CN104862243B

CN104862243B - 一种对黄瓜疫霉菌有抑制作用的放线菌及其筛选方法

Info

Publication number: CN104862243B
Application number: CN201510137283.9A
Authority: CN
Inventors: 易图永; 孙莉; 刘双清; 王运生
Original assignee: Hunan Agricultural University
Current assignee: Hunan Agricultural University
Priority date: 2015-03-26
Filing date: 2015-03-26
Publication date: 2018-07-06
Anticipated expiration: 2035-03-26
Also published as: CN104862243A

Abstract

本发明公开了一种对黄瓜疫霉菌有抑制作用的放线菌及其筛选方法，其是保藏号为CGMCC No.10042的弗吉尼亚链霉菌（Streptomyces virginiae）X54菌株，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。该放线菌对人畜无致病性，是一种能安全、无毒、有效的防治黄瓜疫霉菌（Phytophthora melonis）的拮抗放线菌。同时，该菌对辣椒炭疽病菌、烟草黑胫病菌、水稻纹枯病菌、小麦赤霉病菌、柑橘炭疽病菌、黄瓜枯萎病菌等也有一定的抑制作用，尤其该拮抗菌株对防治黄瓜疫病具有重大的开发潜力。

Description

一种对黄瓜疫霉菌有抑制作用的放线菌及其筛选方法

技术领域

本发明涉及一种对黄瓜疫霉菌有抑制作用的新菌株及其筛选方法。

背景技术

黄瓜疫病(Cucumber phytophthora blight)主要是由黄瓜疫霉菌(Phytophthora melonis)引起的黄瓜上的主要病害，常会造成大片植株的死亡、烂瓜，在我国分布范围广，黄瓜从幼苗期到成株期均有可能染病。幼苗初期染病，始于嫩尖出现暗绿色或褐色、水浸状的腐烂，逐渐萎焉干枯成秃尖。成株时期染病，主要危害茎基部和茎节部以及果实，初为暗绿色、水浸状斑点，逐渐***缢缩，染病部位以上的叶片逐渐枯萎死亡，黄瓜条表面在潮湿环境中生成白色霉层，并伴有恶臭。严重影响了黄瓜的生长和果实的产量及品质。

黄瓜疫病是一种土传性病害，病原菌以菌丝体、卵孢子或厚垣孢子随病残体在土壤或肥料中越冬。翌年，在种子、风雨、灌溉和农具等适合传播病害的媒介下，在适宜的条件下长出孢子囊。影响该病发生的关键因素是湿度过高，一般在90%以上。地洼、重茬田、排水不良、施用带有病残物的肥料的地块，均是发病严重的地方。其次为温度，病菌在5—37℃均能生长发育，在25—30℃为最佳。因此，连续的阴雨天、降雨量大，都会引起病害的严重发生。

黄瓜疫病病原菌为黄瓜疫霉菌（Phytophthora melonis）属鞭毛菌亚门，卵菌纲，疫霉属。病原菌菌丝无色、无隔膜、多分枝，易产生节状或肿瘤状突起，多个聚集在一起容易形成葡萄球状或束状；孢囊梗细长，顶部长有孢子囊；孢子囊无色，呈柠檬形或卵形，孢子囊萌发形成许多游动孢子；游动孢子无色，单胞，呈卵形或球形，具有两根鞭毛，其静止后长出芽管；孢子囊也可直接萌发长出芽管。菌丝间可产生厚垣孢子，球形，淡黄色。卵孢子球形，淡黄色，表面平滑。

黄瓜疫病的防治方法主要有选用耐病品种，加强栽培管理，进行生态防治等都能有效推迟、缓解病害的发生，尤其是化学防治，更是主要的防治措施。但目前化学防治效果不佳且存在生态安全问题。因此，筛选、利用有益微生物及其代谢产物来防治黄瓜疫病是实施绿色植保的具体措施。

发明内容

针对上述问题，本发明人从湖南省农科院采集土壤样品，利用高氏一号培养基通过稀释平板法获得放线菌的单菌落，再采用平板对峙法筛选对黄瓜疫霉菌有抑制作用的放线菌，该菌对人畜无致病性，能安全地用于黄瓜疫病的生物防治。同时，该菌对辣椒炭疽病菌、烟草黑胫病菌、水稻纹枯病菌、小麦赤霉病菌、柑橘炭疽病菌、黄瓜枯萎病菌等也有一定的抑制作用。

本发明提供的技术方案是：一种对黄瓜疫霉菌有抑制作用的放线菌，其是保藏号为CGMCC No. 10042的弗吉尼亚链霉菌X54，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。

该放线菌（弗吉尼亚链霉菌，拉丁名：Streptomycesvirginiae）X54已于2014年 11月 21 日为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC所保藏（保藏地址是：北京市朝阳区北辰西路1号院3号），其保藏号为CGMCC No. 10042，经检测存活。

同时，本发明还提供所述对黄瓜疫霉菌有抑制作用的放线菌在防治黄瓜疫霉菌（Phytophthora melonis）、辣椒炭疽病菌、烟草黑胫病菌、水稻纹枯病菌、小麦赤霉病菌、柑橘炭疽病菌、黄瓜枯萎病菌所致植物病害中的应用。

所述的应用，是利用所述放线菌的发酵液、发酵液提取物进行应用。

所述的应用，所述的植物病害是黄瓜疫病。

本发明还提供一种农用杀菌剂，其包含所述放线菌，优选的是其包含所述菌株的发酵液，或其发酵液提取物。

本发明具有以下有益效果：

本发明经鉴定为弗吉尼亚链霉菌(Streptomyces virginiae)，该菌对人畜无致病性，是一种能安全、无毒、有效的防治黄瓜疫霉菌（Phytophthora melonis）的拮抗放线菌。同时，该菌对辣椒炭疽病菌、烟草黑胫病菌、水稻纹枯病菌、小麦赤霉病菌、柑橘炭疽病菌、黄瓜枯萎病菌等也有一定的抑制作用，抑菌带宽分别为7.2mm、9.2mm、4.0mm、7.7mm、7.0mm、2.0mm。应用实施例表明，X54发酵液稀释50倍后，第二次施药前、末次施药后7天对黄瓜疫病的防效与于对照药剂25%嘧菌酯悬浮剂100克/公顷的防效相当。目前国内鲜有对黄瓜疫霉菌拮抗菌的报道，尤其是没有报道弗吉尼亚链霉菌对黄瓜疫霉菌的抑制作用。因此，该拮抗菌株对防治黄瓜疫病具有很好应用价值和重大的开发潜力。

附图说明

图1为对峙筛选抑制黄瓜疫霉菌的放线菌。

图2为放线菌的培养性状。

图3为放线菌X54的PCR图。

图4为放线菌X54的16S rDNA构建***发育树。

具体实施方式

下面提供实施例以进一步说明本发明。

实施例一菌株的筛选和鉴定

本发明对黄瓜疫霉菌有抑制作用的放线菌的筛选方法如下：

1、土壤样品的采集

从湖南省农科院附近随机采集土样5份。去除表面土壤，采集5-20cm深处的土样约300g，分装标记后带回实验室。

2、放线菌的分离

采用土壤稀释法分离，称取10g土壤倒入装有玻璃珠的90ml无菌水三角瓶中，振荡10min后为10^-1的稀释液，并将此以十倍稀释的方式，稀释成10^-4，10^-5，10^-6的稀释液。吸取10^-4和10^-5稀释液100ul加入到高氏一号培养基（可溶性淀粉20克、NaCl 0.5克、KNO₃ 1克、MgSO₄•7H₂O 0.5克、琼脂 20克、K₂HPO₄ 0.5克、FeSO₄•7H₂O 0.01克、蒸馏水1000ml，pH 7.2），每个梯度3次重复，涂布均匀，倒置于28℃培养箱中培养。

3、拮抗放线菌的筛选

采用平板对峙法，将黄瓜疫霉菌从PDA培养基上活化后，用7mm打孔器打成菌饼备用。取其中一个菌饼，菌丝面朝下，接于PDA培养基中央，在离指示菌等距离接入纯化后的放线菌，进行对峙培养，重复3次，于28℃倒置培养至CK长满平板后观察、测量抑菌圈，将拮抗作用显著的放线菌和细菌进行保存。

采用5倍稀释发酵液对黄瓜疫霉菌进行抑菌活性检测，将初筛到的拮抗效果好的生防菌接种于高氏一号液体培养基中，28℃、200r/min摇床培养5天左右，用细菌过滤器过滤。取过滤后的发酵液5ml与20ml的PDA培养基混合均匀倒平板，并以无菌水5ml代替发酵液与PDA培养基混匀作为CK对照。取黄瓜疫霉菌菌饼，接于混合的培养基中央，重复3次，于28℃倒置培养至CK长满平板，测得发酵液对黄瓜疫霉菌的抑制率为72%。筛选结果请见图1。

4、拮抗放线菌X54抑菌广谱性

采用平板对峙法，将不同的靶标菌株：辣椒炭疽病菌（C.capsici）、烟草黑胫病菌（P.parasitica）、水稻纹枯病菌（R.solani）、小麦赤霉病菌（G.zeae）、柑橘炭疽病菌（C.gloeosporioides）、黄瓜枯萎病菌（F.oxysporum）等进行活化后，同样打成菌饼接于PDA培养基中央，等距离接入纯化后的放线菌X54进行对峙培养，重复3次，于28℃倒置培养至CK长满平板后观察、测量抑菌圈，发现该菌对辣椒炭疽病菌、烟草黑胫病菌、水稻纹枯病菌、小麦赤霉病菌、柑橘炭疽病菌、黄瓜枯萎病菌等也有一定的抑制作用，抑菌带宽分别为7.2mm、9.2mm、4.0mm、7.7mm、7.0mm、2.0mm。

5、拮抗菌的鉴定

（1）培养形态特征

放线菌X54菌落密集，呈粉状，在高氏一号培养基菌丝体初为白色，后气生菌丝呈淡紫灰色，基内菌丝象牙黄，无可溶性色素产生。显微镜下，菌丝无隔断、多分枝，孢子多为椭圆形或圆柱状。放线菌X54除在察氏培养基上生长情况一般之外，其他培养基上生长情况良好。菌丝颜色根据培养基的不同，呈现不同的颜色。在燕麦培养基上气生菌丝浅土黄，基内菌丝淡黄色。在PDA培养基上气生菌丝浅灰色，基内菌丝黄白色。在察氏培养基上气生菌丝和基内菌丝均呈粉白色。在葡萄糖酵母膏培养基上，气生菌丝粉白色，基内菌丝土黄色。此外，除在葡萄糖酵母膏培养基会产生可溶性色素外，其余4种培养基上均无可溶性色素生成。形态特征结果见图2。

（2）生理生化实验

具体参照《常见细菌***鉴定手册》、《链霉菌鉴定手册》，对放线菌X54进行过氧化氢酶、吲哚试验、明胶液化、硝酸盐还原、淀粉水解、纤维素水解、产H₂S、碳氮源利用等各项试验。发现放线菌X54能够使淀粉水解，过氧化氢酶、吲哚试验、明胶液化、硝酸盐还原、纤维素水解、M.R.-V.P.和产H₂S试验均为阴性，能利用葡萄糖、蔗糖、乳糖、麦芽糖产酸，能利用麦芽糖、葡萄糖、尿素、硝酸钾等作为碳氮源，不能利用山梨糖、丙二酸钠等。

（3）16S rDNA测序及序列分析

用CATB方法提取放线菌基因组的DNA。用16S rDNA的细菌通用引物，正向引物27F:5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’，反向引物1492R: 5’-CGGTTACCTTGTTACGACTT-3’，25µL反应体系进行PCR扩增： 10×PCR Bµffer缓冲液2.5µL，正反引物(10pmolPL)各0.5µL，dNTPs(1.25mmolPL)2µL，TaqDNA酶(5/µL)0.3µL，DNA模板(50ng/µL)0.5µL，ddH2O加至25µL。PCR扩增条件：94℃4min预变性，94℃45sec，55℃45sec，72℃1min，共30个循环，72℃10min修复延伸，4℃∞终止反应。得到1500bp左右的片段（图3）。经试剂盒纯化后，与T载体进行连接，再转化到大肠杆菌，挑克隆子，菌液PCR验证，送到生工生物工程（上海）股份有限公司测序，序列为1450bp（请见SEQ ID NO.1所示）。所测序列登陆NCBI的GenBank数据库进行同源性比较，并采用CLUSTAL(X)、MEAG(5.0)软件进行多重序列比较，构建***发育树（图4）发现，所测序列与弗吉尼亚链霉菌(Streptomyces virginiae)的16S rDNA有非常高的一致性（99%），表明该菌为弗吉尼亚链霉菌。

实施例二菌株的应用实施例

在湖南省衡阳市石鼓区黄沙湾团结村5组进行了弗吉尼亚链霉菌(Streptomycesvirginiae)X54菌株的发酵液防治黄瓜疫病田间药效试验。试验地面积1.2亩，黄瓜品种为吉旺黄瓜。整个生长期内只喷施杀虫剂，未喷施其它防病药剂。试验地肥力水平中等偏上，植株生长势一致。田间耕作及肥水管理按高产黄瓜栽培管理。

小区面积和重复：试验药剂、对照药剂和清水对照区进行随机区组排列。试验设5个处理，每处理重复3次，每个小区30m² 。

供试药剂：

1、供试药剂：X54微生物发酵液。

2、对照药剂：25%嘧菌酯悬浮剂，先正达（中国）有限公司生产，市购。

施药方法及用量：供试微生物发酵液母液稀释150、100、50倍，分两次灌根。第一次在移栽成活后（5月14日）灌根，每株150 ml；第二次5月21日灌根，每株200 ml，空白对照和药剂对照以等量清水灌根；对照药剂使用16型电动喷雾器喷雾，按每公顷550克兑水450千克的比例，配制好药液，以等量清水喷雾作空白对照，生育期内施药两次，第一次在黄瓜疫病发病初期5月12日，第二次5月20日。施药时先喷清水对照区，再喷施对照药剂，药液均匀喷洒在叶面及叶背。

试验结果：试验结果表明， X54微生物发酵液50倍、100倍、150倍、对照药剂25%嘧菌酯悬浮剂100克/公顷和150克/公顷，在对照药剂第二次施药前，对黄瓜疫病的平均防效分别为71.7%、56.6%、58.5%、77.4%和88.7%。第二次施药后7天，各药剂对黄瓜疫病的平均防效分别为53.3%、41.1%、15.6%、56.7%和61.1%。

防治效果分析，X54发酵液通过灌根对黄瓜疫病有一定的防治效果。X54发酵液稀释50倍后，第二次施药前、末次施药后7天对黄瓜疫病的防效与于对照药剂25%嘧菌酯悬浮剂100克/公顷的防效相当。

<110> 湖南农业大学

<120>一种对黄瓜疫霉菌有抑制作用的放线菌及其筛选方法

<160> 1

<210> 1

<211> 1450

<212> DNA

<400>1 TGCTTACACATGCAAGTCGAACGATGAAGCCCTTCGGGGTGGATTAGTGGCGAACGGGTGAGTAACACGTGGGCAATCTGCCCTTCACTCTGGGACAAGCCCTGGAAACGGGGTCTAATACCGGATACCACTCCTGTCCGCATGGGCAGGGGTTGAAAGCTCCGGCGGTGAAGGATGAGCCCGCGGCCTATCAGCTTGTTGGTGGGGTAACGGCCCACCAAGGCGACGACGGGTAGCCGGCCTGAGAGGGCGACCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGAAAGCCTGATGCAGCGACGCCGCGTGAGGGATGACGGCCTTCGGGTTGTAAACCTCTTTCAGCAGGGAAGAAGCGAAAGTGACGGTACCTGCAGAAGAAGCGCCGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGCGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGAGCTCGTAGGCGGCTTGTCACGTCGGATGTGAAAGCCCGAGGCTTAACCTCGGGTCTGCATTCGATACGGGCTAGCTAGAGTGTGGTAGGGGAGATCGGAATTCCTGGTGTAGCGGTGAAATGCGCAGATATCAGGAGGAACACCGGTGGCGAAGGCGGATCTCTGGGCCATTACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGTTGGGAACTAGGTGTTGGCGACATTCCACGTCGTCGGTGCCGCAGCTAACGCATTAAGTTCCCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGCGGAGCATGTGGCTTAATTCGACGCAACGCGAAGAACCTTACCAAGGCTTGACATATACCGGAAAGCATTAGAGATAGTGCCCCCCTTGTGGTCGGTATACAGGTGGTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGTCCTGTGTTGCCAGCATGCCCTTCGGGGTGATGGGGACTCACAGGAGACCGCCGGGGTCAACTCGGAGGAAGGTGGGGACGACGTCAAGTCATCATGCCCCTTATGTCTTGGGCTGCACACGTGCTACAATGGCCGGTACAATGAGCTGCGATACCGTGAGGTGGAGCGAATCTCAAAAAGCCGGTCTCAGTTCGGATTGGGGTCTGCAACTCGACCCCATGAAGTCGGAGTCGCTAGTAATCGCAGATCAGCATTGCTGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACGTCACGAAAGTCGGTAACACCCGAAGCCGGTGGCCCAACCCTTGTGGAGGGAGCTGTCGAAGGTGGGACTGGCGATTGGACGAAGTCGAACAAGTACCCGTCCGT

Claims

1.一种对黄瓜疫霉菌有抑制作用的放线菌，其是保藏号为CGMCC No. 10042的弗吉尼亚链霉菌（Streptomycesvirginiae）。

2.一种权利要求1所述的对黄瓜疫霉菌有抑制作用的放线菌在防治黄瓜疫霉菌（Phytophthora melonis）、辣椒炭疽病菌、烟草黑胫病菌、水稻纹枯病菌、小麦赤霉病菌、柑橘炭疽病菌、黄瓜枯萎病菌所致植物病害中的应用。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于：其利用所述放线菌的发酵液、发酵液提取物进行应用。

4.如权利要求2或3所述的应用，其特征在于：所述的植物病害是黄瓜疫病。

5.一种农用杀菌剂，其特征在于：其包含如权利要求1所述的放线菌。

6.如权利要求5所述的农用杀菌剂，其特征在于：其包含如权利要求1所述的放线菌的发酵液，或其发酵液提取物。