KR100967040B1 - 항치주병균 조성물, 상기 항치주병균 조성물을 함유하는항치주병용 음식물 및 구강용 세정제 - Google Patents
항치주병균 조성물, 상기 항치주병균 조성물을 함유하는항치주병용 음식물 및 구강용 세정제 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 부작용이 없어 안전하고, 비병원성 구강내 상재균의 생육에 영향을 주지 않아 치주병균에 대해 우수한 제균효과를 갖는 항치주병균 조성물, 항치주병용 음식물 및 구강용 세정제를 제공한다. 항치주병균 조성물에 카카오 매스 중에 포함되는 코코아 성분, 상기 코코아 성분의 열수 추출물, 상기 코코아 성분 유래의 폴리페놀 또는 상기 코코아 성분 유래의 유리 지방산류를 유효성분으로서 함유시켜, 이 항치주병균 조성물을 음식물 또는 구강용 세정제에 배합한다. 상기 코코아 성분은 코코아 및/또는 카카오 매스인 것이 바람직하다. 또한, 상기 유리 지방산류는 팔미트산, 스테아르산, 올레산 및 리놀레산으로부터 선택된 적어도 1종류 이상을 포함하는 것인 것이 바람직하다.
항치주병균, 구강용 세정제, 유리 지방산류, 폴리페놀, 코코아 성분
Description
본 발명은 카카오 매스(cacao mass) 중에 포함되는 코코아 성분(cocoa fraction)을 유효성분으로서 함유하는 항치주병균 조성물, 상기 항치주병균 조성물을 함유하는 항치주병용 음식물 및 구강용 세정제에 관한 것이다.
치주염(periodontitis)이나 치조농루(periodontoclasia) 등의 치주병은 성인 치아손실의 주원인으로, 후생노동성도 1988년부터 치주병 예방에 몰두하고 있지만, 그 이환율(罹患率)은 해마다 상승하고 있다. 예를 들면, 35~64세 일본인의 80% 전후가 치육염(gingivitis)(치주병 초기)이나 치주염(치주병 후기)이 의심되고 있고, 25~34세까지의 젊은 세대에서도 치육염은 약 60%에 달하고, 치주염으로 진행되고 있는 환자도 10% 이상 있다고 한다.
또한, 미국 치주병학회의 조사에 의하면, 치주병 환자는 건강한 사람에 비해 심근경색을 일으킬 위험이 약 2.8배 높고, 더욱이, 여성의 경우 조산의 위험이 약 7.5배나 되는 것이 판명되어 있다. 또한, 폐렴, 천식, 인두염 등의 호흡기질환을 일으키기 쉬워지거나 혈당값 조절이 곤란해져, 결과적으로 당뇨병을 악화시키게 된 다고도 한다.
치주병의 주된 원인은, 치주 포켓(periodental pocket)에 축적되는 치구(dental plaque) 속의 세균이다. 통상, 건강한 사람의 치주 포켓에서는 그람 양성균(Gram-positivie bacteria)이 대부분을 차지하고 있지만, 치주병이 진행됨에 따라 포르피로모나스(박테로이데스) 진지발리스(Porphyromonas(Bacteroides) gingivalis), 푸소박테리움 뉴클레아텀(Fusobacterium nucleatum), 액티노바실러스 액티노미세템코미탄스(Actinobacillus actinomycetemcomitans) 등의 그람 음성균이 증가한다. 그리고, 중증의 성인 치주병자의 병소부(病巢部)로부터는 높은 비율로 그람 음성균, 특히 포르피로모나스 진지발리스가 검출되어 상기 균에 대한 환자혈청 중의 항체값도 상승하고 있는 예가 많다. 또한, 동물에 포르피로모나스 진지발리스를 접종하면 치주의 염증을 악화시키는 것이 나타나 있고, 이들 결과로부터 포르피로모나스 진지발리스가 치주질환의 성립과 진행에 중요한 작용을 하고 있는 것이 시사되어, 치주병의 병원균(치주병균)으로서 유력시되고 있다.
치주병의 증상 개선방법으로서는, 항염증 효과에 의한 치주염 예방 또는 치료를 들 수 있는데 이들은 대증요법(對症療法)이고, 항균작용에 의한 예방 또는 치료는 보다 근본적인 원인제거이다.
따라서, 치주병의 증상 개선을 위해서는 치주 포켓에 있어서의 포르피로모나스 진지발리스 등의 그람 음성균의 생육을 저해하는 것이 중요하고, 이들 균에 대해 유효한 여러 가지 항균성 물질을 배합한 치마제(dentifrice)나 함수제(mouthwash) 등이 개발되어 시판되고 있다.
예를 들면, 일본국 특허공개 제(평)3-218320호 공보(특허문헌 1)에는, 차의 물 내지 열수 추출물 또는 에탄올 등의 친수성 유기용매 추출물을 유효성분으로 하는 항치주병 및 구취 예방제가 개시되어 있다.
또한, 일본국 특허공개 제(평)4-77424호 공보(특허문헌 2)에는, 치주병 병원균 박테로이데스 진지발리스(Bacteroides gingivalis)의 특이적인 생육 저해작용을 가지고, 더욱이 박테로이데스 진지발리스가 생산하는 콜라게나아제 저해작용을 갖는 항치주병제로서, 몰식자산(gallic acid), (+)-카테킨, (+)-갈로카테킨(gallocatechin), (-)-에피카테킨(epicatechin), (-)-에피갈로카테킨, (-)-에피카테킨갈레이트, (-)-에피갈로카테킨갈레이트 및 이들의 2량체, 3량체 등의 차(Cameria sinensis)로부터 추출된 카테킨류를 유효성분으로서 함유하는 것을 특징으로 하는 항치주병제가 개시되어 있다.
또한, 일본국 특허공개 제(평)6-56687호 공보(특허문헌 3)에는, 찻잎의 물 내지 열수 추출물 또는 에탄올 등의 친수성 유기 용매 추출물을 유효성분으로 하는 치구 제거제 및 치석침착(calculus deposition) 방지제가 개시되어 있다.
또한, 일본국 특허공개 제(평)7-238028호 공보(특허문헌 4)에는, 알칼리제를 사용해서 알칼리 처리한 카카오 매스 또는 상기 카카오 매스로부터 착유(搾油)하여 얻어지는 코코아 파우더로부터 극성용매로 추출한 추출물 또는 그의 분해물을 함유하는 것을 특징으로 하는 치구형성 억제제가 개시되어 있다.
또한, 일본국 특허공개 제(평)8-81380호 공보(특허문헌 5)에는, 중량 평균분자량이 800~10,000, 중합도가 3~30인 폴리페놀을 유효성분으로 하는 항치주병제가 개시되어 있다.
상기 특허문헌 1~3, 5에 개시되어 있는 바와 같이, 지금까지 차의 추출물을 유효성분으로 하는 항치주병제 등은 많이 제안되어 있지만, 카카오 매스 중에 포함되는 코코아 성분이나 그 추출물이 치주병균에 대해 항균효과를 갖는 것은 보고되어 있지 않다. 예를 들면, 상기 특허문헌 4에는, 알칼리제를 사용해서 알칼리 처리한 카카오 매스 또는 상기 카카오 매스로부터 착유하여 얻어지는 코코아 파우더의 추출물 또는 그 분해물이 우식(dental cavity) 원인균인 스트렙토코커스 뮤탄스(Streptococcus mutans)에 의한 글루칸의 치아로의 부착축적(치구형성)을 억제하는 것이 기재되어 있지만 치주병균으로의 항균효과에 대해는 조금도 기재되어 있지 않다.
또한, 종래의 항균성 물질을 배합한 치마제나 함수제 등으로는 충분한 항균효과가 얻어지지 않는 경우도 많았다. 한편, 예를 들면, 테트라사이클린 등의 항생물질은 우수한 항균활성을 갖지만, 내성균의 출현이나 부작용 등의 문제 때문에 그 사용에는 제한이 있었다. 더욱이, 항생물질은 치주병균 뿐 아니라 비병원성 구강내 상재균의 생육까지도 저해해 버리기 때문에, 구강내 상재균총(indigenous bacteria flora)의 균형에 악영향을 끼친다고 하는 문제도 있었다.
이와 같이, 치주병의 치료는 치과의학에 있어서의 가장 어려운 문제 중 하나로, 지금까지 치주병의 효과적인 예방책은 없어, 향후 노령화가 진행되면서 치주질환의 예방은 중요한 문제가 될 것이다.
따라서, 본 발명의 목적은 부작용이 없어 안전하고, 비병원성 구강내 상재균 의 생육에 영향을 주지 않아 치주병균에 대해 우수한 제균(除菌)효과를 갖는 항치주병균 조성물, 항치주병용 음식물 및 구강용 세정제를 제공하는 것에 있다.
발명의 개시
본 발명자 등은 상기 목적을 달성하기 위해 예의 연구한 결과, 코코아가 포르피로모나스 진지발리스 등의 치주병균의 생육을 저해하여 우수한 항치주병균 활성을 갖는 것을 발견하고 이 사실을 토대로 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
즉, 본 발명의 제1 발명은, 카카오 매스 중에 포함되는 코코아 성분을 유효성분으로서 함유하는 것을 특징으로 하는 항치주병균 조성물을 제공하는 것이다.
상기 제1의 발명에 의하면, 초콜릿이나 코코아의 원료로서 옛날부터 섭취되고 있는 코코아 성분을 유효성분으로 하기 때문에, 부작용의 염려가 없어 안전하고, 우수한 제균효과를 갖는 항치주병균 조성물을 제공할 수 있다. 또한, 코코아 성분은 영양적으로도 우수한 소재로, 피로리균(H. pyrori)에 대한 제균효과 등도 가지고 있기 때문에(일본국 특허 제3110020호 공보 참조), 영양 보급효과나 건강 유지효과도 동시에 기대할 수 있다.
본 발명의 제2 발명은, 카카오 매스 중에 포함되는 코코아 성분의 열수 추출물을 유효성분으로서 함유하는 것을 특징으로 하는 항치주병균 조성물을 제공하는 것이다.
상기 제2의 발명에 의하면, 보다 우수한 제균효과를 갖는 항치주병균 조성물을 제공할 수 있다. 또한, 코코아 성분의 열수 추출물은 불용성 성분을 포함하지 않기 때문에 음식물 등에 용이하게 배합할 수 있다.
본 발명의 제3 발명은, 카카오 매스 중에 포함되는 코코아 성분 유래의 폴리페놀을 유효성분으로서 함유하는 것을 특징으로 하는 항치주병균 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 제4 발명은, 카카오 매스 중에 포함되는 코코아 성분 유래의 유리(free) 지방산류를 유효성분으로서 함유하는 것을 특징으로 하는 항치주병균 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 제5 발명은, 카카오 매스 중에 포함되는 코코아 성분 유래의 폴리페놀 및 코코아 성분 유래의 유리 지방산류를 유효성분으로서 함유하는 것을 특징으로 하는 항치주병균 조성물을 제공하는 것이다.
상기 제3, 4, 5의 발명에 의하면, 우수한 제균효과를 갖는 동시에 사용하기 편리한 항치주병균 조성물을 제공할 수 있다.
본 발명의 제6 발명은, 상기 제4 또는 제5의 발명에 있어서, 상기 유리 지방산류는 팔미트산(palmitic acid), 스테아르산(stearic acid), 올레산(oleic acid) 및 리놀레산(linoleic acid)으로부터 선택된 적어도 1종류를 포함하는 것인 항치주병균 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 제7 발명은, 상기 제1 내지 제6의 발명 중 어느 하나에 있어서, 상기 코코아 성분이 코코아 및/또는 카카오 매스인 항치주병균 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 제8 발명은, 상기 제1 내지 제7의 발명 중 어느 하나에 있어서, 비병원성 구강내 상재균의 생육을 저해하지 않고 치주병균에 대해 항균작용을 갖는 항치주병균 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 제9 발명은, 상기 제1 내지 제8의 발명 중 어느 하나에 있어서, 상기 치주병균은 포르피로모나스속, 프레보텔라(Prevotella)속, 푸소박테리움속 또는 액티노바실러스속 중 어느 하나에 속하는 균인 항치주병균 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 항치주병균 조성물은, 비병원성 구강내 상재균의 생육을 저해하지 않고 치주병 환자의 병소부로부터 높은 비율로 검출되는 치주병균을 효율적으로 제균할 수 있다.
본 발명의 제10 발명은, 상기 제1 내지 제9의 발명 중 어느 하나에 기재된 상기 항치주병균 조성물을 함유하는 것을 특징으로 하는 항치주병용 음식물을 제공하는 것이다.
본 발명의 제11 발명은, 상기 제1 내지 제9의 발명 중 어느 하나에 기재된 상기 항치주병균 조성물을 함유하는 것을 특징으로 하는 구강용 세정제를 제공하는 것이다.
상기 제10, 11의 발명에 의하면, 코코아 성분에 유래하는 성분을 유효성분으로서 함유하는 항치주병균 조성물을 함유시킴으로써, 안전하고 간편하게 치주병을 예방할 수 있는 항치주병용 음식물 및 구강용 세정제를 제공할 수 있다.
도면의 간단한 설명
도 1은 전체 코코아 성분의 열수 현탁용액을 첨가한 배지에서, 치주병균인 포르피로모나스 진지발리스(Porphyromonas
gingivalis ATCC33277)를 배양했을 때의 생균수의 경시적 변화 나타내는 도면이다.
도 2는 전체 코코아 성분의 열수 현탁용액을 첨가한 배지에서, 치주병균인 푸소박테리움 누클레아텀(Fusobacterium
nucleatum ATCC22586)을 배양했을 때의 생균수의 경시적 변화 나타내는 도면이다.
도 3은 전체 코코아 성분의 열수 현탁용액을 첨가한 배지에서, 치주병균인 프레보텔라 인터미디어(Prevotella
intermedia ATCC25611)를 배양했을 때의 생균수의 경시적 변화 나타내는 도면이다.
도 4는 전체 코코아 성분의 열수 현탁용액을 첨가한 배지에서, 치주병균인 액티노바실러스 액티노미세템코미탄스(Actinobacillus
actinomycetemcomitans ATCC33844)를 배양했을 때의 생균수의 경시적 변화 나타내는 도면이다.
도 5는 코코아 성분의 열수 추출용액을 첨가한 배지에서, 치주병균인 프레보텔라 니그레센스(Prevotella
nigrescens ATCC33563)를 배양했을 때의 생균수의 경시적 변화 나타내는 도면이다.
도 6은 코코아 성분의 열수 추출용액을 첨가한 배지에서, 치주병균인 푸소박테리움 누클레아텀(Fusobacterium
nucleatum ATCC22586)을 배양했을 때의 생균수의 경시적 변화 나타내는 도면이다.
도 7은 코코아 성분의 열수 추출용액을 첨가한 배지에서, 비병원성 구강내 상재균인 스트렙토코커스 안기노서스(Streptococcus
anginosus ATCC333977)를 배양 했을 때의 생균수의 경시적 변화 나타내는 도면이다.
도 8은 코코아 성분의 열수 추출용액을 첨가한 배지에서, 비병원성 구강내 상재균인 스트렙토코커스 살리발리우스(Streptococcus
salivalius ATCC7075)를 배양했을 때의 생균수의 경시적 변화 나타내는 도면이다.
도 9는 코코아 성분의 열수 추출용액을 첨가한 배지에서, 비병원성 구강내 상재균인 스트렙토코커스 산구이니스(Streptococcus
sanguinis ATCC10556)를 배양했을 때의 생균수의 경시적 변화 나타내는 도면이다.
도 10은 전체 코코아 성분의 열수 현탁용액을 첨가한 배지에서, 치주병균인 포르피로모나스 진지발리스(Porphyromonas
gingivalis ATCC33277)를 배양했을 때의 생균수의 경시적 변화 나타내는 도면이다.
도 11은 코코아용액 또는 코코아용액으로부터 추출한 폴리페놀 획분(fraction)(50% 메탄올 추출획분)을 첨가한 배지에서, 치주병균인 포르피로모나스 진지발리스(Porphyromonas
gingivalis ATCC33277)를 배양했을 때의 생균수의 경시적 변화 나타내는 도면이다.
도 12는 상기 50% 메탄올 추출획분의 수용성 획분(PVPP 처리 전 획분), 또는 상기 획분으로부터 폴리페놀을 흡착 제거한 획분(PVPP 처리 후 획분)을 첨가한 배지에서, 치주병균인 포르피로모나스 진지발리스(Porphyromonas
gingivalis ATCC33277)를 배양했을 때의 생균수의 경시적 변화 나타내는 도면이다.
도 13은 상기 50% 메탄올 추출획분(코코아 유래의 폴리페놀), 또는 차 카테킨(tea-catechin)을 첨가한 배지에서, 치주병균인 포르피로모나스 진지발리스 (Porphyromonas
gingivalis ATCC33277)를 배양했을 때의 생균수의 경시적 변화 나타내는 도면이다.
도 14는 코코아용액으로부터 추출한 유리 지방산 획분(헥산-메탄올 추출획분)을 첨가한 배지에서, 치주병균인 포르피로모나스 진지발리스(Porphyromonas
gingivalis ATCC33277)를 배양했을 때의 생균수의 경시적 변화 나타내는 도면이다.
도 15는 코코아 성분의 열수 추출용액 또는 「FFA comp.」를 첨가한 배지에서, 치주병균인 포르피로모나스 진지발리스(Porphyromonas
gingivalis ATCC33277)를 배양했을 때의 생균수의 경시적 변화 나타내는 도면이다.
도 16은 코코아 성분의 열수 추출용액 또는 「FFA comp.」를 첨가한 배지에서, 치주병균인 프레보텔라 니그레센스(Prevotella
nigrescens ATCC33563)를 배양했을 때의 생균수의 경시적 변화 나타내는 도면이다.
발명을 실시하기 위한 최선의 형태
본 발명에 있어서 코코아 성분이란, 카카오 매스로부터 코코아 버터를 제거한 성분을 의미하고, 주로 단백질, 당질, 식물섬유(수용성 난소화성 다당류, 헤미셀룰로오스(hemicellulose), 셀룰로오스, 리그닌(lignin) 등), 인지질, 무기질(인, 마그네슘, 칼슘, 철, 아연, 구리, 칼륨, 나트륨 등), 비타민 A, 비타민 B군, 비타민 C, 비타민 E(각종 토코페롤 등), 나이아신(niacin), 옥살산, 구연산, 사과산, 호박산, 젖산, 초산, 폴리페놀류(탄닌, 에피카테킨, 카테킨, 케르세틴(quercetin) 등), 무수 카페인, 테오브로민(theobromine), 각종 유리 지방산류(팔미트산, 스테 아르산, 올레산, 리놀레산 등) 등을 함유하고 있다.
상기 코코아 성분으로서는, 구체적으로는 카카오 매스로부터 코코아 버터를 착유하여 얻어지는 코코아(코코아 파우더)나, 카카오 매스 자체를 바람직하게 사용할 수 있다.
또한, 코코아 성분의 열수 추출물이란, 상기 코코아 성분을 열수로 추출하여 얻어지는 코코아 성분의 수용성 획분으로, 코코아 성분에 포함되는 상기 유기산류, 유리 지방산류, 비타민류, 폴리페놀류 등의 수용성 성분을 함유하고 있다. 코코아 성분의 열수 추출물의 조제방법은 특별히 한정되지 않지만, 예를 들면, 코코아 파우더 또는 카카오 매스에 적당량(통상, 코코아 성분 질량의 5~100배량)의 물, 바람직하게는 온수를 가하여 균일하게 분산시키고, 오토클레이브(autoclave) 등으로 가열 처리(통상, 40~130℃, 1~30분간)한 후, 여과, 원심분리 등의 수단에 의해 불용성 획분을 제거하여 얻어진 추출액을 그대로 사용할 수 있고, 필요에 따라 농축해도 되고 추가로 건조하여 사용하는 것도 가능하다.
또한, 코코아 성분 유래의 폴리페놀은, 예를 들면, 코코아 또는 카카오 매스를 물에 현탁한 후, 등량(等量)의 헥산을 가하여 잘 혼합해서 헥산층과 수층으로 분획하여 수층을 회수하고, 회수한 수층에 등량의 50%(v/v) 메탄올 수용액을 가하여 잘 혼합해서 그 상청을 회수하여 메탄올을 제거함으로써 조제할 수 있다.
또한, 코코아 성분 유래의 유리 지방산류란 상기 코코아 성분에 포함되어 있는 각종 유리 지방산을 의미하고, 구체적으로는, 팔미트산, 스테아르산, 올레산, 리놀레산, 리놀렌산(linolenic acid), 팔미톨레산(palmitoleic acid), 미리스트산 (myristic acid), 라우르산(lauric acid) 등을 들 수 있다. 본 발명에 있어서는 상기의 각종 유리 지방산을 포함하는 혼합물을 바람직하게 사용할 수 있고, 그 중에서도 팔미트산, 스테아르산, 올레산 및 리놀레산으로부터 선택된 적어도 1종류 이상을 포함하는 혼합물을 보다 바람직하게 사용할 수 있다. 상기 혼합물 중에 있어서의 각 유리 지방산의 비율은 특별히 제한되지 않지만, 상기 코코아 성분 중에 포함되는 전체 유리 지방산 중에 있어서의 각 유리 지방산의 비율을 토대로 결정하는 것이 바람직하다. 구체적으로는, 전체 유리 지방산 중에 있어서의 각 유리 지방산의 비율이, 팔미트산 10~50 질량%, 스테아르산 10~50 질량%, 올레산 10~70 질량%, 리놀레산 1~50 질량%, 리놀렌산 1~10 질량%, 팔미톨레산 1~10 질량%, 미리스트산 1~10 질량%, 라우르산 1~10 질량%를 포함하는 혼합물을 바람직하게 사용할 수 있다.
상기의 각 유리 지방산을 함유하는 혼합물은 상술한 열수 추출, 알코올 추출, 헥산 추출, 아세톤 추출 등의 방법에 의해, 상기 코코아 성분에 포함되는 각종 유리 지방산을 추출함으로써 얻을 수 있다. 예를 들면, 상기 코코아 성분의 열수 추출물 중에는 각 유리 지방산이 상기와 같은 비율로 포함되어 있어 이 열수 추출물을 그대로 사용할 수 있고, 필요에 따라 상기 열수 추출물로부터 유리 지방산류를 추가로 정제해서 사용해도 된다. 또한, 상기의 코코아 성분 중에 포함되는 전체 유리 지방산에 있어서의 각 유리 지방산의 비율을 토대로, 각 유리 지방산을 소정의 비율로 배합하여 조제하는 것도 가능하다.
본 발명의 항치주병균 조성물은 코코아 성분, 코코아 성분의 열수 추출물, 코코아 성분 유래의 폴리페놀 및/또는 코코아 성분 유래의 유리 지방산류를 유효성분으로서 함유하는 것으로, 상기와 같이 하여 조제한 코코아 성분, 코코아 성분의 열수 추출물, 코코아 성분 유래의 폴리페놀 및/또는 코코아 성분 유래의 유리 지방산류를 그대로 항치주병균 조성물로서 사용할 수 있다. 또한, 필요에 따라 착색제, 보존제, 향료, 풍미제, 감미제, 단백질(유단백(lactoprotein), 대두단백(soybean protein) 등), 비타민류, 미네랄류, 당류(덱스트린 등), 항치주병균 활성을 갖는 유산균이나 생약 등을 포함할 수 있다. 그 중에서도 영양학적 견지에서 유단백 및 비타민류를 포함하는 것이 바람직하다.
본 발명의 항치주병균 조성물은 유효성분으로서 코코아 성분을 사용하는 경우는, 상기 코코아 성분을 0.01~50 질량% 포함하는 것이 바람직하고, 0.01~10 질량% 포함하는 것이 보다 바람직하다.
또한, 유효성분으로서 코코아 성분의 열수 추출물을 사용하는 경우에는, 상기 열수 추출물을 고형물 환산으로 0.001~20 질량% 포함하는 것이 바람직하고, 0.1~10 질량% 포함하는 것이 보다 바람직하다.
또한, 유효성분으로서 코코아 성분 유래의 폴리페놀을 사용하는 경우에는, 상기 폴리페놀을 0.0001~10 질량% 포함하는 것이 바람직하고, 0.001~1 질량% 포함하는 것이 보다 바람직하다.
또한, 유효성분으로서 코코아 성분 유래의 유리 지방산류를 사용하는 경우에는, 상기 유리 지방산류를 0.0001~1 질량% 포함하는 것이 바람직하고, 0.001~0.2 질량% 포함하는 것이 보다 바람직하다.
또한, 유효성분으로서 코코아 성분 유래의 폴리페놀과 유리 지방산류를 병용하는 경우는, 상기 폴리페놀을 0.0001~10 질량%, 상기 유리 지방산류를 0.0001~1 질량% 포함하는 것이 바람직하고, 상기 폴리페놀을 0.01~1 질량%, 상기 유리 지방산류를 0.001~0.2 질량% 포함하는 것이 보다 바람직하다.
본 발명의 항치주병균 조성물의 유효 투여량은 성인 1일당 코코아 성분(카카오 매스) 환산으로 1 g 이상이고, 보다 바람직하게는 10 g 이상이다. 또한, 코코아 성분의 열수 추출물(고형물) 환산으로 0.1~10 g이고, 보다 바람직하게는 1~10 g이다. 또한, 코코아 성분 유래의 폴리페놀 환산으로 0.01~1 g이고, 보다 바람직하게는 0.1~1 g이다. 또한, 코코아 성분 유래의 유리 지방산류 환산으로 0.01~1 g이고, 보다 바람직하게는 0.1~1 g이다.
본 발명의 항치주병균 조성물은 후술하는 실시예에 나타내어지는 바와 같이, 비병원성 구강내 상재균의 생육을 저해하지 않고 치주병 환자의 병소부로부터 높은 비율로 검출되는 포르피로모나스속, 프레보텔라속, 푸소박테리움속 또는 액티노바실러스속에 속하는 치주병균을 효율적으로 제균할 수 있다. 따라서, 구강내 상재균총의 균형에 악영향을 줄 염려도 없다.
포르피로모나스속에 속하는 치주병균으로서는, 예를 들면 포르피로모나스 진지발리스(Porphyromonas
gingivalis), 포르피로모나스 아사카롤리티카(Porphyromonas
asaccharolytica), 포르피로모나스 엔도돈탈리스(Porphyromonas
endodontalis) 등을 들 수 있다. 또한, 프레보텔라속에 속하는 치주병균으로서는, 예를 들면 프레보텔라 인터미디어(Prevotella
intermedia), 프레보텔라 니그레센스 (Prevotella
nigrescens), 프레보텔라 멜라니노게니카(Prevotella
mellaninogenica) 등을 들 수 있다. 또한, 푸소박테리움속에 속하는 치주병균으로서는, 예를 들면 푸소박테리움 뉴클레아텀(Fusobacterium
nucleatum), 푸소박테리움 네크로포름(Fusobacterium
necrophorum), 푸소박테리움 나비포름 AA(Fusobacterium
naviforme) 등을 들 수 있다. 또한, 액티노바실러스속에 속하는 치주병균으로서는, 예를 들면 액티노바실러스 액티노미세템코미탄스(Actinobacillus
actinomycetemcomitans) 등을 들 수 있다.
한편, 비병원성 구강내 상재균으로서는, 스트렙토코커스 안기노서스(Streptococcus
anginosus), 스트렙토코커스 살리발리우스(Streptococcus
salivalius), 스트렙토코커스 산구이니스(Streptococcus
sanguinis) 등을 예시할 수 있다.
본 발명의 항치주병균 조성물의 제제형태는 특별히 제한은 없고, 정제, 환제, 산제, 액제, 현탁제, 유제, 과립제 등을 예시할 수 있어, 사용형태에 맞춰 선택할 수 있다.
고형제제화의 담체로서는, 예를 들면 젖당, 백당(sucrose), 포도당, 전분, 카올린(kaolin), 결정 셀룰로오스, 규산 등의 부형제, 포도당액, 전분액, 젤라틴용액, 카르복시메틸셀룰로오스, 히드록시프로필셀룰로오스 등의 결합제, 카르복시메틸셀룰로오스나트륨, 저치환도(低置換度) 히드록시프로필셀룰로오스 등의 붕괴제(disintegrator), 폴리옥시에틸렌 소르비탄 지방산 에스테르류 등의 계면활성제, 스테아르산염 등의 활택제 등을 사용할 수 있다. 또한, 정제의 경우는 필요에 따라 당의정, 필름 코팅정으로 하는 것도 가능하다.
또한, 액제, 유제, 현탁제 등의 형태로 성형하기 위해서는, 희석제로서 예를 들면 물, 에틸알코올, 마크로골(macrogol), 프로필렌글리콜, 폴리옥시화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 지방산 에스테르류 등의 통상의 용해보조제, 완충제 등을 사용해도 되지만, 코코아 성분의 열수 추출물의 물성과의 균형면에서 프로필렌글리콜이 특히 바람직하게 사용된다.
본 발명의 항치주병균 조성물은, 예를 들면 초콜릿, 코코아음료 등의 각종 음료(젤리 음료도 포함한다), 껌, 캔디(하드캔디, 소프트캔디), 정과(tablet confectionery), 각종 레토르트식품(retort food) 등의 음식물에 첨가할 수 있다.
음식물 중에 있어서의 항치주병균 조성물의 첨가량은, 상기의 유효투여량을 토대로 적절히 설정할 수 있지만, 코코아 성분(카카오 매스) 환산으로 0.01~50 질량%가 바람직하고, 5~30 질량%가 보다 바람직하다. 또한, 코코아 성분의 열수 추출물(고형물) 환산으로 0.1~20 질량%가 바람직하고, 0.2~10 질량%가 보다 바람직하다. 또한, 코코아 성분 유래의 폴리페놀 환산으로 0.001~5 질량%가 바람직하고, 0.1~3 질량%가 보다 바람직하다. 또한, 코코아 성분 유래의 유리 지방산류 환산으로 0.01~1 질량%가 바람직하고, 0.05~0.5 질량%가 보다 바람직하다.
또한, 본 발명의 항치주병균 조성물은, 예를 들면 치마제, 함수제 등의 구강용 세정제에 첨가하는 것도 가능하다. 구강용 세정제 중에 있어서의 항치주병균 조성물의 첨가량도 상기의 유효투여량을 토대로 적절히 설정할 수 있지만, 코코아 성분 환산으로 0.01~10 질량%가 바람직하고, 0.1~5 질량%가 보다 바람직하다. 또한, 코코아 성분의 열수 추출물(고형물) 환산으로 0.001~3 질량%가 바람직하고, 0.01~2 질량%가 보다 바람직하다. 또한, 코코아 성분 유래의 폴리페놀 환산으로 0.0001~10 질량%가 바람직하고, 0.001~1 질량%가 보다 바람직하다. 또한, 코코아 성분 유래의 유리 지방산류 환산으로 0.001~1 질량%가 바람직하고, 0.01~0.5 질량%가 보다 바람직하다.
이하, 실시예를 들어 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다.
실시예 1 <치주병균에 대한 코코아 파우더의 항균효과의 검토>
코코아 파우더(상품명「모리나가 순(pure) 코코아」, 모리나가 세이카 가부시키가이샤제)를 30%(w/v) 또는 10%(w/v)가 되도록 증류수에 현탁하여, 121℃에서 15분간 오토클레이브 처리하였다. 이들 용액을 전체 코코아 성분의 열수 현탁용액으로서 사용하여, 이하의 방법에 의해 항균활성의 측정을 행하였다.
BHI(Brain Heart Infusion)배지(디후코사제)에, 5%(w/v)의 Yeast Extract(디후코사제)와 0.05%(w/v)의 L 시스테인(L-cysteine)(시그마사제)을 첨가한 액체배지에, 상기 전체 코코아 성분의 열수 현탁용액을 각각 10%(v/v) 첨가하여 배지를 조제하고, 대조배지로서 전체 코코아 성분의 열수 현탁용액 대신에 증류수를 가한 BHI 배지를 조제하였다.
각 배지에 치주병균(포르피로모나스 진지발리스(Porphyromonas
gingivalis ATCC33277), 또는 푸소박테리움 뉴클레아텀(Fusobacterium
nucleatum ATCC22486), 또는 프레보텔라 인터미디어(Prevotella
intermedia ATCC25611), 또는 액티노바실 러스 액티노미세템코미탄스(Actinobacillus
actinomycetemcomitans ATCC33844))를 105 CFU/ml 전후가 되도록 현탁하여, 혐기(嫌氣) 조건하 37℃에서 배양하였다.
배양 개시 후 1, 3, 6시간 후에 각각 배양액을 샘플링하고, 포르피로모나스 진지발리스(ATCC33277), 프레보텔라 인터미디어(ATCC25611)는 헤민 메나디온(hemin menadione) 함유 브루셀라혈액(Brucella blood) 한천평판배지에 푸소박테리움 뉴클레아텀(ATCC22486), 액티노바실러스 액티노미세템코미탄스(ATCC33844)는 BHI 한천평판배지에 각각 단계 희석한 배양액을 일정량 접종해서 배양하여, 출현한 콜로니수를 계측하였다.
그리고, 배양액 1 ml 중의 생균수를 구하여 최초 생균수에 대한 비율(% CFU)을 구하였다. 도 1에 포르피로모나스 진지발리스(ATCC33277)의 결과, 도 2에 푸소박테리움 뉴클레아텀(ATCC22486)의 결과, 도 3에 프레보텔라 인터미디어(ATCC25611)의 결과, 도 4에 액티노바실러스 액티노미세템코미탄스(ATCC33844)의 결과를 나타낸다.
도 1에 나타내어지는 바와 같이, 30%(w/v) 또는 10%(w/v) 전체 코코아 성분의 열수 현탁용액을 10%(v/v) 첨가한 어떤 경우에 있어서도, 포르피로모나스 진지발리스(ATCC33277)는 배양시간의 경과에 동반하여 생균수가 대폭 감소하고 있는 것을 알 수 있다.
또한, 도 2에 나타내어지는 바와 같이, 30%(w/v) 또는 10%(w/v) 전체 코코아 성분의 열수 현탁용액을 10%(v/v) 첨가한 어떤 경우에 있어서도, 푸소박테리움 뉴 클레아텀(ATCC22486)은 배양시간의 경과에 동반하여 생균수가 대폭 감소하고 있는 것을 알 수 있다.
또한, 도 3에 나타내어지는 바와 같이, 30%(w/v) 또는 10%(w/v) 전체 코코아 성분의 열수 현탁용액을 10%(v/v) 첨가한 어떤 경우에 있어서도, 프레보텔라 인터미디어(ATCC25611)는 포르피로모나스 진지발리스(ATCC33277)나 푸소박테리움 뉴클레아텀(ATCC22486) 정도는 아니지만, 배양시간의 경과에 동반하여 생균수가 감소하고 있는 것을 알 수 있다.
또한, 도 4에 나타내어지는 바와 같이, 30%(w/v) 또는 10%(w/v) 전체 코코아 성분의 열수 현탁용액을 10%(v/v) 첨가한 어떤 경우에 있어서도, 액티노바실러스 액티노미세템코미탄스(ATCC33844)는 프레보텔라 인터미디어(ATCC25611)와 마찬가지로, 포르피로모나스 진지발리스(ATCC33277)나 푸소박테리움 뉴클레아텀(ATCC22486) 정도는 아니지만, 배양시간의 경과에 동반하여 생균수가 감소하고 있는 것을 알 수 있다.
이상의 결과로부터, 전체 코코아 성분의 열수 현탁용액은 치주병균인 포르피로모나스 진지발리스(ATCC33277), 푸소박테리움 뉴클레아텀(ATCC22486), 프레보텔라 인터미디어(ATCC25611), 액티노바실러스 액티노미세템코미탄스(ATCC33844)에 대해 우수한 항균활성을 가지고 있는 것을 알 수 있었다.
실시예 2 <치주병균에 대한 코코아 파우더 열수 추출물의 항균효과의 검토>
코코아 파우더(상품명「모리나가 순 코코아」, 모리나가 세이카 가부시키가이샤제)를 10%(w/v)가 되도록 물에 현탁하여, 121℃에서 15분간 오토클레이브 처리 하였다. 그리고, 실온에서 15분간 원심(×1,000 g)하여 상청을 회수하였다. 이 상청을 코코아 성분의 열수 추출용액(고형분 2~3 질량%)으로서 사용하여, 이하의 방법에 의해 항치주병균 활성의 측정을 행하였다.
BHI(Brain Heart Infusion)배지(디후코사제)에, 상기 코코아 성분의 열수 추출용액을 1%(v/v) 또는 10%(v/v) 첨가하여 배지를 조제하고, 대조배지로서 코코아 성분의 열수 추출용액 대신에 증류수를 가한 BHI 배지를 조제하였다.
각 배지에 치주병균(프레보텔라 니그레센스(ATCC33563) 또는 푸소박테리움 누클레아텀(ATCC22586))을 106~107 CFU/ml가 되도록 현탁하여, 혐기 조건하 37℃에서 배양하였다. 배양 개시 후 1, 3, 6시간 후에 각각 배양액을 샘플링하고, 헤민 메나디온 함유 브루셀라혈액 한천플레이트에 단계 희석한 배양액을 일정량 접종해서 배양하여, 출현한 콜로니수를 계측하였다. 그리고, 배양액 1 ml 중의 생균수를 구하여 최초 생균수에 대한 비율(%CFU)을 구하였다. 도 5에 프레보텔라 니그레센스(ATCC33563)의 결과, 도 6에 푸소박테리움 누클레아텀(ATCC22586)의 결과를 나타낸다.
도 5에 나타내어지는 바와 같이, 프레보텔라 니그레센스(ATCC33563)에 있어서는, 코코아 성분의 열수 추출용액을 10%(v/v) 첨가한 경우, 배양시간의 경과에 동반하여 생균수가 대폭 감소하고 있는 것을 알 수 있다.
또한, 도 6에 나타내어지는 바와 같이, 푸소박테리움 누클레아텀(ATCC22586)에 있어서는, 코코아 성분의 열수 추출용액을 1%(v/v) 또는 10%(v/v) 첨가한 어떤 경우에 있어서도, 배양시간의 경과에 동반하여 생균수가 대폭 감소하고 있는 것을 알 수 있다.
이상의 결과로부터, 코코아 성분의 열수 추출액은 치주병균인 프레보텔라 니그레센스(ATCC33563), 푸소박테리움 누클레아텀(ATCC22586)에 대해 우수한 항균활성을 가지고 있는 것을 알 수 있었다.
실시예 3 <비병원성 구강내 상재균에 미치는 코코아 파우더의 영향 검토>
실시예 1에서 조제한 30%(w/v) 전체 코코아 성분의 열수 현탁용액을 10%(v/v) 첨가한 BHI 배지를 실시예 1과 동일하게 조제하고, 대조배지로서 전체 코코아 성분의 열수 현탁용액 대신에 증류수를 가한 BHI 배지를 조제하였다.
이 배지에 비병원성 구강내 상재균(스트렙토코커스 안기노서스(Streptococcus
anginosus ATCC333977), 스트렙토코커스 살리발리우스(Streptococcus
salivalius ATCC7075), 스트렙토코커스 산구이니스(Streptococcus
sanguinis ATCC10556))을 105 CFU/ml 전후가 되도록 현탁하여, 혐기 조건하 37℃에서 배양하였다. 배양 개시 후 4시간 후에 각각 배양액을 샘플링하고, BHI 한천평판배지에 각각 단계 희석한 배양액을 일정량 접종해서 배양하여, 출현한 콜로니수를 계측하였다. 그리고, 배양액 1 ml 중의 생균수를 구하여 최초 생균수에 대한 비율(%CFU)을 구하였다. 도 7에 스트렙토코커스 안기노서스(ATCC333977)의 결과, 도 8에 스트렙토코커스 살리발리우스(ATCC7075)의 결과, 도 9에 스트렙토코커스 산구이니스(ATCC10556)의 결과를 나타낸다.
도 7에 나타내어지는 바와 같이, 30%(w/v)의 전체 코코아 성분의 열수 현탁용액을 10%(v/v) 첨가한 경우에 있어서, 스트렙토코커스 안기노서스(ATCC333977)는 배양시간이 경과해도 생균수의 감소가 보이지 않는 것을 알 수 있다.
또한, 도 8에 나타내어지는 바와 같이, 30%(w/v)의 전체 코코아 성분의 열수 현탁용액을 10%(v/v) 첨가한 경우에 있어서, 스트렙토코커스 살리발리우스(ATCC7075)도 배양시간이 경과해도 생균수의 감소가 보이지 않는 것을 알 수 있다.
또한, 도 9에 나타내어지는 바와 같이, 30%(w/v)의 전체 코코아 성분의 열수 현탁용액을 10%(v/v) 첨가한 경우에 있어서, 스트렙토코커스 산구이니스(ATCC10556)도 배양시간이 경과해도 생균수의 감소가 보이지 않는 것을 알 수 있다.
이상의 결과로부터, 전체 코코아 성분의 열수 현탁용액은 비병원성 구강내 상재균인 스트렙토코커스 안기노서스(ATCC333977), 스트렙토코커스 살리발리우스(ATCC7075), 스트렙토코커스 산구이니스(ATCC10556)에 대해는 항균활성을 전혀 나타내지 않는 것을 알 수 있었다.
실시예 4 <단시간에 있어서의 코코아 파우더의 항치주병균 효과의 검토>
실시예 1에서 조제한 30%(w/v) 전체 코코아 성분의 열수 현탁용액을 10%(v/v) 첨가한 BHI 배지를 실시예 1과 동일하게 조제하고, 대조배지로서 전체 코코아 성분의 열수 현탁용액 대신에 물을 가한 BHI 배지를 조제하였다.
각 배지에 포르피로모나스 진지발리스(ATCC33277)를 105 CFU/ml 전후가 되도 록 현탁하여, 혐기 조건하 37℃에서 배양하였다. 배양 개시 후 5, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60분 후에 각각 배양액을 샘플링하고, 헤민 메나디온 함유 브루셀라혈액 한천평판배지에 각각 단계 희석한 배양액을 일정량 접종해서 배양하여, 출현한 콜로니수를 계측하였다. 그리고, 배양액 1 ml 중의 생균수를 구하여 최초 생균수에 대한 비율(%CFU)을 구하였다. 또한, 실험은 2회 행하였다. 그들 결과를 도 10에 나타낸다.
도 10에 나타내어지는 바와 같이, 포르피로모나스 진지발리스(ATCC33277)에 있어서는, 30%(w/v) 전체 코코아 성분의 열수 현탁용액을 10%(v/v) 첨가한 경우에 있어서, 배양 10분 후까지는 생균수는 거의 변하지 않지만, 배양 15분 후에는 생균수가 대폭 감소하고, 배양 30분 후에는 생균이 검출되지 않는 것을 알 수 있다.
이상의 결과로부터, 전체 코코아 성분의 열수 현탁용액은 치주병균인 포르피로모나스 진지발리스(ATCC33277)에 대해, 단시간에 우수한 항균활성을 발휘하는 것을 알 수 있었다. 따라서, 통상의 음용으로도 치주병균에 대해 충분한 항균활성을 기대할 수 있는 것이 시사되었다.
실시예 5 <치주병균의 임상 분리주에 대한 코코아 파우더의 항균효과의 검토>
실시예 1에서 조제한 30%(w/v) 또는 10%(w/v)의 전체 코코아 성분의 열수 현탁용액을 10%(v/v) 첨가한 BHI 배지를 실시예 1과 동일하게 조제하고, 대조배지로서 전체 코코아 성분의 열수 현탁용액 대신에 물을 가한 BHI 배지를 조제하였다.
쯔루미대학 부속병원에서 치료를 받고 있는 치주병환자의 병소로부터, 페이 퍼 포인트(paper point)를 사용하여 치주병균군을 채취하고, 그 중에서 헤민 메나디온 함유 브루셀라혈액 한천평판배지 상에 흑색 콜로니를 형성하는 균주를 선택하여, PCR법을 사용한 동정법(A. Ashimoto, C. Chen, I. Bakker, J. Slots., Oral Microbiology Immunology 1996 Aug; 11(4): 266-73)에 의해, 표 1에 나타내는 5주(株)의 포르피로모나스 진지발리스(Porphyromonas
gingivalis) 임상 분리주(Porphyromonas
gingivalis 113H, Porphyromonas
gingivalis 823D, Porphyromonas
gingivalis 1113C, Porphyromonas
gingivalis 1113D, Porphyromonas
gingivalis
1433F)를 단리하였다.
상기 각 배지에, 각 임상 분리주를 105 CFU/ml 전후가 되도록 현탁하여, 혐기 조건하 37℃에서 배양하였다. 배양 개시 후 1, 3, 6시간 후에 각각 배양액을 샘플링하고, 헤민 메나디온 함유 브루셀라혈액 한천평판배지에 각각 단계 희석한 배양액을 일정량 접종해서 배양하여, 출현한 콜로니수를 계측하였다. 그리고, 배양액 1 ml 중의 생균수를 구하여 최초 생균수에 대한 비율(%CFU)을 구하였다.
그 결과, 30%(w/v) 또는 10%(w/v) 전체 코코아 성분의 열수 현탁용액을 10%(v/v) 첨가한 어떤 경우에 있어서도, 모든 포르피로모나스 진지발리스(Porphyromonas
gingivalis)의 임상 분리주는 배양시간의 경과에 동반하여 표준 균주(type strain)인 포르피로모나스 진지발리스(ATCC33277)와 동일하게 생균수가 대폭 감소하고 있었다.
이 결과로부터, 치주병균 포르피로모나스 진지발리스(Porphyromonas
gingivalis)에 대한 코코아 파우더의 항균효과의 실용성이 확인되었다.
실시예 6 <코코아 파우더 중의 항균성분의 동정-1>
코코아 파우더(상품명「레드 코코아(Red Cocoa)」, 모리나가 세이카 가부시키가이샤제)를 10%(w/v)가 되도록 증류수에 현탁하였다. 이하, 이 용액을 「코코아용액」이라 한다.
상기 코코아용액에 등량의 헥산을 가하여 지방분을 분리하였다. 지방분을 제거한 나머지 수용성 획분에 등량의 100% 메탄올을 가하여 10분간 진탕하고, 원심분리하여 상청을 분리하였다. 그 침전물에 50% 메탄올을 가하여 10분간 진탕하고, 원심분리하여 상청을 분리하였다. 이 작업을 2회 반복하여 모은 상청을 증발기(evaporator)에 걸어 메탄올을 완전히 증발시킨 후, 10%(w/v) 코코아 파우더 상당이 되도록 증류수에 현탁하였다. 이 획분을 이하 「50% 메탄올 추출획분」이라 한다. 이 획분에는 코코아 중의 폴리페놀류가 포함되어 있는 것으로 생각된다.
상기 10%(w/v) 코코아용액, 상기 10%(w/v) 코코아 파우더 상당 50% 메탄올 추출획분 현탁액을 10%(w/v) 첨가한 BHI 배지를 조제하고, 대조배지로서 코코아용액 대신에 물을 가한 BHI 배지를 조제하였다.
각 배지에 포르피로모나스 진지발리스(ATCC33277)를 105 CFU/ml 전후가 되도록 현탁하여, 혐기 조건하 37℃에서 배양하였다. 배양 개시 후 1, 3, 6시간 후에 각각 배양액을 샘플링하고, 헤민 메나디온 함유 브루셀라혈액 한천평판배지에 각각 단계 희석한 배양액을 일정량 접종해서 배양하여, 출현한 콜로니수를 계측하였다. 그리고, 배양액 1 ml 중의 생균수를 구하여 최초 생균수에 대한 비율(%CFU)을 구하였다. 그 결과를 도 11에 나타낸다.
도 11에 나타내어지는 바와 같이, 10%(w/v) 코코아용액, 10%(w/v) 코코아 파우더 상당의 50% 메탄올 추출획분을 10%(v/v) 첨가한 어떤 경우에 있어서도, 포르피로모나스 진지발리스(ATCC33277)는 배양시간의 경과에 동반하여 생균수가 대폭 감소하고 있는 것을 알 수 있다.
이상의 결과로부터, 코코아의 항균 주성분은 폴리페놀류일 가능성이 높은 것으로 생각되었기 때문에, 폴리페놀류 등의 페놀기를 갖는 물질을 흡착하는 수지인 PVPP를 사용해서 이하와 같은 실험을 행하였다.
상기의 방법으로 얻은 50% 메탄올 추출획분을 원심분리하여 수용성 상청을 분리, 회수하였다. 이것을 「PVPP 처리 전 획분」이라 한다. 이 획분에 PVPP를 1 g/상청 10 ml를 가하여 37℃에서 30분간 진탕하고, 원심분리하여 상청과 PVPP를 분리하여 상청을 회수하였다. 이것을 「PVPP 처리 후 획분」이라 한다.
상기 PVPP 처리 전 획분, 또는 PVPP 처리 후 획분을 10%(w/v) 첨가한 BHI 배지를 조제하고, 대조배지로서 PVPP 처리 전 획분 대신에 물을 가한 BHI 배지를 조 제하였다.
각 배지에 포르피로모나스 진지발리스(ATCC33277)를 105 CFU/ml 전후가 되도록 현탁하여, 혐기 조건하 37℃에서 배양하였다. 배양 개시 후 1, 3, 6시간 후에 각각 배양액을 샘플링하고, 헤민 메나디온 함유 브루셀라혈액 한천평판배지에 각각 단계 희석한 배양액을 일정량 접종해서 배양하여, 출현한 콜로니수를 계측하였다. 그리고, 배양액 1 ml 중의 생균수를 구하여 최초 생균수에 대한 비율(%CFU)을 구하였다. 그 결과를 도 12에 나타낸다.
도 12에 나타내어지는 바와 같이, PVPP 처리 전 획분을 10%(v/v) 첨가한 경우, 포르피로모나스 진지발리스(ATCC33277)의 생균수는 대폭 감소하였지만, 폴리페놀을 제거한 PVPP 처리 후 획분을 10%(v/v) 첨가한 경우에는 생균수는 대폭으로는 감소하고 있지 않은 것을 알 수 있다. 이것은 각 획분의 폴리페놀 농도를 측정한 결과와도 일치하고 있었다. 이상의 결과로부터, 코코아의 항균 주성분은 PVPP에 의해 흡착되는 폴리페놀류인 것이 확인되었다.
실시예 7 <코코아 유래의 폴리페놀과 차 카테킨의 항균효과의 비교>
에피갈로카테킨 등을 포함하는 차 유래 폴리페놀(상품명「선페논(Sunphenon)」, 타이요가가쿠 가부시키가이샤제)을 0.05%(w/v)가 되도록 증류수에 현탁하고, 121℃에서 15분간 오토클레이브 처리하였다. 이 용액을 이하「차 카테킨용액」이라 한다.
상기 차 카테킨용액과 실시예 6에 있어서의 「50% 메탄올 추출획분」의 폴리 페놀 농도를 측정하여, 「차 카테킨용액」에 포함되는 폴리페놀량(0.313 mg/ml)과 동일 농도가 되도록 「50% 메탄올 추출획분」을 1.25%(w/v) 코코아 파우더 상당으로 조정하였다.
「차 카테킨용액」과 조정한 「50% 메탄올 추출획분」을 각각 10%(w/v) 첨가한 BHI 배지를 조제하였다.
상기 각 배지에 포르피로모나스 진지발리스(ATCC33277)를 106 CFU/ml 전후가 되도록 현탁하여, 혐기 조건하 37℃에서 배양하였다. 배양 개시 후 1, 3, 6시간 후에 각각 배양액을 샘플링하고, 헤민 메나디온 함유 브루셀라혈액 한천평판배지에 각각 단계 희석한 배양액을 일정량 접종해서 배양하여, 출현한 콜로니수를 계측하였다. 그리고, 배양액 1 ml 중의 생균수를 구하여 최초 생균수에 대한 비율(%CFU)을 구하였다. 그 결과를 도 13에 나타낸다.
도 13에 나타내어지는 바와 같이, 포르피로모나스 진지발리스(ATCC33277)에 있어서는 1.25%(w/v) 코코아 파우더 상당의 「50% 메탄올 추출획분」 10%를 첨가한 경우, 배양 1시간 후에는 생균은 검출되지 않았지만, 차 카테킨용액 10%를 첨가한 경우는, 0.3% CFU 정도까지 감소하는데 그쳤다. 또한, 그 후, 배양시간의 경과에 동반하여 양 샘플에 있어서 생균수가 대폭 감소되었다.
이상의 결과로부터, 동량의 차 카테킨과 코코아 유래의 폴리페놀의 항균효과를 비교한 경우, 코코아 유래의 폴리페놀 쪽이 보다 높은 비활성(比活性)을 가지고 있는 것이 시사되었다.
실시예 8 <코코아 파우더 중의 항균성분의 동정-2>
10%(w/v) 코코아용액을 2N 염산으로 pH 2로 조정하였다. 이 조작에 의해 코코아용액 중의 수분에 염의 형태로 용해되어 있는 유리 지방산이 모두 유분으로 이행한다.
상기 코코아용액에 등량의 헥산을 가하여 실온에서 10분간 진탕한 후, 원심분리하여 헥산 획분을 분리하였다. 교반과 원심분리의 조작을 3회 반복하고, 모은 헥산 획분을 증발기에 걸어 헥산을 완전히 증발시킨 후, 10%(w/v) 코코아 파우더 상당이 되도록 증류수에 현탁하고, 추가로 8N 수산화나트륨에 의해 pH를 원래대로 되돌렸다. 이 획분에 4배량의 100% 메탄올을 가하여 65℃로 가온하면서 15분간 진탕한 후, 원심분리하여 유층과 수층을 분리하였다. 교반과 원심분리의 조작을 2회 반복하고, 모은 수층을 증발기에 걸어 메탄올을 완전히 증발시킨 후, 10%(w/v) 코코아 파우더 상당이 되도록 증류수에 현탁하였다. 이 획분을 이하 「헥산-메탄올 추출획분」이라 한다. 이 획분에는 코코아 중의 유리 지방산이 포함되어 있는 것으로 생각된다.
상기 10%(w/v) 코코아 파우더 상당의 헥산-메탄올 추출획분 현탁액을 10%(w/v) 첨가한 BHI 배지를 조제하고, 대조배지로서 헥산-메탄올 추출획분 현탁액 대신에 물을 가한 BHI 배지를 조제하였다.
각 배지에 포르피로모나스 진지발리스(ATCC33277)를 105 CFU/ml 전후가 되도록 현탁하여, 혐기 조건하 37℃에서 배양하였다. 배양 개시 후 1, 3, 6시간 후에 각각 배양액을 샘플링하고, 헤민 메나디온 함유 브루셀라혈액 한천평판배지에 각각 단계 희석한 배양액을 일정량 접종해서 배양하여, 출현한 콜로니수를 계측하였다. 그리고, 배양액 1 ml 중의 생균수를 구하여 최초 생균수에 대한 비율(%CFU)을 구하였다. 그 결과를 도 14에 나타낸다.
도 14에 나타내어지는 바와 같이, 10%(w/v) 코코아 파우더 상당의 헥산-메탄올 추출획분을 10%(v/v) 첨가한 경우, 포르피로모나스 진지발리스(ATCC33277)는 배양시간의 경과에 동반하여 생균수가 감소하고 있는 것을 알 수 있다. 이상의 결과로부터, 코코아에 포함되는 유리 지방산에도 항균효과가 있는 것으로 생각되었다.
실시예 9
실시예 2와 동일하게 하여 코코아 성분의 열수 추출용액을 10%(v/v) 첨가한 BHI 배지를 조제하고, 대조배지로서 코코아 성분의 열수 추출용액 대신에 증류수를 가한 BHI 배지를 조제하였다.
또한, 표 2에 나타내는 비율로 유리 지방산을 정제수에 첨가한 유리 지방산 조성물(이하, 「FFA comp.」라고 한다)을 조제하고, 이것을 BHI 배지에 10%(v/v) 첨가하여 배지를 조제하였다. 이 「FFA comp.」는 질량 스펙트럼 등으로 분석한 순 코코아 중의 유리 지방산 조성을 토대로 하여, 그 주요한 유리 지방산 4종류를 정제수에 첨가해서, 코코아 성분 중의 유리 지방산 조성을 인공적으로 재현한 것으로, 각 유리 지방산을 상기 코코아 성분의 열수 추출용액과 동등량 함유하는 것이다.
이들 배지에 치주병균(포르피로모나스 진지발리스(ATCC33277), 또는 프레보텔라 니그레센스(ATCC33563))을 106~107 CFU/ml 전후가 되도록 현탁하여, 혐기 조건하 37℃에서 배양하였다. 그리고, 배양 개시 후 1, 3, 6시간 후에 각각 배양액을 샘플링하고, 헤민 메나디온 함유 브루셀라혈액 한천평판배지에 각각 단계 희석한 배양액을 일정량 접종해서 배양하여, 출현한 콜로니수를 계측하였다. 그리고, 배양액 1 ml 중의 생균수를 구하여 최초 생균수에 대한 비율(%CFU)을 구하였다. 도 15에 포르피로모나스 진지발리스(ATCC33277)의 결과, 도 16에 프레보텔라 니그레센스(ATCC33563)의 결과를 나타낸다.
도 15에 나타내어지는 바와 같이, 포르피로모나스 진지발리스(ATCC33277)에 있어서는, 코코아 성분의 열수 추출용액을 10%(v/v) 첨가한 경우, 배양시간의 경과에 동반하여 생균수가 대폭 감소하고 있는 것을 알 수 있다. 또한, 「FFA comp.」를 첨가한 경우도, 배양시간의 경과에 동반하여 생균수가 대폭 감소하고 있는 것을 알 수 있다.
또한, 도 16에 나타내어지는 바와 같이, 프레보텔라 니그레센스(ATCC33563)에 있어서는, 도 5에 나타내는 결과와 마찬가지로, 코코아 성분의 열수 추출용액을 10%(v/v) 첨가한 경우, 배양시간의 경과에 동반하여 생균수가 감소하고 있는 것을 알 수 있다. 한편, 「FFA comp.」를 첨가한 경우도, 대조군에 비하면 생균수가 감소하고 있는 것을 알 수 있다.
이상의 결과로부터, 코코아 성분의 열수 추출물 및 코코아 성분 유래의 유리 지방산류는, 치주병균의 종류에 따라 그 유효 농도가 상이하지만, 포르피로모나스 진지발리스(ATCC33277), 프레보텔라 니그레센스(ATCC33563), 푸소박테리움 누클레아텀(ATCC22586)에 대해 우수한 항균활성을 가지고 있는 것을 알 수 있었다.
실시예 10
하기 표 3의 배합에 의해, 본 발명의 항치주병균 조성물을 함유하는 초콜릿을 제조하였다.
실시예 11
하기 표 4의 배합에 의해, 본 발명의 항치주병균 조성물을 함유하는 추잉검을 제조하였다.
실시예 12
하기 표 5의 배합에 의해, 본 발명의 항치주병균 조성물을 함유하는 캔디를 제조하였다.
실시예 13
하기 표 6의 배합에 의해, 본 발명의 항치주병균 조성물을 함유하는 스포츠 음료를 제조하였다.
실시예 14
하기 표 7의 배합에 의해, 본 발명의 항치주병균 조성물을 함유하는 로얄젤리음료를 제조하였다.
실시예 15
하기 표 8의 배합에 의해, 본 발명의 항치주병균 조성물을 함유하는 레토르트 파우치(retort pouch)가 든 팥죽을 제조하였다.
실시예 16
하기 표 9의 배합에 의해, 본 발명의 항치주병균 조성물을 함유하는 트로키제(troche)를 제조하였다.
실시예 17
하기 표 10의 배합에 의해, 본 발명의 항치주병균 조성물을 함유하는 함수제를 제조하였다.
실시예 18
하기 표 11의 배합에 의해, 본 발명의 항치주병균 조성물을 함유하는 반죽 치약제(toothpaste)를 제조하였다.
이상 설명한 바와 같이 본 발명에 의하면, 카카오 매스 중에 포함되는 코코아 성분, 상기 코코아 성분의 열수 추출물, 상기 코코아 성분 유래의 폴리페놀 및/또는 상기 코코아 성분 유래의 유리 지방산류를 유효성분으로서 함유시킴으로써, 부작용의 우려가 없어 안전하고, 우수한 제균 효과를 갖는 항치주병균 조성물을 제공할 수 있다. 이 항치주병균 조성물은 치주병 환자의 병소부로부터 높은 비율로 검출되는 포르피로모나스속, 프레보텔라속, 푸소박테리움속 또는 액티노바실러스속에 속하는 치주병균에 대해 단시간에 우수한 항균활성을 나타내고, 상기 균의 증식을 억제함으로써 치주염이나 치육염 등의 치주병의 예방, 치료효과를 기대할 수 있다. 또한, 비병원성 구강내 상재균의 생육을 저해하지 않아, 구강내 상재균총의 균형 개선에 도움이 된다.
따라서, 이 항치주병균 조성물을 음식물이나 구강용 세정제 등에 함유시킴으 로써, 안전하고 손쉽게 치주병의 예방이 가능한 항치주병용 음식물 및 구강용 세정제를 제공할 수 있다.
Claims (11)
- 카카오 매스 중에 포함되는 코코아 성분을 유효성분으로서 함유하는 것을 특징으로 하는, 포르피로모나스속, 프레보텔라속, 푸소박테리움속 또는 액티노바실러스속에 속하는 치주병균에 대한 항치주병균 조성물.
- 제1항에 있어서, 카카오 매스 중에 포함되는 코코아 성분의 열수 추출물을 유효성분으로서 함유하는 항치주병균 조성물.
- 제1항에 있어서, 카카오 매스 중에 포함되는 코코아 성분 유래의 폴리페놀을 유효성분으로서 함유하는 항치주병균 조성물.
- 제1항에 있어서, 카카오 매스 중에 포함되는 코코아 성분 유래의 유리 지방산류를 유효성분으로서 함유하는 항치주병균 조성물.
- 제1항에 있어서, 카카오 매스 중에 포함되는 코코아 성분 유래의 폴리페놀 및 코코아 성분 유래의 유리 지방산류를 유효성분으로서 함유하는 항치주병균 조성물.
- 제4항에 있어서, 상기 유리 지방산류는 팔미트산, 스테아르산, 올레산 및 리놀레산으로부터 선택된 적어도 1종류를 포함하는 것인 항치주병균 조성물.
- 제5항에 있어서, 상기 유리지방산류는, 팔미트산, 스테아르산, 올레산 및 리놀레산으로부터 선택된 적어도 1종류를 포함하는 것인 항치주병균 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 코코아 성분은 코코아, 카카오 매스, 또는 코코아 및 카카오 매스인 항치주병균 조성물.
- 제1항에 있어서, 비병원성 구강내 상재균의 생육을 저해하지 않고, 치주병균에 대해 항균작용을 갖는 항치주병균 조성물.
- 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 항치주병균 조성물을 함유하는 것을 특징으로 하는 항치주병용 식품.
- 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 항치주병균 조성물을 함유하는 것을 특징으로 하는 구강용 세정제.
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