KR100962522B1 - 3색 광원을 이용하는 멀티플렉스 ｃａｒｓ 분광장치 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 3색 광원을 이용하는 멀티플렉스 CARS 분광장치에 관한 것으로서 짧은 파장을 갖는 광대역 레이저 광원에 의한 펌프광과 상대적으로 긴 파장의 안정적인 레이저 광원에 의한 스톡스광의 조합에 의하여 측정 시료의 고유 분자진동에 다중 공명이 이룬 상태에서 상기 2개의 레이저 광원과는 별도의 탐색광 역할을 수행하는 좁은 선폭의 단파장(short-wavelength) 레이저 광을 상호작용시킴으로서 높은 분해능으로 파장성분 분리가 가능한 CARS 분광신호를 발생시키는 것을 특징으로 한다.
이에 따라 높은 분해능의 파장성분 분해가 불가능해지는 종래의 2색 광원 방식 멀티플렉스 CARS 분광법의 단점을 극복하도록 하여 CARS 스펙트럼 왜곡 문제를 극복할 수 있다.
분자진동 분광학, 자발 라만 산란, 간섭성 반스톡스 라만 산란, 레이저 현미경
Description
본 발명은 3색 광원을 이용하는 멀티플렉스 CARS 분광장치에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 3개의 분리된 파장대역의 레이저 빔을 시료 내부에 집속하여 멀티플렉스 CARS 스펙트럼 신호를 취득하여 분광분석을 하는 3색 광원을 이용하는 멀티플렉스 CARS 분광장치에 관한 것이다.
세포나 조직과 같은 생체 시료를 비롯하여 광학적으로 거의 투명한 미세 시료를 관찰함에 있어서 기존의 일반 광학 영상기법이 가지는 문제점은, 시료 내의 다양한 소기관(intracellular organs)과 물질에 대해 뚜렷한 형태학적 영상을 얻기 매우 어렵고, 더 나아가 분자화학종의 공간분포에 대한 구별된 측정이 거의 불가능하다는 것이다. 이는 시료와 가시광선이 상호작용할 때, 관찰 대상(objects)과 배경 매질(background substance) 간의 차이가 미미해 광학적 대비(optical contrast)가 제공되지 않기 때문이다. 즉, 시료 내의 관찰하려는 특정 미세 구조물 또는 미량의 물질이 주위를 둘러싼 배경매질과 분간이 되지 않는 것이다.
광학영상을 통해 다양한 세포내 대사 물질이나 소기관의 거동을 관찰함으로써 생명과학 현상 및 질병 메커니즘을 규명하기 위한 방편으로, 일반 광학현미경의 원리적 한계를 극복할 수 있는 방법이 동원되고 있다. 특히, 분자선택적 표지자의 도움 없이 물질 자체의 고유한 분광학적 특성을 검출하여 분자영상을 취득하는 현미경 기술이 주목받고 있다. 특정 분자를 빛과 상호작용시켜서 고유의 진동 지문(molecular vibrational fingerprint) 분광신호를 분석하는 대표적인 방법으로 라만 산란(Raman scattering) 분광법을 들 수 있으며 현미경 광학계와 결합되어 미세 구조에 대한 분자영상 측정에 이용되고 있다.
도 1은 자발 라만 분광신호 생성의 원리를 나타낸 분자진동천이 모식도이다.
라만 현미경에서 분자 영상을 구성하는 픽셀 데이터는 특정한 단일 파장의 레이저를 시료에 조사하여 발생된 자발 라만 스펙트럼으로 이루어진다. 관찰 대상인 분자진동 모드에 공명을 이루지 않는 고정된 파장의 입사 레이저 광자가 비탄성 산란을 통해 적색 천이(red-shifted) 라만 분광 신호를 생성하는데, 이때 입사 광자와 라만 산란된 광자의 에너지 차는 상호작용을 하는 시료 내 물질의 분자진동 모드 에너지에 해당한다. 즉, 시료에 의한 레이저 산란광을 수집해 얻은 라만 스펙트럼은 시료 구성물질의 특유한 분자진동 모드 정보를 담고 있다.
상기한 적외선 흡수 현미경과 라만 현미경은 각기 나름대로의 장단점을 가지고 있다. 라만 현미경은 분자진동 주파수와 관계없는 임의의 단일 파장 광원을 사용하므로 장치의 구성에 있어서 여기용 레이저 광원이 차지하는 비중이 낮고 동작이 간편하다는 장점이 있다. 또한 가시광 영역의 짧은 파장을 갖는 레이저 광원을 사용함으로써, 우수한 공간분해능의 현미경 영상을 얻는데 확실히 유리하다. 다만, 분광 정보를 주는 라만 산란 신호의 세기가 극히 미약해서 영상을 취득하는데 걸리는 시간이 매우 길어지는 단점을 지닌다. 특히, 살아있는 생체 시료의 동적 특성을 관찰하거나 광 손상의 위험으로 인해 여기용 레이저의 강도를 충분히 증가시키지 못할 경우, 이는 더욱 취약한 문제점으로 작용하게 된다.
라만 현미경의 상기 취약점을 개선하기 위한 대표적인 방편으로 간섭성 반스톡스 라만 산란(coherent anti-Stokes Raman scattering; CARS) 분광법을 이용한 현미경을 들 수 있으며, 종래 라만 현미경의 큰 단점이라 할 수 있는 낮은 측정감도와 느린 영상취득 속도를 획기적으로 개선한 것이다. 분자진동을 검출함에 있어서 라만 산란 현상을 이용하는 것은 종래의 라만 현미경과 유사하지만, 근본적인 차이는 선형광학 현상인 자발 라만 산란(spontaneous Raman scattering)을 이용하는 것이 아니라 3개의 입사 레이저 광이 시료와 상호작용하여 비선형 광학 신호(nonlinear optical signal)를 생성하는 일종의 사광파혼합법(four wave mixing)이다.
도 2는 CARS 비선형 분광신호 생성의 원리를 나타낸 분자진동천이 모식도이다.
CARS 분광법의 원리는 다음과 같다. 시료 특정분자의 라만천이(Raman shift) 만큼 주파수 차이가 있는 2개의 입사 레이저 광(펌프광 및 스톡스광)이 맥놀이를 일으키면서 이 파형에 결맞는(coherent) 분자진동(forced harmonic oscillation)을 강제 유도한다. 위상이 일치된 진동을 하는 분자들에 3번째 레이저 광(탐색광)이 입사되면, 상호작용 후 레이저 파장이 짧아지는 반스톡스(anti-Stokes) 라만 산란이 일어나면서 동일한 위상을 갖고 특정 진행방향을 갖는 간섭성(coherent) 신호광이 출력된다. 이러한 비선형 광학적 신호를 시료 공간 상에서 정밀하게 고속 맵핑(mapping)하면 CARS 현미경 영상이 얻어진다.
CARS 현미경의 가장 큰 장점은, 라만 현미경과 마찬가지로 분자진동 선택적 영상을 얻되 매우 높은 측정감도와 영상 취득속도를 제공하는 것이다. 시료 손상이 없는 레이저 강도 제한조건에서도 CARS는 자발 라만 산란의해 약 10,000배 이상 강한 신호광을 발생시키므로, 신호대 잡음비가 높은 좋은 품질의 영상을 빠른 속도로 얻을 수 있다. CARS 현상은 사광파 혼합을 일으키는 물질 고유의 3차 비선형 감수율(nonlinear optical susceptibility) 특성에 의한 것이므로, 입사 레이저 광 세기의 3제곱에 비례하는 신호 증대효과가 있고, 레이저 공초점 현미경처럼 시료 내부에 대한 3차원 영상을 높은 공간 분해능으로 얻을 수 있는 기능이 구현된다. 또한, 레이저 상호작용 후 측정 시료에 어떠한 레이저 에너지도 남기지 않는 광매개변환(optical parametric conversion) 프로세스이기 때문에, 레이저에 의한 시료 열 손상을 원리적으로 피할 수 있는 비침습적 측정법이다.
하지만, CARS 분광법은 실제 적용에 있어서의 단점으로 분자의 고유진동과 무관한 비공명성(non-resonant) 3차 비선형 감수율의 영향으로 인해 분자 선택성과 신호대 잡음비 저하의 문제를 지적할 수 있다. 또한, 임의의 단일 파장 광원을 사용하는 라만 분광법과 대비되는 결정적인 약점으로서, CARS 분광법은 일반적으로 2개의 입사 레이저 광(펌프광 및 스톡스광) 중 어느 하나의 파장을 변화시켜 주어야 만 특정 시료의 광대역(broadband) 분자진동 스펙트럼을 취득할 수 있다. 즉, 펌프광 영역 또는 스톡스광 영역의 레이저 광원이 빠르고 안정적인 발진 파장 가변특성을 가지고 있어야 한다. 현재로서는 바이오메디칼 CARS 영상에 적합한 피코초-펨토초 레이저 광원의 경우, 상기 요구 조건을 만족시키는 구현 예가 거의 없다.
도 3은 2색 광원을 이용하는 멀티플렉스 CARS 분광장치의 신호 생성 원리를 나타낸 분자진동천이 모식도이고, 도 4는 멀티플렉스 CARS 분광법에 의해 얻어지는 스펙트럼 양상을 보여주는 모식도이다.
광대역 분자진동 스펙트럼을 취득하기 위한 실용적 CARS 구현 방법으로서 파장 가변형(wavelength tunable) 레이저 광원을 사용하는 대신 넓은 파장 대역에서 동시에 레이저 발진이 이루어지는 광원을 채택한 멀티플렉스(multiplex) CARS 기법이 동원될 수 있다. CARS 신호 생성을 위한 2개의 입사 레이저 중에서 스톡스광 역할을 담당하는 레이저가 광대역 발진특성을 가지도록 구성하는 것이 일반적이며, 생성된 CARS 신호가 광대역 분자진동 스펙트럼 성분을 포함하고 있기 때문에 각 파장 성분을 분리하여 검출하기 위한 단색기(monochromator) 또는 분광기(spectrometer)가 결합된다.
상기 2색 광원을 이용한 멀티플렉스 CARS 분광장치의 구현에 사용되는 광대역 발진 레이저 광원은, CARS 신호 생성의 원리에 준하여 스톡스광 역할을 하기 위해 발진 파장대역이 반드시 펌프광 역할을 담당하는 레이저의 파장에 비하여 길어야 한다(도 3 참조). 상기 조건이 만족될 경우, 생성되는 멀티플렉스 CARS 스펙트럼은 고정 파장에서 동작되는 펌프광 레이저 광원의 선폭(linewidth)으로 제한되는 높은 파장 분해능을 달성할 수 있다(도 4(a) 참조). 상기 조건과 반대로 광대역 발진 레이저 광원이 상대적으로 짧은 파장 대역에서 동작하게 되면, 광대역 레이저 광이 펌프광 역할과 탐색광 역할을 동시에 하게 됨에 따라 높은 분해능의 파장성분 분해가 불가능한 멀티플렉스 CARS 스펙트럼 신호가 발생된다(도 4(b) 참조).
원리적으로 2색 광원을 이용한 멀티플렉스 CARS 분광장치 구성에 필요한 광대역 발진 레이저 광원과 좁은 선폭의 고정 파장 레이저 광원의 조합은 여러 형태로 구현이 가능하다. 하지만 실제 시료에 대해 멀티플렉스 CARS 분광측정을 적용함에 있어서 CARS 현상 이외의 원하지 않는 광-시료 상호작용을 배제하기 위해서는 사용하는 레이저 광원이 700 nm 이상의 파장을 갖는 근적외선(near IR) 대역에서 동작하는 것이 바람직하다. 특히, 생체 조직과 같은 산란 시료(turbid media)에 대하여 측정이 이루어질 경우, 레이저 광의 시료 투과 깊이를 늘리기 위해서는 파장이 길수록 유리하므로 레이저 광원의 파장 선택에 있어서 중대한 제약이 따른다.
대체적으로 CARS 분광에 요구되는 라만 변위(Raman shift)의 범위가 500 ~ 4000 cm-1 임을 감안하면, 펌프광 역할을 하는 짧은 파장의 레이저가 700 nm 이상에서 동작할 경우 스톡스광 역할을 담당하는 광대역 레이저는 적어도 950 nm 이상의 파장에서 동작이 이루어져야 한다. 현실적으로 900 nm 이상의 파장에서 광대역 발진이 가능한 초단펄스 레이저 광원은 상용화되지 못한 상태이며, 유일한 대안으로서 광자결정섬유(photonic crystal fiber)에서 생성되는 초광대역 백색광(super-continuum)을 이용하는 방법이 있다.
초광대역 백색광은 주로 안정적인 고출력 발진 특성을 갖는 중심파장 800 nm 근처의 Ti:Sapphire 펨토초 레이저 광원이나 중심파장 1064 nm의 Nd 이득매질 계열 모드잠금 피코초 레이저(modelocked picosecond laser)를 높은 비선형성을 갖는 광자결정섬유에 주입하여 발생시킬 수 있다. 상기 방법을 이용하면 멀티플렉스 CARS 분광법의 스톡스광으로 사용할 수 있는 장파장의 광대역 출력을 얻을 수 있으나, 총 변환 효율이 매우 낮고(5% 미만) 균일한 모양의 안정적인 출력 스펙트럼을 얻기 매우 어려운 기술적 문제가 있다. 근본적으로 광자결정섬유의 광 손상 한계(optical damage threshold)로 인해서 주입 가능한 레이저 출력이 제한되어 멀티플렉스 CARS 분광법에 요구되는 충분한 출력의 스톡스광을 얻기 어렵다. 결과적으로 상기 특성을 갖는 스톡스광을 채택하면 멀티플렉스 CARS 분광 측정에 소요되는 시간이 길어지고 스펙트럼의 신호대 잡음비(signal-to-noise ratio) 저하 및 스펙트럼 규격화(normalization) 과정이 수반되게 된다.
따라서, 현재 기술(state-of-the-art technology) 수준에서 안정적이고 충분한 출력을 제공하는 중심파장 800 nm 근처의 광대역 초단펄스 레이저 광원을 활용할 수 있는 별도의 방편이 요구된다. 즉, 짧은 파장을 갖는 광대역 레이저 광원을 펌프광으로 사용하면서, 상대적으로 긴 파장의 안정적인 레이저 광원이 스톡스광으로 작용할 수 있는 효과적인 멀티플렉스 CARS 분광법의 고안이 요구된다.
본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위하여 안출된 것으로, 본 발명의 목적은 광대역 레이저 광원을 이용하여 멀티플렉스 CARS 분광법을 구현함에 있어서 짧은 파장을 갖는 광대역 레이저 광원을 펌프광으로 활용하되, 이로 인하여 높은 분해능의 파장성분 분해가 불가능해지는 2색 광원 방식 멀티플렉스 CARS 분광법의 단점을 극복하도록 하는 3색 광원을 이용한 멀티플렉스 CARS 분광장치를 제공하는 것이다.
또, 본 발명의 부수적인 목적은 실제 CARS 현미경 이미징 시스템에서 구현이 가능한 멀티플렉스 CARS 신호 생성, 수집 및 처리 광학계를 제공하는 것이다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위하여 본 발명의 3색 광원을 이용하는 멀티플렉스 CARS 분광장치는 짧은 파장을 갖는 광대역 레이저 광원에 의한 펌프광과 상대적으로 긴 파장의 안정적인 레이저 광원에 의한 스톡스광의 조합에 의하여 측정 시료의 고유 분자진동에 다중 공명이 이룬 상태에서 상기 2개의 레이저 광원과는 별도의 탐색광 역할을 수행하는 좁은 선폭의 단파장(short-wavelength) 레이저 광을 상호작용시킴으로서 높은 분해능으로 파장성분 분리가 가능한 CARS 분광신호를 발생시키는 것을 가장 큰 특징으로 한다.
이에 따라 본 발명의 3색 광원을 이용하는 멀티플렉스 CARS 분광장치는 시료 구성 매질의 분자진동을 다중으로 여기하기 위한 펌프광(pump beam)을 발생시키는 광대역 레이저 광원(10); 상기 펌프광과 상호작용하여 다중으로 여기된 분자진동이 공명을 이루도록 하는 스톡스광(stokes beam)을 발생시키는 스톡스 레이저 광원(20); 상기 공명 여기된 분자진동 시료로부터 멀티플렉스 CARS 스펙트럼 신호를 발생시키는 탐색광(probe beam)을 발생시키는 프로브 레이저 광원(30); 상기 펌프광, 스톡스광 및 탐색광의 광펄스 출력을 시간적으로 동기화하며, 상기 펌프광, 스톡스광 및 탐색광을 공간적으로 동축 상에 동기화시키는 빔 컴바이너(beam combiner)(40); 상기 시공간적으로 동기화된 레이저 빔을 시료 내부의 국소점으로 집속하는 현미경 대물렌즈(50); 상기 현미경 대물렌즈(50)에 의해 국소화되는 시료 내부의 레이저 빔의 집속점 위치를 임의로 조정하기 위한 시료 변위 스캐너(60); 상기 시료의 집속점에서 발생되는 CARS 신호를 수집하여 평행광화(collimation)하는 수집 렌즈(condenser) 광학계(70); 상기 수집된 CARS 신호 중에 포함된 노이즈(noise) 파장성분을 제거하기 위한 이색성 거울(dichroic mirror) 또는 대역제거 필터(notch filter); 상기 노이즈가 제거된 순수한 CARS 신호의 파장성분을 공간적으로 분산시키는 단색기(monochromator)(90); 상기 단색기(90)에 의하여 파장분산된 멀티플렉스 CARS 스펙트럼 신호의 검출을 위한 배열형 광검출기(1D/2D photodetector array)(100); 상기 배열형 광검출기(100)로 검출된 파장분산된 멀티플렉스 CARS 스펙트럼 신호를 컴퓨터로 전송하여 데이터를 분석 처리하는 데이터 분석기(110);를 포함하여 이루어지는 것을 특징으로 한다.
상기 데이터 분석기는 측정된 멀티플렉스 CARS 스펙트럼을 입사 레이저의 불균일 분광강도 분포에 의해 발생한 비공명 CARS 스펙트럼으로 규격화함으로써 측정 시료 자체의 의미있는 멀티플렉스 CARS 스펙트럼으로 분석 처리하는 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명의 배열형 광검출 장치는 광전자 양자효율(quantum efficiency)과 신호대잡음비(signal-to-noise ratio)가 우수한 1차원 또는 2차원 ICCD 또는 EMCCD를 이용하는 것을 특징으로 한다.
아울러, 본 발명의 상기 멀티플렉스 CARS 분광장치는 종래의 고정 파장 CARS 현미경 이미징 장치와 결합하여 동시에 구현할 수 있는 것을 특징으로 한다.
상술한 바와 같이 본 발명은 3색 레이저 광원을 이용한 멀티플렉스 CARS 분광법을 고안함으로써 종래의 2색 레이저 광원을 이용한 멀티플렉스 CARS 분광법이 가지는 원리적 및 기술적 문제를 해결할 수 있다.
즉, 종래의 멀티플렉스 CARS 분광법이 반드시 펌프광에 비하여 파장이 긴 스톡스광 역할을 할 수 있는 광대역 레이저 광원을 요구하는 제약에서 벗어나 현재 기술(state-of-the-art technology) 수준에서 안정적이고 충분한 출력을 제공하는 광대역 근적외선 초단펄스 레이저 광원을 펌프광으로 이용 가능하도록 한다. 또한, 본 발명에 의한 프로브 레이저 광원 추가와 적정 동작파장 조건이 만족되면 종래의 멀티플렉스 CARS 분광법 적용시 원리적으로 피할 수 없는 파장분해 불가능의 CARS 스펙트럼 왜곡 문제를 극복할 수 있다.
더불어 본 발명의 부수적인 효과는 종래의 2색 광원 CARS 현미경을 이용한 고속 이미징 기술과 연계한 호환 운용이 가능하도록 멀티플렉스 CARS 신호 생성, 수집 및 처리 광학계를 구성함으로써 CARS를 이용한 비선형분광 현미경 기술분야에서 측정 시료에 대한 분자화학적 선택성과 분자진동 분광분석 능력을 획기적으로 향상하는 데 기여할 수 있다.
이하, 상기한 바와 같은 구성을 가지는 본 발명에 의한 3색 광원을 이용하는 멀티플렉스 CARS 분광장치를 첨부된 도면을 참고하여 상세하게 설명한다.
도 5는 본 발명에 의한 3색 광원을 이용하는 멀티플렉스 CARS 분광장치의 레이저-시료 상호작용 에너지 준위 및 천이 다이어그램이고, 도 6은 본 발명에 의해 새로이 제안된 3색 광원을 이용하는 멀티플렉스 CARS 분광법을 구현하기 위한 측정장치 구성을 나타낸 도면이다.
상기한 바와 같은 구성을 가지는 본 발명의 멀티플렉스 CARS 분광장치는 시료에 대한 광대역 분자진동 스펙트럼을 얻기 위하여 발진 주파수 또는 파장 특성이 다른 3 개의 독립적인 레이저, 즉, 시료 구성 매질의 분자진동을 다중으로 여기하기 위한 펌프광(pump beam)을 발생시키는 광대역 레이저 광원(10)과, 상기 펌프광과 상호작용하여 다중으로 여기된 분자진동이 공명을 이루도록 하는 스톡스광(stokes beam)을 발생시키는 스톡스 레이저 광원(20) 및 상기 공명 여기된 분자진동 시료로부터 멀티플렉스 CARS 스펙트럼 신호를 발생시키는 탐색광(probe beam)을 발생시키는 프로브 레이저 광원(30)으로 구성된 3색 광원 시스템을 사용하는 것이 특징이다. 즉, CARS 분광 신호를 생성함에 있어서 펌프광 역할을 하는 중심 주 파수 
의 광대역(주파수 범위, 
) 레이저 광원(10), 스톡스광 역할을 하는 주파수 
의 고정 장파장(long-wavelength)의 스톡스 레이저 광원(20), 그리고 탐색광 역할을 하는 주파수 
의 고정 단파장(short-wavelength)의 프로브 레이저 광원(30)이 사용된다(도 5 참조). 이 때, 빛의 주파수 
와 파장 
은, 빛의 속도를 
라고 할 때 
의 관계에 있다.
CARS 신호 생성 과정에서 상기 광대역(중심 주파수, 
, 대역폭, 
) 펌프광을 구성하는 주파수 성분(
)과 상기 스톡스광(중심 주파수, 
)의 조합은 측정 시료와의 공명 상호작용을 통하여 시료를 구성하는 물질이 가질 수 있는 분자진동 에너지 레벨 
들을 넓은 범위(
) 에서 동시에 여기하는 역할을 한다. 상기 탐색광 역할을 하는 주파수 
의 고정 단파장(short-wavelength) 레이저가 별도로 입사되지 않는 기존의 2색 광원 CARS 분광법의 경우, 상기 광대역 펌프광이 CARS 신호 생성에 있어서의 탐색광 역할을 함께 하게 되어, 여기된 각 분자진동(
)으로부터 펌프광의 주파수 대역폭 
만큼 퍼진 탐색광 성분(주파수 
)에 의한 반스톡스 라만 산란 신호(
)가 발생한다. 결과적으로 파장성분 분해가 불가능하고 펌프광 대역폭만큼 퍼진(convolution) 멀티플렉스 CARS 신호가 최소 주파수 
로부터 최대 주파수 
의 범위에 걸쳐 서로 중첩되어 발생하게 된다(도 4(b) 참조).
이와는 달리, 본 발명의 3색 광원 멀티플렉스 CARS 분광법에 따라서 좁은 선폭의 탐색광 역할을 수행하는 주파수 
의 고정 단파장(short-wavelength) 레이저를 추가로 입사시키면(도 5 참조), 높은 분해능으로 파장분해가 가능한 잘 정의된 멀티플렉스 CARS 스펙트럼을 얻을 수 있다(도 4(c) 참조). 즉, 주파수 
의 멀티플렉스 CARS 신호가 최소 주파수 
로부터 최대 주파수 
의 범위에 걸쳐 각 분자진동 성분의 주파수 중첩 없이 생성된다.
상기 3색 광원 멀티플렉스 CARS 분광법의 구현 시 반드시 고려해야 할 사항은, 상기 탐색광 역할을 수행하는 레이저의 주파수 
의 적절한 선택이다. 실제로는 멀티플렉스 CARS 신호 생성에 있어서 3색 광원에 의한 분광 신호와 2색 광원에 의한 분광 신호가 동시에 생성되기 때문에, 고분해능 CARS 분광 분석에 사용될 3색 광원 멀티플렉스 CARS 스펙트럼이 2색 광원에 의한 스펙트럼과 겹쳐지지 않도록 해야 한다. 즉, 3색 광원 멀티플렉스 CARS 스펙트럼 영역의 최소 주파수가 2색 광원 멀티플렉스 CARS 스펙트럼 영역의 최대 주파수보다 크도록 설정하면 된다. 수식적으로는 광대역 펌프광 레이저의 조건(중심 주파수, 
, 대역폭, 
)이 주어졌을 때, 탐색광의 주파수 
가 적어도 
이상이 되도록 하는 것이 3색 광원 멀티플렉스 CARS 분광법의 구현에 필요한 조건이다.
비선형 라만산란 현상에 기초한 멀티플렉스 CARS 분광법의 구현을 위하여, 상기 주파수 조건을 만족하는 3색 레이저 광원 시스템은 첨두 세기(peak intensity)가 높은 반복 펄스(pulse) 출력 특성을 가지는 것이 바람직하며, 각각의 레이저가 모두 같은 펄스 반복률(repetition rate)과 타이밍(timing)을 가지도록 시간적으로 동기화(synchronization)하는 광학적/기계적 장치 즉, 동기화기기에 의해서 높은 정밀도(레이저 펄스 시간폭 이내)로 제어된다. 능동형(active) 장치 또는 수동형(passive) 장치의 조합이 가능하며, 주종형(master-slave) 레이저 펄스열 동기장치(laser pulse train synchronizer)나 광학적 펄스 지연기(optical pulse delay generator)가 해당된다.
CARS 신호는 측정시료 내부에서 여기용 레이저 빔들이 공간적으로 모두 한 위치에 집속되는 경우에 효율적으로 생성된다. 따라서, 상기 동기화된 3색 펄스 레이저 시스템의 레이저 빔들은 공간적으로 동축 상에서 위치와 방향이 겹쳐지면서 빔의 크기를 일치시키기 위한 부가 장치를 통하여 결합된다. 부가 장치라 함은, 펌프광, 스톡스광, 탐색광 경로 상에 놓인 빔 확대기(beam expander)와 상기 펌프광, 스톡스광, 탐색광 공간적으로 동축 상에 손실 없이 합치시키는 빔 컴바이너(beam combiner)(40)를 포함한다.
상기 빔 컴바이너(40)는 주파수 대역이 다른 레이저 빔 간의 반사 및 투과 특성이 정반대인 이색성 거울(dichroic mirror)의 조합으로 구성된다. 구현의 한 예로써(도 6 참조), 상기 3색 멀티플렉스 CARS 광원 중 파장이 가장 짧은 프로브 레이저 빔을 반사시키고 이보다 파장이 상대적으로 긴 광대역 펌프 레이저 빔을 투과시키는 이색성 거울에 의하여 두 레이저 빔이 공간적으로 합치된다. 이후 공간적으로 합치된 프로브 레이저 빔과 광대역 펌프 레이저 빔을 모두 반사시키고 파장이 가장 긴 스톡스 레이저 빔을 투과시키는 이색성 거울을 거치면서 모든 레이저 빔들이 공간적으로 합치된다.
상기 빔 컴바이너(40)에 의해 공간적으로 결합된 상기 3색 레이저 시스템의 출력 레이저 빔은 시료 앞에 위치한 현미경 대물렌즈(microscope objective)(50)를 통해 시료 내부의 국소점으로 집속된다. 현미경 대물렌즈(50)의 초점에 집속된 상기 레이저 빔은 시료 구성 물질의 분자진동과 상호작용하여 멀티플렉스 CARS 신호를 전방향으로 생성하게 된다. 이때, 상기 현미경 대물렌즈(50)에 의해 시료 내부에 레이저가 집속되는 측정점 위치를 임의로 조정하기 위하여 시료 변위 스캐너(precision sample translator)(60)가 사용된다.
상기 시료 변위 스캐너(60)는 상기 현미경 대물렌즈(50)에 의해 국소화되는 시료 내부의 레이저 집속점을 XY 평면과 광축(Z축) 방향으로 변화시킴으로써 멀티플렉스 CARS 신호를 검출하고자 하는 시료 내부의 위치를 임의로 지정할 수 있게 하는 수동(manual) 또는 전동(motorized) 또는 피에조 트랜스듀서(piezoelectric transducer) 방식의 기계적 이송장치(mechanical translator)를 사용한다.
상기 시료 내부의 레이저 집속점에서 생성된 멀티플렉스 CARS 신호는 수집 렌즈(condenser) 광학계(70)에 의하여 수집되어 평행광화(collimation)된다. 수집된 멀티플렉스 CARS 신호와 함께 분광분석에 불필요한 입사 레이저 성분들이 높은 강도로 존재하는데, 이색성 거울(dichroic mirror)(80) 또는 대역제거 필터(notch filter)를 사용하여 멀티플렉스 CARS 스펙트럼 대역과는 다른 입사 레이저 파장 성분을 제거한다. 상기 필터 처리된 순수한 멀티플렉스 CARS 신호의 스펙트럼을 측정하기 위하여 CARS 신호의 파장성분을 공간적으로 분산시키는 회절격자(grating) 또는 프리즘을 파장분산소자(wavelength dispersion element)로 사용하는 단색기(monochromator)(90)가 사용되며, 단색기(90) 출력단에 파장분산된 멀티플렉스 CARS 스펙트럼 신호는 배열형 광검출기(1D/2D photodetector array)(100)에 검출된다.
상기 배열형 광검출기(100)는 광전자 양자효율(quantum efficiency)과 신호대잡음비(signal-to-noise ratio)가 우수한 1차원 또는 2차원의 전하결합소자(CCD: charge coupled device), 냉각 CCD(cooled CCD), 증폭 CCD(Intensified CCD) 및 전자증폭 CCD(EMCCD)로부터 선택되는 어느 하나를 이용한다.
상기 배열형 광검출기(100)로 취득한 파장분산 CARS 스펙트럼 신호는 데이터 분석기(110)로 전송되어 분석 처리된다. 상기 데이터 분석기라 함은 분광강도(spectral intensity) 규격화(normalization) 및 라만 변위(Raman shift) 변환 등의 정량적 보정 과정을 거쳐서 멀티플렉스 CARS 스펙트럼을 최종적으로 추출하는 역할을 수행한다.
상기 멀티플렉스 CARS 스펙트럼을 시료의 공간적 위치에 따라서 측정하면 현미경 영상이 얻어지는데, 이를 위해 시료 내부의 레이저 빔 집속점 위치를 시료 내부에서 래스터 스캔(raster scan)하는 상기 시료 변위 스캐너(60)를 사용한다. 본 발명의 상기 시료 변위 스캐너는, 시료의 위치를 XY 평면과 Z축 방향으로 기계적 이송(motorized translation)하거나, 시공간 합치된 레이저 빔의 진행 방향을 2차원 평면상으로 고속 주사하는 갈바노 미러 스캐너(galvano mirror scanner)를 사용하는 것이 바람직하다. 상기와 같은 방법으로 동작되는 본 발명에 의한 멀티플렉스 CARS 분광 장치는 고분해능 분자진동 현미경 장치에 사용될 수 있다.
본 발명은 멀티플렉스 CARS 분광법의 구현에 있어서, 광대역 레이저 광원을 펌프광으로 사용할 수 있도록 파장이 짧은 프로브 레이저 광원을 추가한 3색 레이저 광원 시스템을 도입하여, 고분해능의 멀티플렉스 CARS 분광 측정과 분자진동 현미경 이미징과의 호환 운용이 가능한 장치의 구성을 이루는 것을 요점으로 한다.
도 1은 자발 라만 분광신호 생성의 원리를 나타낸 분자진동천이 모식도.
도 2는 CARS 비선형 분광신호 생성의 원리를 나타낸 분자진동천이 모식도.
도 3은 2색 광원을 이용하는 멀티플렉스 CARS 분광장치의 신호 생성 원리를 나타낸 분자진동천이 모식도.
도 4는 멀티플렉스 CARS 분광법에 의해 얻어지는 스펙트럼 특성을 보여주는 모식도.
도 5는 본 발명에 의한 3색 광원을 이용하는 멀티플렉스 CARS 분광장치의 레이저-시료 상호작용 에너지 준위 및 천이 다이어그램.
도 6은 본 발명에 의해 새로이 제안된 3색 광원을 이용하는 멀티플렉스 CARS 분광법을 활용한 측정장치 구성을 나타낸 도면.
** 도면의 주요 부분에 대한 도면 부호의 설명 **
10: 광대역 레이저 광원
20: 스톡스 레이저 광원
30: 프로브 레이저 광원
40: 빔 컴바이너(beam combiner)
50: 현미경 대물렌즈
60: 시료 변위 스캐너
70: 수집 렌즈(condenser) 광학계
80: 이색성 거울(dichroic mirror)
90: 단색기(monochromator)
100: 배열형 광검출기(1D/2D photodetector array)
110: 데이터 분석기
Claims (6)
- 시료 구성 매질의 분자진동을 다중으로 여기하기 위한 펌프광(pump beam)을 발생시키는 광대역 레이저 광원(10);상기 펌프광과 상호작용하여 다중으로 여기된 분자진동이 공명을 이루도록 하는 스톡스광(stokes beam)을 발생시키는 스톡스 레이저 광원(20);상기 공명 여기된 분자진동 시료로부터 멀티플렉스 CARS 스펙트럼 신호를 발생시키는 탐색광(probe beam)을 발생시키는 프로브 레이저 광원(30);상기 펌프광, 스톡스광 및 탐색광의 광펄스 출력을 시간적으로 동기화하시키고 상기 펌프광, 스톡스광 및 탐색광을 공간적으로 동축 상에 동기화시키는 빔 컴바이너(beam combiner)(40);상기 시공간적으로 동기화된 레이저 빔을 시료 내부의 국소점으로 집속하는 현미경 대물렌즈(50);상기 현미경 대물렌즈(50)에 의해 국소화되는 시료 내부의 레이저 빔의 집속점 위치를 임의로 조정하기 위한 시료 변위 스캐너(60);상기 시료의 집속점에서 발생되는 CARS 신호를 수집하여 평행광화(collimation)하는 수집 렌즈(condenser) 광학계(70);상기 수집된 CARS 신호 중에 포함된 노이즈(noise) 파장성분을 제거하기 위한 이색성 거울(dichroic mirror)(80) 또는 대역제거 필터(notch filter);상기 노이즈가 제거된 순수한 CARS 신호의 파장성분을 공간적으로 분산시키 는 단색기(monochromator)(90);상기 단색기(90)에 의하여 파장분산된 멀티플렉스 CARS 스펙트럼 신호의 검출을 위한 배열형 광검출기(1D/2D photodetector array)(100);상기 배열형 광검출기(100)로 검출된 파장분산된 멀티플렉스 CARS 스펙트럼 신호를 컴퓨터로 전송하여 데이터를 분석 처리하는 데이터 분석기(110);를 포함하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 3색 광원을 이용하는 멀티플렉스 CARS 분광 장치.
- 제 1 항에 있어서,상기 프로브 레이저 광원(30)은 펌프광, 스톡스광 및 프로브광을 이용하여 생성되는 3색 멀티플렉스 CARS 스펙트럼 신호로부터 펌프광 및 스톡스광을 이용하여 생성되는 왜곡된 2색 멀티플렉스 CARS 스펙트럼 신호와 분리될 수 있도록 스톡스광보다 파장이 짧은 레이저 광원을 사용하는 것을 특징으로 하는 3색 광원을 이용하는 멀티플렉스 CARS 분광 장치.
- 제 1 항에 있어서,상기 시료 변위 스캐너(60)는 상기 현미경 대물렌즈(50)에 의해 국소화되는 시료 내부의 레이저 집속점을 XY 평면과 광축(Z축) 방향으로 변화시킴으로써 멀티플렉스 CARS 신호를 검출하고자 하는 시료 내부의 위치를 임의로 지정할 수 있게 하는 수동(manual) 또는 전동(motorized) 또는 피에조 트랜스듀서(piezoelectric transducer) 방식의 기계적 이송장치(mechanical translator)를 사용하는 것을 특징으로 하는 3색 광원을 이용하는 멀티플렉스 CARS 분광 장치.
- 제 1 항에 있어서,상기 단색기(90)는 CARS 신호의 파장성분을 공간적으로 분산시키기 위하여 회절격자 또는 프리즘을 파장분산소자(wavelength dispersion element)로 사용하는 것을 특징으로 하는 3색 광원을 이용하는 멀티플렉스 CARS 분광 장치.
- 제 1 항에 있어서,상기 배열형 광검출기(100)는 감도를 높이고 낮은 잡음 레벨로 검출하기 위한 1차원 또는 2차원 배열의 전하결합소자(CCD: charge coupled device), 냉각 CCD(cooled CCD), 증폭 CCD(Intensified CCD) 및 전자증폭 CCD(EMCCD)로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 3색 광원을 이용하는 멀티플렉스 CARS 분광 장치.
- 제 1 항 내지 제 5 항에서 선택되는 어느 한 항에 의한 상기 멀티플렉스 CARS 분광 장치가 현미경 이미징 장치에 사용되는 것을 특징으로 하는 3색 광원을 이용하는 멀티플렉스 CARS 분광 현미경.
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