KR100973195B1 - 복합 한약재 추출물을 포함하는 심혈관계 질환 예방 또는치료용 조성물 - Google Patents

복합 한약재 추출물을 포함하는 심혈관계 질환 예방 또는치료용 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 복합 한약재 추출물에 관한 것으로, 좀더 자세히는 와송, 지우초, 금은화, 귀전우, 마가목, 백지, 마치현 및 우피를 열수 또는 친수성 유기용매로 추출한 복합 한약재 추출물은 항심혈관계 질환 활성, 항동맥경화 활성 및 항콜레스테롤혈증 활성을 가짐으로써 항동맥경화, 심혈관계 질환, 고콜레스테롤 혈증 예방 및 치료제로 유용하게 사용될 수 있다.
복합 한약재 추출물, 심혈관계 질환, 동맥경화, 고지혈증, 콜레스테롤혈증

Description

복합 한약재 추출물을 포함하는 심혈관계 질환 예방 또는 치료용 조성물{Composition containing complex oriental medicine extract for prevention and treatment of cardiovascular disease}
본 발명은 복합 한약재 추출물을 포함하는 동맥경화 및 고콜레스테롤 혈증 등 심혈관계 질환의 예방 및/또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
심혈관계 질환으로서 가장 대표적인 동맥경화는 동맥혈관의 손상 및 리포프로테인으로 인한 콜레스테롤 축적 등이 발생원인으로 알려져 있다. 동맥벽은 얇은 단층의 세포로 된 내막, 평활근육 세포로 된 동맥벽의 중간층, 동맥을 보호역할을 하는 외막으로 되어 있다. 동맥경화는 동맥벽의 손상과 변성으로 동맥경화 형성을 유발하여 발병하지만, 고혈압, 고지혈증, 흡연이 중요하다. 혈액 속의 콜레스테롤 수치가 높은 고지혈증일 경우는 동맥 내막과 근육층 사이의 식세포가 많은 기름기를 세포질 속에 함유하여 동맥벽에 지방이 축적된다.
고콜레스테롤혈증 환자에서는 LDL이 산화되어 동맥혈관 벽의 내피세포를 손상시키고, 혈소판 등이 내벽에 들러붙어 동맥경화증을 유발시킨다는 프리라디칼과 지질 과산화물에 의한 조직상해설이 주목되며, 산화적 스트레스의 증가에 의한 조 직손상이 만성합병증 유발의 주요원인이다. 세포 내 산화 스트레스의 주원인인 활성산소의 지질과산화 반응은 활성산소가 체내의 단백질의 SH기나 DNA와 화학결합을 절단하고 가교 결합을 형성하여 구조적 변화를 일으키거나(Von, sonntag, 'The Chemical Basis of Radiation of biology' Tylor and Francis. (eds), London, 31, 1987; Fridovich, I., Arch . Biochem . Biophys., 247, 1, 1986) 세포막의 불포화 지방산과 연쇄반응을 통하여 지질과산화를 촉진하고, 지질과산화의 최종 산물인 말론디알데하이드(malondialdehyde)의 함량이 증가되어 동맥경화의 원인이 된다(Schraufstatter, I. et al., J. Clin . Invest., 82, 1040, 1988; Bartoli, G.M. et al., Biochem. Biophys, Acta., 966, 214, 1988).
인체는 활성산소로부터 조직 손상의 보호와 방어를 위해 항산화 활성효소인 카탈라제, 글루타치온 퍼옥시다제 등과 글루타치온, 토코페롤과 같은 항산화 물질들을 필요로 한다. 특히, 글루타치온은 동물조직 중에서 비단백 티올(nonprotein thiol)의 대부분을 차지하며 활성산소의 청소부로서 H2O2 및 과산화지질을 대사시키는 글루타치온 퍼옥시다제의 기질로, 세포 내 항산화제 중에서 중요한 역할을 담당하며, 글루타치온 결핍은 지질과산화 반응을 촉진시킨다. 고지방식이나 고콜레스테롤 식이와 같은 고지방이나 고콜레스테롤 섭취는 체내 조직의 산화적 손상을 초래한다(Mantha S.V. et al., Am J ClimNutr 17(5), 281-286, 1965; Del Boccio G. et al., Atherosiclerosis 81(2), 127-135, 1990). 고콜레스테롤 상태에서는 산화적 스트레스가 촉진된다(Balkan J. et al., Biosci Biotechnol Biochem 66(8), 1755-1758, 2002; Naito M. et al., J, Atheroscler Thromb 9(5), 243-250, 2002; Jeon S.M. et al., Life Sci 69(24), 2855-2866, 2001). 고콜레스테롤 상태에서는 수퍼옥사이드 디스뮤테이즈, 글루타치온 퍼옥시다제 및 카탈라제 등의 항산화계 효소가 감소하고 지질과산화물 함량은 증가하므로 항산화제의 섭취로 이를 개선할 수 있다(Bok S.H. et al., Int Vitam Nutr Res 72(3), 161-169, 2002), 고콜레스테롤 상태에서 산화적 스트레스를 방어하는 항산화 효소의 양과 활성이 불충분하고 항산화 방어계가 불균형 상태이면 심혈관질환이 잘 유발된다(Jeon S.M. et al., Life Sci 69(24), 2855-2866, 2001; Bok S.H. et al., Int Vitam Nutr Res 72(3), 161-169, 2002).
따라서, 본 발명의 목적은 현대인의 건강을 해치는 심혈관계 질환의 예방 및/또는 치료용 조성물을 제공하려는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명자들은 여러 가지 한약재 및 천연물에 대하여 활성을 연구하여 오던 중 와송, 지우초, 금은화, 귀전우, 마가목, 백지, 마치현 및 우피를 포함하는 복합 한약재 추출물이 심혈관계 질환인 동맥경화 및 고콜레스테롤혈증 등을 예방 및 치료하는 활성이 있음을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 복합 한약재 추출물은 항산화 활성 및 혈관 내 콜레스테롤을 낮추는 활성을 나타내므로 이에 따라 심혈관계 질환의 치료제로 사용될 수 있다. 또한, 독성이 없으므로 심혈관계 질환을 예방하거나 개선하는 건강기능성식품으로도 널리 이용될 수 있다.
동맥경화증은 저밀도 지단백 (low density lipoprotein, LDL) 입자가 동맥 내강을 빠져 나와 혈관내피세포하에 체류하여 염증을 일으키며 동맥 내면에 지방을 누적시켜 이상조직이 증식하여 동맥 내경의 협착을 일으키는 질병이다. 콜레스테롤은 LDL 및 HDL에 주로 함유되어 있고, 트리글리세리드는 주로 VLDL에 함유되어 있 다. 총콜레스테롤과 LDL-콜레스테롤은 관상동맥질환의 주요 위험인자이다. 따라서 동맥경화의 예방과 치료에 중요한 목표는 LDL이다. 임상에서는 LDL의 농도를 측정하기가 불가능하며 LDL-콜레스테롤의 농도는 LDL의 농도와 비례하므로, LDL-콜레스테롤을 참조한다. LDL-콜레스테롤의 농도가 높을수록 LDL의 농도가 높고 입자의 수가 많으므로 동맥경화의 위험이 증가한다. 반면에，HDL-콜레스테롤이 높으면 관상동맥질환이 감소한다.
혈청 내 총콜레스테롤과 중성지방 함량 측정결과 고콜레스테롤 식이 섭취군보다 본 발명의 추출물 투여군에서 유의적인 감소경향을 나타내었다.
고콜레스테롤 식이 섭취군과 비교시 본 발명의 추출물 투여군이 혈청 내 LDL-콜레스테롤 함량을 유의적으로 낮추었다. 따라서 본 발명의 추출물이 고콜레스테롤 혈청 지질수준을 낮추어주므로 체내 지질대사를 개선하여 체지방 함량을 낮추는데 효과적이었고 더 나아가 심혈관계 질환 예방에 효과적일 것으로 사료된다. 반면, 혈청 내 HDL-콜레스테롤 함량은 본 발명의 추출물 투여군에서 고콜레스테롤 식이 섭취군보다 유의적으로 높은 함량을 보였다. 이러한 혈청내 HDL-콜레스테롤 함량의 증가는 동맥경화의 진행을 억제하거나 경감시키는 작용을 하여 (Sung I.S. et al., J Kor Soc Food Sci Nutr 26(3), 494-500, 1997), 동맥경화지수가 감소된 것으로 사료된다.
또 하나의 동맥경화증의 위험인자는 세포내 산화 스트레스의 주원인인 활성산소(프리 라디칼, oxygen radical)이다. 본 발명자들은 유해 라디칼 생성에 관여하는 효소인 크산틴 산화효소 활성과 유해 라디칼 제거에 관여하는 효소인 수퍼옥 사이드 디스뮤테이즈, 카탈라제 및 글루타치온 퍼옥시다제(GSH-Px) 활성을 측정하였다. 복부 대동맥 혈관조직 내 크산틴 산화효소 활성을 보면, 고콜레스테롤 식이 섭취군보다 본 발명 추출물 투여군의 활성이 유의적으로 감소하는 경향을 나타내었다. 본 발명의 추출물 투여군에서 크산틴 산화효소 활성이 유의적으로 감소한 것은 크산틴 산화효소에 대해 강한 저해작용을 가지는 복합 한약재 추출물의 구성성분인 폴리페놀 화합물이 체내 유해 활성산소 생성기인 크산틴 산화효소 저해작용을 일으킨 것으로 사료된다.
고콜레스테롤 식이 섭취군에 비해 본 발명 추출물 투여군의 수퍼옥사이드 디스뮤테이즈 활성이 유의적으로 증가하였는데, 이는 콜레스테롤 과잉 섭취로 인한 동맥경화의 유발로 생성이 증가된 활성산소를 소거하려는 생리적 적응현상으로 활성산소의 제거효소인 수퍼옥사이드 디스뮤테이즈가 활성화된 것으로 사료된다.
또한, 고콜레스테롤 식이 섭취군에 비해 본 발명 추출물 투여군의 유의적인 카탈라제 활성 증가는 지방의 자동산화 및 유기물의 산화로 생긴 H2O2를 분해하기 위하여 카탈라제 활성이 높아진 것으로 생각된다.
복부 대동맥 혈관조직내 제 3 항산화제인 클루타치온 퍼옥시다제(GSH-Px) 활성은 고콜레스테롤 식이 섭취군에 비해 본 발명 추출물 투여군에서 유의적으로 증가하는 경향을 나타내었다.
세포 내 지질과산화반응은 동맥경화와 노화의 원인이 되기도 한다. 세포내 산화 스트레스로 인한 프리 라디칼 생성 증가 및 항산화적 방어력 약화로 지질과산 화물이 축적되는데, 환원형 글루타치온 함량이 증가하는 등 방어기구가 강화되면 지질과산화물 함량은 감소한다(Yoon Y.H. et al., Kor . J. Nutr, 27, 1007-1017, 1994). 본 발명 추출물 투여가 동맥경화의 유발을 억제시켜 복부 대동맥 혈관조직내 지질과산화를 효과적으로 저해시켜 지질과산화물(MDA) 수준을 감소시키며, 산화 스트레스의 예방과 개선이 인정된다.
인 비트로 상에서 지질과산화의 연쇄반응에 관여하는 산화성 프리 라디칼을 소거함으로써 항산화제로 작용하는 물질은 프리 라디칼인 DPPH를 하이드라진 형태로 환원시키는 능력을 측정하여 검색할 수 있다. 본 발명의 추출물 농도별 프리 라디칼 소거 활성을 DPPH에 대한 전자공여능(electron donating ability, EDA)으로 측정하였다. 추출물 농도가 증가할수록 프리 라디칼 소거활성이 증가하여 농도 의존적인 효과가 있음을 알 수 있다. 또한, 천연 항산화제로 널리 알려진 1% α-토코페롤(79.41%)과 프리 라디칼 소거활성을 비교했을 때 같은 농도의 1% 추출물의 프리 라디칼 소거활성이 유의적인 증가 경향을 보였다.
또한, 본 발명 추출물의 농도별에 따른 과산화수소 저해율(%)을 측정하였다. 본 발명 추출물의 농도가 증가할수록 유의적으로 과산화수소 저해율이 증가하여 농도 의존적인 효과를 나타내었다. 이러한 결과로부터 본 발명 추출물의 항산화 효과는 강력한 프리 라디칼 소거활성과 함께 지질과산화 억제 활성에 기인함을 유추할 수 있다. 본 발명에 의하면 본 발명 추출물은 고콜레스테롤 식이로 인한 동맥경화 등 심혈관계 질환의 예방제 또는 치료제로써 이용 가능하다.
본 발명은 와송(OROSTACHYS JAPONICUS), 지우초(SANGUISORBA OFFICINALIS), 금은화(LONICERA JAPONICA), 귀전우(WINGED SPINDLE), 마가목(Sorbus commixta Hedl.), 백지(ANGELICA DAHURICA), 마치현(PORTULACA OLERACEA) 및 우피(RHODODENDRON BRACHYCARPUM)의 열수 또는 친수성 유기용매 추출물을 포함하는 심혈관계 질환 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
본 발명은 와송(바위솔; OROSTACHYS JAPONICUS), 지우초(오이풀; SANGUISORBA OFFICINALIS), 금은화(LONICERA JAPONICA), 귀전우(화살나무; WINGED SPINDLE), 마가목(Sorbus commixta Hedl.), 백지(구릿대; ANGELICA DAHURICA), 마치현(쇠비름; PORTULACA OLERACEA), 우피(만병초; RHODODENDRON BRACHYCARPUM)를 포함하는 복합 한약재를 세절하여 완충용액에서 분쇄한 뒤 원심분리 후의 침전물을 열수 또는 친수성 유기용매로 추출하여 제조되며 심혈관계 질환, 동맥경화 및 고콜레스테롤 질환 예방 및/또는 치료 활성을 가지는 추출물을 제공한다.
와송은 돌나물과의 여러해살이풀이고, 높이는 10cm 정도이며, 잎은 녹색이나 더러는 자줏빛을 띠는데, 두껍고 다닥다닥 어긋나서 기와를 포갠 것처럼 보인다. 가을에 잎 사이에서 20cm 가량의 꽃줄기가 나와 피침 모양의 흰 꽃이 총상(總狀) 꽃차례로 핀다. 산속의 바위 위에 저절로 나는데 한국, 일본 등지에 분포한다. 와송은 암세포를 파괴하는 강한 항암효과와 간, 위장, 대장의 독성제거 효과가 알려져 있다. 또한, 만성변비, 하혈, 복통, 만성피로 개선 효능이 있는 것으로 알려져 있다.
지우초는 장미과에 속하는 다년생초로서, 오이풀(Sanguisorba officinalis)이라고도 한다. 뿌리줄기가 길게 옆으로 자라며, 줄기는 곧추 자라 키가 1.5m에 이 르는 것도 있다. 타원형의 잎은 끝과 밑부분이 둥근 모양인 잔잎 5~11개가 모여 깃털처럼 달리고, 가장자리는 3각 형태의 톱니가 고르게 있다. 짙은 붉은색의 꽃은 7~9월경 긴 꽃대에 수상(穗狀)꽃차례로 핀다. 꽃은 길이가 2.5㎝ 정도이고, 꽃받침 4장, 수술은 4개이다. 4각형의 열매는 날개가 달린 수과(瘦果)로 10월에 익는다. 전국의 산야나 평지에서 자라는데 특히 산비탈의 습기 있는 토양에서 잘 자란다. 한방에서 지혈·해독에 사용하며, 각혈·월경과다·산후복통·동상의 치료에 쓰인다.
금은화는 인동 덩굴의 꽃을 한방에서 이르는 말로서, 열을 내리고 독을 푸는 작용을 한다.
귀전우는 화살나무라고도 하며, 노박 덩굴과에 딸린 잎 지는 떨기나무이다. 키는 3m쯤 자라고 가지는 사방으로 퍼지며 잔가지에는 코르크질의 날개가 붙어 있다. 참빗나무, 홋잎나무라고도 부른다. 잎은 마디마다 2장이 마주 붙으며 잎 모양은 달걀 꼴로 양 끝이 뾰족하다. 잎의 길이는 3~5cm이고 가장자리에 작은 톱니가 있으며 잎 뒷면은 잿빛을 띤 녹색이다. 5월에 연한 녹색의 꽃이 피어 가을에 둥글납작한 열매가 갈색으로 익는다. 민간에서 위암, 식도암 등 갖가지 암에 효과가 있다고 널리 알려져 있고, 한방이나 민간에서 산후 피멎이 약, 정신불안, 여성의 자궁출혈, 대하, 어혈을 없애는 약으로 쓴다. 열매를 오래 달여 고약을 만들어 피부병 치료에 쓰기도 했다.
마가목은 장미과의 낙엽 활엽 교목으로, 높이는 5~10미터이며, 잎은 깃모양 겹잎이고 가장자리에 톱니가 있다. 초여름에 작고 흰 꽃이 가지 끝에 방상(房狀) 꽃차례로 피고 열매는 이과(梨果)로 10월에 익는다. 재목은 단단하여 세공물이나 지팡이를 만드는 데 쓰고 나무껍질과 열매는 약용한다. 깊은 산의 숲 속에서 저절로 나는데 한국, 일본, 사할린 등지에 분포한다. 열매는 괴혈병의 특효약이다. 그리고 비타민 결핍증 예방치료에 특별한 효험을 나타낸다. 열매에는 여러 가지 비타민이 풍부하게 함유되어 있어 강장 효과가 있으며, 따라서 신체허약증을 막아 준다.
백지는 산형과의 여러해살이 풀인 구릿대 뿌리를 백지라고 한다. 백지는 두통, 코막힘, 곳물이 연이어 나오는 증상을 다스린다. 사지마비 및 안질환, 부인의 대하에도 유효하며, 소염, 배농 작용이 있어 창양(瘡瘍), 종독(腫毒), 피부궤양에 활용된다. 항균 작용이 있어 대장균, 이질균, 바이러스균, 녹농균 등에 억제작용을 나타낸다.
마치현은 쇠비름을 말하는 것으로서, 맛은 시고 성질은 차다. 열을 내리고 독을 풀며, 어혈을 없애고 벌레를 죽이며 오줌을 잘 누게 한다. 약리실험에서 강심작용, 혈압을 높이는 작용, 억균작용, 자궁을 수축시키는 작용, 피를 멎게 하는 작용 등이 밝혀졌다. 대장염의 예방 치료에 주로 쓴다.
우피는 진달래과(―科 Ericaceae)에 속하는 상록관목으로서, 만병초(Rhododendron brachycarpum)라고도 한다. 키는 4m 정도 자라며 줄기는 갈색이다. 잎은 어긋나지만 줄기 끝에서는 모여나기도 한다. 잎 앞면은 진한 초록색이며 광택이 나고, 잎 뒷면은 연한 갈색 털이 빽빽하게 나 있다. 잎 가장자리는 밋밋하나 잎 뒤로 조금 말려 있다. 꽃은 7월에 흰색 또는 매우 연한 분홍색으로 피는데, 줄기 끝에 10~20송이가 무리져 달린다. 꽃부리는 깔때기처럼 생겼으며, 10개의 수술은 그 길이가 모두 다르고 수술대 밑에는 털이 달려 있다. 모든 병을 낫게 해준다고 해서 만병초라 이름지어졌다. 잎은 만병엽(萬病葉)이라 하여 콩팥이 나쁜 경우나 류머티즘에 먹으면 효과가 있고 이뇨에도 쓰인다. 주로 고산지대의 숲속에서 자라며 강원도 북쪽지방에서 흔히 볼 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 심혈관계 질환이 동맥경화, 고콜레스테롤혈증 또는 고지혈증인 것을 특징으로 한다.
본 발명은 상기 열수 또는 친수성 유기용매 추출물을 원심분리하여 잔존하는 고형물을 알칼리 추출하고, 다시 원심분리하여 그 상등액을 중화시킨 후 증류수로 투석하여 얻어지는 것을 특징으로 하는 심혈관계 질환 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.
본 발명은 상기 열수 또는 친수성 유기용매 추출물을 원심분리하여 잔존하는 고형물을 알칼리 추출하고, 다시 원심분리한 다음 그 잔존하는 고형물을 알칼리 추출하고 다시 원심분리하여 그 상등액을 중화시킨 후 증류수로 투석하여 얻어지는 것을 특징으로 하는 심혈관계 질환 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.
본 발명은 상기 열수 또는 친수성 유기용매 추출물을 원심분리하여 잔존하는 고형물을 알칼리 추출하고 다시 원심분리한 다음, 잔존하는 고형물을 알칼리 추출하고 원심분리하여 그 잔존 고형물을 녹인 후, 다시 원심분리하여 얻어진 상등액을 증류수로 투석하고 유기용매로 침전시켜 얻어지는 것을 특징으로 하는, 심혈관계 질환 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.
뿐만 아니라, 본 발명은 상기 열수 또는 친수성 유기용매 추출물을 원심분리하여 잔존하는 고형물을 알칼리 추출하고, 다시 원심분리한 다음, 잔존하는 고형물을 알칼리 추출하고 다시 원심분리하여 그 잔존 고형물을 녹인 후, 원심분리하여 얻어진 침전물을 증류수로 세척하여 얻어지는 것을 특징으로 하는, 심혈관계 질환 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한 상기 여러 가지 방식으로 얻은 추출물 중에서 선택되는 하나 이상을 유효성분으로 함유하는 심혈관계 질환 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 여러 가지 방식으로 얻은 추출물 중에서 선택되는 하나 이상을 유효성분으로 하는 심혈관계 질환 예방 또는 개선용 건강기능성 식품을 제공한다.
뿐만 아니라, 본 발명은 상기 여러 가지 방식으로 얻은 추출물 중에서 선택되는 하나 이상을 유효성분으로 하는 복부 비만·지방합성 예방 또는 개선용 건강기능성 식품을 제공한다.
본 발명자들은 동국대학교 경주 한방병원에서 구입한 와송, 지우초, 금은화, 귀전우, 마가목, 백지, 마치현 및 우피가 각각 0.5~1.5 범위에서 혼합된 건조약재 500g을 세절하여, 50mM 인산완충액-생리식염수(PBS; pH 7.2)용액에서 분쇄기(Tekmar Co., Cincinati, OH, USA)를 사용하여 분쇄한 뒤 4℃, 15,000xg, 20분간 원심분리하고 그 침전물을 열수 또는 친수성 유기용매로 추출하여 얻어진 추출물 및 추출 분획에 대하여 심혈관계질환, 동맥경화질환 및 고콜레스테롤 질환 개선 활성이 있는지를 조사하여 본 발명에 이르게 되었다. 각 한약재의 혼합 비율은 중량비로 각각 0.5~1.5 범위 이내이다. 이 범위를 벗어나는 경우 산화억제 활성 또는 혈중 콜레스테롤을 낮추는 효능이 저하되는 문제점이 있다.
본 발명은 와송, 지우초, 금은화, 귀전우, 마가목, 백지, 마치현 및 우피가 각각 0.5~1.5 범위에서 혼합된 복합 한약재 추출물을 유효성분으로 함유하는 심혈관계질환, 동맥경화질환 및 고콜레스테롤 질환을 예방하고 치료활성용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 추출물은 임상투여시에 경구 또는 비경구 투여가 가능하며 일반적인 의약품 제제의 형태로 사용될 수 있다.
즉, 본 발명의 추출물은 실제 임상투여시에 경구 및 비경구의 여러 가지 제형으로 투여될 수 있는데, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형 제제는 하나 이상의 생약추출물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트 (Calcium carbonate), 수크로스 (Sucrose) 또는 락토오스 (Lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜 (Propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔 (witepsol), 마크로골, 트윈 (tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명 추출물의 유효용량은 100～600㎎/㎏이고, 바람직하기로는 200～500㎎/㎏이며, 하루 1~3회 투여될 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 추출물을 유효성분으로 하는 건강기능성 식품을 제공한다. 본 발명의 추출물은 심혈관계 질환의 예방 또는 개선 효과를 위한 건강기능성 식품으로 다양하게 이용될 수 있다. 본 발명에 추출물을 첨가할 수 있는 식품으로는 분말, 과립, 정제, 캡슐형태의 각종 식품류, 음료, 차 등을 들 수 있다. 이때 식품 또는 음료 중의 상기 추출물의 양은 특별한 제한은 없으나, 일반적으로 본 발명의 건강기능성 식품 조성물 중량의 0.01 내지 20%중량을 추출물로 할 수 있다. 본 발명의 음료 조성물은 지시된 비율로, 필수 성분으로서 상기 추출물을 함유하는 외에는 액체성분에는 특별한 제한점은 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예는 포도당, 과당, 말토스, 슈크로스, 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제 및 합성 향미제를 가할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100㎖당 일반적으로 약 1 내지 20g, 바람직하게는 약 5 내지 10g이다.
상기 외에 본 발명의 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 충진제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 본 발명의 조성물들은 천연 과일 쥬스 및 과일 쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 특별히 제한되어 있는 것은 아니나, 본 발명의 조성물 100 중량부당 0 내지 약 20중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.
이하 실시예에 의하여 본 발명을 상세하게 설명한다.
하기 실시예는 본 발명을 구체적으로 예시하는 것이며, 본 발명의 내용이 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
<재료 및 방법>
1. 시약, 기기 및 복합 한약재 추출물 조제
혈청 지질함량 측정에는 (주)영동제약의 제품을, 콜레스테롤은 덕산사(Korea), 환원형 L-글루타치온, 글루타치온 환원효소, NADPH(β-Nicotinamide adenin dinucleotide phosphate), 크산틴(Xanthine), 크산틴 산화효소(Xanthine Oxidase) 등은 Sigma사(USA)의 제품을 사용하였으며, 그 외 일반 시약들은 특급품을 사용하였다.
건조된 한약재를 추출할 때는 한약재를 적당한 크기로 자른 다음, 막자사발, 분쇄기 등을 이용하여 완전히 분말로 하여 메탄올, 에탄올 또는 프로판올을 포함하는 친수성 유기용매 또는 열수를 이용하여 추출한다. 건조된 재료는 먼저 메탄올이나 에탄올로 추출하는 것이 바람직하다. 알코올은 세포막을 파괴함으로 세포 내의 성분을 추출할 수 있으나 에테르 또는 CHCl3 같은 비극성 용매로는 세포 내 성분을 용출시키기 어렵다.
2. 실험동물처치
실험동물은 체중 3주령 50～70g의 외견상 건강한 스프래그-돌리 종 웅성 흰쥐를 대한실험동물(주)로부터 구입 후, 사육실(온도 25℃, 상대습도 60%)에 1주일 동안 적응시켜 실험에 사용하였다. 각 실험군은 정상 대조군(normal), 식이 고콜레스테롤 투여로 동맥경화 유발군(콜레스테롤), 식이 고콜레스테롤 투여로 인한 동맥경화 유발 후 본 발명의 복합 한약재 추출물 투여군으로 나누었으며, 각 3마리씩 분리 수용하였다. 실험기간 동안 물과 사료(효창 사이언스, Korea)의 양은 제한 없이 공급하였다. 식이 콜레스테롤은 올리브유와 4:1 비율로 혼합액을 만들어 8주간 투여하여 동맥경화증을 유도하였다.
본 발명 추출물 투여군은 식이 고콜레스테롤 섭취군와 같은 방법으로 식이 고콜레스테롤를 투여하여 동맥경화증을 유도한 후, 본 발명의 추출물과 물을 3:7 비율로 희석하여 4주간 투여하였다. 모든 실험군은 처치 24시간 전부터 물만 공급하고 금식시켰다. 동물의 처치는 에테르 마취 하에 개복한 후 복부 대동맥으로부터 채혈하여 실혈사시키고 일정량의 복부대동맥 혈관조직을 적출하였다. 4℃ 상태의 생리식염수로 간문맥을 통하여 간을 관류하고 조직 내의 남아 있는 혈액을 제거한 다음 간을 적출하였다. 적출한 간과 복부대동맥 혈관조직은 생리식염수로 씻은 후 여과지로 압박하여 장기 내에 남아있는 생리식염수를 제거한 다음 무게를 측정하여 항산화 및 산화적 스트레스 관련 실험 측정용 시료로 사용하기 위해 -80℃ 냉동보관하였다. 채취한 혈액은 실온에서 30분간 방치한 다음 3.000rpm에서 15분간 원심분리하여 혈청을 얻고 혈청 내 지질 함량 측정용 시료로 사용하였다.
3. 효소시료의 조제
간 조직의 일정량을 4배량의 0.1M 인산칼륨 완충액(pH 7.4) 용액을 넣고 호모제나이저를 이용하여 마쇄 균질액을 제조하였다. 이 균질액을 600×g에서 10분간 원심분리하고, 핵 및 마쇄되지 않은 부분을 제거한 상층액을 10.000×g에서 20분간 원심분리하여 상층액을 얻어 -80℃ 냉동보관하였다. 복부 대동맥 혈관조직 마쇄 균질액도 위의 방법으로 실행하였다. 간조직 및 복부 대동맥 혈관조직 마쇄 균질액은 지질 과산화 및 크산틴 산화효소, 수퍼옥사이드 디스뮤테이즈, 카탈라제, 글루타치온 퍼옥시다제 활성도 측정용 시료로 사용하였다.
4. DPPH 라디칼 소거 항산화 활성 측정
DPPH(2,2-Diphenyl-2-picrylhydrazy) 라디칼을 소거하는 활성은 Blois(Blois MS, Nature , 181:1199-1201, 1958)의 방법을 수정하여 측정하였다. 본 발명의 복합 한약재 추출물 2㎖(각각 0.01, 0.05, 0.1, 0.5 및 1% 농도)에 0.2mM DPPH 용액 1㎖를 첨가한다. 10초간 혼합 후 30분간 실온에서 반응시킨다. 전자공여능(EDA)은 시료 첨가군과 무첨가군(대조군)의 흡광도 차이를 백분율로 나타낸다. 대조군은 시료대신 증류수로 측정하고, 양성 대조군으로 α-토코페롤을 이용하여 비교한다. 파장 517nm에서 흡광도 변화를 측정하였다.
EDA(%) = (100 - 시료 첨가군 흡광도 / 대조군 흡광도) × 100
5. 과산화수소 소거능
과산화수소 소거능은 Duh(Duh P.D. et al., Lebensm .- Wiss .u.- Technol ., 32:269-277, 1999)등과 Ruch(Ruch R.J. et al., Carcinogenesis , 10(6):1003-1007, 1989)등의 방법에 준하여 측정하였다. PBS(phosphate-buffered saline, pH 7.4)로 제조한 1mM 과산화수소 용액 0.6㎖와 시료 용액 1㎖를 30℃에서 10분간 반응시킨 뒤 230nm에서 흡광도를 측정하였다. 이때 블랭크는 과산화수소 없이 PBS 용액만으로, 대조군은 시료 용액 없이 과산화수소-PBS 용액으로 사용하였다.
과산화수소 소거능(%) = (100-시료 첨가군의 흡광도/대조군의 흡광도)×100
6. 총콜레스테롤 함량 측정
혈청 내 총콜레스테롤은 영동제품 키트를 이용하여 혈청 0.02㎖에 효소용액 3㎖를 혼합한 후 37℃ 온수에서 5분간 반응시킨 후 증류수를 블랭크로 하여 파장 500nm에서 흡광도를 측정한다.
7. 고밀도 콜레스테롤 함량 측정
혈청 내 HDL -콜레스테롤은 영동 제품 키트를 이용하여 혈청 1㎖를 원심분리용 시험관에 넣고 침전시약 0.1㎖를 넣어 혼합하여 실온에서 5분간 방치한 후 10분간 원심분리하여 상층액을 새 시험관에 옮긴다. 상층액 0.02㎖와 효소용액 3㎖을 혼합한 후 37℃ 온수에서 15분간 반응시킨다. 반응이 끝나면 증류수를 블랭크로 하여 파장 500nm에서 흡광도를 측정한다.
8. 중성지방 함량 측정
혈청 내 트리글리세라이드는 영동 제품 키트를 이용하여 혈청 0.02㎖과 사용시약 3㎖를 시험관에 넣고 혼합한 후, 37℃ 온수에서 5분간 반응시킨다. 반응이 끝난 후 사용시약을 블랭크로 하여 파장 546nm에서 흡광도를 측정한다.
9. 저밀도 콜레스테롤 함량 측정
LDL-콜레스테롤의 농도는 총콜레스테롤, HDL-콜레스테롤, 트리글리세라이드 측정치로부터 Friede-wald 방식을 이용하여 산출하였다.
LDL-콜레스테롤 =〔총콜레스테롤-(HDL-콜레스테롤+(트리글리세라이드/5))〕
10. 동맥경화지수 측정
동맥경화지수(Atherosclerotic Index, Al)는 LDL-콜레스테롤, HDL-콜레스테롤 측정치로부터 동맥경화지수를 산출하는 방식을 이용하여 계산하였다.
Al = △ (LDL-콜레스테롤 - HDL-콜레스테롤) / HDL-콜레스테롤
11. 복부 대동맥 혈관조직 내 지질과산화물 함량 측정
복부 대동맥 혈관조직 내 지질과산화물 함량은 TBA(thiobarbituric acid)와 반응하여 생성된 TBA-반응물질의 함량으로 Ohkawa(Ohkawa, H. et al., Analytical Biochem., 95, 351, 1979) 방법을 응용하여 측정하였다. 각 실험군의 복부 대동맥 혈관조직 1g과 0.05M 인산완충액(pH 7.4) 5㎖를 반씩 나누어 넣어 마쇄시킨다. 시험관에 0.5㎖의 복부 대동맥 혈관 조직 마쇄 균질액을 넣고 7% SDS(Sodium dodecyl sulfate) 1㎖를 넣어 혼합시킨 후 37℃ 온수에서 30분간 반응시킨다. 이 반응물에 0.67% TBA와 아세트산을 동량으로 혼합하여 2㎖를 넣고 잘 섞은 후, 98℃의 끓는 물에 50분간 가열한 후 급냉시켜 n-부탄올 5㎖를 넣고 원심분리 3.000×rpm에서 10분간 원심분리한다. 이 후 TBA 반응물이 존재하는 n-부탄올층을 취하여 535nm에서 흡광도를 측정하였다. 지질과산화물 함량은 조직 g당 nmole로 표시하였다.
12. 크산틴 산화효소 활성 저해효과
복부 대동맥 혈관조직 내 크산틴 산화효소 활성은 Stirpe(Stripe, F. et al., J. Biol . Chem , 244:3855, 1969)의 방법을 수정하여 측정하였다. 0.1M 인산칼슘 완충액에 크산틴 2mM의 농도로 녹여 원심분리 튜브에 1㎖을 넣고, 크산틴 산화효소 0.1㎖와 복부 대동맥 혈관조직 마쇄 균질액 0.1㎖을 넣는다. 대조군으로는 시료 대신 증류수를 동량 넣는다. 37℃에서 5분간 반응시킨다. 20% 트리클로로아세트산(TCA) 1㎖를 가하여 반응을 종료시킨다. 반응액 중에 생성된 요산(uric acid)을 파장 292nm 흡광도로 측정한다. 효소 활성도 단위는 효소 반응액 중에 함유된 단백질 1mg이 1분간 반응하여 기질인 크산틴으로부터 생성된 요산의 양을 nmole로 표시하였다.
13. 유해 활성산소 제거계 효소 수퍼옥사이드 디스뮤테이즈 활성 효과
복부 대동맥 혈관조직 내 수퍼옥사이드 디스뮤테이즈 활성은 McCord와 Fridovich(McCord, J.M. and Fridovich. I., J. Biol . chem . 244 : 6049～6055, 1969)의 방법을 수정하여 측정하였다. 0.2M 인산나트륨 완충액(pH 7.4) 672㎕, 1mM 크산틴 100㎕, 1% 데옥시염소산나트륨(DOC) 30㎕, 1.5mM 칼륨 시아나이드(KCN) 30㎕, 0.2mM 사이토크롬 C 150㎕를 넣은 혼합물에 복부 대동맥 혈관조직 마쇄 균질액 5㎕를 넣고 크산틴 산화효소 10㎕를 넣어 혼합한 후 파장 550nm에서의 흡광도 변화 를 1분 30초 동안 측정한다.
크산틴은 기질로 사용되고 사이토크롬 C는 O2 생성을 방지하는 역할을 하며, KCN은 발색액, DOC는 크산틴을 하이포크산틴으로 만드는 산화제로 사용된다. 하이포크산틴은 수퍼옥사이드 디스뮤테이즈의 활성자리에 초산화음이온 O2 -를 반응시킬수 있도록 유도한다. 수퍼옥사이드 디스뮤테이즈 활성도 단위는 효소 반응액 중에 함유된 단백질 1mg이 1분 30초 동안 반응하여 O2가 한 개의 전자를 받아들여 불완전 산화된 O2 -를 H2O2로 전환된 양을 의미하며, 특이활성도는 1mg 단백질에 해당하는 효소 단위로 환산하여 나타내었다.
14. 유해 활성산소 제거 효소 카탈라제 활성에 미치는 효과
복부 대동맥 혈관조직 내 카탈라제 활성은 Aebi(Aebi H., Catalase. In Methods of enzymatic analysis. Vergmeyer HU, ed. Academic press , New York. 2: 673-684, 1974)의 방법을 수정하여 측정하였다. 복부 대동맥 혈관조직 마쇄 균질액 0.01㎖를 50mM 인산칼륨 완충액(pH 7.4) 2.89㎖와 혼합한 후, 300mM H2O2 0.1㎖을 넣어 반응을 개시한 다음 파장 240nm에서 5분 동안 감소하는 흡광도의 양을 측정한다. 카탈라제 활성도 단위는 효소 반응액 중에 함유된 단백질 mg이 5분간 소실되는 H2O2의 양(nmole)으로 나타내었다.
15. 유해 활성산소 제거 효소 글루타치온 퍼옥시다제 활성에 미치는 효과
복부 대동맥 혈관조직 내 글루타치온 퍼옥시다제 활성은 Lawrence(Lawrence R.A. et al., Biochem Biophys Res commum 71(4): 952~958, 1976)의 방법을 수정하여 측정하였다. 복부 대동맥 혈관조직 마쇄 균질액 0.1㎖을 50mM 인산칼륨 완충액(pH 7.0) 2.6㎖에 가하고, 30mM 글루타치온 0.1㎖, 6mM NADPH 0.1㎖, 그리고 1단위의 글루타치온 환원효소를 첨가하여 혼합한 후, 25℃에서 5분간 방치한다. 여기에 7.5mM H2O2 0.1㎖를 첨가하여 반응을 개시한 후 파장 340nm에서 2분간 흡광도 변화를 측정한다. 활성도 단위는 효소 반응액 중에 함유된 단백질 mg이 2분간 산화되는 NADPH의 양(nmole)으로 나타내었다.
16. 통계분석
모든 실험결과는 평균±표준편차를 계산하였고, 각 실험군 간 즉, 정상군, 식이 콜레스테롤 섭취군, 식이 콜레스테롤 섭취 후 본 발명 추출물 투여군에 의한 효과의 유의성은 ANOVA(one-way analysis of variance)를 실시하여 검증하였고, p＜0.05 수준에서 유의성이 관찰된 경우 각 실험군 간의 평균값의 차이에 대한 유의성은 Duncan`s multiple range test를 이용하여 p＜0.05 수준에서 평가하였다.
<결과>
실시예 1: 생약추출
건조된 와송, 지우초, 금은화, 귀전우, 마가목, 백지, 마치현 및 우피가 동일량씩 혼합된 복합 한약재 500g을 세절하여, 50mM PBS (pH 7.2)용액에서 분쇄한 뒤, 4℃, 15,000xg에서 20분간 원심분리하였다. 그 후 시료 5g을 취하여 10배량의 메탄올을 가하여 70℃에서 3시간 동안 가온 침출하여 여과(동양여지 No. 1)하고 여액을 모아 감압농축 후 정량하여 실험에 사용하였다("본 발명의 추출액"). 추출액은 87.5g을 1ℓ의 물에 넣고 가열맨틀에서　３시간　진탕하여　1mm 필터를 통해 여과하고, 물에 녹지 않은 불용성 물질들은 제거하였다. 상층액은　회전식 감압 농축기(Rotary vaccum Evaporator)로 약 50% 정도로 감압 농축하였다. 또한, 인비트로에서 항산화 측정용으로는 농축액(100㎖)을 동결건조하여 동결건조분말을 얻었다(수율 15%).
실시예 2: MTT 어세이에 의한 사람동맥혈관평활근세포주(HASMC)에 대한 증식억제활성
사람 동맥혈관 평활근세포주(HASMC) 2.4×103를 각각 96웰 마이크로플레이트에 웰당 198㎕씩 분주한 후 MTT 어세이를 실시하였던 바, 상기 실시예 1에서 얻은 본 발명의 추출물에 대해 0, 5, 20, 20, 50, 100, 200㎍/㎖의 농도별로 세포증식억제 활성을 검토하였다. 200㎍/㎖까지 독성이 없으므로 이 농도 하에서 사용할 수 있다. 즉, 세포 독성이 없거나 낮은 것으로 나타나 건강기능성 보조제로서 활용할 수 있었다.
실시예 3: 추출물 농도별 DPPH 유리기 소거 효과
지질과산화의 연쇄반응에 관여하는 산화성 프리 라디칼을 소거하는 항산화 효과를 프리 라디칼인 DPPH (2,2-diphenyl-2-picrylhydrazyl)를 하이드라진 형태로 환원시키는 활성을 측정함으로써 확인하였다. DPPH는 자신이 가지고 있는 홀수의 전자 때문에 517nm에서 강한 흡수 띠를 보이나 페놀 화합물과 같이 수소에 전자를 제공해주는 전자공여체와 반응하면 전자나 수소 라디칼을 받아 페녹시 라디칼을 생성하게 된다. 따라서 흡수 띠도 사라지게 되고 안정한 분자가 된다. 또한 공여된 전자는 비가역적으로 결합하며 그 수에 비례하여 진보라색 DPPH의 색깔은 점점 옅어지게 되고 흡광도도 감소하게 된다. 본 발명의 추출물 농도별 프리 라디칼 소거 활성을 DPPH에 대한 전자공여능(electron donating ability, EDA)으로 측정하였다. 추출물 농도가 0.01%일 때 33.96±3.75%, 0.05%일 때 44±3.96%, 0.1%일 때 73.3±4.57%, 0.5%일 때 86±4.46%, 1%일 때 92.66±4.87% 소거활성을 나타내었다(표 1). 한편, 천연 항산화제로 널리 알려진 1% α-토코페롤(79.41% 소거율)을 양성 대조군으로 하여 비교하였다.
* 양성 대조군: 1% α-토코페롤 = 79.41%
* (*) 1% α-토코페롤과 비교한 P < 0.05
0% 0.05% 0.1% 0.5% 1% 양성대조군
1% 토코페롤
전자공여능
(%)
20.2±1.2
35.4±3.5
65.5±5.3
84.6±8.6
93.2±3.2*
79.41%
실시예 4: 추출물 농도에 따른 과산화수소 소거 효과
H2O2 및 수퍼옥사이드 디스뮤테이즈(SOD)는 과산화지질의 생성을 촉진하는 것으로 알려져 있으며, 과산화지질은 동맥경화, 뇌졸중 등의 성인병의 원인이고, 간조직의 세포막에 과산화지질이 증가하면 세포의 기능이 저하되어 염증이 유발되된다(Yamaguchi, N., Dev . Food Nutrition Sci ., 13, 291, 1986). 본 발명의 추출물 농도별 과산화수소 저해율을 측정한 결과, 표 2와 같은 결과를 얻었다.
과산화수소 소거 효과는 240nm 흡광도를 측정하여 저해율(%)을 구하였다.
추출물 농도 0% 0.05% 0.1% 0.5% 1%
저해율(%) 23.5±2.5 36.7±5.6 57.6±6.3 72.5±4.7 87.4±3.6*
실시예 5: 추출물의 혈청 내 총콜레스테롤 저해효과
일반적으로 총콜레스테롤 농도는 LDL-콜레스테롤 농도와 밀접한 관련을 나타내며 변동하고 총콜레스테롤의 약 80% 정도는 LDL-콜레스테롤이 차지하고 있다. 혈청 중에는 유리형 및 에스테르형 콜레스테롤이 존재한다. 에스테르형 콜레스테롤에 콜레스테롤에스테르 하이드롤라제를 반응시키면 유리형과 지방산으로 분해된다. 혈청내 총콜레스테롤 수치는 정상군 63.4±6.4㎎/㎗, 고콜레스테롤 식이 섭취군은 143.7±21.5㎎/㎗, 열수추출 농축액 투여군은 96.7±8.7㎎/㎗이다(표 3). 추출 농축액 투여군의 혈청 내 총콜레스테롤 수치는 고콜레스테롤 식이 섭취군보다 30.1% 가량 유의적으로 감소하였다. 실험군은 스프래그-돌리 종 웅성 흰쥐 각 3마리씩 정상군, 동맥경화 유도를 위한 고콜레스테롤 식이 섭취군, 고콜레스테롤 섭취 후 추출 농축액 투여군으로 나누어 처리하였다.
정상 대조군 콜레스테롤 식이군 콜레스테롤 식이+
추출 농축액 투여군

혈청 콜레스테롤(㎎/㎗)
63.4±6.4
143.7±21.5
96.7±8.7*
실시예 6: 혈청내 고밀도 콜레스테롤 수치에 대한 추출 농축액 투여군의 효과
고밀도 콜레스테롤(HDL-콜레스테롤, High Density Lipoprotein-cholesterol)은 혈액 중의 콜레스테롤을 간으로 운반시켜 혈액 중의 콜레스테롤 수치를 낮추는 작용을 한다. 황산 덱스트란과 황산 마그네슘을 이용하여 LDL과 VLDL 지단백을 침전시킨 후 상층에 남아 있는 HDL층의 콜레스테롤을 측정하였다. HDL-콜레스테롤 농도가 높으면 동맥경화증 예방가능하며, 흡연, 고혈압, 비만 등은 HDL-콜레스테롤의 감소 요인이다. 표 4와 같이 추출 농축액 투여군의 혈청 내 HDL-콜레스테롤 수치는 고콜레스테롤 식이 섭취군보다 53% 가량 유의적인 증가를 보여주었다.
정상대조군 콜레스테롤 식이군 콜레스테롤 식이+
추출 농축액 투여군
혈청 HDL-콜레스테롤
(㎎/㎗)
42.3±3.6
21.4±2.2
63.3±3.6*
혈청 중성지질 트리글리세리드(㎎/㎗)
27.7±4.5
47.5±4.3
33.6±2.7*
실시예 7: 혈청내 저밀도 콜레스테롤 저해효과
저밀도 콜레스테롤 (LDL-콜레스테롤, Low Density Lipoprotein-cholesterol)은 간조직의 콜레스테롤을 혈액으로 운반하며 혈액 중의 콜레스테롤 수치를 상승시키는 동맥경화유발인자이다. Friede-wald 공식에 의하여, 혈청내 LDL-콜레스테롤 수치는 LDL-콜레스테롤 =〔총콜레스테롤-(HDL-콜레스테롤+(트리글리세리드/5))〕로 구하였다. 결과는 표 5와 같고, 추출 농축액 투여군은 고콜레스테롤 식이 섭취군보다 65.1% 가량 유의적으로 감소하였다.
정상대조군 콜레스테롤 식이군 콜레스테롤 식이+
추출 농축액 투여군
혈청 LDL-콜레스테롤
(㎎/㎗)		 18.2±1.3 103.3±8.7 37.4±3.6*
실시예 8: 혈청 내 콜레스테롤의 동맥경화지수에 대한 효과
AI= △〔(LDL-콜레스테롤 - HDL-콜레스테롤)/ HDL-콜레스테롤〕공식을 이용하여 각 실험군의 혈청내 콜레스테롤의 동맥경화지수(AI, Atherosclerotic Index)를 산출한 결과, 혈청내 콜레스테롤의 동맥경화지수는 정상군 0.6, 고콜레스테롤 식이 섭취군 1.82, 추출 농축액 투여군 0.8이다(표 6). 이는 본 발명의 추출액 투여군이 고콜레스테롤 식이 섭취군보다 동맥경화지수가 92% 가량 유의적으로 감소함을 의미한다. 이 결과로부터 지방합성을 억제하는 비만예방치료제로서 효과가 인정된다.
정상대조군 콜레스테롤 식이군 콜레스테롤 식이+
추출 농축액 투여군

동맥경화 지수
0.6±0.03
1.82±0.2
0.8±0.01*
* 콜레스테롤 식이군과 비교하여 유의한 감소 (p＜0.05)
실시예 9: 복부 대동맥 혈관조직 내 지질과산화 억제효과
고지방식이나 고콜레스테롤 식이 섭취는 체내 조직의 산화적 손상을 초래하며 고콜레스테롤 상태에서 산화적 스트레스가 촉진되고 다양한 항산화 방어기전의 활성 변화가 관찰된다. 고콜레스테롤 상태에서는 수퍼옥사이드 디스뮤테이즈(SOD), 글루타치온 퍼옥시다제(glutathione peroxidase; GSH-Px) 및 카탈라제 등과 같은 항산화계 효소의 양은 감소하고 지질과산화물 함량은 증가하는 반면, 항산화제의 보강에 의해 이들 값이 개선되므로, 복부대동맥에서의 이들 억제활성을 검토하였다. 실험군의 간조직을 마쇄하여 부탄올 및 다른 화합물과의 지질과산화 반응을 이용하여 반응산물로 생성되는 지질과산화물 MDA를 추출하고 특정 파장 535nm에서 흡광도를 측정하였다(n=5). 복부 대동맥 혈관조직내 지질과산화의 분해산물인 지질과산화물 MDA 함량은 표 7과 같다. 복부 대동맥 혈관조직내 MDA 수준은 열수추출 농축액 투여군에서는 고콜레스테롤 식이 섭취군보다 15% 가량 유의적인 감소 경향을 보였다.
정상대조군 콜레스테롤 식이군 콜레스테롤 식이+
추출 농축액 투여군

MDA(nmole/g tissue)
23.3±2.3
35.6±2.6
28.4±1.8*
* 콜레스테롤 식이군과 비교하여 유의한 감소 (p＜0.05)
실시예 10: 복부 대동맥 혈관조직 내 크산틴 산화효소 활성 저해효과
크산틴 산화효소(XO, Xanthine oxidase)는 체내 유리기 생성계의 비특이적인 효소로 주로 퓨린체의 대사산물인 하이포크산틴을 크산틴으로, 크산틴을 다시 산화시켜 요산으로 생성하는 과정에서 유리기인 수퍼옥사이드 라디칼을 생성하는 효소이다(Ziegler, D. W. et al., Infection and Immunity, 3, 237, 1971; Duke, E. J. et al., J, Biochem , 131, 1973). 이러한 프리 라디칼의 발생은 크산틴 산화효소의 대사과정에서뿐만 아니라 포스포리파제 A2 활성의 증가, 체내로 유입된 이물질을 산화시키는 소포체의 혼합기능 산화효소계의 대사과정에서도 프리 라디칼을 생성한다고 알려져 있다(Sohal, R.S. et al. Exper , Gerontol ., 25, 499, 1980). 크산틴 산화효소 활성 반응액 중에 생성된 요산을 흡광도 292nm에서 측정하여 활성을 나타내었다. 각 값은 세 마리에 대한 평균±표준편차이다. 복부 대동맥 혈관조직내 크산틴 산화효소 활성은 고콜레스테롤 식이 섭취군(3.1±0.2 nmol/mg 단백질)에 비해 추출 농축액 투여군(2.2±0.2 nmol/mg 단백질)에서 20% 유의적으로 감소하였다.
정상대조군 콜레스테롤 식이군 콜레스테롤 식이+
추출 농축액 투여군
요산
(nmole/㎎ 단백질)
1.8±0.3
3.1±0.2
2.2±0.2*
* 콜레스테롤 식이군과 비교하여 유의한 감소 (p＜0.05)
실시예 11: 복부 대동맥 혈관조직 내 수퍼옥사이드 디스뮤테이즈 활성에 대한 효과
수퍼옥사이드 디스뮤테이즈(SOD)는 2개의 수퍼옥사이드 라디칼을 제거하여 체내 축적을 막아준다. SOD 활성 측정은 크산틴을 기질로 사용하고 사이토크롬 C는 O2 생성을 방지하는 역할을 하며, KCN은 발색액, DOC는 크산틴을 하이포크산틴으로 만드는 산화제로 사용된다. 하이포크산틴은 SOD의 활성자리에 초산화음이온 O2 -를 반응시킬수 있도록 유도한다. SOD 활성은 550nm에서 1분 30초간 흡광도를 타임 스캐닝하여 측정하였다. 각 값은 세 마리에 대한 평균±표준편차이다. 복부 대동맥 혈관조직 내 SOD 활성은 고콜레스테롤 식이 섭취군(8.83±0.7unit/mg 단백질)이 열수추출 농축액 투여군(13.2±1.1 unit/mg 단백질)에서는 23.5% 가량 유의적인 증가 경향을 나타내었다(표 9).
정상대조군 콜레스테롤 식이군 콜레스테롤 식이+
추출 농축액 투여군

Unit/mg protein
10.6±1.12
8.83±0.7
13.2±1.1*
* 콜레스테롤 식이군과 비교하여 유의한 감소 (p＜0.05)
실시예 12: 복부대동맥 혈관조직 내 카탈라제 활성화에 대한 효과
H2O2를 제거하는 카탈라제 활성은 열수추출 농축액 투여군(22.3±3.2 nmol/mg protein/min)에서는 고콜레스테롤 식이 섭취군(15.2±1.3 nmol/mg protein/min)보다 28% 가량 유의적인 증가 경향을 보였다(표 10).
정상대조군 콜레스테롤 식이군 콜레스테롤 식이+
추출 농축액 투여군

감소된 H2O2 nMol/mg protein/min
18.2±1.3
15.2±1.3
22.3±3.2*
* 콜레스테롤 식이군과 비교하여 유의한 감소 (p＜0.05)
실시예 13: 복부 대동맥 혈관조직내 글루타치온 퍼옥시다제활성에 대한 효과
글루타치온 퍼옥시다제(GSH-Px)는 모든 포유동물의 조직에서 발견되며 글루타치온을 사용하여 H2O2를 제거하며, 이때 생성된 산화형 글루타치온(GSSG)은 글루타치온 환원효소에 의해 다시 글루타치온에 의존하는 산화환원반응을 통해 세포막을 보호한다. 치료역할까지 하는 환원형 글루타치온과 제3 항산화제로 불리는 GSH-Px는 세포질 내와 미토콘드리아 내에서 세포를 지키는 항산화제이다.
산화형 글루타치온(GSSG) 형성에 따른 NADPH의 흡광도가 감소되는 속도를 340nm에서 2분간 측정하였다. 열수추출 농축액 투여군에서는 GSH-Px 활성이 35% 가량 유의적인 증가 경향을 보였다.
정상대조군 콜레스테롤 식이군 콜레스테롤 식이+
추출 농축액 투여군

감소된 NADPH nMol/mg protein/min
5.0±0.3
3.63±0.2
5.8±0.5*
* 콜레스테롤 식이군과 비교하여 유의한 감소 (p＜0.05)
도 1은 본 발명 추출물의 사람 동맥혈관 평활근 세포주(HASMC)에 대한 세포독성을 나타낸다.
도 2는 본 발명의 복합 한약재 추출물 투여군의 지질생성 억제 및 동맥경화억제 효과를 나타낸다.

Claims (9)

  1. 와송(Orostachys Japonicus), 지우초(Sanguisporba Officinalis), 금은화(Lonicera Japonica), 귀전우(Winged Spindle), 마가목(Sorbus commixta Hedl.), 백지(Angelica Dahurica), 마치현(Portulaca Oleracea) 및 우피(Rhododendron Brachycarpum)의 열수 또는 친수성 유기용매 추출물을 포함하는 심혈관계 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 심혈관계 질환은 동맥경화, 고콜레스테롤혈증 또는 고지혈증인 것을 특징으로 하는 심혈관계 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 열수 또는 친수성 유기용매 추출물을 원심분리하여 잔존하는 고형물을 알칼리 추출하고, 다시 원심분리하여 그 상등액을 중화시킨 후 증류수로 투석하여 얻어지는 것을 특징으로 하는 심혈관계 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 열수 또는 친수성 유기용매 추출물을 원심분리하여 잔존하는 고형물을 알칼리 추출하고, 다시 원심분리한 다음 그 잔존하는 고형물을 알칼리 추출하고 다시 원심분리하여 그 상등액을 중화시킨 후 증류수로 투석하여 얻어지는 것을 특징으로 하는 심혈관계 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 열수 또는 친수성 유기용매 추출물을 원심분리하여 잔존하는 고형물을 알칼리 추출하고 다시 원심분리한 다음, 잔존하는 고형물을 알칼리 추출하고 원심분리하여 그 잔존 고형물을 녹인 후, 다시 원심분리하여 얻어진 상등액을 증류수로 투석하고 유기용매로 침전시켜 얻어지는 것을 특징으로 하는, 심혈관계 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 열수 또는 친수성 유기용매 추출물을 원심분리하여 잔존하는 고형물을 알칼리 추출하고, 다시 원심분리한 다음, 잔존하는 고형물을 알칼리 추출하고 다시 원심분리하여 그 잔존 고형물을 녹인 후, 원심분리하여 얻어진 침전물을 증류수로 세척하여 얻어지는 것을 특징으로 하는, 심혈관계 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  7. 제1항의 추출물 및 제3항 내지 제6항의 추출물 중에서 선택되는 하나 이상을 유효성분으로 함유하는 심혈관계 질환 예방 또는 치료용 조성물.
  8. 와송(Orostachys Japonicus), 지우초(Sanguisporba Officinalis), 금은화(Lonicera Japonica), 귀전우(Winged Spindle), 마가목(Sorbus commixta Hedl.), 백지(Angelica Dahurica), 마치현(Portulaca Oleracea) 및 우피(Rhododendron Brachycarpum)의 열수 또는 친수성 유기용매 추출물을 유효성분으로 함유하는 심혈관계 질환 예방 또는 개선용 건강기능성 식품.
  9. 와송(Orostachys Japonicus), 지우초(Sanguisporba Officinalis), 금은화(Lonicera Japonica), 귀전우(Winged Spindle), 마가목(Sorbus commixta Hedl.), 백지(Angelica Dahurica), 마치현(Portulaca Oleracea) 및 우피(Rhododendron Brachycarpum)의 열수 또는 친수성 유기용매 추출물을 유효성분으로 함유하는 복부 비만·지방합성 예방 또는 개선용 건강기능성 식품.
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