KR101329344B1 - Antibody for Detecting Hemagglutinin of Swine Influenza and Use Thereof - Google Patents
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Abstract
돼지인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌(Hemagglutinin)의 항원결정부위(epitope), 이를 사용하여 제조된 항체, 상기 항체를 포함하는 돼지인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌 타입별 검출 키트, 상기 항체를 이용하는 돼지인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌 타입별 검출 방법, 및 상기 항원결정부위를 포함하는 백신 조성물이 제공되며, 상기 검출 키트 및 검출 방법은 돼지인플루엔자 바이러스 감염에 따른 헤마글루티닌 항원형 1형 또는 3형을 감별 검출하여 돼지인플루엔자 감염 타입을 진단할 수 있는 것을 특징으로 한다.Antigen epitope of swine influenza virus Hemagglutinin, antibody prepared using the same, swine influenza virus hemagglutinin-type detection kit comprising the antibody, swine influenza virus hemagglutinin using the antibody Magglutinin type detection method, and a vaccine composition comprising the antigenic determination site is provided, the detection kit and detection method by differentially detecting hemagglutinin antigen type 1 or type 3 according to swine influenza virus infection It is characterized by being able to diagnose a swine influenza infection type.
Description
본 발명은 돼지인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌(Hemagglutinin)의 항원결정부위(epitope), 이를 사용하여 제조된 항체, 상기 항체를 포함하는 돼지인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌 타입별 검출 키트, 상기 항체를 이용하는 돼지인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌 타입별 검출 방법, 및 상기 항원결정부위를 포함하는 백신 조성물에 관한 것이다.
The present invention is epitope of the swine influenza virus hemagglutinin (epitope), an antibody prepared using the same, a pig influenza virus hemagglutinin-type detection kit comprising the antibody, pig using the antibody The present invention relates to a method for detecting influenza virus hemagglutinin and a vaccine composition comprising the epitope.
돼지 인플루엔자(Swine Influenza)는 influenza type A H1N1 virus가 1930년도에 처음 확인 되었으며, 현재 유행하고 있는 신종 인플루엔자바이러스를 미 질병예방통제센터(CDC)가 미국인 신종인플루 감염자로부터 추출한 H1N1 바이러스 샘플을 분석한 결과 이번 바이러스는 지금까지 돼지, 조류, 인간에서 발견되지 않은 혼합종으로 밝혀졌다. 기존 돼지 인플루엔자 바이러스에 조류 인플루엔자와 사람 인플루엔자가 합쳐지는 과정에서 유전체 변형이 일어나 돼지끼리 퍼지던 바이러스가 사람 간에도 전파되고 있는 상황이다. Swine Influenza was first identified as influenza type A H1N1 virus in 1930, and H1N1 virus samples obtained by the US Centers for Disease Control and Prevention (CDC) extracted from the H1N1 influenza virus. The virus has been found to be a mixed species not found in pigs, birds and humans. In the process of combining avian influenza and human influenza with the existing swine influenza virus, a genome modification occurs and a virus spread between pigs is spreading among humans.
현재 세계보건기구(WHO)도 경보단계를 현재 대유행 경고(Pandemic alert) 단계로 사람과 사람 간의 감염에 대한 의미 있는 증거가 존재하는 5단계에서 최고 수준인 대유행(Pandemic) 단계인 효율적이고 지속적인 사람과 사람 간의 감염의 6단계로 상향할 것을 검토하는 등 국제적으로 신종인플루엔자의 위력이 여전하다. 이러한 인플루엔자바이러스(Influenza virus)는 사람, 말, 조류, 돼지 등의 동물에서 질병을 일으키고 있으며, 이들 종간에도 서로 감염된다는 보고되고 있다. Currently, the World Health Organization (WHO) also uses the alert stage as the current pandemic alert stage, with efficient and sustained human and pandemic stages, the highest level in
특히, 돼지의 tracheal epithelium은 조류 인플루엔자바이러스의 수용체(receptor, α-2,3-N-acetylneuraminic acid-galactose linkages)와 사람 인플루엔자바이러스의 수용체(receptor, α-2,6-N- acetylneuraminic acid-galactose linkages)가 모두 발현되며, 이러한 이중 감수성은 인간에게 대유행 잠재력을 갖는 새로운 인플루엔자바이러스의 출현에 대한 mixing vessel로서 돼지와 연관이 있다.In particular, the pig tracheal epithelium is a receptor for avian influenza virus (receptor, α-2,3-N-acetylneuraminic acid-galactose linkages) and human influenza virus (receptor, α-2,6-N-acetylneuraminic acid-galactose linkages) are expressed, and this double sensitivity is associated with pigs as a mixing vessel for the emergence of new influenza viruses with pandemic potential in humans.
인플루엔자바이러스의 종간 전파여부는 많이 연구되어 왔고, life cycle이 짧은 돼지의 인플루엔자바이러스가 human strain보다 항원성의 변화가 적고, 변이원성이 적어 reservoir 역할을 하는지에 관해 지대한 관심을 가지고 연구하고 있으며, 1918년의 pandemic도 최근의 연구에 의하면 돼지와 유사한 인플루엔자바이러스가 원인체였고, 이후에도 사람이 돼지 인플루엔자바이러스에 감염 된 보고가 있다. The spread of influenza virus species has been studied a lot, and it is studied with great interest whether the influenza virus of pigs with a short life cycle acts as a reservoir due to less antigenic changes and less mutagenicity than human strains. Recent studies have shown that pandemic was caused by swine-like influenza viruses, and humans have been infected with swine influenza virus.
반대로 돼지가 사람의 인플루엔자바이러스에 의해 감염된 예로 human H1N1 subtype variants에 대한 항체가 돼지 혈청중에서 검출된 예도 있으며, 이런 보고를 통해서 인플루엔자바이러스의 종간 전파여부가 많이 연구되어 있음을 알 수 있다. On the contrary, in some cases, the pigs were infected with human influenza virus, and antibodies to human H1N1 subtype variants were detected in pig serum, and these reports indicate that the spread of influenza virus species has been studied.
Influenza A strain의 대유행은 human strain과 non-human strain의 인플루엔자바이러스가 공통숙주에 복합감염되어 reassortment 가 자연적으로 생겨 발생한 것이라는 추측도 있다. 돼지는 사람 인플루엔자바이러스에 감수성이 있어 H1N1, H3N2 subtype의 잠재적인 reservoir 역할을 할 수 있다. Scholtissek et al 은 돼지에 서로 다른 subtype의 virus가 감염되어 이들이 증식과정에서 서로 유전자를 교환하여 reassortment virus의 출현 및 새로운 pandemic이 일어나는데 중요하다고 제안하였다. 이러한 사실들은 사람 인플루엔자 바이러스의 발생과정에서 돼지 인플루엔자바이러스가 중요한 위치를 차지한다고 볼 수 있다.The pandemic of influenza A strains has been speculated that spontaneous reassortment of human and non-human strains of influenza virus resulted from a complex infection in a common host. Pigs are susceptible to human influenza virus and may serve as potential reservoirs of the H1N1 and H3N2 subtypes. Scholtissek et al suggested that pigs are infected with different subtypes of viruses, and that they are important for the emergence of reassortment virus and new pandemic by exchanging genes. These facts suggest that swine influenza virus plays an important role in the development of human influenza virus.
현재 다년간의 경험에 따라 조류 인플루엔자 바이러스의 감시체계 및 진단시스템은 이미 구축되어 있으나, 돼지 인플루엔자 바이러스의 감시체계 및 진단시스템은 개발이 미미한 실정이다. 또한 기존의 상용화된 조류 인플루엔자 바이러스 진단 키트의 경우 낮은 민감도(104.5 ~105.5 EID/mL)와 돼지 가검물의 비특이 반응발생 등의 가능성으로 사용여부가 불확실한 상태이다. The surveillance system and diagnosis system of avian influenza virus have already been established according to many years of experience. However, the surveillance system and diagnosis system of swine influenza virus have not been developed. In addition, the existing commercialized avian influenza virus diagnostic kit is uncertain because of the low sensitivity (10 4.5 ~ 10 5.5 EID / mL) and the possibility of nonspecific reaction of pig specimens.
따라서, 돼지인플루엔자 바이러스의 지속적인 현장 모니터링 시스템을 구축하는 것이 시급하며, 돼지 인플루엔자바이러스의 지역별, 시기별 혈청형의 변화양상 및 감염정도를 분석하여 돼지로부터 발생될 수 있는 신종 인플루엔자바이러스 지속적인 감시 체계를 구축할 것이 요구된다.
Therefore, it is urgent to establish a continuous on-site monitoring system for swine influenza virus, and to establish a continuous surveillance system for swine influenza virus that can be generated from pigs by analyzing the change pattern and the extent of infection of the swine influenza virus by region and time. It is required to do
이러한 요구에 부응하여, 본 발명의 일례는 돼지인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌(Hemagglutinin) 서열의 특정 부분을 포함하는 돼지인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌 단백질의 항원형 특이 항원결정부위(epitope)를 제공한다.In response to this need, one embodiment of the present invention provides an antigenic specific epitope of the swine influenza virus hemagglutinin protein comprising a specific portion of the swine influenza virus hemagglutinin sequence.
다른 예는 상기 돼지인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌 단백질의 항원형 특이 항원결정부위(epitope)를 항원으로 하여 제조된 항체를 제공한다.Another example provides an antibody prepared by using the antigen-type epitope of the swine influenza virus hemagglutinin protein as an antigen.
또 다른 예는 상기 항체를 포함하는 돼지인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌 항원형 타입별 검출용 키트를 제공한다.Another example provides a swine influenza virus hemagglutinin antigen-type detection kit comprising the antibody.
또 다른 예는 상기 항체를 돼지인플루엔자를 포함하는 시료에 반응시키고, 상기 항체에 대하여 양성반응을 탐지하여 돼지인플루엔자 헤마글루티닌 항원형 타입을 검출하는 방법을 제공한다.Another example provides a method of detecting a swine influenza hemagglutinin antigen type by reacting the antibody with a sample comprising swine influenza and detecting a positive response to the antibody.
또 다른 예는 상기 항체를 포함하는 돼지인플루엔자 감염의 예방 및/또는 치료용 조성물을 제공한다.Another example provides a composition for preventing and / or treating swine influenza infection comprising the antibody.
또 다른 예는 상기 항원결정부위, 이를 코딩하는 DNA 분자, 이를 포함하는 발현 벡터, 및/또는 상기 발현벡터로 형질전환된 형질전환 세포를 포함하는 돼지인플루엔자에 대한 백신 조성물을 제공한다.
Another example provides a vaccine composition for swine influenza comprising the epitope, a DNA molecule encoding the same, an expression vector comprising the same, and / or a transformed cell transformed with the expression vector.
본 발명자들은 돼지인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌(Hemagglutinin) 서열의 일부이며 헤마글루티닌 항원형 타입별 특이성을 갖는 12개의 아미노산 서열을 탐색하고(표 1 및 도 1 참조), 이들의 항원결정부위(epitope)로서의 용도를 확인하여 본 발명을 완성하였다. 본 발명에서 항원결정부위로서 탐색된 아미노산 서열은 헤마글루티닌 항원형 타입별, 특히 헤마글루티닌 항원형 1형 또는 3형에 대하여 특이적인 것을 특징으로 한다.We searched for 12 amino acid sequences that are part of the swine influenza virus Hemagglutinin sequence and have specificity by type of hemagglutinin antigen type (see Table 1 and Figure 1), and their epitope sites ( The present invention was completed by confirming the use as an epitope). In the present invention, the amino acid sequence searched as the epitope is characterized by hemagglutinin antigen-type type, in particular,
따라서, 본 발명의 일례는 표 1의 SEQ ID NO: 1 내지 12로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드를 포함하는 돼지인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌의 항원결정부위 폴리펩타이드 분자를 제공한다.Accordingly, one embodiment of the present invention provides a polypeptide molecule of the epitope of swine influenza virus hemagglutinin comprising a polypeptide consisting of an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1 to 12 of Table 1.
한 구체예에서, 상기 항원결정부위 폴리펩타이드 분자는 SEQ ID NO: 1 내지 6으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드를 포함하는 돼지인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌 항원형 1형 단백질의 항원결정부위 폴리펩타이드 분자일 수 있다. 또 다른 구체예에서, 상기 항원결정부위 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 7 내지 12로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드를 포함하는 돼지인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌 항원형 3형 단백질의 항원결정부위 폴리펩타이드 분자일 수 있다.In one embodiment, the epitope polypeptide molecule is an epitope of a swine influenza virus
본 명세서에 사용되는 바로서, '항원결정부위 폴리펩타이드 분자'는 SEQ ID NO: 1 내지 12로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드의 돼지인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌 항원형 1형 또는 3형 단백질의 항원결정부위로서의 용도의 물질적 표현이다.As used herein, an 'antigenic site polypeptide molecule' is a swine influenza virus
본 발명의 다른 예는 상기 SEQ ID NO: 1 내지 12로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드를 포함하는 항원결정부위를 특이적으로 인식하는(또는 특이적으로 결합하는) 돼지인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌에 대한 항체를 제공한다. 일례에서, 상기 항체는 SEQ ID NO: 1 내지 6으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드를 포함하는 1종 이상의 항원결정부위 폴리펩타이드 분자를 특이적으로 인식하는, 돼지인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌 항원형 1형 단백질에 특이적인 항체일 수 있다. 또 다른 예에서, 상기 항체는 SEQ ID NO: 7 내지 12로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드를 포함하는 1종 이상의 항원결정부위 폴리펩타이드 분자를 특이적으로 인식하는 돼지인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌 항원형 3형 단백질에 특이적인 항체일 수 있다.Another example of the invention is swine influenza virus hemaggle that specifically recognizes (or specifically binds) an epitope comprising a polypeptide consisting of an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1-12 It provides an antibody against rutinin. In one example, the antibody specifically recognizes at least one epitope polypeptide molecule comprising a polypeptide consisting of an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1-6, porcine influenza virus hemagglutinin It may be an antibody specific for
상기 돼지인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌 항원형 1형 단백질에 특이적 항체는 SEQ ID NO: 1 내지 6으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드를 포함하는 돼지인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌 항원형 1형 단백질의 항원결정부위를 포함하는 폴리펩타이드 분자를 항원으로 하여 통상의 방법으로 제조된 것일 수 있다. 또한, 상기 돼지인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌 항원형 3형 단백질에 특이적 항체는 SEQ ID NO: 7 내지 12로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드를 포함하는 돼지인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌 항원형 3형 단백질의 항원결정부위를 포함하는 폴리펩타이드 분자를 항원으로 하여 통상의 방법으로 제조된 것일 수 있다.The swine influenza virus
예컨대, 상기 SEQ ID NO: 1 내지 6으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드를 포함하는 돼지인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌 항원형 1형 단백질의 항원결정부위 또는 SEQ ID NO: 7 내지 12로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드를 포함하는 돼지인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌 항원형 3형 단백질의 항원결정부위를 포함하는 펩타이드 분자를 항원으로 토끼 또는 마우스 등과 같이 통상적으로 사용되는 동물에 주입하여 제조된 항체일 수 있다. For example, the epitope of the swine influenza virus
상기 항체는 다클론 항체 또는 단클론 항체인 항체일 수 있다. 한 구체예에서, 상기 돼지인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌 항원형 1형 단백질에 특이적 항체 또는 돼지인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌 항원형 3형 단백질에 특이적 항체는 상기 돼지인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌 항원형 1형 또는 3형 단백질의 항원결정부위를 포함하는 폴리펩타이드를 주입한 마우스로부터 통상적인 방법으로 얻어진 하이브리도마 세포에 의하여 통상적인 방법으로 생산된 단클론 항체일 수 있다. 또 다른 구체예에서, 상기 항체는 SEQ ID NO: 1 내지 6으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드를 포함하는 2종 이상의 돼지인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌 항원형 1형 단백질의 항원결정부위 또는 SEQ ID NO: 7 내지 12로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드를 포함하는 2종 이상의 돼지인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌 항원형 3형 단백질의 항원결정부위를 혼합하여, 토끼 또는 마우스 등의 통상적으로 사용되는 동물에 투여하여 통상적인 방법으로 제조되는 다클론 항체일 수 있다. The antibody may be an antibody that is a polyclonal antibody or a monoclonal antibody. In one embodiment, the antibody specific for the swine influenza virus
상기와 같이 얻어진 항체는 돼지인플루엔자 바이러스, 바람직하게는 돼지인플루엔자 바이러스의 헤마글루티닌 항원형 유형별로 특이적인 항원결정부위를 특이적으로 인식하므로, 이를 이용하여 돼지인플루엔자 바이러스의 검출, 바람직하게는 돼지인플루엔자 바이러스의 헤마글루티닌 항원형 유형별 (제1형 또는 제3형) 검출이 가능하다.The antibody obtained as described above specifically recognizes specific antigenic sites according to hemagglutinin antigen-type types of swine influenza virus, preferably swine influenza virus, and thus detects swine influenza virus, preferably swine. Detection of hemagglutinin antigen type (
따라서, 본 발명의 다른 예는 상기 항체를 1종 이상 포함하는 돼지인플루엔자 바이러스 검출용 키트를 제공한다. 한 구체예에서, 상기 키트는 SEQ ID NO: 1 내지 6으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드를 포함하는 항원결정부위 폴리펩타이드 분자를 특이적으로 인식하는 항체를 1종 이상 포함하는 돼지인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌 항원형 1형 검출용(또는 헤마글루티닌 항원형 1형의 돼지인플루엔자 바이러스 검출용) 키트일 수 있다. 다른 구체예에서, 상기 키트는 SEQ ID NO: 7 내지 12로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드를 포함하는 항원결정부위 폴리펩타이드 분자를 특이적으로 인식하는 항체를 1종 이상 포함하는 돼지인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌 항원형 3형 검출용(또는 헤마글루티닌 항원형 3형의 돼지인플루엔자 바이러스 검출용) 키트일 수 있다. 또 다른 구체예에서, 상기 키트는 SEQ ID NO: 1 내지 6으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드를 포함하는 항원결정부위 폴리펩타이드 분자를 특이적으로 인식하는 항체 1종 이상; 및 SEQ ID NO: 7 내지 12로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드를 포함하는 항원결정부위 폴리펩타이드 분자를 특이적으로 인식하는 항체 1종 이상을 포함하는, 돼지인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌 항원형 1형과 3형의 동시 검출용 키트일 수 있다.Therefore, another example of the present invention provides a kit for detecting swine influenza virus comprising at least one of the above antibodies. In one embodiment, the kit is swine influenza comprising at least one antibody that specifically recognizes an epitope polypeptide molecule comprising a polypeptide consisting of an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1-6. Kit for detecting viral hemagglutinin antigen type 1 (or for detecting swine influenza virus of hemagglutinin antigen type 1). In another embodiment, the kit comprises swine influenza comprising at least one antibody that specifically recognizes an epitope polypeptide molecule comprising a polypeptide consisting of an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 7-12. Kit for detecting viral hemagglutinin antigen type 3 (or for detecting swine influenza virus of hemagglutinin antigen type 3). In another embodiment, the kit comprises at least one antibody that specifically recognizes an epitope polypeptide molecule comprising a polypeptide consisting of an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1-6; And at least one antibody that specifically recognizes an epitope polypeptide molecule comprising a polypeptide consisting of an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 7 to 12, porcine influenza virus hemagglutinin anti It may be a
상기 키트는 포함된 항체와 여기에 적용될 시료 중의 항원(항원결정부위)과의 반응을 확인할 수 있는 표지 수단을 추가로 포함할 수 있다. 상기 반응 확인 표지 수단은 특별한 제한이 없으며, 예컨대, 면역크로마토그래피(Immunochromatography), 유세포측정, 면역조직화학염색, 효소결합 면역흡착 분석(enzyme liked immunosorbent assay: ELISA), 방사선 면역측정법(radioimmunoassay: RIA), 효소 면역분석(enzyme immunoassay: EIA), 형광면역분석(Floresence immunoassay: FIA), 발광면역분석(luminescence immunoassay: LIA)으로 이루어진 군으로부터 선택된 방법을 실시하기 위하여 통상적으로 사용되는 모든 수단일 수 있다. The kit may further include a labeling means for confirming the reaction between the antibody included and the antigen (antigen determination site) in the sample to be applied thereto. The reaction confirmation labeling means is not particularly limited and includes, for example, immunochromatography, flow cytometry, immunohistochemical staining, enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), radioimmunoassay (RIA) , An enzyme immunoassay (EIA), a fluorescence immunoassay (FIA), and a luminescence immunoassay (LIA).
상기 표지 수단을 검출하는 방법은 표지인자의 종류에 따라 당업자에게 공지된 방법을 이용할 수 있으며, 구체적으로는 육안, 검출장비, 검출시약 등을 이용할 수 있다. 상기 검출시약은 검사하고자 하는 표지 인자(analyte)의 존재를 육안 또는 기타 기구를 통해 외부에서 식별이 가능하도록 해 주는 소정의 표지 시약(labeled reagent), 보조적 특이결합부재, 및/또는 신호발생 시스템의 구성 성분을 포함할 수 있다. 표지된 검출시약은 이미 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 잘 알려져 있다. 이러한 표지의 예는 촉매, 효소(예를 들어, 포스파타제, 퍼옥시다제 등으로서, 보다 구체적인 예로는 효소 기질과 결합하여 함께 사용되는 염기성 포스파타제와 양고추 퍼옥시다제 등), 효소기질(예를 들어, 니트로블루테트라졸리움, 3,5',5,5'-테트라니트로벤지딘, 4-메톡시1나프톨, 4클로로1나프톨, 5-브로모-4-클로로-3-인돌일포스페이트, 화학발광 효소기질로는 디옥세탄, 및 유도체와 이들의 유사체), 형광화합물(예를 들면, 플로우레세인(fluorescein),피코빌리프로틴(phycobiliprotein),로다민(rhodamine)등과 이들 유도체 및 유사체), 화학발광화합물, 금속졸(Metal sol), 염료졸(Dye sol), 미립자 라텍스(Particulate latex), 칼라인디케이터(Color Indicator), 리포좀에 포함된 색재료(Color matter), 탄소졸 및 셀레늄과 같은 비금속졸 등이 있다. 일예로, 표지수단으로는 효소의 경우 HRP(horse radishperoxidase)가 있으며, 형광물질로는 FITC(Fluoresceinthiocarbamyl ethylenediamine)가, 발광물질로는 루미놀(luminol), 이소루미놀 및 루시게닌(lucigenin)이, 방사선 동위원소로는 125I, 3H, 14C 및 131I가 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 표지 수단에 의한 표지 여부는 효소의 기질이나, 형광, 발광 또는 방사선을 측정하기 위한 도구를 이용하여 확인 가능하다. 일예로 상기 항체는 ELISA 키트 또는 스트립 키트로 제조될 수 있다.The method for detecting the labeling means may use a method known to those skilled in the art according to the type of labeling factor, and specifically, the naked eye, a detection device, a detection reagent, or the like may be used. The detection reagent may be provided by a predetermined labeling reagent, an auxiliary specific binding member, and / or a signaling system, which enables the external identification of the presence of an analyte to be tested by the naked eye or other apparatus. It may comprise a component. Labeled detection reagents are well known to those of ordinary skill in the art. Examples of such labels include catalysts, enzymes (e.g., phosphatase, peroxidase, etc., and more specific examples include basic phosphatase and red pepper peroxidase used in conjunction with enzyme substrates), enzyme substrates (e.g. , Nitrobluetetrazolium, 3,5 ', 5,5'-tetranitrobenzidine, 4-methoxy1naphthol, 4chloro1naphthol, 5-bromo-4-chloro-3-indolylphosphate, chemiluminescent enzyme Substrates include dioxetane and derivatives and analogs thereof, fluorescent compounds (e.g., fluorescein, phycobiliprotein, rhodamine and the like and derivatives and analogues), chemiluminescent compounds , Metal sol, dye sol, particulate latex, color indicator, color matter contained in liposomes, non-metal sol such as carbon sol and selenium have. For example, as a labeling means, enzymes include horse radishperoxidase (HRP), fluorescent materials include FITC (Fluoresceinthiocarbamyl ethylenediamine), and light emitting materials include luminol, isoluminol and lucigenin, and radioisotope. Elements include, but are not limited to, 125I, 3H, 14C, and 131I. Labeling by the labeling means can be confirmed using a substrate for measuring the enzyme or a tool for measuring fluorescence, luminescence or radiation. In one embodiment, the antibody may be prepared as an ELISA kit or a strip kit.
상기한 항체의 돼지인플루엔자 바이러스의 검출, 바람직하게는 돼지인플루엔자 바이러스의 헤마글루티닌 항원형 유형별 (제1형 또는 제3형) 검출 용도에 근거하여, 본 발명의 또 다른 예는 상기 항체를 이용한 돼지인플루엔자 바이러스의 검출 방법을 제공한다. 보다 구체적으로, 상기 검출 방법은Based on the detection of the swine influenza virus of the above-described antibody, preferably the hemagglutinin antigen-type type (
생물 시료를 준비하는 단계;Preparing a biological sample;
상기 시료에 SEQ ID NO: 1 내지 12로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드를 포함하는 항원결정부위 폴리펩타이드 분자를 특이적으로 인식하는 1종 이상의 항체를 적용하는 단계; 및Applying to the sample at least one antibody that specifically recognizes an epitope polypeptide molecule comprising a polypeptide consisting of an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1-12; And
항원-항체 반응을 검사하는 단계Testing antigen-antibody responses
를 포함할 수 있다.. ≪ / RTI >
한 구체예에서, 상기 검출 방법은 시료에 SEQ ID NO: 1 내지 6으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드를 포함하는 항원결정부위 폴리펩타이드 분자를 특이적으로 인식하는 1종 이상의 항체를 적용하는 단계를 포함하는, 돼지인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌 항원형 1형 검출 (또는 헤마글루티닌 항원형 1형의 돼지인플루엔자 바이러스 검출) 방법일 수 있다. 다른 구체예에서, 상기 검출 방법은 시료에 SEQ ID NO: 7 내지 12로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드를 포함하는 항원결정부위 폴리펩타이드 분자를 특이적으로 인식하는 1종 이상의 항체를 적용하는 단계를 포함하는, 돼지인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌 항원형 3형 검출 (또는 헤마글루티닌 항원형 3형의 돼지인플루엔자 바이러스 검출) 방법일 수 있다. 또 다른 구체예에서, 상기 검출 방법은 시료에 SEQ ID NO: 1 내지 6으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드를 포함하는 항원결정부위 폴리펩타이드 분자를 특이적으로 인식하는 1종 이상의 항체 및 SEQ ID NO: 7 내지 12로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드를 포함하는 항원결정부위 폴리펩타이드 분자를 특이적으로 인식하는 1종 이상의 항체를 적용하는 단계를 포함하는, 돼지인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌 항원형 1형 및 3형의 동시 검출 (또는 헤마글루티닌 항원형 1형 및 3형의 돼지인플루엔자 바이러스의 동시 검출) 방법일 수 있다.In one embodiment, the detection method is applied to one or more antibodies that specifically recognize epitope polypeptide molecules comprising a polypeptide consisting of an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1 to 6 to a sample. Swine influenza virus
상기 시료는 돼지인플루엔자 바이러스 존재 여부 및/또는 돼지인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌 항원형 유형별 조사를 필요로 하는 모든 생물학적 시료를 의미한다. 예컨대, 상기 시료는 동물, 바람직하게는 조류 또는 포유류로부터 분리된 타액, 혈액 등의 체액, 세포, 조직, 가검물 등의 생물학적 시료 등일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. The sample refers to all biological samples requiring the presence of swine influenza virus and / or swine influenza virus hemagglutinin antigen type-specific investigation. For example, the sample may be, but is not limited to, biological samples such as saliva, body fluids such as blood, cells, tissues, and the like isolated from animals, preferably birds or mammals.
상기 항원-항체 반응에서 양성반응이 검출되면 해당 유형의 돼지인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌이 존재하는 것으로 판단할 수 있다. 상기 항원-항체 반응의 양성 반응은 통상적인 효소 반응, 형광, 발광 및/또는 방사선 검출을 통하여 하여 탐지될 수 있다. 보다 구체적으로, 면역크로마토그래피(Immunochromatography), 유세포측정, 면역조직화학염색, 효소결합 면역흡착 분석(enzyme liked immunosorbent assay: ELISA), 방사선 면역측정법(radioimmunoassay: RIA), 효소 면역분석(enzyme immunoassay: EIA), 형광면역분석(Floresence immunoassay: FIA), 발광면역분석(luminescence immunoassay: LIA) 등으로 이루어진 군으로부터 선택된 방법일 수 있다. 여기에 사용되는 표지 인자는 상기 키트 부분에서 설명한 바와 같다. If a positive reaction is detected in the antigen-antibody reaction, it may be determined that the swine influenza virus hemagglutinin exists. Positive reactions of the antigen-antibody reactions can be detected through conventional enzymatic reactions, fluorescence, luminescence and / or radiation detection. More specifically, immunochromatography, flow cytometry, immunohistochemical staining, enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), radioimmunoassay (RIA), enzyme immunoassay (EIA) ), Fluorescence immunoassay (FIA), luminescence immunoassay (LIA) and the like. Labeling factors used herein are as described in the kit section above.
또 다른 예에서, 본 발명은 상기 SEQ ID NO: 1 내지 12로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드를 포함하는 1종 이상의 항원결정부위 폴리펩타이드 분자를 특이적으로 인식하는 항체를 유효성분으로 포함하는 돼지인플루엔자 바이러스 감염 예방 및/또는 치료용 조성물을 제공한다. 한 구체예에서, 상기 조성물은 SEQ ID NO: 1 내지 6으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드를 포함하는 항원결정부위 폴리펩타이드 분자를 특이적으로 인식하는 1종 이상의 항체를 포함하는 헤마글루티닌 항원형 1형의 돼지인플루엔자 바이러스 감염의 예방 및/또는 치료용 조성물일 수 있다. 다른 구체예에서, 상기 조성물은 SEQ ID NO: 7 내지 12로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드를 포함하는 항원결정부위 폴리펩타이드 분자를 특이적으로 인식하는 1종 이상의 항체를 포함하는 헤마글루티닌 항원형 3형의 돼지인플루엔자 바이러스 감염의 예방 및/또는 치료용 조성물일 수 있다. 또 다른 구체예에서, 상기 조성물은 SEQ ID NO: 1 내지 6으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드를 포함하는 항원결정부위 폴리펩타이드 분자를 특이적으로 인식하는 1종 이상의 항체와 SEQ ID NO: 7 내지 12로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드를 포함하는 항원결정부위 폴리펩타이드 분자를 특이적으로 인식하는 1종 이상의 항체를 포함하는 헤마글루티닌 항원형 1형의 돼지인플루엔자 바이러스 및 헤마글루티닌 항원형 3형의 돼지인플루엔자 바이러스 감염 예방 및/또는 치료용 조성물일 수 있다.In another example, the present invention provides an antibody that specifically recognizes one or more epitope polypeptide molecules comprising a polypeptide consisting of an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1 to 12 as an active ingredient. It provides a composition for preventing and / or treating swine influenza virus infection comprising. In one embodiment, the composition comprises a hemagle comprising at least one antibody that specifically recognizes an epitope polypeptide molecule comprising a polypeptide consisting of an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1-6 It may be a composition for preventing and / or treating swine flu virus infection of
또한, 본 발명의 SEQ ID NO: 1 내지 12의 아미노산 서열을 갖는 항원결정부위는 돼지인플루엔자 바이러스, 바람직하게는 돼지인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌 항원형 1형 또는 3형에 특이적인 부위이고, 돼지인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌 항원형 유형에 특이적인 항체를 효과적으로 생성시키므로, 상기 항원결정부위는 돼지인플루엔자 바이러스, 바람직하게는 헤마글루티닌 항원형 1형의 돼지인플루엔자 바이러스 또는 헤마글루티닌 항원형 3형의 돼지인플루엔자 바이러스에 대한 백신으로서도 유용하다.In addition, the epitope having a amino acid sequence SEQ ID NO: 1 to 12 of the present invention is a swine influenza virus, preferably a swine influenza virus
따라서, 본 발명의 또 다른 예는 SEQ ID NO: 1 내지 12로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 항원결정부위 폴리펩타이드 분자, 상기 폴리펩타이드 분자를 코딩하는 DNA 분자, 상기 DNA 분자를 포함하는 발현벡터, 및 상기 발현벡터로 형질전환된 형질전환 세포로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 유효성분으로 포함하는 돼지인플루엔자 바이러스에 대한 백신 조성물를 제공한다. 한 구체예에서, 상기 백신 조성물은 SEQ ID NO: 1 내지 6으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 항원결정부위 폴리펩타이드 분자, 상기 폴리펩타이드 분자를 코딩하는 DNA 분자, 상기 DNA 분자를 포함하는 발현벡터, 및 상기 발현벡터로 형질전환된 형질전환 세포로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 유효성분으로 포함하는 헤마글루티닌 항원형 1형의 돼지인플루엔자 바이러스에 대한 백신 조성물일 수 있다. 다른 구체예에서, 상기 백신 조성물은 SEQ ID NO: 7 내지 12로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 항원결정부위 폴리펩타이드 분자, 상기 폴리펩타이드 분자를 코딩하는 DNA 분자, 상기 DNA 분자를 포함하는 발현벡터, 및 상기 발현벡터로 형질전환된 형질전환 세포로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 유효성분으로 포함하는 헤마글루티닌 항원형 3형의 돼지인플루엔자 바이러스에 대한 백신 조성물일 수 있다. Thus, another example of the present invention is an epitope polypeptide molecule comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1 to 12, a DNA molecule encoding the polypeptide molecule, an expression comprising the DNA molecule It provides a vaccine composition for swine influenza virus comprising as an active ingredient a vector, and at least one selected from the group consisting of transformed cells transformed with the expression vector. In one embodiment, the vaccine composition comprises an epitope polypeptide molecule comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1 to 6, a DNA molecule encoding the polypeptide molecule, an expression comprising the DNA molecule It can be a vaccine composition for
또 다른 구체예에서, 상기 백신 조성물은 SEQ ID NO: 1 내지 6으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 항원결정부위 폴리펩타이드 분자, 상기 폴리펩타이드 분자를 코딩하는 DNA 분자, 상기 DNA 분자를 포함하는 발현벡터, 및 상기 발현벡터로 형질전환된 형질전환 세포로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상; 및 SEQ ID NO: 7 내지 12로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 항원결정부위 폴리펩타이드 분자, 상기 폴리펩타이드 분자를 코딩하는 DNA 분자, 상기 DNA 분자를 포함하는 발현벡터, 및 상기 발현벡터로 형질전환된 형질전환 세포로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 유효성분으로 포함하는 헤마글루티닌 항원형 1형 돼지인플루엔자 바이러스 및 헤마글루티닌 항원형 3형의 돼지인플루엔자 바이러스에 대한 백신 조성물일 수 있다.In another embodiment, the vaccine composition comprises an epitope polypeptide molecule comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1 to 6, a DNA molecule encoding the polypeptide molecule, and the DNA molecule At least one selected from the group consisting of expression vectors and transformed cells transformed with the expression vectors; And an epitope polypeptide molecule comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 7 to 12, a DNA molecule encoding the polypeptide molecule, an expression vector comprising the DNA molecule, and the expression vector It may be a vaccine composition for
상기 돼지인플루엔자 바이러스 감염 예방 및/또는 치료용 조성물, 및 백신 조성물은 통상적인 경로, 예컨대, 혈관(정맥) 내 투여, 피하 투여, 복막 투여 등으로 투여 가능하지만 이에 제한되는 것은 아니며, 통상적으로 정해진 용량으로 투여 가능하다. 또한 상기 조성물들은 통상적으로 사용되는 부형제 등의 첨가제를 추가로 포함할 수 있다. 이와 같은 조성물의 투여 경로, 투여량, 첨가제 등은 관련 기술분야의 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 결정할 수 있는 사항이다. The composition for preventing and / or treating swine influenza virus infection, and the vaccine composition may be administered by conventional routes, such as, but not limited to, intravascular administration, subcutaneous administration, peritoneal administration, and the like. Can be administered. In addition, the compositions may further include additives such as excipients commonly used. Routes of administration, dosages, additives and the like of such compositions are those that can be readily determined by one of ordinary skill in the art.
이하 본 발명을 더욱 자세히 설명하고자 한다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail.
본 발명에서, 국내 및 국외에서 유행하는 돼지인플루엔자 바이러스의 염기서열을 이용하여 펩타이드 항원을 인공적으로 제조하고, 토끼와 쥐를 이용하여 돼지인플루엔자 바이러스에 특이적으로 반응할 수 있는 단클론 및 다클론 항체를 제작하였다. 확보된 돼지인플루엔자 바이러스의 각각의 항원형 별로 아미노산 서열을 생물정보학 도구를 사용하여 비교 분석하였다. 특히 돼지인플루엔자 바이러스의 항원형과 밀접하게 연관이 있는 헤마글루티닌 단백질의 아미노산서열을 생물정보학 도구 프로그램을 이용하여 multiple alignment를 수행하고 헤마글루티닌의 항원형별 변이 및 보존적인 부분을 규명하였다. 그리고 항원성 및 친수성(hydrophilicity)의 특성을 분석하여 타입별로 약 10개의 아미노산 부위를 선정하였으며, 이중 친수성이 강하고 항원성이 높은 타입별 6 내지 7개의 펩타이드를 선정하여 제작하였다. In the present invention, a monoclonal and polyclonal antibody capable of artificially preparing a peptide antigen using the nucleotide sequence of the swine influenza virus, which is popular in Korea and abroad, and specifically reacting to the swine influenza virus using rabbits and mice. Produced. The amino acid sequence of each antigenic type of the acquired swine influenza virus was compared and analyzed using a bioinformatics tool. In particular, the amino acid sequence of hemagglutinin protein, which is closely related to the antigenic type of swine influenza virus, was subjected to multiple alignments using a bioinformatics tool program, and the variation and conserved regions of hemagglutinin were identified. In addition, about 10 amino acid sites were selected for each type by analyzing the characteristics of antigenicity and hydrophilicity, and 6 to 7 peptides were selected for each type having strong hydrophilicity and high antigenicity.
또한 상기 펩타이드 항원을 사용하여, 토끼와 쥐에서 각각 다클론 항체 및 단클론 항체를 제조하였다. 본 발명에 따라 제작된 단클론 및 다클론항체의 돼지인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌 단백질과의 반응성을 평가하기 위하여, 합성된 항원형별 펩타이드와 WHO 인플루엔자 표준연구소로부터 분양받은 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌 타입 1에서 13까지 13종의 바이러스(표 2) 등과 제조된 항체와의 면역학적 반응을 ELISA를 사용하여 평가하였다. 본 발명에서 제작된 펩타이드 단클론 및 다클론항체는 모두 돼지인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌 항원형 1형 및 3형 타입에 각각 특이적으로 반응하는 것을 ELISA 분석법으로 모두 확인하였다. The peptide antigen was also used to prepare polyclonal and monoclonal antibodies in rabbits and mice, respectively. In order to evaluate the reactivity of the monoclonal and polyclonal antibodies prepared according to the present invention with the swine influenza virus hemagglutinin protein, the synthesized antigen-type peptide and the WHO influenza standard laboratory were Influenza
항체를 이용한 검출법은 이러한 분자생물학적 분석법의 한계를 극복하고 빠르고 간편하며 상대적으로 낮은 수준의 정도 관리가 필요한 검출법이라고 할 수 있다. 항체를 사용하여 새로운 돼지인플루엔자 바이러스 진단기법을 개발하기 위해서는 민감하고 특이적인 단클론 및 다클론 항체가 반드시 필요하며 기반이라고 할 수 있다. 그러므로 다양한 유전형의 돼지인플루엔자 바이러스와 반응하는 항체를 개발하는 것이 면역학적 분석방법의 핵심이다. 이러한 돼지인플루엔자 바이러스와 반응하는 특이적인 단클론 및 다클론 항체의 개발은 진단법뿐 만이 아니라 바이러스의 전사, 복제 등의 연구에 사용될 수 있는 중요한 연구재료로 사용이 가능하다.The detection method using antibodies can be said to be a detection method that overcomes the limitations of such molecular biological assays and requires fast, simple and relatively low quality control. Sensitive and specific monoclonal and polyclonal antibodies are essential and essential for the development of new swine influenza virus diagnostics using antibodies. Therefore, developing antibodies that react with various genotypes of swine influenza virus is the key to immunological analysis. The development of specific monoclonal and polyclonal antibodies that react with the swine influenza virus can be used as an important research material that can be used for not only diagnostic methods but also for transcription and replication of viruses.
돼지 인플루엔자는 influenza type A H1N1 virus가 1930년도에 처음 확인 되었으며, 최근 유행하고 있는 신종인플루엔자바이러스를 미 질병예방통제센터(CDC)가 미국인 신종인플루 감염자로부터 추출한 H1N1 바이러스 샘플을 분석한 결과 이번 바이러스는 지금까지 돼지, 조류, 인간에서 발견되지 않은 혼합 종으로 밝혀지고 있다. 기존 돼지 인플루엔자 바이러스에 조류 인플루엔자와 사람 인플루엔자가 합쳐지는 과정에서 유전체 변형이 일어나 돼지끼리 퍼지던 바이러스가 사람 간에도 전파되고 있는 상황이다. 최근 신종인플루엔자 바이러스의 대유행으로 세계보건기구(WHO)도 경보단계를 최고 수준인 대유행(Pandemic) 단계인 효율적이고 지속적인 사람과 사람 간의 감염의 6단계로 상향하였다.Swine influenza was first identified in influenza type A H1N1 virus in 1930, and H1N1 virus samples of the latest pandemic influenza virus from the US Centers for Disease Control and Prevention (CDC) have been analyzed. It has been found to be a mixed species not found in pigs, birds, and humans. In the process of combining avian influenza and human influenza with the existing swine influenza virus, a genome modification occurs and a virus spread between pigs is spreading among humans. With the recent pandemic of the influenza virus, the World Health Organization (WHO) has raised the alert level to six levels of efficient and persistent human-to-human infection, the highest pandemic level.
이와 같이 돼지 인플루엔자 바이러스는 국내외의 신종 인플루엔자의 대유행의 중요한 원인체로 중요성이 점자 증대되고 있으나, 민감하고 특이적으로 반응하는 항체가 개발되어 있지 않고 표준화된 진단법이 부재하여 진단 및 연구에 매우 어려움이 있다.As such, swine influenza virus has become increasingly important as an important cause of pandemic influenza at home and abroad, but it is difficult to diagnose and research due to the lack of sensitive and specific antibodies and the lack of standardized diagnostic methods. .
본 발명은 돼지인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌 항원형 특이 항원결정부위를 선택적으로 인지하는 물질(항체)를 생산하는 방법과, 상기 항체를 생산하는 생산주를 제공한다.The present invention provides a method for producing a substance (antibody) that selectively recognizes swine influenza virus hemagglutinin antigen-type specific epitope, and a producer of the antibody.
일례로, 상기 항체 생산주는 본 발명에 따른 항원결정부위를 발현하는 세포를 항원으로 이용하여 통상의 방법으로 제조가능하다. In one example, the antibody producer can be prepared by a conventional method using a cell expressing an epitope according to the present invention as an antigen.
일례로, 돼지인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌 항원형 특이적 항체 (단클론 항체)의 제조 방법은, (a) 상기 항원결정부위 폴리펩타이드 분자 또는 상기 항원결정부위를 발현하는 세포를 마우스 또는 토끼 등의 동물에 주입하여 면역화 시키는 단계, (b) 상기 항원결정부위에 특이적인 항체를 생산하는 비장세포를 수득하는 단계, 및 (c) 상기 비장세포를 골수종세포와 융합시켜, 상기 특이적 항체를 생산하는 하이브리도마 세포를 선별하는 단계를 포함하는, 항체 생산하는 생산주 제조방법으로 통하여 실시 가능 하다. 상기 생산주는 생체외(in vitro)에서 배양하거나, 생체내 주입하여 항체를 분리할 수 있다. 일례로, 마우스의 복강내에 삽입하고 복수로부터 분리, 정제할 수 있다. 단클론 항체의 분리 및 정제는 배양 상층액 또는 복수를 이온교환 크로마토그래피(DEAE 또는 DE52 등), 항 면역글로불린 칼럼 또는 프로테인 A 컬럼 등의 친화성 크로마토그래피를 이용하여 실시할 수 있다.In one example, the method for producing swine influenza virus hemagglutinin antigen-specific antibody (monoclonal antibody), (a) an animal, such as a mouse or rabbit, the antigen-determining polypeptide molecules or cells expressing the antigenic-determining site Immunizing by injecting the same, (b) obtaining splenocytes producing an antibody specific for the epitope, and (c) fusing the splenocytes with myeloma cells to produce the specific antibody. Bridoma cells, including the step of selecting, can be carried out through the production method of the production line for producing antibodies. The producer may be cultured in vitro or injected in vivo to isolate the antibody. For example, the mouse can be inserted into the abdominal cavity and separated and purified from ascites. Isolation and purification of monoclonal antibodies can be carried out using affinity chromatography such as ion supernatant chromatography (DEAE or DE52), anti-immunoglobulin column or protein A column, or the culture supernatant or ascites.
본 발명은 돼지인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌 항원형 1형 및 3형 타입 단백질의 보존적이고 항원성을 나타내는 9-16개의 펩타이드 항원을 제조하고 쥐와 토끼를 사용하여 단클론 항체 및 다클론 항체를 제조하였다. 이러한 단클론 및 다클론 항체의 제작은 돼지인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌 항원형을 신속하고 정확하게 검체를 확인할 수 있는 도구로써 사용이 가능하다. 이러한 항체는 돼지인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌 항원형 분석을 위한 생물학적 특성을 연구할 수 있는 기본적인 도구를 제공할 뿐만 아니라 진단 등에 응용이 가능한 중요한 기능을 가지고 있다.The present invention prepared 9-16 peptide antigens showing conservative and antigenicity of swine influenza virus
본 발명에서 국내에서 분리된 돼지인플루엔자 바이러스 유행주의 헤마글루티닌 아미노산의 서열과 Genebank에 등록된 국외 돼지인플루엔자 바이러스주의 돼지인플루엔자 바이러스 아미노산 서열을 생물정보학 도구를 이용하여 보존적이면서 헤마글루티닌의 1형 및 3형의 항원형을 감별할 수 있는 아미노산 부위를 성공적으로 확보해 내었으며, 이와 함께 항원적인 특성이 있는지 표면에 존재가 가능한 지를 연구하였다. 본 발명에서 보존적이고 항원형 1형과 3형만을 감별할 수 있는 헤마글루티닌 아미노산서열 부위는 친수성과 소수성을 분석하여 강한 소수성을 나타낸 부위를 제외하고 1형 및 3형 외의 다른 타입의 항원형과의 교차반응을 유발할 수 있는 아미노산서열의 일치도를 분석하여 항원형 감별을 위한 항체생산에 제약이 있는 부위를 배제하였다. In the present invention, the sequence of the hemagglutinin amino acid sequence of the swine influenza virus epidemic strain isolated from Korea and the swine influenza virus amino acid sequence of the foreign swine flu strain of the foreign swine influenza virus strain registered in Genebank are conserved while using bioinformatics tools. Amino acid sites capable of discriminating between antigens of
그러므로 12개의 후보 펩타이드 서열을 확보, 제조 및 투입하여 단클론 및 다클론 항체를 쥐와 토끼를 이용하여 제조하고 평가하였다. 제조된 단클론 및 다클론 항체의 면역학적 반응성을 보기위하여 먼저 제조한 펩타이드와의 반응성을 테스트하였다. 그 결과를 보면 모든 종류의 단클론 및 다클론 항체의 경우에는 각기 투입한 펩타이드와는 특이적으로 강하게 반응하는 것을 확인할 수 있었다. 그리고 다음 단계로 제작된 항체와 돼지인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌 과의 반응성 및 교차반응을 분석하기 위하여, 표 2의 돼지인플루엔자바이러스 헤마글루티닌 항원형 1 내지 13형의 돼지인플루엔자 바이러스로 직접 효소면역측정법 (ELISA, Enzyme Linked Immuno-Sorbent Assay)를 수행한 결과 헤마글루티닌 항원형 1형과 3형을 감별할 수 있는 최소 9개의 단클론 항체를 제조하였다. Therefore, 12 candidate peptide sequences were obtained, prepared, and injected to prepare and evaluate monoclonal and polyclonal antibodies using mice and rabbits. To see the immunological reactivity of the prepared monoclonal and polyclonal antibodies, the reactivity with the prepared peptides was first tested. As a result, it was confirmed that all types of monoclonal and polyclonal antibodies reacted specifically with the peptides injected. And in order to analyze the reactivity and cross-reaction between the antibody produced in the next step and the swine influenza virus hemagglutinin, the enzyme directly immunized with swine influenza virus of swine influenza virus
그리고 본 발명에서 제작한 헤마글루티닌 항원형 1형에 반응하는 1개의 다클론 항체와 뉴 헤마글루티닌 항원형 3형에 반응하는 1개의 다클론 항체의 강한 반응성을 나타내었고 항원형을 구분이 가능하였다. 이러한 결과로부터 본 발명의 단클론 및 다클론 항체모두가 돼지인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌 항원형 1형과 3형에 매우 민감하고 특이적으로 반응하는 것을 알 수 있다. 그러므로 본 발명에서 개발된 단클론항체 및 다클론항체는 앞으로 돼지인플루엔자 감염 검진 및 모니터링에 사용될 수 있는 중요한 진단의 기초재료이며, 앞으로 빠르고 신속한 돼지인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌 항원형 1형과 3형을 감별하는 진단 키트의 개발로 이용될 것으로 예상된다.
In addition, one polyclonal antibody that responds to the
본 발명은 돼지인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌 단백질의 항원형 1형 내지 3형의 항원결정부위(epitope), 이를 이용하여 제조된 항체, 및 상기 항체를 이용한 돼지인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌의 감별검출 기술에 관한 것으로서, 상기 항체는 매우 민감하고 특이적으로 반응하므로, 돼지의 인플루엔자 바이러스 감염 검진 및 모니터링에 사용될 수 있는 중요한 진단의 기초재료로 이용될 수 있으며, 앞으로 빠르고 신속한 돼지인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌 항원형 1형 내지 3형을 감별검출의 진단 키트의 개발로 이용될 것이다.
The present invention is an epitope of the
도 1a 및 1b는 인플루엔자 바이러스 헤마글루디닌 항원형 1형(1a) 및 3형(1b) 단백질의 신호 서열 예측 (Signal sequence prediction) 결과이다.
도 2a 및 2b는 인플루엔자 바이러스 헤마글루디닌 항원형 1형(1a) 및 3형(1b)의 Predicted transmembrane segments for sequence 결과 얻어진 그래프이다.
도 3a 및 3b는 인플루엔자 바이러스 헤마글루디닌 항원형 1형 및 3형 단백질의 친수성(3a)/소수성(3b) 파라미터를 보여주는 그래프이다.
도 4a는 인플루엔자 바이러스 헤마글루디닌 항원형 1형의 antigenic peptide를 나타내고, 도 4b는 인플루엔자 바이러스 헤마글루디닌 항원형 3형의 antigenic peptide를 나타낸다.
도 5a 내지 5d는 단클론/다클론 항체를 제조를 위해 최종적으로 선정된 헤마글루디닌 항원형 1형 및 3형의 항원결정부위를 보여주는 것이다 (붉은색 및 밑줄로 표시).
도 6은 실시예에서 단클론/다클론 항체를 제조하는 방법을 보여주는 개략도이다.
도 7a 내지 7c는 서열번호 1 내지 3을 혼합하여 제조한 인플루엔자 바이러스 헤마글루디닌 항원형 1형의 다클론 항체의 반응성 시험결과를 나타내고, 도 7d 내지 7f는 서열번호 4 내지 6을 혼합하여 제조한 인플루엔자 바이러스 헤마글루디닌 항원형 1형의 다클론 항체의 반응성 시험결과를 나타내는 그래프이다.
도 8a 내지 8c는 서열번호 7 내지 9을 혼합하여 제조한 인플루엔자 바이러스 헤마글루디닌 항원형 3형의 다클론 항체의 반응성 시험결과를 나타내고, 도 8d 내지 8f는 서열번호 10 내지 12을 혼합하여 제조한 인플루엔자 바이러스 헤마글루디닌 항원형 3형의 다클론 항체의 반응성 시험결과를 나타내는 그래프이다.
도 9a는 인플루엔자 바이러스 헤마글루디닌 항원형 1형의 단클론 항체의 반응성 시험결과를 나타내고, 도 9b는 인플루엔자 바이러스 헤마글루디닌 항원형 3형의 단클론 항체의 반응성 시험결과를 나타낸다.
도 10는 본 발명에 따른 돼지인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌 항원형 1형과 3형 진단 키트의 분해 사시도이다.
<도면의 주요 부분에 대한 부호의 설명>
1: 면역분석장치 2: 분석 스트립
3: 하부 케이스 4: 상부 케이스
3A, 3B: 제1, 제2 스트립 지지부
4A, 4B: 제1, 제2 스트립 대응부
21: 검체 패드 22: 멤브레인
221: 검사선 222: 대조선
23: 흡수 패드 24: 단변
25: 장변 31: 단변 고정부
32: 장변 고정부 33: 하부 차단부
41: 검체 투입구 42: 결과 표시창
43: 문자 표시구
도 11은 본 발명의 진단 키트를 구성하는 스트립의 구조를 나타낸 것이다.
도 12는 본 발명에 따른 돼지인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌 항원형 1형과 3형 감별 진단 키트를 촬영한 사진이다.1A and 1B show the signal sequence prediction of influenza virus hemaggludinin antigen type 1 (1a) and type 3 (1b) proteins.
2A and 2B are graphs obtained as a result of Predicted transmembrane segments for sequence of influenza virus hemaggludinin antigen type 1 (1a) and type 3 (1b).
3A and 3B are graphs showing the hydrophilic (3a) / hydrophobic (3b) parameters of influenza virus
Figure 4a shows the antigenic peptide of influenza virus
5A-5D show the epitopes of
6 is a schematic diagram illustrating a method of preparing monoclonal / polyclonal antibodies in the Examples.
7A to 7C show the reactivity test results of the influenza virus
8A to 8C show the reactivity test results of the influenza virus
9A shows the reactivity test results of influenza virus
10 is an exploded perspective view of the swine influenza virus
Description of the Related Art
1: immunoassay device 2: assay strip
3: lower case 4: upper case
3A, 3B: first and second strip supports
4A, 4B: first and second strip counterparts
21: sample pad 22: membrane
221: inspection line 222: control line
23: absorption pad 24: short side
25: long side 31: short side fixing part
32: long side fixing part 33: lower blocking part
41: Sample inlet 42: Result display window
43: character indicator
Figure 11 shows the structure of the strip constituting the diagnostic kit of the present invention.
12 is a photograph of the swine influenza virus
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in detail by way of examples.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.However, the following examples are illustrative of the present invention, and the present invention is not limited to the following examples.
<< 실시예Example 1> 1>
펩타이드Peptides 항원결정부위 결정 Epitope determination
돼지인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌 항원형 1형 및 3형의 감별을 위하여, 바이오인포메틱스 프로그램(DNAMAN version 6 (Lynnon Corporation) 또는 Vector NTI Suite 7.1 (informax, Inc.))을 이용하여 multialign으로 상동성 지역을 조사하고, 그 부위에 항원성이 높게 나타나는 지역을 선정하는 절차로 진행하였다. For differentiation of swine influenza virus
먼저, 인플루엔자바이러스 헤마글루티닌(Hemagglutinin, HA) 항원의 감별을 위한 타입별 항체 개발을 위하여, 국내외 돼지 및 인체 감염 인플루엔자바이러스의 염기 및 아미노산서열을 해외 GenBank(미국), 유전체 데이터베이스에서 확보하고 각 혈청형별 multialign을 실행하여 각 헤마글루티닌 단백질 부위의 도메인별로 약 10개 이상의 보존적인 아미노산서열을 상동성 지역으로 선정하였다. 이와 동시에 동일 인플루엔자바이러스 동일 또는 타입간의 분리연도 및 지역별 바이러스 변이(mutation) 양상을 분석하여 고변이부위(hyper variable region)와 고보존 부위(highly conserved region)으로 구분하여 분석하였다. First, in order to develop antibodies by type for differentiation of influenza virus hemagglutinin (HA) antigens, the base and amino acid sequences of domestic and overseas swine and human infected influenza viruses are obtained from overseas GenBank (US) and genome databases. Serum-type multialignment was performed to select more than 10 conservative amino acid sequences as homologous regions for each hemagglutinin protein domain. At the same time, the same influenza virus was divided into hypervariable regions and highly conserved regions by analyzing the year and region of virus mutations.
상기 결과를 바탕으로 항원성 에피톱(epitope) 선정은 고보존 부위(highly conserved region)를 대상으로 바이오인포메틱스 프로그램(DNAMAN version 6 (Lynnon Corporation) 또는 Vector NTI Suite 7.1 (informax, Inc.)) 시뮬레이션을 통해 2차 구조 및 항원성 부위의 순위를 결정하고, 5개 이상의 항원결정부위 (에피토프, epitope)를 결정하여 항체제작에 사용하였다. 상기 순위 결정방법은 보존부위중 항원형간의 차별화 가능부위를 선정하고 유사도의 정도, 에피토프로써의 기능 수행여부, 친수성, 또는 소수성 특성 분석 등의 특징을 나열한 후 순위를 결정하는 것으로 수행하였다. 상기 DNAMAN 프로그램에 포함되어 있는 기능을 이용하여 Signal sequence prediction, Predicted transmembrane segments for sequence, 친수성 및 소수성 파라미터, antigenic peptide의 결과를 도출하여, 도 1a, 도1b (이상 Signal sequence prediction), 도 2a, 도 2b (이상 Predicted transmembrane segments for sequence), 도 3a, 도 3b (이상 친수성 및 소수성 파라미터), 도 4a, 4b (antigenic peptide) 에 나타내었다.Based on these results, antigenic epitope selection was performed using a bioinformatics program (DNAMAN version 6 (Lynnon Corporation) or Vector NTI Suite 7.1 (informax, Inc.)) for highly conserved regions. Secondary structures and antigenic sites were ranked by simulation, and five or more epitopes were determined and used for antibody production. The ranking method was performed by selecting a site capable of differentiating between antigen types among the conserved sites, and then ranking the features after listing the degree of similarity, function as an epitope, hydrophilicity, or hydrophobic characterization. Signal sequence prediction, predicted transmembrane segments for sequence, hydrophilicity and hydrophobic parameters, and antigenic peptide results were derived using the functions included in the DNAMAN program, and FIGS. 1A and 1B (above signal sequence prediction), FIGS. 2A and FIG. 2b (above Predicted transmembrane segments for sequence), FIG. 3A, FIG. 3B (above hydrophilic and hydrophobic parameters), and FIG. 4A, 4B (antigenic peptide).
헤마글루티닌 항원형별 인플루엔자바이러스 아미노산 서열의 상동성 및 감별가능 부위를 선정하기 위해 비교된 GenBank 등재된 타입별 단백질서열은 아래의 표 3에 나타낸 바와 같다:The GenBank listed type-specific protein sequences compared to select homologous and distinguishable sites of hemagglutinin antigen-specific influenza virus amino acid sequences are shown in Table 3 below:
최종적으로 선정된 헤마글루디닌 항원형 1형 및 3형의 항원결정부위를 도 5a 내지 5d에 나타내었다 (붉은색 및 밑줄로 표시).The finally selected epitope regions of
도 5a 내지 5d에 나타낸 12 종의 항원결정부위를 아래에 나타내었다: The 12 antigenic regions shown in FIGS. 5A-5D are shown below:
SEQ ID NO. 아미노산 서열 길이(aa) TypeSEQ ID NO. Amino Acid Sequence Length (aa) Type
1 LHLGKCNIA 9 HA11
2 GRMNYYWTL 9 HA12
3 PSIQSRGLF 9 HA13
4 EKNVTVTHSVNLL 13 HA14
5 NAKEIGNGCFEFYHK 15 HA15
6 KNGTYDYPKYSEEAKL 16 HA16
7 ATLCLGHHAVPNGT 14 HA37
8 VSTKRSQQT 9 HA38
9 CNSECITPNGSI 12 HA39
10 FDKLYIWGVHHP 12 HA310
11 NEKFHQIEKEFSEVEG 16 HA311
12 ENAEDMGNGCFKIYHK 16 HA3
12
<< 실시예Example 2> 2>
돼지인플루엔자 바이러스 Swine Flu Virus 펩타이드Peptides 단/ only/ 다클론Polyclone 항체의 제작 Production of antibodies
상기 표 1에서 나타낸 헤마글루티닌 항원형 1형과 3형 특이 펩타이드는 pre-activated KLH(Keyhole limpet hemocyanin, Pierce)와 pre-activated BSA(bovine serum albumine, Pierce)에 conjugation을 시켜서 면역학적 반응성이 나타나도록 하였다. 이와 같이 제조된 conjugated 펩타이드를 쥐와 토끼에 투입하여 단클론 항체 및 다클론 항체를 각각 제조하였다. 단클론 항체 및 다클론 항체를 성공적으로 생성하였다. 각 펩타이드에서 생성된 단클론 항체 및 다 클론 항체에 관한 사항을 아래의 표 4에 기술하였다. 다클론 항체의 경우 토끼를 사용하여 헤마글루티닌 항원형 1형 2종과 3형 2종을 각각 제조하였으며, 단클론 항체는 1형 6 가지 종류 7개, 3형 6가지 종류 13개의 단클론 항체세포를 조사하였다.
<2-1> 마우스에서 <2-1> from mouse 단클론Monoclonal 항체의 제작 Production of antibodies
항원형 1형에 특이적인 항체를 제조하기 위해 상기에서 언급한 서열번호 1 내지 3의 펩타이드 항원을 혼합하여 마우스에 투입하여 단클론 항체를 제조하였고, 항원형 3형에 특이적인 항체를 제조하기 위해 상기에서 언급한 서열번호 7 내지 9의 펩타이드 항원을 혼합하여 마우스에 투입하여 단클론 항체를 제조하였다. In order to prepare an antibody specific for
보다 구체적으로, 첫 번째 면역화로서, 상기 표 1의 서열을 갖도록 합성된 펩타이드 250μL를 동량(250μL)의 complete Freund's adjuvant (Sigma)를 혼합하여 유화체를 만든 후, 생후 6 내지 8주령의 암컷 BALB/c 마우스의 복강 내 (intraperitoneal injection, ip)에 주입하였다. 1 마리당 500μg의 합성된 펩타이드를 주사하며 6 마리를 대상으로 실시하였다. 두 번째 면역화로서 2주 후에 같은 요령으로 주사하였다. 단, incomplete Freund's adjuvant (Sigma)를 사용하며, 항원의 양을 첫 번째 면역화와 동일한 양으로 하여 동일한 방법으로 두 번째 면역화 및 세 번째 면역화(두 번째 면역화로부터 2주 후)를 실시하여 투여하였다.More specifically, as the first immunization, 250μL of the peptide synthesized to have the sequence shown in Table 1 above was mixed with the same amount (250μL) of complete Freund's adjuvant (Sigma) to make an emulsified body, and then the female BALB / c The mice were injected into intraperitoneal injection (ip). Six mice were injected with 500 μg of the synthesized peptide per animal. Two weeks later as a second immunization, the same technique was injected. However, incomplete Freund's adjuvant (Sigma) was used, and the second and third immunizations (two weeks after the second immunization) were administered in the same manner with the same amount of antigen as the first immunization.
그리고, 마지막으로 2주 후에 항원(3차 투여 시와 동일한 양)을 PBS에 혼합하여 이를 꼬리의 정맥 (미정맥, intravenous injection, iv)에 주사하였다. 마지막 면역화 후 3일 뒤에 세포융합과정을 수행하여 단클론 항체를 생산하는 세포를 제조하였다 (실시예 <2-3> 및 <2-4> 참조). 단클론 항체를 제조하는 구체적인 방법을 도 6에 모식적으로 나타내었다.
Finally, two weeks later, the antigen (the same amount as in the third administration) was mixed in PBS and injected into the vein of the tail (travenous injection, iv). Three days after the last immunization, cell fusion was performed to prepare cells that produce monoclonal antibodies (see Examples <2-3> and <2-4>). The specific method of manufacturing a monoclonal antibody is typically shown in FIG.
<2-2> <2-2> 토끼에서In the rabbit 다클론Polyclone 항체의 제조 Preparation of antibodies
상기에서 제조된 서열번호 1 내지 6의 1형 6종류와 서열번호 7 내지 12의 3형 6종류를 각각 3종류씩의 펩타이드 항원을 혼합하여 토끼에 투여하여 다클론 항체를 제조하였다. 상기에서 확보된 합성 펩타이드를 토끼 (뉴질랜드 화이트, 암컷, 2 ~ 2.2 kg)에 투여하였다. The polyclonal antibody was prepared by mixing 6 types of peptide antigens of SEQ ID Nos. 1 to 6 and 6 types of peptides of SEQ ID NOs. The synthetic peptides secured above were administered to rabbits (New Zealand White, Female, 2-2.2 kg).
1차 투여 시에는 항원을 1mg/400μL PBS로 준비하여 동량의 complete Freund's adjuvant (Sigma)를 혼합 후 유화체를 만들어 한 부위당 투여량 약 30-50 ul 정도로 소량씩 등의 여러 부위 (10여 부위, 한 부위에 많이 양이 투여되면 화농-pus가 형성될 수 있으며, 심할 경우 육아종이 유발된다)에 피하 주사 하였다. 2주 후 2차 투여부터는 1차 투여와 방법은 같으나 incomplete Freund's adjuvant (Sigma)를 이용하였다. 3차 투여는 2차 투여 시와 동일하며, 마지막 4차 투여 시 이정맥에 100μL 정도로 혈관 내 직접 투여하였다.In the first administration, antigens were prepared in 1mg / 400μL PBS, and the same amount of complete Freund's adjuvant (Sigma) was mixed and an emulsion was formed. If a large amount is administered at one site, purulent-pus may be formed, and if severe, granulomas are induced). After 2 weeks, the second dose was the same as the first dose, but incomplete Freund's adjuvant (Sigma) was used. The third dose was the same as the second dose, and the final fourth dose was about 100 μL in the vein directly to the vein.
마지막 투여 후 이정맥을 통하여 채혈하여 아래와 같은 방법으로 항체가를 검사한 뒤 높은 수준에 이르면(ELISA 테스트 결과 해당 혈청을 1000배 이상 희석하여 측정이 가능한 역가가 나옴을 확인) 토끼를 마취한 후 전혈을 채혈하여 37℃에서 30분 내지 60분간 정치시키면 혈액 세포들이 응고되어 혈병을 형성하며, 이를 제거한 후 혈장을 확보하였다. 준비된 혈장은 4℃, 10000g, 10분간 원심분리 후 상층액을 취하였다.After the last administration, blood was collected through the vein and the antibody titer was tested by the following method and reached a high level (ELISA test showed that the serum was diluted 1000 times or more to find the titer that can be measured). When blood was collected and allowed to stand at 37 ° C. for 30 to 60 minutes, blood cells coagulated to form a blood clot, thereby removing plasma. The prepared plasma was centrifuged at 4 ° C., 10000 g for 10 minutes, and the supernatant was taken.
상기 얻어진 상층액으로부터 면역친화성 크로마토그래피 (immunoaffinity chromatogarphy) 법을 사용하여 항체를 정제하였다. 즉, 상층액을 비드의 5배 부피의 인산화염(PBS)으로 Equilibrate된 단백질(Protein) A가 콘쥬게이션 되어있는 아가로스 비드(peptron) 컬럼(empty column, Pierce)에 로드시켰다. 5층용적(bed volumn)의 인산화염(PBS)로 컬럼을 세척한 후에, 0.1M Glycine, pH3.0의 버퍼용액으로 다클론항체를 용출하였다. 용출된 다클론항체에 다시 1/10 부피의 1M Tris, pH8.0을 가하여 중화시켰다. 최종적으로 순수한 다클론항체를 분리한 다음 인산화염 완충액(PBS)에 투석하여 항체를 분리 및 정제하였다.
Antibodies were purified from the obtained supernatants using immunoaffinity chromatography. In other words, the supernatant was loaded onto an agarose beads column (Pierce) conjugated with Protein A, which was conjugated with 5-fold volume of phosphate (PBS) of beads. After washing the column with bed volumn phosphate (PBS), polyclonal antibodies were eluted with 0.1 M glycine, pH 3.0 buffer solution. The eluted polyclonal antibody was neutralized again by adding 1/10 volume of 1M Tris, pH8.0. Finally, the pure polyclonal antibody was isolated and then dialyzed in phosphate buffer (PBS) to isolate and purify the antibody.
<2-3> 항원 투여 중의 혈청 항체가 검사 (항체 <2-3> Serum antibody test during antigen administration (antibody titeringtitering ) )
3차 면역화 후 4일 뒤에 꼬리 미정맥에서 채혈하여 혈청을 얻은 뒤 인산염 완충액 (PBS)에 부피 기준으로 1/100000, 1/5000, 1/1000 및 1/100 농도로 연속 희석하여 효소면역측정법 (ELISA, Enzyme Linked Immuno-Sorbent Assay)을 사용하여 항체가 형성되는 것을 결정하였다. 측정된 흡광도 (optical density, O.D)값이 음성대조군의 마우스(항원을 주입하지 않은 쥐의 혈청)의 흡광도와 비교하여 양호하고 1/100 희석배율에서 흡광도 2이상 보일 경우 면역화가 성공한 것으로 보고 세포 간 융합 준비를 하였다. 항체가가 낮으면 2주 후에 다시 면역화를 시도하였다.
Four days after the third immunization, blood was collected from the tail vein and serially diluted in phosphate buffer (PBS) at concentrations of 1/100000, 1/5000, 1/1000 and 1/100 by volume. Enzyme immunoassay (ELISA, Enzyme Linked Immuno-Sorbent Assay) was used to determine the formation of antibodies. If the measured optical density (OD) value is good compared to the absorbance of the negative control mouse (serum of the non-antigen-injected mouse), and the absorbance is 2 or more at 1/100 dilution, the immunization was reported to be successful. Fusion was prepared. Immunization was again attempted after 2 weeks if the antibody titer was low.
<2-4> <2-4> 비장세포와Splenocytes 골수종세포의 융합 ( Fusion of myeloma cells ( CellCell fusionfusion ))
최종 면역 3-4일 후 마우스의 비장을 무균적으로 적출하고 26-gauge 주사바늘로 적출하고 세절한 후, 혈청이 첨가되지 않은 차가운 DMEM(Dulbecco's Modified ed Eagle's medium, Gibco)에 부유시켰다. 부유액을 50㎖ 튜브에 수집하여 1-2분간 정치시킨 후 상층액을 모아 이를 DMEM으로 1,000rpm, 10분씩 3번 원심세척하였다. 침전된 림프구를 마우스 골수종 세포(myeloma, Sp2/0-Ag14, 한국세포주은행)와 세포 개수 기준으로 7:1 내지 10:1 정도의 비율로 혼합하고, 37℃로 미리 가온한 DMEM으로 1회 원심세척한 후, pasteur pipet을 이용하여 상층액을 완전히 제거하였다. Three to four days after the last immunization, the spleens of the mice were aseptically extracted with a 26-gauge needle and sliced and suspended in cold DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's medium, Gibco) without serum. The suspension was collected in a 50 ml tube and allowed to stand for 1-2 minutes. The supernatants were collected and centrifuged three times for 10 minutes at 1,000 rpm with DMEM. Precipitated lymphocytes were mixed with mouse myeloma cells (myeloma, Sp2 / 0-Ag14, Korea Cell Line Bank) at a ratio of 7: 1 to 10: 1 based on the number of cells, and centrifuged once with DMEM preheated to 37 ° C. After washing, the supernatant was completely removed using a pasteur pipet.
이 혼합세포에 37℃로 미리 가온한 50%(w/v) polyethylene glycol 1,500 (PEG 1,500; Boehringer Mannheim) 1㎖를 1분에 걸쳐 첨가하였다. PEG를 가한 후 혼합 세포가 들어있는 시험관을 1분 내지 2분간 흔들어주며 세포 융합을 유도하였다. 여기에 DMEM 5㎖를 5분에 걸쳐 첨가한 후, 다시 DMEM 10㎖를 천천히 첨가하고 나서, 37℃ 항온수조에서 5분간 정치시켰다. 혼합액을 1,000 rpm에서 10분간 원심분리한 후 상층액을 제거하였다. 침전된 세포를 HAT supplement (0.1mM hypoxanthine, 0.4μM aminopteri, 16μM thymidine, Sigma)와 20% 우태아혈청(Gibco)이 첨가된 DMEM에 106 cell/㎖의 농도로 부유시켰다. 이 부유액을 96-well microplate (Nunc)에 well당 100㎕씩 분주하였다. 준비된 well을 37℃ 항온 항습 배양기에서 배양하며, 3일 내지 4일마다 배지를 교환하였다. 융합 2주 후부터는 HT supplement (100μM hypoxanthine, 16μM thymidine, Sigma)와 10% 우태아혈청이 첨가된 DMEM으로 배양하고, 3주 후부터는 10% 우태아혈청만 첨가된 DMEM으로 배양하였다.1 ml of 50% (w / v) polyethylene glycol 1,500 (PEG 1500; Boehringer Mannheim), previously warmed to 37 ° C., was added to the mixed cells over 1 minute. After adding PEG, the test tube containing the mixed cells was shaken for 1 to 2 minutes to induce cell fusion. After 5 ml of DMEM was added thereto over 5 minutes, 10 ml of DMEM was slowly added again, and allowed to stand for 5 minutes in a 37 ° C constant temperature water bath. The mixed solution was centrifuged at 1,000 rpm for 10 minutes and the supernatant was removed. Precipitated cells were suspended in DMEM supplemented with HAT supplement (0.1 mM hypoxanthine, 0.4 µM aminopteri, 16 µM thymidine, Sigma) and 20% fetal bovine serum (Gibco) at a concentration of 10 6 cells / ml. This suspension was dispensed in a 96-well microplate (Nunc) 100 μl per well. The prepared wells were incubated in a 37 ° C. constant temperature incubator, and medium was changed every 3 to 4 days. Two weeks after fusion, HT supplements (100μM hypoxanthine, 16μM thymidine, Sigma) and 10% fetal bovine serum were added to DMEM. Three weeks later, 10% fetal bovine serum was added to DMEM.
하이브리도마 선별은 하기 실시예 <2-5>에 특이성 및 반응성결과로 선별하였다 (흡광도 기준). Hybridoma screening was selected based on the specificity and reactivity results in the following <2-5> (absorbance criteria).
단클론 항체는 면역친화성 크로마토그래피 (immunoaffinity chromatogarphy) 법을 사용하여 정제하였다. 즉, 상층액을 비드의 5배 부피의 인산화염(PBS)으로 Equilibrate된 단백질(Protein) A가 콘쥬게이션 되어있는 아가로스 비드(peptron) 컬럼(empty column, Pierce)에 로드시켰다. 5층용적(bed volumn)의 인산화염(PBS)로 컬럼을 세척한 후에, 0.1M Glycine, pH3.0의 버퍼용액으로 단클론항체를 용출하였다. 용출된 단클론항체에 다시 1/10 부피의 1M Tris, pH8.0을 가하여 중화시켰다. 최종적으로 순수한 단클론항체를 분리한 다음 인산화염 완충액(PBS)에 투석하여 항체를 분리 및 정제하였다.
Monoclonal antibodies were purified using immunoaffinity chromatogarphy. In other words, the supernatant was loaded onto an agarose beads column (Pierce) conjugated with Protein A, which was conjugated with 5-fold volume of phosphate (PBS) of beads. After washing the column with bed volumn phosphate (PBS), monoclonal antibody was eluted with 0.1M glycine, pH3.0 buffer solution. The eluted monoclonal antibody was neutralized again by adding 1/10 volume of 1M Tris, pH8.0. Finally, the pure monoclonal antibody was isolated and then dialyzed in phosphate buffer (PBS) to isolate and purify the antibody.
<2-5> 단/<2-5> stage / 다클론Polyclone 항체의 Antibody ELISAELISA 을 이용한 특이성 검사Specificity test
단/다클론항체의 특이성 분석을 위하여, 합성된 펩타이드를 각각 coating buffer(KOMA BIOTECH INC, K0331021)에 1 ㎍/㎖ 농도로 희석하여 well 당 200 ㎕씩 첨가 하고 4 ℃에서 overnight incubation하여 코팅시켰다. 코팅된 플레이트를 washing solution (PBST, KOMA BIOTECH INC, K0331041, K0331051)으로 5회 반복 세척하고, Blocking solution (1% BSA/PBS, KOMA BIOTECH INC, K0331032)을 well 당 250 ㎕씩 첨가 후 상온에서 1시간 동안 반응하여 blocking을 수행하였다. For specificity analysis of mono / polyclonal antibodies, the synthesized peptides were diluted to 1 ㎍ / ml in coating buffer (KOMA BIOTECH INC, K0331021), added 200 ㎕ per well, and coated by overnight incubation at 4 ° C. Wash the coated plate five times with washing solution (PBST, KOMA BIOTECH INC, K0331041, K0331051), add Blocking solution (1% BSA / PBS, KOMA BIOTECH INC, K0331032) 250 well per well, and then at room temperature Blocking was performed by reacting for a time.
blocking된 플레이트는 다시 세척용액을 이용하여 5회 반복하여 세척하고 다/단클론 항체 배양 용액(배지: DMEM)을 well당 200μL씩 분주하고, 음성대조군용 well에 희석액(세포 배양 배지 DMEM)을 200μL 분주한 다음 상온에서 60분간 반응시켰다. The blocked plate was washed again five times using the washing solution, and 200 μL of the poly / monoclonal antibody culture solution (medium: DMEM) was dispensed by 200 μL per well, and 200 μL of the diluted solution (cell culture medium DMEM) was added to the negative control well. After the reaction at room temperature for 60 minutes.
시료의 반응이 완료된 플레이트는 세척용액을 이용하여 5회 반복하여 세척하고 항-마우스 IgG에 HRP (Horse reddish peroxidase)가 융합된 시약(1:5,000 (v/v), Antibody Incorporated, USA) 을 well 당 200 ㎕씩 첨가 후 상온에서 1시간 동안 반응시키고, 세척액 (PBST, 137 mM NaCl, 2.68 mM KCl, 10.14 mM Na2HPO4, 1.76 mM K2HPO4, 0.5% Tween)으로 세척하였다. 얻어진 반응액을 TMB Substrate kit (KOMA BIOTECH INC, K0331060)로 발색반응을 유도하고 stop solution (2 M, H2SO4)으로 반응을 정지한 후, ELISA reader(TECAN) 로 450nm 파장에서의 흡광도를 측정하여 분석하였다.After the reaction of the sample was completed, the plate was washed five times with a washing solution, and a reagent (1: 5,000 (v / v), Antibody Incorporated, USA) in which HRP (Horse reddish peroxidase) was fused to anti-mouse IgG was well used. After 200 μl of sugar was added, the mixture was reacted at room temperature for 1 hour, and washed with a washing solution (PBST, 137 mM NaCl, 2.68 mM KCl, 10.14 mM Na 2 HPO 4 , 1.76 mM K 2 HPO 4 , 0.5% Tween). Induce the color reaction with the TMB Substrate kit (KOMA BIOTECH INC, K0331060), stop the reaction with stop solution (2 M, H 2 SO 4 ), and absorb the light at 450 nm with ELISA reader (TECAN). Measured and analyzed.
음성대조군의 흡광도의 3배 이상 되는 흡광도 값을 양성 반응의 최소치로 기준하여 음성, 양성으로 판정하였다. 각 펩타이드에서 생성된 단/다클론 항체들 중 O.D(Optical Density) 값이 1이 초과되는 것만을 선정하였다.
An absorbance value that is three times or more the absorbance of the negative control group was determined to be negative or positive based on the minimum value of the positive reaction. Of the mono / polyclonal antibodies generated in each peptide, only those with an optical density (OD) greater than 1 were selected.
<< 실시예Example 3> 3>
단/only/ 다클론Polyclone 항체의 Antibody ELISAELISA 을 선별 및 특성분석Screening and Characterization
<3-1> <3-1> ELISAELISA 를 통한 항체 선별Antibody Screening Through
상기 실시예 <2-5>에서 선정된 펩타이드 항체를 아래의 표 4에 정리하였다. The peptide antibodies selected in Example <2-5> are summarized in Table 4 below.
표 4에 기재된 바와 같은 돼지인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌 항원형 1형에 대한 단클론 펩타이드 항체 7종 (HA1M#1-HA1M#7) 및 3형에 대한 단클론 펩타이드 항체 13종(HA3M#1-HA3M#13), 항원형 1형에 대한 다클론 펩타이드 항체 2종(HA1P#1, HA1P#2)과 3형에 대한 다클론 펩타이드 항체 2종(HA3P#1, HA3P#2)의 총 24종의 항체를 대상을 항원-항체반응을 수행하였다.Seven monoclonal peptide antibodies against swine influenza virus hemagglutinin antigen type 1 (HA1M # 1-HA1M # 7) and 13 monoclonal peptide antibodies against type 3 (HA3M # 1-HA3M #) as described in Table 4. 13) A total of 24 antibodies, including two polyclonal peptide antibodies against antigen type 1 (
상기 단/다클론항체 선정을 위한 항원-항체 반응은, 105 TCID50의 Influenza A/Korea/01/2009 H1N1 (국내분리주, 최초로 국내 사람에서 분리된 신종인플루엔자 A(H1N1)바이러스로, 질병관리본부 국립보건원 인프루엔자바이러스팀에서 분양받음, NCBI Taxonomy ID : 644289)와 Influenza A/Swine/Korea/Can04/2005 H3N2 (국내분리주, 국립수의과학검역원, NCBI Taxonomy ID : 538544, 현재 돼지인플루엔자 3종 불활화백신주생산에 사용되고 있음)를 각각 coating buffer(KOMA BIOTECH INC, K0331021)에 1/10로 희석하여 well 당 200 ㎕씩 첨가 하고 4 ℃에서 overnight incubation하여 코팅시키는 것을 제외하고, 상기 실시예 <2-5>와 동일한 방법으로 수행하였다.The single / multi-antigen for the monoclonal antibodies selected - antibody reaction, 10 5 TCID 50 of the Influenza A / Korea / 01/2009 H1N1 ( local isolates, initially the new influenza A (H1N1) virus isolated from Korean people, disease control NCBI Taxonomy , distributed by National Institutes of Health, Influenza Virus Team ID : 644289) and Influenza A / Swine / Korea / Can04 / 2005 H3N2 (Domestic Isolation, National Veterinary Quarantine Service, NCBI Taxonomy ID : 538544, currently used to produce three inactivated vaccines for swine influenza, diluted 1/10 in coating buffer (KOMA BIOTECH INC, K0331021), added 200 μl per well, and coated by overnight incubation at 4 ° C. Except that, the same process as in Example <2-5> was carried out.
이와 같이 얻어진 결과를 아래의 표 4에 나타내었다.The results thus obtained are shown in Table 4 below.
펩타이드
항체Monoclonal
Peptide
Antibody
펩타이드
항체Polyclonal
Peptide
*: Influenza A/Korea/01/2009 H1N1 (국내분리주, 최초로 국내 사람에서 분리된 신종인플루엔자 A(H1N1)바이러스로, 질병관리본부 국립보건원 인프루엔자바이러스팀에서 분양받음, NCBI Taxonomy ID : 644289)*: Influenza A / Korea / 01/2009 H1N1 (National isolate, the first influenza A (H1N1) virus isolated from domestic humans, distributed by the National Institutes of Health, Influenza Virus Team, NCBI Taxonomy) ID : 644289)
**: Influenza A/Swine/Korea/Can04/2005 H3N2 (국내분리주, 국립수의과학검역원, NCBI Taxonomy ID : 538544, 현재 돼지인플루엔자 3종 불활화백신주생산에 사용되고 있음)**: Influenza A / Swine / Korea / Can04 / 2005 H3N2 (National isolates, National Veterinary Quarantine Service, NCBI Taxonomy ID : 538544, currently used for the production of three inactivated vaccines for swine flu)
표 4에서 알 수 있는 바와 같이, 본 발명에 따른 돼지인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌 항원형 1형과 3형 특이 항체를 각각 이용하여 헤마글루티닌 항원형 1형과 3형간의 감별탐지가 가능하였다. 그러나, HA3M#9 내지 HA3M#13의 서열번호 9에 대한 항체는 만들어지지 않았다. 이중 반응성이 우수한 단클론 항체 2개의 클론만을 선정하여 헤마글루티닌 항원형 1형 내지 13형까지 감별가능여부를 확인하였는데 사용하였다. 항원형 1형에 대한 선정된 단클론은 H1-1 (SEQ ID NO: 1)에 반응하는 HA1M#1 및 HA1M#2, H1-2 (SEQ ID NO: 2)에 반응하는 HA1M#4 및 HA1M#5이고, 항원형 3형에 대한 선정된 단클론은 H3-1 (SEQ ID NO: 7)에 반응하는 HA3M#2 및 HA3M#4, H3-2 (SEQ ID NO: 8)에 반응하는 HA3M#6 및 HA3M#7, H3-3 (SEQ ID NO: 9)에 반응하는 HA3M#12 및 HA3M#13 이다. 항원형 1형과 3형의 각각의 다클론항체(HA1P#1, HA1P#2, HA3P#1, HA3P#2)는 모두 반응성이 좋아 모두 선정하였다.
As can be seen in Table 4, differential detection between
<3-2> <3-2> ELISAELISA 를 통한 항체 특성분석Antibody Characterization Through
선정된 단/다클론항체의 특성 분석을 위하여, 합성된 펩타이드를 각각 coating buffer(KOMA BIOTECH INC, K0331021)에 1 ㎍/㎖ 농도로 희석하여 well 당 200 ㎕씩 첨가 하고 4 ℃에서 overnight incubation하여 코팅시켰다. 코팅된 플레이트를 washing solution (PBST, KOMA BIOTECH INC, K0331041, K0331051)으로 5회 반복 세척하고, Blocking solution (1% BSA/PBS, KOMA BIOTECH INC, K0331032)을 well 당 250 ㎕씩 첨가 후 상온에서 1시간 동안 반응하여 blocking을 수행하였다. For characterization of selected mono / polyclonal antibodies, synthesized peptides were diluted to 1 ㎍ / ml in coating buffer (KOMA BIOTECH INC, K0331021), added 200 ㎕ per well and coated overnight at 4 ℃. I was. Wash the coated plate five times with washing solution (PBST, KOMA BIOTECH INC, K0331041, K0331051), add Blocking solution (1% BSA / PBS, KOMA BIOTECH INC, K0331032) 250 well per well, and then at room temperature Blocking was performed by reacting for a time.
blocking된 플레이트는 다시 세척용액을 이용하여 5회 반복하여 세척하고 다/단클론 항체는 1mg/ml으로 조정하고 인산화 완충용액(PBS)으로 1/100, 1/1,000, 1/5,000, 1/10,000, 1/50,000 및 1/100,000으로 희석하여 well당 200μL 씩 분주하고, 음성대조군은 마우스 IgG(1mg/ml, ARISTA BIOLOGICALS INC.)을 인산화 완충용액(PBS)으로 1/1,000으로 희석하여 well에 200μL 분주한 다음 상온에서 60분간 반응시켰다. The blocked plate was washed again five times with the washing solution, and the poly / monoclonal antibody was adjusted to 1 mg / ml and 1/100, 1 / 1,000, 1 / 5,000, 1 / 10,000, with phosphorylation buffer (PBS). Dilute to 1 / 50,000 and 1 / 100,000 and dispense 200μL per well.The negative control group was diluted 1 / 1,000 with mouse IgG (1mg / ml, ARISTA BIOLOGICALS INC.) In phosphorylated buffer solution (PBS) to dispense 200μL into the well. After the reaction at room temperature for 60 minutes.
시료의 반응이 완료된 플레이트는 세척용액을 이용하여 5회 반복하여 세척하고 항-마우스 IgG 또는 항-토끼 IgG에 HRP (Horse reddish peroxidase)가 융합된 시약(1:5,000(v/v), Antibody Incorporated, USA) 을 well 당 200 ㎕씩 첨가 후 상온에서 1시간 동안 반응시키고, 세척액 (PBST, 137 mM NaCl, 2.68 mM KCl, 10.14 mM Na2HPO4, 1.76 mM K2HPO4, 0.5% Tween)으로 세척하였다. 얻어진 반응액을 TMB Substrate kit (KOMA BIOTECH INC, K0331060)로 발색반응을 유도하고 stop solution (2 M, H2SO4)으로 반응을 정지한 후, ELISA reader(TECAN) 로 450nm 파장에서의 흡광도를 측정하여 분석하였다.After the reaction of the sample was completed, the plate was washed five times with a washing solution and a reagent (1: 5,000 (v / v), Antibody Incorporated, in which HRP (Horse reddish peroxidase) was fused to anti-mouse IgG or anti-rabbit IgG) , USA) was added 200 μl per well and then reacted at room temperature for 1 hour, followed by washing (PBST, 137 mM NaCl, 2.68 mM KCl, 10.14 mM Na 2 HPO 4 , 1.76 mM K 2 HPO 4 , 0.5% Tween). Washed. Induce the color reaction with the TMB Substrate kit (KOMA BIOTECH INC, K0331060), stop the reaction with stop solution (2 M, H 2 SO 4 ), and absorb the light at 450 nm with ELISA reader (TECAN). Measured and analyzed.
이와 같이 얻어진 흡광도 결과를 상기 표 4, 도 7a 내지 7f, 8a 내지 8f, 9a 및 9b 에 나타내었다.
The absorbance results thus obtained are shown in Table 4, Figs. 7A to 7F, 8A to 8F, 9A and 9B.
<< 실시예Example 4> 4>
돼지인플루엔자 바이러스 Swine Flu Virus
헤마글루티닌Hemagglutinin
항원형Antigenic type
1형과 3형 특이 특이항체를 이용한 진단 스트립 및 진단 Diagnostic Strips and
<4-1> 돼지인플루엔자 바이러스 <4-1> Swine Flu Virus
헤마글루티닌Hemagglutinin
항원형Antigenic type
1형과 3형 특이 항체가 코팅된 멤브레인( Membranes coated with
상기 <실시예 3>에서 항원형 1형에 대한 선정된 단클론은 H1-1 (SEQ ID NO: 1)에 반응하는 HA1M#1 및 HA1M#2; H1-2 (SEQ ID NO: 2)에 반응하는 HA1M#4 및 HA1M#5이고, 항원형 3형에 대한 선정된 단클론은 H3-1 (SEQ ID NO: 7)에 반응하는 HA3M#2 및 HA3M#4, H3-2 (SEQ ID NO: 8)에 반응하는 HA3M#6 및 HA3M#7 이다. 항원형 1형과 3형의 각각의 다클론 항체는 HA1P#1, HA1P#2, HA3P#1, HA3P#2 이다. Selected monoclonals for
이와 같이 선별된 단/다클론 항체는 0.5 내지 2.5 ㎎/㎖ 농도로 맞추어 검사선으로 사용하고, 대조선은 염소 항-마우스 IgG(Goat anti-mouse IgG, Arista Biologicals Inc.)를 사용하였다.The mono / polyclonal antibody thus selected was used as a test line at a concentration of 0.5 to 2.5 mg / ml, and a control line was used as goat anti-mouse IgG (Arista Biologicals Inc.).
상기 검사선의 단/다클론 항체 및 대조선의 대조 용액은 디스펜싱 기구(KINAMETICS, USA)를 사용하여 니트로 셀룰로오스 막(Millipore) 에 코팅하고, 낮은 습도의 실험실에서 밤새 건조하거나 적어도 5시간 이상 팬에서 건조시켰다. 상기 제조된 막의 플레이트는 건조제(Silica gel, TPG)와 함께 밀봉된 컨테이너 또는 낮은 습도의 실험실에서 보관하였다.
The mono / polyclonal antibody of the test line and the control solution of the control line were coated on a nitro cellulose membrane (Millipore) using a dispensing instrument (KINAMETICS, USA) and dried overnight in a low humidity laboratory or in a pan for at least 5 hours. I was. Plates of the prepared membranes were stored in a sealed container or a low humidity laboratory with a desiccant (Silica gel, TPG).
<4-2> 돼지인플루엔자 바이러스 <4-2> Swine Flu Virus
헤마글루티닌Hemagglutinin
항원형
상기 <실시예 3>에서 선별된 단/다클론 항체를 최종 농도가 4 내지 20㎍/㎖가 되도록 교반하면서 잘 섞어주고, 금 용액(colloidal Gold, 1 O.D.)에 한 방울씩 첨가한 후, 이 용액을 다시 15분간 교반하였다. 그 후, 금 입자 부유 물에 10%의 BSA 용액을 첨가하였다. 다시 15분간 교반한 후, 결합된 금용액을 6,000g에서 30분간 원심분리하여, 결합되지 않은 재조합 단백질을 제거하기 위해서 상등액은 버리고, 결합된 금 용액 펠렛에, 펠렛용량의 3배의 1%의 BSA가 첨가된 5 mM 소디움 보레이트 (Sodium Tetraborate, pH7.2)를 첨가한 후 상기 펠렛을 재부유하였다. 상기 부유물을 다시 원심분리하고, 최종 펠렛을 1%의 BSA가 첨가된 5 mM 소디움 테트라보레이트 (Sodium Tetraborate, pH7.2)에서 스펙트로포토메타 530nm에서 흡광도가 10+/-1이 되게 조정함으로써, 돼지인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌 항원형 1형과 3형 특이 특이 항체-금 (Gold) 접합체를 제조하였다.
The mono / polyclonal antibody selected in <Example 3> was mixed well while stirring to have a final concentration of 4 to 20 µg / ml, and was added dropwise to a gold solution (colloidal Gold, 1 OD). The solution was stirred again for 15 minutes. Thereafter, 10% BSA solution was added to the gold particle suspension. After another 15 minutes of stirring, the bound gold solution was centrifuged at 6,000 g for 30 minutes, and the supernatant was discarded to remove unbound recombinant protein. The pellet was resuspended after addition of 5 mM Sodium Tetraborate (pH 7.2) with BSA. The suspension was centrifuged again and the final pellet was adjusted to an absorbance of 10 +/− 1 at spectrophotometer 530 nm in 5 mM Sodium Tetraborate (pH 7.2) with 1% BSA. Influenza virus
<4-3> 금 접합체 처리 패드의 준비<4-3> Preparation of gold conjugated treatment pad
금 접합체 처리 패드는 상기 <실시예 4-2>에서 제조된 금 접합체에 트레할로스 (Trehalose, SIGMA)를 최종 농도가 5%(v/v)가 되도록 첨가하여 다음과 같이 제조하였다.The gold conjugated treatment pad was prepared by adding trehalose (SIGMA) to a final concentration of 5% (v / v) to the gold conjugate prepared in Example 4-2.
구체적으로 돼지인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌 항원형 1형과 3형 특이 특이항체를 이용한 진단 스트립 (strip)을 위해, 0.5 x 20 cm 유리섬유에 상기 <실시예 4-2>에서 제조한 돼지인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌 항원형 1형과 3형 특이 항체-금 (Gold) 접합체가 최종농도 1.0 내지 2.5 OD (Optical Density)가 되게 제조하였다.
Specifically for swine influenza virus
<4-4> 흡수패드 및 <4-4> absorption pad and 검체패드Sample pad 제조 Produce
흡수패드 및 검체패드는 반응용액이 잘 흡수될 수 있도록 건조하여 당업계에 공지된 방법에 따라 패드의 절단, 반응용액 처리(일반적으로 dipping), 건조, 및 보관 등의 과정으로 제조하였다.The absorbent pad and the sample pad were dried so that the reaction solution could be absorbed well, and were prepared by the process of cutting the pad, treating the reaction solution (generally dipping), drying, and storing according to methods known in the art.
<4-5> <4-5> 디바이스device 조립 Assembly
상기에서 제조된 각각의 멤브레인과 패드들을, 오른쪽부터 검체패드, 골드패드(금 접합체 처리패드), 니트로셀룰로오스 멤브레인, 마지막으로 흡수패드를 각각 중첩되게 결합하고 면역분석장치(디바이스)에 크기에 맞는 스트립 크기로 절단하였다 (도 11 참조). 이렇게 절단된 스트립을 최종적으로 동시 진단용 면역분석장치(콤보 디바이스, 출원번호 10-2008-0075645)의 하판에 각각 넣고 상판을 덮어 동시 진단용 키트를 제조하였다 (도 10 참조).
Each of the membranes and pads prepared above were combined to overlap the sample pad, the gold pad (gold conjugate pad), the nitrocellulose membrane, and finally the absorbent pad, respectively, from the right side, and were sized to the immunoassay device (device). Cut to size (see FIG. 11). The strips thus cut were finally put in the lower plate of the simultaneous diagnosis immunoassay device (combo device, application number 10-2008-0075645), and the top plate was covered to prepare a simultaneous diagnosis kit (see FIG. 10).
<4-6> 제품 구성<4-6> Product Composition
상기에서 설명된 면역분석장치와 검체 전개액 (PBS, 50mM KCl, 300mM NaCl, 0.5% Tween20, 0.1% NaN3)을 최종 제품으로 구성하였다 (도 12 참조).
The immunoassay device and sample development (PBS, 50mM KCl, 300mM NaCl, 0.5% Tween20, 0.1% NaN3) described above consisted of the final product (see Figure 12).
<< 시험예Test Example 1> 1>
돼지인플루엔자 바이러스 Swine Flu Virus
헤마글루티닌Hemagglutinin
항원형Antigenic type
1형과 3형 특이항체를 사용한 헤마글루티닌 감별 진단 스트립의 효능 시험 Efficacy test of hemagglutinin differential diagnostic
상기의 <실시예 4>에 의해 제조된 감별 진단 키트를 이용하여 상기 표 2의 13종의 항원형별 인플루엔자바이러스를 대상으로 감별여부를 진단하였다. The differential diagnosis kit prepared according to Example 4 was used to diagnose the differentiation of 13 kinds of antigen-type influenza viruses in Table 2 above.
상기 <실시예 4>에서 제조된 감별 진단 키트와 항원형별 바이러스의 유전자염기서열 결과를 가지고 각각 검사하여 그 결과를 표 5에 나타냈다. Each of the differentiation diagnostic kits prepared in <Example 4> and the genotype sequence results of the antigen-type viruses were examined, and the results are shown in Table 5.
상기 표 5에 기재한 바와 같이, 본 발명의 돼지인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌 항원형 1형과 3형 특이항체를 이용한 진단 키트는, 유전자염기서열 결과와 일치하는 결과를 보여주었다. As described in Table 5, the diagnostic kit using the swine influenza virus
따라서, 본 발명의 돼지인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌 항원형 1형과 3형 특이항체는 인플루엔자바이러스 헤마글루티닌 항원형 1형과 3형을 감별하는 진단키트를 개발하는데 매우 유용함을 알 수 있다.Therefore, it can be seen that the swine influenza virus
서열목록 전자파일 첨부Attach an electronic file to a sequence list
Claims (27)
상기 항체는 단클론 항체 또는 다클론 항체인, 항체.5. The method of claim 4,
The antibody is a monoclonal antibody or a polyclonal antibody.
SEQ ID NO: 7 내지 12로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열로 이루어진 항원결정부위 폴리펩타이드 분자를 특이적으로 인식하는 항체 1종 이상을 더 포함하는, 돼지인플루엔자 바이러스 검출용 키트.9. The method of claim 8,
SEQ ID NO: The kit for detecting swine influenza virus further comprises at least one antibody that specifically recognizes the epitope polypeptide molecules consisting of amino acid sequences selected from the group consisting of 7 to 12.
상기 시료에 SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열로 이루어진 항원결정부위 폴리펩타이드 분자를 특이적으로 인식하는 항체를 적용하는 단계; 및
항원-항체 반응을 검사하는 단계
를 포함하는, 돼지인플루엔자 바이러스 검출 방법.Preparing an animal sample except human;
Applying an antibody that specifically recognizes an epitope polypeptide molecule consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 to the sample; And
Testing antigen-antibody responses
Comprising, swine flu virus detection method.
상기 시료에 SEQ ID NO: 7 내지 12로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열로 이루어진 항원결정부위 폴리펩타이드 분자를 특이적으로 인식하는 1종 이상의 항체를 더 포함하는, 돼지인플루엔자 바이러스 검출 방법.The method of claim 12,
The sample further comprises one or more antibodies that specifically recognize the epitope polypeptide molecules consisting of amino acid sequences selected from the group consisting of SEQ ID NO: 7 to 12, swine influenza virus detection method.
상기 항원결정부위 폴리펩타이드 분자는 SEQ ID NO: 7 내지 12로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열로 이루어진 1종 이상의 폴리펩타이드를 더 포함하는,백신 조성물.17. The method of claim 16,
The epitope polypeptide molecule further comprises at least one polypeptide consisting of an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 7 to 12, vaccine composition.
SEQ ID NO: 7 내지 12로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열로 이루어진 항원결정부위 폴리펩타이드 분자를 특이적으로 인식하는 1종 이상의 항체를 더 포함하는, 돼지인플루엔자 바이러스 감염 예방 또는 치료용 조성물.21. The method of claim 20,
SEQ ID NO: The composition for preventing or treating swine influenza virus infection, further comprising one or more antibodies that specifically recognize the epitope polypeptide molecules consisting of amino acid sequences selected from the group consisting of 7 to 12.
상기 키트는 SEQ ID NO: 2 내지 6으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열로 이루어진 항원결정부위 폴리펩타이드 분자를 특이적으로 인식하는 1종 이상의 항체를 더욱 포함하고, 돼지인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌 항원형 1형을 검출하는 것을 특징으로 하는, 돼지인플루엔자 바이러스 검출용 키트.9. The method of claim 8,
The kit further comprises one or more antibodies that specifically recognize an epitope polypeptide molecule consisting of an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 2 to 6, porcine influenza virus hemagglutinin antigen type 1 A kit for detecting swine influenza virus, characterized by detecting a form.
상기 항체 적용단계는 상기 시료에 SEQ ID NO: 2 내지 6으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열로 이루어진 항원결정부위 폴리펩타이드 분자를 특이적으로 인식하는 1종 이상의 항체를 추가로 적용하는 것이고, 돼지인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌 항원형 1형을 검출하는 것을 특징으로 하는, 돼지인플루엔자 바이러스 검출 방법.The method of claim 12,
The antibody applying step is to further apply one or more antibodies that specifically recognize the epitope polypeptide molecules consisting of amino acid sequences selected from the group consisting of SEQ ID NO: 2 to 6 in the sample, swine influenza virus A method for detecting swine influenza virus, characterized by detecting hemagglutinin antigen type 1.
SEQ ID NO: 2 내지 6으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열로 이루어진 1종 이상의 폴리펩타이드 분자, 상기 폴리펩타이드 분자를 코딩하는 DNA 분자, 상기 DNA 분자를 포함하는 발현벡터, 및 상기 발현벡터로 형질전환된 형질전환세포로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 더욱 포함하고, 헤마글루티닌 항원형 1형의 돼지인플루엔자 바이러스에 대하여 효과를 갖는 것을 특징으로 하는, 백신 조성물.17. The method of claim 16,
SEQ ID NO: at least one polypeptide molecule consisting of an amino acid sequence selected from the group consisting of 2 to 6, a DNA molecule encoding the polypeptide molecule, an expression vector comprising the DNA molecule, and transformed with the expression vector The vaccine composition further comprises at least one selected from the group consisting of transformed cells, and has an effect on hemagglutinin antigen type 1 swine influenza virus.
SEQ ID NO: 2 내지 6으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열로 이루어진 항원결정부위 폴리펩타이드 분자를 특이적으로 인식하는 1종 이상의 항체를 더욱 포함하고, 헤마글루티닌 항원형 1형의 돼지인플루엔자 바이러스에 대하여 효과를 갖는 것을 특징으로 하는, 돼지인플루엔자 바이러스 감염 예방 또는 치료용 조성물.21. The method of claim 20,
Further comprising at least one antibody that specifically recognizes an epitope polypeptide molecule consisting of an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 2 to 6, hemagglutinin antigen type 1 swine influenza virus It has an effect against, composition for preventing or treating swine influenza virus infection.
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| KR20120028603A (en) | 2012-03-23 |
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