KR100982883B1 - 혼합추출물을 포함하는 화장료 조성물 및 이의 제조 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 민들레(Taraxacum officinlale), 자소엽(Perilla ocymoides), 참가사리(Gloiopeltis Tenax), 연자육(Nelumbo Nucifera Seed), 야래향(Cestrum nocturnum) 및 비파나무잎(Eriobotrya Japonica Leaf)의 혼합 추출물을 포함하는 화장료 조성물 및 이의 제조방법을 제공한다. 본 발명의 화장료 조성물은 항균, 항산화, 미백, 수분보유 등의 효과가 있어 아토피 피부 개선용 화장료로 유용하다.

민들레, 자소엽, 참가사리, 연자육, 야래향, 비파나무잎, 항균제, 화장료, 아토피

Description

혼합추출물을 포함하는 화장료 조성물 및 이의 제조 방법{Cosmetic composition comprising mixture extract and preparation thereof}

본 발명은 혼합추출물을 포함하는 화장료 조성물 및 이의 제조방법에 관한 것이다.

아토피의 어원은 "I burn"이라는 그리스 어원의 용어로 아토피안의 가려움증을 한번에 대변할 수 있다. 아토피란 용어는 "이상한", ‘부적절한’이란 뜻을 가지고 있듯이 유아기에 주로 발생하여 태열의 형태로 나타나나 그 유발 원인은 확실히 밝혀진 바가 없다. 주로 각질층내의 세라마이드(ceramides)의 함량이 감소됨에 따라 발생하는 것으로서 각질층의 수분유지기능이 떨어짐에 따라 피부가 건조되어 각질이 쉽게 일어나며 피부장벽(skin barrier) 기능이 저하됨에 따라 자극유발물질이 각질층 내로 침입하여 자극을 유발시키고 정상피부에서는 침입하기 어려운 항원 단백질이 침입함에 따라 피부 알러지 등이 용이하게 발생하여 견디기 힘들만큼의 소양증 증상을 나타낸다. 그러므로 아토피 환자의 90% 이상이 포도상구균에 감염되어 있는데 이 균은 환자가 가려움을 참지 못해 긁어서 생기기도 하지만 최근의 보고에 의하면 이 세균의 외독소가 우리 몸의 면역체계를 자극하여 알레르기를 일으 키는 화학물질을 나오게 하여 아토피를 악화시킨다고 한다. 즉, 이 세균 자체가 알레르겐으로 작용한다는 것이다.

세계적으로 아토피 피부가 증가되고 있으며 이로 인해 수분 보유력이 저하되고 피부보호기능이 상실되어 적은 자극에도 민감하게 반응하여 알러지가 발생하며, 활성산소에 의한 것으로 활성산소에 의해 과산화지질이 생성하게 되고 이것에 의해 아토피 피부가 발생한다. 또한 세균, 바이러스, 곰팡이에 감염되어 더욱 악화될 수 있다. 따라서, 이러한 아토피를 치료하기 위해서는 항균, 보습, 항염의 효과가 우수하며, 부작용이 없고 비용이 저렴한 물질의 개발 및 그 물질을 함유하는 사용이 용이한 화장료의 개발이 필수적이다.

한편, 민들레(Taraxacum officinlale)는 국화과 식물로, 중국 의학의 6대 약초 중 하나로 항균과 소염 등에 좋은 식물로 보고되었으며, 동의보감 등의 고전 문헌에 따르면 어혈을 삭혀서 깨끗이 하고 종기를 없애주는 민간요법으로 사용되기도 하였다. 한국특허공보 제1995-005739호는 민들레의 항균 아토피 치료 효과에 대해 기술하고 있다.

자소엽(Perilla ocymoides)은 꿀풀과에 속하는 일년생 풀로, 늦여름에 전초를 베어 그늘에 말려 사용하며 맛은 맵고 성질은 따뜻하여 폐경, 비경, 위경에 작용하는 것으로 본초강목에 나와 있다. 또한 땀을 내어 풍한을 없애며 비위의 기를 잘 통하게 하고 태아를 안정시키고 물고기독을 해독하며, 약리실험에서 약한 해열 작용, 건위작용, 억균작용, 방부작용 등이 밝혀졌다. 또한, 자소엽은 풍한표증, 비위의 기가 막혀 헛배가 부르고 그득한 증상, 토하고 설사하는 증상, 한담으로 기침이 나고 숨이 찬 증상 및 임신부의 구토, 기체로 인한 태동불안, 물고기중독 등에 쓰인다. 한국특허공보 제2002-0061963호는 자소엽의 항균 아토피 치료 효과에 대해 기술하고 있다.

참가사리(Gloiopeltis Tenax)는 참가사리는 식용으로 애용되는 해조류 중 홍조류에 속하며, 2006년 한국영양학회지 39(4), 366~371의 참가사리의 생리활성효과에 대한 연구에 따르면 항산화효과와 항균효과가 보고된 바 있다.

연자육(Nelumbo Nucifera Seed)은 연꽃의 열매로 연밥 또는 연실이라고도 불려지며, 단백질, 지방, 탄수화물, 비타민, 광물질 등이 풍부하게 함유되어 있다. 연자육은 비(脾)기능이 허약해서 설사를 할 때에 비(脾) 기능을 보(補)하여 설사를 멈추게 하는 작용을 하며, 토사자(蒐絲子), 녹용(鹿茸)과 함께 신(腎)기능이 약해서 생기는 유정(遺精) 및 몽정(夢精)의 치료에 사용되며, 백과(白果), 금앵자(金櫻子)와 함께 배합부인의 백대하 치료에 사용된다. 또한, 산조인(酸棗仁), 백문동(麥門冬)과 함께 음혈(陰血)이 회손되어 가슴이 뛰고 잘 놀라며 잠을 못 자는 증상 치료에 사용된다.

야래향(Cestrum nocturnum)은 남미와 서인도 제도 등이 자생지인 열대 식물 로 열을 내리는 효과가 있어서 감기로 인해 목이 부어 있거나 열이 날 때 좋은 효능이 있다고 한다.

비파나무잎(Eriobotrya Japonica Leaf)은 아미그달린, 우루솔산, 올레놀산, 탄닌, 비타민B1 등의 성분이 함유되어 있는 것으로 알려져 있다. 또한, 비파나무잎은“의방유취”<주후방>에 반위와 헛구역이 나는 것을 치료하는 처방약으로 기재되어 있으며, <한국항암본초>에서는 각종암을 호전시키는 나무로 기재되어 있다.

현재 일반적으로 아토피 피부를 치료하기 위해서는 보습제 또는 타르제제를 사용하거나, triamcinolone 및 fluocinolone와 같은 스테로이드 제제 사용, clindamycin, dicloxacilline와 같은 항생제, 항소양제 사용, potassium permanganate, cetrimide, chlorhexidine, chloroxylenol, dibromopropamidine, polynoxylin, povidone iodine, triclosan와 같은 항균제, 면역 조절, 면역 억제, 면역 치료제, 식품, 향기, 한방 등의 방법을 사용하고 있다. 그러나 타르제제나 스테로이드 제제는 발진, 피부색 변화, 고혈압, 백내장 등의 부작용이 심각하며, 자외선 치료는 햇볕의 화상, 가려움증 유발, 색소 침착과 장기간 치료 시에는 피부의 조기 노화와 암의 위험이 높고, 항생제는 주로 내복약으로 사용해야하는 단점이 있다. 또한, 항균제는 농도에 따른 피부 자극이 있다. 면역조절, 억제제 등은 최근 가장 많이 사용되고 있으나 수두, 대상포진 등의 바이러스에 감염된 얼굴에 사용해서는 안 되는 등의 사용상의 어려움이 있다. 또한, 식품요법, 한방치료, 기타 향 기요법 등은 사용상의 부작용은 없지만 그 효과가 미비한 경우가 많으며 피부도포용 화장품의 경우 수입에 의존하므로 그 가격이 비싸서 사용상에 그 한계가 있다. 따라서 국내산 자생식물을 이용한, 항균 작용 및 아토피 피부 개선 효과가 뛰어난 성분에 대한 연구가 시급한 것이 현실이다.

본 발명의 목적은 항염, 항산화, 항균, 세포증식, 피부 가려움증 개선, 아토피 피부 개선 등의 효능이 우수하고 안정성 및 안전성에 문제가 없는 추출물을 포함하는 화장료 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 이러한 효능을 갖는 추출물을 포함하는 화장료 조성물의 제조방법을 제공하는 것이다.

본 발명은 민들레, 자소엽, 참가사리, 연자육, 야래향 및 비파나무잎의 혼합 추출물을 포함하는 화장료 조성물을 제공한다.

본 발명의 화장료 조성물에서, 혼합추출물은 민들레 추출물, 자소엽 추출물, 참가사리 추출물, 연자육 추출물, 야래향 추출물 및 비파나무잎 추출물이 다양한 비율로 혼합된 것일 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 혼합 추출물은 민들레 추출물: 자소엽 추출물: 참가사리 추출물: 연자육 추출물: 야래향 추출물: 비파나무잎 추출물이 1: 0.5~3 :0.5 ~5: 0.5~ 5: 0.2~ 2: 0.5 ~ 5 중량비로 혼합된 것이 바람직하며, 1: 1: 2: 2: 0.5: 2 중량비인 것이 더욱 바람직하다.

본 발명의 혼합추출물은 당업자에게 알려진 다양한 추출방법으로 다양한 용매를 이용하여 추출될 수 있다. 예를 들어, 본발명에서 혼합추출물은 민들레, 자 소엽, 참가사리, 연자육, 야래향 및 비파나무잎을 각각 물, 탄소수1 내지 4의 무수알코올 또는 함수알코올 및 에틸아세테이트 중에서 선택된 용매로 추출한 것을 혼합한 것이거나, 민들레, 자소엽, 참가사리, 연자육, 야래향 및 비파나무잎을 다양한 비율로 혼합한 후에 상기 용매로 추출한 추출물일 수 있다.

상기 민들레, 자소엽, 참가사리, 연자육, 야래향 및 비파나무잎의 추출시 용매를 달리하여 추출된 추출물을 비교한 결과, 용매를 달리함에 따라 추출된 양에 약간의 차이가 있었을 뿐 추출성분은 동일하였다. 다만, 효율성 등을 고려할 때 에탄올 수용액을 용매로 사용하는 것이 보다 편리하였다. 따라서 70%(v/v)함수에탄올로 추출한 것이 바람직하다. 여기서 70%(v/v) 함수 에탄올이란, 에탄올이 70%(v/v)이고, 물이 30%(v/v)인 에탄올을 의미한다.

본 발명의 화장료 조성물은 민들레, 자소엽, 참가사리, 연자육, 야래향 및 비파나무잎 혼합 추출물을 액상의 중량으로서 0.1%~10%의 양을 화장료에 첨가할 수 있다.

또한 첨가방법은 냉각 콘덴서가 달린 증류장치를 이용하여 증발되어 나오는 용매를 회수하면서 그 건조중량으로서 0.001∼5중량%, 바람직하게는 0.01∼3중량%의 양으로 화장료에 첨가한다. 0.001중량% 미만인 경우 그 효능효과가 미비하고, 5중량% 초과인 경우 유의적인 차이를 나타내지 않는다. 따라서, 본 발명의 화장료 조성물은 혼합추출물이 화장료 조성물 총 건조중량에 대하여 0.001∼5중량%의 양으 로 포함된 것이 바람직하다.

본 발명의 화장료 조성물의 제형은 다양한 형태일 수 있다. 예를 들어, 유연화장수, 영양화장수, 영양크림, 맛사지크림, 에센스 또는 팩일 수 있다. 즉, 본 발명은 각 제형의 항균 및 아토피 피부 개선 화장료 조성에 있어서, 상기의 민들레 및 자소엽 추출물 외에 다른 성분들을 기타 화장료의 제형 또는 사용목적 등에 따라 임의로 선정하여 배합할 수 있다. 각각의 제형에 사용되는 기타 성분들은 당업자에게 이미 각 제형을 만드는데 통상적으로 사용되는 정제수, 유분, 계면활성제, 보습제, 고급 알콜, 킬레이이트제, 색소, 지방산, 산화방지제, 방부제, 왁스, pH조절제, 향료 등이 있다.

본 발명의 화장료 조성물은 항산화 및 항균용 또는 아토피 피부 개선용 인 것이 바람직하다.

또한, 본 발명은 민들레, 자소엽, 참가사리, 연자육, 야래향 및 비파나무잎을 물, 탄소 수 1 내지 4의 무수 또는 함수 알코올, 및 에틸 아세테이트로 구성된 그룹에서 선택된 용매로 추출하고, 농축하여 혼합추출물을 제조하는 단계를 포함하는 혼합추출물 화장료 조성물 제조방법을 제공한다. 바람직한 추출용매는 70%(v/v)함수에탄올이다.

본 발명의 제조방법에서, 추출은 50℃ 내지 100℃에서 3 시간 내지 24시간 동안 이루어지거나 4℃ 내지 30℃에서 3일 내지 20일 동안 이루어지는 것이 바람직하다.

또한, 본 발명의 제조방법은 추출공정의 수행 전 또는 후에 디에틸에테르 가용성분을 제거하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물은 세포 증식 및 무독성 효과, 항산화 효과, 다양한 세균에 대한 항균 효과 및 아토피 피부 개선 효과가 우수하므로, 항산화, 항균 및 아토피 피부 개선을 위한 기능성 화장료 조성물로 사용가능하다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예 및 실험예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 이에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

또한, 이하에서 언급된 민들레, 자소엽, 참가사리, 연자육, 야래향 및 비파나무잎은 대한민국 경동약업시장에서 구입한 것이며, 추출용매는 DAICEL CHEMICAL INDUSTRIES,LTD 으로부터 구입한 것이다.

<실시예 1> 민들레, 자소엽, 참가사리, 연자육, 야래향 및 비파나무잎 혼합 추출물 제조

건조시킨 민들레, 자소엽, 참가사리, 연자육, 야래향 및 비파나무잎에 대하여 각각 100g을 생약 분쇄기를 이용하여 10 내지 200 메쉬 크기로 분쇄한 후, 70%(v/v) 에탄올 수용액 500ml를 가하여 초음파 진동에 넣고 초음파 진동을 가하여 세포막내의 것을 포함한 유효성분이 에탄올 속에 추출되게 한 후 상온에서 24시간 냉침시킨 후, 0.40㎛ 여과지를 이용하여 제균여과하였다. 여과된 추출물을 45℃에서 감압 농축하여 각각의 농축액을 수득하였다.

상기에서 얻은 각각의 추출물들에 대해 Escherichia coli(구입처:생물자원센터 균주번호 KTCT 2571, ATCC8739)에 대한 최소저해농도시험(Minimum inhibitory Concentration, MIC, reference:식품미생물학 실험서, 지구문화사, 2000)에 따라 각 추출물의 동일농도에서 최적의 활성 농도 확인하였으며, 그 결과는 표1과 같다.

추출 성분	Escherichia coli
	0.25%	0.5%	1%	2%
민들레	+	+	-	-
자소엽	+	+	-	-
참가사리	+	+	+	-
연자육	+	+	+	-
야래향	+	-	-	-
비파나무잎	+	+	+	-

상기 표에서, + : 항균활성이 나타나지 않음으로 배지가 불투명, -:항균활성으로 인해 배지가 투명함을 나타낸다.

표1에 나타난 결과에 근거하여 민들레, 자소엽, 참가사리, 연자육, 야래향 및 비파나무잎 추출물을 각각 1 중량%, 1 중량%, 2 중량%, 2 중량%, 0.5 중량% 및 2 중량% 과 나머지 물을 함유한 혼합 추출물을 제조하였다.

비교예 1. 민들레 추출물 제조

건조시킨 민들레 100g을 생약 분쇄기로 10 내지 200 메쉬 크기로 분쇄한 후, 70%(v/v) 에탄올 수용액 500ml를 가하여 초음파 진동에 넣고 초음파 진동을 가하여 세포막내의 것을 포함한 유효성분이 에탄올 속에 추출되게 한 후 상온에서 24시간 냉침시킨 후, 0.40㎛ 여과지를 이용하여 제균여과하였다. 여과된 추출물을 45℃에서 감압 농축하여 표제의 추출물을 수득하였다.

비교예 2. 자소엽 추출물 제조

건조시킨 자소엽 100g을 생약 분쇄기로 10 내지 200 메쉬 크기로 분쇄한 후, 70%(v/v) 에탄올 수용액 500ml를 가하여 초음파 진동에 넣고 초음파 진동을 가하여 세포막내의 것을 포함한 유효성분이 에탄올 속에 추출되게 한 후 상온에서 24시간 냉침시킨 후, 0.40㎛ 여과지를 이용하여 제균여과하였다. 여과된 추출물을 45℃에서 감압 농축하여 표제의 추출물을 수득하였다.

비교예 3. 참가사리 추출물 제조

건조시킨 참가사리 100g을 생약 분쇄기로 10 내지 200 메쉬 크기로 분쇄한 후, 70%(v/v) 에탄올 수용액 500ml를 가하여 초음파 진동에 넣고 초음파 진동을 가하여 세포막내의 것을 포함한 유효성분이 에탄올 속에 추출되게 한 후 상온에서 24시간 냉침시킨 후, 0.40㎛ 여과지를 이용하여 제균여과하였다. 여과된 추출물을 45℃에서 감압 농축하여 표제의 추출물을 수득하였다.

실시예 2. 화장수 제조

실시예 1의 민들레, 자소엽, 참가사리, 연자육, 야래향 및 비파나무잎 혼합 추출물을 함유한 화장료 중 화장수(스킨로션)를 하기 표 2의 조성으로 제조하였다.

번호	원 료	함량(중량%)
1	민들레, 자소엽, 참가사리, 연자육, 야래향 및 비파나무잎 혼합추출물 (실시예 1)	1.0
2	글리세린	3.0
3	부틸렌 글리콜	2.0
4	프로필렌 글리콜	2.0
5	폴리옥시에칠렌 경화피마자유	1.0
6	에탄올	10.0
7	트리에탄올아민	0.1
8	방부제	적량
9	색소	적량
10	향료	적량
11	정제수	잔량

표2에 기재된 11번에 2,3,4,8번을 순서대로 투입하고 교반하여 용해시켰다. 이 용액에, 5번을 60℃ 정도로 가열하여 용해시킨 후, 10번을 투입하여 용해한 후 11번에 투입하였다. 마지막으로 이 용액에 1,6,7,9번을 투입하여 충분히 교반한 뒤 실온에서 72시간 숙성시켜, 본 발명에 따른 화장수를 제조하였다.

실시예 3. 영양로션 제조

실시예 1의 민들레, 자소엽, 참가사리, 연자육, 야래향 및 비파나무잎 혼합 추출물을 함유한 화장료 중 영양로션을 하기 표3의 조성으로 제조하였다.

번호	원 료	함량(중량%)
1	민들레, 자소엽, 참가사리, 연자육, 야래향 및 비파나무잎 혼합 추출물 (실시예 1)	1.0
2	밀납	1.0
3	폴리솔베이트 60	1.5
4	솔비탄 세스퀴올레이트	0.5
5	유동 파라핀	10.0
6	소르비탄 스테아레이트	1.0
7	친유형 모노스테아린산 글리세린	0.5
8	스테아린산	1.5
9	글리세릴스테아레이트/피이지-400 스테아레이트	1.0
10	프로필렌글리콜	3.0
11	카르복시폴리머	0.1
12	트리에탄올아민	0.2
13	방부제	적량
14	색소	적량
15	향료	적량
16	정제수	잔량

상기 표3에 기재된 10, 11, 13, 16번을 혼합교반하면서 80 ~ 85℃ 사이로 가열하여 제조부에 투입한 후 유화기를 작용시키고 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 12번를 80 ~ 85℃사이로 가열 용해한 후 유화하였다. 유화가 끝난후, 교반기를 이용하여 교반하면서 50℃까지 냉각한 뒤 15번을 투입하고 45℃까지 냉각한 뒤 14번을 투입하였다. 이후, 35℃에서 1번을 투입하여 25℃까지 냉각한 뒤 72시간 숙성시켜 본 발명에 따른 영양로션을 제조하였다.

실시예 4. 영양크림의 제조

실시예 1의 민들레, 자소엽, 참가사리, 연자육, 야래향 및 비파나무잎 혼합 추출물을 함유한, 화장료 중 영양크림을 하기 표 4에 기재된 조성으로 제조하였다.

번호	원 료	함량(중량%)
1	민들레, 자소엽, 참가사리, 연자육, 야래향 및 비파나무잎 혼합 추출물 (실시예 1)	1.0
2	스테아린산	2.0
3	세틸알콜	2.0
4	글리세릴모노스테아레이트	2.0
5	폴리옥시에틸렌소르비탄모노스테아레이트	0.5
6	솔비탄세스퀴올레이트	0.5
7	글리세릴모노스테아레이트/글리세릴스테아레이트/폴리옥시에틸렌스테아레이트	1.0
8	왁스	1.0
9	유동파라핀	4.0
10	스쿠알란	4.0
11	카프릴릭/카프릭트리글리세라이드	4.0
12	카르복시비닐폴리머	0.3
13	부틸렌글리콜	5.0
14	글리세린	3.0
15	트리에탄올아민	0.5
16	정제수	잔량

상기 표4에 기재된 12, 13, 14, 16번을 혼합교반하면서 80 ~ 85℃ 사이로 가열하여 제조부에 투입한 후 유화기를 작용시키고 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11번을 80 ~ 85℃사이로 가열하여 용해한 후 15번를 투입 교반하여 제조부에 투입하고 유화한다. 유화가 끝나면 교반기를 이용하여 교반하면서 35℃까지 냉각하고 1번을 투입하여 25℃까지 냉각한 뒤 72시간 숙성시켜 영양크림을 수득하였다.

실시예 5. 에센스 제조

실시예 1의 민들레, 자소엽, 참가사리, 연자육, 야래향 및 비파나무잎 혼합 추출물을 함유한 화장료 중 에센스를 하기 표 5의 조성으로 제조하였다.

번호	원 료	함량(중량%)
1	민들레, 자소엽, 참가사리, 연자육, 야래향 및 비파나무잎 혼합 추출물 (실시예 1)	1.0
2	시토 스테롤	1.7
3	폴리글리세릴 2-올레이트	1.5
4	세라마이드	0.7
5	스테아레스-4	1.2
6	콜레스테롤	1.5
7	디세틸포스페이트	0.4
8	농글리세린	5.0
9	마카다미아 오일	15.0
10	카르복시비닐폴리머	0.2
11	산탄검	0.2
12	방부제	적량
13	향료	적량
14	정제수	잔량

상기 표5에 기재된 2, 3, 4, 5 및 6번을 일정한 온도에서 균질화하여 비이온계 양친매성 지질을 제조하였다. 이 비이온계 양친매성 지질과 1, 7, 8 및 14번을 혼합하고 일정한 온도에서 균질화하여 마이크로플루이다이져를 통과하고 이어 9번를 일정한 온도에서 서서히 첨가하여 균질화시킨 후, 다시 마이크로플루이다이져에 재차 통과시켰다. 그 후, 10, 11, 12, 13번을 투입하여 분산시켜 안정화하고 실온에서 72시간 숙성시켜 본 발명에 따른 에센스를 제조하였다.

비교예 4 내지 6: 영양크림 제조

실시예4에서 실시예1의 추출물 대신에 비교예 1 또는 2를 넣는 것을 제외하고 실시예4와 동일한 방법으로 표6에 기재된 조성으로 비교예 4 내지 6에 해당하는 영양크림을 각각 제조하였다.

번호	원 료	비교예 4	비교예 5	비교예 6
2	스테아린산	2.0	2.0	2.0
3	세틸알콜	2.0	2.0	2.0
4	글리세릴모노스테아레이트	2.0	2.0	2.0
5	폴리옥시에틸렌소르비탄모노스테아레이트	0.5	0.5	0.5
6	솔비탄세스퀴올레이트	0.5	0.5	0.5
7	글리세릴모노스테아레이트/글리세릴스테아레이트/폴리옥시에틸렌스테아레이트	1.0	1.0	1.0
8	왁스	1.0	1.0	1.0
9	유동파라핀	4.0	4.0	4.0
10	스쿠알란	4.0	4.0	4.0
11	카프릴릭/카프릭트리글리세라이드	4.0	4.0	4.0
12	카르복시비닐폴리머	0.3	0.3	0.3
13	부틸렌글리콜	5.0	5.0	5.0
14	글리세린	3.0	3.0	3.0
15	트리에탄올아민	0.5	0.5	0.5
16	정제수	잔량	잔량	잔량
17	물	1.0	-	-
1	비교예 1	-	1.0	-
1	비교예 2	-	-	1.0

<실험예 1 > 세포 무독성 확인

상기 실시예1 및 비교예1 내지 3에서 제조된 추출물에 대하여 세포배양을 이용한 세포 증식 효과를 측정하였다. 세포 증식 및 독성 시험은 다음 문헌에 기재된 방법에 따라 실험하였다(Mosmann, T., Rapid Colorimetric Assay for Cellular Growth and Survival: Application to Proliferation and Cytotoxicity Assays. J. Immunol. Meth. 1983, 65, 55-63.). 세포 증식 및 독성 시험에 사용한 배지(Medium)는 10% FBS(fetal bovine serum)를 포함하는 DMEM(Dulbeco"s Modified Eagle"s Medium)에 인간섬유모세포 세포라인[Human fibroblast cell line(ATCC, CRL-2076), 구입처:한국세포주은행]을 24well plate에 1X10⁵cells/ml의 농도로 씨딩(Seeding)하였다. 씨딩 24시간 후 배지를 교체하고 실시예1의 추출물 및 비교예 1 내지 3의 추출물을 농도별로 첨가한 후 3일간 37℃, 5% CO₂ 배양기(incubator)에 배양하였다. 이후 0TT(Tetrazolium-based colorimetric)용액 1ml/well씩을 첨가한 후 37℃, CO₂ 배양기에서 4시간 후, Media를 제거하고 여기에 DMSO(dimethylsulfoxide)를 200㎕씩 첨가한 뒤 550nm에서 흡광도를 측정하였으며, 그 결과를 표 7에 나타내었다. 대조군은 시료를 무처리한 것이다.

추출물 농도 (%)	세포 증식율(%)
	비교예 1	비교예 2	비교예 3	실시예1
대조군	100	100	100	100
0.01	100.21	100.18	100.93	100.93
0.05	100.59	101.21	101.76	101.76
0.1	113.21	115.70	116.12	116.12
0.3	116.62	118.43	125.56	138.56
0.5	125.32	138.32	144.62	142.62
1.0	129.43	142.95	148.53	165.53

상기 표 7에 나타난 바와 같이, 혼합추출물인 실시예 1은 세포 수준에서 독성을 나타내지 않아 인체에 안전한 화장료 조성물로 적용이 가능하며, 단일 추출물인 비교예 1 내지 3 보다 세포를 우수하게 증식시키는 효과가 있음을 알 수 있다.

<실험예 2> 항산화 효과 확인

상기 비교예1 내지 3 및 실시예 1에 대하여 DPPH(2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl)을 이용하여 자유라디칼(Free Radical) 소거률을 측정하여 항산화 효과를 확인하였다. 0.2mM DPPH 메탄올 용액 1ml에 각각 비교예 1 내지 3 및 실시예 1을 0.3㎖ 첨가하고 실온에서 잘 교반하여 10분간 반응시켰다. 그리고 520nm에서 흡광도를 측정하고, 자유라디칼 50% 소거농도 (IC₅₀)의 값을 계산하여 그 결과를 아래의 표 8에 기재하였다.

	IC50(시료%)
비교예 1	2.4
비교예 2	2.2
비교예 3	2.4
실시예 1	1.5

상기 표 8에 나타난 바와 같이, 실시예 1의 자유라디칼 50% 소거농도 (IC₅₀)가 단일 추출물인 비교예1 내지 3에 비해 약 2배가량 향상된 값을 가짐이 확인된다. 따라서 실시예1은 비교예1 내지 3에 비해 우수한 항산화 효능을 가진다.

<실험예 3> NK-kB 활성 억제 효과 확인

면역세포에서의 염증반응에 염증을 유발시키는 물질로 LPS에 의해 염증이 유발되면 호염증성 사이토카인으로 알려진 NF-kB 활성이 증가되면서 IL-8과 TNF-α의 유전자 발현이 이루어지는 것으로 알려져 있다. 따라서, 실시예1 및 비교예 1 내지 3에 대하여 이러한 염증반응 시스템에서 호염증성 사이토카인의 생산에 중요한 역할을 하는 것으로 보고된 NF-kB의 활성 억제 효과를 측정하였다. 인간단핵구세포인 THP-1 세포(구입처: 한국세포주은행, TIB-202)를 6웰에 각각 1x10⁶개의 세포를 분주한 후, 수퍼펙트 트란스펙션 리에전트(superfect transfection reagent)를 이용하여 NF-kB 루시퍼라아제 리포터 프라스미드 DNA (NF-kB luciferase reporter plasmid DNA, 구입처:Stratagene)를 형질감염(transfection)시켰다. 형질감염 후 24시간이 경과한 후, 리포폴리사카라이드(lipopolysaccharide; LPS, 구입처 Sigma) (100ng/ml)를 처리하여 THP-1 세포를 활성화시킴과 동시에 실시예1 및 비교예1 내지 3의 추출물을 농도별(1, 5, 10, 20, 30ppm)로 처리하였다. 24시간 후 세포를 수집하여 루미노미터(luminometer)를 이용하여 NF-kB 활성을 측정하였으며, 대조군은 시료를 무처리한 것이다. 측정한 NF-kB 활성억제효과는 inhibition(%)은 하기 식1을 통해 계산하였으며, 그 결과는 표9와 같다.

[식1]

inhibition(%)= [(A-B)/A] X100

(A:대조군 측정값 B:시료처리 측정값)

농도 (ppm)	Inhibition (%)
	비교예 1	비교예 2	비교예3	실시예 1
1	4.05	4.01	4.41	5.01
5	15.74	15.23	15.45	18.71
10	32.41	39.24	40.21	42.45
20	50.53	76.41	77.67	89.51
30	78.54	87.45	85.42	97.54

상기 표9에서와 같이, 본 발명의 조성물은 단일 추출물에 비해 우수한 NF-kB 활성 억제 효과를 가진다.

<실험예 4 > 항균력 효과 확인 확인

실시예1 및 비교예 1 내지 3의 추출물을 0.1중량%로 하여 항균력 평가의 시료로 사용하였다. 각각의 균주들을 액체배지 100㎖에 백금이로 접종하여 32°C에서 20시간 배양하여 활성화시켰다. 그 배양액을 각각의 배지에 100㎕접종(10⁷~10⁸ cfu/㎖)하여 각 균주별 평판배지를 준비한 상기의 시료 20㎕를 점적한 paper disk(직경 6mm)을 배지 중앙에 올려놓고 36시간 동안 배양한 후, 생성된 저해환의 직경을 측정하였다. 대조군은 희석용매인 D.W로 하였으며 균주는 스타필로코커스 어우레어스(Staphylocuccus aureus), 칸디다 알비칸(Candida albicans)을 선택하였다. 균의 생육조건은 다음 표 10과 같이 시행하였으며, 저해환 생성측정에 의한 항균력 실험결과는 표11과 같다.

균주	배지	배양시간,온도
Staphylocuccus aureus(ATCC 29737)	Nutrient agar	48시간, 37°C
Candida albicans(ATCC 10259)	Nutrient agar	48시간, 37°C

시료	저해환의 직경(mm)
	Staphylocuccus aureus	Candida albicans
비교예 1	10	11
비교예 2	10	10
비교예 3	10	10
실시예 1	12	13

표 11에 나타난 바와 같이, 본 발명의 추출물은 민들레, 자소엽 및 참가사리 단독 추출물에 비해 포도상구균, 진균의 다양한 균에 대하여 항균력이 우수함을 확인할 수 있었다.

<실험예 5> Lipoxygense 활성억제효과 확인

항염증 효과 중에서 염증유발에 관련이 있는 lipoxygenase 활성 억제효과를 확인하는 실험이다. Lipoxygenase는 soybean에서 정제한 sigma사 제품을 사용하였으며 563 unit/ml로 희석하여 사용하였다. UV 통과 96 well plate에 Tris-HCl (100 mM, pH 8.5) buffer 155 ul에 실시예1 또는 비교예 1 내지 2의 추출물 5ul와 20 ul의 효소액을 첨가하고 상온에서5분 동안 방치 하였다. 이후, 33uM의 linolenic acid (sigma, USA) 20ul를 첨가하고 234 nm에서 200초 동안 흡광도의 변화를 측정하였다. 흡광도의 변화를 가지고 비교예 1, 비교예 2, 실시예 1에 대한 lipoxygenase 저해능 을 하기 식2를 통해 계산하였으며 이를 표12에 나타내었다. 대조군은 시료를 무처리한 것이다.

[식2]

inhibition(%)= [(A-B)/A] X100

(A:대조군 흡광도 측정값 B:시료처리 흡광도 측정값)

실시예 1은 단일 추출물 비교예 1 및 2에 비해 lipoxygenase 활성억제 효과가 더 우수하고 더 효과적인 결과를 나타내었다.

<실험예 6> 탈과립화 억제 효과 확인

세포실험을 통하여 β-헥소사미니다제 분비 양의 억제하는 효과를 측정하여 면역세포의 탈과립화를 확인하는 것으로서 염증 및 알러지 반응 효과를 평가하기 위한 시험을 시행하였다. RBL-2H3 세포주를 1% 어린 소 혈청(Fetal bovine serum)과 L-글루타민(Glutamine)을 포함하는 둘베코(Dulbeccos)에 의해 수정된 이글(Eagle)의 배지(Dulbeccos' modified Eagle's medium, 이하 DMEM)을 이용하여 37 ℃ 5% CO₂ 인큐베이터에서 배양시키고, 고착성을 갖는 세포를 트립신(Trypsin)-EDTA 용액을 사용하여 부유시킨 후 이를 분리, 회수하여 실험에 이용하였다. RBL-2H3 세포주를 활성인자(Dinitrophenol-conjugated human serum albumin, (DNP-HSA)-specific IgE)로 활성화 시킨 후 활성화된 세포에 안티젠(DNP-HSA) 50 ng/mL을 처리하고 비교예 1, 비교예 2 및 실시예 1의 추출물을 다양한 농도로 처리하여 60분(도 1의 (A)) 및 120분(도 1의 (B)) 동안 배양하였다. 이후 엘리사 관측기(ELISA reader)를 이용하여 배지 내로 분비된 β-헥소사미니다제(hexosaminidase) 양을 측정하여 억제도[inhibition(%)]를 하기 식3을 통해 계산하여, 하기 표 13에 나타내었다.대조군은 시료를 무처리한 것이다.

[식3]

inhibition(%)= [(A-B)/A] X100

(A:대조군 측정값 B:시료처리 측정값)

실시예 1은 비교예 1 및 2에 비해 농도의 증가에 따라 β-헥소사미니다제 분비양이 감소하여 그 억제 효과가 비교예 1 및 2에 비해 실시예 1에서 더 효과적인 결과를 나타내었다.

<실험예 7> 지질과산화억제효과 확인

아토피 피부염의 발생 원인이 될 수 있는 지질과산화에 대한 실시예1, 비교예1 및 비교예2의 억제효과를 확인하였다. 8% Sodium lauryl sulfate 수용액에 linolenic acid를 0.1%가 되게 용해한 후 3.9ml을 취한 후 이에 비교예 1, 비교예2 및 실시예 1를 각각 0.1ml 씩 첨가한 후 자외선을 한 시간 조사하였다. 그리고 이 용액 1 ml를 취한 후 0.8% TBA 수용액 1.5ml와 20% 초산(pH 3.5) 1.5ml를 첨가하고 1시간 동안 중탕하여 냉각한 후 정제수 1ml와 n-BuOH:Pyridine(15:1) 5ml를 가하여 진탕하였다. 이후 원심분리 후 n-BuOH층을 취해 532nm에서 흡광도를 측정하여 지질과산화 억제[inhibition(%)]를 하기 식4를 이용하여 계산하여, 그 결과를 표 14에 나타내었다. 대조군은 시료를 무처리한 것이다.

[식4]

inhibition(%)= [(A-B)/A] X100

(A:대조군 측정값 B:시료처리 측정값)

상기 표 14에서 알 수 있듯이, 실시예 1이 비교예 1 및 2에 비해 각 농도에서 더 월등한 지질과산화억제 효과가 있음이 확인되었다.

<실험예 8> 미백효과 확인

아토피로 인한 피부 색소 침착을 개선시킬 수 있는 미백 효과를 다음과 같은 방법으로 실시예1, 비교예1 및 2에 대하여 측정하였다.

murine melanoma(B16 F10) 세포(구입처:한국세포은행)를 10%의 FBS(fetal bovine serum)가 함유된 DMEM 배지로 6-웰 플레이트에 웰당 1×10⁵개로 접종한 후, 5% CO₂ 및 37℃ 하에서 세포가 웰 바닥에 약 80% 이상 부착될 때까지 배양하였다. 배양후 배지를 제거하고 실시예1, 비교예1 및 2를 세포독성이 없는 0.5중량%로 희석된 배지에 교체한 후, 5% CO₂ 및 37 ℃ 하에서 3일간 배양하였다. 배지를 제거한 세포를 PBS(phosphated buffer saline)로 세척하고, 이것을 트립신으로 처리하여 세포를 회수하였다. 회수된 세포는 혈구계 (hematocytometer)를 이용하여 세포수를 측정한 후 5,000 내지 10,000 rpm으로 10분간 원심분리한 다음 상등액을 제거하여 펠렛(pellet)을 얻었다. 이 세포 펠렛을 60℃에서 건조한 후, 10% DMSO가 함유된 1M 수산화나트륨액 100 ㎕를 넣어 60℃ 항온조에서 세포 내 멜라닌을 얻었다. 이 액을 가지고 마이크로플레이트 리더(microplate reader)로 490㎚에서 흡광도를 측정하여, 세포 일정수당 멜라닌 양을 구하였고 그 값을 하기 식5를 이용하여 계산하여 하기 표 15에 나타냈었다. 대조군은 시료를 무처리한 것이다.

[식5]

inhibition(%)= [(A-B)/A] X100

(A:대조군 측정값 B:시료처리 측정값)

시료	멜라닌 생성 억제율(%)
비교예 1	50
비교예 2	43
실시예 1	68

상기 표 15 에 나타난 바와 같이, 본 발명에 따른 실시예1은 비교예 1 및 2에 비해 멜라닌 생성 억제율이 우수하였다.

<실험예 9> 각질층 수분 보유 회복력 확인

실시예 4 및 비교예 4 내지 6에 대해 피부 각질층 수분보유 회복력 실험을 시행하였다. 아토피성 피부염의 주된 증상인 수분증발량이 많은 각질층 상태로 만들기 위해 성인 20~40세 피시험자 남녀 20명에게, sodium dodecyl sulfate 5%를 처리한 후, 30분 이상 항온항습실에서 휴식을 취하게 하였다. 또한, 팔하박부 안쪽에 4X4㎠의 구획을 설정한 후 시료를 2㎍/㎠의 두께로 1일 3회 내지 수회 도포하고 시간경과에 따라 각질층 수분증발량(TEWL)측정장치 (Tewameter, Courage+Khazake electronic Gmbh사, Germany)를 이용하여 각질층의 수분 함량을 측정하였으며, 자구적인 회복력을 비교를 위해 SDS 처리후 시료를 적용치 않은 무처리군도 함께 측정하였다. 그 결과를 표16에 나타냈었다.

상기 표16의 결과를 보면, 본 발명의 화장료인 실시예4가 단독추출물의 화장료보다 피부장벽손상 후 우수한 회복효과를 나타냄을 알 수 있다.

<실험예 10> 아토피 피부 개선효과 확인 1

실시예 4 및 비교예 5에 의해 제조된 화장료에 대하여 아토피 피부염을 가진 성인 30명을 대상으로 피부 개선효과를 측정하였다.

시험대상자를 임의로 2개조로 나누어 각 조에 실시예 4, 비교예 5를 맹검법(double-blinded test)에 의하여 각각 오른쪽과 왼쪽으로 나누어 전신에 도포하되, 가능한 한 시험시료의 효과에 영향을 미칠 수 있는 다른 보습제의 사용은 금지하였다. 시험 시료를 도포한 지 1, 2, 3, 4주 후의 효과를 스코래드 (SCORAD:SCORing Atopic Dermatitis) 측정법으로 평가하여 그 결과를 하기 표17에 나타내었다. 또한 민들레, 자소엽, 참가사리, 연자육, 야래향 및 비파나무잎 추출물을 함유하는 화장품의 사용 전후에 대한 임의의 한 실험대상자에 대한 임상적 결과 사진을 도1에 표시하였다.

1) 판정기준

① 정도 기준(Extent criteria) : 면적 = 파손부위/100

② 강도 기준(intensity criteria)

- 홍반 (1/2/3), - 부종 (1/2/3), - 삼출 (1/2/3), - 피부 벗겨짐(1/2/3),

- 태선화 정도 (1/2/3), - 건조 정도 (1/2/3)

③ 주관적 기준

- 가려움 (1-10), - 불면증 (1-10)

*스코래드 계산 = (정도기준/5) + (강도기준/7) + 주관적기준

표 17을 참조하면, 실시예 4의 화장료가 비교예 5의 화장료에 비해 아토피 피부 개선효과가 매우 우수하다는 것을 알 수 있다. 특히, 실시예 4의 4주 후의 결과를 보면 84% 정도의 우수한 개선 효과를 나타낸다.

<실험예 10> 아토피 피부 개선효과 확인 2

보호자가 느끼는 아토피 피부염 완화 효과를 살펴보기 위하여, 아토피가 있는 소아 20명에게 실시예 4 및 비교예 5의 화장료를 1개월 동안 사용한 후, 사용자의 부모가 하기 기준에 따라 피부염의 가려움증, 홍반 변화, 피부 건조증에 대한 만족도와 함께 전반적인 피부염 개선 정도 및 시험시료에 의한 부작용 여부 등을 평가한 것을 하기 표 18에 나타냈다.

(판정기준)

1	2	3	4	5
효과없음	약간있음	보통	우수	매우우수
매우불만	불만	보통	만족	매우만족

분류	피부가려움증	홍반 변화	피부 건조증	전반적 개선효과	부작용
실시예 4	4.21	3.82	3.92	4.52	4.09
비교예 5	2.25	3.17	3.14	3.11	3.95

상기 표 18에서와 같이, 본 발명에 따른 실시예 4의 화장료는 피시험자인 아토피성 피부를 갖는 소아에 대하여 전 평가항목에서 개선 효과가 있음을 확인할 수 있다.

도1은 실험예10에 따른 본 발명의 화장료 조성물의 사용 전과 후의 임상 사진이다.

Claims (11)

1. 민들레(Taraxacum officinlale), 자소엽(Perilla ocymoides), 참가사리(Gloiopeltis tenax), 연자육(Nelumbo Nucifera Seed), 야래향(Cestrum nocturnum) 및 비파나무잎(Eriobotrya Japonica Leaf)의 혼합추출물을 포함하는 화장료 조성물.
2. 제1항에 있어서, 상기 혼합추출물이 민들레 추출물: 자소엽 추출물: 참가사리 추출물: 연자육 추출물: 야래향 추출물: 비파나무잎 추출물이 1: 1: 2: 2: 0.5: 2 중량비로 혼합된 것인 화장료 조성물.
3. 제1항에 있어서, 상기 혼합추출물은 민들레, 자소엽, 참가사리, 연자육, 야래향 및 비파나무잎을 70%(v/v)함수에탄올로 추출한 것인 화장료 조성물.
4. 제1항에 있어서, 상기 혼합추출물이 화장료 조성물 총 건조중량에 대하여 0.001∼5중량%의 양으로 포함된 화장료 조성물.
5. 제1항에 있어서, 상기 화장료 조성물은 유연화장수, 영양화장수, 영양크림, 맛사지크림, 에센스 또는 팩의 제형인 화장료 조성물.
6. 제1항에 있어서, 상기 화장료 조성물은 항산화 및 항균용인 화장료 조성물.
7. 제1항에 있어서, 상기 화장료 조성물은 아토피 피부 개선용인 화장료 조성물
8. 민들레(Taraxacum officinlale), 자소엽(Perilla ocymoides), 참가사리(Gloiopeltis tenax), 연자육(Nelumbo Nucifera Seed), 야래향(Cestrum nocturnum) 및 비파나무잎(Eriobotrya Japonica Leaf)을 물, 탄소 수 1 내지 4의 무수 또는 함수 알코올, 및 에틸 아세테이트로 구성된 그룹으로부터 선택된 용매로 추출한 후, 농축하여 혼합추출물을 제조하는 단계를 포함하는 화장료 조성물 제조방법.
9. 제8항에 있어서, 상기 추출은 50℃ 내지 100℃에서, 3 시간 내지 24시간 동안 수행하는 것인 화장료 조성물 제조방법.
10. 제8항에 있어서, 추출을 4℃ 내지 30℃에서 3일 내지 20일 동안 수행하는 것인 화장료 조성물 제조방법.
11. 제8항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 용매가 70%(v/v) 함수에탄올인 화장료 조성물 제조방법.

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