KR100895324B1

KR100895324B1 - 성체 줄기세포를 이용한 인슐린 분비세포로의 분화유도방법

Info

Publication number: KR100895324B1
Application number: KR1020070044663A
Authority: KR
Inventors: 김해권; 강현미
Original assignee: 주식회사 휴림바이오셀; 김해권
Priority date: 2007-05-08
Filing date: 2007-05-08
Publication date: 2009-05-07
Also published as: KR20080099052A

Abstract

본 발명은 성체 줄기세포를 이용한 인슐린 분비세포로의 분화 유도방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 안면 피하 지방조직 유래 줄기세포(Facial adipose-derived stem cells) 또는 양막 유래 줄기세포(Amniotic membrane-derived stem cells)를 체외에서 인슐린 분비세포로 분화를 유도하되, 세포배양 방법을 2단계로 나누어서 1단계에서는 배양액 내 포도당의 농도를 고농도로 처리하고 2단계에서는 저농도로 처리하며, 배양액에 니코티나마이드(Nicotinamide), 글루카곤 유사 펩타이드(Glucagon-like peptide 1), 액티빈 에이(Activin A) 등의 싸이토카인(Cytokine)을 첨가함으로써 제1형 당뇨병 치료를 위한 인슐린 분비세포로 분화시키는 방법에 관한 것이다.

따라서, 본 발명은 안면 피하 지방조직 또는 양막 유래 줄기세포가 체외에서 기능적으로 효율이 높은 인슐린분비세포로 분화되어 장차 제1형 당뇨병(Type 1 diabetes mellitus)의 세포치료제(Therapeutic cells)로서 매우 유용하다.

안면 피하 지방조직, 양막, 인슐린 분비세포, 배양액 조성, 2단계 배양법

Description

성체 줄기세포를 이용한 인슐린 분비세포로의 분화 유도방법{Method for the differentiation of human adult stem cells into insulin-secreting cells}

도 1은 눈 밑 피하지방으로부터 줄기세포(Eyelid adipose-derived stem cells)를 분리하여 3주 동안 인슐린 분비세포로의 분화를 유도한 후의 세포의 모습이다.

도 2는 안면 뺨 부위의 피하지방조직으로부터 줄기세포(Cheek adipose-derived stem cells)를 분리하여 3주 동안 인슐린 분비세포로의 분화를 유도한 후의 세포의 모습이다.

도 3은 눈 밑 피하지방 유래 줄기세포를 3주 동안 인슐린 분비세포로 분화시킨 후, 25 mM 포도당이 첨가된 배양액에 2시간 동안 노출시켜 얻은 배양액 내의 인슐린에 대한 효소면역측정(Enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)을 시행한 그래프이다.

도 4는 눈 밑 피하지방 유래 줄기세포를 3주 동안 인슐린 분비세포로 분화시킨 후, 25 mM 포도당이 첨가된 배양액에 2시간 동안 노출시켜 얻은 배양액 내의 씨-펩타이드에 대한 효소면역측정을 시행한 그래프이다.

도 5는 뺨 부위 피하지방 유래 줄기세포를 인슐린 분비세포로 분화시킨 후 디엠이엠 고포도당 배양액에 2시간 동안 노출시켜 얻은 배양액 내의 인슐린에 대한 효소면역측정을 시행한 그래프이다.

도 6은 뺨 부위 피하지방 유래 줄기세포를 인슐린 분비세포로 분화시킨 후 디엠이엠 고포도당 배양액에 2시간 동안 노출시켜 얻은 배양액 내의 씨-펩타이드에 대한 효소면역측정을 시행한 그래프이다.

도 7은 사람의 양막조직 유래 줄기세포를 인슐린 분비세포로 분화시킨 후 디엠이엠 고포도당 배양액에 2시간 동안 노출시켜 얻은 배양액 내의 인슐린에 대한 효소면역측정을 시행한 그래프이다.

도 8은 양막조직 유래 줄기세포를 3주 동안 인슐린 분비세포로 분화시킨 후, 디엠이엠 고포도당 배양액에 2시간 동안 노출시켜 얻은 배양액 내의 씨-펩타이드(C-peptide)에 대한 효소면역측정을 시행한 그래프이다.

도 9는 눈 밑 피하지방 유래 줄기세포를 3주 동안 인슐린 분비세포로 분화시킨 후, 인슐린과 프로 인슐린, 싸이토케라틴19(CK19)에 대한 항체를 사용하여 면역세포화학염색법(Immunocytochemistry)으로 인슐린 분비세포 특이 단백질의 발현 여부를 알아본 것이다.

도 10은 양막조직 유래 줄기세포를 3주 동안 인슐린 분비세포로 분화시킨 후 인슐린과 프로인슐린(Proinsulin)에 대한 항체를 이용하여 면역세포화학염색법으로 단백질의 존재 여부를 알아본 것이다.

도 11은 눈 밑 피하지방 유래 줄기세포를 3주 동안 인슐린 분비세포로 분화시킨 후, 동 세포의 인슐린 분비세포 특유의 유전자 발현 양상을 역전사-중합효소 연쇄 반응 (Reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR)으로 조사한 결과를 나타낸 그림이다.

도 12는 눈 밑 피하지방 유래 줄기세포를 3주 동안 인슐린 분비세포로 분화시킨 후 인슐린 분비세포만을 선별적으로 염색하는 디티존 염색(dithizone staining)을 시행한 것이다.

도 13은 눈 밑 피하지방 유래 줄기세포 또는 동 세포를 3주 동안 인슐린 분비세포로 분화시킨 것을 각각 당뇨 쥐에 이식한 후 당뇨 쥐의 생존율을 비교한 표이다.

도 14는 눈 밑 피하지방 유래 줄기세포 또는 동 세포를 3주 동안 인슐린 분비세포로 분화시킨 것을 각각 당뇨 쥐에 이식한 후 당뇨 쥐의 혈당 변화를 비교한 표이다.

도 15는 눈 밑 피하지방 유래 줄기세포 또는 동 세포를 3주 동안 인슐린 분비세포로 분화시킨 것을 각각 당뇨 쥐에 이식한 후 당뇨 쥐의 몸무게 변화를 비교한 표이다.

도 16은 눈 밑 피하지방 유래 줄기세포를 또는 동 세포를 3주 동안 인슐린 분비세포로 분화시킨 것을 각각 당뇨 쥐에 이식한 후 당뇨 쥐의 물의 흡수량을 비교한 표이다.

도 17은 정상 생쥐와 인슐린 분비세포를 이식받은 후 정상 혈당으로 돌아온 당뇨 쥐의 당부하검사(Glucose tolerance test, GTT) 결과를 나타낸 그래프이다.

도 18은 정상 생쥐와 인슐린 분비세포를 이식받은 후 혈당이 정상으로 돌아 온 당뇨 쥐의 혈액 내 사람의 인슐린 단백질의 농도를 효소면역측정법으로 분석한 그래프이다.

도 19는 정상 쥐와 인슐린 분비세포를 이식받은 후 혈당이 정상으로 돌아온 당뇨 쥐의 혈액 내 사람의 씨-펩타이드의 농도를 효소면역측정법으로 분석한 그래프이다.

2000년 현재 전 세계적으로 약 1억 5천만 명의 당뇨병환자가 있으며 이들의 수는 매년 증가하여 2025년에는 환자의 수가 약 3억 명에 달할 것으로 예견되고 있 다[Zimmet P, Alberti KG, Shaw J (2001) Global and societal implications of the diabetes epidemic. Nature 414, 782-787]. 이중 약 5%는 제1형 당뇨병(Type 1 diabetes mellitus)인 인슐린 의존적(Insulin-dependent) 당뇨병으로서, 인슐린을 분비하는 췌장의 베타세포(β-cell)가 자가면역 반응에 의해 파괴되어 유래되는 질병(Autoimmune disease)이다. 췌장 조직의 약 1%를 차지하는 내분비 조직세포 가운데 약 60 ~ 80%는 인슐린을 분비하는 베타세포로서 여기서 생산된 인슐린은 우리 몸에서 혈액 내에 있는 당의 항상성을 유지시켜 주는 작용을 한다. 만일 인슐린이 생산되지 못할 경우, 혈액 내 당의 농도가 높아지게 되고 신장 등과 같은 여러 장기의 기능을 손상시키는 증세는 물론 때로는 생명에 위협을 주는 합병증을 유발할 수 있다. 제1형 당뇨병의 치료는 지속적으로 인슐린 주사를 맞거나 다른 사람의 췌장을 이식받는 등의 방법이 있으나, 전자의 경우 근본적인 치료방법이 될 수 없고 평생 주사를 맞아야 하는 고통이 따르며, 그 효과 역시 지속적이지 않다. 또한, 후자의 경우도 타인의 췌장을 이식 받고자 하는 환자의 수가 기증자 수에 비해 너무 많고 면역학적인 조직적합성 여부를 고려할 때 혜택을 받을 수 있는 환자의 수는 극히 제한이다. 따라서, 이러한 제한점을 극복할 수 있는 새로운 시술 방법의 개발이 매우 절실하다.

최근 많은 사람들이 줄기세포를 이용한 당뇨질환의 치료법 개발에 중점을 두고 있으며, 세포치료제로 사용가능한 대표적인 줄기세포로는 배아 줄기세포(Embryonic stem cells, ESC), 태아 줄기세포(fetal stem cells FSC), 성체 줄기세포(Adult stem cells, ASC)를 들 수 있다.

이 중 사람의 배아 줄기세포를 이용하여 인슐린을 분비하는 세포로 분화를 시킨 예로는 Soria 등[Soria B, Roche E, Berna G and Leon-Quinto T (2000) Insulin-secreting cells derived from embryonic stem cells normalize glycemia in streptozotocin-induced diabetic mice. Diabetes 49, 157-162], Assady 등[Assady S, Maor G, Amit M, Itskovitz-Eldor J, Skorecki KL, and Tzukerman M. (2001) Insulin production by human embryonic stem cells. Diabetes 50, 1691-1707], Fujikawa 등[Fujikawa T, Oh SH, Pi L, Hatch HM, Shupe T, and Petersen BE (2005) Teratoma formation leads to failure of treatment for type I diabetes using embryonic stem cell-derived insulin-producing cells. Am J Pathol 166, 1781-1791]이 있으며 이렇게 체외에서 분화시킨 세포를 당뇨를 유발한 동물 모델에 이식하면, 혈당이 정상으로 회복된다(Soria et al., 2000; Fujikawa et al., 2005). 그러나, 배아 줄기세포(Fujikawa et al., 2005)와 태아줄기세포[Hagell P, and Brundin P (2001) Cell survival and clinical outcome following intrastriatal transplantation in Parkinson disease. J Neuropathol Exp Neurol 60, 741-752]는 체내 이식 후 암을 유발할 가능성과 윤리적 문제로 인해 현재는 사용이 거의 불가능하다. 이와는 달리 성체 줄기세포는 발암의 가능성이 없으며 윤리적 문제를 일으키지 않으므로 가장 적절한 세포 치료제라 할 수 있다.

사람의 성체 줄기세포 및 전구세포를 이용하여 체외에서 인슐린 분비세포로의 분화를 시도한 예를 다음 표 1에 나타내었다.

[표 1]

지방 유래 줄기세포 및 여러 가지 조직 유래 전구세포를 이용한 인슐린 분비세포로의 체외분화 연구

세포 종류	배양액 내 인슐린 첨가여부	분석방법	인슐린 분석	참고문헌
태아 간 유래 전구세포	+	RT-PCR ELISA	5 ng/10⁶cells	Zalzman et al., 2003 ¹⁾
췌장 유래 세포	+	RT-PCR ELISA	16 ng/2x10⁵ cells	Gao et al., 2003 ²⁾
간 유래 전구세포	+	RT-PCR RIA ICC	0.25 pmol/ug DNA	Nakajima-Nagata et al., 2004 ³⁾
신경전구세포	+	RT-PCR ICC RIA	2 ng/ml/50 IPCs	Hori et al., 2005 ⁴⁾
췌장 유래 세포	-	RT-PCR ICC		Zhao et al., 2005 ⁵⁾
췌장섬 유래 중간엽 줄기세포	-	ICC IHC		Eberhardt et al., 2006 ⁶⁾
지방 유래 중간엽 줄기세포	-	RT-PCR ICC		Timber et al., 2006 ⁷⁾
태아 췌장 세포	-	RIA	3.6 pg/mg DNA	Otonkoski et al., 1993 ⁸⁾
췌장섬 유래 전구세포	-	RT-PCR ICC RIA	220 pg/ml	Abraham, 2002 ⁹⁾
말초혈액 유래 단핵세포	-	RIA	120 pg/mg protein	Ruhnke et al. 2005 ¹⁰⁾
RT-PCR, reverse transcription-polymerase chain reaction, 역전사-중합효소 연쇄 반응; ICC, immunocytochemistry, 면역세포화학염색법; IHC, immunohistochemistry, 면역조직화학염색법; RIA, radioimmuno assay, 방사면역측정법.

1) Zalzman M, Gupta S, Giri RK, Berkovich I, Sappal BS, Karnieli O, Zern MA, Fleischer N, and Efrat S (2003) Reversal of hyperglycemia in mice by using human expandable insulin-producing cells differentiated from fetal liver progenitor cells. Proc Natl Acad Sci USA 100(12):7253-7258.

2) Gao R, Ustinov J, Pulkkinen MA, Lundin K, Korsgren O, Otonkoski T (2003) Characterization of endocrine progenitor cells and critical factors for their differentiation in human adult pancreatic cell culture. Diabetes 52, 2007-2015.

3) Nakajima-Nagata N, Sakurai T, Mitaka T, Katakai T, Yamato E, Miyazaki J, Tabata Y, Sugai M, and Shimizu A (2004) In vitro induction of adult hepatic progenitor cells into insulin-producing cells. Biochem Biophys Res Commun. 318, 625-630.

4) Hori Y, Gu X, Xie X, and Kim SK (2005) Differentiation of insulin-producing cells form human neural progenitor cells. PLOS Med 2(4), e103

5) Zhao M, Amiel SA, christie MR, Rela M, Haeton N and Huang GC (2005) Inulin-producing cells derived from human pancreatic non-endocrine cell cultures reverse streptozotocin-induced hyperglycaemia in mice. Diabetologia 48, 2051-2061

6) Eberhardt M, Salmon P, von Mach MA, Hengstler JG, Brulport M, Linscheid P, Seboek D, Oberholzer J, Barbero A, Martin I, Muller B, Trono D, and Zulewski H (2006) Multipotential nestin and Isl-1 positive mesenchymal stem cells isolated from human pancreatic islets. Biochem Biophys Res Commun 345, 1167-1176.

7) Timber K, Seboek D, Eberhardt M, Linscheid P, Christ-Crain M, Keller U, Muller B, and Zulewski H (2006) Human adipose tissue-derived mesenchymal stem cells differentiate into insulin, somatostatin, and glucagon expressing cells. Biochem Biophys Res Commun 341, 1135-1140.

8) Otonkoski T, Beattie GM, Mally MI, Ricordi C, Hayek A. Related Articles, Links (1993) Nicotinamide is a potent inducer of endocrine differentiation in cultured human fetal pancreatic cells. J Clin Invest 92, 1459-1466.

9) Abraham EJ, Leech CA, Lin JC, Zulewski H, and Habener JF. (2002) Insulinotropic hormone glucagon-like peptide-1 differentiation of human pancreatic islet-derived progenitor cells into insulin-producing cells. Endocrinology 143, 3152-3161.

10) Ruhnke M, Ungefroren H, Nussler A, Martin F, Brulport M, Schormann W, Hengstler JG, Klapper W, Ulrichs K, Hutchinson JA, Soria B, Parwaresch RM, Heeckt P, Kremer B, and Fandrich F (20005) Differentiation of in vitro-modified human peripheral blood monocytes into hepatocyte-like and pancreatic islet-like cells. Gastroenterology 128, 1774-1786.

이 중 Zalzman 등 (2003), Gao 등 (2003), Nakajima-Nagata 등 (2004), Hori 등 (2005)의 방법은 인슐린 분비세포로의 분화 유도 시 배양액에 인슐린을 첨가하는 것이다. 그러나, 인슐린이 이미 포함되어 있는 배양액에서 분화한 인슐린분비세포들의 경우, 정상적인 인슐린 분비 시에 나타나는 씨-펩타이드를 분비하지 않으므로 인슐린분비세포로 분화한 것으로 보기 어렵다(Rajagopal et al., 2003; Hansson et al., 2004). 이와는 달리 Zhao 등 (2005), Timber 등 (2006), Eberhardt 등 (2006)은 배양액에 인슐린을 넣지 않고 인슐린 분비세포로 분화시켰다고 주장하고 있으나 인슐린 분비세포로의 분화를 입증하는데 가장 중요한 지표인 인슐린의 분비 여부는 물론이고 씨-펩타이드의 분비 여부 등을 조사하지 않아 주장의 신뢰성이 없다.

한편, Otonkoski 등 (1993)은 사람 태아의 췌장조직으로부터 태아 줄기세포를 추출하여 이를 체외에서 인슐린 분비세포로 분화시키고 이들로부터 인슐린이 분비되는 것을 방사면역측정법으로 측정한 바 있으나 상기한 것처럼 태아조직 유래 줄기세포는 세포치료제로서는 부적합하다.

현재까지 사람의 성체 줄기세포를 체외에서 인슐린 분비세포로 분화시킨 예는 말초혈액유래 줄기세포를 이용한 Ruhnke 등 (2005)이 있으며 이들은 방사면역측정법(Radioimmuno assay, RIA)을 사용하여 배양액 내로 분비된 인슐린의 양을 측정한 바 있다.

한편, 체외에서 인슐린 분비세포로 분화시킨 세포들의 궁극적인 목표는 사람의 당뇨질환을 치료하기 위한 것이 목적이다. 따라서, 이들 세포의 효용성은 반드시 당뇨질환 동물을 대상으로 하여 치료효과가 입증되어야 한다.

사람의 성체 줄기세포를 당뇨를 유발시킨 동물의 체내에 이식하여 세포치료효과가 성공적으로 이루어진 예를 다음 표 2에 나타내었다.

[표 2]

미분화 줄기세포 및 분화 줄기세포를 당뇨쥐 동물 모델의 세포치료제로 이용한 예

세포 종류	분화 검증	세포 이식 방법	생체 검사	참고문헌
태아 췌장 세포	미분화	NOD-SCID mice, 2000 cell aggregates, IP 이식 70일 간 관찰	혈당측정	Wu et al., 2004 ¹⁾
제대혈 유래 단핵세포	미분화	NOD mice, 1x10⁷ cells IP 이식	IHC	Yosida et al., 2005 ²⁾
말초혈액 단핵세포	RIA	OF1 mice, 5x10⁶ cells 신장캡슐 이식 10일 후 검사	IHC	Ruhnke et al., 2005 ³⁾
췌장유래 세포	RT-PCR IHC	SCID mice, 2.5x10⁶ cells 신장캡슐이식 7일~43일 간 관찰	혈당측정 GTT IHC	Zhao et al., 2005 ⁴⁾
태아 췌장 세포	IHC RIA RT-PCR	Nude BALB/C mice, 500 ICCs 신장캡슐이식 3달 후 검사	혈당측정 GTT ELISA (씨-펩타이드)	Otonkoski et al., 1993 ⁵⁾
신경전구 세포	RT-PCR IHC RIA	NOD-SCID mice, 500 IPCs 신장캡슐이식 4주 후 관찰	GTT ELISA (씨-펩타이드) IHC	Hori et al., 2005 ⁶⁾
RT-PCR, reverse transcription-polymerase chain reaction, 역전사-중합효소 연쇄 반응; ICC, immunocytochemistry, 면역세포화학염색법; IHC, immunohistochemistry, 면역조직화학염색법; RIA, radioimmuno assay, 방사면역측정법; GTT, glucose tolerance test, 당부하검사; ELISA, enzyme-linked immunosorbent assay, 효소면역측정법.

1) Wu F, Jagir M, Powell JS. (2004) Long-term correction of hyperglycemia in diabetic mice after implantation of cultured human cells derived from fetal pancreas. Pancreas 29, e23-29.

2) Yoshida S, Ishikawa F, Kawano N, Shimoda K, Nagafuchi S, Shimoda S, Yasukawa M, Kanemaru T, Ishibashi H, Shultz LD, and Harada M (2005) Human cord blood--derived cells generate insulin-producing cells in vivo. Stem Cells 23, 1409-1416.

3) Ruhnke M, Ungefroren H, Nussler A, Martin F, Brulport M, Schormann W, Hengstler JG, Klapper W, Ulrichs K, Hutchinson JA, Soria B, Parwaresch RM, Heeckt P, Kremer B, and Fandrich F (2005) Differentiation of in vitro- modified human peripheral blood monocytes into hepatocyte-like and pancreatic islet-like cells. Gastroenterology 128, 1774-1786.

4) Zhao M, Amiel SA, christie MR, Rela M, Haeton N and Huang GC (2005) Inulin-producing cells derived from human pancreatic non-endocrine cell cultures reverse streptozotocin-induced hyperglycaemia in mice. Diabetologia 48, 2051-2061

5) Otonkoski T, Beattie GM, Mally MI, Ricordi C, Hayek A. Related Articles, Links (1993) Nicotinamide is a potent inducer of endocrine differentiation in cultured human fetal pancreatic cells. J Clin Invest 92, 1459-1466.

6) Hori Y, Gu X, Xie X, and Kim SK (2005) Differentiation of insulin-producing cells form human neural progenitor cells. PLOS Med 2(4), e103

이 중 Wu 등 (2004)과 Yoshida 등 (2005)은 태아의 췌장조직으로부터 세포를 추출하여 당뇨 생쥐에 이식한 후, 혈당조사를 통해 당뇨질환으로부터 회복된 것을 관찰하고 나아가서 면역조직화학염색법을 사용하여 이식한 세포들이 생쥐의 체내에서 인슐린 분비세포로 분화하였다고 주장하고 있으나 가장 중요한 지표인 생쥐혈액 내 사람의 인슐린과 씨-펩타이드의 존재 여부가 검증되지 않아 효과를 알 수 없다. 또한, Ruhnke 등 (2005)과 Zhao 등 (2005)은 체외에서 인슐린 분비세포로 분화시킨 것을 생쥐의 체내에 이식하였으나 이들의 경우에도 생쥐혈액 내 사람의 인슐린과 씨-펩타이드의 존재 여부가 입증되지 않아 신뢰성이 없다.

반면에 Otonkoski 등 (1993)과 Hori 등 (2005)은 분화시킨 세포를 이식하고 효소면역측정법을 통하여 생쥐혈액 내의 사람의 인슐린과 씨-펩타이드의 분비량을 조사하였다. 그러나, 이들이 사용한 세포는 각각 태아 췌장유래 세포 및 신경전구세포주로서 전술한 바와 같은 발암성 및 윤리적 문제 등의 이유로 현실적으로 세포치료제로 사용하기에는 부적합하다.

이처럼 현재까지의 연구 결과들을 종합해 볼 때, 우선 사람의 성체줄기세포를 인슐린과 씨-펩타이드 모두를 체외에서 분비하는 인슐린 분비세포로 분화시킨 예는 거의 없으며, 나아가서 이러한 세포를 당뇨 쥐와 같은 실험동물의 체내에 이식시켜 당뇨의 회복은 물론이고 동물의 혈액 내에 사람의 인슐린과 씨-펩타이드가 모두 분비되는 것을 확인한 연구 결과는 없다.

이에, 본 발명자들은 배아 줄기세포의 윤리적인 문제를 극복할 수 있는 성체줄기세포를 이용하여 제1형 당뇨병을 치료할 수 있는 세포 치료제(Therapeutic cell)를 개발하기 위하여, 분화를 유도할 때는 종전의 많은 연구에서 문제가 되고 있는 배양액에 인슐린을 첨가하는 방법을 사용하지 않고, 포도당 농도를 다르게 순차적으로 처리하고 분화에 효과적이라고 알려진 여러 가지 싸이토카인을 함께 처리함으로써 인슐린 분비세포로의 분화를 유도하는 방법을 개발하고 분화 유도한 세포를 당뇨를 유발한 동물 모델에 주입하여 이 세포가 실제로 생체 내에서도 기능을 발휘함을 확인함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 성체 줄기세포인 사람의 안면 피하 지방조직 또는 양막조직에서 유래한 줄기세포를 이용하여 인슐린 분비세포로의 분화 유도방법을 제공하는데 그 목적이 있다.

본 발명은 사람의 안면 피하 지방조직 또는 양막 조직으로부터 분리해 낸 줄기세포를 체외에서 인슐린 분비세포로 분화시키는 방법에 관한 것이다.

이와 같은 본 발명의 구성을 더욱 상세하게 설명하면 다음과 같다.

본 발명은 안면 피하 지방조직 유래 줄기세포(Facial adipose-derived stem cells) 또는 양막 유래 줄기세포(Amniotic membrane-derived stem cells)를 체외에서 인슐린 분비세포로 분화를 유도하되, 세포배양 방법을 2단계로 나누어서 1단계에서는 배양액 내 포도당의 농도를 고농도로 처리하고 2단계에서는 저농도로 처리하며, 배양액에 니코티나마이드(Nicotinamide), 글루카곤 유사 펩타이드(Glucagon-like peptide 1), 액티빈 에이(Activin A) 등의 싸이토카인(Cytokine)을 첨가함으로써 제1형 당뇨병 치료를 위한 인슐린 분비세포로 분화시키는 방법에 관한 것이다.

상기 성체 줄기세포는 안면 피하 지방조직 또는 양막조직으로부터 분리된 것이 바람직하다. 또한, 상기 안면 피하 지방 조직은 눈 밑 피하 조직, 뺨 부위 조직 또는 기타 안면 피하 지방 조직을 의미한다.

본 발명은 인간의 성체 줄기세포를 체외에서 인슐린 분비세포로 분화를 유도 시,

배양액 내 포도당을 20 ~ 30 mM의 고농도로 하여 5 ~ 10일 동안 세포를 배양하고, 포도당을 4 ~ 7 mM의 저농도로 하여 10 ~ 20일 동안 세포를 배양하는 2단계 로 인슐린 분비세포로의 분화 유도방법을 특징으로 한다.

이때, 배양액으로는 디엠이엠(Dulbecco's modified Eagle's medium, DMEM), 아이엠디엠(Iscove's modified Dulbecco's media, IMDM), 알피엠아이1640(RPMI1640), 알파엠이엠(a-Minimum essential media, a-MEM), 햄 에프12 (HAM's F12) 및 199 배양액(Media 199) 중에서 선택된 1종 또는 2종 이상이 바람직하다.

상기 배양액에 첨가하는 소태아혈청 또는 제대혈혈청 또는 사람의 혈청 또는 혈청대체물의 농도는 5 ~ 20%가 적당하다.

상기 배양액에 첨가하는 니코티나마이드의 농도는 5 ~ 20 mM, 글루카곤 유사 펩타이드의 농도는 5 ~ 20 nM, 액티빈 에이의 농도는 1 ~ 10 nM이 적당하며 특히 두 가지 이상의 싸이토카인을 혼합하여 사용하는 것이 더욱 효과적이다.

줄기세포의 배양은 콜라겐이 도포되어 있는 배양접시를 사용하는 것이 적당하다.

줄기세포를 인슐린 분비세포로 분화를 유도할 때는 다음과 같은 2단계 배양법을 사용한다.

1단계로서 20 ~ 30 mM의 고농도 포도당 배양액에 소태아혈청과 2종 이상의 싸이토카인을 첨가하여 세포를 4 ~ 10일 동안 배양하는 단계 및

2단계로서 4 ~ 7 mM의 저농도 포도당 배양액에 소태아혈청과 2종 이상의 싸이토카인을 첨가하여 세포를 10 ~ 20일 동안 배양하는 단계를 포함한다.

본 발명에 따른 인슐린분비세포의 분화 유도 과정을 상세히 설명하면 다음과 같다.

1. 먼저, 안면 피하 지방조직 또는 양막조직으로부터 각각의 줄기세포를 분리한다.

2. 분리된 세포들이 줄기세포로서의 특성을 나타내는 지를 조사한다. 즉, 12회 이상의 계대배양을 통한 세포의 증식 여부, 줄기세포 특유의 유전자 발현 여부, 줄기세포 특유의 단백질 발현 여부, 다분화능(Multipotency) 여부 등을 조사한다.

3. 위 2항에서 얻은 줄기세포를 전술한 바와 같은 2단계 배양법으로 배양함으로써 체외에서 인슐린분비세포로 분화시킨다,

4. 위 3항에서 분화한 세포를 수거하여 효소면역측정법를 통해 인슐린과 씨-펩타이드의 분비량을 측정한다.

5. 위 3항에서 분화한 세포를 수거하여 면역세포화학염색법을 통해 인슐린 단백질과 프로인슐린 단백질의 발현 여부를 조사한다.

6. 위 3항에서 분화한 세포를 수거하여 역전사-중합효소 연쇄 반응을 통해 췌장의 인슐린 분비세포 특이 유전자들의 발현 여부를 조사한다.

7. 위 3항에서 분화한 세포를 수거하여 디티존 염색법으로 인슐린 분비세포 로의 분화 여부를 조사한다.

8. 위 3항에서 분화한 세포를 수거하여 스트렙토조토신으로 당뇨가 유발된 생쥐의 체내에 이식하여 동 생쥐의 당뇨 치료효과 여부를 조사한다.

9. 위 8항에서 세포를 이식받은 생쥐의 혈액을 채취하여 효소면역측정법을 통해 쥐의 혈청 내 사람의 인슐린과 씨-펩타이드의 존재 여부 및 농도를 조사한다.

비록 현재까지 많은 종류의 사람 조직세포들이 당뇨 쥐의 당뇨질환을 치료할 수 있는 것으로 주장되어 왔으나 궁극적으로 당뇨질환으로부터 회복된 당뇨 쥐의 혈액 내에서 사람의 인슐린 및 씨-펩타이드가 검출된 예는 없다. 다만 Otonkoski 등 (1993)은 사람 태아의 췌장세포를 그리고 Hori 등 (2005)은 사람의 신경구 암세포주를 체외에서 인슐린분비세포로 분화시킨 후 당뇨 쥐에 이식하고 생쥐혈액 내의 사람의 씨-펩타이드의 분비량을 조사한 바 있다. 비록 이들이 사용한 세포는 전술한 바와 같이 발암성 및 윤리적 문제 등의 이유로 현실적으로 세포치료제로 사용하기에는 부적합하지만 태아의 췌장세포의 경우 2.24 ng/ml 그리고 신경구 암세포주의 경우 32 pg/ml의 씨-펩타이드 단백질이 생쥐 혈액에서 검출되었다. 이에 대해 본 발명에서는 사람의 성체 줄기세포를 분화시켜 이식한 후 생쥐혈액 내에 142 pg/ml의 씨-펩타이드 단백질은 물론이고 나아가서 129 pg/ml의 사람 인슐린 단백질이 생쥐 혈액에서 검출되었다.

이와 같은 발명의 성과로 미루어 보건대 본 발명에서 제시한 배양 방법은 세포치료제로 사용가능한 성체 줄기세포를 체외에서 인슐린 분비세포로 분화시킬 때 매우 효과적인 방법이 될 것이다.

이하, 다음 실시예를 들어 본 발명을 상세히 기술할 것이나 본 발명의 범위를 이들 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 줄기세포의 분리 및 배양

본 발명에서 사용하는 양막조직 유래 유사중간엽 줄기세포는 분만 시 버려지는 인간의 태반 조직에서 얻은 것으로 먼저 양막을 분리한 후 100 unit/ml 페니실린(Penicillin), 100 mg/ml 스트렙토마이신(Streptomycin)이 첨가된 동량의 인산염식염수(Dulbecco's phosphate-buffered saline)로 서너 번 세척하여 혈액을 제거하였다. 양막조직을 0.25% 트립신(Trypsin) 용액 50 ml에 넣어 잘게 잘라서 37 ℃에서 30분간 반응시킨 후 실온에서 5분간 300 g로 원심분리한 후 양막조직세포의 침전층을 얻었다. 이 같은 과정을 세 번 되풀이하여 양막조직으로부터 양막상피세포(Amniotic epithelial cells)를 제거하였다. 상피세포가 제거된 양막조직에 2 mg/ml 콜라게나제 에이(Collagenase A)와 0.05 mg/ml 핵산분해효소(DNase) 혼합액 50 ml을 처리하여 37 ℃에서 2시간동안 반응시켰다. 그런 후 혼합물을 실온에서 5분간 300 g로 원심분리한 후 세포침전층을 얻어 계대배양을 실시하였다.

눈 밑 또는 뺨 피하 지방조직 유래 줄기세포는 외과 수술 후 버려지는 지방조직에서 얻어진 것으로, 지방조직을 15 ml 코니칼 시험관(conical tube)에 넣고 여기에 0.075% 타입 1 콜라게나제(Collagenase type 1), 100 unit/ml 페니실린 (Penicillin), 100 mg/ml 스트렙토마이신(Streptomycin)이 첨가된 동량의 인산염식염수(Dulbecco's phosphate-buffered saline, PBS)를 넣고 37 ℃에서 30분간 흔들어 주었다. 이 후 동량의 증식배양액을 첨가하여 10 ℃ 혹은 실온에서 5분간 300 g로 원심분리한 후 상층액은 버리고 세포침전층을 얻었다. 여기에 50배 부피의 디엠이엠 저포도당 배양액(포도당 5.5 mM)을 첨가하여 위와 같은 원심분리방법으로 두 번에 걸쳐서 세척한 후 얻어진 세포를 계대 배양하였다.

계대배양은 다음과 같이 실시하였다.

먼저, 얻어진 세포침전물을 5 ml의 증식배양액, 즉 10% 소태아혈청이 첨가된 디엠이엠 저포도당 배양액(포도당 5.5 mM)과 함께 25 cm² size의 플라스틱 배양접시(Nunc, USA)에 넣고 5% CO₂가 공급되는 37 ℃ 배양기에서 2 ~ 3주 동안 배양하되 배양액은 1주일에 두 번 새 것으로 교체하였다. 배양한지 2 ~ 3주 후 세포가 접시 바닥의 70%를 채울 때 일차 계대배양을 실시하되 먼저 배양접시 내의 배양액을 버리고 기본배양액으로 한번 세척하였다. 그런 후 0.125% 트립신(trypsin)과 1 mM 이디티에이(ethylenediaminetetraacetic acid, EDTA)가 첨가된 3 ml의 행크스평형 식염수(Hank's balanced salt solution, HBSS)를 넣고 37 ℃ 배양기에서 3분 동안 방치한 후 동량의 증식배양액을 첨가하였다. 이를 15 ml 코니칼 시험관에 옮기고 5분간 300 g로 원심분리한 후 상층액을 버리고 세포침전층을 얻었다. 그런 후 50배의 기본배양액을 첨가하고 10 ℃에서 5분간 300 g로 원심분리한 후 상층액을 버리고 세포침전층을 얻는 방법으로 세척하며 이 과정을 두 번 반복하였다. 얻어진 세포를 15 ml의 증식배양액이 들어 있는 75 cm² size의 플라스틱 배양접시(Nunc, USA)에 3 x 10⁵ 개의 세포를 넣고 5%의 이산화탄소가 공급되는 37 ℃ 배양기에서 배양하며 1주일에 한 번씩 계대 배양을 실시하였다.

상기 연구 결과, 안면피하 지방조직 및 양막조직으로부터 각각 15회 이상의 계대배양이 성공적으로 이루어진 성체 줄기세포들을 얻을 수 있었으며 인슐린세포로의 분화 연구에는 3회 이상의 계대배양이 실시된 세포들을 사용하였다.

실시예 2: 줄기세포의 인슐린분비세포로의 분화 유도

상기 실시예 1에서 얻어진 각각의 줄기세포를 1단계 7일 및 2단계 14일의 2단계로 나누어 총 21일 동안 분화유도 배양액에서 배양을 실시하였다.

눈 밑과 뺨의 피하 지방조직 유래 줄기세포의 경우, 1단계에서는 15 ㎍/cm² 콜라겐(Collagen)으로 도포되어 있는 48-웰 배양접시(Nunc, USA)에 5x10³ cells/well의 농도로 세포를 배양하되 10% 소태아혈청이 첨가된 디엠이엠 고포도당 배양액(포도당 25 mM)에 10 mM 니코티나마이드와 4 nM 액티빈 에이(NA) 혹은 10 mM 니코티나마이드와 10 nM 글루카곤 유사 펩타이드(NG) 혹은 4 nM 액티빈 에이와 10 nM 글루카곤 유사 펩타이드(AG) 혹은 10 mM 니코티나마이드와 4 nM 액티빈 에이와 10 nM 글루카곤 유사 펩타이드 모두가 첨가된 배양액(NAG) 등 4 종류의 분화배양액에서 7일 동안 배양하였고, 대조군(Control)으로서는 10% 소태아혈청만이 첨가된 디엠이엠 고포도당 배양액(포도당 25 mM), 즉 증식배양액으로 세포를 배양하였다. 2단계에서는 상기 1단계의 각각의 5군의 세포들을 같은 배양접시에서 배양하되 디엠이엠 고포도당 배양액 대신에 10% 소태아혈청이 들어 있는 디엠이엠 저포도당 배양액(포도당 5.5 mM)을 사용하여 각각 14일 동안 배양하였다. 배양액은 3 ~ 4일 간격으로 교체해주었다.

양막조직 유래 줄기세포의 경우, 상기 피하 지방조직 유래 줄기세포와 유사한 방법으로 배양하되 세포를 2군으로 나누어 한 군은 대조군 즉 증식배양액으로 배양하고 다른 한 군은 니코티나마이드(10 nM), 액티빈 에이(4 nM), 글루카곤 유사 펩타이드(10 nM)를 모두 첨가한 배양액(NAG)으로 배양하였다.

총 21일간의 배양이 끝난 후, 각각의 세포들을 수거하여 인슐린을 분비하는 세포로 분화가 되었는지를 다음의 실시예들에서 설명한 방법으로 조사하였다.

실시예 3: 분화 후 세포 모양의 변화

눈 밑 피하 지방조직으로부터 분리한 성체 줄기세포를 21일간 증식배양액에서만 배양한 결과, 신경섬유와 같은 원래의 형태를 유지하였으나, 분화배양액에서 배양된 세포들은 배양액의 종류에 상관없이 모든 군에서 원래의 신경섬유 형태를 소실하고 대신에 췌장세포와 유사한 둥근 형태로 변화하였다(도 1). 특히, 이들 중 액티빈 에이와 글루카곤 유사 펩타이드를 처리해 준 군(AG)과 니코티나마이드와 액티빈 에이와 글루카곤 유사 펩타이드를 모두 처리해 준 군(NAG)의 경우, 세포덩어리(Colony)가 형성되었다.

뺨의 피하지방으로부터 줄기세포를 분리하여 상기 눈 밑 피하지방조직유래 줄기세포와 마찬가지로 4 조건으로 나누어 배양한 후 세포의 모양 변화를 살펴 본 결과, 눈 밑 피하 지방조직 유래 줄기세포와 유사하게 증식배양액에서 배양한 줄기세포는 원래의 모양을 유지하고 있었으나, 사이토카인을 처리한 모든 군에서는 세포의 모양이 둥글게 변하였다(도 2).

실시예 4: 인슐린 및 씨-펩타이드의 분비량 측정

총 21일 간의 배양이 끝난 후 상기 5 조건으로 배양된 각 군의 세포들을 0.5% 소혈청알부민이 첨가된 동량의 디에이엠 저포도당 배양액(포도당 5.5 mM)으로 12시간동안 배양하였다. 그런 후, 세포들을 첨가제가 없는 디에이엠 고포도당 배양액(포도당 25 mM)에 2시간 동안 노출시키고 이때의 배양액을 얻어 사람의 인슐린 또는 씨-펩타이드가 도포되어 있는 96-웰 접시(Mercodia, Sweden)에 위에서 얻은 배양액을 각각 25 ㎕씩 넣은 후 인슐린과 씨-펩타이드에 대한 Mercodia 회사에서 제공한 항체를 넣고 1시간 동안 반응시켰다. 그 후, 제공된 기질을 첨가하여 30분간 반응시킨 뒤 흡광도를 측정하였다.

그 결과, 눈 밑 지방유래 줄기세포의 경우, 대조군인 증식배양액에서 배양된 세포는 11.4 pg/ml/hour의 인슐린을 배양액으로 분비하였으며 니코티나마이드와 액티빈 에이가 첨가된 경우 26.5 pg/ml/hour, 니코티나마이드와 글루카곤 유사 펩타이드의 경우 41.9 pg/ml/hour, 액티빈 에이와 글루카곤 유사 펩타이드의 경우 59.2 pg/ml/hour, 그리고 니코티나마이드와 글루카곤 유사 펩타이드 및 액티빈 에이를 모두 첨가하여 분화를 유도한 군에서는 118.1 pg/ml/hour의 인슐린이 분비되었다 (도 3). 한편, 이들 세포가 분비한 씨-펩타이드의 양은 대조군의 경우 18.7 pg/ml/hour, 니코티나마이드와 액티빈 에이가 첨가된 경우 34.7 pg/ml/hour, 니코티나마이드와 글루카곤 유사 펩타이드의 경우 50.8 pg/ml/hour, 액티빈 에이와 글루카곤 유사 펩타이드의 경우 96.3 pg/ml/hour, 그리고 니코티나마이드와 글루카곤 유사 펩타이드 및 액티빈 에이를 모두 첨가하여 분화를 유도한 군에서는 286.0 pg/ml/hour로서 배양액에 니코티나마이드와 글루카곤 유사 펩타이드 및 액티빈 에이를 모두 첨가하여 분화를 유도한 세포들이 가장 많은 인슐린과 씨-펩타이드를 분비하였다(도 4).

뺨의 지방세포의 경우, 대조군의 경우 34.7 pg/ml/hour의 인슐린을 배양액으로 분비하였으며 니코티나마이드와 액티빈 에이가 첨가된 경우 131.8 pg/ml/hour, 니코티나마이드와 글루카곤 유사 펩타이드의 경우 48.4 pg/ml/hour, 액티빈 에이와 글루카곤 유사 펩타이드의 경우 211.6 pg/ml/hour, 그리고 니코티나마이드와 글루카곤 유사 펩타이드 및 액티빈 에이를 모두 첨가하여 분화를 유도한 군에서는 246.2 pg/ml/hour의 인슐린이 분비되었다(도 5). 또한, 이들 세포가 분비한 씨-펩타이드의 양은 대조군의 경우 13.2 pg/ml/hour, 니코티나마이드와 액티빈 에이가 첨가된 경우 160.3 pg/ml/hour, 니코티나마이드와 글루카곤 유사 펩타이드의 경우 100.7 pg/ml/hour, 액티빈 에이와 글루카곤 유사 펩타이드의 경우 559.9 pg/ml/hour, 그리고 니코티나마이드와 글루카곤 유사 펩타이드 및 액티빈 에이를 모두 첨가하여 분화를 유도한 군에서는 734.5 pg/ml/hour으로서 배양액에 니코티나마이드와 글루카곤 유사 펩타이드 및 액티빈 에이를 모두 첨가하여 분화를 유도한 세포들이 가장 많은 인슐린과 씨-펩타이드를 분비하였다(도 6).

양막에서 유래한 줄기세포의 경우, 대조군(Control)은 15.2 pg/ml/hour의 인슐린을 분비하였고 실험군(NAG)으로서 니코티나마이드와 글루카곤 유사 펩타이드 및 액티빈 에이를 모두 첨가하여 분화를 유도한 군에서는 94.2 pg/ml/hour의 인슐린을 분비하였다(도 7). 또한, 이들 세포가 분비한 씨-펩타이드의 양은 대조군(Control)의 경우 30.6 pg/ml/hour이었고 니코티나마이드와 글루카곤 유사 펩타이드 및 액티빈 에이를 모두 첨가하여 분화를 유도한 실험군(NAG)에서는 216.2 pg/ml/hour의 씨-펩타이드를 분비하였다(도 8).

위 인슐린 및 씨-펩타이드 분비량의 측정 결과들로 보아, 안면 피하 지방조직 및 양막조직으로부터 성체 줄기세포를 분리하여 체외에서 인슐린분비세포로 분화를 시킬 때에는 배양액에 니코티나마이드와 액티빈 에이 그리고 글루카곤 유사 펩타이드를 모두 처리하여 2단계로 배양하는 것이 가장 효과적이다.

실시예 5: 면역세포화학염색법을 이용한 인슐린 분비세포 특이 단백질의 발현

안면 피하지방 및 양막조직에서 분리한 성체 줄기세포를 다양한 조건에서 배양하여 인슐린 분비세포로 분화를 유도한 후, 이 세포들이 인슐린과 인슐린 전구물질(precursor)인 프로인슐린 또는 싸이토케라틴19 단백질을 발현하는지를 면역세포화학염색법을 통해 조사하였다.

위 실시예 4에서 배양액을 수거하고 남은 대조군과 실험군의 눈 밑 지방조직및 양막조직 유래 줄기세포에 동량의 2단계 배양액을 넣어 7일 동안 다시 배양하였다. 그런 후, 이 배양액을 버리고 남은 세포를 4% 파라포름알데히드(paraformaldehyde)로 4 ℃에서 90분간 고정하였다. 그런 후 인산염식염수로 세 번 세척하고, 세포에 내재하는 내재성 효소를 제거하기 위해 3% 과산화수소(Peroxidase)로 10분 동안 반응시킨 후, 2%의 소혈청 알부민이 첨가된 인산염식염수로 실온에서 60분 방치하였다. 이 후, 사람의 인슐린에 대한 항체 (anti-human insulin mouse monoclonal antibody), 프로인슐린에 대한 항체 (anti-human proinsulin mouse monoclonal antibody) 혹은 싸이토케라틴19에 대한 항체(anti-human cytokeratin19 mouse monoclonal antibody)를 1:1000 혹은 싸이토케라틴19 항체의 경우 1:400의 농도로 희석하여 위 용액에 첨가한 후 4 ℃에서 12시간 반응시켰다. 다음으로 바이오틴(biotin)이 결합된 2차 항체 (biotinylated anti-mouse IgG goat antibody)와 과산화수소가 결합된 스트렙타비딘(peroxidase-conjugated streptavidin)을 각각 20분씩 처리한 후 디아미노벤지딘(3,3'-diaminobenzidine, DAB)을 사용하여 발색하였다.

그 결과, 눈 밑 지방조직유래 줄기세포의 경우 인슐린과 프로인슐린에 대한 항체와의 반응성은 증식배양액에서 배양된 미분화세포에서는 약하게 나타났고 그 외 모든 분화유도 조건에서 배양된 세포들의 경우 두 항체와의 반응성이 현저히 강하게 나타났으며, 특히 액티빈 에이와 글루카곤 유사 펩타이드를 처리해 준 그룹과 니코티나마이드와 액티빈 에이 및 글루카곤 유사 펩타이드 모두를 처리해 준 그룹 에서 가장 강한 반응성이 나타났다(도 9). 싸이토케라틴19 단백질에 대한 항체의 반응성은 배양조건에 상관없이 모든 세포들에서 뚜렷하게 나타났으나, 특히 니코티나마이드와 액티빈 에이 및 글루카곤 유사 펩타이드가 모두 들어 있는 배양액에서 배양된 세포들이 가장 강한 반응을 나타내었다(도 9).

양막조직 유래 줄기세포의 경우 증식배양액에서 배양한 대조군의 세포들 (Control)은 거의 염색이 되지 않은 반면, 니코티나마이드와 액티빈 에이 및 글루카곤 유사 펩타이드를 모두 처리하여 배양한 세포들(NAG)은 현저히 강한 염색 반응을 나타내었다(도 10).

위 인슐린, 프로인슐린 및 싸이토케라틴19 단백질에 대한 면역세포화학염색 결과들로 보아, 안면 피하 지방조직 및 양막조직으로부터 성체 줄기세포를 분리하여 체외에서 인슐린 분비세포로 분화를 시킬 때에는 배양액에 니코티나마이드와 액티빈 에이 그리고 글루카곤 유사 펩타이드를 모두 처리하여 2단계로 배양하는 것이 가장 효과적이다.

실시예 6: 인슐린 분비세포 특이 유전자의 발현

눈 밑 지방에서 유래한 줄기세포를 상기 실시예 2에서와 같은 방법으로 5군으로 나누어 증식 혹은 분화를 유도한 후, 각각의 세포가 인슐린분비세포에 특이적인 유전자를 발현하는지 여부를 역전사-중합효소 연쇄반응 방법을 이용하여 조사하였다.

먼저, 각 실험군의 세포에 1 ml의 트라이졸 용액(Tri-reagent)을 넣고 잘 섞 어 준 후 200 ㎕의 클로로포름을 첨가하고 잘 섞어주었다. 이를 15분 동안 상온에서 방치한 다음 14,000 rpm으로 15분간 원심분리한 후 맨 위층의 상등액을 새 튜브로 옮겼다. 여기에 500 ㎕의 이소프로판올(isopropanol)을 첨가하여 잘 섞어준 다음 14,000 rpm으로 10분간 원심 분리하였다. 그런 후 상등액을 버리고 1 ml의 75% 에탄올을 넣고 잘 섞은 후 14,000 rpm으로 10분간 원심 분리하였다. 상등액을 버리고 남은 75% 에탄올을 완전히 휘발시킨 후 멸균된 3차 증류수를 넣고 65 ℃에서 5분 동안 방치하여 RNA를 용출시켰다. 용출된 RNA를 자외선분광광도계(UV-spectrophotometer)를 이용하여 260 nm의 파장에서 흡광도를 측정한 후, 리보핵산 7.5 ㎍에 1x 반응완충용액(reaction buffer), 1 mM의 뉴클레오티드(dNTP), 0.5 mg/ml의 올리고-디티(oligo-dT), 20U의 리보핵산분해효소 억제제 (RNase inhibitor), 그리고 20U의 역전사효소(M-MuLV reverse transcriptase)를 첨가하고 멸균된 3차 증류수로 총양을 50 ㎕로 맞춘 용액을 42 ℃에서 60분간 반응시켰다.

중합효소 연쇄반응은 위 역전사 반응에서 얻어진 3 ㎕의 상보적 디옥시리보핵산(cDNA), 2 mM의 염화마그네슘(MgCl₂), 0.25 U 호열균 디옥시리보핵산 중합효소(Taq polymerase) 그리고 각각의 제조된 10 pmol의 시발물 (primer)을 호열균 디옥시리보핵산 중합효소를 위한 완충용액(Taq buffer; Fermentas, USA)에 넣어 총 15 ㎕가 되도록 한 다음 중합반응을 수행하였다. 처음 94 ℃에서 5분간 초기변성단계(predenaturation), 94 ℃에서 30초간 변성단계(denaturation), 각 유전자에 따른 온도 조건에서 30초간 풀림단계(annealing), 72 ℃에서 30초간 총 35회의 연장단계(extension), 그리고 72 ℃에서 5분간 후기연장단계 (postelongation)를 차례대로 진행시켜 역전사-중합효소 연쇄반응 산물을 얻었다.

[표 3]

본 발명에 사용된 유전자 프라이머(Primer)의 뉴클레오티드 배열순서

유전자	프라이머(서열번호)	크기 (bp)	풀림 온도(℃)	Reference
GAPDH	5'- aca act ttg gta tcg tgg aa -3' (1) 5'- aaa ttc gtt gtc ata cca gg -3' (2)	456	53	NM_002046
insulin	5'- aac caa cac ctg tgc ggc tc -3' (3) 5'- aag ggc ttt att cca tct ctc tcg -3' (4)	320	59	J00265
ngn3	5'- cgt gaa ctc ctt gaa ctg agc ag -3' (5) 5'- tgg cac tcc tgg gac gag ttt c -3' (6)	211	61	AF234829
pdx1	5'- ccc atg gat gaa gtc tac g -3' (7) 5'- gtc ctc ctc ctt ttt cca c -3' (8)	262	54	NM_000209
Glucokinase	5'- gaa tac ccc cca gag acc ttt tc -3' (9) 5'- ggt ttc ttcc tga gcc agc g -3' (10)	182	61	M90299
Isl1	5'- agc atc aat gtc ctc tca act tcc -3' (11) 5'- tgt ttg gca agg caa tga cc -3' (12)	493	57	NM_002202
Nkx6.1	5'- aca cga gac cca ctt ttt ccg -3' (13) 5'- tgc tgg act tgt gctt ctt caa c -3' (14)	336	59	NM_006168
Glut 2	5'- agc ttt gca gtt ggt gga at -3' (15) 5'- aat aag aat gcc cgt gac ga -3' (16)	300	57	NM_000340
Beta 2	5'- cag aac cag gac atg ccc -3' (17) 5'- atc aaa gga agg gct ggt g -3' (18)	216	60	NM_002500
Glucagon	5'- atg aac gag gac aag cgc -3' (19) 5'- gta acg aac cga cca ctt -3' (20)	236	57	NM_002054
CK18	5'- gag atc gag gct ctc aag ga -3' (21) 5'- caa gct ggc ctt cag att tc -3' (22)	357	57	NM_00024
HNF4a	5'- gag cag gaa tgg gaa gaa tg -3' (23) 5'- ggc tgt cct ttg gga tga ag -3'(24)	205	62	NM_178849

이중 15 ㎕의 산물을 전기영동용 시료 완충용액(loading buffer; 0.25% bromophenol blue, 0.25% xylene cyanol, 40% sucrose)과 섞은 후 2% 아가로즈 겔(agarose gel)에서 100V로 30분간 전기영동을 시행하였다. 전기영동이 끝난 겔을 에티디움 브로마이드(ethidium bromide)로 염색한 후 자외선 투사기(UV transilluminator; Vilber loumat, FRANCE)로 염색 양상을 조사하였다. 대조군 으로서 글리세르알데히드인산 탈수소효소(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH)의 발현 양을 조사하고 이와 비교하여 각각의 유전자의 발현 양을 상대적으로 비교하였다. 실험은 3회 반복하고 이로부터 결과를 얻어 비교 분석하였다.

상기 방법으로 분석한 결과, 도 11에 나타낸 바와 같이, 췌장 발생에 있어서 중요한 작용을 하는 유전자로 알려진 글루카곤(Glucagon), 피디엑스1(PDX1), 엔케이엑스6.1(Nkx6.1) 그리고 인슐린(Insulin) 등의 유전자는 액티빈 에이와 글루카곤 유사 펩타이드를 첨가한 군 및 니코티나마이드와 액티빈 에이 그리고 글루카곤 유사 펩타이드 모두를 첨가한 군에서 분화 유도된 세포에서만 현저한 발현이 나타났고 미분화세포 및 니코티나마이드와 액티빈 에이를 첨가한 배양액 그리고 니코티나마이드와 글루카곤 유사 펩타이드를 첨가한 배양액에서 인슐린분비세포로 분화 유도한 세포에서는 전혀 발현이 되지 않았다. 다만 인슐린 유전자의 경우, 니코티나마이드와 글루카곤 유사 펩타이드를 첨가한 군에서 배양된 세포에서도 소량의 발현이 이루어 졌다.

엔지엔3(NGN3), 아일렛1(islet1), 베타2(beta2), 글루코키나제(Glucokinase, GK), 간핵인자4α(HNF4α), 싸이토케라틴18(CK18) 등의 유전자는 분화의 여부에 상관없이 모든 군의 세포에서 발현되었다. 다만, 엔지엔3 유전자는 액티빈 에이와 글루카곤 유사 펩타이드를 첨가한 군과 니코티나마이드와 액티빈 에이 그리고 글루카곤 유사 펩타이드 모두를 첨가한 군에서 현저히 발현이 증가하였고, 아일렛1과 베타2 유전자는 싸이토카인의 종류에 상관없이 모든 군에서 대조군에 비해 현저 히 발현양이 증가하였다(도 11).

위 유전자 발현 양상의 분석결과로 보아 눈 밑 피하 지방조직 유래 성체 줄기세포를 체외에서 인슐린 분비세포로 분화를 시킬 때에는 배양액에 니코티나마이드, 액티빈 에이, 글루카곤 유사 펩타이드의 세 가지 싸이토카인 모두를 첨가하는 것이 가장 효과적이며, 액티빈 에이와 글루카곤 유사 펩타이드의 두 가지 싸이토카인을 첨가하는 것도 상당한 효과를 볼 수 있다.

실시예 7: 디티존 염색(Dithizone staining)

인슐린은 세포 내에서 아연이온(Zn⁺⁺)과 함께 헥사머(hexamer)를 형성하게 되는데, 디티존(dithizone)은 이 아연이온에 결합하여 세포를 염색하는 물질로서 췌장의 베타세포에 특이적인 염색법으로 알려져 있다. 이를 이용하여 눈 밑 지방에서 분리한 줄기세포를 인슐린을 분비하는 세포로 분화를 유도한 후 디티존 염색법을 사용하여 분화의 여부를 조사하였다.

염색법은 디티존 분말 50 mg을 디메틸 설폭사이드(Dimethyl sulfoxide, DMSO) 5 ml에 녹인 후, 10 ㎕의 디티존 용액을 1 ml의 디에이엠 저포도당 배양액에 녹이고 0.2 mm의 나일론 필터를 통해 필터를 한 후에 사용하였다. 즉, 세포가 들어 있는 배양 접시에 염색 용액을 떨어뜨린 후 37 ℃에서 15분 반응시킨 후, 인산염식염수로 서너 번 씻어 준 뒤 광학현미경으로 염색 정도를 확인하였다.

그 결과, 대조군, 니코티나마이드와 액티빈 에이가 첨가된 배양액, 니코티나마이드와 글루카곤 유사 펩타이드가 첨가된 배양액에서 배양된 세포들은 거의 염색이 되지 않았고 액티빈 에이와 글루카곤 유사 펩타이드를 첨가한 군과 니코티나마이드, 액티빈 에이, 글루카곤 유사 펩타이드 모두를 첨가한 군에서 배양된 세포는 매우 진하게 염색되었으며, 특히 세포가 둥글게 뭉쳐진 부분에서 염색이 진하게 나타났다(도 12).

위의 디티존 염색결과로 미루어, 눈 밑 피하지방 유래 성체 줄기세포를 인슐린 분비세포로 분화시킬 때에는 배양액에 니코티나마이드, 액티빈 에이, 글루카곤 유사 펩타이드 모두를 첨가하는 것이 가장 효과적이며, 액티빈 에이와 글루카곤 유사 펩타이드의 두 가지 싸이토카인을 첨가하는 것도 상당한 효과를 볼 수 있다.

실시예 8: 세포 이식 당뇨 쥐의 반응

상기 실시예들에서 얻은 결과를 토대로 하여 눈 밑 피하지방 유래 성체 줄기세포를 두 군으로 나누어 한 군은 대조군으로서 증식배양액에서만 배양된 미분화세포군(UDC, undifferentiated cells)으로 하고 다른 한 군은 니코티나마이드와 액티빈 에이와 글루카곤 유사 펩타이드 모두를 첨가한 배양액에서 총 21일간 2단계로 배양하여 인슐린분비세포로 분화한 분화세포군(DC, differentiated cells)으로 하여 이들을 각각 당뇨 쥐에 이식하여 당뇨 치료의 효과 여부를 조사하였다.

먼저, 씨57비엘 계통의 생쥐(C57BL/6 strain)의 복강에 180 mg/kg의 농도로 스트렙토조토신을 주사하여 당뇨를 유발한 뒤 3 ~ 5일 뒤에 공복 시의 혈당을 측정 하여 350 mg/dl 이상의 혈당을 나타내는 생쥐를 선택하였다. 이들 쥐를 각각 5마리씩 3군으로 나누어, 세포 없이 50 ㎕의 생리식염수만을 당뇨 쥐의 신장 피막 내에 이식한 쥐(sham operation), 1.5x10⁶/의 미분화세포를 50 ml의 디엠이엠 저포도당 배양액에 넣어 당뇨 쥐의 신장 피막 내에 이식한 쥐(UDC Tx), 1.5x10⁶/㎕의 분화된 세포를 50 ml의 디엠이엠 저포도당 배양액(포도당 5.5 mM)에 넣어 당뇨쥐의 신장 피막 내에 이식한 쥐(DC Tx)의 3군으로 나누었으며 시간에 따른 생쥐의 생존율, 혈당, 체중 및 물 흡수량의 변화를 조사하였다. 대조군으로서는 정상 생쥐 5마리를 사용하였다. 생존율은 통계 프로그램인 SPSS 12를 사용하여 도식화 하였으며, 혈당은 3일에 한 번씩 공복 상태의 생쥐의 꼬리의 피를 얻어 Roche사의 Accucheck Active 혈당기를 사용하여 측정하였다. 또한, 물의 흡수량은 24시간동안 먹는 양을 측정하여 도식화하였다.

연구 결과,

1. 생존율은, 분화한 세포를 이식한 쥐(DC Tx)의 경우 5마리 중 3마리는 이식 후 60일이 지나도 살아남았으며(세포이식 반응성이 좋은 쥐, responsive DC Tx), 나머지 2마리(세포이식 반응성이 좋지 않은 쥐, unresponsive DC Tx)와 미분화 세포를 이식한 생쥐(UDC Tx)와 식염수만을 이식한 생쥐(Sham opertation)의 모든 개체는 42일 안에 죽었다(도 13).

2. 혈당의 변화는, 세포이식 반응성이 좋은 쥐는 이식 후 10일 내에 혈당이 150 mg/dl으로 나타났으며, 이 값은 당뇨를 유발하지 않은 정상 쥐와 유사하였다. 그러나, 미분화 세포를 이식한 쥐와 식염수만 이식한 쥐의 혈당은 36일이 지나도 350 mg/dl 이상으로 고혈당이 지속되었다(도 14).

3. 체중 변화를 조사한 결과, 세포이식 반응성이 좋은 쥐는 이식 전 18 g에서 27일이 지났을 때에는 22 g으로 증가하였고 이는 정상 쥐와 비슷하였다. 세포이식 반응성이 좋지 않은 쥐와 미분화 세포를 이식한 쥐, 식염수만 이식한 쥐들은 이식 전 18 g에서 27일이 지났을 때에는 평균 15 g으로 줄어들었다(도 15).

4. 물의 흡수량을 비교한 조사한 결과, 세포이식 반응성이 좋은 쥐의 물의 흡수량은 24시간 동안 평균 18 ml 정도의 물을 흡수하였으며 정상 생쥐는 12ml을 흡수하였다. 그러나, 세포이식 반응성이 좋지 않은 쥐와 미분화 세포를 이식한 쥐, 식염수만 이식한 쥐의 경우는 24시간동안 평균 40 ml의 물을 흡수하였다(도 16).

상기 결과에서 나타난 것처럼 분화한 세포를 이식하였을 때에 반응성이 좋은 쥐는 혈당이 정상으로 회복되었으며 체중의 변화와 물의 흡수량도 정상 쥐와 유사한 반면, 세포이식 반응성이 좋지 않은 쥐와 미분화 세포를 이식한 쥐, 그리고 식염수만 이식한 쥐들은 고혈당, 저체중, 물의 고흡수량 등 심각한 당뇨 현상을 나타내었다.

실시예 9: 당뇨의 세포 치료 효과

위 실시예 8에서 얻어진 세포이식 반응성이 좋은 생쥐들이 생체 내에서 정상 적으로 포도당을 사용할 수 있는지를 알아보기 위해 당부하 검사를 실시하였다.

정상 쥐 3마리와 세포이식 반응성이 좋은 쥐 3마리를 12시간 동안 금식시킨 후 복강 주사로 1.5 g/kg 농도의 포도당을 주입하고 이 후 30, 60, 90, 120분 간격으로 혈당을 조사하였다.

그 결과, 정상 쥐(Positive control)의 경우, 포도당을 주입하기 전 115 mg/dl이었으나 포도당을 주입한 후 30분 동안은 혈당이 빠르게 증가하여 210 mg/dl가 되었고 120분이 경과하였을 때에는 150 mg/dl 이하의 값을 나타내었다. 이에 대해 세포이식 반응성이 좋은 쥐(Responsive DC Tx)의 경우 포도당을 주입한 후 30분 동안은 혈당이 빠르게 증가하여 320 mg/dl가 되었고 120분이 경과하였을 때에는 200 mg/dl 이하의 값을 나타내었고 180분이 지났을 때에는 150 mg/dl 이하의 값을 나타내었다(도 17).

이 결과로 미루어 볼 때, 세포이식 반응성이 좋은 쥐의 경우 정상 생쥐에 비해 다소 느리지만 생체 내 포도당을 정상적으로 흡수하고 대사할 수 있으며 당뇨가 치료된 것으로 사료된다.

또한, 세포이식 반응성이 좋은 쥐로부터 혈청을 얻어 혈청 내 사람의 인슐린과 씨-펩타이드의 농도를 효소면역측정법으로 조사하였다.

그 결과, 정상 생쥐의 혈청(Normal) 내에서는 20.2 pg/ml의 사람 인슐린이 검출되었으나 세포이식 반응성이 좋은 쥐의 혈청(DC Tx) 내에는 129.3 pg/ml의 사람 인슐린이 검출되었다(도 18).

또한, 정상 생쥐의 혈청(Normal) 내에서는 10.2 pg/ml의 사람 씨-펩타이드가 존재하는 것으로 나타났으나, 세포이식 반응성이 좋은 쥐의 혈청(DC Tx) 내에는 142.3 pg/ml의 씨-펩타이드가 검출되었다(도 19).

상기 연구 결과들로 보아, 사람의 눈 밑 피하 지방조직 또는 양막조직 유래 줄기세포를 동 발명에서 기술한 방법으로 체외에서 인슐린 분비세포로 분화시킨 후 이를 당뇨 쥐의 체내에 이식하면 이 세포들은 생쥐의 체내에서 혈중 포도당의 농도에 반응하여 사람의 인슐린과 씨-펩타이드를 분비하여 생쥐의 혈당을 조절한다.

이상에서 설명한 바와 같이, 본 발명은 눈 밑 피하 지방조직 또는 양막조직 유래 줄기세포를 인슐린 분비세포로 분화시키기 위한 배양액 조성과 이 배양액을 이용한 분화방법을 확립함으로써 기존 분화방법에 비해 배양액에 인슐린을 첨가하지 않고 분화를 유도한다는 점이 우수하며, 인슐린 분비세포를 제1형 당뇨 쥐에 주입하였을 때, 혈당이 떨어지고, 끝까지 살아남았으며, 포도당을 정상적으로 대사할 수 있는 것으로 보였다. 또한, 세포를 이식 받은 생쥐의 혈액에서 사람의 인슐린과 씨-펩타이드가 나타나는 것으로 보아 제1형 당뇨를 치료할 수 있는 세포치료제로서 사용가능할 것으로 기대된다.

<110> HURIMBIOCELL CO., LTD. KIM, hae kwon INFITRON, INC. <120> Method for the differentiation of human adult stem cells into insulin-secreting cells <160> 24 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH forward primer <400> 1 acaactttgg tatcgtggaa 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH reverse primer <400> 2 aaattcgttg tcataccagg 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> insulin forward primer <400> 3 aaccaacacc tgtgcggctc 20 <210> 4 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> insulin reverse primer <400> 4 aagggcttta ttccatctct ctcg 24 <210> 5 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ngn3 forward primer <400> 5 cgtgaactcc ttgaactgag cag 23 <210> 6 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ngn3 reverse primer <400> 6 tggcactcct gggacgagtt tc 22 <210> 7 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pdx1 forward primer <400> 7 cccatggatg aagtctacg 19 <210> 8 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pdx1 reverse primer <400> 8 gtcctcctcc tttttccac 19 <210> 9 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Glucokinase forward primer <400> 9 gaataccccc cagagacctt ttc 23 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Glucokinase reverse primer <400> 10 ggtttcttcc tgagccagcg 20 <210> 11 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Isl1 forward primer <400> 11 agcatcaatg tcctctcaac ttcc 24 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Isl1 reverse primer <400> 12 tgtttggcaa ggcaatgacc 20 <210> 13 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nkx6.1 forward primer <400> 13 acacgagacc cactttttcc g 21 <210> 14 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nkx6.1 reverse primer <400> 14 tgctggactt gtgcttcttc aac 23 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Glut 2 forward primer <400> 15 agctttgcag ttggtggaat 20 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Glut 2 reverse primer <400> 16 aataagaatg cccgtgacga 20 <210> 17 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Beta 2 forward primer <400> 17 cagaaccagg acatgccc 18 <210> 18 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Beta 2 reverse primer <400> 18 atcaaaggaa gggctggtg 19 <210> 19 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Glucagon forward primer <400> 19 atgaacgagg acaagcgc 18 <210> 20 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Glucagon reverse primer <400> 20 gtaacgaacc gaccactt 18 <210> 21 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CK18 forward primer <400> 21 gagatcgagg ctctcaagga 20 <210> 22 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CK18 reverse primer <400> 22 caagctggcc ttcagatttc 20 <210> 23 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HNF4a forward primer <400> 23 gagcaggaat gggaagaatg 20 <210> 24 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HNF4a reverse primer <400> 24 ggctgtcctt tgggatgaag 20

Claims

인간의 성체 줄기세포를 체외에서 인슐린 분비세포로 분화를 유도 시,

20 ~ 30 mM의 고농도 포도당 배양액에 니코티나마이드(nicotinamide), 액티빈 에이(activin A) 및 글루카곤 유사 펩타이드(glucagon-like peptide 1) 중에서 선택된 2종 이상의 싸이토카인을 첨가하여 5 ~ 10일 동안 세포를 배양한 후,

4 ~ 7 mM의 저농도 포도당 배양액에 니코티나마이드(nicotinamide), 액티빈 에이(activin A) 및 글루카곤 유사 펩타이드(glucagon-like peptide 1) 중에서 선택된 2종 이상의 싸이토카인을 첨가하여 10 ~ 20일 동안 세포를 배양하는 것을 특징으로 하는 인슐린 분비세포로의 분화 유도방법.
제 1 항에 있어서, 상기 성체 줄기세포는 안면 피하 지방조직 또는 양막 조직으로부터 분리된 것임을 특징으로 하는 유도방법.
제 1 항에 있어서, 상기 배양액은 디엠이엠(Dulbecco's modified Eagle's medium, DMEM), 아이엠디엠(Iscove's modified Dulbecco's media, IMDM), 알피엠아이1640(RPMI1640), 알파엠이엠(a-Minimum essential media, a-MEM), 햄 에프12 (HAM's F12) 및 199 배양액(Media 199) 중에서 선택된 1종 또는 2종 이상인 것을 특징으로 하는 방법.
삭제
제 1 항에 있어서, 상기 니코티나마이드는 5 ~ 20 mM, 글루카곤 유사 펩타이드는 5 ~ 20 nM, 액티빈 에이는 1 ~ 10 nM의 농도로 사용하는 것을 특징으로 하는 방법.