KR101025880B1

KR101025880B1 - 성체 줄기세포를 이용한 인슐린 분비세포로의 분화 유도방법

Info

Publication number: KR101025880B1
Application number: KR1020080104393A
Authority: KR
Inventors: 김해권; 강현미; 공희숙
Original assignee: 공희숙
Priority date: 2008-10-23
Filing date: 2008-10-23
Publication date: 2011-03-30
Also published as: US20100190251A1; CN101724602A; KR20100045281A; JP2010099069A; EP2180043A1; CN101724602B

Abstract

본 발명은 사람의 성체줄기세포를 이용한 인슐린 분비세포로의 분화 유도방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 눈 피하 지방조직에서 분리해 낸 줄기세포를 인슐린 분비 효율이 우수한 인슐린 분비세포로 분화를 유도하는 방법으로써, 배양액 내 포도당 농도를 고농도에서 저농도로 순차적으로 처리하고, 배양액에 B27 보충제(supplement), 섬유아세포 성장인자-2(Fibroblast growth factor-2), 상피세포 성장인자(Epidermal growth factor), 니코티나마이드(Nicotinamide), 글루카곤 유사 펩타이드(Glucagon-like peptide-1), 액티빈 에이(Activin A), 인슐린 유사 성장인자(Insulin like growth factor), 베타셀룰린(Betacellulin)과 같은 사이토카인(Cytokine)과 성장인자(Growth factor)를 2 단계 또는 4단계로 처리하는 배양법을 사용하여 제1형 당뇨병 치료를 위한 세포 치료제인 인슐린 분비세포로 분화 유도하는 방법에 관한 것이다.

줄기세포, 인슐린 분비세포로의 분화 유도, 눈 피하 지방조직, 사이토카인, 성장인자

Description

성체 줄기세포를 이용한 인슐린 분비세포로의 분화 유도방법{Method for the differentiation of human adult stem cells into insulin-secreting cells}

본 발명은 성체 줄기세포를 이용한 인슐린 분비세포로의 분화 유도방법에 관한 것이다.

제1형 당뇨병은 인슐린 의존적 당뇨병으로서, 인슐린을 분비하는 췌장의 베타세포가 자가 면역 반응에 의해 파괴되어 체내 인슐린의 부족으로 인해 유래되는 질병이다. 인슐린은 우리 몸에서 혈액 내에 있는 당의 항상성을 유지시켜 주는 작용을 하고, 인슐린이 생산되지 못할 경우, 혈액 내 당의 농도가 높아지게 되고 신장, 신경, 망막 등과 같은 여러 장기의 기능을 손상시키는 합병증을 유발할 수 있다. 제1형 당뇨병의 치료는 지속적으로 인슐린 주사를 맞거나 다른 사람의 췌장이나 베타세포를 이식받는 등의 방법이 있으나, 전자의 경우 근본적인 치료방법이 될 수 없고 평생 주사를 맞아야 하는 고통이 따르며, 그 효과 역시 지속적이지 않다. 또한, 후자의 경우도 타인의 췌장을 이식받는 수술이 필요하기 때문에 조직의 사용에 있어 많은 제한점을 가지고 있고, 재발하는 자가 면역 반응에 의해 이식된 세포가 다시 파괴될 수 있다는 한계를 가지고 있다. 최근 많은 연구 들이 줄기세포를 이용한 세포치료제 개발에 중점을 두고 있으며, 대표적인 줄기세포로는 배아 줄기세포와 성체 줄기세포를 들 수 있다. 배아 줄기세포는 체외에서 인슐린을 분비하는 세포로 분화가 가능하며, 이 세포들을 당뇨 쥐에 이식했을 경우 고혈당을 치료할 수 있다는 연구보고들이 있다[Fujikawa T, Oh SH, Pi L, Hatch HM, Shupe T, Petersen BE (2005) Teratoma formation leads to failure of treatment for type I diabetes using embryonic stem cell-derived insulin-producing cells. Am J Pathol 166, 1781-1791; D'Amour KA, Bang AG, Eliazer S, Kelly OG, Agulnick AD, Smart NG, Moorman MA, Kroon E, Carpenter MK, Baetge EE (2006) Production of pancreatic hormone-expressing endocrine cells from human embryonic stem cells. Nat Biotechnol 24,1392-1401]. 그러나, 배아 줄기세포는 임상적용에 있어 이식했을 경우 암이 발생할 수 있다는 큰 단점을 가지고 있다[Kroon E, Martinson LA, Kadoya K, Bang AG, Kelly OG, Eliazer S, Young H, Richardson M, Smart NG, Cunningham J, Agulnick AD, D'Amour KA, Carpenter MK, Baetge EE (2008) Pancreatic endoderm derived from human embryonic stem cells generates glucose-responsive insulin-secreting cells in vivo. Nat Biotechnol 26, 397-398].

현재까지 외배엽 기원 전구세포로부터 인슐린을 발현하는 세포로 분화가 가능하다는 보고[Hori Y, Gu X, Xie X, and Kim SK. (2005) Differentiation of insulin-producing cells form human neural progenitor cells. PLOS. Med. 2, 103]와 췌장관 세포(Pancreatic ductal cells)에서 유래한 상피세포가 췌장의 섬과 같은 구조로 분화가 가능했다는 보고[Bonner-Weir S, Taneja M, Weir GC, .Tatarkiewicz K, Song KH, Sharma A and O'Neil JJ (2000) In vitro cultivation of human islets from expanded ductal tissue. Prod Natl Acad Sci 97, 7999-8004]가 있다. 그러나, 전자의 경우, 신경구 세포주 (Neurosphere cell line)를 사용하여 분화를 유도하였으며, 소의 인슐린을 배양액에 첨가하였기 때문에 그 효율성의 입증이 어려우며, 후자의 경우 관 조직(Ductal tissue)에서 얻을 수 있는 줄기세포의 양이 극히 제한적이라는 단점이 있다. 특히, 배아 줄기세포의 경우 인슐린이 포함되어 있는 배양액에서 분화를 유도할 경우, 분비된 인슐린은 배양액에 있는 인슐린을 흡수하여 다시 내놓는다는 보고가 있으며, 이 사실은 이런 세포들이 인슐린이 분비될 때 함께 잘려지는 C-펩타이드를 분비하지 않는다는 결과로 입증되었다[Rajagopal J, Anderson WJ, Kume S, Martinez OI, and Melton DA (2003) Insulin staining of ES cell progeny from insulin uptake. Science 299, 363; Hansson M, Tonning A, Frandsen U, Petri A, Rajagopal J, Englund MC, Heller RS, Hakansson J, Fleckner J, Skold HN, melton K, Semb H, and Serup P (2004) Artifactual insulin release from differentiated embryonic stem cells. Diabetes 53, 2603-2609]. 따라서, 최근 많은 연구들이 배양액에 인슐린을 첨가하지 않고 분화를 유도하는 시도를 하고 있으며, 현재까지 다음 표 1에서처럼 최근에 인슐린 유사 성장인자나 베타셀룰린을 분화 배양액에 첨가하여 분화를 유도한 보고들도 있다. 그러나 배아줄기세포의 경우, 앞에서 언급한 것과 같이 윤리적인 문제와 암이 발생할 수 있기 때문에 치료의 목적으로 사용하기는 어렵고, 피부 에서 유래한 섬유아세포를 이용하여 만능성 줄기세포 (induced pluripotent stem cells)를 유도하거나 중간엽 줄기세포를 이용하여 분화를 시도하고 있으나, 인슐린과 씨-펩타이드 분비량이 현저히 낮은 수치이다.

[표 1]

줄기세포를 이용하여 인슐린 분비세포로 체외 분화 연구

세포 종류	인슐린 분비량	C-펩타이드 분비량	참고 문헌
배아줄기세포	-	5ng/ug DNA	Jiang et al., 2007 ¹⁾
피부섬유아세포		0.15 ng/ug DNA	Tateishi et al., 2008 ²⁾
중간엽줄기세포	1.291 mU/L	163 ng/L	Li et al., 2008 ³⁾

1) Jiang J, Au M, Lu K, Eshpeter A, Korbutt G, Fisk G, Majumdar AS (2007) Generation of insulin-producing islet-like clusters from human embryonic stem cells Stem Cells 25, 1940-1953.

2)Tateishi K, He J, Taranova O, Liang G, D'Alessio AC, Zhang Y(2008) Generation of insulin-secreting islet-like clusters from human skin fibroblasts.J Biol Chem. doi/10.1074/jbc.M806597200

3) Li L, Li F, Qi H, Feng G, Yuan K, Deng H, Zhou H. (2008) Coexpression of Pdx1 and betacellulin in mesenchymal stem cells could promote the differentiation of nestin-positive epithelium-like progenitors and pancreatic islet-like spheroids.Stem Cells Dev.17, 815-823.

이에, 본 발명자들은 사람의 제1형 당뇨병을 치료할 수 있는 세포치료제를 개발하기 위하여 사람의 성체 줄기세포를 재료로 하여, 체외 배양 시에 배양액 내의 포도당 농도를 다르게 순차적으로 처리하고 베타세포로의 분화에 효과적이라고 알려진 여러 가지 사이토카인과 성장인자를 선택하여 처리함으로써, 높은 효율로 인슐린을 분비할 수 있는 세포로의 분화를 유도하는 방법을 개발함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 사람의 성체줄기세포를 이용하여 인슐린 분비세포로의 분화 유도방법을 제공하는데 있다.

본 발명은 크게 두 가지 실험으로 나누어서 볼 수 있으며, 그 첫 번째 실험은 인슐린 유사 성장인자를 첨가하여 분화에 효과적인지를 살펴본 결과이며, 두 번째 실험은 액티빈 에이 대신에 베타셀룰린이 분화에 미치는 영황을 살펴본 결과이다.

먼저, 첫 번째 발명은

사람의 성체 줄기세포를 체외에서 인슐린 분비세포로 분화를 유도 시,

20 ~ 30 mM의 포도당 농도를 가지는 고포도당 배양액에 5 ~ 20%의 소태아혈청, 1 ~ 10 nM의 엑티빈 에이, 5 ~ 20 nM의 글루카곤 유사 펩타이드 및 10 ~ 30 ng/ml의 섬유아세포 성장인자-2를 첨가하여 4 ~ 10일 동안 1단계 배양한 후,

4 ~ 7 mM의 포도당 농도를 가지는 저포도당 배양액에 5 ~ 20%의 소태아혈청, 5 ~ 20 mM의 니코티나마이드, 1 ~ 10 nM의 엑티빈 에이, 5 ~ 20 nM의 글루카곤 유사 펩타이드 및 10 ~ 100 ng/ml의 인슐린유사 성장인자를 첨가하여 10 ~ 20 일 동안 2단계 배양하는 인슐린 분비세포로의 분화 유도방법을 그 특징으로 한다.

본 발명을 더욱 상세하게 설명하면, 사람의 성체 줄기세포의 일종인 눈 피하지방조직으로부터 분리해 낸 줄기세포를 분화유도 배양액에서 배양시키되, 배양액 내 포도당 농도를 고농도에서 저농도로 처리하고, 배양액에 섬유아세포 성장인자-2, 니코티나마이드, 글루카곤 유사 펩타이드, 액티빈 에이, 인슐린 유사 성장인자와 같은 싸이토카인과 성장인자를 첨가함으로써 제1형 당뇨병 치료를 위한 인슐린분비세포로 분화시키는 방법에 관한 것이다.

본 발명은 2단계 배양법을 사용하며, 3 군으로 나누어서 그 효과를 시험하였다. 첫 번째 군(대조군)은 1단계에서 포도당의 농도가 20 ~ 30 mM인 배양액에 니코티나마이드, 엑티빈 에이, 글루카곤 유사 펩타이드(NAG)를 4 ~ 10일 동안 처리하고 2단계에서 포도당 농도가 4 ~ 7 mM인 배양액에 같은 사이토카인을 처리하여 10 ~ 20일 동안 배양[NAG 군]하는데, 이는 앞에서 언급한 바와 같이 2007년 5월 국내 특허 출원[2007-44663]한 바 있는 배양조건이다. 두 번째 군은 1단계에서는 포도당의 농도가 20 ~ 30 mM인 배양액에 소태아혈청, 엑티빈 에이, 섬유아세포 성장인자-2, 글루카곤 유사 펩타이드 등의 싸이토카인과 성장인자를 혼합하여 4 ~ 10일 동안 처리하고 2단계에서는 포도당의 농도가 4 ~ 7 mM인 배양액에 소태아혈청, 니코티나마이드, 엑티빈 에이, 글루카곤 유사 펩타이드, 인슐린 유사 성장인자-1과 같은 싸이토카인과 성장인자를 혼합하여 10 ~ 20일 동안 처리한다[NAGI1 군]. 마지막으로 세 번째 군은 두 번째 군과 1단계는 동일하게 처리하고 2단계에서는 인슐린 유사 성장인자-1 대신 인슐린 유사 성장인자-2를 처리[NAGI2군]하여 분화를 유도하는 배양조건이다.

또한, 두 번째 방법은,

분화에 효과적이라고 알려진 BTC(beta-cellulin)와 혈청 보충제(serum supplement) 중 하나인 B27 보충제(supplement)를 사용하여 인슐린 분비 효율성이 높은 분화 조건을 개발하였다(실시예 17).

포도당의 농도가 20 ~ 30 mM인 배양액(고농도 포도당 배양액)에 B27 보충제, 섬유아세포 성장인자-2, 상피세포 성장인자(Epidermal growth factor)를 첨가하여 1 ~ 7일 동안 배양한 후, 같은 포도당 농도의 배양액에, 소태아혈청, 엑티빈 에이, 섬유아세포 성장인자-2, 글루카곤 유사 펩타이드-1이 첨가된 배양액에 1 ~ 7일 동안 배양한다.

다음 단계에서는 포도당의 농도가 4 ~ 7 mM인 배양액(저농도 포도당 배양액)에 소태아혈청, 엑티빈 에이, 섬유아세포 성장인자-2, 글루카곤 유사 펩타이드-1과 같은 싸이토카인과 성장인자를 혼합하여 1 ~ 7일 동안 배양한 후, 마지막 단계에서 4 ~7 mM인 배양액에 소태아혈청, 니코티나마이드, 글루카곤 유사 펩타이드-1, 베타셀룰린을 첨가하여 10 ~ 20일 동안 배양하는 4단계 배양법을 포함한다.

이때, 상기 배양액은 DMEM(Dulbecco's modified Eagle medium) 또는 DMEM/F12(Dulbecco's modified Eagle medium : Nutrient mixture F-12 1:1 mixture)인 것이 적합하다.

본 발명에 따른 인슐린 분비세포의 분화 유도 과정을 상세히 설명하면 다음과 같다.

눈 피하지방 유래 줄기세포는 성형외과적 시술에서 얻어지는 눈 피하 부위 및 뺨 부위의 지방을 각각 타입 I의 콜라게나제(Collagenase type I)로 30분간 37 ℃에서 반응시킨 후, 원심분리하여 세포침전층을 얻어 소태아혈청이 첨가된 배양액에서 배양한다.

얻어진 줄기세포를 15 ~ 30일 동안 분화유도 배양액에서 배양하는데, 콜라젠이 도포되어 있는 배양접시에서 처음 4 ~ 10일 동안은 고포도당 배양액에 5 ~ 20%의 소태아혈청, 5 ~ 20 nM의 글루카곤 유사 펩타이드, 1 ~ 10 nM의 액티빈 에이, 10 ~ 30 ng/ml의 섬유아세포 성장인자-2를 첨가하여 배양한다. 4 ~ 10 일 후, 저포도당 배양액에 5 ~ 20%의 소태아혈청, 5 ~ 20 mM의 니코티나마이드, 5 ~ 20 nM의 글루카곤 유사 펩타이드, 1 ~ 10 nM의 액티빈 에이, 10 ~ 100 ng/ml의 인슐린 유사 성장인자를 첨가하는 배양액에 10 ~ 20 일 동안 배양한다.

15 ~ 30 일 배양이 끝난 뒤 저농도의 포도당 배양액에 소혈청알부민(Bovine serum albumin, BSA)를 첨가하여 10 ~ 15시간동안 처리한다. 10 ~ 15시간 후, 고농도의 포도당 배양액에 2시간 동안 노출시킨 후, 배양액을 얻어 인슐린 효소면역화학법를 통해 인슐린과 C-펩타이드가 얼마나 분비되었는지를 알아보았다. 그 결과, 본 발명에서 발견한 분화 조건이 분화를 유도하지 않은 군(대조군) 보다 인슐린과 C-펩타이드의 분비양이 증가하였으며, 기존에 특허를 출원한 바 있는 NAG군에 비교해 봤을 때, 인슐린 유사 펩타이드-1을 첨가한 군(NAGI1 군)은 효과가 없었 지만, 인슐린 유사 펩타이드-2를 첨가한 군(NAGI2 군)에서는 인슐린이 약 8배, C-펩타이드는 약 6배가 많이 증가하였다. 또한, 효과가 가장 좋은 군인 인슐린 유사 펩타이드-2를 첨가하여 배양한 세포를 얻어 유전자 발현 양상을 살펴본 결과 췌장 특이 베타세포의 특이적인 유전자로 알려진, ND(neuro D1), PC(prohormone convertase)1/3, PC2, NGN3, Glut(Glucose transporter) 1, Glut 2, pax4, pdx1 등과 같은 유전자들이 1단계 배양액에서 분화 유도한 후 발현되기 시작했으며, nkx 6-1, 인슐린은 2단계 배양액에서 분화 유도한 후에 발현되었다. 이 세포들을 이용하여 세포면역화학 염색법을 시행한 결과, 세포 내 CK19 , 프로인슐린, 인슐린, C-펩타이드 단백질을 모두 발현하였으며, 베타 세포에 특이적인 염색법으로 알려진, 디티존 염색에도 강하게 염색되었다.

결론적으로 본 발명에서 사용한 인슐린 분비세포로의 분화 방법은 배양액에 인슐린을 첨가하지 않고 2단계 배양법을 이용하여, 1단계에서는 고농도의 포도당 농도에 섬유아세포 성장인자-2, 엑티빈 에이, 글루카곤 유사 펩타이드를 첨가하여 분화를 유도한 후, 저농도의 포도당 농도에 니코티나마이드, 엑티빈 에이, 글루카곤 유사 펩타이드, 인슐린 유사 성장인자-2를 처리하여 배양하는 배양법을 밝혀냈으며, 본 배양법은 2007년 5월 특허를 출원했던 NAG군 보다 효과적으로 인슐린을 분비할 수 있는 방법이라고 할 수 있다.

한편, 두 번째 실험 결과인 다음과 같은 배양법도 효과적인 인슐린 분비방법으로 본 발명에 포함된다.

20 ~ 30 mM의 포도당 농도를 가지는 고포도당 배양액에 0.5X ~ 4X B27 보충 제, 10 ~ 30 ng/ml의 섬유아세포 성장인자-2, 10 ~ 30 ng/ml의 상피세포 성장인자를 첨가하여 1 ~ 7일 배양한 후, 동일한 포도당 농도에 5 ~ 20%의 소태아혈청, 1 ~ 10 nM의 엑티빈 에이, 5 ~ 20 nM의 글루카곤 유사 펩타이드 및 10 ~ 30 ng/ml의 섬유아세포 성장인자-2를 첨가하여 1 ~ 7일 동안 배양하고,

4 ~ 7 mM의 포도당 농도를 가지는 저포도당 배양액에 5 ~ 20%의 소태아혈청, 1 ~ 10 nM의 엑티빈 에이, 5 ~ 15 nM의 글루카곤 유사 펩타이드 및 10 ~ 30 ng/ml의 섬유아세포 성장인자-2를 첨가하여 1 ~ 7일 동안 배양한 뒤, 동일한 포도당 농도의 배양액에 5 ~ 20%의 소태아혈청, 5 ~ 20 mM의 니코티나마이드, 1 ~ 10 ng/ml 의 베타셀룰린, 5 ~ 20 nM의 글루카곤 유사 펩타이드를 첨가하여 10 ~ 20 일 동안 배양한다.

상기와 같이 베타셀룰린을 첨가한 배양군(BTC)은 인슐린이 약 6배, 씨-펩타이드는 약 6배가 증가하였다.

따라서, 3일 동안 소태아 혈청 대신 B27 보충제를 첨가한 후 엑티빈 에이 대신 베타 셀룰린을 첨가하는 방법 역시 NAG군 보다 효과적으로 인슐린을 분비할 수 있는 방법으로 보인다.

본 발명은 사람의 성체 줄기세포에서 유래된 줄기세포를 인슐린 분비세포로 분화시키기 위한 배양액 조성과 이 배양액을 이용한 분화방법에 관한 것으로서, 이는 2007년 5월 국내특허 출원을 했던 NAG군(2007-44663) 보다 인슐린과 C-펩타이드 분비량이 7 ~ 8배 정도 뛰어나다는 점에서 제 1형 당뇨병을 치료할 수 있는 세포치 료제로서의 효능이 매우 뛰어난 것으로 기대된다.

이하, 다음 실시예를 들어 본 발명을 상세히 기술할 것이나 본 발명의 범위를 이들 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 줄기세포의 분리

성형외과적 시술에서 얻어지는 사람의 눈 피하지방을 환자의 동의 아래 기증받아 0.075% 타입 1의 콜라게나제 용액에서 30분간 37 ℃에서 반응시킨 후, 소태아혈청이 첨가된 배양액을 콜라게나제와 동량 처리하여, 효소의 활성을 중성화시켰다. 원심 분리하여 세포침전층을 얻어 배양액으로 두 번 씻어준 뒤, 10% 소태아혈청이 첨가된 배양액(DMEM-LG)에서 배양하였다.

실시예 2: 줄기세포의 배양

얻어진 줄기세포를 21일 동안 분화유도 배양액에서 배양을 하였다. 즉, 콜라겐이 코팅되어 있는 48-웰 배양접시에 5 x 10³ cells/웰의 농도로 세포를 넣어준 뒤, 처음 7일 동안은 25 mM 포도당이 첨가된 배양액(고포도당 배양액, DMEM-HG)에 10% 소태아혈청, 4 nM 엑티빈 에이, 10 nM 글루카곤 유사 펩타이드, 20 ng/ml 섬유아세포 성장인자-2를 첨가하여 배양하였다. 일주일 후, 5.5 mM 포도당 농 도를 가지는 저포도당 배양액(DMEM-LG)에 10% 소태아혈청, 10 mM 니코티나마이드, 4 nM 엑티빈 에이, 10 nM 글루카곤 유사 펩타이드, 50 ng/ml 인슐린 유사 성장인자-1 또는 인슐린 유사 성장인자-2를 첨가하여 14일 동안 배양하였다

배양액은 3 ~ 4일 간격으로 교체해 주었다. 3주 배양 후, 인슐린을 분비하는 세포로 분화가 되었는지를 다음과 같은 방법으로 확인하였다.

실시예 3: 분화 후 세포 모양의 변화

사람의 눈 피하지방으로부터 줄기세포를 분리하여 배양한 후 세포의 모양 변화를 현미경 하에서 관찰한 결과, 아무런 성장인자나 사이토카인이 첨가되지 않은 증식 배양액에서 배양한 눈 피하 지방조직 유래 줄기세포는 원래의 모양을 유지하고 있었으나, 니코티나마이드와 엑티빈 에이, 글루카곤 유사 펩타이드 또는 인슐린 유사 성장인자-1, -2 등의 사이토카인을 처리한 군에서는 세포의 모양이 둥글게 변한 것을 관찰할 수 있었다(도 1). 특히, 분화를 유도한 후 3주째가 되면 세포의 모양이 둥글게 변화고 세포 덩어리가 형성되는 것이 관찰되었다.

실시예 4: 인슐린 및 C-펩타이드 분비 확인

상기 3주 배양이 끝난 뒤 저포도당 배양액에 0.5% 소혈청 알부민을 첨가하여 12시간동안 처리하였다. 이후, 고포도당 배양액에 2시간 동안 노출시키고 배양액을 얻어 인슐린 효소면역화학 측정법을 이용해 인슐린의 분비량을 측정하였다(도 2). 또한, 인슐린이 분비될 때 함께 잘려져서 분비되는 C-펩타이드를 면 역화학측정법을 이용해서 측정하였다(도 3). 인슐린과 C-펩타이드 효소면역화학측정법은 Sweden의 Mercodia 회사의 킷트를 사용하였으며, 사람의 인슐린과 C-펩타이드가 코딩되어 있는 96-웰 플레이트에 농도가 알려진 표준용액과 위에서 얻은 배양액을 각각 25 ㎕씩 넣은 다음, 인슐린과 C-펩타이드 항체를 넣어 1시간 반응시켰다. 이후, TMB 기질 용액을 넣고 30분 반응시킨 뒤 흡광도를 측정하여 인슐린과 C-펩타이드의 양을 측정하였다. 그 결과, 분화를 유도하지 않은 세포에 비해 본 발명에서 개발한 2단계 배양법을 사용하여 분화를 유도한 그룹에서 인슐린과 C-펩타이드가 분비되었으며, 특히 인슐린 유사 펩타이드-2가 첨가된 군(NAGI2 군)에서는 NAG 군에 비해 인슐린은 약 8배, C-펩타이드는 약 6배의 양이 분비되었다.

실시예 5: 인슐린분비세포의 특이 단백질 발현

사람의 눈 피하 지방 조직에서 유래된 줄기세포를 효소면역화학 측정법에 의해 가장 효과적인 배양법으로 보이는 인슐린 유사 펩타이드-2가 첨가된 배양액을 사용하여 인슐린 분비세포로 분화 유도한 후, CK19, 인슐린, C-펩타이드 그리고 프로인슐린(pro-insulin), 세포 밖으로 분비되기 전, 완전한 인슐린으로 잘려지지 않은 형태) 단백질의 세포 내 발현정도를 면역세포 화학법을 이용하여 조사하였다(도 4). 면역세포 화학법은 3주 동안 분화를 유도한 뒤 고농도의 포도당에 2시간 노출시킨 세포를 4% 파라포름알데하이드(Paraformaldehyde)를 이용하여 4 ℃에서 90분 고정하고 인산완충용액으로 세 번 세척하였다. 세포 안에 존재하는 내재 성 페록시다아제(Endogenouse peroxidase)를 제거하기 위해 10분 동안 3% 과산화수소를 처리하고, 다시 background 시그널을 차단하기 위하여 2%의 소혈청 알부민이 첨가된 인산완충용액으로 실온에서 60분 동안 반응시켰다. 이후, 각각 사람의 CK19(1:400), C-펩타이드(1:500), 인슐린(1:500) 그리고 프로인슐린(1:500) 단백질에 특이적으로 반응하는 1차 항체가 희석된 인산완층용액을 이용하여 4 ℃에서 반응시켰다. 음성대조군의 경우 1차 항체 대신 인산완충용액만 넣어주었다. 12시간 후 바이오틴(Biotin)이 결합된 2차 항체와 과산화수소가 결합된 스트렙타비딘(Streptavidin)을 각각 20분씩 처리한 후 디아미노벤지딘(3,3'-diaminobenzidine, DAB)을 사용하여 발색하였다. 그 결과, 니코티나마이드와 액티빈 에이, 글루카곤 유사 펩타이드를 모두 처리해 준 실험군이 분화를 유도하지 않은 대조군보다 CK19, C-펩타이드, 인슐린 그리고 프로인슐린 단백질 모두가 세포 내에서 뚜렷하게 발현이 증가되는 것을 관찰하였다(도 4).

실시예 6: 인슐린 분비세포 특이 유전자의 발현

사람의 눈 피하지방에서 유래한 줄기세포를 인슐린 유사 펩타이드-2가 첨가된 배양액에서 분화를 유도한 후, 7일, 14일, 21일째에 세포를 얻어 분화된 세포가 인슐린 분비세포의 특이적인 유전자가 발현되는지 알아보기 위해 역전사-중합효소 연쇄반응 방법을 이용하여 조사하였다.

먼저, 분화된 세포로부터 총 리보핵산을 분리하였다. 시험관에 들어있는 세포에 1 ml의 트라이졸 용액(Tri-reagent)을 넣고 잘 섞어준 후 200 ㎕의 클로로 포름을 첨가하고 잘 섞어주었다. 15분 동안 상온에서 방치한 다음 14,000 rpm으로 15분간 원심분리 후, 맨 위층의 상등액을 새 튜브로 옮겼다. 여기에 500 ㎕의 이소프로판올(isopropanol)을 첨가한 후 잘 섞어준 다음 14,000 rpm으로 10분간 원심 분리하였다. 상등액을 버리고 1 ml의 75% 에탄올을 넣고 잘 섞은 후 14,000 rpm으로 10분간 원심 분리하였다. 상등액을 버리고 남은 75% 에탄올을 잘 말린 후 멸균된 3차 증류수를 넣고 65 ℃에서 5분 동안 방치하여 RNA를 용출시켰다. 용출된 RNA를 자외선분광 분석계(UV-spectrophotometer)를 이용하여 260 nm의 파장에서 흡광도를 측정한 후, 리보핵산 7.5 ㎍에 1x 반응완충용액(Rreaction buffer), 1 mM의 뉴클레오티드(dNTP), 0.5 mg/ml의 올리고-디티(Oligo-dT), 20 U의 리보핵산분해효소 억제제(RNase inhibitor), 그리고 20 U의 역전사효소(M-MuLV reverse transcriptase)를 첨가하고 멸균된 3차 증류수로 총 양을 50 ㎕로 맞춘 용액을 42 ℃에서 60분간 반응시켰다.

중합효소 연쇄반응은 다음 표 2에서 나타낸 바와 같이, 각각의 유전자에 대한 합성된 상보적 디옥시리보핵산(cDNA)에 1x 호열균 디옥시리보핵산 중합효소를 위한 완충용액(Taq buffer), 2 mM의 염화마그네슘(MgCl₂), 0.25 U 호열균 디옥시리보핵산 중합효소(Taq polymerase) 그리고 10 pmol의 시발물질(Primer)이 혼합된 용액 속에서 중합반응을 수행하였다.

최초 94 ℃에서 5분간 초기변성단계(Predenaturation) 후, 94 ℃에서 30초간 변성단계(Denaturation)를 거치고, 각 유전자에 따른 온도 조건에서 30초간 안정 상태인 풀림단계(Annealing)를 하고 72 ℃에서 30초간 총 35회의 연장단계(Extension)를 실시하여 증폭하였다. 마지막으로 72 ℃에서 5분간 후기연장(Ppostelongation)을 시켜 PCR 산물을 얻어 이중 15 ㎕의 역전사-중합효소 연쇄반응(PCR) 산물을 6x 로딩용액(Loading buffer; 0.25% bromophenol blue, 0.25% xylene cyanol, 40% sucrose)과 섞은 후 2% 아가로즈 겔(Agarose gel)에 로딩하여 100 V로 30분간 전기 영동하였다. 전기영동이 끝난 겔을 에티디움 브로마이드(Ethidium bromide)로 염색한 후 자외선 투사기(UV transilluminator; Vilber loumat, FRANCE)로 염색 양상을 조사하였다. 대조군으로서 글리세르알데히드인산 탈수소효소(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH)의 발현양을 조사하고 이와 비교하여 각각의 유전자의 발현 양을 상대적으로 비교하였다. 실험은 3회 반복하고 이로부터 결과를 얻어 비교 분석하였다.

다음 표 2는 역전사-중합효소 연쇄반응법(Reverse-transcriptase polymerase chain reaction, RT-PCR)을 이용하여 인슐린 분비세포의 특이 유전자 발현 여부를 알아보고자 하는 데에 사용되는 시발물질(Primer)의 명칭 및 뉴클레오티드의 순서와 역전사-중합효소 연쇄반응법에 의해 얻어지는 산물의 크기 목록이다.

[표 2]

유전자	프라이머	크기 (bp)	풀림 온도(℃)	비고
GAPDH	5'-acaactttggtatcgtggaa-3' (서열번호 1) 5'-aaattcgttgtcataccagg-3' (서열번호 2)	456	53	NM_002046
insulin	5'-aaccaacacctgtgcggctc-3' (서열번호 3) 5'-aagggctttattccatctctctcg-3' (서열번호 4)	320	59	J00265
ngn3	5'-cgtgaactccttgaactgagcag-3' (서열번호 5) 5'-tggcactcctgggacgagtttc-3' (서열번호 6)	211	61	AF234829
pdx1	5'-cccatggatgaagtctacg-3' (서열번호 7) 5'-gtcctcctcctttttccac-3' (서열번호 8)	262	54	NM_000209
GK	5'-gaataccccccagagaccttttc-3' (서열번호 9) 5'-ggtttcttcctgagccagcg-3' (서열번호 10)	182	61	M90299
Isl1	5'-agcatcaatgtcctctcaacttcc-3' (서열번호 11) 5'-tgtttggcaaggcaatgacc-3' (서열번호 12)	493	57	NM_002202
Nkx6.1	5'-acacgagacccactttttccg-3' (서열번호 13) 5'-tgctggacttgtgcttcttcaac-3' (서열번호 14)	336	59	NM_006168
Glut 2	5'-agctttgcagttggtggaat-3' (서열번호 15) 5'-aataagaatgcccgtgacga-3' (서열번호 16)	300	57	NM_000340
ND	5'-cagaaccaggacatgccc-3' (서열번호 17) 5'-atcaaaggaagggctggtg-3' (서열번호 18)	216	60	NM_002500
Glucagon	5'-atgaacgaggacaagcgc-3' (서열번호 19) 5'-gtaacgaaccgaccactt-3' (서열번호 20)	236	57	NM_002054
SST	5'-ggctgcgctgtccatcgtcct g-3' (서열번호 21) 5'-ttgcgttctcggggtgccatagc-3' (서열번호 22)	276	63	NM_001048
PP	5'-ctctgttactacagccactg-3' (서열번호 23) 5'-agtcgtaggagacagaaggt-3' (서열번호 24)	261	55	NM_002722.3
PC1/3	5'-ttggctgaaagagaacgggatacatct-3' (서열번호 25) 5'-acttctttggtgattgctttggcggtg-3' (서열번호 26)	457	60	NM_000493.3
PC2	5'-gcatcaagcacagacctacactcg-3' (서열번호 27) 5'-gagacacaaccacccttcatccttc-3' (서열번호 28)	309	63	NM 003594.2
GLUT1	5'-ctcactgctcaagaagacatgg-3' (서열번호 29) 5'-ctgggtaacagggatcaaacag-3' (서열번호 30)	366	60	NM 006516.1
GLP-1R	5'-gttcccctgctgtttgttgt-3' (서열번호 31) 5'-cttggcaagtctgcatttga-3' (서열번호 32)	228	55	NM002062.2
PAX4	5'-cacctctctgcctgaggacacggtgag-3' (서열번호 33) 5'-ctgcctcattccaagccatacagtagtg-3' (서열번호 34)	444	63	NM 006193.1

상기와 같은 방법으로 분석한 결과, 췌장 발달에 있어 중요한 작용을 하는 전사인자로 알려진 neuro D, islet 1과 같은 유전자와 췌장의 내분비 세포 중 베타 세포를 제외한 다른 세포들이 분비하는 단백질인 글루카곤, SST(somatostatin), PP(pancreatic polypeptide)는 분화를 시키지 않은 세포에서도 발현되는 것으로 관찰되었다. 그러나, 분화를 유도한 경우 7일째부터 PC2, PC1/3, Glp1R, neurogenin 3, Glut2, Glut1, pax4, pdx1 등과 같은 유전자들이 발현되기 시작했으 며 Nkx6-1과 인슐린은 14일째부터 발현되기 시작하여 21일째 그 발현양이 현저히 증가하였다(도 5).

실시예 7: 디티존 염색 (Dithizone staining)

인슐린은 세포 내에서 아연이온(Zn⁺⁺)과 함께 헥사머(Hexamer)를 형성하게 되는데, 디티존은 이 아연이온에 결합하여 세포를 염색하는 물질로서 췌장의 베타세포에 특이적인 염색법으로 알려져 있다. 따라서, 인슐린 유사 펩타이드-2가 첨가된 배양액에 배양한 세포를 디티존 염색을 해 보았다. 염색법은 디티존 분말 50 mg을 디메틸 설폭사이드(Dimethyl sulfoxide, DMSO) 5 ml에 녹인 후, 10 ㎕의 디티존 용액을 1 ml의 배양액에 녹여 사용하였다. 사용 전에는 0.2 ㎛의 나일론 필터를 통해 필터를 한 후에 사용하며, 배양 접시에 염색 용액을 떨어뜨린 후 37 ℃에서 15분 반응시킨 후, 3번 인산완충용액으로 씻어준 뒤 광학 현미경 하에 염색 정도를 확인하였다. 이를 이용하여 염색한 결과, 분화된 세포는 뚜렷하게 염색되었으며, 특히 세포가 둥글게 뭉쳐진 부분에서 염색이 진하게 나타났다(도 6).

위에서 보는 바와 같이, 사람의 눈 피하지방 유래 줄기세포를 먼저 1단계 즉, 높은 농도의 포도당, 엑티빈 에이, 섬유아세포 성장인자-2, 글루카곤 유사 펩타이드-1을 함께 처리한 후 2단계, 즉 낮은 농도의 포도당, 니코티나마이드, 엑티빈 에이, 글루카곤 유사 펩타이드-1, 인슐린 유사 성장인자-2를 함께 처리하는 방 법으로 분화를 유도한 결과 높은 포도당 농도에 반응하여 많은 양의 인슐린과 C-펩타이드를 분비하였다. 또한, 인슐린, C-펩타이드, 프로 인슐린 단백질뿐 아니라 베타세포 특유의 유전자도 발현하였으며, 디티존 염색에도 뚜렷하게 염색이 되었다. 따라서, 본 발명에서 개발한 배양방법은 눈 피하지방 줄기세포를 인슐린을 분비하는 베타세포로 매우 효과적으로 분화시켰다.

실시예 8: 줄기세포 배양

얻어진 줄기세포를 21일 동안 분화유도 배양액에서 배양을 하였다. 즉, 콜라겐이 코팅되어 있는 48-웰 배양접시에 5 x 10³ cells/웰의 농도로 세포를 넣어준 뒤, 처음 3일 동안은 25 mM 포도당이 첨가된 배양액(고포도당 배양액, DMEM-HG)에 1X의 B27 보충제, 20 ng/ml의 섬유아세포 성장인자-2, 그리고 20 ng/ml의 상피세포 성장인자를 첨가하여 3일 동안 배양한 후, 같은 포도당 농도에 10% 소태아 혈청, 4nM의 엑티빈 에이, 20ng/ml의 섬유아세포 성장인자-2, 그리고 10 nM의 글루카곤 유사 펩타이드-1이 첨가된 배양액에 4일동안 배양하였다. 일주일 후, 5.5 mM 포도당 농도를 가지는 포도당 배양액(DMEM-LG)에 10% 소태아혈청, 4 nM의 엑티빈 에이, 20 ng/ml의 섬유아세포 성장인자-2, 그리고 10 nM의 글루카곤 유사 펩타이드-1이 첨가된 배양액에 3일 동안 배양한 후, 같은 농도의 포도당 농도의 배양액에 10 mM의 니코티나마이드, 10 nM의 글루카곤 유사 펩타이드, 10 ng/ml의 베타셀룰린을 첨가하여 10일 동안 배양하였다.

실시예 9: 인슐린 및 씨-펩타이드 분비 확인

상기 3주 배양이 끝난 뒤 저포도당 배양액에 0.5% 소혈청 알부민을 첨가하여 12시간동안 처리하였다. 이후, 고포도당 배양액에 2시간 동안 노출시키고 배양액을 얻어 인슐린 효소면역화학 측정법을 이용해 인슐린의 분비량을 측정하였다(도 7). 또한, 인슐린이 분비될 때 함께 잘려져서 분비되는 씨-펩타이드를 면역화학측정법을 이용해서 측정하였다(도 8). 인슐린과 씨-펩타이드 효소면역화학측정법은 Sweden의 Mercodia 회사의 킷트를 사용하였으며, 사람의 인슐린과 씨-펩타이드가 코딩되어 있는 96-웰 플레이트에 농도가 알려진 표준용액과 위에서 얻은 배양액을 각각 25 ㎕씩 넣은 다음, 인슐린과 씨-펩타이드 항체를 넣어 1시간 반응시켰다. 이후, TMB 기질 용액을 넣고 30분 반응시킨 뒤 흡광도를 측정하여 인슐린과 씨-펩타이드의 양을 측정하였다. 그 결과, 분화를 유도하지 않은 세포에 비해 상기 실시예 8의 배양법을 사용하여 분화를 유도한 그룹에서 인슐린과 씨-펩타이드가 분비되었으며 NAG 군에 비해 인슐린은 약 6배, 씨-펩타이드는 약 6배의 양이 분비되었다.

도 1은 사람의 눈 피하지방 유래 줄기세포를 이용하여 3주 동안 인슐린분비세포로의 분화를 유도한 후의 세포의 모습이다.

도 2는 사람의 눈 피하지방 유래 줄기세포를 이용하여 3주 동안 인슐린분비세포로의 분화를 유도하고, 25 mM 포도당이 첨가된 배양액에 2시간 동안 노출시킨 후 이 배양액을 얻어 인슐린에 대한 효소면역화학측정을 시행한 그래프이다.

도 3은 사람의 눈 피하지방 유래 줄기세포를 이용하여 3주 동안 인슐린분비세포로의 분화를 유도하고, 25 mM 포도당이 첨가된 배양액에 2시간 동안 노출시킨 후 이 배양액을 얻어 씨-펩타이드에 대한 효소면역화학측정을 시행한 그래프이다.

도 4는 사람의 눈 피하지방 유래 줄기세포를 이용하여 3주 동안 인슐린분비세포로의 분화를 유도하고, 인슐린과 프로인슐린, CK19, 씨-펩타이드에 대한 항체를 사용하여 면역세포화학적인 방법으로 세포내 단백질의 존재 여부를 알아본 것이다.

도 5는 사람의 눈 피하지방 유래 줄기세포를 이용하여 3주 동안 인슐린분비세포로의 분화를 유도하고, 동 세포의 베타세포 특이 유전자 발현 양상을 살펴본 그림이다.

도 6은 사람의 눈 피하지방 유래 줄기세포를 이용하여 3주 동안 인슐린분비세포로의 분화를 유도하고, 인슐린을 분비하는 베타세포만을 선별적으로 염색하는 디티존 염색(Dithizone staining)을 시행한 것이다.

도 7은 사람의 눈 피하지방 유래 줄기세포를 이용하여 3주 동안 인슐린분비 세포로의 분화를 유도하고, 25 mM 포도당이 첨가된 배양액에 2시간 동안 노출시킨 후 이 배양액을 얻어 인슐린에 대한 효소면역화학측정을 시행한 그래프이다.

도 8은 사람의 눈 피하지방 유래 줄기세포를 이용하여 3주 동안 인슐린분비세포로의 분화를 유도하고, 25 mM 포도당이 첨가된 배양액에 2시간 동안 노출시킨 후 이 배양액을 얻어 씨-펩타이드에 대한 효소면역화학측정을 시행한 그래프이다.

<110> KONG, HUI SOOK <120> Method for the differentiation of human adult stem cells into insulin-secreting cells <160> 34 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH forward primer <400> 1 acaactttgg tatcgtggaa 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH reverse primer <400> 2 aaattcgttg tcataccagg 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> insulin forward primer <400> 3 aaccaacacc tgtgcggctc 20 <210> 4 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> insulin reverse primer <400> 4 aagggcttta ttccatctct ctcg 24 <210> 5 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ngn3 forward primer <400> 5 cgtgaactcc ttgaactgag cag 23 <210> 6 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ngn3 reverse primer <400> 6 tggcactcct gggacgagtt tc 22 <210> 7 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pdx1 forward primer <400> 7 cccatggatg aagtctacg 19 <210> 8 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pdx1 reverse primer <400> 8 gtcctcctcc tttttccac 19 <210> 9 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Glucokinase forward primer <400> 9 gaataccccc cagagacctt ttc 23 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Glucokinase reverse primer <400> 10 ggtttcttcc tgagccagcg 20 <210> 11 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Isl1 forward primer <400> 11 agcatcaatg tcctctcaac ttcc 24 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Isl1 reverse primer <400> 12 tgtttggcaa ggcaatgacc 20 <210> 13 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nkx6.1 forward primer <400> 13 acacgagacc cactttttcc g 21 <210> 14 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nkx6.1 reverse primer <400> 14 tgctggactt gtgcttcttc aac 23 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Glut 2 forward primer <400> 15 agctttgcag ttggtggaat 20 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Glut 2 reverse primer <400> 16 aataagaatg cccgtgacga 20 <210> 17 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ND forward primer <400> 17 cagaaccagg acatgccc 18 <210> 18 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ND reverse primer <400> 18 atcaaaggaa gggctggtg 19 <210> 19 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Glucagon forward primer <400> 19 atcaaaggaa gggctggtg 19 <210> 20 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Glucagon reverse primer <400> 20 gtaacgaacc gaccactt 18 <210> 21 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SST forward primer <400> 21 ggctgcgctg tccatcgtcc tg 22 <210> 22 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SST reverse primer <400> 22 ttgcgttctc ggggtgccat agc 23 <210> 23 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PP forward primer <400> 23 ctctgttact acagccactg 20 <210> 24 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PP reverse primer <400> 24 agtcgtagga gacagaaggt 20 <210> 25 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PC1/3 fprward primer <400> 25 ttggctgaaa gagaacggga tacatct 27 <210> 26 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PC1/3 reverse primer <400> 26 acttctttgg tgattgcttt ggcggtg 27 <210> 27 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PC2 forward primer <400> 27 gcatcaagca cagacctaca ctcg 24 <210> 28 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PC2 reverse primer <400> 28 gagacacaac cacccttcat ccttc 25 <210> 29 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GLUT1 forward primer <400> 29 ctcactgctc aagaagacat gg 22 <210> 30 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GLUT1 reverse primer <400> 30 ctgggtaaca gggatcaaac ag 22 <210> 31 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GLP-1R forward primer <400> 31 gttcccctgc tgtttgttgt 20 <210> 32 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GLP-1R reverse primer <400> 32 cttggcaagt ctgcatttga 20 <210> 33 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PAX4 forward primer <400> 33 cacctctctg cctgaggaca cggtgag 27 <210> 34 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PAX4 reverse primer <400> 34 ctgcctcatt ccaagccata cagtagtg 28

Claims

사람의 성체 줄기세포를 체외에서 인슐린 분비세포로 분화를 유도 시,

20 ~ 30 mM의 포도당 농도를 가지는 고포도당 배양액에 5 ~ 20%의 소태아혈청, 1 ~ 10 nM의 엑티빈 에이, 5 ~ 20 nM의 글루카곤 유사 펩타이드 및 10 ~ 30 ng/ml의 섬유아세포 성장인자-2를 첨가하여 4 ~ 10일 동안 1단계 배양한 후,

4 ~ 7 mM의 포도당 농도를 가지는 저포도당 배양액에 5 ~ 20%의 소태아혈청, 5 ~ 20 mM의 니코티나마이드, 1 ~ 10 nM의 엑티빈 에이, 5 ~ 20 nM의 글루카곤 유사 펩타이드 및 10 ~ 100 ng/ml의 인슐린유사 성장인자를 첨가하여 10 ~ 20 일 동안 2단계 배양하는 것을 특징으로 하는 인슐린 분비세포로의 분화 유도방법.
제 1 항에 있어서, 상기 인슐린유사 성장인자는 인슐린유사 성장인자-2인 것을 특징으로 하는 방법.
사람의 성체 줄기세포를 체외에서 인슐린 분비세포로 분화를 유도 시

20 ~ 30 mM의 포도당 농도를 가지는 고포도당 배양액에 B27 보충제, 10 ~ 30 ng/ml의 섬유아세포 성장인자-2, 10 ~ 30 ng/ml의 상피세포 성장인자를 첨가하여 1 ~ 7일 배양한 후, 동일한 포도당 농도에 5 ~ 20%의 소태아혈청, 1 ~ 10 nM의 엑 티빈 에이, 5 ~ 20 nM의 글루카곤 유사 펩타이드 및 10 ~ 30 ng/ml의 섬유아세포 성장인자-2를 첨가하여 1 ~ 7일 동안 배양하는 단계;

4 ~ 7 mM의 포도당 농도를 가지는 저포도당 배양액에 5 ~ 20%의 소태아혈청, 1 ~ 10 nM의 엑티빈 에이, 5 ~ 20 nM의 글루카곤 유사 펩타이드 및 10 ~ 30 ng/ml의 섬유아세포 성장인자-2를 첨가하여 1 ~ 7일 동안 배양한 뒤, 동일한 포도당 농도의 배양액에 5 ~ 20%의 소태아혈청, 5 ~ 20 mM의 니코티나마이드, 1 ~ 10 ng/ml 의 베타셀룰린, 5 ~ 15 nM의 글루카곤 유사 펩타이드를 첨가하여 10 ~ 20 일 동안 배양하는 것을 특징으로 하는 방법.