JP2007111048A - プルーフリーディング特性を有するdnaポリメラーゼを用いるポリメラーゼ連鎖反応のための方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】プルーフリーディング活性を有するDNAポリメラーゼの効率が顕著に高まる、及び/又はDNAポリメラーゼの3'−5'−エキソヌクレアーゼ活性を低減または最適に遮断する方法。特に一本鎖、直鎖オリゴヌクレオチド、ヘアピンオリゴヌクレオチドおよびRNAおよびDNA分子である、標的基質を用いる。さらに、ポリメラーゼ連鎖反応の実施に必要な試薬を含むキットに利用できる。
【選択図】なし
Description
この実施例では、高忠実度DNAポリメラーゼを用いたERCC1のPCR増幅に対する、異なる長さの「フィード」オリゴヌクレオチド(P20−GAPDH;P30−GAPDH;P45−GAPDHおよびランダム8量体)の作用を調べる。オリゴヌクレオチドP20−GAPDH(20量体);P30−GAPDH(30量体);およびP45−GAPDH(45量体)はヒトGAPDH遺伝子座と相補的である。これらは天然糖−リン酸骨格を有する一本鎖オリゴヌクレオチドであり、3'−OH末端基の代わりに3'−リン酸を有する。ランダム8量体は、ランダム配列を有する8量体である(N8)。これは同様に天然糖−リン酸骨格および3'−OH基を有する一本鎖オリゴヌクレオチドである。
ERCC1−for: GCT GTT TGA TGT CCT GCA CGA G
ERCC1−rev: GCC TGG CCT GGG AGG ACG ATT
P20−GAPDH: GCG TCA AAG GTG GAG GAG TG [Phosp−Q]
P30−GAPDH: GCG TCA AAG GTG GAG GAG TGG GTG TCG CTG [Phosp−Q]
P45−GAPDH: GCG TCA AAG GTG GAG GAG TGG GTG TCG CTG TTG AAG TCA GAG GAG [Phosp−Q]
([Phosp−Q]:3'−OHの代わりに3'−リン酸)
この実施例では、高忠実度DNAポリメラーゼを用いたPCRに対する、ヘアピン「フィード」DNAオリゴヌクレオチドP78 3'PおよびP78 3'P−チオの作用を調べた。そのオリゴヌクレオチドは5'−領域に、ヒトGAPDH遺伝子座と相補的である配列を含む。3'−領域は、二本鎖ヘアピン構造が形成できるように、オリゴヌクレオチドの5'−領域と相補的である。これらは、3'−OH基の代わりに3'−リン酸を有するオリゴヌクレオチドである。オリゴヌクレオチドP78 3'P−チオは、最後と最後から二番目の3'−塩基の間のDNAの糖−リン酸骨格にホスホチオアートを有する。
CYST 3: CCC AAA CCC AAC CCA TAC ACA C
CYST 5: CCT TGC CTT AGA TGT GTC GGC A
P78 3'P: GCG TCA AAG GTG GAG GAG TGG GTG TCG CTG TTG AAG TCA TGA CTT CAA CAG CGA CAC CCA CTC CTC CAC CTT TGA CGC [Phosp−Q]([Phosp−Q]: 3'−リン酸instead of 3'−OH)
この実施例では、ランダム化部分またはユニバーサル塩基イノシンを含む「フィード」オリゴヌクレオチド(N14−degAATAAA; pA−I; βActpA−6I−3')の、ヒトCFTR遺伝子座由来の1.5kb断片のPCR増幅に対する作用を調べた。
CYST 3: CCC AAA CCC AAC CCA TAC ACA C
CYST 5: CCT TGC CTT AGA TGT GTC GGC A
N14−degAATAAA: NNN NNN NNN NNN NNH HND DVA ATA AA
pA−I: III III III III III III III AAT AAA
βActpA−6I−3': GTA CAC TGA CTT GAG ACC AGT TGA ATA AAI III II
この実施例では、異なる特性を有する「フィード」DNAオリゴヌクレオチドの、高忠実度DNAポリメラーゼを用いるPCRに対する作用を調べた。下記に示す配列を有するオリゴヌクレオチドGAP P78 3'P、GAP P78 3'P−チオ、N14−degAATAAAおよびPA−IをPCRに加えた。オリゴヌクレオチドGAP P78 3´PおよびGAP P78 3'P−チオはすでに実施例2に記載されており、およびオリゴヌクレオチドN14−degAATAAAおよびPA−Iはすでに実施例3に記載された。
BACT−TM.5: TCA CCC ACA CTG TGC CCA TCT ACG A
BACT−TM.3: CAG CGG AAC CGC TCA TTG CCA ATG G
GAP P78 3´P: GCG TCA AAG GTG GAG GAG TGG GTG TCG CTG TTG AAG TCA TGA CTT CAA CAG CGA CAC CCA CTC CTC CAC CTT TGA CGC [Phosp−Q]
([Phosp−Q]: 3'−リン酸)
GAP P78 3'P−チオ: GCG TCA AAG GTG GAG GAG TGG GTG TCG CTG TTG AAG TCA TGA CTT CAA CAG CGA CAC CCA CTC CTC CAC CTT TGA CG*C [Phosp−Q]
([Phosp−Q]: 3'−リン酸;*:骨格中のホスホチオアート)
N14−degAATAAA: NNN NNN NNN NNN NNH HND DVA ATA AA
pA−I: III III III III III III III AAT AAA
この実施例では、DNA骨格中のホスホチオアートの存在が異なる一本鎖45量体「フィード」オリゴヌクレオチドの、高忠実度DNAポリメラーゼによるβ−アクチンのPCR増幅に対する作用を調べた。
BACT−TM.5: TCA CCC ACA CTG TGC CCA TCT ACG A
BACT−TM.3: CAG CGG AAC CGC TCA TTG CCA ATG G
GAP45−3'P: GCG TCA AAG GTG GAG GAG TGG GTG TCG CTG TTG AAG TCA GAG GAG
GAP45−チオ: GCG TCA AAG GTG GAG GAG TGG GTG TCG CTG TTG AAG TCA GAG GA*G [Phosp−Q] ([Phosp−Q]: 3'−リン酸; *:骨格中のホスホチオアート)
この実施例では、塩基脱落スペーサーを含む「フィード」DNAオリゴヌクレオチドG45−TP−1sp−dおよびG45−TP−2sp−dの、β−アクチンによる高忠実度PCRに対する作用を調べた。下記に示す配列を有するオリゴヌクレオチドG45−TP−1sp−dおよびG45−TP−2sp−dをPCRに加えた。これらは、3'−OH基の代わりに3'−リン酸を有し、およびDNA骨格中の最後と最後から二番目の3'−塩基の間のリン酸の代わりにホスホチオアートを有する一本鎖オリゴヌクレオチドである。両種は、塩基脱落スペーサーの存在(G45−TP−1sp−d)および非存在(G45−TP−2sp−d)が異なる。
BACT−TM.5: TCA CCC ACA CTG TGC CCA TCT ACG A
BACT−TM.3: CAG CGG AAC CGC TCA TTG CCA ATG G
G45−TP−1sp−d: GCG TCA AAG GTG GAG GAG TGG GT [sp−d]GTC GCT GTT GAA GTC AGA GGA *G[Phosp−Q]([sp−d]:塩基脱落スペーサー[Phosp−Q]:3'−リン酸)
この実施例では、本発明の意味で「フィード」として用いられるRNAの、高忠実度PCR(β−アクチンのPCR増幅)に対する作用を調べた。市販の転移RNA(tRNA、R8508、シグマ社(Sigma GmbH)、ドイツ、ミュンヘン、タウフキルヒェン(Taufkirchen))およびリボソームRNA(rRNA、R6750、シグマ社)を、高忠実度PCRの「フィード」として加えた。
β−アクチン順方向: TCA CCC ACA CTG TGC CCA TCT ACG A
β−アクチン逆方向: CAG CGG AAC CGC TCA TTG CCA ATG G
この実施例では、本発明の意味での「フィード」としてのRNAの、高忠実度PCR(β−アクチンのPCR増幅)に対する作用を調べた。市販のポリA−RNA(キアゲン社(QIAGEN)、1010373)を、高忠実度PCRの「フィード」として加えた。これはホモ−A−ポリマーであり、異なる長さのポリ(A)分子の不均一な混合物を含む(主画分0.2kbないし5.0kb)。
β−アクチン順方向: TCA CCC ACA CTG TGC CCA TCT ACG A
β−アクチン逆方向: CAG CGG AAC CGC TCA TTG CCA ATG G
この実施例では、DNAの糖−リン酸骨格の最後と3'−塩基の間にホスホチオアートを有するPCRプライマーの、高忠実度PCR(β−アクチンのPCR増幅)に対する作用を調べおよび標準PCRプライマーと比較することになっていた。文献では(スケラ(Skerra),A.,ホスホロホスホチオアートプライマーはプルーフリーディング活性を有するDNAポリメラーゼによるDNA配列の増幅を改善する(Phosphoro phosphothioat primers improve the amplification of DNA sequences by DNA polymerases with proofreading activity),Nucleic Acids Res,1992,20(14),3551−3554)、糖−リン酸骨格に最後と最後から二番目の3'−塩基の間にホスホチオアートを有するPCRプライマーについて正の効果が記載されている。この実験では、実施例4から8で使用したβ−アクチンPCR系の増幅に対するそのようなプライマーの作用を、標準プライマーと比較して調べることになっていた。プライマーの作用は、濃度範囲0.2μMから1μMで試験した。
β−アクチン 順方向: TCA CCC ACA CTG TGC CCA TCT ACG A
β−アクチン 逆方向: CAG CGG AAC CGC TCA TTG CCA ATG G
β−アクチン 順方向−チオ: TCA CCC ACA CTG TGC CCA TCT ACG *A
β−アクチン 逆方向−チオ: CAG CGG AAC CGC TCA TTG CCA ATG *G
(*:骨格中のホスホチオアート)
この実施例は、ヘアピン「フィード」オリゴヌクレオチドの、酵素VentRを用いるマウスPKC遺伝子座由来の2kb断片のPCR増幅に対する作用に関する。特に、ヘアピン「フィード」DNAオリゴヌクレオチドGAP P78 3'P−チオの、いくつかの古細菌種に由来する高忠実度DNAポリメラーゼを用いる高忠実度PCRに対する作用をこの実施例で調べた。酵素VentR(ニュー・イングランド・バイオラブズ社(New England Biolabs),M0254S)は元来サーモコッカス(Thermococcus spec)に由来し、一方、前記の実施例で使用したプルーフスタート(ProofStart)ポリメラーゼは元来パイロコッカス(Pyrococcus spec.)から単離された。加えて、プルーフスタート(ProofStart)ポリメラーゼと比較して、VentRはまたPCRホットスタートを欠く。オリゴヌクレオチドGAP P78 3'P−チオは実施例2ですでに詳細に記載された。
MPUC 3: GCT GCT TGA AGA AAC GAG CGG TG
MPUC5+258: CTG CAC CTT CTG GAA TTC CGA CTC
GAP P78 3´P−チオ: GCG TCA AAG GTG GAG GAG TGG GTG TCG CTG TTG AAG TCA TGA CTT CAA CAG CGA CAC CCA CTC CTC CAC CTT TGA CG*C [Phosp−Q] ([Phosp−Q]: 3'−リン酸; *:骨格中のホスホチオアート)
この実施例では、「フィード」DNAオリゴヌクレオチドN40−チオの、いくつかの古細菌種に由来する高忠実度DNAポリメラーゼを用いる高忠実度PCR(β−アクチンのPCR増幅)に対するに対する作用を試験した。ポリメラーゼVentR(ニュー・イングランド・バイオラブズ社(New England Biolabs),M0254S)は元来サーモコッカス(Thermococcus spec)に由来し、一方、プルーフスタート(ProofStart)ポリメラーゼは元来パイロコッカス(Pyrococcus spec.)から単離された。加えて、プルーフスタート(ProofStart)ポリメラーゼと比較して、VentRはまたPCRホットスタートを欠く。「フィード」オリゴヌクレオチドは、ランダム配列ofA、C、GおよびT(N)のランダム配列を持つ一本鎖オリゴヌクレオチドであり、3'−OH基の代わりに3'−リン酸を有し、およびまたDNAの糖−リン酸骨格の最後と最後から二番目の3'−塩基の間にホスホチオアートを含む。
β−アクチン 順方向: TCA CCC ACA CTG TGC CCA TCT ACG A
β−アクチン 逆方向: CAG CGG AAC CGC TCA TTG CCA ATG G
N40−チオ: NNN NNN NNN NNN NNN NNN NNN NNN NNN NNN NNN NNN NN*N [Phosp−Q] (N: A,C,G,T; [Phosp−Q]: 3'− リン酸; *:骨格中のホスホチオアート)
この実施例では、「フィード」DNAオリゴヌクレオチドGAP45−チオの、いくつかの古細菌種に由来する高忠実度DNAポリメラーゼを用いる高忠実度PCR(マウスPKC遺伝子座由来2kb断片のPCR増幅)に対する作用を調べた。使用した酵素VentR(ニュー・イングランド・バイオラブズ社(New England Biolabs),M0254S) は元来サーモコッカス(Thermococcus spec)に由来し、一方、プルーフスタート(ProofStart)ポリメラーゼは元来パイロコッカス(Pyrococcus spec.)から単離された。オリゴヌクレオチドGAP45−チオは実施例5にすでに詳細に記載されている。
MPUC 3: GCT GCT TGA AGA AAC GAG CGG TG
MPUC5+258: CTG CAC CTT CTG GAA TTC CGA CTC
GAP45−チオ: GCG TCA AAG GTG GAG GAG TGG GTG TCG CTG TTG AAG TCA GAG GA*G [Phosp−Q] ([Phosp−Q]: 3'−リン酸; *: 骨格中のホスホチオアート)
この実施例では、「フィード」オリゴヌクレオチドN40−チオの、PCRプライマーの濃度変化と関連した、β−アクチンのPCR増幅に対する作用を調べた。この実施例では、特に、「フィード」DNAオリゴヌクレオチドN40−チオの高忠実度PCRに対する作用を、さまざまな濃度のPCRプライマーの存在下で調べ、および「フィード」オリゴヌクレオチド無しの反応と比較した。使用した「フィード」オリゴヌクレオチドN40−チオは実施例11にすでに詳細に記載されている。プライマー濃度の作用は濃度範囲0.2μMから1μMで試験した。
β−アクチン 順方向: TCA CCC ACA CTG TGC CCA TCT ACG A
β−アクチン 逆方向: CAG CAG CGG AAC CGC TCA TTG CCA ATG G
N40− チオ: NNN NNN NNN NNN NNN NNN NNN NNN NNN NNN NNN NNN NN*N [Phosp−Q] (N: A,C,G,T; [Phosp−Q]: 3'−リン酸; *: 骨格中のホスホチオアート
I.テンプレート核酸:
1.ゲノムDNA:使用したヒトゲノムDNA(HuDNAおよびgDNA)は、キアンプDNA血液マキシキット(QIAamp DNA Blood Maxi Kit)(キアゲン社(QIAGEN)、カタログ番号51192)またはフレキシジーンDNAキット(FlexiGene DNA Kit)(キアゲン社、カタログ番号51204)を用いて血液から単離された。マウスゲノムDNAは、NIH−3T3細胞からDNイージー・組織キット(DNeasy Tissue Kit)(キアゲン社、カタログ番号69504)を用いて抽出された。単離されたDNAの濃度は、後で光度法(OD260)によって測定した。
1.RNA:K562細胞由来の総RNAを、RNイージー・ミディ・キット(RNeasy Midi Kit)(キアゲン社(QIAGEN)、カタログ番号75142)を用いて単離した。
Claims (69)
- 少なくとも一種類の標的基質がポリメラーゼ連鎖反応に挿入される点で特徴づけられる、テンプレート核酸、少なくとも一種類のプライマー、デオキシリボヌクレオシド三リン酸およびプルーフリーディング活性を有するポリメラーゼが用いられるポリメラーゼ連鎖反応法。
- 少なくとも一種類の標的基質が、プルーフリーディング活性を有するポリメラーゼの3'−5'−エキソヌクレアーゼ活性を部分的にまたは完全に阻害する点で特徴づけられる、請求項1に記載のポリメラーゼ連鎖反応法。
- 標的基質が一本鎖オリゴヌクレオチドである点で特徴づけられる、請求項1または2に記載のポリメラーゼ連鎖反応法。
- 一本鎖オリゴヌクレオチドが、プルーフリーディング活性を有するポリメラーゼによって伸長されない点で特徴づけられる、請求項3に記載のポリメラーゼ連鎖反応法。
- 一本鎖オリゴヌクレオチドの3'末端での伸長の能力の欠如が修飾によってもたらされる点で特徴づけられる、請求項4に記載のポリメラーゼ連鎖反応法。
- 一本鎖オリゴヌクレオチドの3'末端を修飾するために、OH基がリン酸基または別の残基で置換される、または伸長不能がジデオキシヌクレオチド、一個または数個の逆塩基、RNA、塩基脱落部位、スペーサー、色素、消光残基、たとえばブラックホール・クエンチャー(Black Hole Quencher)、ダブシル(Dabcyl)、副溝結合剤、修飾塩基、たとえばスーパー塩基またはハロゲン化塩基または適当な塩基アナログによって達成される点で特徴づけられる、請求項5に記載のポリメラーゼ連鎖反応法。
- オリゴヌクレオチドの骨格が修飾されている点で特徴づけられる、請求項3から6のうちの一つに記載のポリメラーゼ連鎖反応法。
- オリゴヌクレオチドの骨格が少なくとも3'末端の最後の塩基と最後から二番目の塩基の間で修飾されている点で特徴づけられる、請求項7に記載のポリメラーゼ連鎖反応法。
- オリゴヌクレオチドの骨格中のリン酸がホスホチオアートで置換されている点で特徴づけられる、請求項7または8に記載のポリメラーゼ連鎖反応法。
- DNA二本鎖が形成されうるように、オリゴヌクレオチドがテンプレート核酸と少なくとも部分的に相補的である点で特徴づけられる、請求項3から9のうちの一つに記載のポリメラーゼ連鎖反応法。
- オリゴヌクレオチドがランダム配列を示す点で特徴づけられる、請求項3から9のうちの一つに記載のポリメラーゼ連鎖反応法。
- オリゴヌクレオチドが、アデニン(A)、シトシン(C)、グアニン(G)およびチミン(T)、ユニバーサル塩基(たとえばイノシン、3−ニトロピロールまたは5−ニトロ−インドール)、一個以上のウラシル、メチルシトシン、塩基アナログまたは修飾塩基の群から選択される塩基を含む点で特徴づけられる、請求項3から11のうちの一つに記載のポリメラーゼ連鎖反応法。
- オリゴヌクレオチドが一個以上のPNA(ペプチド核酸)またはLNA(ロックト核酸)を含む点で特徴づけられる、請求項3から12のうちの一つに記載のポリメラーゼ連鎖反応法。
- オリゴヌクレオチド がホモオリゴヌクレオチドである点で特徴づけられる、請求項3から9または11から13のうちの一つに記載のポリメラーゼ連鎖反応法。
- オリゴヌクレオチドが10から100塩基、好ましくは12から80、および特に20から45塩基の長さを示す点で特徴づけられる、請求項3から14のうちの一つに記載のポリメラーゼ連鎖反応法。
- オリゴヌクレオチドがポリメラーゼ連鎖反応中に0.1から20μM、好ましくは0.2から2.5μM、および特に0.5から1.5μMの濃度で存在する点で特徴づけられる、請求項3から15のうちの一つに記載のポリメラーゼ連鎖反応法。
- プルーフリーディング活性を有するポリメラーゼの標的基質に対する分子比が、1:1ないし1:1000、好ましくは1:1ないし1:500、および特に1:1ないし1:200である点で特徴づけられる、請求項3から16のうちの一つに記載のポリメラーゼ連鎖反応法。
- 少なくとも一種類の標的基質が二本鎖オリゴヌクレオチドである点で特徴づけられる、請求項1または2に記載のポリメラーゼ連鎖反応法。
- 二本鎖オリゴヌクレオチドがプルーフリーディング活性を有するポリメラーゼによって伸長され得ない点で特徴づけられる、請求項18に記載のポリメラーゼ連鎖反応法。
- オリゴヌクレオチドの骨格が修飾されている点で特徴づけられる、請求項18または19に記載のポリメラーゼ連鎖反応法。
- オリゴヌクレオチドの骨格が少なくとも3'末端の最後の塩基と最後から二番目の塩基の間で修飾されている点で特徴づけられる、請求項20に記載のポリメラーゼ連鎖反応法。
- オリゴヌクレオチドの骨格中のリン酸がホスホチオアートで置換されている点で特徴づけられる、請求項20または21に記載のポリメラーゼ連鎖反応法。
- 標的基質が、自己相補ヘアピン構造を形成できる標的配列を示す点で特徴づけられる、請求項18から22のうちの一つに記載のポリメラーゼ連鎖反応法。
- 標的基質が、塩基配列中におよび/またはDNAの骨格中に少なくとも一種類の修飾を示す点で特徴づけられる、請求項23に記載のポリメラーゼ連鎖反応法。
- 標的基質がDNA二本鎖を、少なくともポリメラーゼ連鎖反応のアニーリング段階中に形成する点で特徴づけられる、請求項18から24のうちの一つに記載のポリメラーゼ連鎖反応法。
- アニーリングが温度40ないし70℃で実施される点で特徴づけられる、請求項25に記載のポリメラーゼ連鎖反応法。
- 標的基質のヘアピン構造の場合、自己相補領域の長さが10ないし100塩基、好ましくは12から80塩基、および特に20から45塩基である点で特徴づけられる、請求項18から26のうちの一つに記載のポリメラーゼ連鎖反応法。
- 標的基質の長さが20ないし200塩基、好ましくは24ないし160塩基である点で特徴づけられる、請求項18から26のうちの一つに記載のポリメラーゼ連鎖反応法。
- オリゴヌクレオチドがポリメラーゼ連鎖反応中に0.05から20μM、好ましくは0.2ないし10μM、および特に0.2ないし2.5μMの濃度で存在する点で特徴づけられる、請求項18から28のうちの一つに記載のポリメラーゼ連鎖反応法。
- プルーフリーディング活性を有するポリメラーゼの標的基質に対する分子比が、1:0.5ないし1:1000、好ましくは1:0.5ないし1:500、および特に1:1ないし1:200である点で特徴づけられる、請求項18から29のうちの一つに記載のポリメラーゼ連鎖反応法。
- オリゴヌクレオチドの5'末端が修飾を有する点で特徴づけられる、請求項18から30のうちの一つに記載のポリメラーゼ連鎖反応法。
- 少なくとも一種類の標的基質が二本鎖DNA分子であり、ポリメラーゼ連鎖反応に用いられるプライマーのための結合部位を含まない点で特徴づけられる、請求項1または2に記載のポリメラーゼ連鎖反応法。
- 二本鎖DNA分子が、プルーフリーディング活性を有するポリメラーゼによって伸長されない点で特徴づけられる、請求項32に記載のポリメラーゼ連鎖反応法。
- 二本鎖DNA分子が3'末端に修飾を示す点で特徴づけられる、請求項32または33に記載のポリメラーゼ連鎖反応法。
- 修飾として、二本鎖DNA分子の3'末端のOH基がリン酸基で置換されている点で特徴づけられる、請求項34に記載のポリメラーゼ連鎖反応法。
- DNA分子の骨格が修飾されている点で特徴づけられる、請求項32から35のうちの一つに記載のポリメラーゼ連鎖反応法。
- DNA分子の骨格が少なくとも3'末端の最後の塩基と最後から二番目の塩基の間で修飾されている点で特徴づけられる、請求項36に記載のポリメラーゼ連鎖反応法。
- DNA分子の骨格中のリン酸がホスホチオアートで置換されている点で特徴づけられる、請求項36または37のうちの一つに記載のポリメラーゼ連鎖反応法。
- オリゴヌクレオチドが環状DNA分子である点で特徴づけられる、請求項31または37のうちの一つに記載のポリメラーゼ連鎖反応法。
- 少なくとも一種類の標的基質が、ポリメラーゼ連鎖反応に用いられるプライマーのための結合部位を含まない一本鎖DNA分子である点で特徴づけられる、請求項1または2に記載のポリメラーゼ連鎖反応法。
- 一本鎖DNA分子が、プルーフリーディング活性を有するポリメラーゼによって伸長されない点で特徴づけられる、請求項40に記載のポリメラーゼ連鎖反応法。
- 一本鎖DNA分子が3'末端に修飾を示す点で特徴づけられる、請求項40または41に記載のポリメラーゼ連鎖反応法。
- 修飾として、一本鎖DNA分子の3'末端のOH基がリン酸基で置換されている点で特徴づけられる、請求項42に記載のポリメラーゼ連鎖反応法。
- DNA分子の骨格が修飾されている点で特徴づけられる、請求項40から43のうちの一つに記載のポリメラーゼ連鎖反応法。
- DNA分子の骨格が少なくとも3'末端の最後の塩基と最後から二番目の塩基の間で修飾されている点で特徴づけられる、請求項44に記載のポリメラーゼ連鎖反応法。
- DNA分子の骨格中のリン酸がホスホチオアートで置換されている点で特徴づけられる、請求項44または45のうちの一つに記載のポリメラーゼ連鎖反応法。
- オリゴヌクレオチドが環状DNA分子である点で特徴づけられる、請求項40から46のうちの一つに記載のポリメラーゼ連鎖反応法。
- ポリメラーゼの標的基質に対する比が1:20ないし1:1000である点で特徴づけられる、請求項32から47のうちの一つに記載のポリメラーゼ連鎖反応法。
- いくつかの配列モチーフを有する一群のDNA分子が標的基質として用いられる点で特徴づけられる、請求項32から48のうちの一つに記載のポリメラーゼ連鎖反応法。
- 標的基質がDNA二本鎖を、少なくともポリメラーゼ連鎖反応のアニーリング段階中に形成する点で特徴づけられる、請求項32から49のうちの一つに記載のポリメラーゼ連鎖反応法。
- アニーリングが温度40ないし70℃で実施される点で特徴づけられる、請求項40に記載のポリメラーゼ連鎖反応法。
- 標的基質の長さが最大10,000塩基である点で特徴づけられる、請求項32から51のうちの一つに記載のポリメラーゼ連鎖反応法。
- DNA二本鎖の5'末端が修飾を有する点で特徴づけられる、請求項32から39のうちの一つに記載のポリメラーゼ連鎖反応法。
- 標的基質がRNAである点で特徴づけられる、請求項1または2に記載のポリメラーゼ連鎖反応法。
- RNAがジデオキシヌクレオチドを含む点で特徴づけられる、請求項54に記載のポリメラーゼ連鎖反応法。
- RNAが3'末端に修飾を示す点で特徴づけられる、請求項54または55に記載のポリメラーゼ連鎖反応法。
- RNAの3'末端への修飾として、OH基がリン酸基で置換されている点で特徴づけられる、請求項56に記載のポリメラーゼ連鎖反応法。
- RNAの骨格が修飾されている点で特徴づけられる、請求項54から57のうちの一つに記載のポリメラーゼ連鎖反応法。
- オリゴヌクレオチドの骨格が少なくとも3'末端の最後の塩基と最後から二番目の塩基の間で修飾されている点で特徴づけられる、請求項58に記載のポリメラーゼ連鎖反応法。
- オリゴヌクレオチドの骨格中のリン酸がホスホチオアートで置換されている点で特徴づけられる、請求項58または59のうちの一つに記載のポリメラーゼ連鎖反応法。
- RNAがいくつかの配列モチーフを有する一群のRNA分子を含む点で特徴づけられる、請求項54から60のうちの一つに記載のポリメラーゼ連鎖反応法。
- RNA標的分子がホモポリマーである点で特徴づけられる、請求項54から61のうちの一つに記載のポリメラーゼ連鎖反応法。
- 標的基質がDNA/RNA二本鎖を、少なくともポリメラーゼ連鎖反応のアニーリング段階中に形成する点で特徴づけられる、請求項54から62のうちの一つに記載のポリメラーゼ連鎖反応法。
- アニーリングが温度40ないし70℃で実施される点で特徴づけられる、請求項63に記載のポリメラーゼ連鎖反応法。
- 標的基質の長さが10ないし10,000塩基である点で特徴づけられる、請求項54から64のうちの一つに記載のポリメラーゼ連鎖反応法。
- RNAの5'末端が修飾を有する点で特徴づけられる、請求項54から65のうちの一つに記載のポリメラーゼ連鎖反応法。
- ポリメラーゼ連鎖反応の実施のための、好ましくは請求項1から66のうちの一つに記載のポリメラーゼ連鎖反応の実施のための、キットが少なくとも一種類の標的基質を含むキット。
- キットがまた少なくとも一種類のプライマー、デオキシリボヌクレオシド三リン酸、一つのPCR緩衝液、Mg2+イオンを含む一種類の溶液、PCR添加剤および/または一つのプルーフリーディング活性を有するポリメラーゼを含む点で特徴づけられる、請求項67に記載のキット。
- 選択されたPCR添加剤がベタイン、ポリエチレングリコール(PEG)、デキストラン、グリセロール、ジメチルスルホキシド(DMSO)、ウシ血清アルブミン(BSA)、一本鎖DNA結合タンパク質および/または(非イオン性)界面活性剤からである点で特徴づけられる、請求項68に記載のキット。
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