KR100958308B1 - 항체 절편 발현용 벡터 및 이 벡터를 이용해 항체를디스플레이하는 재조합 파지를 생산하는 방법 - Google Patents

항체 절편 발현용 벡터 및 이 벡터를 이용해 항체를디스플레이하는 재조합 파지를 생산하는 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 수용성 경쇄 항체 절편(VL+CL)을 생산하기 위한 플라스미드 벡터(pLA-1 또는 pLT-2) 및 중쇄 항체 절편(VH+CH1)-ΔpIII 융합 단백질 발현 및 유전형-표현형 연계 기능을 지닌 파지미드 벡터(pHf1g3T-1 또는 pHf1g3A-2), 상기 벡터를 이용하여 형질전환 시킨 숙주 및 상기 숙주로 수용성 항체 및 항체를 디스플레이하는 재조합 파지를 생산 및 선별하는 방법에 관한 것이다.
수용성 항체 절편, 벡터, 플라즈미드, 파지미드, 파지 디스플레이

Description

항체 절편 발현용 벡터 및 이 벡터를 이용해 항체를 디스플레이하는 재조합 파지를 생산하는 방법 {A vector for expressing antibody fragments and a method for producing recombinant phage that displays antibody fragments by using the vector}
본 발명은 수용성 경쇄 항체 절편(VL+CL)을 생산하기 위한 플라스미드 벡터(pLA-1 또는 pLT-2) 및 중쇄 항체 절편(VH+CH1)-ΔpIII 융합 단백질 발현 및 유전형-표현형 연계 기능을 지닌 파지미드 벡터(pHf1g3T-1 또는 pHf1g3A-2), 상기 벡터를 이용하여 형질전환 시킨 숙주 및 상기 숙주로 수용성 항체 및 항체를 디스플레이하는 재조합 파지를 생산 및 선별하는 방법에 관한 것이다.
파지 디스플레이 기술은 영국의 Medical Research Council에서 1990년 처음 개발된 것으로, 인간 항체 라이브러리(library)를 제조하여 항체절편(Fab, ScFv)의 형태로 박테리오파지의 표면에 발현시켜 특정 항원에 대한 항체클론들을 선별하는 기술이다.
인간 재조합 항체의 생산에 있어서 파지 디스플레이 기술의 중요성은 이미 잘 인지되고 있으며 (참고문헌: Clackson, T., Hoogenboom, H.R., Grifiths, A.D., Winter, G.. 1991. Making antibody fragments using phage display libraries. Nature. 352, 624.; Hoogenboom, H., Charmes, P., 2000. Natural and designer binding sites made by phage display Technology. Immunol. Today 21, 371.; Hoet, R.M., Cohen, E.H., Kent, R.B., Rookey, K., Schoonbroodt, S., Hogan, S., Rem, L., Frans, N., Daukandt, M., Pieters, H., van Hegelsom, R., Neer, N.C., Nastri, H.G., Rondon, I.J., Leeds, J.A., Hufton, S.E., Huang, L., Kashin, I., Devlin, M., Kuang, G., Steukers, M., Viswanathan, M., Nixon, AE., Sexton, D.J., Hoogenboom, H.R., Ladner, R.C. 2005. Generation of high-affinity human antibodies by combining donor-derived and synthetic complementarity-determining-region diversity. Nat Biotechnol. 23(3), 344.), 항원과 특이적으로 반응하는 거의 모든 종류의 인간 재조합 단일 클론 항체를 단일 pot 항체 라이브러리 시스템으로부터 선별해낼 수 있는 가능성이 제안되었다 (참고문헌: Nissim, A., et al. 1994. Antibody fragments from a 'single pot' phage display library as immunological reagents. EMBO J. 13, 692.; Griffiths, A.D., Williams, S.C., Hartley, O., Tomlinson, I.M., Waterhouse, P., Crosby, W.L., Kontermann, R.E., Jones, P.T., Low, N.M., Allison, T.J., Prospero, T.D., Hoogenboom, H.R., Nissim, A., Cox, J.P.L., Harrison, J.L., Zaccolo, M., Gherardi, E., Winter, G. 1994. Isolation of high affinity human antibodies directly from large synthetic repertoires. EMBO J. 13(14), 3245.). 이는 파지 디스플레이 항체 기술을 활용할 경우 체내 진단이나 치료에 응용할 수 있는 다양한 항체 단편들(scFv 또는 Fab 형태)을 획득할 수 있음을 의미한다 (참고문헌: McCafferty, J., Griffiths, A.D., Winter, G., Chiswell, D.J. 1990. Phage antibodies: filamentous phage displaying antibody variable domains. Nature 348, 552; Winter, G., Griffiths, A.D., Hawkins, R.E., Hoogenboom, H.R. 1994. Making antibodies by phage display technology. Annu. Rev. Immunol. 12, 433.; Griffiths, A.D., Duncan, A.R., 1998. Strategies for selection of antibodies by phage display. Curr Opin Biotechnol. 9, 102). 하지만, 아직까지 여러 가지 기술적 문제점들이 파지 디스플레이 항체 기술에 존재하기 때문에 상기의 이상적인 항체 공학 기술은 완전하게 현실화 되지 못하고 있는 실정이다 (참고문헌: Knappik, A., Plㆌckthun, A., 1995. Engineered turns of a recombinant antibody improve its in vivo folding. Protein Eng. 8, 81; McCafferty, J. 1996. Phage display: factors affecting panning efficiency. In: Kay, B.K., Winter, J., McCafferty, J. (Eds.), Phage Display of Peptides and Proteins, a Laboratory Manual. Academic Press, San Diego, p. 261; Krebber, A., Burmester, J., Pluckthun, A. 1996.Inclusion of an upstream transcriptional terminator in phage display vectors abolishes background expression of toxic fusions with coat protein g3p. Gene. 178, 71; Assazy, H.M.E., Highsmith, W.E., 2002. Phage display technology: clinical applications and recent innovations. Clin Biochem. 35, 425; Baek, H., Suk, K.H., Kim, Y.H., Cha, S. 2002. An improved helper phage system for efficient isolation of specific antibody molecules in phage display. Nucleic Acids Res. 30(5), e18; Corisdeo, S., Wang, B., 2004. Functional expression and display of an antibody Fab fragment in Escherichia coli: study of vector designs and culture conditions. Protein Expr Purif. 34, 270). 즉, 이 기술은 단 몇 주 만에 단일 클론 항체를 분리할 수 있다는 장점이 있으나 분리한 항체의 친화도가 그리 높지 않다는 단점이 있다. 이러한 단점을 보완하기 위하여 분리된 항체클론들의 CDRs 및 FRs의 잔기들을 변이시킨 후 파지 디스플레이 방법을 사용하여 친화도가 보다 높은 인간 항체클론들을 다시 선별하는 시험관내 친화력 성숙(in vitro affinity maturation) 과정을 고려하고 있다.
항체 라이브러리의 질에 영향을 미치는 결정적인 요인의 하나는 항체 유전자가 삽입된 파지미드를 지닌 클론의 숫자이다 (참고문헌: McCafferty, J. 1996. Phage display: factors affecting panning efficiency. In: Kay, B.K., Winter, J., McCafferty, J. (Eds.), Phage Display of Peptides and Proteins, a Laboratory Manual. Academic Press, San Diego, p. 261). 항체 라이브러리 내에 많은 수의 클론이 존재할수록 그 라이브러리의 다양성이 증가한다고 짐작할 수 있는데, 항체 라이브러리로부터 특정 표적분자-특이적 유전자 재조합 항체가 항상 성공적으로 선별될 수 있기 위해 요구되는 라이브러리 내의 최소한의 클론 수를 정의한다는 것은 거의 불가능하다고 할 수 있다. 한편 생쥐의 생체 내에 약 5 X 108 정도의 항체 다양성이 존재한다는 가정 하에 항체 라이브러리로부터 원하는 친화도 및 촉매 기능을 지닌 항체를 확보하기 위해서 라이브러리의 크기가 5 X 108 보다 매 우 커야 한다고 제안되었으며 (참고문헌: Ostermeier, M., Benkovic, S.J. 2000. A two-phagemid system for the creation of non-phage displayed antibody libraries approaching one trillion members. J Immunol Methods. 237(1-2), 175), 실제로 시험관내 (in vitro) 시스템에서는 친화도 성숙 기작이 전무하기 때문에 5 X 108 정도의 다양성을 지닌 항체 라이브러리로부터는 오직 낮은 친화도의 항체(10-6~10-7 M) 만이 선별될 수 있었다 (참고문헌: de Bruin, R., Spelt, K., Mol, J., Koes R., Quattrocchio, F. 1999. Selection of high-affinity phage antibodies from phage display libraries. Nat Biotechnol. 17(4), 397). 더불어 그 외의 다른 실험적 문제점 등으로 말미암아 높은 친화력을 갖는 항체(10-9~10-10 M)를 획득하기 위해서는 항체 라이브러리의 다양성이 1010보다 높아야한다고 제안되어졌다 (참고문헌: Griffiths, A.D., Williams, S.C., Hartley, O., Tomlinson, I.M., Waterhouse, P., Crosby, W.L., Kontermann, R.E., Jones, P.T., Low, N.M., Allison, T.J., Prospero, T.D., Hoogenboom, H.R., Nissim, A., Cox, J.P.L., Harrison, J.L., Zaccolo, M., Gherardi, E., Winter, G. 1994. Isolation of high affinity human antibodies directly from large synthetic repertoires. EMBO J. 13(14), 3245; Sheets, M.D., Amersdorfer, P., Finnern, R., Sargent, P., Lindquist, E., Schier, R., Hemingsen, G., Wong, C., Gerhart, J.C., Marks, J.D., Lindqvist, E. 1998. Efficient construction of a large nonimmune phage antibody library: the production of high-affinity human single-chain antibodies to protein antigens. Proc Natl Acad Sci U S A. 95(11), 6157; Vaughan, T.J., Williams, A.J., Pritchard, K., Osbourn, J.K., Pope, A.R., Earnshaw, J.C., McCafferty, J., Hodits, R.A., Wilton, J., Johnson, K.S. 1996. Human antibodies with sub-nanomolar affinities isolated from a large non-immunized phage display library. Nat Biotechnol. 14(3), 309). 그러나 유감스럽게도 벡터 DNA와 항체 DNA가 라이게이션된 유전자를 전기천공(electroporation) 방법을 사용하여 대장균 (Escherichia coli) 숙주세포 내로 도입할 경우 대장균의 낮은 형질전환 효율성으로 인하여 1010 정도의 다양성을 지닌 항체 라이브러리를 제조한다는 것은 매우 힘들고 오랜 시간이 소요되는 일이다.
이런 기술적 어려움을 회피하기 위하여 람다파지 att 재조합 사이트와 Int 재조합 효소 (참고문헌: Geoffroy, F., Sodoyer, R., Aujame, L., 1994. A new phage display system to construct multicombinatorial libraries of very large antibody repertoires. Gene 151, 109) 또는 loxP 사이트와 파지 P1 Cre 재조합 효소 시스템 (참고문헌: Waterhouse, P., Griffiths, A.D., Johnson, K.S., Winter, G. 1993. Combinatorial infection and in vivo recombination: a strategy for making large phage antibody repertoires. Nucleic Acids Res. 21, 2265; Griffiths, A.D., Williams, S.C., Hartley, O., Tomlinson, I.M., Waterhouse, P., Crosby, W.L., Kontermann, R.E., Jones, P.T., Low, N.M., Allison, T.J., Prospero, T.D., Hoogenboom, H.R., Nissim, A., Cox, J.P.L., Harrison, J.L., Zaccolo, M., Gherardi, E., Winter, G. 1994. Isolation of high affinity human antibodies directly from large synthetic repertoires. EMBO J. 13(14), 3245; Tsurushita, N., Fu, H., Warren, C., 1996. Phage display vectors for in vivo recombination of immunoglobulin heavy and light chain genes to make large combinatorial libraries. Gene. 172, 59)을 이용해 대장균 내에서 플라스미드와 파지미드에 의해 각각 인코딩되는 VL과 VH 유전자의 생체내 (in vivo) 조합이 시도되었으나 이러한 방법으로 제조된 항체 라이브러리의 실제 다양성을 확인하기는 어렵다고 할 수 있다.
또한, 항체 라이브러리의 제조에 있어서 DNA 벡터의 낮은 대장균 형질 전환 효율을 회피하기 위해 파지 감염 방법을 통해 숙주 세포내로 DNA를 도입시키는 방법이 투-벡터 시스템과 더불어 조합 항체 라이브러리의 제조에 시도되었다. 예를 들어 Hoogenboom 등은 중쇄와 경쇄 항체 절편을 각각 생산하는 fd-tet-DOG1 파지 벡터와 pHEN1 파지미드 벡터를 사용, 두 가지의 벡터가 같은 숙주세포 안에서 적절히 유지되어 기능성 있는 Fab 항체 분자를 발현할 수 있는 투-벡터 시스템으로 Fab 항체 라이브러리를 제조할 수 있다는 것을 보여 주었다 (참고문헌: Hoogenboom, H.R., Griffiths, A.D., Johnson, K.S., Chiswell, D.J., Hudson, P., Winter, G. 1991. Multi-subunit proteins on the surface of filamentous phage: methodologies for displaying antibody (Fab) heavy and light chains. Nucleic Acids Res. 19(15), 4133). 그러나 이 방법은 비록 파지의 표면에 기능성 있는 Fab 분자를 디스플레이 시킬 수는 있으나 항체 라이브러리의 제조에 사용하기에는 비실용적이며 그 이유는 재조합 fd-tet-DOG1 파지뿐만 아니라 pHEN1 파지미드 벡터가 삽입된 TG1 세포에 재조합 fd-tet-DOG1 파지를 감염시켜 얻어지는 파지 후손들의 숙주 세포 감염율이 매우 제한적이기 때문이다. 이러한 감염 기능의 손실은 이미 M13δg3 시스템 (참고문헌: Rakonjac, J., Jovanovic, G., Model, P. 1993.Filamentous phage infection-mediated gene expression: construction and propagation of the gIII deletion mutant helper phage R408d3. Gene.198, 99; McCafferty, J. 1996. Phage display: factors affecting panning efficiency. In: Kay, B.K., Winter, J., McCafferty, J. (Eds.), Phage Display of Peptides and Proteins, a Laboratory Manual. Academic Press, San Diego, p. 261)에서 지적되었듯이 상기의 재조합 파지들은 숙주 박테리아의 sex pili와 상호작용하는 자연형 g3p를 지니지 못하기 때문이다.
Ostermeier와 Benkovic에 의해 제안된 또 다른 투-벡터 시스템 (참고문헌: Ostermeier, M., Benkovic, S.J. 2000. A two-phagemid system for the creation of non-phage displayed antibody libraries approaching one trillion members. J Immunol Methods. 237(1-2), 175)은 좀 더 심각한 문제점을 지니고 있는데, 그들의 발명을 자세히 살펴보면, 우선 두 개의 파지미드 벡터에 각각 중쇄 및 경쇄 유전자 라이브러리를 제조한 후에 VCSM13 핼퍼 파지를 이용하여 이 파지미드 게놈을 지닌 재조합 파지를 생산하고 이렇게 생성된 파지를 박테리아 숙주 세포에 동시에 감염시킴으로서 조합 Fab 라이브러리를 제조한다는 것이다. 그러나 이렇게 제조된 라이브러리는 파지 디스플레이에 적용할 경우 별다른 가치가 없는데 그 이유는 매우 심각한 핼퍼 파지의 오염이 예상되며, 더 더욱 표적분자-특이적인 파지의 선별을 위한 기술적 전략이 마련될 수 없다는 한계점을 지니고 있기 때문이다.
본 발명은 중쇄와 경쇄 절편을 코딩하는 두 가지의 벡터를 원형 DNA 형태로 숙주세포 내에 연속적으로 형질전환 시켜서 핼퍼 파지 오염 문제없이 손쉽게 조합 Fab 항체 라이브러리를 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 수용성 경쇄 및 중쇄 항체 절편을 생산하기 위한 플라스미드 벡터(pLA-1 또는 pLT-2) 및 Fd(VH+CH1)-ΔpIII 융합 단백질 발현 및 유전형-표현형 연계 기능을 지닌 파지미드 벡터(pHf1g3T-1 또는 pHf1g3A-2), 상기 벡터를 이용하여 형질전환 시킨 숙주 및 상기 숙주로 수용성 항체와 파지 디스플레이 기술을 이용하여 항체를 디스플레이하는 재조합 파지를 생산 및 선별 하는 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명에서는 (1) pBR322 플라스미드를 Pst I 및 EcoR I으로 효소분해하여 DNA 단편을 생성시키는 단계, (2) pCMTG-SP112 파지미드를 서열번호: 1 및 서열번호: 2로 구성된 프라이머 세트를 사용하여 PCR 반응시키고, PCR 결과물을 Pst I 및 Mun I으로 효소분해하여 DNA 단편을 생성시키는 단계, (3) 상기 단계 (1)의 DNA 단편과 상기 단계 (2)의 DNA 단편을 라이게이션(ligation)시키는 단계, (4) 상기 단계 (3)에서 라이게이션 시킨 DNA를 사용하여 TG1 형질전환용 세포를 형질전환 시키는 단계, 및 (5) 상기 단계 (4)에서 형질전환 된 TG1 세포를 배양하고 이로부터 파지미드를 분리정제하는 단계를 포함하는, pHf1g3T-1 파지미드를 제조하는 방법 및 상기 방법에 따라 제조된 pHf1g3T-1 파지미드를 제공한다.
다른 구체 예에서, 본 발명은 (1) pBAD/gIII 플라스미드를 서열번호: 3 및 서열번호: 4로 구성된 프라이머 세트를 사용하여 PCR 반응시키고, PCR 결과물을 Cla I 및 Spe I으로 효소분해하여 DNA 단편을 생성시키는 단계, (2) pCDFDuet-1 플라스미드를 서열번호: 5 및 서열번호: 6으로 구성된 프라이머 세트를 사용하여 PCR 반응시키고, PCR 결과물을 Cla I 및 Spe I으로 효소분해하여 DNA 단편을 생성시키는 단계, (3) 상기 단계 (1)의 DNA 단편과 상기 단계 (2)의 DNA 단편을 라이게이션 시키는 단계, (4) 상기 단계 (3)에서 라이게이션 된 DNA를 사용하여 TG1 형질전환 용 세포를 형질전환 시키는 단계, (5) 상기 단계 (4)에서 형질전환 시킨 TG1 세포를 배양하고 이로부터 플라스미드를 분리정제하는 단계, (6) 상기 단계 (5)에서 정제된 플라스미드를 Nco I 및 Xho I으로 효소분해하여 DNA 단편을 생성시키는 단계, (7) pCMTG-SP112 파지미드를 서열번호: 7 및 서열번호: 8로 구성된 프라이머 세트를 사용하여 PCR 반응시키고, PCR 결과물을 Nco I 및 Xho I으로 효소분해하여 DNA 단편을 생성시키는 단계, (8) 상기 단계 (6)의 DNA 단편과 상기 단계 (7)의 DNA 단편을 라이게이션 시키는 단계, (9) 상기 단계 (8)에서 라이게이션 된 DNA를 사용하여 TG1 형질전환용 세포를 형질전환 시키는 단계, (10) 상기 단계 (9)에서 형질전환 시킨 TG1 세포를 배양하고 이로부터 플라스미드를 분리정제하는 단계, (11) 상기 단계 (10)에서 정제된 플라스미드를 Sac I 및 Sac II로 효소분해하여 DNA 단편을 생성시키는 단계, (12) pCMTG-SP112 파지미드를 서열번호: 9 및 서열번호: 10으로 구성된 프라이머 세트를 사용하여 PCR 반응시키고, PCR 결과물을 Sac I 및 Sac II로 효소분해하여 DNA 단편을 생성시키는 단계, (13) 상기 단계 (11)의 DNA 단편과 상기 단계 (12)의 DNA 단편을 라이게이션 시키는 단계, (14) 상기 단계 (13)에서 라이게이션 된 DNA를 사용하여 TG1 형질전환용 세포를 형질전환시키는 단계, 및 (15) 상기 단계 (14)에서 형질전환 시킨 TG1 세포를 배양하고 이로부터 플라스미드를 분리정제하는 단계를 포함하는, pLA-1 플라스미드를 제조하는 방법 및 상기 방법에 따라 제조된 pLA-1 플라스미드를 제공한다.
다른 구체 예에서, 본 발명은 (1) 제 2항의 pLA-1 플라스미드를 Xho I 및 Sal I으로 효소분해하여 DNA 단편을 생성시키는 단계, (2) pCMTG-SP112 파지미드를 서열번호: 11 및 서열번호: 12로 구성된 프라이머 세트를 사용하여 PCR 반응시키고, PCR 결과물을 Xho I 및 Sal I으로 효소분해하여 DNA 단편을 생성시키는 단계, (3) 상기 단계 (1)의 DNA 단편과 상기 단계 (2)의 DNA 단편을 라이게이션 시키는 단계, (4) 상기 단계 (3)에서 라이게이션 된 DNA를 사용하여 TG1 형질전환용 세포를 형질전환 시키는 단계, 및 (5) 상기 단계 (4)에서 형질전환 된 TG1 세포를 배양하고 이로부터 파지미드를 분리정제하는 단계를 포함하는, pHf1g3A-2 파지미드를 제조하는 방법 및 상기 방법에 따라 제조된 pHf1g3A-2 파지미드를 제공한다.
다른 구체 예에서, 본 발명은 (1) pBR322 플라스미드를 Pst I 및 EcoR I으로 효소분해하여 DNA 단편을 생성시키는 단계, (2) pCMTG-SP112 파지미드를 서열번호: 13 및 서열번호: 14로 구성된 프라이머 세트를 사용하여 PCR 반응시키고, PCR 결과물을 Pst I 및 Mun I으로 효소분해하여 DNA 단편을 생성시키는 단계, (3) 상기 단계 (1)의 DNA 단편과 상기 단계 (2)의 DNA 단편을 라이게이션 시키는 단계, (4) 상기 단계 (3)에서 라이게이션 된 DNA를 사용하여 TG1 형질전환용 세포를 형질전환 시키는 단계, 및 (5) 상기 단계 (4)에서 형질전환 된 TG1 세포를 배양하고 이로부터 플라스미드를 분리정제하는 단계를 포함하는, pLT-2 플라스미드를 제조하는 방법 및 상기 방법에 따라 제조된 pLT-2 플라스미드를 제공한다..
또 다른 구체 예에서, 본 발명은 (1) 상기 pHf1g3T-1를 사용하여 TG1 세포를 형질전환 시키는 단계, (2) 상기 단계 (1)에서 형질전환 시킨 세포를 상기 pLA-1 을 사용하여 형질전환 시키는 단계, 및 (3) 상기 단계 (2)에서 형질전환 시킨 세포를 배양하는 단계를 포함하는, 듀얼 벡터 시스템-I-A (DVS-I-A)을 제공한다.
또 다른 구체 예에서, 본 발명은 (1) 상기 pLA-1을 사용하여 TG1 세포를 형질전환 시키는 단계, (2) 상기 단계 (1)에서 형질전환 시킨 세포를 상기 pHf1g3T-1을 사용하여 형질전환 시키는 단계, 및 (3) 상기 단계 (2)에서 형질전환 시킨 세포를 배양하는 단계를 포함하는, 듀얼 벡터 시스템-I-B (DVS-I-B)를 제공한다.
또 다른 구체 예에서, 본 발명은 (1) 상기 pLT-2를 사용하여 TG1 세포를 형질전환 시키는 단계, (2) 상기 단계 (1)에서 형질전환 시킨 세포를 상기 pHf1g3A-2를 사용하여 형질전환 시키는 단계, 및 (3) 상기 단계 (2)에서 형질전환 시킨 세포를 배양하는 단계를 포함하는, 듀얼 벡터 시스템-II-A (DVS-II-A)를 제공한다.
또 다른 구체 예에서, 본 발명은 (1) 상기 pHf1g3A-2를 사용하여 TG1 세포를 형질전환 시키는 단계, (2) 상기 단계 (1)에서 형질전환 시킨 세포를 상기 pLT-2를 사용하여 형질전환 시키는 단계, 및 (3) 상기 단계 (2)에서 형질전환 시킨 세포를 배양하는 단계를 포함하는, 듀얼 벡터 시스템-II-B (DVS-II-B)를 제공한다.
또 다른 구체 예에서, 본 발명은 상기 DVS-I-A, DVS-I-B, DVS-II-A 또는 DVS-II-B을 이용하여 인간 Fab 항체 유전자를 발현시키는 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 상기 벡터들의 중요한 특징을 정리하면 하기 표 1과 같다.
표 1. 백터의 특징 비교
DVS-I DVS-II
벡터 pLA-1 pHf1g3T-1 pLT-2 pHf1g3A-2
플라스미드와 파지미드 플라스미드 파지미드 플라스미드 파지미드
프로모터 P BAD P lac P lac P BAD
코딩된 항체 절편 L 쇄 Fd-ΔpIII L 쇄 Fd-ΔpIII
신호 서열 gIII ompA ompA gIII
유도체 아라비노스 IPTG IPTG 아라비노스
복제 기점 CDF ori pBR ori pBR ori CDF ori
f1 기점 없음 있음 없음 있음
파지 후손으로 패키징 없음 있음 없음 있음
항생제 내성 ampR tetR ampR tetR
본 명세서에서, 듀얼 벡터 시스템(Dual Vector system)은 서로 상이한 외래 유전자를 포함하고 있는 두 개의 벡터를 각각 제조하고, 이를 한 숙주에 동시에 또는 연속적으로 형질전환 시켜서 목적하는 생산물을 얻는 시스템을 말한다. 특히, pLA-1 플라스미드 벡터 및 pHf1g3T-1 파지미드 벡터로 형질전환 된 숙주 세포를 이용한 시스템을 듀얼 벡터 시스템(DVS)-I으로, pLT-2 플라스미드 벡터 및 pHf1g3A-2 파지미드 벡터로 형질전환 된 숙주 세포를 이용한 시스템을 듀얼 벡터 시스템(DVS)-II로 칭 한다
본 발명에서는 피루베이트 디하이드로게나제 콤플렉스(pyruvate dehydrogenase complex)-E2(PDC-E2) 특이적인 SP112 Fab 클론을 모델로 사용하여, 듀얼 벡터 시스템(dual-vector system, DVS)으로 이루어진 파지 디스플레이 시스템을 제공하였다. 또한, 본 발명은 상기 듀얼 벡터 시스템을 이용하여 조합 파지 디스플레이 Fab 라이브러리를 제공할 수 있다.
이하, 본 발명을 실시 예를 통하여 더욱 상세히 설명하지만, 이것이 본 발명을 제한하는 것은 아니다.
실시예 1. DVS-I 및 DVS-II의 제조
1.1 박테리아 세포주
대장균 (Escherichia coli) 세포주인 TG1 (supE thi-1 Δ(lac-proAB) Δ(mcrB-hsdSM)5 (rK- mK-) [F` traD36 proAB lacIq lacZΔM15]) (입수처: Amersham Pharmacia Biotech, Sweden)을 클로닝 및 재조합 파지 생산을 위한 박테리아 숙주로 사용하였다.
1.2. PCR 증폭과 올리고뉴클레이타이드의 합성
Ex-Taq 중합효소 (입수처: Takara, Japan)를 모든 PCR 증폭에 사용하였으며, 모든 제한 효소는 다카라 (Takara)사로부터 구입하였다. 또한 본 발명에 사용된 모든 PCR 프라이머는 (주)바이오니아 (Bioneer, Korea)사에서 주문 합성하였다.
1.3. 재조합 벡터의 제조
모든 DNA 클로닝 실험들은 표준 방법 (참고문헌: J. Sambrook, E.F. Fritsch, T. Maniatis, Molecular Cloning. A laboratory Manual, 2nd Ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989.)에 따라 수행하였다.
1.3.1. 듀얼 벡터 시스템-I (DVS-I) (pHf1g3T-1 파지미드와 pLA-1 플라스미드의 조합)
1.3.1.1 pHf1g3T-1의 제조
pBR322 플라스미드 (Dr. M. Eric Gershwin, University of California 제공)를 Pst I과 EcoR I으로 절단하였고, 절단된 4 kb의 DNA 단편을 1%의 아가로스 겔을 사용하여 전기영동을 한 후 Wizard DNA 정제 키트 (입수처: Promega, USA)를 이용하여 획득하였다. 다음 30 유닛의 CIP (calf intestinal phosphatase; 입수처: Roche)를 첨가하여 37℃ 수욕조 (water bath)에서 1시간 반응시킨 후 1 ㎕의 0.5 M EDTA를 넣고 65℃에서 1시간 동안 불활성화 시켰다. PDC-E2-특이적인 인간 단일 클론 항체인 SP112의 Fab 유전자를 지닌 pCMTG-SP112 (입수처: IG Therapy Co.)로부터 P lac + Fd(VH + CH1) + delta gIII + f1 ori으로 구성되어진 DNA 단편을 PCR 방법 (센스 (sense) 프라이머: 5`- GGGCTGCAGACGCGGCCTTTTTACGGTGGTTCCT-3` (서열번호: 1), 및 안티-센스 (anti-sense) 프라이머: 5`-GGGCAATTGCCGCGCACATTTCCCCGAAAAG-3` (서열번호: 2))을 이용하여 94℃ 1분, 55℃ 1분, 72℃ 1분에서 35 사이클 (cycle), 및 72℃에서 10분의 조건으로 증폭하였다. 이 때 PCR 기계는 Perkin Elmer 9700 (제조사: Perkin Elmer Inc.)을 사용하였다. PCR 결과물을 1% 아가로스 겔에 전기 영동하여 DNA 단편 (약 2.1 kb)을 분리한 후 Pst I과 Mun I으로 제한효소 처리를 해주었다. 준비된 pBR322 벡터와 PCR 결과물들을 정량한 후 T4 DNA 라이게이즈 (입수처: Takara)를 넣고 4℃에서 O/N (overnight) 반응시키고 이 반응액을 TG1 형질전환용(electrocompetent) 세포에 2.5 kV, 25 ㎌, 200 Ω의 조건으로 Gene-pulser Ⅱ (제조사: Bio-rad, USA)를 이용 하여 형질전환 하였다. 그 후 1 ㎖의 LB 배양액을 첨가하여 37℃에서 1시간 동안 배양한 후 항생제 선별을 위해 10 ㎍/㎖ 테트라사이클린이 함유된 LB 아가 플레이트(LB/T plate)에 도말하고 37℃에서 밤새 배양하였다.
상기 배양한 세포로부터 파지미드를 분리정제하여 pHf1g3T-1 파지미드를 수득하였다.
1.3.1.2 pLA-1 플라스미드 벡터의 제조
pBAD/gIII (입수처: Invitrogen, USA)의 AraC ORF + ara BAD promoter + Multicloning site - AmpR ORF가 포함된 유전자 절편을 PCR 방법 (센스 프라이머: 5′-GGGATCGATTCAATTGTCT GATTCGTTACCAA-3′ (서열번호: 3)및 안티-센스 프라이머: 5′-GGGACTAGTTCAGTGGAA CGAAAACTCACG-3′ (서열번호: 4))을 이용하여 94℃ 1분, 55℃ 1분, 72℃ 1분에서 35 사이클, 및 72℃에서 10분의 조건으로 증폭하였다. 획득한 2.9 kb 크기의 PCR 결과물을 1% 아가로스 겔을 이용하여 분리하였고, Wizard DNA 정제 키트를 이용하여 정제하였다. DNA 단편을 Cla I과 Spe I으로 제한효소 처리를 한 다음 상기에 기술한 바와 같이 CIP 처리하였다. 또한 CDF ori이 포함된 유전자 절편 (약 850 bp)을 pCDFDuet-1 (입수처: Novagen, USA)으로부터 PCR 방법 (센스 프라이머: 5′-GGGATCGATATAGCTAGCTCACTCGGTCG-3′ (서열번호: 5) 및 안티-센스 프라이머: 5′-GGGACTAGTGCACTGAAATCTAGAGCGGAA-3′ (서열번호: 6))에 의하여 94℃ 1분, 55℃ 1분, 72℃ 1분에서 35 사이클, 및 72℃에서 10분의 조건으로 증폭하였으며, PCR 결과물을 Cla I 과 Spe I으로 제한효소 처리를 해준 후 준비된 pBAD/gIII 벡터 절편과 혼합하여 T4 DNA 라이게이즈 (입수처: Takara)를 넣고 4℃ 에서 O/N 반응시켰다. 이 반응액을 TG1 형질전환용 세포에 2.5 kV, 25 ㎌, 200 Ω의 조건으로 Gene-pulser Ⅱ를 이용하여 형질전환 하였다. 그 후 1 ㎖의 LB 배지를 첨가하여 37 ℃에서 1시간동안 배양한 후 항생제 선별을 위해 50 ㎍/㎖ 암피실린이 첨가된 LB 아가 플레이트 (LB/A plate)에 도말하고 37℃에서 O/N 배양하였다. 상기의 LB/A 플레이트로부터 대장균 균주를 확보하고 단일 콜로니 (colony)를 LB/A 액체 배지에 배양한 후, Wizard 플라스미드 정제 키트를 이용하여 pBAD/gIII/CDF ori 재조합 플라스미드를 분리 정제하였다. 이 플라스미드를 Nco I과 Xho I으로 제한효소 처리한 후 CIP 처리를 수행하였다. 한편 5` 말단 부위에 Sal I 과 Sac II 클로닝 자리가 삽입된 인간 CL 카파 유전자 단편을 pCMTG-SP112로부터 PCR 방법 (센스 프라이머: 5′-GGGCCATGGGATTTAGGTGACACTATAGGATCTCGATCCCGCGAAAT-3′ (서열번호: 7) 및 안티-센스 프라이머: 5′-GGGCTCGAGTTATCAACACTCTCCCCTGTTGCTC-3′ (서열번호: 8))을 이용하여 94℃ 1분, 55℃ 1분, 72℃ 1분에서 35 사이클, 및 72℃에서 10분의 조건으로 증폭하였다. 획득한 PCR 결과물을 Nco I과 Xho I으로 제한효소 처리한 후, 상기의 벡터 DNA와 적당한 농도로 혼합하고 T4 DNA 라이게이즈를 넣은 후 4℃에서 O/N 반응시켰다. 이 반응액을 TG1 형질전환용 세포에 2.5 kV, 25 ㎌, 200 Ω의 조건으로 Gene-pulser Ⅱ를 이용하여 형질전환 하였다. 그 후 1 ㎖의 LB 배지를 첨가하여 37℃에서 1시간동안 배양한 후 항생제 선별을 위해 LB/A 아가 플레이트에 도말하고 37℃ 인큐베이터에서 O/N 배양하였다. 이렇게 얻어진 단일 콜로니를 LB/A 액체 배지에 배양한 후, Wizard 플라스미드 정제 키트를 이용하 여 인간 CL 유전자가 클로닝 된 플라스미드를 획득하였다. 획득한 플라스미드에 Sac I과 Sac II 제한효소 처리를 하고 30 유닛의 CIP를 첨가하여 37℃ 수욕조에서 1시간 반응시킨 후 1 ㎕의 0.5 M EDTA를 넣고 65℃에서 1시간 동안 불활성화 (inactivation)시켰다. 인간 VL 유전자 단편은 pCMTG-SP112로부터 PCR 증폭방법(VLκaSal 5-GGGGTCGACA TGGACATCCAGATGACCCAGTCTCC-3′ (서열번호: 9) 및 JκSac 5′-GGGCGGCGGATAC GTTTGATHTCCASYTTGGTCCC-3′ (서열번호: 10)) (Degeneracy codons: H = A/C/T, S = G /C, Y = C/T))을 이용하여 94℃ 1분, 55℃ 1분, 72℃ 1분에서 35 사이클, 및 72℃에서 10분의 조건으로 증폭하였다. 획득한 PCR 결과물들을 Sac I과 Sac II으로 제한효소 처리를 하고, 상기의 벡터 DNA와 PCR 결과물을 혼합한 후 T4 DNA 라이게이즈를 넣고 4℃에서 O/N 반응시켰다. 이 반응액을 TG1 형질전환용 세포에 2.5 kV, 25 ㎌, 200 Ω의 조건으로 Gene-pulser Ⅱ를 이용하여 형질전환하였다. 그 후 1 ㎖의 LB 배지를 첨가하여 37℃에서 1 시간동안 배양한 후 항생제 선별을 위해 LB/A 아가 플레이트에 도말하고 37℃ 인큐베이터에서 O/N 배양하였다.
상기 배양한 세포로부터 플라스미드를 분리정제하여 pLA-1 플라스미드를 수득하였다.
1.3.2. 듀얼 벡터 시스템 - II (DVS-II) (pHf1g3A-2 파지미드와 pLT-2 플라스미드의 조합)
1.3.2.1 pHf1g3A-2 파지미드 벡터의 제조
본 벡터는 1.3.1.2에서 제작된 pLA-1 벡터로부터 제조하였다. pLA-1 벡터를 Xho I과 Sal I으로 제한효소 처리를 하여 인간 경쇄 항체 유전자 부분을 잘라낸 후, 4.3 kb의 유전자 단편을 획득하였다. 이 유전자를 1% 아가로스 겔을 이용하여 분리하였고, Wizard DNA 정제 키트를 이용하여 정제한 후 CIP 처리를 수행하였다. Fd(VH+CH1) + ΔgIII + f1 ori을 포함하는 DNA 단편을 pCMTG-SP112로부터 PCR 방법 (센스 프라이머:5'-GGGCTGCAGACGCGGCCTTTTTACGGTGGTTCCT-3' (서열번호: 11) 및 안티-센스 프라이머: 5'-GGGCAATTGCCGCGCACATTTCCCCGAAAAG-3' (서열번호: 12))으로 94℃ 1분, 55℃ 1분, 72℃ 1분에서 35 사이클, 및 72℃에서 10분의 조건으로 증폭하였다. 획득된 PCR 결과물을 Xho I과 Sal I으로 제한효소 처리를 하고, 상기의 벡터 DNA와 1:2 몰비(molar ratio)로 혼합한 후, T4 DNA 라이게이즈 (입수처: Takara)를 넣고 4℃에서 O/N 반응시켰다. 이 반응액을 TG1 형질전환용 세포에 2.5 kV, 25 ㎌, 200 Ω의 조건으로 Gene-pulser Ⅱ를 이용하여 형질전환 하였다. 그 후 1 ㎖의 LB 배지를 첨가하여 37 ℃에서 1 시간 동안 배양한 후 항생제 선별을 위해 LB/A 아가 플레이트를 이용하여 항생제 선별을 하였다.
상기 항생제 선별된 세포를 배양하고 이로부터 파지미드를 분리정제하여 pHf1g3A-2 파지미드를 수득하였다.
한편 바이오-패닝(bio-panning) 실험의 음성 대조군으로 사용하기 위해 pHf1g3A-2에 존재하는 PDC-E2 특이적인 SP112의 Fd(VH+CH1) 유전자를 BCKD-E2 (branched-chain alpha-keto acid dehydrogenase complex-E2)에 특이적인 항체의 Fd(VH+CH1) 유전자 (입수처: IG Therapy Co.)로 대체하여 pHf1g3A-2-BCKD 벡터를 따로 제조하였다.
1.3.2.2 pLT-2 플라스미드 벡터의 제조
본 벡터는 pBR322을 이용하여 제조하였다. pBR322 플라스미드 벡터(Dr. M. Eric Gershwin, University of California 제공)를 Pst I과 EcoR I으로 제한효소 처리를 하여 3.6 kb의 유전자 단편을 1% 아가로스 겔로부터 분리하였고, Wizard DNA 정제 키트를 이용하여 정제하였으며 CIP 처리를 수행하였다. Plac + SP112 경쇄 유전자가 포함된 DNA 단편을 pCMTG-SP112로부터 PCR 방법 (센스 프라이머: 5'-GGGATCGATTCAATTGTCTGATTCGTT ACCAA-3' (서열번호: 13) 및 안티-센스 프라이머: 5'-GGGACTAGTTCAGTGGAACGAAAACTC ACG-3' (서열번호: 14))에 의하여 94℃ 1분, 55℃ 1분, 72℃ 1분에서 35 사이클, 및 72℃에서 10분의 조건으로 증폭하였다. 획득한 PCR 결과물을 Pst I과 Mun I으로 제한효소 처리를 하고, 준비된 상기의 pBR322 벡터와 1:2 몰비(molar ratio)로 혼합한 후, T4 DNA 라이게이즈를 넣고 4℃에서 O/N 반응시켰다. 이 반응액을 TG1 형질전환용 세포에 2.5 kV, 25 ㎌, 200 Ω의 조건으로 Gene-pulser Ⅱ를 이용하여 형질전환 하였다. 그 후 1 ㎖의 LB 배지를 첨가하여 37 ℃에서 1시간 동안 배양한 후 항생제 선별을 위해 LB/T 아가 플레이트를 이용하여 항생제 선별을 하였다.
상기 항생제 선별된 세포를 배양하고 이로부터 플라스미드를 분리정제하여 pLT-2 플라스미드를 수득하였다.
실시예 2: E. coli 의 형질전환
2.1 듀얼 벡터 시스템-I (DVS-I)의 형질전환 실험
신선한 TG1 대장균을 LB 배양액에서 배양한 후 J2-MC 원심분리기 (제조사: Beckman)를 이용하여 4000 X g에서 15분 동안 원심분리하였다. 상등액을 제거하고 10% 글리세롤 (입수처: Duchefa)이 포함된 멸균 증류수를 이용하여 TG1 세포를 세척하였다. 이런 과정을 3번 반복하여 형질전환용 세포주를 제조한 후 100 ng의 pLA-1 또는 pHf1g3T-1 벡터로 2.5 kV, 2 ㎌, 200 Ω의 조건에서 Gene-pulser Ⅱ를 이용하여 TG1 세포를 형질전환 하였다. 그 후 TG1 세포를 각각 LB/A와 LB/T 플레이트에 도말하여 37℃에서 배양하였다. 생성된 대장균 콜로니로부터 pLA-1이 들어있는 세포와 pHf1g3T-1이 들어있는 세포를 선별한 후 각각 2% 글루코스 (입수처: Duchfa)가 들어있는 LB/A (LB/AG) 또는 LB/T (LB/TG) 배양액에 OD 600 = 0.5가 되도록 배양하였다. 각각의 배양된 세포를 J2-MC 원심분리기 (제조사: Beckman)를 이용하여 4000 X g에서 15분 동안 원심분리한 후 상등액을 제거하고 10% 글리세롤이 포함된 멸균 증류수를 이용하여 세척하였다. 이런 과정을 3번 반복하여 pLA-1 혹은 pHf1g3T-1이 들어있는 형질전환용 TG1 세포를 제조하였다. 그 후, pLA-1이 포함되어 있는 형질전환용 TG1 세포주에는 100 ng의 pHf1g3T-1을 전기천공하여 형질전환 하였고, pHf1g3T-1이 포함되어 있는 형질전환용 TG1 세포주에는 100 ng의 pLA-1을 전기천공하여 형질전환 하였다. 형질전환이 끝난 세포들은 항생제 선별을 위하여 암피실린과 테트라사이클린이 모두 함유되어 있는 LB/AT 플레이트에서 37℃ O/N 배양하였다. 배양 후 각각의 생성된 콜로니의 개수를 측정하여 CFU (colony forming unit)를 결정하여 도 3A에 나타내었다.
도 3A로부터, pHf1g3T-1 파지미드가 들어있는 TG1 세포를 pLA-1 플라스미드를 이용해 형질전환 할 경우(DVS-I-A) 약 9 X 108 CFU/㎍ DNA를 획득하였지만, TG1 숙주세포로 도입되는 벡터의 순서를 바꿀 경우(DVS-I-B) 숙주세포의 형질전환 효율이 약 45배 정도 감소하였으며, 이로부터 숙주세포로 도입되는 벡터의 순서에 따라 숙주세포의 형질전환 효율에 많은 차이가 발생함을 확인할 수 있다.
2.2. 듀얼 벡터 시스템 - II (DVS-II)의 형질전환
100 ng의 pLT-2또는 pHf1g3A-2 벡터를 이용하여 TG1 세포주를 2.5 kV, 25 ㎌, 200 Ω의 조건으로 Gene-pulser Ⅱ를 사용하여 형질전환 하였다. 형질전환 후, 각각 LB/T 와 LB/A 플레이트에 도말하여 37℃에서 배양함으로서 생성된 대장균 콜로니로부터 pLT-2 또는 pHf1g3A-2가 들어있는 세포를 선별한 후 각각 2% 글루코스가 들어있는 LB/TG 또는 LB/AG 배양액에 OD 600 = 0.5가 되도록 배양하였다. 각각의 배양된 세포를 J2-MC 원심분리기를 이용하여 4000 X g에서 15분 동안 원심분리 하였다. 상등액을 제거하고 10% 글리세롤이 포함된 멸균 증류수를 이용하여 세척하였으며, 이런 과정을 3번 반복하여 pLT-2 또는 pHf1g3A-2가 삽입되어 있는 형질전환용 TG1 세포주를 제조하였다. 그 후 pLT-2가 포함되어 있는 형질전환용 TG1 세포주는 100 ng의 pHf1g3A-2를 사용하여 형질전환 하였고, pHf1g3A-2가 포함되어 있는 형질전환용 TG1 세포주는 100 ng의 pLT-2를 사용하여 형질전환 하였다. 형질전환이 끝난 세포들은 항생제 선별을 위하여 LB/AT 플레이트에서 37℃ O/N 배양하 였다. 배양 후, 각각의 생성된 콜로니의 개수를 측정하여 CFU를 결정하여 도 3B에 나타내었다.
도 3B로부터, ampR과 tetR의 표현형을 나타내는 TG1 세포의 숫자가 DVS-II-A와 DVS-II-B에서 각각 7.8 X 108 CFU/㎍ DNA 및 6.7 X 108 CFU/㎍ DNA로 거의 비슷한 수준으로 나타났음을 확인할 수 있으며, 이로부터 DVS-II에서는 pHf1g3A-2와 pLT-2 벡터의 도입 순서 차이에 의한 숙주세포의 형질전환 효율이 거의 영향을 받지 않는 것으로 확인되어 DVS-II가 DVS-I에 비해 벡터의 안정성이 높음을 알 수 있었다.
실시예 3: 수용성 Fab 분자에 대한 ELISA 분석
수용성 Fab 분자의 준비를 위해 pCMTG-SP112, DVS-I 혹은 DVS-II가 삽입된 TG1 세포를 다음과 같은 조건에서 배양하였다. pCMTG-SP112는 10 ㎖의 LB/AG 배양액을 사용하였고, DVS-I 및 DVS-II는 10 ㎖의 LB/ATG 배양액을 사용하여 대략 OD600 = 0.5 정도까지 배양했다. 각각의 배양액을 3300 X g에서 10분 동안 원심분리 한 후 상등액을 제거하였다. 그 후 pCMTG-SP112는 0.1 mM IPTG (isopropyl-β-D-1-thiogalactopyranisid)가 첨가된 LB/A 배양액(LB/AI)에, DVS-I 및 DVS-II는 0.1 mM IPTG와 0.02% 아라비노스 (arabinose)가 함유된 LB/A 배양액(LB/ATIA)을 이용하여 재현탁한 후, 27℃에서 15시간 배양하였으며 배양액을 원심분리하여 수용성 Fab가 들어있는 상등액을 획득하였다. Maxi-sorp 면역 플레이트 (입수처: Nunc, Denmark)에 10 ㎍/㎖의 PDC-E2, 글루타치온-s-트랜스포레이즈(GST), 인간 인터루킨 -15 (IL-15), 및 소 혈청 알부민(BSA)을 코팅 완충액(0.1 M NaHCO3, pH 9.6)에 각각 희석하여 웰 (well) 당 50 ㎕씩 첨가한 후 4℃ O/N으로 흡착시켰다. 0.1% Tween이 함유된 인산완충식염수(PBS-Tween)로 플레이트를 3번 씻어준 후, 200 ㎕의 블로킹 (blocking) 완충액(PBS에 3% skimmed milk 함유)을 넣고 37℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 다시 PBS-Tween으로 3번 씻어준 다음, 획득한 수용성 Fab 상등액 50 ㎕를 각각의 웰에 첨가해주고 37℃에서 1시간 동안 반응시켰다. PBS-Tween으로 3회 세척 후, 1:5000으로 블로킹 완충액에 희석된 염소 항-인간 카파 L쇄 항체-HRPO 컨쥬게이션된 pAb (입수처: Sigma)를 플레이트에 넣은 후 각각의 수용성 Fab 항체가 PDC-E2에 대하여 특이적인 반응성을 갖는지 확인하였다. 결합 반응은 3.3',5.5'-테트라메틸 벤지딘(TMB) 기질을 이용하여 확인하였고, 450nm의 흡광도에서 ELISA 리더 (제조사: Boirad)를 이용하여 측정하였다. 그 결과를 도 4에 나타내었다.
도 4로부터, DVS-I은 pCMTG- SP112와 비교하였을 때 항원 결합 활성을 나타내는 SP112 Fab 분자를 약 5배 이상 적은 수준으로 생산하였고, 이에 반해 DVS-II는 pCMTG-SP112에 비하여 SP112 Fab 항체 생산량의 차이가 거의 유사하며 DVS-I보다 약 4배 정도 더 많은 양의 항원 결합 활성을 가진 Fab 항체를 생산함을 알 수 있었다. 또한, 상기 세 가지의 TG1 세포 배양액에 존재하는 Fab는 음성 대조군 항원(IL-15, GST 및 BSA)과는 결합하지 않았다.
한편, 파지 (phage) ELISA는 상기와 동일하게 수행하였으며 이 때 파지 상등 액 (5 X 107 PFU/well)을 50 ㎕ 첨가해주고 37℃에서 1시간동안 반응시켰다. PBS-Tween 세척 후, 1:5000으로 블로킹 완충액에 희석된 염소 항-M13 HRPO 컨쥬게이션된 pAb (입수처: Sigma)를 넣은 후 파지가 PDC-E2에 대하여 특이적인 반응성을 갖는지 확인하고, 그 결과를 도 7에 나타내었다.
도 7에서 확인할 수 있는 바와 같이, pCMTG-SP112, DVS-I 또는 DVS-II에 의해 생산된 모든 재조합 파지들이 PDC-E2에 대하여 특이적인 결합 활성을 나타냈고, 음성 대조군 항원(IL-15, GST, BSA)에 대해서는 반응하지 않았다.
실시예 4: 웨스턴 블롯 분석법(Western blot assay)을 통한 Fab 단편의 발현양 비교
재조합 벡터 (pCMTG-SP112, DVS-I 및 DVS-II)가 들어있는 TG1 세포를 상기 실시예 3에서 언급한 바와 같이 IPTG와 아라비노스가 포함된 배양액에 배양한 후, 원심분리를 통하여 세포 침전물을 획득하였다. 획득한 침전물을 SDS-샘플 완충액과 1:1로 재현탁한 후 5분간 끓는 물에서 중탕 시키고 12% SDS-PAGE 실험을 수행하였다. 그 후 SDS-PAGE에 있는 단백질을 레디 겔 프리캐스트 겔 시스템(Ready gel precast gel system, 입수처: Biorad)을 이용하여 니트로셀룰로스 멤브레인 (입수처: Amersham pharmacia biotech)으로 65 V에서 90분간 전달시켰다. 단백질이 옮겨진 멤브레인을 블로킹 완충액으로 상온에서 1시간동안 반응시키고, PBS-Tween으로 각각 5분간 3번 씻어준 후, 융합된 Fd-ΔpIII의 검출을 위하여 블로킹 완충액에 1:3000으로 희석된 마우스 항-myc mAb (입수처: IG Therapy Co.)를 멤브레인과 상 온에서 1시간 반응시켰다. 다시 멤브레인을 각각 5분간 3번 PBS-Tween으로 씻어준 후, 블로킹 완충액에 1:5000으로 희석된 염소 항-마우스 IgG AP 컨쥬게이션된 pAb (입수처: Sigma)를 1시간 동안 반응시켰다. 한편 인간 경쇄 절편의 검출을 위해서는 염소 항-인간 카파 L쇄 AP 컨쥬게이션된 pAb (입수처: Sigma)를 사용하였다. 니트로 블루 테트라졸리움 클로라이드(NBT)/5-브로모-4-클로로-3-인돌리포스페이트(BCIP) 기질 (입수처: Sigma)을 기질로 사용하였으며, 멤브레인 상에 나타나는 신호를 농도계 (densitometer) (제조사: Biorad)를 이용하여 분석하고 그 결과를 도 5에 나타내었다.
도 5에서 확인할 수 있는 바와 같이, Fd-ΔpIII 분자의 경우 TG1 숙주 세포 내에서 DVS-I가 pCMTG-SP112와 DVS-II에 비해 약 3-4배 정도 많은 양을 생산하였으며 반대로 인간 경쇄 절편의 발현량은 오히려 pCMTG-SP112와 DVS-II에 비해 약 6-10배 정도 저하되었다. 따라서 항원 결합 능력을 지닌 Fab는 같은 분자수의 Fd와 경쇄 절편의 조합에 의해 최적으로 생성됨으로 DVS-I에서 보여지는 낮은 항원 결합 활성 Fab 분자의 생산량은 Fab 분자를 구성하는 항체 절편들의 불균형적인 발현에 기인한 것이라고 추정된다.
실시예 5: 재조합 파지의 증폭
재조합 파지의 증폭은 선행기술 (참고문헌: McCafferty, J. 1996. Phage display: factors affecting panning efficiency. In: Kay, B.K., Winter, J., McCafferty, J. (Eds.), Phage Display of Peptides and Proteins, a Laboratory Manual. Academic Press, San Diego, p. 261; Baek, H., Suk, K.H., Kim, Y.H., Cha, S. 2002. An improved helper phage system for efficient isolation of specific antibody molecules in phage display. Nucleic Acids Res. 30(5), e18)에서 보고된 바를 참고로 하여 일부 수정된 방법으로 다음과 같이 재조합 파지를 획득하였다. 간략하게 설명하면, 먼저 재조합 벡터 (pCMTG-SP112, DVS-I 혹은 DVS-II)가 들어있는 각각의 TG1 세포를 각각 배양하였다. pCMTG-SP112는 10 ㎖의 LB/AG 배양액에 배양을 하고, DVS-I 및 DVS-II는 10 ㎖의 LB/ATG 배양액에 대략 OD600 = 0.5 정도까지 배양했다. 각각의 배양액을 3300 X g에서 10분 동안 원심분리 후, 10 ㎖의 LB/G 배양액으로 재현탁하였다. 현탁액에 M13K07 또는 Ex-12 핼퍼 파지를 20 MOI (multiplicity of infection)가 되도록 첨가한 후, 37℃에서 1시간 동안 배양하였다. 세포주와 핼퍼 파지의 혼합액을 다시 3300 X g에서 10분 동안 원심분리한 후 상등액을 제거하여 세포를 수획하였다. 그 후 pCMTG-SP112는 100 ㎖의 LB/AK (100 ㎍의 암피실린 및 50 ㎍의 카나마이신 함유)배양액으로, DVS-I 및 DVS-II는 100 ㎖의 LB/ATKA (100 ㎍의 암피실린, 10 ㎍의 테트라사이클린, 50 ㎍의 카나마이신 및 0.001%의 아라비노스)배양액으로 재현탁한 후, 27℃에서 15시간 동안 배양하였다. 배양액을 3300 X g에서 20분 동안 원심분리한 후 재조합 파지가 존재하는 상등액을 획득하였다. PEG/NaCl 용액을 이용하여 파지입자를 침전시킨 후, 1 ㎖의 멸균 PBS로 재현탁하여 농축된 파지를 획득하였다.
파지 역가는 다음과 같은 PFU (plaque forming unit) 분석법에 의해 측정하였다. TG1 세포를 LB 배양액에 OD600 = 0.8 정도가 되도록 배양하였고, 배양액 100 ㎕에 획득한 파지 농축액 1 ㎕를 첨가하여 섞어준 후, TG1 세포 배양액을 사용하여 10-2, 10-4, 10-6, 10-8으로 100배씩 희석해주었다. 37℃에서 30분 동안 반응시킨 후 4 ㎖의 탑 아가(top agar)와 섞어주어 LB 플레이트에 평평하게 부어주었다. 10분 동안 상온에서 방치한 플레이트를 37℃에서 15시간 동안 배양하였으며, 플레이트에 생성된 플라크를 측정하여 획득한 파지의 역가를 계산하고, 그 결과를 도 6에 나타내었다.
도 6에서 확인할 수 있듯이, Ex12 핼퍼 파지를 파지 레스큐(phage rescue)에 사용할 경우 DVS-II가 가장 높은 파지 역가(약 7 X 1010 PFU/㎖)를 나타냈으며 pCMTG-SP112와 DVS-I이 각각 5 X 1010 PFU/㎖ 및 2 X 1010 PFU/㎖ 정도의 파지를 생산하여 DVS-II에서 가장 좋은 재조합 파지 생산성을 보였다. M13K07 핼퍼 파지의 경우 pCMTG-SP112와 DVS-II에서 거의 비슷한 약 2 X 1011 PFU/㎖의 파지 역가를 보였으며, 이에 반해 DVS-I은 약 1010 PFU/㎖의 파지 역가를 보임으로서 pCMTG-SP112 및 DVS-II와 비교하여 Ex12 핼퍼 파지를 사용하였을 때는 2-3배의 낮은 생산량을 보였고 M13K07을 사용하였을 때는 20배의 낮은 재조합 파지 생산량을 보였다.
또한, 바이오-패닝을 위한 재조합 파지의 생산은 상기에서와 같은 방법으로 수행되었으며 다른 점은 DVS-II가 삽입된 TG1 세포를 DVS-II-BCKD (pLT-2와 pHf1g3A-2-BCKD)가 들어있는 TG1 세포로 1:104, 1:106 혹은 1:108의 비율로 희석한 균주를 사용하였으며, 핼퍼 파지로는 Ex-12 핼퍼 파지를 사용하였다.
실시예 6: 바이오-패닝 (Bio-panning)
PDC-E2에 결합하는 재조합 파지의 선별을 도 8의 도식도에 도시된 대로 패닝(panning) 방법으로 수행하였다 (참고문헌: Baek, H., Suk, K.H., Kim, Y.H., Cha, S. 2002. An improved helper phage system for efficient isolation of specific antibody molecules in phage display. Nucleic Acids Res. 30(5), e18). 우선 Maxi-sorp 면역플레이트에 10 ㎍/㎖의 PDC-E2 항원을 코팅 완충액을 이용하여 4℃ O/N으로 반응시켰다. 그 후, 플레이트를 PBS-Tween으로 3번 씻어준 후, 200 ㎕의 블로킹 완충액을 넣고 37℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 양성 대조군인 DVS-II와 음성 대조군인 DVS-II-BCKD가 각각 삽입되어 있는 TG1 세포주가 각각 1:104, 1:106 혹은 1:108의 비율로 혼합 배양된 시료로부터 획득된 재조합 파지를 24개의 마이크로웰에 총 1.2 X 109 (5 X 107/well)의 농도로 넣어준 후, 37℃에서 2시간동안 반응시켰다. PBS-Tween으로 10회 세척한 후 마이크로웰 당 50 ㎕의 용출 완충액(0.1 M 글라이신-HCl, pH 2.5)을 넣어주어 10분 동안 반응시킴으로서 플레이트로부터 파지를 용출하였다. 획득한 파지는 신선한 TG1 세포에 1시간 동안 감염시켜 주었고, LB/T 플레이트에 도말하여 27℃에서 밤새 배양하였다. LB/T 플레이트 위에 자란 대장균 콜로니를 멸균된 유리막대를 사용하여 획득하고 이 대장균들로부터 Wizard 플라스미드 정제 키트를 이용하여 pHf1g3A-2 파지미드 DNA를 분리 정제 하였다. 이 파지미드 DNA 100 ng을 pLT-2가 이미 삽입되어 있는 TG1 세포에 전기 천 공으로 도입 시킨 후 LB/AT 플레이트에 도말하여 선별하고, 선별된 세포주로부터 Ex12 핼퍼 파지를 이용하여 재조합 파지를 다시 증폭시켰다. 이렇게 증폭된 재조합 파지를 상기의 패닝에 다시 사용하였으며 이러한 실험을 총 4번 반복 진행하였다. 각각의 단계에서 획득한 재조합 파지와 대장균 클론들의 PDC-E2와의 결합 반응도를 ELISA 방법을 통하여 측정하고 그 결과를 도 9에 나타내었다.
도 9로부터, 음성 대조군인 DVS-II-BCKD가 DVS-II보다 104 많은 조건하에서는 1차 패닝부터 PDC-E2-특이적 선별이 진행되고 있으며, 106 많은 조건하에서는 2차 패닝부터 PDC-E2-특이적 선별이 진행되고 있음이 확인되었다. 그러나 음성 대조군인 DVS-II-BCKD가 DVS-II보다 108 많은 조건하에서는 4차 패닝까지 진행하더라도 재조합 파지의 PDC-E2-특이적 선별이 진행되지 않았다. 한편 파지 ELISA에서 보여지는 재조합 파지의 PDC-E2-특이적 선별을 클론 수준에서 확인하기 위하여 각 회의 패닝이 진행된 후에 얻어진 재조합 파지로부터 파지미드 게놈을 분리하여 pLT-2를 지니고 있는 TG1 세포에 삽입하고 이렇게 얻어진 대장균 콜로니 중 24개의 대장균 콜로니를 무작위로 배양한 후, 배양액으로 ELISA를 수행하여 각각의 대장균 클론이 PDC-E2-특이적인 Fab 항체를 생산하는지 조사하여 하기 표 2에 나타내었다.
표 2. 각 패닝 라운드 이후에, 항 PDC- E2 Fab 분자를 분비하는 대장균 클론의 빈도
투입율
(양성/음성)		 항-PDC-E2 클론a의 산출률
1st 라운드 2nd 라운드 3rd 라운드 4th 라운드
1 : 104 4/24 24/24 24/24 24/24
1 : 106 0/24 4/24 21/24 24/24
1 : 108 0/24 0/24 0/24 0/24
음성 대조군 0/24 0/24 0/24 0/24
a 항원 결합 ELISA를 위하여 24개의 클론을 무작위로 추출하였다. 본 표에서는 (양성 클론의 수)/24개 클론의 비율을 나타내었다.
상기 표 2로부터, 음성 대조군인 DVS-II-BCKD가 DVS-II보다 104 많은 조건하에서는 2차 패닝 후에 얻어진 24개의 모든 클론이 PDC-E2-특이적인 Fab 항체를 생산하며, 106 많은 조건하에서는 약 4차 패닝 후 모든 클론이 PDC-E2-특이적인 Fab 항체를 생산함이 확인되었다. 이는 도 9의 파지 ELISA와 일치하는 결과이며 1회의 패닝으로 항원-특이적인 재조합 파지의 선별이 약 100배씩 진행됨을 증명해 준다.
요약하면, DVS-I과 비교하여 DVS-II가 숙주세포의 형질전환 효율이 숙주세포내로 도입되는 벡터의 순서에 관계없이 안정적인 것으로 확인되었으며, 또한 DVS-II를 사용할 경우 항원 결합 반응력을 지닌 수용성 Fab 분자의 발현 양, 유전자 재조합 파지의 역가 및 파지후손의 표면에 디스플레이 되는 Fab-ΔpIII의 양이 기존의 단일 파지미드 벡터를 사용한 파지 디스플레이 시스템과 유사하였고, 또한 패닝 (panning) 방법을 사용하여 표적-특이적 Fab-ΔpIII 분자를 디스플레이하는 재조합 파지를 성공적으로 선별할 수 있어, 항원-특이적 Fd 유전자를 pHf1g3A-2 파지미드 로부터 분리해 낼 수 있었다.
DVS-II 기술은 높은 다양성을 갖는 조합 파지 디스플레이 Fab 라이브러리의 제조에 매우 유용한 도구로 사용될 수 있으며, 더 나아가 항체의 항원-항체 결합 반응에 있어서 경쇄의 유연성을 염두에 둔다면 패닝 방법을 통해 원하는 항체 클론의 선별에 실용적으로 사용될 수 있고, 적어도 설치류 기원의 단일 클론 항체를 안내 선별(guided-selection)이나 쇄 셔플링(chain shuffling) 방법으로 조작하여 인간화 항체를 제조하는데 매우 유용하게 활용될 수 있을 것이다.
DVS-II는 벡터 안정성, 수용성 Fab 분자의 발현량, 생산된 재조합 파지의 역가, 파지 표면에 디스플레이되는 항체 분자의 양 및 항원-특이적인 항체를 디스플레이하는 재조합 파지의 선별 기능 등 모든 부분에서 단일 파지미드 벡터를 사용하는 기존의 파지 디스플레이 시스템과 필적하다고 할 수 있다.
항체 라이브러리의 유용성은 항체 라이브러리를 구성하는 클론의 숫자와 직접적으로 연관되어 있으며, 따라서 라이브러리 내에 많은 수의 클론이 존재할수록 그 라이브러리의 항원 결합 특이성이 증가한다고 추정할 수 있고 이는 더 나아가 특정 항원과 고친화도로 결합하는 유용 항체를 획득할 수 있는 가능성이 증가한다고 할 수 있는데, 이런 면에서 DVS-II는 조합 Fab 항체 라이브러리의 제조에 매우 유용하게 사용될 수 있다.
또한, 기존의 단일 벡터 시스템에서는 중쇄 절편과 경쇄 절편이 모두 하나의 벡터에 의해 발현되어야 한다는 점을 감안하였을 때, 본 발명의 듀얼 벡터 시스템은 독립적인 두 가지 벡터로 구성되어 있으므로 차후 조합 Fab 항체 라이브러리 제 조에 있어서 항체 클로닝 과정에 사용되는 제한효소 등으로 인해 항체 유전자의 다양성이 저해되는 것을 최대한 방지할 수 있다는 장점도 있다.
더불어 DVS-II는 특정 단일 클론 경쇄 유전자와 쌍을 이루는 표적분자-특이적인 중쇄 유전자의 선별할 수 있으며, 설치류 기원의 단일 클론 항체 유전자를 인간 기원 항체 유전자로 전환 시키는 데 사용되는 쇄 셔플링(chain shuffling) 혹은 안내 선별(guided-selection) 기술 등에 곧 바로 사용될 수 있고, 이 때 DVS-II의 가장 큰 장점은 단 한번만 우수한 중쇄 유전자 라이브러리를 pHf1g3A-2 파지미드에 제조하면 원하는 모든 설치류 기원의 경쇄 유전자와 결합하여 특정 항원 결합 특이성을 나타내는 인간 중쇄 유전자 확보에 이 라이브러리를 사용할 수 있다는 것이다.
결론적으로 DVS-II는 파지의 오염에 따른 실험적인 어려움과 재조합 파지 표면에 디스플레이 되는 항체 농도의 감소 없이 기존의 원 파지미드 벡터 보다 쉽게 높은 다양성을 갖는 항체 라이브러리 제조을 할 수 있는 매우 실용적인 기술이며, 또한 다양한 생쥐 항체 유전자로부터 인간화된 항체 유전자를 선별할 수 있는 키트의 개발 가능성을 보유하고 있으므로 항체 신약 개발 분야에 매우 유용하게 활용될 수 있다.
도 1에서는 본 발명에서 제조된 벡터의 개요도를 나타내고 있다. A에서는 듀얼 벡터 시스템-I (DVS-I)이 pLA-1 플라즈미드 및 pHf1g3T-1 파즈미드의 조합을 이용하고 있고, B에서는 듀얼 벡터 시스템-II (DVS-II)가 pLT-2 플라즈미드 및 pHf1g3A-2 파즈미드 조합을 이용하고 있음을 나타낸다.
도 2에서는 DVS-I (DVS-I-A 및 DVS-I-B) 또는 DVS-II (DVS-II-B 또는 DVS-II-B)에서 TG1 형질전환용 숙주 세포를 형질전환 시키는 상이한 4가지 전략을 보여주고 있다.
도 3에서는 듀얼 벡터 시스템에서 상이한 형질전환 전략에 의해 제조된 E.coli군락의 수의 비교를 나타낸다. 군락 형성 단위 (CFU)를 도 2에 따라서 세포로 2차 형질전환한 후에 ampR 및 tetR 표현형을 나타내는 대장균 (E. coli) 군락 수로부터 측정하였다. 신선한 TG1 세포로 도입된 벡터의 순서는 다음과 같다: (A) DVS-I는 DVS-I-A (pHf1g3T-1 → pLA-1) 및 DVS-I-B (pLA-1 → pHf1g3T-1)의 순서이고, (B) DVS-II는 DVS-II-A (pLT-2 → pHf1g3A-2) 및 DVS-II-B (pHf1g3A-2 → pLT-2)의 순서이다. 데이터는 3번 실험의 평균 ± 표준 편차를 나타낸다.
도 4는 pCMTG-SP112, DVS-I 및 DVS-II을 운반하는 TG1 세포에 의해서 생산된 수용성 SP112 분자의 항원 결합 특이성을 나타낸다. PDC-E2 및 GST, IL-15, BSA을 포함하는 다른 음성 대조군 항원을 미세역가 플레이트에 코팅시켰다. 상등액을 pCMTG-SP112, DVS-I 및 DVS-II을 가지고 있는 TG1 세포의 배양액으로부터 수취하 고, ELISA에 적용시켰다. HRPO가 컨쥬게이션된 염소 항-인간 카파 경쇄 항체를 2차 항체로 사용하였다. 결합 신호를 TMB 기질로 시각화시키고 OD450nm에서 분석하였다. 데어터는 3번 실험의 평균 ± 표준 편차를 나타낸다.
도 5는 상이한 벡터 구성을 가지는 TG1 숙주 세포에서 Fd-ΔpIII 및 카파 경쇄의 발현을 결정하는 웨스턴 블롯 분석을 나타낸다. SP112, DVS-I 및 DVS-II을 0.1 mM IPTG 및 0.02% 아라비노오스의 존재하에서 배양하였다. 전세포 용해물을 동일한 농도를 얻기 위하여 사전에 배양한 세포로부터 수득하고, 12% SDS-PAGE의 각 웰에 로딩시켰다. Fd-ΔpIII 융합물은 마우스 항-Myc 꼬리 mAb 및 AP로 컨쥬게이션된 염소 항-마우스 IgG를 사용하고(A), 카파 경쇄 절편은 AP로 컨쥬게이션된 염소 항-인간 카파 경쇄 항체 (B)을 사용하였다. NBT/BCIP 기질을 사용하여 시각화하였다. 레인 1은 pCMTG-SP112을 가지고 있는 TG1 세포, 레인 2은 DVS-I을 가지고 있는 TG1 세포이고, 레인 3은 DVS-II을 가지고 있는 TG1 세포이다.
도 6은 상이한 벡터 세트를 가지는 TG1 세포로부터 수득한 파지 후속의 PFU의 측정을 나타낸다.
도 7은 상이한 벡터 세트를 가지는 TG1 세포로부터 수득한 파지 제조물의 항원 특이적 반응성을 나타내는 파지 ELISA를 나타낸다.
도 8은 DVS-II의 친화력 선별을 나타내는 개괄적인 도안을 나타낸다.
도 9는 연속적인 패닝의 라운드이후에 PDC-E2 특이적 풍부성을 결정하는 폴리클로널 파지 ELISA를 나타낸다. 양성 대조군((pHf1g3A-2 및 pLT-2) 및 음성 대 조군((pHf1g3A-2-BCKD 및 pLT-2)을 가지는 TG1 세포를 1:104, 1:106, 1:108의 비율에서 또는 음성 대조군과 혼합시켰다.
도 10은 pBR322 벡터의 개요도를 나타낸 것이다.
도 11은 pCMTG 벡터의 개요도를 나타낸 것이다.
<110> SUNGKYUNKWAN UNIVERSITY Foundation for Corporate Collaboration <120> A vector for expressing antibody fragments and a method for producing recombinant phage that displays antibody fragments by using the vector <130> IPM-34365 <160> 14 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sense primer <400> 1 gggctgcaga cgcggccttt ttacggtggt tcct 34 <210> 2 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Anti-sense primer <400> 2 gggcaattgc cgcgcacatt tccccgaaaa g 31 <210> 3 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sense primer <400> 3 gggatcgatt caattgtctg attcgttacc aa 32 <210> 4 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Anti-sense primer <400> 4 gggactagtt cagtggaacg aaaactcacg 30 <210> 5 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sense primer <400> 5 gggatcgata tagctagctc actcggtcg 29 <210> 6 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Anti-sense primer <400> 6 gggactagtg cactgaaatc tagagcggaa 30 <210> 7 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sense primer <400> 7 gggccatggg atttaggtga cactatagga tctcgatccc gcgaaat 47 <210> 8 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Anti-sense primer <400> 8 gggctcgagt tatcaacact ctcccctgtt gctc 34 <210> 9 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VLkappaaSal <400> 9 ggggtcgaca tggacatcca gatgacccag tctcc 35 <210> 10 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> JkappaSac <220> <221> misc_feature <222> (21) <223> H is A, C or T <220> <221> misc_feature <222> (26) <223> S is G or C <220> <221> misc_feature <222> (27) <223> Y is C or T <400> 10 gggcggcgga tacgtttgat htccasyttg gtccc 35 <210> 11 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sense primer <400> 11 gggctgcaga cgcggccttt ttacggtggt tcct 34 <210> 12 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Anti-sense primer <400> 12 gggcaattgc cgcgcacatt tccccgaaaa g 31 <210> 13 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sense primer <400> 13 gggatcgatt caattgtctg attcgttacc aa 32 <210> 14 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Anti-sense primer <400> 14 gggactagtt cagtggaacg aaaactcacg 30

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  9. (1) pBR322 플라스미드에 인간 항체의 중쇄를 결합시켜서 제 1 벡터를 제조하는 단계;
    (2) pBAD/gIII 플라스미드를 서열번호: 3 및 서열번호: 4로 구성된 프라이머 세트로 PCR 반응을 통해 제 1 DNA 절편을 제조하고, pCDFDuet-1 플라스미드를 서열번호: 5 및 서열번호: 6으로 구성된 프라이머 세트로 PCR 반응시켜서 제 2 DNA 절편을 제조하고; 제 1 DNA절편 및 제 2 DNA 절편을 결합시킨 후; 인간 항체의 경쇄를 결합시켜서 제 2 벡터를 제조하는 단계;
    (3) 상기 단계 (1)의 제 1벡터를 숙주세포로 형질전환시키는 단계; 및
    (4) 상기 단계 (3)의 형질전환된 숙주세포에 추가로 단계 (2)의 제 2 벡터를 형질전환시키는 단계를 포함하는, 듀얼 벡터 시스템-I-A (DVS-I-A)의 형질전환체를 생산하는 방법.
  10. (1) pBR322 플라스미드에 인간 항체의 중쇄를 결합시켜서 제 1 벡터를 제조하는 단계;
    (2) pBAD/gIII 플라스미드를 서열번호: 3 및 서열번호: 4로 구성된 프라이머 세트로 PCR 반응을 통해 제 1 DNA 절편을 제조하고, pCDFDuet-1 플라스미드를 서열번호: 5 및 서열번호: 6으로 구성된 프라이머 세트로 PCR 반응시켜서 제 2 DNA 절편을 제조하고; 제 1 DNA절편 및 제 2 DNA 절편을 결합시킨 후; 인간 항체의 경쇄를 결합시켜서 제 2 벡터를 제조하는 단계;
    (3) 상기 단계 (1)의 제 2벡터를 숙주세포로 형질전환시키는 단계; 및
    (4) 상기 단계 (3)의 형질전환된 숙주세포에 추가로 단계 (2)의 제 1 벡터를 형질전환시키는 단계를 포함하는, 듀얼 벡터 시스템-I-B (DVS-I-B)의 형질전환체를 생산하는 방법.
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  13. 제 9항의 DVS-I-A을 이용하여 인간 Fab 항체 유전자를 발현시키는 방법.
  14. 제 10항의 DVS-I-B를 이용하여 인간 Fab 항체 유전자를 발현시키는 방법.
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