KR101107330B1 - 인삼 근부병을 억제하는 신규한 스트렙토마이세스 스포로클리바투스 균주 - Google Patents

인삼 근부병을 억제하는 신규한 스트렙토마이세스 스포로클리바투스 균주 Download PDF

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Abstract

본 발명은 식물 병원균에 대하여 길항 작용을 갖는 신규한 스트렙토마이세스 스포로클리바투스 (Streptomyces sporoclivatus) rho-49 균주에 관한 것으로서, 상세하게는 인삼 근부병의 원인균에 대하여 길항작용을 하는 스트렙토마이세스 스포로클리바투스 rho-49 균주, 상기 균주의 세포, 포자, 배양액 또는 이들의 혼합물을 유효성분으로 함유하는 식물 병원균 방제용 미생물 제제, 및 상기 스트렙토마이세스 스포로클리바투스 rho-49의 배양 단계를 포함하는 식물 병원균 방제용 미생물 제제의 제조 방법에 관한 것이다.
스트렙토마이세스 스포로클리바투스, 인삼 근부병, 식물병원균 방제제, 미생물농약

Description

인삼 근부병을 억제하는 신규한 스트렙토마이세스 스포로클리바투스 균주 { NOVEL STREPTOMYSES SPOROCLIVATUS STRAIN ACTIVE AGAINST ROOT ROT OF PANAX GINSENG}
본 발명은 식물 병원균에 대하여 길항 작용을 갖는 신규한 스트렙토마이세스 스포로클리바투스 (Streptomyces sporoclivatus) rho-49 균주에 관한 것으로서, 상세하게는 인삼 근부병의 원인균에 대하여 길항작용을 하는 스트렙토마이세스 스포로클리바투스 rho-49 균주, 상기 균주의 세포, 포자, 배양액 또는 이들의 혼합물을 유효성분으로 함유하는 식물 병원균 방제용 미생물 제제, 및 상기 스트렙토마이세스 스포로클리바투스 rho-49의 배양 단계를 포함하는 식물 병원균 방제용 미생물 제제의 제조 방법에 관한 것이다.
인삼 속에는 7-8 개의 인삼 종이 있지만, 그 중 대표적인 것은 고려인삼으로 현재 동북아 지역을 중심으로 재배 중이다. 특히 고려인삼은 우리나라 고유의 품종으로, 수 천년 전부터 영약 또는 선약으로 동양 의학적으로는 물론 인류의 보건을 위해 오늘날까지 널리 사용되고 있는 한국의 대표적인 생약이다. 인삼은 재배 지역 에 따라 형태적 특성이나 약리 효능이 상이하며, 그 이용 면에서도 상당히 다양하다. 국내 인삼의 경우, 암 예방, 노화 방지, 간장 보호, 피로회복 및 뇌기능을 강화 효과가 알려져 있으며, 최근에는 환경호르몬의 피해를 막아준다는 보고도 있다.
한국은 기후풍토가 인삼의 자생과 재배지로 알맞아 약효가 탁월한 고려인삼을 생산하는 인삼 종주국이다. 이와 같은 인삼의 탁월한 효과 때문에 많은 국가들의 관심이 높아지고, 기존의 인삼 생산국 뿐만 아니라 비생산국도 경쟁적으로 인삼의 연구와 생산을 장려하는 정책을 적극 펼쳐 나가고 있는 추세이다. 인삼을 재배하는 나라는 한국을 비롯하여 중국, 일본, 미국 및 유럽 일부 지역이며, 인삼 소비 국가 역시 과거에는 그 대부분이 유교 문화권으로 한국, 중국, 일본, 대만 및 동남아 등 한정되어 있었으나, 현재 세계 각국으로 인삼 소비층이 확대되고 있다.
전세계의 인삼생산 및 소비시장 규모는 각국의 인삼유통 구조의 특성, 제품형태의 다양성 및 최근자료의 보안조치 등으로 통계자료를 정확하게 수집하기는 어려우나 세계 인삼판매시장의 중심지인 홍콩의 수출입량을 중심으로 각국의 인삼 생산 통계자료를 참고하여 보면 80년대 후반까지 전 세계 인삼생산량의 46% 를 유지하던 한국이 90년대에 39% 내외로 점유율이 감소하여, 세계 평균 생산 증가율에 미치지 못하는 0.5%의 생산증가율을 나타낸 반면, 80년대에 전 세계 생산량의 43% 정도를 점유하고 있던 중국은 90년대에는 50% 이상으로 증가하여 연평균 7.2% 이상의 높은 생산 증가율을 나타내어 인삼 종주국인 한국을 추격하고 있다. 이와 같이 고려인삼은 가격면에서 국가 경쟁력이 약화되고 있는 실정이며, 국가 경쟁력을 강화 하기 위해서는 원료삼인 수삼품질 향상을 위한 재배기술 개발 연구가 절실히 필요한 실정이다. 특히 최근 인삼 재배시 가장 시급한 문제점이 적정 예정지의 절대 부족과 산지토양 조건 악화로 인한 인삼 근부병과 같은 식물병의 발병율이 높아짐에 따른 과도한 농약의 사용으로 인한 인삼 내 농약 잔류량 때문에 수출에 제한을 받기에 무농약 원료삼의 안전한 다수확 생산방법에 관한 집중연구가 시급히 요구되고 있다.
그 동안 인삼 생산기반의 조기구축을 비롯하여 인삼의 종자개량, 관리와 농업구조 개선, 재배방법의 개선과 기계화 촉진 등 과학적인 인삼 재배기술의 개발에 많은 노력들이 있어왔다. 특히 인삼은 다른 작물과 달리 해 가림 구조하에서 재배하므로, 재식 위치, 강우량, 온도, 바람의 강도, 토양의 비옥도, 수분함량, 통기성 및 산도 등의 환경적 요인에 따라 품질과 생산량의 변이가 커서 주요 농작물에 비하여 안전성이 뒤떨어져 있는 실정이다. 특히, 인삼 재배에서 가장 큰 문제점은 연작 장해로 인한 예정지의 선정이다. 예정지란 인삼을 심지 않은 땅을 의미하는 것으로 예전에는 30년 이상이었으나, 최근 한국인삼연초연구소 설립 이후 7년 이상이라는 주장이 있지만 아직까지도 정확하지는 않다. 이와 같이 연작 기한을 두는 이유는 근부병(뿌리썩음병)에 의한 피해 및 생육 불량이기 때문이다. 인삼재배에 있어서 중요시 여겨지는 인삼뿌리썩음 증상은 연작지뿐만 아니라 초작지에서도 관찰이 되고 있으며 근부증상은 묘삼 식부 후 고년근으로 재배되면서 출아 및 잔존율을 떨어뜨리게 하는 원인중의 하나일 것으로 추정된다. 실제로 농가에서 식부한 묘삼 이 5년 후 수확시에는 약 50% 이하의 잔존율로 나타나는 것이 보통이다. 그 이유는 초작재배중 인삼뿌리가 썩는 부위에서 근부병원균들이 서식하고 있기 때문이다.
이와 같이 초작지에서 근부병균에 의해 인삼이 피해를 받은 후 연작으로 인삼을 재배할 때 토양내에서 잔존 근부병원균의 후막포자 등이 예정지 관리시 7-10회 기경 및 로타리 작업으로 토양에 균일하게 분포되면 더욱 인삼에 피해를 일으킬 것으로 판단된다. 실제로 뿌리썩음의 원인으로는 실린드로카폰 데스트럭턴스(Cylindrocarpon destructans), 푸사리움 소라니(Fusarium solani), 피시움 속(Pythium sp.), 파이토프토라 캑토룸(Phytophthora cactorum) 및 어위니아 카로토보라(Erwinia carotovora)등에 의한 병해가 단독으로 또는 복합적으로 크게 관여한다고 보고되어 있다(인삼재배, 표준영농교본 p 103, 농촌진흥청, 2000). 뿐만 아니라, 뿌리썩음병은 유묘의 모잘록병을 일으키는 라이족토니아 소라니(Rhizoctonia solani), 점무늬병의 알터나리아 파낙스(Alternaria panax) 등에 의한 피해가 문제시되고 있다.
이와 같은 병해의 방제법으로는 토양내 병원균의 밀도를 감소시키거나 발병을 억제시키기 위한 유기물 사용 등을 통한 예정지 관리와 토양 훈증제를 이용한 화학적방제가 시도중이며, 답전 윤환의 논삼 재배법 등에 의한 경종적 방제가 실시되고 있다. 그러나 이상의 방제법으로는 뚜렷한 효과를 거두기 어렵고 인삼뿌리썩음병 등과 같은 토양 전염성 병원균들은 토양중에 후막포자를 형성하여 열악한 조건에서도 장기간 생존할 수 있기에 완벽한 방제가 매우 어렵다. 또한, 토양 훈증제의 사용은 유해 미생물 및 유용 미생물까지 원천적으로 제거하여 토양 생태계의 파 괴에 대한 위험성도 있다. 또한, 현재까지 인삼뿌리썩음병을 방제하기 위한 방안으로 길항미생물을 이용한 생물학적 방제법과 특히 연작지의 경우 사이론, 밧사미드 등 토양훈증제를 이용한 화학적 방제법 및 답전 윤환의 논삼재배법등 경종적 방법이 사용되고 있으나, 아직까지도 그 방법이 체계화되어 있지 않은 실정이다. 무엇보다도 인삼 토양병에 대한 지금까지의 생물학적 방제연구는 길항 미생물 선별과 포장처리 효과검정 등에 대해 주로 수행하여 왔으나, 인삼 뿌리썩음병에 대한 방제효과는 일관성을 보이지 않았으며, 이는 길항 미생물을 이용한 생물학적 방제법의 한계로 지적되고 있다.
이에, 본 발명자들은 방제가 어려운 인삼 토양병의 생물학적 방제를 위해 병원균과 인삼의 재배특성을 고려하여 토양의 근본적 구조를 개선하고, 지속적인 효과를 나타내는 친환경적 인삼 근부병의 방제대책으로서 미생물학적 방제에 관한 연구를 지속적으로 수행하여 예의 노력한 결과, 주요 인삼 근부병에 대하여 신규한 길항 미생물을 선별하였고, 상기 미생물이 인삼을 비롯하여 식물 병원균에 대하여 우수한 길항 효과를 확인하고 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 식물 병원균에 대하여 길항 작용을 갖는 스트렙토마이세스 스포로클리바투스 rho-49 (Streptomyces sporoclivatus rho-49) KCTC 11525BP인 균주를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 스트렙토마이세스 스포로클리바투스 rho-49 의 세포, 포자, 배양액 또는 이들의 혼합물을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 식물 병원균 방제용 미생물 제제를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 자연에서 분리된 식물 병원균에 길항능력을 지니는 스트렙토마이세스 스포로클리바투스 rho-49 균주를 배지에서 성장 발육시키는 단계를 포함하는, 식물 병원균 방제용 미생물 제제의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 식물 병원균에 대하여 길항 작용을 갖는 스트렙토마이세스 속 (Streptomyces sp.) 균주에 관한 것으로, 보다 상세하게는 식물 병원균 특히, 인삼 근부종을 일으키는 식물 병원균에 대하여 길항작용을 갖는 신규한 스트렙토마이세스 스포로클리바투스 rho-49 (Streptomyces sporoclivatus rho-49) 균주에 관한 것이다.
본 발명에서의 용어, "스트렙토마이세스 (Streptomyces sp.)"란, 토양 방선균의 대표적인 속(屬)으로 항생물질을 생산하며, 방선균 스트렙토미세스과(科)에 속하는 균류(菌類)이며 기균사(氣菌絲)에 연쇄상의 분생자를 형성하는 특징을 가진 한 무리의 총칭한다. 바람직하게 본 발명에 따른 신규 스트렙토마이세스 스포로클리바투스는 부속이 양호한 토양에서 분리하고, 피토프소라 캑토룸 및 콜렉트리쿰 아쿠타툼에 공통적으로 강한 항균력을 가지는 미생물을 선발하여 분리ㆍ동정한 결과, 스트렙토마이세스 스포로클리바투스(Streptomyces sporoclivatus)로 확인되었다. 본 발명자는 이를 스트렙토마이세스 스포로클리바투스 rho-49로 명명하고, 한국생명공학연구원 유전자은행에 2009년 07월 06일자로 기탁하였으며, 수탁번호 KCTC 11525BP를 부여받았다.
본 발명의 균주는 식물 병원균에 의해 유발되는 다양한 식물병에 제한없이 사용될 수 있으며, 바람직하게는 인삼 근부병에 사용될 수 있다.
본 발명에서의 용어, "인삼 근부병"이란, 다른 말로 뿌리 썩음병을 지칭하는 것으로 여러 종류의 원인이 단독 혹은 복합적으로 관여하므로 증상이 매우 다양하고, 부패가 진행된 상태에 따라 흑변 또는 갈변을 나타낸다. 초기에는 전형적인 균에 의한 흑색 또는 갈색 반점이 형성되나 병이 진전됨에 따라 부생성 선충 및 타 균에 의해 물렁물렁하게 되기도 하는 등 여러가지 증상을 나타낸다.
인삼 근부병을 유발하는 병원균의 예로는, 실린드로카폰 데스트럭탄 스(Cylindrocarpon destructans), 리족토니아 솔라니(Rhizoctonia solani), 보트리티스 시네리아(Botrytis cinerea), 푸라리움 솔라니(Fusarium solani), 피토프소라 캑토룸(Phytophthora cactorum) 및 피시움 울티멈(Pythium ultimum) 등이 있으며, 이에 제한되지 않는다. 뿐만 아니라, 이들 병원균 하나 하나에 의해 단독으로 발병되기 보다는 상호관련하여 발현되는 복합 감염으로 발생하는 경우가 대부분이다.
또한, 본 발명의 균주를 상기 병원균에 의해 유발되는 다양한 식물병에도 효과가 있다. 상기 병원균에 의해 유발되는 질환의 예로, 잿빛곰팡이병의 원인이 되는 보트리티스 시네리아, 뿌리썩음병의 원인이 되는 푸사리움 솔라니, 입고병과 모잘록병의 원인균인 피시움속 및 고추역병 병균인 파이토프소라 캑토룸 등이 있으며, 상기 식물 병원균에 의하여 유발되는 병의 종류는 이에 제한되지 않는다.
바람직하게 본 발명의 균주는 인삼 근부병을 유발하는 다양한 종류의 식물 병원균인 상기 병원균들에 대하여 강한 길항작용을 갖으며, 더욱 바람직하게는 실린드로카폰 데스트럭탄스에 대하여 강한 길항작용을 갖는다(도 3 및 도 10).
바람직한 실시예로부터, 본 발명의 스트렙토마이세스 스포로클리바투스 rho-49 균주는 식물 병원균에 대하여 길항작용을 갖으며, 이를 확인하기 위하여 다양한 식물 병원균에 대한 상기 균주의 항균 활성을 분석한 결과, 인삼 근부병을 야기하는 병원균인 실린드로카폰 데스트럭탄스, 복합적 발병 원인균인 푸사리움 소라니, 피시움 속 및 파이토프토라 캑토룸등에 대하여 강한 항균력이 있음이 확인되었다(도 3 내지 8). 특히, 본 발명의 스트렙토마이세스 스포로클리바투스 rho-49 균주가 인삼 근부병의 주원인균인 실린드로카폰 데스트럭탄스에 대하여 매우 우수한 길항균임을 확인하였다(도 10). 이외에도 또한, 스트렙토마이세스 스포로클리바투스 rho-49는 점무늬병을 야기하는 알테나리아 파낙스(Altenarils panax)에 대한 항균 활성을 확인하였다(도 7).
이와 같이 본 발명의 균주가 인삼 근부병을 포함하는 다양한 식물병을 일으키는 병원균에 대하여 강한 길항작용을 나타냄으로, 상기 균주를 환경친화적인 무공해 생물농약으로 사용할 경우, 인삼 근부병을 비롯하여 다양한 식물병을 예방할 수 있고, 인위적인 약품에 의한 생태계 파괴 및 독성 문제 해소에 유용하다.
다른 하나의 양태로서, 본 발명은 스트렙토마이세스 스포로클리바투스 rho-
44 균주를 사용한 식물 병원균 방제용 미생물 제제에 관한 것으로서, 바람직하게는 본 발명의 균주 세포, 포자, 배양액 또는 이들의 혼합물을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 식물 병원균 방제용 미생물 제제에 관한 것이다.
본 발명의 미생물 제제는 식물 병원균에 대하여 길항작용을 갖는 스트렙토마이세스 스포로클리바투스 rho-49 균주 세포, 포자, 배양액 또는 이들의 혼합물을 유효성분으로 함유하는 식물병 방제제 등의 생물농약을 포함할 수 있다. 본 발명의 미생물 제제에 포함되는 상기 배양액은 상기 균체 배양액에서 균체를 제거한 상청액으로, 원심분리 또는 여과를 통해 얻을 수 있으며, 액상 또는 건조 후 고체상으로 식물 병원균 방제용 미생물 제제에 포함될 수 있다. 이러한 미생물 제제는 스트렙토마이세스 스포로클리바투스 rho-49 균주, 이의 배양액, 이의 배양액 추출물, 배양 여액 외에 농약제제로 사용가능한 담체를 함께 사용하여 제조될 수 있다. 담체로는 통상적으로 사용되는 농약제형으로 허용 가능한 담체면 모두 사용할 수 있으나, 본 발명의 항진균성 화합물이 농약제로 사용되기 위해서 약제학적 분야에서 공지의 방법에 의하여 제조될 수 있으며, 그 자체 또는 약학적으로 허용되는 담체 (carrier), 부형제 (forming agent), 희석제 (diluent) 등과 혼합하여 다양한 제형으로 제조되어 사용될 수 있다. 또한, 상기 제제는 항진균 활성 세균을 식물잎에 잘 부착되거나 토양에서 잘 분해되게 하는 코팅 응집물질을 사용할 수 있다.
바람직한 일 실시예로부터, 본 발명의 미생물 제제는 인삼 근부병을 유발하는 식물 병원균에 대하여 길항작용 및 항균활성이 매우 높음을 확인하였으며(실시예 2 및 4), 상기 본 발명의 스트렙토마이세스 스포로클리바투스 rho-49 균주, 포자, 배양액 또는 이들의 혼합물를 포함한 미생물 제제는 인삼 근부병을 억제하는 데 유용하게 사용될 수 있다.
바람직하게 본 발명에 따른 유효성분은 전체 미생물제제 조성물에 대하여 상기 균체 배양액 추출물을 0.001 내지 90%로 사용하는 것이며, 더욱 바람직하게는 본 발명에 따른 균주 배양액 추출물을 100 내지 500배 희석하여 분제로 제제화시킨다. 상기와 같이 제조된 식물 병원균 방제용 미생물 제제는 인삼 근부병, 잿빛곰팡이병, 뿌리썩음병, 입고병, 모잘록병, 고추역병 및 상기 식물병을 유발하는 병원균 등을 방제하기 위하여, 작물을 정식한 후 식물체 지상부에 경엽처리 방법으로 처리하는 것이 바람직하다. 이러한 미생물제제는 인삼 근부병과 같은 식물병 방제제, 종자코팅제, 미생물영양제, 토양개량제 등의 전반적인 농약제로 사용될 수 있다.
또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 자연에서 분리된 식물 병원균에 대하여 길항력을 갖는 스트렙토마이세스 스포로클리바투스 rho-49 균주를 배지에서 성장 발육시키는 단계를 포함하는, 식물 병원균 방제용 미생물 제제의 제조방법에 관한 것이다.
바람직하게 본 발명은 자연에서 분리된 식물 병원균, 즉 인삼 근부병 유발 병원균에 대하여 길항력을 갖는 스트렙토마이세스 스포로클리바투스 rho-49 균주를 배지에서 성장 발육시키는 단계를 포함하는, 식물 병원균 방제용 미생물 제제의 제조방법에 관한 것이다. 보다 상세하게 본 발명의 미생물 제제의 제조방법은 실린드로카폰 데스트럭탄스, 리족토니아 솔라니, 보트리티스 시네리아, 푸라리움 솔라니, 피토프소라 캑토룸 및 피시움 울티멈 등과 같은 식물 병원균에 대하여 길항력이 있는 미생물 스트렙토마이세스 스포로클리바투스 균주를 토양으로부터 분리하는 단계; 분리된 길항미생물 스트렙토마이세스 스포로클리바투스 균주의 동정단계; 상기 분리한 스트렙토마이세스 스포로클리바투스 균주의 포자 현탁액을 한천 고체 배지에 처리한 후, 곰팡이 병균을 접종하고 항균 활성 정도를 측정하여 스트렙토마이세스 스포로클리바투스 균주의 길항력을 검정하는 단계; 및 분리된 길항미생물 스트렙토마이세스 스포로클리바투스 균주의 대량 생산 단계를 포함한다(실시예 1).
본 발명의 제조방법에 의한 식물 병원균 방제용 미생물 제제는 인삼 근부병 유발 병원균으로서, 그 예로 실린드로카폰 데스트럭탄스(Cylindrocarpon destructans), 리족토니아 솔라니(Rhizoctonia solani), 보트리티스 시네리아(Botrytis cinerea), 푸라리움 솔라니(Fusarium solani), 피토프소라 캑토룸(Phytophthora cactorum), 피시움 울티멈(Pythium ultimum)등이 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 균주 스트렙토마이세스 스포로클리바투스 rho-49는 인삼 근부병의 원인이 되는 실린드로카폰 데스트럭탄스 및 모잘록병의 원인이 되는 피시움과 뿌리썩음병의 원인이 되는 푸사리움 속에 대해서 우수한 억제 효과가 있을 뿐만 아니라 고추역병의 원인균인 파이토프소라 캑토룸에도 활성을 보임에 따라 환경친화적인 무공해 생물농약으로 사용할 경우, 생태계 파괴 및 인축 독성 문제를 해소할 수 있으므로 농약산업 및 환경 산업상 매우 유용하다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 균주의 분리 및 동정
1-1: 균주 분리
본 실험예에서는 인삼 근부병을 야기하는 실린드로카폰 데스트럭탄스(Cylindrocarbon destructans)를 시험균주로 하여 이에 대하여 항균력을 갖는 미생물을 분리하기 위하여, 전국 각지에서 토양 시료를 수거하였다. 시료 채취는 표토층의 15 센티미터 전후의 깊이를 선정하여 채취하였으며, 잡초, 낙엽 등의 이물질을 제거하였다. 이를 200 ㎖ 유리병에 담아 밀봉한 후, 0 내지 4℃의 상태로 실험실에 운반하였다. 채취한 시료 1 g을 멸균수 10 ㎖과 혼합하여 28 ℃에서 30분 간 진탕한 후, 토양 희석 한천평판법으로 104-6 배까지 희석하였다. 그 다음 상기 희석액 0.1 ㎖를 YM 배지에 분주하여 배지 전면에 골고루 편 다음, 30 ℃ 배양기에서 2 내지 4 일간 배양 후, 생성되는 콜로니를 순수 분리하여 YM 고체배지에 옮겨 4 ℃에서 보관하면서 사용하였다. 또한, 추가로 시험균주로서 각각의 진균은 피토프소라 캑토룸 외 8종을 사용하여 항균 스펙트럼을 분석하였다.
1-2: 균주 동정
상기에서 선별한 균주에 대한 동정을 하기와 같이 실시하였다.
가. 형태적 특성
선별한 균주는 YM 한천배지에 접종한 후 30 ℃에서 3 일간 배양하여 얻은 단일 콜로니를 표 1과 같이 다양한 배지에 배양하면서 나타나는 배양학적 및 생리학 적 특성을 관찰하여 하기 표 1에 표기하였다.
스트렙토마이세스 스포로클리바투스의 배양학적 특성 분석.
분석 항목 특성
배지 종류에 따른 포자의 색깔/균사의 색깔
ISP 2 배지 흰색/연노란
ISP 3 배지 회색/연노란
ISP 4 배지 회색/회갈색
ISP 5 배지 회색/연노란
포자 사슬 형태(spore chain morphology) 지선형형
포자수 / 포자사슬 15~25개
색소(pigment) 생성 여부
ISP 2 배지 유
ISP 3 배지 유
ISP 4 배지 무
ISP 5 배지 유
탄소 사용 여부
아라비노스(arabonose) -
프락토스(fructose) +
글루코스(glucose) +
만니톨(mannitol) +
라피노스(raffinose) -
수크로스(sucrose) +
자일로스(xylose) +
하기 성분 첨가 시 성장 여부
5 %(w/v) 염화나트륨(NaCl) +
100㎍/㎖ 탈리움 아세테이트(Thallium acetate) -
1㎍/㎖ 크리스탈 바이오렛(crystal violet) +
20㎍/㎖ 스트렙토마이신(streptomycin) -
10㎍/㎖ 페니실린(penicillin) -
성장 가능한 최저 pH 3.5
+ : 가능, -: 불가능
나. 16S rDNA 염기서열 분석
선별한 균주의 계통분류학적인 위치를 확인하기 위하여 전체 16S rDNA 염기서열의 29% 이상의 염기서열에 해당되는 446bp의 염기서열을 분석하였다. 선별한 균주로부터 16S rDNA 분절 5'-AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG-3'을 프라이머(primer) 세트로 PCR하여 증폭시킨 후, 증폭산물을 정제하여 TOPO TA 클로닝 키트(Invitrogen)에 삽입(ligation)하고, 이를 대장균에 형질전환하였다. 형질전환된 대장균으로부터 플라스미드(plasmid)를 추출한 후 자동염기서열 분석장치(Applied Biosystems model 373A automatic sequencer)와 키트(BigDye Terminator Cycle Sequencing kit, Perkin-Elmer Applied Biosystems)를 이용하여 염기서열을 분석하였다. 선별한 균주의 16S rDNA는 유전자은행의 블라스트 프로그램를 이용하여 상동성을 분석하였다(도 1). 그 결과, 선별된 균주는 스트렙토마이세스 스포로클리바투스 NBRC 13847과 100 %의 상동성을 나타냄으로써, 본 발명의 균주는 스트렙토미세스 스포로클리바투스 균주인 것으로 최종 확인되었다. 따라서 이를 2009년 7월 6일자로 한국생명공학연구원 유전자은행에 특허균주로 기탁하고 수탁번호 KCTC 11525BP를 부여 받았다.
실시예 2: 각종 식물병원균에 대한 길항력 검정
인삼 근부병을 야기하는 다양한 병원균인 Cylindrocarpon destructans KACC 41077 Streptomyces scabies(감자 더덩이병), Pythium utimum KACC 40705(근부병), Colletotrichum acutatum KACC 40042(탄저병), Botrytis cinerea KACC 40573(잿빛곰팡이), (근부병), Phytophthora cactorum KACC 40166(근부병, 역병), Rhizoctonia solani AG-2-2(IV) KACC 40123 (모잘록병) 등 8 종의 시험균을 한국농업미생물자원센터에서 분양받아 스트렙토마이세스 스포로클리바투스의 길항력을 검정하여 항균 범위를 조사하였다. 감자한천배지(PDA, Difco)를 살균한 후, 50 ℃의 배지에 각 병원균의 균사와 포자가 함유된 배양액 200 ㎕를 혼합 평판하고 배지가 완전히 굳은 다음 길항미생물을 배양한 배양액 10 ㎕을 페이퍼디스크(직경 8 mm)에 묻힌 후 병원균이 혼합된 페트리디쉬에 올려놓고 각종 병원균의 생육이 잘되는 28 ℃에서 3 ∼ 4일 배양했다. 길항미생물이 각종 병원균에 미치는 영향을 저지원의 직경으로 조사하고, 이를 다음 표 2에 나타냈다. 표 2에서 볼 수 있는 바와 같이, 본 발명의 길항미생물 스트렙토마이세스 스포로클리바투스 균주와 식물병원균과의 길항효과에 대한 검정결과, 본 발명의 상기 균주는 인삼 근부병의 주요 발병원인균인 실린드로카폰 데스트럭탄스 및 복합적 발병 원인균인 푸사리움 소라니, 피시움, 파이토프토라 캑토룸등에 대한 강한 항균력이 있음이 확인되었다 또한 탄저병의 원인균인 콜레토트리쿰 아쿠타툼, 점무늬병의 원인이 되는 알테나리아 파낙스에 대하여서도 억제효과를 나타내는 것을 확인하였다.
병원성 곰팡이에 대한 스트렙토마이세스 스포로클리바투스 항균 범위
검정시험균(곰팡이) 활성정도
스트렙토마이세스 스카비(Streptomyces scabies) -
피시움 울티멈(Pythium utimum) +++++
콜레토트리쿰 아쿠타툼(Colletotrichum acutatum) ++++
보트리티스 시네리아(Botrytis cinerea) +
실린드로카폰 데스트럭탄스(Cylindrocarpon destructans) +++++
알테나리아 파낙스(Alternaria panax) ++++
파이토프소라 캑토룸(Phytophthora cactorum) ++++
라이족토니아 솔라니(Rhizoctonia solani ) ++++
++++ : 저지원(clear zone)의 크기 >40 mm, +++ : 30 ~ 40 mm,
++ : 20 ~ 30 mm, + : 10 ~ 20 mm, - : 10 mm 이하
대부분의 시험균주에서 우수한 길항성을 나타내었으며, 이러한 다양한 항균활성은 하나의 제품으로 다양한 작물에 응용 가능성을 제시한다고 할 수 있다. 또한, 스트렙토마이세스 스포로클리바투스의 활성을 재검증하기 위하여 항균활성을 나타내는 각각의 시험균을 대상으로 매우 우수한 항균력을 확인하였다(도 3 내지 도 8).
실시예 3: 스트렙토마이세스 스포로클리바투스 대량 배양
길항 미생물 스트렙토마이세스 스포로클리바투스 균주는 2.5 L 발효기를 사용하여 배양되었으며, 이때 사용한 생산배지조성은 전분 5 g, 포도당 20 g, 대두분 25 g, 육즙엑기스 1 g, 효모추출물 4g, 염화나트륨 2 g, 인산칼륨 0.25 g, 탄산칼슘 2 g을 증류수 1 L에 녹인 후 pH를 7.2로 조절한 통상적인 액체배지를 제조하여 사용하였다. 종배양은 500 ml 삼각플라스크에 효모엑기스 5 g/L, 육즙엑기스 5 g/L, 포도당 10 g/L가 첨가된 100 ml 액체배지를 이용하여 배양하였다. 배양조건은 28 ℃ , 150 rpm으로 120 시간 진탕 배양한 후 스트렙토마이세스 스포로클리바투스가 포함된 종배양액 5 %(v/v)를 1.5 L 생산배지를 함유한 2.5 L 발효기에 접종하고 28 ℃에서 150 rpm, 1 vvm의 조건으로 120 시간 동안 배양하였다(도 9).
실시예 4: 스트렙토마이세스 스포로클리바투스의 길항 효과
실린드로카폰 데스트럭탄스와 스트렙토마이세스 스포로클리바투스를 100:1 ~ 1:10의 비율로 혼합한 다음 이를 각각 토양에 살포한 후 실린드로카폰 데스트럭탄스에 대한 스트렙토마이세스 스포로클리바투스의 생육 억제 정도를 분석하였다. (도 10) 도 10에서 보는 바와 같이 실린드로카폰 데스트럭탄스와 스트렙토마이세스 스포로클리바투스의 비율이 50:1에서도 우수한 억제 효과를 나타내으로써 상기 스트렙토마이세스 스포로클리바투스는 인삼 근부병의 주요 원인균인 실린드로카폰 데스트럭탄스에 대해 매우 우수한 길항균임을 확인하였다.
도 1은 본 발명의 신균주 스트렙토마이세스 스포로클리바투스의 16S rDNA 염기서열 중 450bp를 분석한 도이다.
도 2는 스트렙토마이세스 스포로클리바투스를 20,000배로 확대하여 촬영한 전자현미경 사진이다.
도 3은 실린드로카폰 데스트럭탄스(Cylidrocabon destractans) 에 대한 본 발명의 신균주 스트렙토마이세스 스포로클리바투스의 항균활성을 나타낸 도이다.
도 4는 피시움 울티멈(Pythium ultimum)에 대한 본 발명의 신균주 스트렙토마이세스 스포로클리바투스의 항균활성을 나타낸 도이다.
도 5는 보트리티스 시네리아(Botritis cinerea)에 대한 본 발명의 신균주 스트렙토마이세스 스포로클리바투스의 항균활성을 나타낸 도이다.
도 6은 푸사리움 솔라니(Fusarium solani)에 대한 본 발명의 신균주 스트렙토마이세스 스포로클리바투스의 항균활성을 나타낸 도이다.
도 7은 알테나리아 파낙스(Altenarils panax)에 대한 본 발명의 신균주 스트 렙토마이세스 스포로클리바투스의 항균활성을 나타낸 도이다.
도 8은 라이족토니아 솔라니(Rhizoctonia solani)에 대한 본 발명의 신균주 스트렙토마이세스 스포로클리바투스의 항균활성을 나타낸 도이다.
도 9는 배양시간에 따른 신균주 스트렙토마이세스 스포로클리바투스의 성장곡선을 나타낸 그래프이다.
도 10은 실린드로카폰 데스트럭탄스에 대한 스트렙토마이세스 스포로클리바투스 길항효과를 나타낸 그래프이다.

Claims (9)

  1. 식물 병원균에 대하여 길항 작용을 갖는 스트렙토마이세스 스포로클리바투스 rho-49 (Streptomyces sporoclivatus rho-49) KCTC 11525BP인 균주.
  2. 제1항에 있어서, 상기 식물 병원균은 실린드로카폰 데스트럭탄스(Cylindrocarpon destructans), 리족토니아 솔라니(Rhizoctonia solani), 보트리티스 시네리아(Botrytis cinerea), 푸라리움 솔라니(Fusarium solani), 피토프소라 캑토룸(Phytophthora cactorum) 및 피시움 울티멈(Pythium ultimum)으로 구성된 군으로부터 선택된 것인 균주.
  3. 제2항에 있어서, 상기 보트리티스 시네리아는 인삼 근부병 및 잿빛 곰팡이병의 발병 원인균인 것을 특징으로 하는 균주.
  4. 제2항에 있어서, 상기 푸라리움 솔라니는 인삼 근부병 및 뿌리 썩음병의 발병 원인균인 것을 특징으로 하는 균주.
  5. 제2항에 있어서, 상기 피시움 울티멈은 인삼 근부병, 입고병 및 모잘록병의 발병 원인균인 것을 특징으로 하는 균주.
  6. 제2항에 있어서, 상기 파이토프소라 캑토룸은 인삼 근부병 및 고추역병의 발병 원인균인 것을 특징으로 하는 균주.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 스트렙토마이세스 스포로클리바투스 rho-49 균주의 세포, 포자, 배양액 또는 이들의 혼합물을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 식물 병원균 방제용 미생물 제제.
  8. 스트렙토마이세스 스포로클리바투스 rho-49 (Streptomyces sporoclivatus rho-49) KCTC 11525BP인 균주를 배지에서 성장 발육시키는 단계를 포함하는, 제7항의 식물 병원균 방제용 미생물 제제의 제조방법.
  9. 제8항에 있어서, 상기 식물 병원균은 실린드로카폰 데스트럭탄 스(Cylindrocarpon destructans), 리족토니아 솔라니(Rhizoctonia solani), 보트리티스 시네리아(Botrytis cinerea), 푸라리움 솔라니(Fusarium solani), 피토프소라 캑토룸(Phytophthora cactorum) 및 피시움 울티멈(Pythium ultimum)으로 구성된 군으로부터 선택된 것인 식물 병원균 방제용 미생물 제제의 제조방법.
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