충액 pH 7.5(반응 용액)로 2000배 희석한 효소 표지 항 마우스 Igs 항체(다코(DAKO)사 제조)를 각 웰에 100 ㎕씩 첨가하여 37 ℃에서 1 시간 동안 반응시켰다. 반응 후 PBS-Tween으로 충분히 세정하고, 2.2'-아지노-비스-3-에틸벤조티아졸린-6-술폰산(ABTS)을 각 웰에 100 ㎕씩 첨가하여 실온에서 30 분간 반응시킨 후, 반응 정지액을 각 웰에 100 ㎕씩 첨가하여 주파장 415 nm, 부파장 490 nm에서 발색 수준을 측정하였다. An equal amount of Freund's complete adjuvant (manufactured by Yatoron Corporation) was added to the immunogen and thoroughly mixed, and Balb / c mice were immunized a total of 4 times at 2 week intervals. Immunogen was injected into the mouse
양성이라고 판정된 배양 상청에 대해서는, 인플루엔자 A형 재조합 핵 단백질 항원(A/뉴 칼레도니아/20/99 유래(r-NP/H1N1), A/키타큐슈/159/93 유래(r-NP/H3N2))을 항원으로 한 ELlSA로 2차 스크리닝을 행하고, 최종적으로 인플루엔자 B형 핵 단백질 항원에 반응하고, 인플루엔자 A형 핵 단백질 항원과는 반응하지 않는 항체를 생산하는 하이브리도마 3 주(FrB1-03, FrB1-07, FVB2-16)을 얻었다. 상기 각 하이브리도마는 산업 기술 종합 연구소 특허 생물 기탁 센터에 부다페이트 조약에 기초하여, 하이브리도마 FrB1-03, 기탁 번호 FERM BP-10070, 하이브리도마 FrB1-07, 기탁 번호 FERM BP-10071, 하이브리도마 FVB2-16, 기탁 번호 FERM BP-10069로서 기탁되어 있다. 상기 하이브리도마 3 주로부터 얻어진 모노클로날 항체의 서브클래스는 전부 IgG1이었다. About culture supernatant determined to be positive, Influenza type A recombinant nuclear protein antigen (derived from A / New Caledonia / 20/99 (r-NP / H1N1), derived from A / Kitakyushu / 159/93 (r-NP / H3N2)) 3 weeks of hybridomas (FrB1-03, which produce secondary antibodies which are subjected to secondary screening with ELlSA as an antigen) and finally react with influenza type B nuclear protein antigens and do not react with influenza type A nuclear protein antigens. FrB1-07, FVB2-16). Each of the hybridomas is based on the Budaate Treaty at the Institute of Industrial Technology, Patent Biology Deposit Center, Hybridoma FrB1-03, Deposit Number FERM BP-10070, Hybridoma FrB1-07, Deposit Number FERM BP-10071, Deposited as hybridoma FVB2-16, accession number FERM BP-10069. The subclasses of monoclonal antibodies obtained from the 3 weeks of hybridoma were all IgG1.
(모노클로날 항체의 웨스턴 블롯팅법에서의 반응성) (Reactivity in Western Blotting of Monoclonal Antibodies)
재조합 항원, 인플루엔자 HA 백신(핵 단백질 항원 함유)을 이용하여 웨스턴 블롯팅법에 의해 반응성을 확인하였다. SDS-PAGE는 e-파젤 10 ％ 겔 농도(아트사 제조)를 사용하여 통상법에 따랐다. 영동 후 PVDF막(아트사 제조)에 전사하고, 블록에이스(다이닛본 세이야꾸 제조)로써 4 ℃에서 밤새 블록킹을 행하였다. 블록킹액을 제거하고, PBS-Tween으로 세정 후, 10 ㎍/㎖의 농도로 조정한 모노클로날 항체를 첨가하여 실온에서 45 분간 반응시켰다. PBS-Tween으로 충분히 세정한 후, 반응 용액으로 4000배 희석한 효소 표지 항 마우스 IgG 항체(Cappel사 제조)를 실온에서 45 분간 반응시켰다. PBS-Tween으로 충분히 세정 후, ECL 웨스턴 블롯팅 검출 시스템(아머샴 바이오사이언스사 제조)를 사용하여 X선 필름(코닥사 제조)에 1 분간 노광시켜 시그널을 검출하였다. Reactivity was confirmed by Western blotting using a recombinant antigen, influenza HA vaccine (containing nuclear protein antigen). SDS-PAGE followed the conventional method using the e-Pazel 10% gel concentration (made by Art Corporation). After electrophoresis, it was transferred to a PVDF film (manufactured by Art Co., Ltd.) and blocked overnight at 4 ° C with a block ace (manufactured by Dainippon Seiyaku). The blocking solution was removed, washed with PBS-Tween, and then monoclonal antibodies adjusted to a concentration of 10 µg / ml were added to react for 45 minutes at room temperature. After sufficient washing with PBS-Tween, the enzyme-labeled anti mouse IgG antibody (manufactured by Cappel) diluted 4000-fold with the reaction solution was allowed to react for 45 minutes at room temperature. After sufficiently washing with PBS-Tween, the signal was detected by exposing the X-ray film (Kodak Co., Ltd.) for 1 minute using an ECL western blotting detection system (manufactured by Amersham Bioscience).
모노클로날 항체 FrB1-03, FrB1-07에서는, 60 내지 75 kD 부근에 강한 밴드가 확인되었다. In the monoclonal antibodies FrB1-03 and FrB1-07, a strong band was found around 60 to 75 kD.
참고예 3: 알칼리 포스파타아제 표지 항-인플루엔자 B형 바이러스 항체의 제조Reference Example 3 Preparation of Alkali Phosphatase Labeled Anti-Influenza B Virus Antibody
상기 참고예 2에서 제조한 항-인플루엔자 B형 바이러스 모노클로날 항체(FrB1-03)를 이용하여, 상기 실시예 참고예 1과 동일한 처리를 반복함으로써 알칼리 포스파타아제 표지 항-인플루엔자 B형 바이러스 항체를 얻었다. Using the anti-influenza B virus monoclonal antibody (FrB1-03) prepared in Reference Example 2 above, the same treatment as in Reference Example 1 was repeated to give an alkaline phosphatase-labeled anti-influenza B virus antibody. Got.
실시예 5: 인플루엔자 A형 바이러스 및 인플루엔자 B형 바이러스 동시 면역 측정 기구Example 5 Influenza A Virus and Influenza B Virus Simultaneous Immunoassay Apparatus
도 6에 나타낸 바와 같이, 폭 5 mm, 길이 50 mm의 니트로셀룰로오스 막(밀리포어사 제조)의 매트릭스 (2)의 전개액 흡수 존 (5)측의 말단에서 16 mm와 13.5 mm의 위치에 실시예 2에서 제조한 항-인플루엔자 A형 바이러스 항체(FVA2-11)와 참고예 2에서 제조한 항-인플루엔자 B형 바이러스 항체(FrB1-03)를 포함하는 수용액 0.7 ㎕를 니트로셀룰로오스 막에 각각 점착하여 건조시켜, 검출 존 (6a) 및 (6b)를 제조하였다. 또한, 매트릭스 (2)의 전개액 흡수 존 (5)측의 말단으로부터 11 mm의 위치에 항 알칼리 포스파타아제 항체(다코사 제조)를 점착하여 건조시켜, 전개액 확인부 (10)을 제조하였다. 다음으로, 매트릭스에 참고예 1에서 제조한 알칼리 포스파타아제 표지 항-인플루엔자 A형 바이러스 항체(5 ㎍/㎖)와 참고예 3에서 제조한 알칼리 포스파타아제 표지 항-인플루엔자 B형 바이러스 항체(5 ㎍/㎖)와의 혼합 수용액 5 ㎕를 점착하여 건조시켜 효소 표지 시약 패드 (4)를 포함하는 표지 시약 존을 제조하였다. As shown in FIG. 6, it implements in the position of 16 mm and 13.5 mm from the terminal of the developing
전개액 패드 (3)은, 폭 5 mm, 길이 20 mm의 여과지(밀리포어사 제조) 상에, 기질로서 5-브로모-4-클로로-3-인돌릴인산(BCIP) 100 ㎍을 폭 6.1 mm의 라인상으로 점착하여 건조시켜 제조하였다. 상기 매트릭스 (2), 전개액 패드 (3), 효소 표지 시약 패드 (4) 및 전개액 흡수 패드 (5)(폭 10 mm, 길이 20 mm, 두께 1 mm의 여과지(와트만사 제조))를, 전개액조 (11)을 갖는 플라스틱 케이스에 고정하고, 도 7 및 8에 나타내는 인플루엔자 A형 바이러스 및 B형 바이러스 동시 면역 측정 기구 (1)을 제조하였다. The developing
참고예 4: 인플루엔자 A형 바이러스 및 B형 바이러스 동시 면역 측정 기구(종래법 기구) Reference Example 4: Influenza A Virus and B Virus Simultaneous Immunoassay Mechanism (Prior Art Apparatus)
실시예 3에서 제조한 제조한 인플루엔자 A형 바이러스 및 B형 바이러스 동시 면역 측정 기구 (1)의 검출 존 (6a) 및 (6b), 알칼리 포스파타아제 표지 항-인플루엔자 바이러스 항체에 대하여, 각각 구입한 항-인플루엔자 A형 바이러스 모노클로날 항체 및 항-인플루엔자 B형 바이러스 모노클로날 항체를 이용하여 제조하고, 인플루엔자 A형 바이러스 및 B형 바이러스 동시 면역 측정 기구(ESPLINE 인플루엔자 A&B(후지레비오사 제조); 종래 측정 기구)를 제조하였다. The detection zones (6a) and (6b) and alkaline phosphatase-labeled anti-influenza virus antibodies of the prepared influenza A virus and B virus simultaneous immunoassay instrument (1) prepared in Example 3 were each purchased. Prepared using anti-influenza type A virus monoclonal antibody and anti-influenza type B virus monoclonal antibody, and an influenza type A virus and type B virus immunoassay instrument (ESPLINE influenza A & B (manufactured by Fujirebio); Conventional measuring instruments).
실시예 6: 인플루엔자 A형 바이러스 및 인플루엔자 B형 바이러스의 측정Example 6: Measurement of Influenza A Virus and Influenza B Virus
상기 실시예 5에서 제조한 인플루엔자 A형 바이러스 및 인플루엔자 B형 바이러스 동시 측정 기구 (1)(본 발명 측정 기구)의 검체 점착 존 (8)에 표 3에 기재된인플루엔자 A형 바이러스의 아형 시료(시료 희석액으로서, 계면활성제를 포함하는 트리스 완충액(pH 8.0)을 사용) 각 30 ㎕를 점착시킨 후, 변형 부재에 설치한 압입부 (12)를 아래쪽으로 가압하여 변형시키고, 변형 부재에 부설된 돌기부 (13)에 의해서 전개액 패드 (3)을 전개액조 (11)에 삽입하여 전개액을 전개액 패드 (3)에 공급하여 측정을 개시하였다. 측정 개시 15 분 후, 대상 시약 존 (10)의 발색에 의해서 전개액의 전개를 확인한 후, 검출 존 (6a) 및 (6b)의 발색을 육안으로 측정하였다. 그 결과를 표 3에 나타내었다. Subtype sample of influenza A virus shown in Table 3 in the sample adhesion zone (8) of the influenza A virus and influenza B virus simultaneous measurement instrument (1) (measurement instrument of the present invention) prepared in Example 5 (sample dilution solution) For example, each 30 μl of a tris buffer solution containing a surfactant (pH 8.0) was adhered to each other, and the press-fitting
또한, 대조로서, 참고예 4에서 제조한 종래 측정 기구에 의해서 표 3에 기재된 상기 시료 30 ㎕에 대하여 동일하게 바이러스의 검출을 행하였다. 그 측정 결과를 표 3에 나타내었다. In addition, as a control, the virus was detected with respect to 30 microliters of the said samples of Table 3 by the conventional measuring instrument manufactured by the reference example 4. The measurement results are shown in Table 3.
결과로부터 종래 측정 기구에서는 검출할 수 없었던 인플루엔자 A형 바이러스의 아형 검체에 대하여, 본 발명 측정 기구에서는 전부 검출 가능하였다. From the results, all of the subtype specimens of influenza A virus which could not be detected by the conventional measuring instrument were detected by the measuring instrument of the present invention.
실시예 7Example 7
상기 실시예 5에서 제조한 인플루엔자 A형 바이러스 및 인플루엔자 B형 바이러스 동시 측정 기구 (1)(본 발명 측정 기구)를 이용하고, 실시예 6과 동일하게 하여 아데노 바이러스(1 내지 7형), 코쿠사키 바이러스(A16, B1 내지 B6형), 단순 헤르페스 바이러스 1형, 에코 바이러스(3형, 4형, 7형, 22형, 30형), 엔테로 바이러스(71형), 문프스 바이러스, 폴리오 바이러스(1 내지 3형), RS 바이러스(서브그룹 A, 서브그룹 B), 파라인플루엔자 바이러스(1 내지 3형), 대장균, 폐렴간균, 녹농균, 영균, 표피 포도 구균, 변형균, 황색 포도 구균, 코리네 박테리아, 디프테리아, 칸디다ㆍ알비칸스, 화농 연쇄 구균, 스트렙토코커스속(그룹 B, C, G, F), 폐렴 연쇄 구균, 헤모필루스속 인플루엔자, 리스테리아ㆍ모노사이토게네스, 폐렴 마이코플라즈마, 클라미디아ㆍ트라코마티스, 클라미디아ㆍ뉴모니에와의 교차 반응성을 조사하였다. 그 결과, 이들 중 어떤 바이러스 또는 균과도 반응하지 않았다. Adenoviruses (
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A201 | Request for examination | ||
| AMND | Amendment | ||
| E902 | Notification of reason for refusal | ||
| AMND | Amendment | ||
| E601 | Decision to refuse application | ||
| AMND | Amendment | ||
| J201 | Request for trial against refusal decision | ||
| B701 | Decision to grant | ||
| N231 | Notification of change of applicant | ||
| GRNT | Written decision to grant | ||
| LAPS | Lapse due to unpaid annual fee |