JP2022123648A - Kit for immunochromatography, and method for quantifying polypeptide - Google Patents

Abstract

To provide new means capable of simply quantifying IgG1 and IgG2.SOLUTION: A kit for immunochromatography can quantify two or more polypeptides comprising IgG of different subclasses heavy chain Fc regions in a sample, and contains a polyclonal antibody capable of binding to the IgG heavy chain Fc regions of different subclasses, where the amino acid sequence similarity between the heavy chain Fc region of the polypeptides and the IgG heavy chain Fc region of the polyclonal antibody is 77% or less.SELECTED DRAWING: Figure 2

Description

本発明は、イムノクロマトグラフィー用キットに関する。また、本発明は、ポリペプチドの定量方法に関する。 The present invention relates to an immunochromatographic kit. The present invention also relates to methods for quantifying polypeptides.

免疫グロブリン（Ｉｇ）は体液性免疫に関与するポリペプチドであり、抗体とも呼ばれる。免疫グロブリンは、その定常領域（Ｆｃ）の違いにより、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＥの５つのクラス（アイソタイプ）に分けられる。そのうち、ＩｇＧは、生体の血漿中の免疫グロブリンの大部分（例えば、ヒトでは７０～７５％）を占め、体液性免疫の主要な機能を担う。 Immunoglobulins (Igs) are polypeptides involved in humoral immunity, also called antibodies. Immunoglobulins are divided into five classes (isotypes), IgG, IgA, IgM, IgD, and IgE, depending on their constant regions (Fc). Of these, IgG accounts for the majority of immunoglobulins in the plasma of living organisms (eg, 70-75% in humans) and plays a major role in humoral immunity.

ＩｇＧはさらにいくつかのサブクラスに分けられる。例えば、ヒトではＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４の４つのサブクラスからなり、マウスではＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ及びＩｇＧ３の４つのサブクラスからなる。そして、ＩｇＧ１及びＩｇＧ２がＩｇＧの大多数を占める。例えばヒトでは、ＩｇＧ１：ＩｇＧ２：ＩｇＧ３：ＩｇＧ４が概ね６５：２５：７：３であり、マウスではＩｇＧ１：ＩｇＧ２ａ：ＩｇＧ２ｂ：ＩｇＧ３が概ね４６：２４：２７：２である。 IgG is further divided into several subclasses. For example, humans consist of four subclasses of IgG1, IgG2, IgG3 and IgG4, and mice consist of four subclasses of IgG1, IgG2a, IgG2b and IgG3. IgG1 and IgG2 account for the majority of IgG. For example, in humans IgG1:IgG2:IgG3:IgG4 is approximately 65:25:7:3 and in mice IgG1:IgG2a:IgG2b:IgG3 is approximately 46:24:27:2.

近年、例えばＢｅｔｈｙｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社やＺｅｐｔｏＭｅｔｒｉｘ社から、ＩｇＧの定量のための酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）試薬が市販されている。しかし、これらのキットが各ＩｇＧサブクラスをどの程度の感度で認識できるのかは不明であるうえに、ＥＬＩＳＡは定量に数時間を要するという課題がある。 Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) reagents for the quantification of IgG have recently become commercially available, eg from Bethyl Laboratories and ZeptoMetrix. However, it is unclear how sensitive these kits can recognize each IgG subclass, and ELISA has the problem that it takes several hours for quantification.

また、特許文献１には、ヒトＩｇＧのＦｃを特異的に認識する２種の抗ヒトモノクローナル抗体と、それらを利用したヒトＩｇＧのＦｃを含有するポリペプチドの測定方法が開示されている。しかし、当該文献の表８によれば、当該測定方法では、ＩｇＧの各サブクラスの検出感度にはバラつきがあり、ヒトと異なる動物種のＩｇＧサブクラス量比の試料におけるＩｇＧの定量精度も不明である。 In addition, Patent Document 1 discloses two types of anti-human monoclonal antibodies that specifically recognize human IgG Fc and a method for measuring a polypeptide containing human IgG Fc using them. However, according to Table 8 of the document, in the measurement method, the detection sensitivity of each IgG subclass varies, and the quantification accuracy of IgG in samples with IgG subclass amount ratios of animal species different from humans is also unknown. .

特開２００９－１４２２６９号公報JP 2009-142269 A

医薬や研究用試薬等に用いられるモノクローナル抗体は、通常は活性化した複数のＢ細胞の中から、特定の抗原に特異的な抗体を発現するＢ細胞クローンをスクリーニングして抗体産生に用いる。このとき、抗体の結合活性の測定に加えてＩｇＧの定量ができれば、高い力価（比活性）の抗体を産生するＢ細胞クローンをスクリーニングすることができる。 Monoclonal antibodies used in pharmaceuticals, research reagents, etc. are usually produced by screening a plurality of activated B cells for B cell clones expressing antibodies specific to specific antigens. At this time, if IgG can be quantified in addition to the measurement of antibody binding activity, B cell clones that produce antibodies with high titer (specific activity) can be screened.

しかし、免疫刺激で活性化したＢ細胞クローンのほとんどはＩｇＧを産生するものの、そのサブクラスは上記のように一定の比率で産生され得る。そのため、サブクラスごとに感度が大きく異なるＩｇＧの定量方法の場合、ＩｇＧを精度よく定量するには、そのサブクラスの特定をしたうえで検量線の作成や補正を行う必要があり、測定に時間と手間がかかるという課題があった。 However, although most immunostimulatory activated B cell clones produce IgG, subclasses thereof can be produced in proportion as described above. Therefore, in the case of IgG quantification methods that have significantly different sensitivities for each subclass, in order to quantify IgG with high accuracy, it is necessary to identify the subclass and then create and correct the calibration curve, which requires time and effort for measurement. There was a problem that it took

本発明者らは、ＩｇＧの中に占める割合が大きいサブクラスであるＩｇＧ１及びＩｇＧ２を同程度の感度で定量することができれば、多くのＢ細胞クローンから産生されるＩｇＧの定量を簡易迅速に行うことができると考えた。 The present inventors believe that if IgG1 and IgG2, which are subclasses occupying a large proportion of IgG, can be quantified with similar sensitivity, IgG produced from many B cell clones can be quantified easily and quickly. I thought I could do it.

そこで、本開示では、ＩｇＧ１とＩｇＧ２を簡便に定量することができる新たな手段を提供することを課題とした。 Therefore, an object of the present disclosure is to provide a new means for easily quantifying IgG1 and IgG2.

本開示の実施形態の一つであるイムノクロマトグラフィー用キットは、
異なるサブクラスのＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域を含む２種以上のポリペプチドを定量することが可能であり、
前記異なるサブクラスのＩｇＧの重鎖Ｆｃ領域に結合可能なポリクローナル抗体を含み、
前記ポリペプチドの重鎖Ｆｃ領域と前記ポリクローナル抗体のＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域のアミノ酸配列類似度が７７％以下である、ことを特徴とする。 The immunochromatography kit, which is one of the embodiments of the present disclosure, comprises
capable of quantifying two or more polypeptides comprising IgG heavy chain Fc regions of different subclasses;
comprising a polyclonal antibody capable of binding to heavy chain Fc regions of IgG of different subclasses;
The amino acid sequence similarity between the heavy chain Fc region of the polypeptide and the IgG heavy chain Fc region of the polyclonal antibody is 77% or less.

前記キットにおいて、前記異なるサブクラスのＩｇＧが、少なくともＩｇＧ１及びＩｇＧ２を含んでもよい。 In the kit, the different subclasses of IgG may include at least IgG1 and IgG2.

前記キットにおいて、ＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は、例えばネズミ目（Ｒｏｄｅｎｔｉａ）生物、より具体的にはマウス又はラットに由来し、かつ、前記ポリクローナル抗体は、鯨偶蹄目（Ｃｅｔａｒｔｉｏｄａｃｔｙｌａ）生物、より具体的にはヤギ、ヒツジ又はウシに由来する。このような構成は、前記ポリクローナル抗体を容易に得ることができる点で好ましい。 In said kit, the IgG heavy chain Fc region is derived from, for example, a Rodentia organism, more particularly mouse or rat, and said polyclonal antibody is derived from a Cetartiodactyla organism, more particularly derived from goats, sheep or cattle. Such a configuration is preferable in that the polyclonal antibody can be easily obtained.

前記異なるサブクラスのＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域を含む２種以上のポリペプチドは、好ましくは互いに分子量が同程度であるものであり、例えば、異なるサブクラスの２種以上のＩｇＧである。 The two or more polypeptides comprising IgG heavy chain Fc regions of different subclasses preferably have similar molecular weights, for example, two or more IgGs of different subclasses.

前記ポリクローナル抗体は、下記の（ｉ）、（ｉｉ）のいずれか又はそれらの両方を経ていることを特徴とする：
（ｉ）前記２種以上のポリペプチドの重鎖Ｆｃ領域を含むポリペプチドを担体とするアフィニティークロマトグラフィーによる精製、
（ｉｉ）血清成分を担体とするアフィニティークロマトグラフィーによる吸収処理。
当該実施形態によれば、前記ポリペプチドの定量性をさらに高めることができる。 The polyclonal antibody is characterized by undergoing either or both of the following (i) and (ii):
(i) purification by affinity chromatography using a polypeptide comprising the heavy chain Fc regions of the two or more polypeptides as a carrier;
(ii) Absorption treatment by affinity chromatography using serum components as carriers.
According to this embodiment, the quantification of the polypeptide can be further enhanced.

前記ポリクローナル抗体は、例えば、標識抗体、抗原捕捉抗体又はそれらの両方の用途でイムノクロマトグラフィーに用いられる。 The polyclonal antibodies are used in immunochromatography, eg, as labeled antibodies, antigen-capturing antibodies, or both.

前記キットは、さらに少なくともイムノクロマトグラフィー試験片を含み、該イムノクロマトグラフィー試験片に前記ポリクローナル抗体が固相化された構成とすることができる。
別の実施形態では、前記ポリクローナル抗体は、例えば乾燥物又は溶液としてキットに含まれ得る。この場合、前記ポリクローナル抗体は、例えばイムノクロマトグラフィー試験片の作製に使用される。 The kit may further include at least an immunochromatographic test strip, and the polyclonal antibody may be immobilized on the immunochromatographic test strip.
In another embodiment, said polyclonal antibody may be included in the kit, eg as a dry matter or as a solution. In this case, said polyclonal antibodies are used, for example, for the production of immunochromatographic test strips.

前記キットは、さらに下記の（Ａ）～（Ｃ）のいずれか１以上を満たす緩衝液を含むことが好ましい：
（Ａ）０．１質量％以上の非イオン性界面活性剤を含有する；
（Ｂ）アルカリ金属イオンの濃度が４００ｍＭ以下である；
（Ｃ）ｐＨ緩衝成分の濃度が２５ｍＭ以上である。
当該緩衝液は（Ａ）～（Ｃ）のいずれか２以上を満たすことがより好ましく、（Ａ）～（Ｃ）の全てを満たすことが更に好ましい。 The kit preferably further contains a buffer that satisfies any one or more of the following (A) to (C):
(A) contains 0.1% by mass or more of a nonionic surfactant;
(B) the concentration of alkali metal ions is 400 mM or less;
(C) The concentration of the pH buffer component is 25 mM or higher.
More preferably, the buffer satisfies any two or more of (A) to (C), and more preferably satisfies all of (A) to (C).

また、本開示の実施形態の一つである、試料中の異なるサブクラスのＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域を有する２種以上のポリペプチドを定量する方法は、
（ａ）試料供給部、展開部及び捕捉部を含むイムノクロマトグラフィー試験片に、試料を接触させること；及び
（ｂ）前記イムノクロマトグラフィー試験片の捕捉部の前記ポリペプチドと抗体の複合体のシグナルを検出すること；を含み、
前記抗体が、前記異なるサブクラスのＩｇＧの重鎖Ｆｃ領域に結合可能なポリクローナル抗体を含み、
前記ポリペプチドの重鎖Ｆｃ領域と前記ポリクローナル抗体のＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域のアミノ酸配列類似度が７７％以下であることを特徴とする。 In addition, a method for quantifying two or more polypeptides having different subclasses of IgG heavy chain Fc regions in a sample, which is one of the embodiments of the present disclosure, comprises
(a) contacting a sample with an immunochromatographic test strip comprising a sample supply portion, a developing portion, and a capturing portion; detecting;
said antibody comprises a polyclonal antibody capable of binding to heavy chain Fc regions of IgG of said different subclasses;
The amino acid sequence similarity between the heavy chain Fc region of the polypeptide and the IgG heavy chain Fc region of the polyclonal antibody is 77% or less.

前記方法において、（ａ）の試料は、以下の（Ａ）～（Ｃ）のいずれか１以上を満たす緩衝液で希釈されることが好ましい。
（Ａ）０．１質量％以上の非イオン性界面活性剤を含有する；
（Ｂ）アルカリ金属イオンの濃度が４００ｍＭ以下である；
（Ｃ）ｐＨ緩衝成分の濃度が２５ｍＭ以上である。
当該緩衝液は（Ａ）～（Ｃ）のいずれか２以上を満たすことがより好ましく、（Ａ）～（Ｃ）の全てを満たすことが更に好ましい。 In the above method, the sample (a) is preferably diluted with a buffer that satisfies any one or more of (A) to (C) below.
(A) contains 0.1% by mass or more of a nonionic surfactant;
(B) the concentration of alkali metal ions is 400 mM or less;
(C) The concentration of the pH buffer component is 25 mM or higher.
More preferably, the buffer satisfies any two or more of (A) to (C), and more preferably satisfies all of (A) to (C).

前記（ａ）の試料を接触させた時点から前記（ｂ）の検出の時点までの時間は、例えば２５～４５分とすることができる。 The time from the time of contacting the sample (a) to the time of detection (b) can be, for example, 25 to 45 minutes.

本開示の実施形態の一つであるポリクローナル抗体の作製方法は、下記の（Ｉ）及び（ＩＩ）を含む：
（Ｉ）動物に、前記異なるサブクラスのＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域を含む組成物を接種して免疫刺激された動物から回収された血清を準備すること；及び
（ＩＩ）前記血清に対して、（ｉ）前記２種以上のポリペプチドの重鎖Ｆｃ領域を含むポリペプチドを担体とするアフィニティークロマトグラフィーによる精製、及び（ｉｉ）ウシ又はウマの血清成分を担体とするアフィニティークロマトグラフィーによる吸収処理、のいずれか一方又はそれらの両方を行うこと。 A method for producing a polyclonal antibody, which is one embodiment of the present disclosure, includes the following (I) and (II):
(I) providing serum collected from an animal that has been immunized by inoculating an animal with a composition comprising an IgG heavy chain Fc region of said different subclass; and (II) to said serum, (i ) purification by affinity chromatography using a polypeptide comprising the heavy chain Fc regions of the two or more polypeptides as a carrier, and (ii) absorption treatment by affinity chromatography using a bovine or horse serum component as a carrier. either or both.

前記ポリクローナル抗体は、例えば、ＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域を含む２種以上のポリペプチドの検出又は定量に使用することができる。 The polyclonal antibody can be used, for example, to detect or quantify two or more polypeptides comprising an IgG heavy chain Fc region.

前記ポリクローナル抗体は、例えば、イムノクロマトグラフィー、ＥＬＩＳＡ法、表面プラズモン共鳴法、ラテックス凝集法、免疫拡散法、ウェスタンブロット法、ドットブロット法、免疫沈降法、免疫電気泳動法又は免疫電気拡散法に使用することができる。 Said polyclonal antibodies are used, for example, in immunochromatography, ELISA, surface plasmon resonance, latex agglutination, immunodiffusion, western blotting, dot blotting, immunoprecipitation, immunoelectrophoresis or immunoelectrodiffusion. be able to.

本開示のイムノクロマトグラフィー用キット及び本開示の方法によれば、ＩｇＧ１重鎖Ｆｃ領域を有するポリペプチドとＩｇＧ２重鎖Ｆｃ領域を有するポリペプチドを同程度の感度で定量することができる。 According to the immunochromatography kit and the method of the present disclosure, polypeptides having an IgG1 heavy chain Fc region and polypeptides having an IgG2 heavy chain Fc region can be quantified with similar sensitivity.

試験例１のヤギの免疫スケジュールの概略図である。1 is a schematic diagram of an immunization schedule for goats in Test Example 1. FIG. 試験例３において、サブクラスの異なるマウスＩｇＧをイムノクロマトグラフィーで測定して得られた吸光度を比較したグラフである。10 is a graph comparing the absorbance obtained by measuring mouse IgG of different subclasses by immunochromatography in Test Example 3. FIG. 試験例３において、マウスＩｇＧ１とＩｇＭをイムノクロマトグラフィーで測定して得られた吸光度を比較したグラフである。2 is a graph comparing the absorbance obtained by measuring mouse IgG1 and IgM by immunochromatography in Test Example 3. FIG. 試験例３において、マウスＩｇＧ１を含有する試料と、マウスＩｇＧ１に加えて１０％ウシ胎仔血清をさらに含有する試料とをイムノクロマトグラフィーで測定して得られた吸光度を比較したグラフである。2 is a graph comparing the absorbance obtained by immunochromatographic measurement of a sample containing mouse IgG1 and a sample further containing 10% fetal bovine serum in addition to mouse IgG1 in Test Example 3. FIG. 試験例３において、種々の濃度のマウスＩｇＧ１を含有する試料を滴下した直後からイムノクロマトグラフィー測定したときの各試料の吸光度の経時変化を表すグラフである。10 is a graph showing changes over time in absorbance of each sample when immunochromatographic measurement was performed immediately after dropping a sample containing mouse IgG1 at various concentrations in Test Example 3. FIG. 図５Ａのデータを、吸光度が安定化したときの値（ほぼ最大値に相当する）で各試料の吸光度を規格化して比較したグラフである。FIG. 5B is a graph comparing the data in FIG. 5A by normalizing the absorbance of each sample with the value when the absorbance is stabilized (corresponding to approximately the maximum value). 試験例３において、種々の濃度のＩｇＧ１を含有する試料を３回測定して得られた吸光度の平均値と、測定値から得られた検量線を表すグラフである。3 is a graph showing average values of absorbance obtained by measuring samples containing IgG1 at various concentrations three times and a calibration curve obtained from the measured values in Test Example 3. FIG.

本明細書において、「抗体」とは、抗原に対して非共有結合的そして特異的に抗原に結合することができる免疫グロブリン（Ｉｇ）ファミリーのポリペプチドを表す。
本明細書において、「ポリクローナル抗体」は複数の抗体分子種からなる抗体集団を指し、「モノクローナル抗体」は単一の分子種からなる抗体集団を表す。 As used herein, "antibody" refers to a polypeptide of the immunoglobulin (Ig) family that is capable of non-covalently and specifically binding to an antigen.
As used herein, "polyclonal antibody" refers to an antibody population composed of multiple antibody molecular species, and "monoclonal antibody" refers to an antibody population composed of a single molecular species.

本明細書において、「ＩｇＧ」は免疫グロブリンＧを表す。ＩｇＧ分子は２本の重鎖及び２本の軽鎖であってジスルフィド結合によって相互結合されたものからなる、分子量約１５万、１～３％の糖鎖を含むポリペプチドである。各重鎖は重鎖可変領域（「ＶＨ」と表す）と重鎖定常領域（「ＣＨ」と表す）からなる。重鎖定常領域は３つのドメインからなり、それぞれ「ＣＨ１」、「ＣＨ２」、「ＣＨ３」と表す。各軽鎖は、軽鎖可変領域（「ＶＬ」と表す）と軽鎖定常領域（「ＣＬ」と表す）からなる。 As used herein, "IgG" refers to immunoglobulin G. An IgG molecule is a polypeptide consisting of two heavy chains and two light chains interconnected by disulfide bonds, with a molecular weight of about 150,000 and containing 1-3% sugar chains. Each heavy chain consists of a heavy chain variable region (designated "VH") and a heavy chain constant region (designated "CH"). The heavy chain constant region consists of three domains, designated "CH1", "CH2" and "CH3" respectively. Each light chain consists of a light chain variable region (denoted "VL") and a light chain constant region (denoted "CL").

ＩｇＧは重鎖の種類によってサブクラスに分けられる。例えば、ヒトのＩｇＧでは重鎖としてＨ_γ１、Ｈ_γ２、Ｈ_γ３及びＨ_γ４の４種類があり、それぞれの重鎖を含むＩｇＧサブクラスは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４である。また、マウス及びラットのＩｇＧでは重鎖としてＨγ１、Ｈ_γ２ａ、Ｈ_γ２ｂ及びＨ_γ３の４種類があり、それぞれの重鎖を含むＩｇＧサブクラスは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、及びＩｇＧ３である。 IgG is divided into subclasses according to the type of heavy chain. For example, human IgG has four types of heavy chains, H _γ1 , H _γ2 , H _γ3 and H _γ4 , and the IgG subclasses containing each heavy chain are IgG1, IgG2, IgG3 and IgG4. In mouse and rat IgG, there are four types of heavy chains, _Hγ1 , _Hγ2a , _Hγ2b , and Hγ3, and the IgG subclasses containing each heavy chain are IgG1, IgG2a, IgG2b, and IgG3.

本明細書において、単純に「ＩｇＧ２」と表した場合、マウス及びラットにおいては、ＩｇＧ２ａとＩｇＧ２ｂの両方を区別なく表すものとする。 In the present specification, the term "IgG2" simply refers to both IgG2a and IgG2b in mice and rats without distinction.

本明細書において、「Ｆｃ」又は「Ｆｃ領域」とは、免疫グロブリンをタンパク質分解酵素であるパパインで消化して得られる断片のうち、重鎖Ｃ末端が含まれる断片又は該断片に相当するポリペプチド鎖上の部分を表す。ＦｃはＣＨ２及びＣＨ３を含む。 As used herein, the term "Fc" or "Fc region" refers to a fragment obtained by digesting an immunoglobulin with a proteolytic enzyme, papain, containing a heavy chain C-terminus or a poly Represents a portion on a peptide chain. Fc includes CH2 and CH3.

本明細書において、「エピトープ」とは、抗体が特異的に結合する、抗原上の部位を指す。 As used herein, "epitope" refers to the site on an antigen to which an antibody specifically binds.

本明細書において、「連結（conjugation）」又は「連結する（conjugate）」とは、ある分子種又は原子種を、共有結合又は非共有結合（特に限定されないが、例えば、配位結合、疎水結合、水素結合、静電結合など）で一体化することを表す。 As used herein, “conjugation” or “conjugate” refers to the binding of certain molecular or atomic species to covalent or non-covalent bonds (including, but not limited to, coordinate bonds, hydrophobic bonds, , hydrogen bond, electrostatic bond, etc.).

本明細書において、標識抗体とは、標識された抗体を指す。また、抗原捕捉抗体とは、固相に固定化され、抗原と結合性のある抗体を指す。 As used herein, a labeled antibody refers to a labeled antibody. An antigen-capturing antibody refers to an antibody immobilized on a solid phase and capable of binding to an antigen.

［イムノクロマトグラフィー用キット］
本開示の実施形態の一つであるイムノクロマトグラフィー用キットは、
異なるサブクラスのＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域を含む２種以上のポリペプチドを定量することが可能であり、
前記異なるサブクラスのＩｇＧの重鎖Ｆｃ領域に結合可能なポリクローナル抗体を含み、
前記ポリペプチドの重鎖Ｆｃ領域と前記ポリクローナル抗体のＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域のアミノ酸配列類似度が７７％以下である、ことを特徴とする。 [Immunochromatography kit]
The immunochromatography kit, which is one of the embodiments of the present disclosure, comprises
capable of quantifying two or more polypeptides comprising IgG heavy chain Fc regions of different subclasses;
comprising a polyclonal antibody capable of binding to heavy chain Fc regions of IgG of different subclasses;
The amino acid sequence similarity between the heavy chain Fc region of the polypeptide and the IgG heavy chain Fc region of the polyclonal antibody is 77% or less.

（異なるサブクラスのＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域を含む２種以上のポリペプチド）
前記イムノクロマトグラフィー用キットは、異なるサブクラスのＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域を含む２種以上のポリペプチドの定量に用いられる。当該２種以上のポリペプチドのうちの少なくとも２種は、それぞれ同種由来で互いにサブクラスが異なるＦｃを含む。当該２種以上のポリペプチドは、本発明の効果を顕著に奏する観点から、互いに分子量が同程度であるものが好ましい。例えば当該２種以上のポリペプチドは、異なるサブクラスの２種以上のＩｇＧであり得る。 (Two or more polypeptides containing IgG heavy chain Fc regions of different subclasses)
The immunochromatography kit is used for quantification of two or more polypeptides containing IgG heavy chain Fc regions of different subclasses. At least two of the two or more polypeptides contain Fc derived from the same species and having different subclasses. The two or more polypeptides preferably have approximately the same molecular weight, from the viewpoint of significantly exhibiting the effects of the present invention. For example, the two or more polypeptides can be two or more IgGs of different subclasses.

本明細書において、ＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域を含むポリペプチドとは、ＩｇＧのＦｃ領域を少なくとも１以上含有していれば特に限定されず、他の部分とＦｃ領域とが共有結合していてもよいし、疎水結合、配位結合、静電結合等により非共有結合して一体となっていてもよい。このようなＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域を含むポリペプチドとしては、例えばＩｇＧ抗体、ＩｇＧのＦｃ領域の断片、及びそれらを含むポリペプチド（例えば、ポリペプチド、薬物、標識等が連結した抗体又はＦｃ領域等）が挙げられる。 As used herein, the polypeptide containing the IgG heavy chain Fc region is not particularly limited as long as it contains at least one IgG Fc region, and other portions and the Fc region may be covalently bound. However, they may be integrated by non-covalent bonding through hydrophobic bonding, coordinate bonding, electrostatic bonding, or the like. Polypeptides containing such IgG heavy chain Fc regions include, for example, IgG antibodies, fragments of IgG Fc regions, and polypeptides containing them (e.g., antibodies or Fc regions linked to polypeptides, drugs, labels, etc.). ).

本明細書において「２種以上のポリペプチドを定量することが可能である」とは、２種以上のポリペプチドを一度に定量することができる場合に限定されず、例えば、別々の試料として同じキット又は方法に供して、それぞれの試料が定量できる場合も包含する。 As used herein, "capable of quantifying two or more polypeptides" is not limited to the case where two or more polypeptides can be quantified at once. It also includes cases where each sample can be quantified by using a kit or method.

（ポリクローナル抗体）
本実施形態のポリクローナル抗体は、異なるサブクラスのＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域を抗原として認識することを特徴とする。その結果、試料中の異なるサブクラスのＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域を含む２種以上のポリペプチドを定量することができる。 (polyclonal antibody)
The polyclonal antibody of this embodiment is characterized by recognizing IgG heavy chain Fc regions of different subclasses as antigens. As a result, two or more polypeptides comprising different subclasses of IgG heavy chain Fc regions in a sample can be quantified.

前記ポリクローナル抗体は、エピトープとして、例えば、前記２種以上のポリペプチドの重鎖Ｆｃ領域の少なくとも一部を認識することができる。 The polyclonal antibody can recognize, as an epitope, for example, at least part of the heavy chain Fc regions of the two or more polypeptides.

前記ポリクローナル抗体の重鎖Ｆｃ領域と前記ポリペプチドの重鎖Ｆｃ領域とのアミノ酸配列の類似度は、例えば、７７％以下、７５％以下、７０％以下、６５％以下又は６０％以下であり得る。また、前記ポリクローナル抗体の重鎖Ｆｃ領域と前記ポリペプチドの重鎖Ｆｃ領域とのアミノ酸配列の類似度は、例えば、５０％以上、５５％以上、６０％以上、６５％以上、７０％以上又は７５％以上であり得る。
本明細書において、アミノ酸配列の類似度は、ＮＣＢＩ ＢＬＡＳＴ（ＵＲＬ：https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）のｂｌａｓｔｐ ｓｕｉｔｅのデフォルトの設定で２つの配列のアラインメントを行って得られるｐｏｓｉｔｉｖｅの数値で表される。 The amino acid sequence similarity between the heavy chain Fc region of the polyclonal antibody and the heavy chain Fc region of the polypeptide may be, for example, 77% or less, 75% or less, 70% or less, 65% or less, or 60% or less. . In addition, the degree of amino acid sequence similarity between the heavy chain Fc region of the polyclonal antibody and the heavy chain Fc region of the polypeptide is, for example, 50% or more, 55% or more, 60% or more, 65% or more, 70% or more, or It can be 75% or more.
As used herein, the similarity of amino acid sequences is determined by aligning two sequences with the default settings of the blastp suite of NCBI BLAST (URL: https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi). It is represented by a positive numerical value obtained by

前記ポリクローナル抗体の由来は、その重鎖Ｆｃ領域が上記のアミノ酸配列類似度を満たす限りにおいて特に限定されない。
例えば、前記２種以上のポリペプチドの重鎖Ｆｃ領域がネズミ目（Ｒｏｄｅｎｔｉａ）生物に由来する場合、前記ポリクローナル抗体は鯨偶蹄目（Ｃｅｔａｒｔｉｏｄａｃｔｙｌａ）生物に由来するものであり得る。即ち、例えば前記２種以上のポリペプチドの重鎖Ｆｃ領域がマウス又はラットに由来する場合、前記ポリクローナル抗体はヤギ、ヒツジ又はウシに由来するものであり得、一実施形態ではヤギに由来するものであり得る。
また、例えば前記２種以上のポリペプチドの重鎖Ｆｃ領域が鯨偶蹄目生物に由来する場合、前記ポリクローナル抗体はネズミ目生物に由来するものであり得る。即ち、例えば前記２種以上のポリペプチドの重鎖Ｆｃ領域がヤギ、ヒツジ又はウシに由来する場合、前記ポリクローナル抗体はマウス又はラットに由来するものであり得る。 The origin of the polyclonal antibody is not particularly limited as long as the heavy chain Fc region satisfies the above amino acid sequence similarity.
For example, if the heavy chain Fc regions of the two or more polypeptides are from a Rodentia organism, the polyclonal antibody can be from a Cetartiodactyla organism. Thus, for example, when the heavy chain Fc regions of the two or more polypeptides are derived from mouse or rat, the polyclonal antibody may be derived from goat, sheep or bovine, and in one embodiment is derived from goat. can be
Alternatively, for example, when the heavy chain Fc regions of the two or more polypeptides are derived from a cetacean organism, the polyclonal antibody may be derived from a murine organism. Thus, for example, where the heavy chain Fc regions of the two or more polypeptides are derived from goat, sheep or bovine, the polyclonal antibody may be derived from mouse or rat.

前記ポリクローナル抗体は、例えば、上記の由来となる動物に、前記異なるサブクラスのＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域を含む組成物を抗原として接種して免疫した後の血清から得られる。当該免疫に用いる組成物としては、例えば、特定の生物種の血清から得られるポリクローナル抗体のパパイン消化物、又はその精製物が挙げられる。 The polyclonal antibody can be obtained, for example, from the serum obtained after immunizing the above-mentioned derived animal by inoculating the composition containing the IgG heavy chain Fc regions of the different subclasses as an antigen. Compositions used for the immunization include, for example, papain-digested products of polyclonal antibodies obtained from sera of specific species, or purified products thereof.

例えばヤギを免疫する場合、抗原接種は、例えば１回、２回、３回、４回、５回又は６回以上行うことができる。また、抗原摂取は１～２週間おきに行うことができる。中でも、抗原接種は、第１回目の抗原接種後に２週間おきに４回の計５回行うことが好ましい。免疫刺激には、完全フロイントアジュバント、不完全フロイントアジュバント、水酸化アルミニウム（ミョウバン）等のアルミニウム塩などのアジュバントを適宜併用することができる。一実施形態では、アジュバントとして、完全フロイントアジュバント、不完全フロイントアジュバント、又はそれらの両方が使用される。 For example, when immunizing goats, the inoculation can be performed, for example, once, twice, three times, four times, five times, or six times or more. In addition, antigen intake can be performed every 1 to 2 weeks. Above all, it is preferable to perform the antigen inoculation four times in total, four times at intervals of two weeks after the first inoculation. Adjuvants such as complete Freund's adjuvant, incomplete Freund's adjuvant, and aluminum salts such as aluminum hydroxide (alum) can be appropriately used for immunostimulation. In one embodiment, the adjuvant used is complete Freund's adjuvant, incomplete Freund's adjuvant, or both.

例えば、抗原接種を行った後で、ポリクローナル抗体が産生されているかどうかを確認するための採血を、最初の抗原接種から、例えば３～１２週間後、４～１０週間後又は５～８週間後に行ってもよい。一実施形態では、当該採血は、例えば最初の抗原接種から５週間後及び／又は７週間後に行われる。 For example, after vaccination, blood is drawn to confirm whether polyclonal antibodies are produced, for example, 3 to 12 weeks, 4 to 10 weeks, or 5 to 8 weeks after the first vaccination. you can go In one embodiment, the blood draw is performed, for example, 5 weeks and/or 7 weeks after the first vaccination.

例えばヤギにポリクローナル抗体を産生させる場合、最初の抗原接種から、例えば５～１５週間後、７～１２週間後又は８～１０週間後に全採血を行ってもよい。一実施形態では、当該採血は、例えば最初の抗原接種から９週間後に行われる。 For example, if a goat is to be raised with polyclonal antibodies, exsanguination may be performed, eg, 5-15 weeks, 7-12 weeks, or 8-10 weeks after the initial challenge. In one embodiment, the blood draw is performed, for example, 9 weeks after the first vaccination.

免疫刺激後に得られるポリクローナル抗体を含有する血清は、そのまま本キットに使用することもできるが、保存安定性及び定量性の向上の観点から、ポリクローナル抗体は精製してキットに使用することが好ましい。精製処理としては、例えば、硫安沈殿、プロテインＡ若しくはプロテインＧ又はイオン交換樹脂等によるクロマトグラフィー等を用いた一般的なＩｇ画分の精製；ポリクローナル抗体の抗原である前記２種以上のポリペプチドの重鎖Ｆｃ領域部分を含むポリペプチドを担体とするアフィニティークロマトグラフィーによる精製から選ばれる１以上の手段を用いることができる。特定の実施形態では、血清は、プロテインＧカラムによる精製を経た後に、前記２種以上のポリペプチドの重鎖Ｆｃ領域を含むポリペプチドを担体とするアフィニティークロマトグラフィーによる精製を行う。これにより、より定量性に優れたポリクローナル抗体を得ることができる。 Serum containing polyclonal antibodies obtained after immunostimulation can be used as it is in this kit, but from the viewpoint of improving storage stability and quantification, it is preferable to purify polyclonal antibodies and use them in the kit. Purification treatments include, for example, ammonium sulfate precipitation, purification of general Ig fractions using chromatography using protein A or protein G, ion exchange resin, etc.; One or more means selected from purification by affinity chromatography using a polypeptide containing a heavy chain Fc region portion as a carrier can be used. In a specific embodiment, the serum is purified by protein G column followed by affinity chromatography using a polypeptide comprising the heavy chain Fc regions of said two or more polypeptides as a carrier. This makes it possible to obtain polyclonal antibodies with better quantification.

前記ポリクローナル抗体を含む組成物は、さらに非特異反応を除くために、血清成分を担体としたアフィニティークロマトグラフィーによる吸収処理（吸着処理）を行ってもよい。吸収処理に用いる血清成分としては、例えば細胞培地に含まれる血清が挙げられる。より具体的には、吸収処理に用いる血清成分は、例えばウシ又はウマの血清である。これにより、より定量性に優れたポリクローナル抗体を得ることができる。 The composition containing the polyclonal antibody may be subjected to absorption treatment (adsorption treatment) by affinity chromatography using a serum component as a carrier in order to further eliminate non-specific reactions. Serum components used for absorption treatment include, for example, serum contained in cell culture media. More specifically, the serum component used for the absorption treatment is, for example, bovine or horse serum. This makes it possible to obtain polyclonal antibodies with better quantification.

前記ポリクローナル抗体は、異なるサブクラスのＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域を含む２種以上のポリペプチドを検出又は定量する用途で、イムノクロマトグラフィー（ラテラルフローイムノアッセイ、ストリップテスト）法の他に、例えば、ＥＬＩＳＡ法、表面プラズモン共鳴法、ラテックス凝集法、免疫拡散法、ウェスタンブロット法、ドットブロット法、免疫沈降法（Ouchterlony法等）、免疫電気泳動法（Mancini法）、免疫電気拡散法（ロケット法）等に用いることができる。これらの分析法では、例えば、前記ポリクローナル抗体は下記の標識抗体の形態で使用される。 The polyclonal antibody is used to detect or quantify two or more polypeptides containing IgG heavy chain Fc regions of different subclasses, in addition to immunochromatography (lateral flow immunoassay, strip test) methods, for example, ELISA method, surface Plasmon resonance method, latex agglutination method, immunodiffusion method, western blot method, dot blot method, immunoprecipitation method (Ouchterlony method, etc.), immunoelectrophoresis method (Mancini method), immunoelectrodiffusion method (rocket method), etc. can be done. In these assays, for example, the polyclonal antibodies are used in the form of labeled antibodies as described below.

（標識抗体、抗原捕捉抗体）
前記ポリクローナル抗体は、イムノクロマトグラフィーにおける標識抗体、抗原捕捉抗体又はそれらの両方に用いることができる。一実施形態では、前記ポリクローナル抗体は、標識抗体及び抗原捕捉抗体の両方に用いられる。 (labeled antibody, antigen capture antibody)
The polyclonal antibodies can be used as labeled antibodies, antigen-capturing antibodies, or both in immunochromatography. In one embodiment, the polyclonal antibody is used both as a labeled antibody and as an antigen-capturing antibody.

前記ポリクローナル抗体を標識抗体して用いる場合、ポリクローナル抗体は、例えば、微小粒子、蛍光物質、酵素、ビオチン、放射性標識体、磁性粒子等の標識が予め連結されて本キットに含まれてもよく、また本キットによって標識抗体を調製してもよい。 When the polyclonal antibody is used as a labeled antibody, the polyclonal antibody may be pre-linked with a label such as microparticles, fluorescent substances, enzymes, biotin, radiolabels, magnetic particles, etc., and may be included in the kit. A labeled antibody may also be prepared using this kit.

微小粒子としては、抗体の抗原結合性を損なわない限りにおいて特に限定されず、例えば、金コロイドのような金属コロイド粒子、着色ラテックス粒子のような着色粒子等が挙げられる。 The microparticles are not particularly limited as long as they do not impair the antigen-binding properties of the antibody, and examples thereof include metal colloid particles such as gold colloid, colored particles such as colored latex particles, and the like.

蛍光物質としては、抗体又はその機能性断片の抗原結合性を損なわない限りにおいて特に限定されず、例えば、ローダミン系、クマリン系、オキサジン系、カルボピロニン系、シアニン系、ピロメセン系、ナフタレン系、ビフェニル系、アントラセン系、フェナントレン系、ピレン系、カルバゾール系、Ｃｙ系、ＥｖｏＢｌｕｅ系、フルオレセイン系又はこれらの誘導体等が挙げられる。 The fluorescent substance is not particularly limited as long as it does not impair the antigen-binding property of the antibody or functional fragment thereof. , anthracene-based, phenanthrene-based, pyrene-based, carbazole-based, Cy-based, EvoBlue-based, fluorescein-based or derivatives thereof.

酵素としては、抗体又はその機能性断片の抗原結合性を損なわない限りにおいて特に限定されず、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、アルカリフォスファターゼ、ペルオキシダーゼ、β－Ｄ－ガラクトシダーゼ、マイクロペルオキシダーゼ等が挙げられる。 The enzyme is not particularly limited as long as it does not impair the antigen-binding property of the antibody or functional fragment thereof, and includes horseradish peroxidase (HRP), alkaline phosphatase, peroxidase, β-D-galactosidase, microperoxidase and the like.

放射性標識体としては、特に限定されないが、例えば、^３Ｈ、^１４Ｃ、^１５Ｎ、^３５Ｓ、^９０Ｙ、^９９Ｔｃ、^１１１Ｉｎ、^１２５Ｉ、^１３１Ｉ等が挙げられる。 Examples of radioactive labels include, but are not particularly limited to, ^3H , ^14C , ^15N , ^35S , ^90Y , ^99Tc , ^111In , ^125I , ^131I and the like.

標識抗体がイムノクロマトグラフィーに用いられる態様としては、例えば下記の（ａ）～（ｃ）のいずれかが挙げられる。
（ａ）本キットがイムノクロマトグラフィー試験片を含み、該試験片に標識抗体が予め含まれる態様
（ｂ）標識抗体が乾燥物又は溶液としてキットに含まれ、イムノクロマトグラフィー試験片の作製に使用される態様
（ｃ）標識抗体が定量の際に試料溶液に添加されるか、又は試料溶液とともにイムノクロマトグラフィー試験片に滴下されて使用される態様。 Embodiments in which the labeled antibody is used in immunochromatography include, for example, any of the following (a) to (c).
(a) A mode in which the present kit contains an immunochromatographic test strip, and the test strip contains a labeled antibody in advance (b) A labeled antibody is contained in the kit as a dried product or a solution, and is used to prepare an immunochromatographic test strip Mode (c) Mode in which the labeled antibody is added to the sample solution during quantification, or dropped onto the immunochromatographic test strip together with the sample solution.

前記ポリクローナル抗体が抗原捕捉抗体としてイムノクロマトグラフィーに用いられる態様としては、例えば下記の（ａ）又は（ｂ）が挙げられる。
（ａ）本キットがイムノクロマトグラフィー試験片を含み、該試験片に前記ポリクローナル抗体が予め固相化されて含まれる態様
（ｂ）前記ポリクローナル抗体が乾燥物又は溶液としてキットに含まれ、イムノクロマトグラフィー試験片の作製に使用される態様。 Examples of embodiments in which the polyclonal antibody is used as an antigen-capturing antibody in immunochromatography include the following (a) or (b).
(a) A mode in which the present kit contains an immunochromatographic test piece, and the polyclonal antibody is previously immobilized on the test piece (b) The polyclonal antibody is contained in the kit as a dried product or a solution, and an immunochromatographic test Embodiments used to make strips.

（その他構成）
（１．イムノクロマトグラフィー試験片）
本キットは、イムノクロマトグラフィー試験片を含むことが好ましい。当該イムノクロマトグラフィー試験片には、上記の標識抗体、抗原捕捉抗体、又はそれらの両方を含むことが好ましい。 (Other configurations)
(1. Immunochromatographic test piece)
Preferably, the kit includes an immunochromatographic test strip. The immunochromatographic test strip preferably contains the labeled antibody, the antigen-capturing antibody, or both.

前記試験片が前記ポリクローナル抗体を含む場合、その含有量は、使用するポリクローナル抗体、定量するポリペプチド、測定条件等によって適宜選択し得るが、試験片１枚当たり、例えば標識抗体は５～１０μｇ、抗原捕捉抗体は１０～３０μｇとすることができる。 When the test strip contains the polyclonal antibody, the content thereof can be appropriately selected depending on the polyclonal antibody to be used, the polypeptide to be quantified, the measurement conditions, etc. The antigen capture antibody can be 10-30 μg.

前記試験片は、例えばテストストリップを含む。当該テストストリップは、第１の開口部と第２の開口部が形成された、例えばプラスチック製のケースの内部に収容され、テストストリップの表面の一部がこれらの開口部から露出している構成とすることができる。例えば、テストストリップの実施形態の一つとして、特に限定されないが、例えば特開２０１９－１５８７９１号公報に記載されたものが挙げられる。下記に、その具体的な実施形態を示す。詳細は当該公報の記載から理解することができる。
＜テストストリップの実施形態の例＞
テストストリップは、例えば、試料滴下部と、展開部と、捕捉部とを備える。テストストリップは、全体として、例えば濾紙などの多孔質支持体で構成される。
試料滴下部は、試料が滴下される部分であり、例えばフィルタペーパによって構成される。試料滴下部は、第１の開口部に露出する。
試料は、第１の開口部から試料滴下部に滴下される。試料滴下部に滴下された検体は、多孔質支持体に吸収され、毛細管現象によって展開部へと向かう。
展開部は、検体をクロマト展開させる部分であり、例えばニトロセルロースメンブレンで構成される。
捕捉部は、使用時には抗原捕捉抗体が、例えば線状又は帯状に固相化される。補足部は、第２の開口部に露出しており、第２の開口部を介して捕捉部上の前記ポリペプチドと抗体の複合体のシグナルを検出によるシグナルを検出することができる。
テストストリップは、試料滴下部から展開部までの間に、さらに標識抗体を保持する標識保持部を備えてもよい。標識試薬が定量の際に試料溶液に添加する態様、又は試料溶液とともにイムノクロマトグラフィー試験片に滴下される態様においては、テストストリップは、標識保持部を備えていなくてもよい。
前記テストストリップは、さらに吸収部を備えてもよい。吸収部は例えばフィルタペーパによって構成され、試料溶液を吸い上げることで、試料滴下部から標識保持部へスムーズに導くことができる。 The test piece includes, for example, a test strip. The test strip is housed inside a case made of plastic, for example, in which a first opening and a second opening are formed, and a part of the surface of the test strip is exposed from these openings. can be For example, one embodiment of the test strip is not particularly limited, but includes one described in Japanese Patent Laid-Open No. 2019-158791. Specific embodiments thereof are shown below. Details can be understood from the description in the publication.
<Example of embodiment of test strip>
The test strip includes, for example, a sample dropper, a developing section, and a trapping section. A test strip generally consists of a porous support, such as filter paper.
The sample dropping part is a part onto which the sample is dropped, and is made up of filter paper, for example. The sample dropping part is exposed at the first opening.
A sample is dropped from the first opening onto the sample dropping portion. The specimen dropped onto the sample dropping section is absorbed by the porous support and directed to the developing section by capillary action.
The developing section is a section for chromatographically developing a sample, and is composed of, for example, a nitrocellulose membrane.
In the capturing portion, the antigen-capturing antibody is immobilized, for example, in a linear or strip shape when used. The capturing part is exposed to the second opening, and the signal of the complex of the polypeptide and the antibody on the capturing part can be detected through the second opening.
The test strip may further include a label holding portion that holds the labeled antibody between the sample dropping portion and the developing portion. In a mode in which the labeling reagent is added to the sample solution during quantification, or a mode in which the labeling reagent is dropped onto the immunochromatography test strip together with the sample solution, the test strip may not have a label holding portion.
The test strip may further comprise an absorbent portion. The absorption part is made up of filter paper, for example, and by sucking up the sample solution, it can be smoothly guided from the sample dropping part to the label holding part.

前記試験片には、例えばＱＲコード（登録商標）などの二次元コードがさらに記載されてもよい。当該二次元コードに含まれる情報は、例えば分析項目、有効期限、ロット番号などの試験片の基本情報、及び、例えば反応時間、検量線などの試験片に固有の呈色反応に関連する情報などである。 A two-dimensional code such as a QR code (registered trademark) may be further printed on the test piece. The information contained in the two-dimensional code includes basic information of the test piece such as analysis items, expiration date, and lot number, and information related to color reaction specific to the test piece, such as reaction time and calibration curve. is.

（２．試薬、器具等）
本キットは、さらにｐＨ緩衝成分、界面活性剤、塩類及びブロッキング剤からなる群より選ばれる１種単独又は２種以上の組み合わせを含むことが好ましい。 (2. Reagents, instruments, etc.)
The kit preferably further contains one or a combination of two or more selected from the group consisting of pH buffer components, surfactants, salts and blocking agents.

ｐＨ緩衝成分としては、特に限定されないが、例えば、リン酸、ホウ酸、酢酸、クエン酸、ギ酸、カコジル酸等の酸又はこれらの塩；グリシン等のアミノ酸；トリスヒドロキシアミノメタン（Ｔｒｉｓ）；ＨＥＰＥＳ、ＭＥＳ等のグッドバッファー等から選ばれる１種の成分単独又は２種以上の成分の組み合わせが挙げられる。 Examples of pH buffer components include, but are not limited to, acids such as phosphoric acid, boric acid, acetic acid, citric acid, formic acid, and cacodylic acid, or salts thereof; amino acids such as glycine; trishydroxyaminomethane (Tris); , a good buffer such as MES, and the like alone or in combination of two or more components.

界面活性剤としては、特に限定されないが、非イオン性界面活性剤が好ましく、エステルエーテル型、エステル型、エーテル型のいずれも用いることができる。より具体的にはＴｗｅｅｎ２０、Ｔｗｅｅｎ４０、Ｔｗｅｅｎ８０、Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ１００、ポリオキシエチレン（６０）ソルビタンモノステアレート、ポリオキシエチレン（６５）ソルビタントリステアレート、ポリオキシエチレン（８０）ソルビタンモノオレエート、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル、ノニデットＰ－４０及びＣＨＡＰＳからなる群より選ばれる１種以上が挙げられる。 Although the surfactant is not particularly limited, nonionic surfactants are preferred, and any of ester ether type, ester type and ether type can be used. More specifically Tween 20, Tween 40, Tween 80, Triton-X100, polyoxyethylene (60) sorbitan monostearate, polyoxyethylene (65) sorbitan tristearate, polyoxyethylene (80) sorbitan monooleate, polyoxyethylene One or more selected from the group consisting of ethylene alkylphenyl ether, Nonidet P-40 and CHAPS.

塩類としては、例えばアルカリ金属（ナトリウム、カリウム等）、アルカリ土類金属塩（マグネシウム、カルシウム等）、アルミニウム、鉄、銅、亜鉛、マンガンの塩が挙げられ、少なくともアルカリ金属塩を含むことが好ましい。一実施形態では、本キットは、塩類として塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化マグネシウムからなる群より選ばれる１種以上を含む。 Salts include, for example, alkali metal (sodium, potassium, etc.), alkaline earth metal salts (magnesium, calcium, etc.), aluminum, iron, copper, zinc, manganese salts, and preferably contain at least an alkali metal salt. . In one embodiment, the kit contains one or more salts selected from the group consisting of sodium chloride, potassium chloride, and magnesium chloride.

ブロッキング剤としては、例えば、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、カゼイン、スキムミルク及び血清からなる群より選ばれる１種以上が挙げられる。 Blocking agents include, for example, one or more selected from the group consisting of bovine serum albumin (BSA), casein, skimmed milk and serum.

上記のｐＨ緩衝成分、界面活性剤、塩類及びブロッキング剤からなる群より選ばれる少なくとも１種以上は、緩衝液として本キットに含まれていても良い。当該緩衝液は、例えば、イムノクロマトグラフィー試料の希釈に用いられる。 At least one or more selected from the group consisting of the above pH buffer components, surfactants, salts and blocking agents may be included in the kit as a buffer solution. The buffer is used, for example, for diluting immunochromatographic samples.

イムノクロマトグラフィー試料の希釈用緩衝液は、例えば以下の（Ａ）～（Ｃ）のうち少なくとも１以上を満たし、好ましくは２以上、より好ましくは３つ全てを満たす。
（Ａ）０．１質量％以上の非イオン性界面活性剤を含有する；
（Ｂ）アルカリ金属イオンの濃度が４００ｍＭ以下である；
（Ｃ）ｐＨ緩衝成分の濃度が２５ｍＭ以上である。 Dilution buffers for immunochromatographic samples satisfy, for example, at least one, preferably two or more, and more preferably all three of the following (A) to (C).
(A) contains 0.1% by mass or more of a nonionic surfactant;
(B) the concentration of alkali metal ions is 400 mM or less;
(C) The concentration of the pH buffer component is 25 mM or higher.

（Ａ）の非イオン性界面活性剤は、例えばＴｗｅｅｎ２０が挙げられる。
（Ａ）の非イオン性界面活性剤の含有量は、バックグラウンドシグナルを抑える観点から、例えば０．１質量％以上、好ましくは０．１５質量％以上、より好ましくは０．２質量％以上であり、例えば０．８質量％以下、好ましくは０．５質量％以下、より好ましくは０．４質量％以下又は０．３質量％以下とすることができる。 Examples of nonionic surfactants (A) include Tween 20.
The content of the nonionic surfactant (A) is, for example, 0.1% by mass or more, preferably 0.15% by mass or more, more preferably 0.2% by mass or more, from the viewpoint of suppressing background signals. For example, it can be 0.8% by mass or less, preferably 0.5% by mass or less, more preferably 0.4% by mass or less, or 0.3% by mass or less.

（Ｂ）のアルカリ金属イオンは、例えばナトリウムイオンが挙げられる。
（Ｂ）のアルカリ金属イオンの含有量は、バックグラウンドシグナルを抑える観点から、例えば４００ｍＭ以下、２００ｍＭ以下、１００ｍＭ以下又は５０ｍＭ以下、好ましくは１ｍＭ以下であり、アルカリ金属イオンを実質的に含まないことがより好ましい。ここで実質的に含まないとは、例えば公知の定量分析法によりアルカリ金属イオンの定量分析を行った場合に、０．１ｍＭ以下となることを表す。 Alkali metal ions (B) include, for example, sodium ions.
The content of alkali metal ions in (B) is, for example, 400 mM or less, 200 mM or less, 100 mM or less, or 50 mM or less, preferably 1 mM or less, from the viewpoint of suppressing background signals, and substantially free of alkali metal ions. is more preferred. Here, "substantially free" means that the content is 0.1 mM or less when quantitative analysis of alkali metal ions is performed by a known quantitative analysis method, for example.

（Ｃ）のｐＨ緩衝成分は、例えばＴｒｉｓ－ＨＣｌが挙げられる。
（Ｃ）のｐＨ緩衝成分の含有量は、バックグラウンドシグナルを抑える観点から、例えば２５ｍＭ以上、５０ｍＭ以上又は１００ｍＭ以上、好ましくは２００ｍＭ以上、より好ましくは４００ｍＭ以上である。また、（Ｃ）のｐＨ緩衝成分は、例えば１Ｍ以下、８００ｍＭ以下又は５００ｍＭ以下であり得る。 The pH buffering component (C) includes, for example, Tris-HCl.
The content of the pH buffer component (C) is, for example, 25 mM or more, 50 mM or more, or 100 mM or more, preferably 200 mM or more, more preferably 400 mM or more, from the viewpoint of suppressing background signals. Also, the pH buffer component of (C) can be, for example, 1 M or less, 800 mM or less, or 500 mM or less.

希釈用緩衝液はブロッキング剤を含んでもよいが、バックグラウンドシグナルを抑える観点から、ブロッキング剤の濃度は、好ましくは０．５質量％以下、より好ましくは０．１質量％であり、ブロッキング剤を実質的に含まないことが更に好ましい。 The dilution buffer may contain a blocking agent, but from the viewpoint of suppressing background signals, the concentration of the blocking agent is preferably 0.5% by mass or less, more preferably 0.1% by mass. Substantially free is more preferred.

上記の緩衝液中の成分の含有量は、試料を希釈する際の濃度であって、本キット中に含まれる緩衝液はその濃縮物（例えば、上記成分の各濃度の整数倍の濃度の濃縮物）であってもよい。 The content of the components in the above buffer solution is the concentration when diluting the sample, and the buffer solution contained in this kit is its concentration (for example, concentration of integral multiples of each concentration of the above component) object).

本キットには、前記異なるサブクラスのＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域と同じサブクラスのＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域を含む１種以上のポリペプチドをさらに含んでもよい。当該ポリペプチドは、陽性対照として、あるいは、例えば、定量の際の検量線の作成、検量線の補正等の標準試料として用いることができる。例えば、当該ポリペプチドは、サブクラスの特定されていないＩｇＧ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４からなる群より選ばれる１種以上であり得る。 The kit may further comprise one or more polypeptides comprising an IgG heavy chain Fc region of the same subclass as the IgG heavy chain Fc region of a different subclass. The polypeptide can be used as a positive control or as a standard sample for, for example, preparation of a standard curve for quantification, correction of a standard curve, and the like. For example, the polypeptide can be one or more selected from the group consisting of unspecified subclasses of IgG, IgG1, IgG2, IgG3 and IgG4.

本発明のキットには、その他の試薬又は器具として、さらに水（ＭｉｌｌｉＱ水、脱イオン水、蒸留水等）、発色又は蛍光検出用基質、スポイト、シリンジ、チップ、プラスチックチューブからなる群より選ばれる１種以上を含んでもよい。 In the kit of the present invention, other reagents or instruments are selected from the group consisting of water (MilliQ water, deionized water, distilled water, etc.), chromogenic or fluorescent detection substrates, droppers, syringes, tips, and plastic tubes. One or more may be included.

（用途）
本キットは、異なるサブクラスのＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域を含む２種以上のポリペプチドを定量することが可能であるが、当該定量の用途に限定されない。例えば、本キットは、異なるサブクラスのＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域を含む２種以上のポリペプチドを検出する用途に使用することができる。
本明細書において、「検出」とは、物質の有無の定性的な判別を表す。 (Application)
This kit can quantify two or more polypeptides containing IgG heavy chain Fc regions of different subclasses, but is not limited to such quantification. For example, the kit can be used to detect two or more polypeptides containing IgG heavy chain Fc regions of different subclasses.
As used herein, "detection" refers to qualitative determination of the presence or absence of a substance.

本キットは、少なくともＩｇＧ１重鎖Ｆｃ領域を含むポリペプチドと、ＩｇＧ２重鎖Ｆｃ領域を含むポリペプチドを定量することができる。本キットは、これらのポリペプチドを同程度の感度で定量することができるため、個別に検量線の作成や補正を行う必要がなく、簡易迅速に定量が可能である。よって、本キットは、例えばＩｇＧ抗体やその産生細胞のスクリーニング等において、サブクラスが特定されていない試料のＩｇＧの定量に適している。 This kit can quantify a polypeptide containing at least an IgG1 heavy chain Fc region and a polypeptide containing an IgG2 heavy chain Fc region. Since this kit can quantify these polypeptides with the same level of sensitivity, there is no need to create or correct a standard curve for each polypeptide, and quantification can be performed easily and quickly. Therefore, the present kit is suitable for quantification of IgG in samples of unspecified subclasses, for example, in screening for IgG antibodies or IgG-producing cells.

定量又は検出の対象となる前記２種以上のポリペプチドを含む試料は、イムノクロマトグラフィーが可能な液状物であれば特に限定されない。例えば、本キットの試料は、血液、尿、唾液、鼻汁、鼻腔拭い液、咽頭拭い液、リンパ液、髄液、腹膜液、***、膣液、涙液、眼内液、硝子体液、糞便、汗若しくは他の体液、又はそれらの分離物若しくは抽出物（血清等）などの生体試料；細胞培養培地上清（例えば、ハイブリドーマ培養上清）；細胞又は組織の抽出物、などが挙げられる。 The sample containing the two or more polypeptides to be quantified or detected is not particularly limited as long as it is a liquid that can be immunochromatographed. For example, the samples of this kit include blood, urine, saliva, nasal discharge, nasal swab, pharyngeal swab, lymph fluid, cerebrospinal fluid, peritoneal fluid, semen, vaginal fluid, tears, intraocular fluid, vitreous humor, feces, and sweat. or other body fluids, or biological samples such as isolates or extracts thereof (such as serum); cell culture medium supernatants (eg, hybridoma culture supernatants); cell or tissue extracts, and the like.

［異なるサブクラスのＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域を有する２種以上のポリペプチドを定量する方法］
本開示の実施形態の一つである、試料中の異なるサブクラスのＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域を有する２種以上のポリペプチドを定量する方法は、
（ａ）試料供給部、展開部及び捕捉部を含むイムノクロマトグラフィー試験片に、試料を接触させること；及び
（ｂ）前記イムノクロマトグラフィー試験片の捕捉部の前記ポリペプチドと抗体の複合体のシグナルを検出すること；を含み、
前記抗体が、前記異なるサブクラスのＩｇＧの重鎖Ｆｃ領域に結合可能なポリクローナル抗体を含み、
前記ポリペプチドの重鎖Ｆｃ領域と前記ポリクローナル抗体のＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域のアミノ酸配列類似度が７７％以下である、
ことを特徴とする。 [Method for Quantifying Two or More Polypeptides Having IgG Heavy Chain Fc Regions of Different Subclasses]
A method for quantifying two or more polypeptides having IgG heavy chain Fc regions of different subclasses in a sample, which is one embodiment of the present disclosure, comprises:
(a) contacting a sample with an immunochromatographic test strip comprising a sample supply portion, a developing portion, and a capturing portion; detecting;
said antibody comprises a polyclonal antibody capable of binding to heavy chain Fc regions of IgG of said different subclasses;
The amino acid sequence similarity between the heavy chain Fc region of the polypeptide and the IgG heavy chain Fc region of the polyclonal antibody is 77% or less,
It is characterized by

本方法の前記イムノクロマトグラフィー試験片は、例えば、上記の［イムノクロマトグラフィー用キット］の項に記載されたイムノクロマトグラフィー試験片を用いることができる。 As the immunochromatographic test strip of this method, for example, the immunochromatographic test strip described in the section [Immunochromatographic kit] can be used.

前記ポリペプチドと抗体の複合体において、当該抗体は、例えば標識抗体及び抗原捕捉抗体を含む。当該抗体の全てが前記ポリクローナル抗体であってもよいし、別の抗体を標識抗体、抗原捕捉抗体等として含んでもよい。 In the polypeptide-antibody conjugate, the antibody includes, for example, a labeled antibody and an antigen-capturing antibody. All of the antibodies may be polyclonal antibodies, or other antibodies may be included as labeled antibodies, antigen-capturing antibodies, and the like.

前記ポリクローナル抗体は、標識抗体、抗原捕捉抗体又はそれらの両方であり、特定の実施形態では、標識抗体及び抗原捕捉抗体の両方である。 Said polyclonal antibody is a labeled antibody, an antigen-capturing antibody or both, in certain embodiments both a labeled antibody and an antigen-capturing antibody.

前記ポリペプチドと抗体の複合体のシグナルの発生には、例えば標識抗体の標識物質自体から、又は標識物質が集合することが関与する。シグナルの測定は当該標識物質の種類によって適宜選択することができ、例えば標識物質に由来する吸光度、反射光、蛍光、磁気、電磁波（可視光線、Ｘ線等）、粒子線（α線、β線等）等の測定が挙げられる。
例えば、前記標識抗体の標識が金コロイドである場合、前記シグナルは、例えば捕捉部の赤色の着色、又は５００ｎｍ～６００ｎｍ（好ましくは５２０～５４０ｎｍであり、例えば５２５ｎｍ）の波長の光を照射した場合の吸光度の変化である。 Signal generation of the polypeptide-antibody complex involves, for example, the labeling substance itself of the labeled antibody or the assembly of the labeling substance. Signal measurement can be appropriately selected depending on the type of the labeling substance. etc.).
For example, when the label of the labeled antibody is colloidal gold, the signal is, for example, red coloration of the capturing portion, or when irradiated with light having a wavelength of 500 nm to 600 nm (preferably 520 to 540 nm, for example 525 nm). is the change in absorbance of

本方法において、ＩｇＧの定量におけるバックグラウンドシグナルを抑える観点から、（ａ）の試料は、以下の（Ａ）～（Ｃ）のいずれか１以上を満たす緩衝液で希釈されることが好ましい。
（Ａ）０．１質量％以上の非イオン性界面活性剤を含有する；
（Ｂ）アルカリ金属イオンの濃度が４００ｍＭ以下である；
（Ｃ）ｐＨ緩衝成分の濃度が２５ｍＭ以上である。
当該緩衝液は、例えば、上記の［イムノクロマトグラフィー用キット］の項に記載された希釈用緩衝液を用いることができる。 In this method, from the viewpoint of suppressing background signals in IgG quantification, the sample (a) is preferably diluted with a buffer that satisfies any one or more of the following (A) to (C).
(A) contains 0.1% by mass or more of a nonionic surfactant;
(B) the concentration of alkali metal ions is 400 mM or less;
(C) The concentration of the pH buffer component is 25 mM or higher.
As the buffer, for example, the dilution buffer described in the section [Immunochromatography kit] can be used.

前記（ａ）の試料を当該緩衝液で希釈する際の希釈倍率は、例えば、５倍以上、１０倍以上、２０倍以上、３０倍以上又は４０倍以上である。さらに、試料の夾雑物による定量への影響を抑制する観点から、希釈倍率は、好ましくは５０倍以上であり、例えば１００倍以上、１５０倍以上、２００倍以上、２５０倍以上又は３００倍以上であってもよい。 The dilution ratio when the sample (a) is diluted with the buffer solution is, for example, 5-fold or more, 10-fold or more, 20-fold or more, 30-fold or more, or 40-fold or more. Furthermore, from the viewpoint of suppressing the influence of sample contaminants on quantification, the dilution ratio is preferably 50-fold or more, for example, 100-fold or more, 150-fold or more, 200-fold or more, 250-fold or more, or 300-fold or more. There may be.

また、（ａ）の試料に動物の血清（例えば、ウシ血清、ウマ血清等）を含有する場合は、試料の夾雑物による定量への影響が抑制する観点から、試料中の動物の血清の濃度が１０質量％以下、５質量％以下、１質量％以下又は０．１質量％以下となるように試料を希釈することが好ましい。 In addition, when the sample of (a) contains animal serum (e.g., bovine serum, horse serum, etc.), from the viewpoint of suppressing the influence of contaminants in the sample on quantification, the concentration of animal serum in the sample is preferably 10% by mass or less, 5% by mass or less, 1% by mass or less, or 0.1% by mass or less.

前記（ａ）の試料を接触させた時点から前記（ｂ）の検出の時点までの時間は、温度、湿度、使用する抗体、試料、緩衝液等によって適宜選択し得る。当該時間は、例えば室温（約２５℃）においては、例えば１分以上、５分以上、１０分以上、又は１５分以上とすることができ、シグナルの安定性（定量性）を向上させる観点から、好ましくは２０分以上、より好ましくは２５分以上である。また、当該時間は、例えば２４時間以下、１２時間以下、６時間以下、２時間以下、６０分以下又は４５分以下とすることができる。 The time from the time of contacting the sample in (a) to the time of detection in (b) can be appropriately selected depending on the temperature, humidity, antibody used, sample, buffer solution, and the like. The time may be, for example, 1 minute or more, 5 minutes or more, 10 minutes or more, or 15 minutes or more at room temperature (about 25° C.), from the viewpoint of improving signal stability (quantitation). , preferably 20 minutes or more, more preferably 25 minutes or more. Also, the time can be, for example, 24 hours or less, 12 hours or less, 6 hours or less, 2 hours or less, 60 minutes or less, or 45 minutes or less.

本方法のその他の具体的な態様については、上記の［イムノクロマトグラフィー用キット］の項の、用途の項の記載に準じる。 Other specific aspects of the present method conform to the descriptions in the section of use in the section of [Immunochromatography kit] above.

以下、本発明に関し、実施例を用いて詳細に説明するが、本発明はその要旨を超えない限り、以下の実施例に限定されるものではない。 Hereinafter, the present invention will be described in detail using examples, but the present invention is not limited to the following examples as long as the gist thereof is not exceeded.

［試験例１．イムノクロマトグラフィー試験片の調製］
（ＩｇＧのＦｃ領域に結合可能なポリクローナル抗体の調製）
以下の手順でマウスＩｇＧのＦｃ領域に結合可能な、ヤギ由来のポリクローナル抗体を調製した。免疫刺激から血清の分離までは、イワキ株式会社に委託して実施した。
（１）ヤギ（若齢成獣）にマウスＩｇＧのＦｃ領域を抗原として接種した。
使用した抗原は、マウス血清のＩｇＧの精製物をパパイン消化して断片化したものであり、マウスＩｇＧの４種類のサブクラスのＦｃ領域全てを含む。
接種は委託先の６３日の標準免疫スケジュール（図１）に沿って実施した。即ち、第１回目の抗原接種後に２週間おきに４回抗原接種を行った。１回につき当該抗原を２ｍｇ／頭で、アジュバントとともに接種した。アジュバントは、初回は完全フロイントアジュバント（ＦＣＡ）、２回目以降は不完全フロイントアジュバント（ＦＩＡ）を使用した。
（２）抗原刺激後６３日目にヤギから血液を採取した。
（３）血液から血清を遠心分離した。そして、プロテインＧカラムを用いて血清から免疫グロブリン画分を分離した。
（４）次に、（１）の抗原に用いたＦｃ領域をアガロースビーズに固定した担体を用いたアフィニティークロマトグラフィーにより、（３）で得られた免疫グロブリン画分からＦｃ領域に結合可能な抗体の画分を分離した。
（５）さらに、得られた抗体画分をウシ血清及びウマ血清を固定化した担体に接触させる吸収処理を行い、これらの血清に対する交差性を抑えたポリクローナル抗体画分を調製した。 [Test Example 1. Preparation of immunochromatographic test piece]
(Preparation of polyclonal antibody capable of binding to Fc region of IgG)
A goat-derived polyclonal antibody capable of binding to the Fc region of mouse IgG was prepared by the following procedure. Iwaki Co., Ltd. was entrusted with the steps from immunostimulation to serum separation.
(1) Goats (young adults) were inoculated with the Fc region of mouse IgG as an antigen.
The antigen used was papain-digested and fragmented mouse serum IgG, containing all four mouse IgG subclass Fc regions.
Inoculation was carried out according to the contractor's 63-day standard immunization schedule (Fig. 1). That is, after the first vaccination, four vaccinations were performed at intervals of two weeks. The antigen was inoculated with adjuvant at 2 mg/head per time. As an adjuvant, complete Freund's adjuvant (FCA) was used for the first time, and incomplete Freund's adjuvant (FIA) was used for the second and subsequent times.
(2) Blood was collected from goats on day 63 after antigen stimulation.
(3) Centrifuged the serum from the blood. The immunoglobulin fraction was then separated from the serum using a protein G column.
(4) Next, by affinity chromatography using a carrier in which the Fc region used for the antigen in (1) is immobilized on agarose beads, an antibody capable of binding to the Fc region from the immunoglobulin fraction obtained in (3) Fractions were separated.
(5) Further, the obtained antibody fraction was subjected to an absorption treatment by contacting it with a carrier on which bovine serum and horse serum were immobilized to prepare a polyclonal antibody fraction with suppressed cross-reactivity to these sera.

（イムノクロマトグラフィー試験片の作製）
以下の手順で、抗原捕捉抗体として上記ヤギ由来ポリクローナル抗体、標識抗体として当該ポリクローナル抗体の金コロイド標識体を含む、イムノクロマトグラフィー試験片を作製した。
（１）上記のヤギ由来ポリクローナル抗体の一部を、物理吸着により金コロイド標識して、標識抗体を調製した。
（２）（１）で調製した標識抗体５μｇを幅８ｍｍ×長さ５ｍｍのグラスファイバー製のパッド（ミリポア社製）に浸み込ませて乾燥させることにより、試料滴下部かつ標識保持部であるコンジュゲートパッドを調製した。
（３）特開第２０１９－１５８７９１号公報の図４の捕捉部のように、幅２５ｍｍ×長さ５ｍｍのニトロセルロースメンブレンの第１の端から１０ｍｍの位置に、抗体塗布機を用いて０．８μＬ／ｃｍの塗布量で、上記のヤギ由来ポリクローナル抗体（抗原捕捉抗体）を含む溶液を線状に塗布した。次に塗布後のメンブレンを５５℃、３０分乾燥させて、抗原捕捉抗体を固相化した。
（４）上記のメンブレンの第１の端に、さらにコンジュゲートパッドの上に試料をしみこませるためのグラスファイバー製のサンプルパッド（幅５ｍｍ×長さ２０ｍｍ、ミリポア社製）を重層した。これらを特開第２０１９－１５８７９１号公報の図２に示されるような２つの開口部が設けられたケースに挟み込んでイムノクロマトグラフィー試験片を作製した。このとき、第１の開口部（試料注入口）に試料滴下部が、もう一方の第２の開口部（観察窓）に捕捉部が露出するように配置した。 (Preparation of immunochromatographic test piece)
An immunochromatographic test strip containing the above goat-derived polyclonal antibody as an antigen-capturing antibody and the gold colloid-labeled polyclonal antibody as a labeled antibody was prepared by the following procedure.
(1) A part of the goat-derived polyclonal antibody was labeled with colloidal gold by physical adsorption to prepare a labeled antibody.
(2) 5 μg of the labeled antibody prepared in (1) is impregnated into a glass fiber pad (manufactured by Millipore) having a width of 8 mm and a length of 5 mm and dried to form a sample dropping portion and a label holding portion. A conjugate pad was prepared.
(3) Using an antibody coating machine, a 0.05 mm sample was applied to a position 10 mm from the first end of a nitrocellulose membrane having a width of 25 mm and a length of 5 mm, as in the trapping portion of FIG. 4 of Japanese Patent Application Laid-Open No. 2019-158791. The solution containing the goat-derived polyclonal antibody (antigen-capturing antibody) was linearly applied at a coating amount of 8 μL/cm. Next, the coated membrane was dried at 55° C. for 30 minutes to immobilize the antigen-capturing antibody.
(4) A glass fiber sample pad (width 5 mm x length 20 mm, manufactured by Millipore) was further overlaid on the first end of the above membrane for impregnating the sample onto the conjugate pad. An immunochromatographic test piece was prepared by sandwiching these in a case provided with two openings as shown in FIG. 2 of JP-A-2019-158791. At this time, the sample dropping portion was exposed to the first opening (sample injection port), and the trapping portion was exposed to the other second opening (observation window).

［試験例２．試料用緩衝液の検討］
１０μｇ／ｍＬ又は０μｇ／ｍＬのマウスＩｇＧ1を含むハイブリドーマ培養液を、表１の種々の組成の緩衝液で５０倍に希釈したものを調製した。
上記の試験例１のイムノクロマトグラフィー試験片の試料注入口に、試料１００μＬを滴下し、室温（２５℃）で所定の時間イムノクロマト展開した３０分後にポイントリーダー（登録商標、ウシオ電機株式会社製）を用いて、標識抗体の金コロイドの凝集により吸収される波長５２５ｎｍの光を観察窓に露出する捕捉部に照射し、吸光度を測定した。 [Test Example 2. Examination of sample buffer solution]
A hybridoma culture medium containing 10 µg/mL or 0 µg/mL mouse IgG1 was diluted 50-fold with buffers of various compositions shown in Table 1, and prepared.
100 μL of the sample was dropped into the sample injection port of the immunochromatographic test piece of Test Example 1 above, and immunochromatographic development was performed for a predetermined time at room temperature (25° C.) 30 minutes later, a point reader (registered trademark, manufactured by Ushio Inc.) was added. was used to irradiate the capture portion exposed to the observation window with light of a wavelength of 525 nm, which is absorbed by aggregation of the gold colloid of the labeled antibody, and the absorbance was measured.

表１に測定結果を示した。１０μｇ／ｍＬ ＩｇＧを含有する場合の吸光度Ａ１は、いずれの緩衝液でも測定に適した十分大きい値を示した。そこで、それぞれの緩衝液のＩｇＧを含有しない場合の吸光度Ａ２が小さいほどバックグラウンドシグナルが小さく良好であると考えて、緩衝液の組成の最適化を検討した。Ｎｏ．３～６及び９の比較から、Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ濃度が高いほどＡ２が小さくなることが示される。また、Ｎｏ．１～３の比較及びＮｏ．７～９の比較から、ＮａＣｌの濃度が低いほどＡ２が小さくなることが示される。Ｎｏ．７とＮｏ．１０の比較及びＮｏ．２とＮｏ．１１、１２との比較から、Ｔｗｅｅｎ２０が０．２質量％で最適であることが示される。さらに、Ｎｏ．２とＮｏ．１３の比較から、ＢＳＡ濃度が低いほどＡ２が小さくなることが示される。 Table 1 shows the measurement results. The absorbance A1 when containing 10 μg/mL IgG showed a sufficiently large value suitable for measurement in any buffer solution. Therefore, considering that the smaller the absorbance A2 of each buffer without IgG, the smaller the background signal, the better, and optimization of the composition of the buffer was investigated. No. A comparison of 3-6 and 9 shows that the higher the Tris-HCl concentration, the smaller the A2. Also, No. 1 to 3 comparison and No. A comparison of 7-9 shows that the lower the concentration of NaCl, the smaller the A2. No. 7 and No. 10 comparisons and no. 2 and No. A comparison with 11, 12 shows that Tween 20 is optimal at 0.2 wt%. Furthermore, No. 2 and No. A comparison of 13 shows that the lower the BSA concentration, the smaller the A2.

［試験例３．イムノクロマトグラフィー法によるＩｇＧの定量試験］
本試験例は、試験例１のイムノクロマトグラフィー試験片に試料を滴下し、所定の時間イムノクロマト展開した後に試験例２に記載の方法で、ポイントリーダーで吸光度測定を行った。希釈液として、４００ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ９．３）、２００ｍＭ ＮａＣｌ、及び０．２質量％ Ｔｗｅｅｎ２０を含有する水溶液を使用した。 [Test Example 3. Quantitative test of IgG by immunochromatographic method]
In this test example, a sample was dropped onto the immunochromatographic test strip of Test Example 1, immunochromatographic development was performed for a predetermined time, and then the absorbance was measured with a point reader by the method described in Test Example 2. An aqueous solution containing 400 mM Tris-HCl (pH 9.3), 200 mM NaCl, and 0.2 mass % Tween20 was used as a diluent.

（ＩｇＧサブクラス間の反応性の比較）
マウスＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ又はＩｇＧ２ｂを０、２．５、５．０又は１０μｇ／ｍＬ含有し、さらに１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を含有するハイブリドーマ用培地（Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ－ＳＦＭ、Ｇｉｂｃｏ社製）を調製した。これらの溶液を上記の希釈液で５０倍に希釈した溶液を試料として滴下し、３０分間イムノクロマト展開してから吸光度測定した。結果を図２に示した。ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ及びＩｇＧ２ｂは各濃度に対して同等の吸光度を示していることから、試験例１の試験片は、サブクラス間の反応性の差が少ないことが明らかとなった。 (Comparison of reactivity between IgG subclasses)
A hybridoma medium (Hybridoma-SFM, manufactured by Gibco) containing 0, 2.5, 5.0 or 10 μg/mL of mouse IgG1, IgG2a or IgG2b and further containing 10% fetal bovine serum (FBS) was prepared. . A solution obtained by diluting these solutions 50 times with the diluent was added dropwise as a sample, and the absorbance was measured after immunochromatographic development for 30 minutes. The results are shown in FIG. Since IgG1, IgG2a and IgG2b show equivalent absorbance for each concentration, it was clarified that the test piece of Test Example 1 has little difference in reactivity between subclasses.

（交差反応性の検証）
マウスＩｇＭを０、２．５若しくは１２．５μｇ／ｍＬ含有する、又はＩｇＧ１を０、２．５若しくは１２．５μｇ／ｍＬ含有する、１０％ウシ胎仔血清含有ハイブリドーマ用培地を調製した。これらの溶液を上記の希釈液で５０倍に希釈した溶液を試料として試験片に滴下し、３０分間イムノクロマト展開してから吸光度を測定した。結果を図３に示した。試験例１の試験片はマウスのＩｇＭに反応しないことが示された。 (Verification of cross-reactivity)
A hybridoma medium containing 0, 2.5 or 12.5 μg/mL of mouse IgM or 0, 2.5 or 12.5 μg/mL of IgG1 and containing 10% fetal bovine serum was prepared. A solution obtained by diluting these solutions 50-fold with the above diluent was dropped as a sample onto a test piece, subjected to immunochromatographic development for 30 minutes, and then absorbance was measured. The results are shown in FIG. It was shown that the test piece of Test Example 1 does not react to mouse IgM.

（ａ）５．０μｇ／ｍＬとなるようにマウスＩｇＧを加えたハイブリドーマ用培地と、（ｂ）５．０μｇ／ｍＬとなるようにマウスＩｇＧを加えた１０％ウシ胎仔血清含有ハイブリドーマ用培地、のそれぞれを希釈液で５０倍に希釈したものを試料として試験片に滴下し、３０分イムノクロマト展開してから吸光度を測定した。結果を図４に示した。（ａ）と（ｂ）の試料の吸光度に差がないことから、試験例１の試験片を用いたＩｇＧの定量において、ウシ胎仔血清による妨害を受けないことが示された。 (a) a hybridoma medium containing mouse IgG at 5.0 μg/mL and (b) a hybridoma medium containing 10% fetal bovine serum containing mouse IgG at 5.0 μg/mL. Each sample was diluted 50-fold with a diluent and dropped onto a test piece as a sample, and the absorbance was measured after immunochromatographic development for 30 minutes. The results are shown in FIG. Since there was no difference in absorbance between the samples (a) and (b), it was shown that the quantification of IgG using the test piece of Test Example 1 was not interfered with by fetal bovine serum.

（試料を滴下した後、測定するまでのイムノクロマト展開時間の検討）
０．５、１．５、３．０、４．５、６．０、７．０、８．０、９．０及び１２．０μｇ／ｍＬのマウスＩｇＧ１を含有するハイブリドーマ用培地を調製した。これらの溶液を上記の希釈液で５０倍に希釈したものを試料として試験片に滴下し、すぐに吸光度測定を開始して、０から９０分間までの吸光度の経時変化を測定した。得られた各試料の吸光度の経時変化を表すグラフを図５Ａに示した。また、図５Ｂは、図５Ａで得られたデータについて、各濃度のＩｇＧ１を含有する試料の吸光度を、吸光度が安定したときの値で規格化して表したグラフである。これらのグラフから、試料中のＩｇＧ濃度に関係なく、試料滴下後２０～６０分、より好ましくは２５～４５分室温でインキュベートすることによって、安定した高いシグナル強度が得られることが判明した。 (Examination of immunochromatographic development time until measurement after dropping the sample)
Hybridoma media containing 0.5, 1.5, 3.0, 4.5, 6.0, 7.0, 8.0, 9.0 and 12.0 μg/mL mouse IgG1 were prepared. A 50-fold dilution of these solutions with the diluent was dropped as a sample onto the test piece, and the absorbance measurement was immediately started to measure the change in absorbance over time from 0 to 90 minutes. FIG. 5A shows a graph showing the change in absorbance over time of each sample obtained. FIG. 5B is a graph showing the data obtained in FIG. 5A, normalizing the absorbance of the sample containing IgG1 at each concentration by the value when the absorbance is stable. From these graphs, it was found that a stable high signal intensity can be obtained by incubating at room temperature for 20 to 60 minutes, more preferably 25 to 45 minutes after dropping the sample, regardless of the IgG concentration in the sample.

（検量線の作成）
表２に示す実濃度のマウスＩｇＧ１を含有する緩衝液を試料として試験片に滴下して３０分後に吸光度測定を行った。測定は同じ実濃度の試料について３回実施した。得られたデータから作成された検量線を図６に示した。また、測定された吸光度から当該検量線を用いて計算される測定濃度の平均値、標準偏差及び変動係数を表２に示した。いずれの濃度においても測定濃度は実濃度にほぼ一致しており、変動係数（ＣＶ％）が２０％以下と定量性が良好な検量線が得られた。 (Preparation of calibration curve)
A buffer solution containing mouse IgG1 at the actual concentration shown in Table 2 was dropped as a sample onto the test piece, and absorbance was measured 30 minutes later. Measurements were performed in triplicate on samples of the same actual concentration. A calibration curve prepared from the obtained data is shown in FIG. Table 2 shows the average value, standard deviation, and coefficient of variation of the measured concentration calculated from the measured absorbance using the calibration curve. At any concentration, the measured concentration was almost the same as the actual concentration, and a calibration curve with a coefficient of variation (CV%) of 20% or less and good quantification was obtained.

Claims (9)

異なるサブクラスのＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域を含む２種以上のポリペプチドを定量することが可能であり、
前記異なるサブクラスのＩｇＧの重鎖Ｆｃ領域に結合可能なポリクローナル抗体を含み、
前記ポリペプチドの重鎖Ｆｃ領域と前記ポリクローナル抗体のＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域のアミノ酸配列類似度が７７％以下である、イムノクロマトグラフィー用キット。 capable of quantifying two or more polypeptides comprising IgG heavy chain Fc regions of different subclasses;
comprising a polyclonal antibody capable of binding to heavy chain Fc regions of IgG of different subclasses;
An immunochromatographic kit, wherein the amino acid sequence similarity between the heavy chain Fc region of the polypeptide and the IgG heavy chain Fc region of the polyclonal antibody is 77% or less. 前記異なるサブクラスのＩｇＧが、少なくともＩｇＧ１及びＩｇＧ２を含む、請求項１に記載のイムノクロマトグラフィー用キット。 The immunochromatographic kit according to claim 1, wherein the different subclasses of IgG include at least IgG1 and IgG2. 前記ポリペプチドのＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域が、ネズミ目（Ｒｏｄｅｎｔｉａ）生物に由来し、前記ポリクローナル抗体が鯨偶蹄目（Ｃｅｔａｒｔｉｏｄａｃｔｙｌａ）生物に由来する、請求項１又は２に記載のイムノクロマトグラフィー用キット。 3. The immunochromatographic kit of claim 1 or 2, wherein the IgG heavy chain Fc region of said polypeptide is derived from a Rodentia organism and said polyclonal antibody is derived from a Cetartiodactyla organism. 前記ポリクローナル抗体は、下記の（ｉ）、（ｉｉ）のいずれか又はそれらの両方を経ていることを特徴とする、請求項１～３のいずれか一項に記載のイムノクロマトグラフィー用キット
（ｉ）前記２種以上のポリペプチドの重鎖Ｆｃ領域を含むポリペプチドを担体とするアフィニティークロマトグラフィーによる精製、
（ｉｉ）血清成分を担体とするアフィニティークロマトグラフィーによる吸収処理。 The immunochromatographic kit according to any one of claims 1 to 3, wherein the polyclonal antibody undergoes either or both of the following (i) and (ii): (i) purification by affinity chromatography using a polypeptide comprising the heavy chain Fc regions of the two or more polypeptides as a carrier;
(ii) Absorption treatment by affinity chromatography using serum components as carriers. さらに少なくともイムノクロマトグラフィー試験片を含み、該イムノクロマトグラフィー試験片に前記ポリクローナル抗体が固相化される、請求項１～４のいずれか一項に記載のイムノクロマトグラフィー用キット。 The immunochromatographic kit according to any one of claims 1 to 4, further comprising at least an immunochromatographic test strip, on which the polyclonal antibody is immobilized. 下記の（Ａ）～（Ｃ）のいずれか１以上を満たす緩衝液を含む、請求項１～５のいずれか一項に記載のイムノクロマトグラフィー用キット：
（Ａ）０．１質量％以上の非イオン性界面活性剤を含有する；
（Ｂ）アルカリ金属イオンの濃度が４００ｍＭ以下である；
（Ｃ）ｐＨ緩衝成分の濃度が２５ｍＭ以上である。 The immunochromatographic kit according to any one of claims 1 to 5, comprising a buffer solution that satisfies any one or more of the following (A) to (C):
(A) contains 0.1% by mass or more of a nonionic surfactant;
(B) the concentration of alkali metal ions is 400 mM or less;
(C) The concentration of the pH buffer component is 25 mM or higher. 異なるサブクラスのＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域を含む２種以上のポリペプチドを定量する方法であって、
（ａ）試料供給部、展開部及び捕捉部を含むイムノクロマトグラフィー試験片に、試料を接触させること；及び
（ｂ）前記イムノクロマトグラフィー試験片の捕捉部の前記ポリペプチドと抗体の複合体のシグナルを検出すること；を含み、
前記抗体が、前記異なるサブクラスのＩｇＧの重鎖Ｆｃ領域に結合可能なポリクローナル抗体を含み、
前記ポリペプチドの重鎖Ｆｃ領域と前記ポリクローナル抗体のＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域のアミノ酸配列類似度が７７％以下である、方法。 A method for quantifying two or more polypeptides comprising IgG heavy chain Fc regions of different subclasses, comprising:
(a) contacting a sample with an immunochromatographic test strip comprising a sample supply portion, a developing portion, and a capturing portion; detecting;
said antibody comprises a polyclonal antibody capable of binding to heavy chain Fc regions of IgG of said different subclasses;
The method, wherein the amino acid sequence similarity between the heavy chain Fc region of said polypeptide and the IgG heavy chain Fc region of said polyclonal antibody is 77% or less. 前記（ａ）の試料が、以下の（Ａ）～（Ｃ）のいずれか１以上を満たす緩衝液で希釈されることを含む、請求項６に記載の方法：
（Ａ）０．１質量％以上の非イオン性界面活性剤を含有する；
（Ｂ）アルカリ金属イオンの濃度が４００ｍＭ以下である；
（Ｃ）ｐＨ緩衝成分の濃度が２５ｍＭ以上である。 7. The method of claim 6, wherein the sample of (a) is diluted with a buffer that satisfies any one or more of the following (A) to (C):
(A) contains 0.1% by mass or more of a nonionic surfactant;
(B) the concentration of alkali metal ions is 400 mM or less;
(C) The concentration of the pH buffer component is 25 mM or higher. 前記（ａ）の試料を接触させた時点から前記（ｂ）の検出の時点までの時間が２５分～４５分間である、請求項７又は８に記載の方法。 9. The method according to claim 7 or 8, wherein the time from the contacting of the sample (a) to the detection of (b) is 25 to 45 minutes.

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