ES2327382T3 - Metodos para presentar (poli)peptidos/proteinas en particulas de bacteriofagos a traves de enlaces disulfuro. - Google Patents

Abstract

Método para presentar un/una (poli)péptido/proteína sobre la superficie de una partícula de bacteriófago que comprende: producir o permitir la unión de dicho/-a (poli)péptido/proteína tras la expresión a un elemento del recubrimiento proteico de dicha partícula de bacteriófago, produciéndose dicha unión por la formación de un enlace disulfuro entre un primer residuo de cisteína comprendido en dicho/-a (poli)péptido/proteína y un segundo residuo de cisteína comprendido en dicho elemento del recubrimiento proteico.

Description

Métodos para presentar (poli)péptidos/proteínas en partículas de bacteriófagos a través de enlaces disulfuro.

La presente invención se refiere a métodos para presentar (poli)péptidos/proteínas en la superficie de partículas de bacteriófago uniendo los/las (poli)péptidos/proteínas a través de enlaces disulfuro.

Smith demostró por primera vez en 1985 que un fago filamentoso tolera fragmentos de proteína extraños insertados en su proteína del gen III (pIII), y pudo demostrar que los fragmentos de proteína se presentan en la superficie del fago (Smith, 1985). Ladner extendió ese concepto a la detección de repertorios de (poli)péptidos y/o proteínas presentadas en la superficie del fago (documento WO 88/06630; documento WO 90/20809) y, desde entonces, la presentación de fago ha experimentado una evolución espectacular y ha dado como resultado unos logros sustanciales.

Se han desarrollado varios formatos para construir y detectar bibliotecas de presentación en fago de (poli)péptidos/proteínas, y un gran número de artículos de revisión y monografías cubren y resumen estos desarrollos (por ejemplo, Kay et al., 1996; Dunn, 1996; McGregor, 1996).

Con mayor frecuencia, se han usado sistemas basados en fagos filamentosos.

Inicialmente propuesta como una presentación de fragmento Fv (FEcs) de cadena simple (documento WO 88/
06630; véase además el documento WO 92/01047), el método se ha expandido rápidamente a la presentación del inhibidor de la tripsina pancreática bovina (BPTI, "bovine pancreatic trypsin inhibitor") (documento WO 90/02809), bibliotecas de péptidos (documento WO 91/19818), hormona del crecimiento humana (documento WO 92/09690), y otras proteínas diversas incluyendo la presentación de proteínas multiméricas tales como fragmentos Fab (documentos WO 91/17271; WO 92/01047).

Para anclar el péptido o la proteína a la superficie del bacteriófago filamentoso, la mayoría de las veces se emplean fusiones a proteínas de recubrimiento de fago. Se prefieren fusiones a proteína del gen III (Parmley y Smith, 1988) o fragmentos de los mismos (Bass et al., 1990), y proteína del gen VIII (Greenwood et al., 1991). En un caso, se ha usado gen VI (Jespers et al., 1995), y recientemente, se ha usado una combinación de gen VII y gen IX para la presentación de fragmentos Fv (Gao et al., 1999).

Adicionalmente, también se ha logrado la presentación de fago en el fago lambda. En ese caso, se han usado la proteína del gen V (Maruyama et al., 1994), proteína del gen J, y proteína del gen D (Sternberg y Hoess, 1995; Mikawa et al., 1996).

Además de usar fusiones genéticas, se han unido proteínas o péptidos extraño a superficies de fago a través de dominios de asociación. En el documento WO 91/17271, se sugirió el uso de una etiqueta presentada sobre un fago y un ligando de unión a la etiqueta fusionado al péptido/proteína que va a presentarse para lograr una presentación no covalente.

Se persiguió un concepto similar para la presentación de bibliotecas de ADNc (Crameri y Suter, 1993). Ahí se uso la interacción jun/fos para mediar la presentación de fragmentos de ADNc. En su constructo, residuos de cisteína adicionales que flanquean ambos extremos de jun, así como de fos, estabilizaron adicionalmente la interacción formando dos enlaces disulfuro.

Como alternativa y además de la presentación en fago de scFv, la presentación de Fv estabilizado mediante enlaces disulfuro (dsFv) en fago mostró una estabilidad mejorada y una mejor unión que permitieron el aislamiento de fragmentos Fv novedosos a partir de bibliotecas de presentación en fago (Brinkmann et al., 1995). Se mostró que los componentes de un dsFv podían secretarse, plegarse y montarse en el periplasma de E. coli para formar un dsFv funcional presentado en un fago y que este fago con dsFv podía unirse específicamente a antígeno y enriquecerse selectivamente a partir de bibliotecas de fagos grandes.

A la hora de detectar bibliotecas de presentación en fago en el cribado biológico ("biopanning") el problema sigue siendo cómo recuperar mejor el fago que se unió a la diana deseada. Normalmente, esto se logra mediante elución con tampones apropiados, bien usando un gradiente de pH o un gradiente de sal, o bien mediante elución usando una diana soluble. Sin embargo, los agentes de unión más interesantes que se unen con gran afinidad a la diana podrían perderse mediante ese enfoque. Se han concebido métodos alternativos que tratan de superar ese problema, o bien proporcionando una señal de escisión entre el/la (poli)péptido/proteína que se está presentando y su componente de fusión, o bien entre la diana de interés y su vehículo que ancla la diana a una superficie sólida.

Adicionalmente, todos los enfoques referidos anteriormente en el presente documento requieren el uso de proteínas de fusión que comprenden al menos parte de una proteína de recubrimiento de fago y un/una (poli)péptido/proteína extraño(-a). Especialmente en el caso de usar gen III como componente para péptidos/proteínas que van a presentarse, esto conduce a varios problemas. En primer lugar, el producto de expresión del gen III es tóxico para la célula huésped, lo cual requiere una estricta regulación de las proteínas de fusión del gen III. En segundo lugar, la expresión de productos del gen III puede hacer a las células huésped resistentes a la infección con fago auxiliar requerida para la producción de partículas de fago progenie. Y finalmente, los acontecimientos de recombinación entre los constructos de fusión del gen III y las copias de tipo natural del gen III conducen a artefactos no deseados. Adicionalmente, dado que hay que usar al menos el dominio C-terminal de la proteína del gen III que comprende aproximadamente 190 aminoácidos con el fin de lograr la incorporación de la proteína de fusión en el recubrimiento de fago, el tamaño de los vectores que comprenden las secuencias de ácido nucleico es bastante mayor, conduciendo a una disminución en la eficacia de la transformación. Sin embargo, la eficacia de la transformación es un factor crucial para la producción de bibliotecas muy grandes. Adicionalmente, para la caracterización de (poli)péptido/proteínas obtenidos tras la selección a partir de una biblioteca de presentación en fago, normalmente, el/la (poli)péptido/proteína vuelven a clonarse en vectores de expresión con el fin de retirar el componente de fusión de la proteína de recubrimiento, o con el fin de crear nuevas proteínas de fusión tal como mediante fusión a enzimas para la detección o a dominios de multimerización. Sería ventajoso tener un sistema que permitiera una expresión directa sin volver a clonar, y un acoplamiento directo del/de la (poli)péptido/proteína a otros restos.

Adicionalmente, la mayoría de estos enfoques (excepto para el trabajo de Jespers et al. (1995), el documento WO 91/17271, y de Crameri y Suter (1993) mencionados anteriormente en el presente documento) se limitan a la presentación de (poli)péptidos/proteínas que tienen un N-terminal libre, dado que los/las (poli)péptidos/proteínas tienen que fusionarse en el C-terminal con una proteína de recubrimiento de fago. Especialmente en el caso de bibliotecas de ADNc, o en el caso de proteínas que requieren un C-terminal libre para ser funcional, sería muy deseable tener un método simple que no requiera la generación de las fusiones en C-terminal.

Por tanto, el problema técnico que subyace a la presente invención es desarrollar un sistema simple, fiable que permita la presentación de (poli)péptidos/proteínas en partículas de fago sin la necesidad de usar proteínas de fusión con proteínas de recubrimiento de fago. Adicionalmente, existe una necesidad de un método que permita recuperar (poli)péptidos/proteínas de unión fuerte de una manera más fiable.

La solución a este problema técnico se logra proporcionando las realizaciones caracterizadas en las reivindicaciones. Por consiguiente, la presente invención permite crear y detectar fácilmente bibliotecas grandes de (poli)péptidos/proteínas presentadas en la superficie de partículas de bacteriófago. El enfoque técnico de la presente invención es la unión de (poli)péptidos/proteínas mediante enlaces disulfuro a la superficie de partículas de fago.

Por tanto, la presente invención se refiere a un método para presentar un/una (poli)péptido/proteína sobre la superficie de una partícula de bacteriófago que comprende:

producir o permitir la unión de dicho/-a (poli)péptido/proteína tras la expresión a un elemento del recubrimiento proteico de dicha partícula de bacteriófago, produciéndose dicha unión por la formación de un enlace disulfuro entre un primer residuo de cisteína comprendido en dicho/-a (poli)péptido/proteína y un segundo residuo de cisteína comprendido en dicho elemento del recubrimiento proteico.

\vskip1.000000\baselineskip

En el contexto de la presente invención, el término "bacteriófago" se refiere a virus bacterianos que forman paquetes que consisten en un recubrimiento proteico que contiene ácido nucleico requerido para la replicación de los fagos. El ácido nucleico puede ser ADN o ARN, bien de cadena doble o simple, lineal o circular. Los bacteriófagos, tal como el fago lambda o un fago filamentoso (tal como M13, fd, o f1), son bien conocidos por el experto en la técnica. En el contexto de la presente invención, el término "partículas de bacteriófago" se refiere a las partículas según la presente invención, es decir, a partículas que presentan un/una (poli)péptido/proteína a través de enlaces disulfuro.

Durante el montaje de los bacteriófagos, las proteínas de recubrimiento pueden empaquetar diferentes secuencias de ácido nucleicos, siempre que comprendan una señal de empaquetamiento. En el contexto de la presente invención, el término "secuencias de ácido nucleico" contenidas en bacteriófagos o partículas de bacteriófago se refiere a secuencias de ácido nucleico o vectores que tienen la capacidad de empaquetarse mediante proteínas de recubrimiento de bacteriófago durante el montaje de bacteriófagos o partículas de bacteriófago. Preferiblemente, dichas secuencias de ácido nucleico o vectores se derivan de genomas de bacteriófago que aparecen en la naturaleza, y comprenden, por ejemplo, en el caso de fago filamentoso, vectores de fago y fagémidos. Los últimos son plásmidos que contienen una señal de empaquetamiento y un origen de replicación de fago además de características de plásmido.

El término "(poli)péptido" se refiere a moléculas que consisten en una o más cadenas de múltiples, es decir, dos o más, aminoácidos unidos mediante enlaces peptídicos.

El término "proteína" se refiere a (poli)péptidos en los que al menos parte del (poli)péptido tiene o puede adquirir una disposición tridimensional definida formando estructuras secundarias, terciarias, o cuaternarias, dentro y/o entre sus cadena(s) (poli)peptídica(s). Esta definición comprende proteínas tales como proteínas que aparecen en la naturaleza o proteínas al menos parcialmente artificiales, así como fragmentos o dominios de proteínas enteras, siempre que estos fragmentos o dominios puedan adquirir una disposición tridimensional definida tal como se describió anteriormente.

Ejemplos de (poli)péptidos/proteínas que consisten en una cadena son fragmentos de anticuerpo Fv de cadena simple, y ejemplos para (poli)péptidos/proteínas que consisten en más cadenas son fragmentos de anticuerpo
Fab.

Cuando el primer residuo de cisteína se sitúa en el C-terminal del/de la (poli)péptido/proteína, el formato de
presentación corresponde a la situación de presentación convencional fusionándose el C-terminal genéticamente al elemento de la proteína de recubrimiento de fago. Sin embargo, usando el N-terminal del/de la (poli)péptido/proteína, el formato de presentación puede revertirse como en el sistema pJuFO de Crameri y Suter referido anterior-
mente.

El término "superficie de una partícula de bacteriófago" se refiere a la parte de una partícula de bacteriófago que está en contacto con el medio en el que está contenida la partícula y que es accesible. La superficie se determina por las proteínas que forman parte del recubrimiento de fago (los elementos del recubrimiento proteico de la partícula) que se monta durante la producción de fago en células huésped apropiadas.

El término "tras la expresión" se refiere a la situación en la que el ácido nucleico que codifica para dicho/a (poli)péptido/proteína se expresa en una célula huésped antes de la unión del (poli)péptido/proteína a dicho recubrimiento, a diferencia de los enfoques en los que se está expresando el ácido nucleico que codifica para las proteínas de fusión con proteínas de recubrimiento de bacteriófago. La expresión del ácido nucleico que codifica para dicho/-a (poli)péptido/proteína y la etapa de producir o permitir la unión puede realizarse en etapas y/o medios separados. Sin embargo, preferiblemente, la expresión y la etapa de producir o permitir la unión se realizan secuencialmente en una célula huésped apropiada. El término "en el que dicha unión se produce mediante la formación de un enlace disulfuro" se refiere a una situación, en la que el enlace disulfuro es responsable de la unión, y en la que no se ha fusionado de manera recombinante un dominio de interacción, para la interacción con un segundo dominio presente en el/la (poli)péptido/proteína, a dicho elemento del recubrimiento proteico, tal como por ejemplo es el caso del sistema pJuFo (Crameri y Suter, 1993).

En una realización preferida, la partícula de bacteriófago que presenta el/la (poli)péptido/proteína contiene una secuencia de ácido nucleico que codifica para el/la (poli)péptido/proteína.

En la técnica se conocen bien métodos para la construcción de moléculas de ácido nucleico que codifican para un/una (poli)péptido/proteína según la presente invención, para la construcción de vectores que comprenden dichas moléculas de ácido nucleico, para la introducción de dichos vectores en células huésped seleccionadas apropiadamente, para producir o permitir la expresión de dichos/-as (poli)péptidos/proteínas (véase, por ejemplo, Sambrook et al., 1989; Ausubel et al., 1999; Ge et al., 1995). Más conocidos son los métodos para la introducción de material genético requerido para la generación de bacteriófagos de progenie o partículas de bacteriófago en células huésped apropiadas, y para producir o permitir la generación de dichos bacteriófagos de progenie o partículas de bacteriófago (véase, por ejemplo, Kay et al., 1996).

En una realización más preferida, la presente invención se refiere a un método, en el que dicho segundo residuo de cisteína está presente en una posición de aminoácido correspondiente en una proteína de recubrimiento de tipo natural de un bacteriófago.

En una realización todavía más preferida, la presente invención se refiere a un método, en el que dicho elemento del recubrimiento proteico es una proteína de recubrimiento de tipo natural de un bacteriófago.

El término "proteína de recubrimiento de tipo natural" se refiere a aquellas proteínas que forman el recubrimiento de fago de bacteriófagos que se producen naturalmente. En el caso de bacteriófagos filamentosos, dichas proteínas de tipo natural son la proteína del gen III (pIII), la proteína del gen VI (pVI), la proteína del gen VII (pVII), proteína del gen VIII (pVIII), y la proteína del gen IX (pIX). Las secuencias, incluyendo las diferencias entre los elementos muy relacionados de los bacteriófagos filamentosos tales como f1, fd, y M13, se conocen bien por el experto en la técnica (véase, por ejemplo, Kay et al., 1996).

En una realización más preferida, dicho elemento del recubrimiento proteico es una variante truncada de una proteína de recubrimiento de tipo natural de un bacteriófago, comprendiendo dicha variante truncada al menos esa parte de dicha proteína de recubrimiento de tipo natural que produce la incorporación de dicha proteína de recubrimiento en el recubrimiento proteico de la partícula de bacteriófago.

El término "variante truncada" se refiere a proteínas derivadas de las proteínas de tipo natural referidas anteriormente, que se modifican mediante deleción de al menos parte de las secuencias de tipo natural. Esto comprende variantes tales como variantes de proteína del gen III truncadas que se han hallado en mutantes de bacteriófago (Crissman y Smith, 1984) o que se han generado en el transcurso de los métodos de presentación en fago convencionales (Por ejemplo, Bass et al., 1990; Krebber, 1996). Por ejemplo, dicha variante truncada puede consistir, o incluir, el dominio C-terminal de la proteína del gen III. Para identificar las variantes truncadas según la presente invención, puede fusionarse una etiqueta de detección a la variante, y puede establecerse un ensayo para determinar si la variante se incorpora al recubrimiento de fago de las partículas de bacteriófago formadas en presencia de la variante.

Truncando una proteína de tipo natural mediante la deleción de una parte de la proteína de tipo natural, puede volverse disponible un residuo de cisteína que en la proteína de tipo natural estaba formando un enlace disulfuro con una segunda cisteína comprendida en la parte delecionada.

\newpage

En una realización todavía más preferida, dicho elemento del recubrimiento proteico es una variante modificada de una proteína de recubrimiento de tipo natural de un bacteriófago, en el que dicha variante modificada puede incorporarse en el recubrimiento proteico de la partícula de bacteriófago.

Un experto en la técnica conoce bien los métodos para lograr la modificación de una proteína de tipo natural según la presente invención, e implican técnicas convencionales de clonación y/o mutagénesis. En la técnica se conocen bien métodos para la construcción de moléculas de ácido nucleico que codifican para una variante de proteína de tipo natural utilizada en un método según la presente invención, para la construcción de vectores que comprende dichas moléculas de ácido nucleico, incluyendo la construcción de vectores de fago y/o fagémidos, para la introducción de dichos vectores en células huésped seleccionadas apropiadamente, para producir o permitir la expresión de dicha proteína modificada (véase, por ejemplo, Sambrook et al., 1989; Ausubel et al., 1999; Kay et al., 1996). Para identificar variantes modificadas según la presente invención, puede fusionarse una etiqueta de detección a la variante, y puede establecerse un ensayo para determinar si la variante puede o se incorpora en el recubrimiento de fago de partículas de bacteriófago formada en presencia de la variante.

En una realización más preferida, dicho segundo residuo de cisteína no está presente en una posición de aminoácido correspondiente en una proteína de recubrimiento de tipo natural de un bacteriófago.

En una realización preferida, dicha segunda cisteína se ha introducido artificialmente en una proteína de recubrimiento de tipo natural de un bacteriófago.

En el contexto de la presente invención, el término "introducido artificialmente" se refiere a una situación en la que una proteína de recubrimiento de tipo natural se ha modificado por medio de, por ejemplo, medios recombinantes. Por ejemplo, puede manipularse un ácido nucleico que codifica para una proteína de recubrimiento de tipo natural mediante procedimientos convencionales para introducir un codón de cisteína que crea una secuencia de ácido nucleico que codifica para una proteína de recubrimiento modificada, en los que se introduce artificialmente un residuo de cisteína mediante inserción en, o adición de dicho residuo de cisteína a, dicha al menos parte de una proteína de recubrimiento modificada o de tipo natural, o mediante sustitución de un residuo de aminoácido comprendido en dicha al menos parte de una proteína de tipo natural o modificada por dicho residuo de cisteína, o mediante fusión de dicha al menos parte de una proteína de recubrimiento modificada o de tipo natural con un/una (poli)péptido/proteína que comprende dicho segundo residuo de cisteína, o mediante cualquier combinación de dichas inserciones, adiciones, sustituciones o fusiones. Con la expresión del ácido nucleico que comprende un codón de cisteína introducido de manera recombinante de este tipo, se forma una variante de la proteína de tipo natural que comprende un residuo de cisteína.

En una realización más preferida, dicha segunda cisteína se ha introducido artificialmente en una variante truncada de una proteína de recubrimiento de tipo natural de un bacteriófago.

En una realización todavía más preferida, dicha segunda cisteína se ha introducido artificialmente en una variante modificada de una proteína de recubrimiento de tipo natural de un bacteriófago.

Un experto en la técnica conoce bien los métodos para lograr la introducción artificial según la presente invención, e implican técnicas convencionales de clonación y/o mutagénesis. En la técnica se conocen bien los métodos para la construcción de moléculas de ácido nucleico que codifican para una variante modificada de una proteína de tipo natural utilizada en un método según la presente invención, para la construcción de vectores que comprenden dichas moléculas de ácido nucleico, para la introducción de dichos vectores en células huésped seleccionadas apropiadamente, para producir o lograr la expresión de dichas proteínas de fusión (véase, por ejemplo, Sambrook et al., 1989; Ausubel et al., 1999).

En otra realización, la presente invención se refiere a un método, en el que dicha segunda cisteína está presente en, o en las proximidades de, el C- o el N-terminal de dicho elemento del recubrimiento de fago de dicha partícula de bacteriófago.

El término "en las proximidades de" se refiere a una extensión de hasta 15, o más preferiblemente, hasta 10 aminoácidos, contados en ambos casos desde o bien el N- o el C-terminal de dicho/-a (poli)péptido/proteína, siempre que el N- o C-terminal se sitúe en el exterior del bacteriófago.

Todavía más preferido es un método, en el que dicho bacteriófago es un bacteriófago filamentoso. El experto en la técnica conoce bien los bacteriófagos filamentosos tales como M13, fd, o f1.

En el caso de un bacteriófago filamentoso, se prefiere particularmente un método, en el que dicho elemento del recubrimiento proteico de la partícula de bacteriófago es o se deriva de la proteína de recubrimiento de tipo natural pIII.

Más preferido es un método, en el que dicho elemento del recubrimiento de proteína de la partícula de bacteriófago es o se deriva de la proteína de recubrimiento de tipo natural pix.

En el contexto de la presente invención, el término "se deriva" se refiere a una modificación, en la que la proteína modificada puede incorporarse en el recubrimiento proteico de la partícula de bacteriófago. Preferiblemente, aquellas partes de la proteína modificada que corresponden a la proteína de tipo natural muestran una identidad de aminoácido que supera aproximadamente el 70%, de manera preferible aproximadamente el 80%, lo más preferible aproximadamente el 90% en comparación con la secuencia de tipo natural correspondiente.

En una realización todavía más preferida de la presente invención, el método comprende:

(a) proporcionar una célula huésped que albergue una secuencia de ácido nucleico que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica para dicho/-a (poli)péptido/proteína;

(b) producir o permitir la expresión de dicha secuencia de ácido nucleico; y

(c) producir o permitir la producción de partículas de bacteriófago en dicha célula huésped.

\vskip1.000000\baselineskip

En el contexto de la presente invención, el término "producir o permitir la expresión" describe el cultivo de células huésped en condiciones tales que la secuencia de ácido nucleico se expresa. En la técnica se conocen bien los métodos para la construcción de moléculas de ácido nucleico que codifican para un/una (poli)péptido/proteína según la presente invención, para la construcción de vectores que comprenden dichas moléculas de ácido nucleico, para la introducción de dichos vectores en células huésped seleccionadas apropiadamente, para producir o permitir la expresión de (poli)péptidos/proteínas (véase, por ejemplo, Sambrook et al., 1989; Ausubel et al., 1999). Mejor conocidos son los métodos para la introducción del material genético requerido para la generación de bacteriófagos de progenie o partículas de bacteriófago en células huésped apropiadas, y para producir o permitir la generación de dichos bacteriófagos de progenie o partículas de bacteriófago (véase, por ejemplo, Kay et al., 1996). La etapa de producir o permitir la producción de partículas de bacteriófago puede requerir el uso de fagos auxiliares apropiados, por ejemplo, en el caso de trabajar con fagémidos.

Las etapas (b) y (c) pueden realizarse secuencialmente, en cualquier orden, o simultáneamente.

En una realización más, dicho/-a (poli)péptido/proteína comprende una inmunoglobulina o un fragmento funcional del mismo/-a.

En este contexto, "inmunoglobulina" se usa como sinónimo de "anticuerpo". El término "fragmento funcional" se refiere a un fragmento de una inmunoglobulina que conserva el resto de unión a antígeno de una inmunoglobulina. Fragmentos de inmunoglobulina funcionales según la presente invención pueden ser fragmentos Fv (Skerra y Plückthun, 1988), ScFv (Bird et al., 1988; Huston et al., 1988), Fv unido con disulfuro (Glockshuber et al., 1992; Brinkmann et al., 1993), Fab, F(ab')_{2} u otros fragmentos bien conocidos por el experto en la técnica, que comprenden el dominio variable de una inmunoglobulina o un fragmento de inmunoglobulina.

Se prefiere particularmente un fragmento Fvsc o Fab.

En una realización preferida, la presente invención se refiere a una secuencia de ácido nucleico que codifica para una variante modificada de una proteína de recubrimiento de tipo natural de un bacteriófago, consistiendo dicha variante modificada en:

(a) una o más partes de dicha proteína de recubrimiento de tipo natural de un bacteriófago, en la que una de dichas partes comprende al menos esa parte que produce o permite la incorporación de dicha proteína de recubrimiento en el recubrimiento de fago; y

(b) entre uno y seis residuos de aminoácido adicionales no presentes en las posiciones de aminoácido correspondientes en una proteína de recubrimiento de tipo natural de un bacteriófago, en la que uno de dichos residuos de aminoácido adicionales es un residuo de cisteína.

\vskip1.000000\baselineskip

En el contexto de la presente invención, una variante modificada mediante sustitución de un residuo de aminoácido en una secuencia de proteína de recubrimiento de tipo natural por un residuo de cisteína puede contemplarse como una variante compuesta de dos partes de dicha proteína de tipo natural unidas por un residuo de cisteína adicional. De manera correspondiente, las variantes de una proteína de recubrimiento de tipo natural que comprende varias mutaciones en comparación con la secuencia de tipo natural pueden contemplarse como que están compuestas de varias partes de tipo natural, en las que las partes individuales están unidas por los residuos mutados. Sin embargo, dichas variantes también pueden resultar de la adición de hasta seis residuos, incluyendo un residuo de cisteína, a o bien el C y/o bien al N-terminal de la proteína de recubrimiento de tipo natural.

Más preferida es una secuencia de ácido nucleico que codifica para una variante modificada de una proteína de recubrimiento de tipo natural de un bacteriófago, en la que dicha variante modificada consiste en:

(a) una o más partes de dicha proteína de recubrimiento de tipo natural de un bacteriófago, en la que una de dichas partes comprende al menos esa parte que produce o permite la incorporación de dicha proteína de recubrimiento en el recubrimiento de fago;

(b) entre uno y seis residuos de aminoácido adicionales no presentes en las posiciones de aminoácido correspondientes en una proteína de recubrimiento de tipo natural de un bacteriófago, en la que uno de dichos residuos de aminoácido adicionales es un residuo de cisteína; y

(c) una o más secuencias de péptido con fines de purificación y/o detección.

\vskip1.000000\baselineskip

Particularmente preferidos son péptidos que comprenden al menos cinco residuos de histidina (Hochuli et al., 1988), que pueden unirse a iones metálicos, y pueden, por tanto, usarse para la purificación de la proteína a la que se fusionan (Lindner et al., 1992). La invención también proporciona restos adicionales tales como las etiquetas habitualmente usadas c-myc y FLAG (Hopp et al., 1988; Knappik y Plückthun, 1994), o la etiqueta Strep (Schmidt y Skerra, 1994; Schmidt et al., 1996).

La variante modificada puede comprender además residuos de aminoácido requeridos para la clonación, para la expresión, o el transporte proteico. Los residuos de aminoácido requeridos para la clonación pueden incluir residuos codificados por secuencias de ácidos nucleicos que comprenden secuencias de reconocimiento para endonucleasas de restricción que se incorporan con el fin de permitir la clonación de las secuencias de ácido nucleico en los vectores apropiados. Los residuos de aminoácido requeridos para la expresión pueden incluir residuos que conducen a un aumento de la solubilidad o estabilidad del/de la (poli)péptido/proteína. Los residuos de aminoácido requeridos para el transporte proteico pueden incluir secuencias de señalización responsables del transporte de la variante modificada del periplasma de E. coli y/o residuos de aminoácidos que facilitan la escisión eficaz de dichas secuencias de señalización. Los residuos de aminoácido adicionales requeridos para fines de clonación, expresión, transporte proteico, purificación y/o detección referidos anteriormente, son restos numerosos bien conocidos por el experto en la técnica.

En otra realización, la presente invención se refiere a un vector que comprende una secuencia de ácido nucleico según la presente invención.

En una realización preferida, el vector comprende además una o más secuencias de ácido nucleico que codifica para un/una (poli)péptido/proteína que comprende un segundo residuo de cisteína.

En una realización más preferida, dicho/-a (poli)péptido/proteína comprende una inmunoglobulina o un fragmento funcional de la misma.

En el caso de los fragmentos de anticuerpo Fv de cadena simple referidos anteriormente en el presente documento, el vector comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica para los dominios VH y VL unidos por un conector de (poli)péptido, y en el caso de fragmentos de anticuerpo Fab, el vector comprende dos secuencias de ácido nucleico que codifican para cadenas VH-CH y VL-CL.

En una realización adicional, la presente invención se refiere a una célula huésped que contiene una secuencia de ácido nucleico según la presente invención o un vector según la presente invención.

En el contexto de la presente invención el término "célula huésped" puede ser cualquiera de varias usadas habitualmente en la producción de proteínas heterólogas, incluyendo pero no limitándose a bacterias, tales como Escherichia coli (Ge et al., 1995), o Bacillus subtilis (Wu et al., 1993), hongos, tales como levaduras (Horwitz et al, 1988; Ridder et al., 1995) u hongos filamentosos (Nyyssönen et al., 1993), células de plantas (Hiatt y Ma, 1993; Whitelam et al., 1994), células de insectos (Potter et al., 1993; Ward et al., 1995), o células de mamífero (Trill et al., 1995).

En una realización todavía más preferida, la presente invención se refiere a una variante modificada de una proteína de recubrimiento de bacteriófago de tipo natural codificada por una secuencia de ácido nucleico según la presente invención, un vector según la presente invención o producido por una célula huésped según la presente invención.

La memoria descriptiva también describe una partícula de bacteriófago que presenta un/una (poli)péptido/proteína en su superficie que puede obtenerse mediante un método que comprende:

producir o permitir la unión de dicho/-a (poli)péptido/proteína tras la expresión de un elemento del recubrimiento proteico de dicha partícula de bacteriófago, produciéndose dicha unión por la formación de un enlace disulfuro entre un primer residuo de cisteína comprendido en dicho (poli)péptido/proteína y un segundo residuo de cisteína comprendido en dicho elemento del recubrimiento proteico.

\vskip1.000000\baselineskip

En otra realización, la presente invención se refiere a una partícula de bacteriófago que presenta un/una (poli)péptido/proteína unida a su superficie, produciéndose dicha unión por la formación de un enlace disulfuro entre un primer residuo de cisteína comprendido en dicho/-a (poli)péptido/proteína y un segundo residuo de cisteína comprendido en un elemento del recubrimiento proteico de dicha partícula de bacteriófago, en la que dicha partícula de bacteriófago contiene una secuencia de ácido nucleico para la expresión de dicho/-a (poli)péptido/proteína.

En una realización preferida, la partícula de bacteriófago contiene además un vector que comprende una o más secuencias de ácido nucleico que codifican para dicho/-a (poli)péptido/proteína.

En una realización más preferida de la presente invención, la partícula de bacteriófago contiene un vector según la presente invención, en la que dicho vector comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica para una proteína de recubrimiento de bacteriófago de tipo natural modificada y además una o más secuencias de ácido nucleico que codifican para un/una (poli)péptido/proteína, y lo más preferiblemente que comprenden al menos un dominio funcional de una inmunoglobulina.

Por analogía, las realizaciones preferidas del método de la presente invención referido anteriormente en el presente documento, se aplican a los bacteriófagos de la presente invención.

En una realización adicional, la presente invención se refiere a una colección diversa de partículas de bacteriófago según la presente invención, en el que cada una de dichas partículas de bacteriófago presenta un/una (poli)péptido/proteína de una colección diversa de (poli)péptidos/proteínas. Una "colección diversa de partículas de bacteriófago" puede designarse también como una "biblioteca" o una "pluralidad de partículas de bacteriófago". Cada elemento de una biblioteca de este tipo presenta un elemento distinto de la biblioteca.

En el contexto de la presente invención el término "colección diversa" se refiere a una colección de al menos dos partículas o moléculas que difieren en al menos parte de sus composiciones, propiedades y/o secuencias. Por ejemplo, una colección diversa de (poli)péptidos/proteínas es un conjunto de (poli)péptidos/proteínas que difieren en al menos una posición de aminoácido de su secuencia. Una colección diversa de (poli)péptidos/proteínas de este tipo puede obtenerse de varias maneras, por ejemplo, mediante mutagénesis aleatoria de al menos un codón de una secuencia de ácido nucleico que codifica un/una (poli)péptido/proteína inicial, usando una PCR propensa al error para amplificar una secuencia de ácido nucleico que codifica para un/una (poli)péptido/proteína inicial, o usando cadenas de mutación ("mutator strains") como células huésped en un método según la presente invención. Estos y los métodos adicionales o alternativos para la generación de colecciones diversas de (poli)péptidos/proteínas se conocen bien por el experto en la técnica. Una "colección diversa de partículas de bacteriófago" pueden designarse como una biblioteca o una pluralidad de partículas de bacteriófago. Cada elemento de una biblioteca de este tipo presenta un elemento distinto de la biblioteca.

En otra realización, la invención se refiere a un método para obtener un/una (poli)péptido/proteína que tiene una propiedad deseada que comprende:

(a) proporcionar la colección diversa de partículas de bacteriófago según la presente invención; y

(b) detectar dicha colección diversa y/o seleccionar de dicha colección diversa para obtener al menos una partícula de bacteriófago que presenta un/una (poli)péptido/proteína que tenga dicha propiedad deseada.

\vskip1.000000\baselineskip

En el contexto de la presente invención el término "propiedad deseada" se refiere a una propiedad predeterminada que debe tener uno de los/las (poli)péptidos/proteínas de la colección diversa de (poli)péptidos/proteínas y que constituye la base para la detección y/o selección de la colección diversa. Tales propiedades comprenden propiedades tales como la unión a una diana, el bloqueo de una diana, la activación de una reacción mediada por diana, la actividad enzimática, y propiedades adicionales que se conocen bien por el experto en la técnica. Dependiendo del tipo de propiedad deseada, un experto en la técnica podrá identificar el formato y las etapas necesarias para realizar la detección y/o selección.

El más preferido es un método en el que dicha propiedad deseada es la unión a una diana de interés.

Dicha diana de interés puede presentarse a dicha colección diversa de partículas de bacteriófago de varias maneras bien conocidas por el experto en la técnica, tal como recubierta sobre superficies para el cribado biológico en fase sólida ("solid phase biopanning"), unida a partículas tales como perlas magnéticas para el cribado biológico en disolución, o presentada en la superficie de células para el cribado biológico de células enteras o el cribado biológico en cortes de tejido. Las partículas de bacteriófago que se hayan unido a dicha diana pueden recubrirse por varios métodos bien conocidos por el experto en la técnica, tal como mediante elución con tampones apropiados, o bien usando un gradiente de pH o de sal, o bien mediante elución específica usando una diana soluble.

En una realización preferida, el método para obtener un/una (poli)péptido/proteína comprende adicionalmente:

(ba) poner en contacto dicha colección diversa de partículas de bacteriófago con la diana de interés;

(bb) eluir partículas de bacteriófago que no se unen a la diana de interés;

(bc) eluir partículas de bacteriófago que se unen a la diana de interés, tratando en condiciones reductoras los complejos de diana de interés y bacteriófagos que se unen a dicha diana de interés formados en la etapa (ba).

\vskip1.000000\baselineskip

En condiciones reductoras, tales como por la incubación con DTT, los enlaces disulfuro se escinden permitiendo así recuperar las partículas de bacteriófago específicas para más series de cribado biológico y/o para la identificación de la/las (poli)péptidos/proteínas que se unen específicamente a dicha diana.

Leyendas de figuras

Figura 1a: mapa del vector de constructo pMorphX7-hag2-LH.

Figura 1b: secuencia del vector de pMorphX7-hag2-LH.

Figura 2: secuencia del vector de Ptft74-N1-hag-HIPM

Figura 3: secuencia del vector de Pqe60-MacI

Figura 4: Unión específica de scFv presentado en fagos no modificados mediante ingeniería.

Los fagos derivados de constructos pMorphX7-MacI5-LCH, pMorphX7-MacI5-LHC y pMorphX7-MacI5-LH se produjeron mediante procedimientos convencionales y se incubaron previamente en PBSTM o bien con DTT 5 mM (+DTT) o bien sin DTT. Se recubrieron placas de microtitulación Maxisorp Nunc-Immuno con 5 \mug/pocillo de antígeno específico (MacI, columnas oscuras) así como con antígeno de control inespecífico (BSA, columnas claras) y se incubaron con 1 x 10^{10} fagos/pocillo, respectivamente. Se detectaron fagos unidos mediante conjugado anti-M13-HRP y sustrato soluble azul BM. Se usaron fagos derivados a partir de un vector de presentación de fago convencional pMorph13-MacI5 como control (3 x 10^{7} fagos/pocillo). Los detalles del experimento se dan en el ejemplo 1.

Figura 5: Unión específica de scFv presentado en fagos no modificados mediante ingeniería.

Los fagos derivados de constructos pMorphX7-hag2-LCH, pMorphX7-hag2-LHC y pMorphX7-hag2-LH se produjeron mediante procedimientos convencionales y se incubaron previamente en PBSTM o bien con DTT 5 mM (+DTT) o bien sin DTT. Se recubrieron placas de microtitulación Maxisorp Nunc-Immuno con 5 \mug/pocillo de antígeno específico (N1-hag, columnas oscuras) así como con antígeno de control inespecífico (BSA, columnas claras) y se incubaron con 1 x 10^{10} fagos/pocillo, respectivamente. Se detectaron fagos unidos mediante conjugado anti-M13-HRP y sustrato soluble azul BM. Se usaron fagos derivados a partir de un vector de presentación de fago convencional pMorph13-hag2 como control (3 x 10^{7} fagos/pocillo). Los detalles del experimento se dan en el ejemplo 1.

Figura 6a: Mapa del vector de constructo pbr-C-gIII.

Figura 6b: Secuencia de casete de expresión para pIII de longitud total con un residuo de cisteína N-terminal (C-gIII).

Figura 6c: Secuencia de casete de expresión para pIII truncado con un residuo de cisteína N-terminal (C-gIIICT).

Figura 7a: Mapa del vector de constructo pMorph18-C-gIII-hag2-LHC.

Figura 7b: Secuencia del vector de pMorph18-C-gIII-hag2-LHC.

Figura 8: Detección de scFv MacI-5 presentado en fagos modificados mediante ingeniería - sistema de dos vectores.

Los fagos derivados de constructos pMorphX7-MacI-5-LH/pBR-C-gIII (carriles 1 y 5), pMorphX7-MacI-5-LHC/
pBR-C-gIII (carriles 2 y 6), pMorphX7-MacI-5-LHC (carriles 3 y 7) y pMorphX7-MacI-5-LH (carriles 4 y 8) se produjeron mediante procedimientos convencionales. Se incubaron previamente 1-5 x 10^{10} fagos en PBS con DTT (carriles 1-4) o sin DTT (carriles 5-8). Se añadió tampón de carga de SDS sin agentes reductores, los fagos se aplicaron a un gel de PAA en SDS al 4-15% Ready y se analizaron en inmunotransferencias. La detección de los scFv asociados con fagos se realizó mediante anticuerpo anti-FLAG M1, conjugado anti-ratón-IgG-AP y sustrato Fast BCIP/NPT (6A) y mediante anticuerpo anti-pIII, conjugado anti-ratón-IgG-AP y sustrato Fast BCIP/NPT (6B). El marcador de intervalo bajo (Amersham nºRPN756) se marca como M. Los datos experimentales se dan en el ejemplo 2.1.

Figura 9: Detección de scFv presentado en fagos modificados mediante ingeniería - sistema de un vector.

Los fagos derivados de constructos pMorph18-C-gIII-hag2-LHC (carriles 1-8; 7A), pMorph18-C-gIII-AB1.1-LHC (carriles 1, 2, 5 y 6; 7B), y pMorph18-C-gIII-MacI-5-LHC (carriles 3, 4, 7 y 8; 7B) se produjeron mediante procedimientos convencionales. Se incubaron previamente 1-5 x 10^{10} fagos en PBS con DTT (carriles 1, 2, 5 y 6; 7A y carriles 1-4; 7B) o sin DTT (carriles 3, 4, 7 y 8; 7A y carriles 5-8; 7B). Se añadió tampón de carga de SDS sin agentes reductores, los fagos se aplicaron a un gel de PAA en SDS al 4-15% Ready y se analizaron en inmunotransferencias. La detección de los scFv asociados con fagos se realizó mediante anticuerpo anti-FLAG M1, conjugado anti-ratón-IgG-AP y sustrato Fast BCIP/NPT (carriles 1-4; 7A) y mediante anticuerpo anti-pIII, conjugado anti-ratón-IgG-AP y sustrato Fast BCIP/NPT (carriles 5-8; 7A y carriles 1-8; 7B). El marcador de intervalo bajo (Amersham nºRPN756) se marca como M. Los detalles experimentales se dan en el ejemplo 2.1.

\newpage

Figura 10: Unión específica de scFv presentado en fagos modificados mediante ingeniería - Comparación de los diferentes sistemas de dos vectores.

Los fagos derivados de constructos pMorphX7-MacI-5-LHC/pBR-C-gIII (1), pMorphX7-MacI-5-LHC/pBR-C-gIIICT (2), pMorphX7-MacI5-LHC/pUC-C-gIII (3), pMorphX7-MacI-5-LHC/pUC-C-gIIICT (4), pMorphX7-MacI-5-LHC (5), pMorphX7-MacI-5-LH (6) y el vector de presentación de fago convencional pMorph13-MacI-5 (7) se produjeron mediante procedimientos convencionales. Se recubrieron placas de microtitulación Maxisorp Nunc-Immuno con 5 \mug/pocillo de antígeno específico (MacI) así como con antígeno de control inespecífico (BSA, datos no mostrados) y se incubaron con una gama de 6,4 x 10^{6} y 1x10^{11} fagos/pocillo. Se detectaron fagos unidos mediante conjugado anti-M13-HRP y sustrato azul BM. Los detalles experimentales se dan en el ejemplo 2.1.

Figura 11: Unión específica de scFv presentado en fagos modificados - Comparación de los sistemas de uno y dos vectores.

Los fagos derivados de constructos pMorphX7-MacI-5-LHC/pBR-C-gIII (1), pMorphX7-MacI-5-LHC/pBR-C-gIIICT (2), pMorph18-C-gIII-MacI-5-LHC (3), pMorph18-C-gIIICT-MacI-5-LHC (4), y pMorphX7-MacI-5-LHC (5) se produjeron mediante procedimientos convencionales. Se recubrieron placas de microtitulación Maxisorp Nunc-Immuno con 5 \mug/pocillo de antígeno específico (MacI, columnas oscuras) así como con antígeno de control inespecífico (BSA, columnas claras) y se incubaron con 1 x 10^{10} y 1 x 10^{9} fagos, respectivamente. Se detectaron fagos unidos mediante conjugado anti-M13-HRP y sustrato azul BM. Los detalles experimentales se dan en el ejemplo
2.1.

Figura 12: Unión específica de scFv presentado en fagos modificados mediante ingeniería - Comparación de proteínas del gen IX y del gen III modificadas mediante ingenería en el sistema de un vector.

Los fagos derivados de constructos pMorph18-C-gIII-MacI-5-LHC (1), pMorph18-C-gIIICT-MacI-5-LHC (2), pMorph18-C-gIX-MacI-5-LHC (3), pMorphX7-MacI-5-LHC (4) y el vector de presentación de fago convencional pMorph13-MacI-5 (5) se produjeron mediante procedimientos convencionales. Se recubrieron placas de microtitulación Maxisorp Nunc-Immuno con 5 \mug/pocillo de antígeno específico (MacI, columnas oscuras) así como con antígeno de control inespecífico (BSA, columnas claras) y se incubaron con 1 x 10^{10}, 1 x 10^{9} y 1 x 10^{8} fagos, respectivamente. Se detectaron fagos unidos mediante conjugado anti-M13-HRP y sustrato azul BM. Los detalles experimentales se dan en el ejemplo 2.1.

Figura 13: Unión específica de scFv presentado en fagos modificados mediante ingeniería - Impacto del DTT.

Los fagos derivados de constructos pMorph18-C-gIII-MacI-5-LHC (1), pMorph18-C-gIIICT-MacI-5-LHC (2), pMorph18-C-gIX-MacI-5-LHC (3), pMorphX7-MacI-5-LHC (4) y el vector de presentación de fago convencional pMorph13-MacI-5 (5) se produjeron mediante procedimientos convencionales y se incubaron previamente en PBSTM, o bien con DTT 5 mM (+) o sin DTT (-). Se recubrieron placas de microtitulación Maxisorp Nunc-Immuno con 5 \mug/pocillo de antígeno específico (MacI, columnas oscuras) así como con antígeno de control inespecífico (BSA, columnas claras) y se incubaron con 1 x 10^{10} fagos, respectivamente. Se detectaron fagos unidos mediante conjugado anti-M13-HRP y sustrato azul BM. Los detalles experimentales se dan en el ejemplo 2.1.

Figura 14: Especificidad de scFv seleccionados - cribado de agrupaciones preseleccionadas frente a N1-MacI.

Se expresaron scFv seleccionados tras dos series del cribado de presentación-cys frente al antígeno N1-MacI a partir de la agrupación de la cadena-\kappa (1-5) y cadena-\lambda (6-8) según los procedimientos convencionales. Se recubrieron placas de 384 pocillos (Maxisorp; Nunc) con 0,1 \mug/pocillo de leche en polvo (A), BSA (B), FITC-BSA (C, FITC acoplado a BSA), N1-hag (D), N1-Np50 (E) y N1-MacI (N1-MacI) y se incubaron con 10 \mul de disolución de scFv, respectivamente. Se detectaron scFv unidos mediante una mezcla de anti-Flag M1, anti-Flag M2 y conjugado anti-ratón-IgG-AP, así como, sustrato de fluorescencia AttoPhos (Roche nº1484281). Cada scFv se sometió a prueba por cuadruplicado y se presentan los valores medios.

Figura 15: Especificidad de scFv seleccionados - Cribado de agrupaciones preseleccionadas frente a N1-Np50.

Se expresaron scFv seleccionados tras dos series del cribado de presentación-cys frente al antígeno N1-Np50 (1-8) según los procedimientos convencionales. Se recubrieron placas de 384 pocillos (Maxisorp; Nunc) con 0,1\mug/pocillo de leche en polvo (A), BSA (B), FITC-BSA (C, FITC acoplado a BSA), N1-hag (D), N1-MacI (E) y N1-Np50 (N1-Np50) y se incubaron con 10 \mul de disolución de scFv, respectivamente. Se detectaron scFv unidos mediante una mezcla de anti-Flag M1, anti-Flag M2 y conjugado anti-ratón-IgG-AP, así como, sustrato de fluorescencia AttoPhos (Roche nº1484281). Cada scFv se sometió a prueba por cuadruplicado y se presentan los valores medios.

Figura 16a: Mapa del vector de constructo pMorphX10-Fab-MacI5-VL-LHC-VH-FS.

Figura 16b: Secuencia del vector completa de pMorphX10-Fab-MacI5-VL-LHC-VH-FS.

\newpage

Figura 17: Detección de Fab ICAM1-C8 presentado en fagos modificados mediante ingeniería.

Los fagos derivados de constructos pMorphX10-Fab-ICAM1C8-VL-LHC-VH-MS/pBAD-SS-C-gIII (carriles 5, 6, 11, 12), pMorphX10-Fab-ICAM1C8-VL-LHC-VH-MS (carriles 3, 4, 9, 10) y pMorph18-Fab-ICAM1C8 (carriles 1, 2, 7, 8) se produjeron mediante los procedimientos convencionales. Se incubaron previamente 1 x 10^{10} en PBS con DTT (carriles 1-6) o sin DTT (carriles 7-12). Se añadió tampón de carga de SDS sin agentes reductores, los fagos se aplicaron a un gel de PAA en SDS al 12% Ready y se analizaron en inmunotransferencias. La detección se realizó mediante anticuerpo anti-pIII, conjugado anti-ratón-IgG-HRP y sustrato de precipitación POD Azul BM. El marcador de peso molecular de intervalo bajo (Amersham Life Science nºRPN756) se marca como M. Experimental, los detalles se dan en el ejemplo 2.2.

Figura 18: Detección de Fab MacI-A8 presentado en fagos modificados mediante ingeniería.

Los fagos derivados de constructos pMorphX10-Fab-MacIA8-VL-LHC-VH-MS/pBAD-SS-C-gIII (carriles 5, 6, 11, 12), pMorphX10-Fab-MacIA8-VL-LHC-VH-FS (carriles 3, 4, 9, 10) y pMorph18-Fab-MacIA8 (carriles 1, 2, 7, 8) se produjeron mediante los procedimientos convencionales. Se incubaron previamente 1 x 10^{10} en PBS con DTT (carriles 1-6) o sin DTT (carriles 7-12). Se añadió tampón de carga de SDS sin agentes reductores, los fagos se aplicaron a un gel de PAA en SDS al 12% Ready y se analizaron en inmunotransferencias. La detección se realizó mediante anticuerpo anti-pIII, conjugado anti-ratón-IgG-HRP y sustrato de precipitación Azul BM. El marcador de peso molecular de intervalo bajo (Amersham Life Science nºRPN756) se marca como M. Los detalles experimentales se dan en el ejemplo 2.2.

Figura 19: Unión específica de Fab presentados en fagos modificados mediante ingeniería - Fab MacI-5.

Los fagos derivados de constructos pMorphX10-Fab-MacI-5-VL-LHC-VH-FS/pBR-C-gIII (1), pMorphX10-Fab-MacI5-VL-VH-FS/pBR-C-gIII (2), pMorphX10-Fab-MacI5-VL-VH-CFS/pBR-C-gIII (3), pMorphX10-Fab-MacI5-VL-VH-LHC/pBR-C-gIII (4), pMorphX9-Fab-MacI5-FS (5), y el vector de presentación de fago convencional
pMorph18-Fab-MacI5 (6) se produjeron mediante los procedimientos convencionales. Se recubrieron placas de microtitulación Maxisorp Nunc-Immuno con 5 \mug/pocillo de antígeno específico (N1-MacI) y se incubaron con 1 x 10^{8} (columnas claras) y 1 x 10^{9} (columnas oscuras) fagos por pocillo. Se detectaron fagos unidos mediante conjugado anti-M13-HRP y sustrato soluble azul BM. Cada columna representa el valor medio de tres preparaciones de fago independientes sometidas a prueba por duplicado. Los detalles experimentales se dan en el ejemplo 2.2.

Figura 20: Unión específica de Fab presentados en fagos modificados mediante ingenería - Fab MacI-A8.

Los fagos derivados de constructos pMorphX10-Fab-MacIA8-VL-LHC-VH-FS/pBR-C-gIII (1), pMorphX10-Fab-MacIA8-VL-C-VH-FS/pBR-C-gIII (2), pMorphX10-Fab-MacIA8-VL-VH-CFS/pBR-C-gIII (3), pMorphX10-Fab-MacIA8-VL-VH-LHC/pBR-C-gIII (4), pMorphX9-Fab-MacIA8-FS (5), y el vector de presentación de fago convencional pMorph18-Fab-MacIA8 (6) se produjeron mediante los procedimientos convencionales. Se recubrieron placas de microtitulación Maxisorp Nunc-Immuno con 5 \mug/pocillo de antígeno específico (N1-MacI) y se incubaron con 1 x 10^{9} (columnas claras) y 1 x 10^{10} (columnas oscuras) fagos por pocillo. Se detectaron fagos unidos mediante conjugado anti-M13-HRP y sustrato soluble azul BM. Cada columna representa el valor medio de tres preparaciones de fago independientes sometidas a prueba por duplicado. Los detalles experimentales se dan en el ejemplo 2.2.

Figura 21: Unión específica de Fab presentados en fagos modificados mediante ingeniería - Fab ICAM1-C8.

Los fagos derivados de constructos pMorphX10-Fab-ICAM1C8-VL-LHC-VH-MS/pBR-C-gIII (1),
pMorphX10-Fab-ICAM1C8-VL-C-VH-MS/pBR-C-gIII (2), pMorphX10-Fab-ICAM1C8-VL-VH-CMS/pBR-C-gIII (3), pMorphX10-Fab-ICAM1C8-VL-VH-LHC/pBR-C-gIII (4), pMorphX9-Fab-ICAM1C8-MS (5), pMorphX9-Fab-ICAM1C8-MS/pBR-C-gIII (6) se produjeron mediante los procedimientos convencionales. Se recubrieron placas de microtitulación Maxisorp Nunc-Immuno con 5 \mug/pocillo de antígeno específico (ICAM1, columnas oscuras) o con antígeno inespecífico (BSA, columnas claras), y se incubaron con 1 x 10^{9} fagos por pocillo. Se detectaron fagos unidos mediante conjugado anti-M13-HRP y sustrato soluble azul BM. Cada columna representa el valor medio de una preparación de fago sometida a prueba por duplicado. Los detalles experimentales se dan en el ejemplo 2.2.

Figura 22: Unión específica de Fab presentados en fagos modificados mediante ingeniería - Impacto del DTT.

Los fagos derivados de constructos pMorphX10-Fab-MacI5-VL-LHC-VH-FS/pBR-C-gIII (1), pMorphX10-Fab-MacI5-VL-C-VH-FS/pBR-C-gIII (2), pMorphX10-Fab-MacI5-VL-VH-CFS/pBR-C-gIII (3), pMorphX10-Fab-MacI5-VL-VH-LHC/pBR-C-gIII (4), pMorphX9-Fab-MacI5-FS (5), y el vector de presentación de fago convencional pMorph18-Fab-MacI5 (6) se produjeron mediante los procedimientos convencionales y se incubaron previamente en PBSTM, o bien con DTT 10 mM (+) o bien sin DTT (-). Se recubrieron placas de microtitulación Maxisorp Nunc-Immuno con 5 \mug/pocillo de antígeno específico (N1-MacI, columnas oscuras) así como con antígeno de control inespecífico (BSA, columnas claras) y se incubaron con 1 x 10^{9} fagos, respectivamente. Se detectaron fagos unidos mediante conjugado anti-M13-HRP y sustrato azul BM. Cada columna representa el valor medio de una preparación de fago sometida a prueba por duplicado. Los detalles experimentales se dan en el ejemplo 2.2.

\newpage

Los ejemplos ilustran la invención.

Ejemplo 1 Presentación de (poli)péptidos/proteínas sobre la superficie de partículas de bacteriófago filamentoso no modificado mediante ingeniería a través de la formación de enlaces disulfuro

En el ejemplo siguiente, todos los experimentos de biología molecular se realizan según los protocolos convencionales (Ausubel et al., 1999).

Construcción de vectores que expresan scFv

Todos los vectores usados son derivados de fagémido de alto número de copias pMorphX7-LH (figura 1a+b), un derivado de la serie del vector pCAL (documento WO 97/08320; Knappik et al., 2000). El casete de expresión comprende la secuencia señal phoA, un sitio de unión mínimo para el anticuerpo monoclonal (mab) anti-FLAG M1 (Sigma nºF-3040) (Knappik y Plückthun, 1994), un fragmento de cadena sencilla (scFv), un ligador corto (PGGSG) y una etiqueta de 6 x histidina (6His; Hochuli et al., 1988) (figura 1a). Se han generado pMorphX7-LCH y pMorphX7-LHC insertando casetes de oligonucleótidos que codifican para Cys-6His y 6His-Cys, respectivamente, entre los sitios AscI y HindIII únicos de pMorphX7-LH (figura 1a, tabla 1). Todos los vectores expresan scFv soluble no genéticamente fusionado a ninguna proteína de recubrimiento de fago. El vector de presentación de fago convencional pMorph13, que se basa en el vector pCAL4 descrito en el documento WO 97/08320 y expresa una fusión de un scFv a la parte C-terminal de la proteína de fago pIII, se usó como control positivo. Los scFv se han intercambiado entre los vectores respectivos mediante los sitios XbaI y EcoRI únicos (véase la figura 1a).

Descripción del scFv - interacciones de antígeno

Todos los scFv derivan de una biblioteca de anticuerpos combinatoria humana (HuCAL; documento WO 97/08320; Knappik et al., 2000). Los genes consenso HuCAL VH y VL (descritos en el documento WO 97/08320), y las secuencias CDR3 de los scFv se dan en la tabla 2. Se seleccionó el clon hag2 frente a un péptido de la hemaglutinina del virus de la influenza (aa 99-110 de hemaglutinina más aa flanqueantes adicionales (mostrados en cursiva, CAGPYDVPDYASLRSHH), y el clon MacI-5 frente a un fragmento (MacI) de cadena alfa de CR-3 humano (SWISS-PROT entrada P11215, aa 149-353 de CR-3 alfa humano fusionado a una secuencia C-terminal que contiene una etiqueta de 6 x histidina). Los antígenos correspondientes para ELISA y experimentos con bibliotecas dopadas se obtuvieron tal como sigue. El antígeno específico de hag2, N1-hag, se produjo usando el vector de expresión pTFT74-N1-hag-HIPM, un derivado del vector pTFT74 (Freund et al., 1993) (figura 2). N1-hag comprende los aa 1-82 de la proteína III del gen maduro del fago M13 que contiene un residuo de metionina adicional en el N-terminal (N1) fusionado a la secuencia de aminoácido PYDVPDYASLRSHHHHHH (hag) que comprende los aa 99-110 de la hemaglutinina del virus de la influenza y una etiqueta de 6 x histidina (en cursiva). La expresión, la purificación y el replegamiento de N1-hag se realizó tal como se describió (Krebber, 1996; Krebber et al., 1997). Como antígeno para MacI-5, se usó un fragmento purificado (MacI) de cadena alfa de CR-3 humano (SWISS-PROT entrada P11215) fusionado a una etiqueta de 6 x histidina C-terminal. Concretamente, el casete de expresión codifica para una metionina N-terminal, los aminoácidos 149-353 de alfa CR-3 humano y los aminoácidos IEGRHHHHHH. Este casete está flanqueado por sitios de restricción únicos BspHI y HindIII y puede introducirse, por ejemplo, en los sitios únicos NcoI y HindIII de pQE-60 (QIAGEN GMBH, Hilden, Alemania), produciendo el vector de expresión pQE60-MacI (figura 3). La expresión y purificación se realizó usando los métodos convencionales (The QIAexpressionist^{TM} 3ª edición: A handbook for high-level expresión and purification of 6xHis-tagged proteins (julio de 1998). QIAGEN GMBH, Hilden, Alemania). La albúmina sérica bovina (BSA, Sigma nºA7906) se usó como antígeno de control negativo.

Funcionalidad de scFv presentados en fagos no modificados

Para demostrar que los scFv presentados son funcionales con respecto al reconocimiento de sus antígenos específicos, se realizaron ELISA del fago. El análisis se realizó para los dos scFv de HuCAL, hag2 y MacI-5. Se analizaron tres sistemas de expresión que difieren en los módulos fusionados al C-terminal del scFv, concretamente pMorphX7-LH, pMorphX7-LHC y pMorphX7-LCH.

Se produjeron fagos según los procedimientos convencionales usando fago auxiliar VCSM13 (Kay et al., 1996). Se recubrieron placas de microtitulación Nunc Maxisorp (nº 442404) con antígeno específico o antígeno de control (BSA, Sigma nºA7906) durante 12 h a 4ºC y a una concentración de 5 \mug/pocillo en PBS. Los fagos se incubaron previamente en PBSTM (PBS que contiene leche descremada en polvo al 5% y Tween 20 al 0,1%), bien con o bien sin DTT 5 Mm, durante 2 h a temperatura ambiente antes de aplicarse al pocillo de ELISA recubierto con antígeno a una concentración de 1 x 10^{10} fagos por pocillo, excepto para pMorph13 que se usó a una concentración de 3 x 10^{7} fagos por pocillo. Tras la unión durante 1 h a temperatura ambiente, los fagos no unidos específicamente se eliminaron por lavado con PBS que contenía Tween 20 al 0,05% y los fagos unidos se detectaron en ELISA usando un conjugado anti-M13-HRP (Amersham Pharmacia Biotech nº27-9421-01) y azul BM soluble (Boehringer Mannheim nº1484281). Se midió la absorbancia a 370 nm. Las señales de ELISA obtenidas con el antígeno específico se compararon con las del antígeno de control. Pudo mostrarse la unión específica de fagos que presentaban scFv al antígeno. Como ejemplo, en las figuras 4 y 5 se muestran dos ELISA de este tipo para scFv hag2 y MacI-5, respectivamente. Con fagos derivados de pMorphX7-LCH y pMorphX7-LHC se alcanzaron señales entre 1,9 y 5,8 veces superiores el fondo. Cuando se añadió DTT 5 mM a los fagos antes de la unión de antígeno durante la etapa de incubación previa, la señal de ELISA disminuyó hasta casi los niveles de fondo, mientras que el DTT no tuvo un efecto muy importante sobre los fagos de presentación convencional (pMorph13).

Enriquecimiento de fagos no modificados que presentan scFv

Para demostrar que fagos no modificados mediante ingeniería que presentan scFv pueden enriquecerse sobre antígeno específico, se realizó un experimento llamado de biblioteca dopada. Se mezclaron fagos específicos con un elevado exceso de fagos inespecíficos y se realizaron tres series de cribado sobre antígeno específico. Se determinó el enriquecimiento para los fagos específicos tras cada serie. El análisis se realizó para HuCAL scFv hag2 y MacI-5 en el vector pMorhX7-LHC.

Se mezclaron fagos derivados de pMorphX7-hag2-LHC y pMorphX7-MacI-5-LHC en proporciones de 1:10^{5} (cribado de pMorphX7-hag2-LHC) así como 10^{5}:1 (cribado de pMorphX7-MacI-5-LHC). Se realizaron tres series de cribado sobre el antígeno específico hag2 y MacI-5, respectivamente. Los fagos se prepararon mediante los procedimientos convencionales y se bloquearon previamente mediante la mezcla 1:1 con PBSTM (PBS, leche descremada en polvo al 5%, Tween 20 al 0,1%) e incubación durante 2 h a TA (temperatura ambiente). Se recubrieron los pocillos de microtitulación Nunc (nº442404) con antígeno específico N1-hag (así como BSA) a una concentración de 5 \mug/pocillo en PBS durante la noche a 4ºC, y posteriormente se bloquearon con 400 \mul de PBSM (PBS, leche descremada en polvo al 5%) durante 2 h a TA. Durante la primera serie, se aplicaron 10^{11} fagos bloqueados previamente por pocillo y se incubaron durante 1 h a TA sobre un agitador de placas de microtitulación. Se retiró la disolución de fago y los pocillos se lavaron 3 veces con PBST (PBS, Tween 20 al 0,05%) y 3 veces con PBS. Se eluyeron los fagos unidos con trietilamina 100 mM según los protocolos convencionales y se usaron para la infección de células TG1. Además, los fagos residuales se eluyeron mediante infección directa de las TG1 añadidas a los pocillos. Tras cada serie de cribado sobre el antígeno específico, se determinó la proporción de fagos específicos con respecto inespecíficos mediante el análisis de al menos 46 células infectadas independientes mediante PCR. La PCR se realizó según los protocolos convencionales usando colonias simples como fuente de molde y oligonucleótidos específicos para VH CDR3 y VL CDR3 de cada scFv como cebadores. Tras 3 series de cribado, se obtuvieron \sim4% de clones positivos (4 de 93 clones analizados) para el cribado de pMorphX7-hag2-LHC y se obtuvieron \sim90% de clones positivos (82 de 91 clones analizados) para el cribado de pMorphX7-MacI-5-LHC.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 2 Presentación de (poli)péptidos/proteínas en la superficie de partículas de bacteriófago filamentoso modificados mediante ingeniería

Ejemplo 2.1

Presentación de scFv

El ejemplo 1 descrito anteriormente muestra que pueden presentarse scFv funcionales sobre fagos no modificados mediante ingeniería a través de enlaces disulfuro. Este sistema puede mejorarse adicionalmente, por ejemplo, a través de modificación mediante ingeniería de una cisteína expuesta sobre una proteína de recubrimiento de fago. Una proteína de recubrimiento de fago candidato es la proteína III (pIII) que se compone de tres dominios N1, N2 y pIIICT. Posibles sitios para ubicar un residuo de cisteína impar son las regiones ligadoras entre los dominios o el N-terminal expuesto del dominio o la pIIICT en una versión de pIII truncada. Un ejemplo adicional sería una proteína IX de recubrimiento de fago (pIX) en la que la cisteína podría, ligarse, por ejemplo, al N-terminal de la proteína de longitud total. En principio, los casetes para la expresión de tales proteínas modificadas pueden colocarse en el vector que está proporcionando el scFv (sistema de un vector), o un vector separado (sistema de dos vectores).

A continuación, se describirán los experimentos en los que se modificaron mediante ingeniería tanto una versión de pIII de longitud total, como truncada, así como de pIX. Estas proteínas se expresaron conjuntamente en la misma célula bacteriana junto con el scFv, bien a partir del mismo fagémido (derivados de pMorph18-C-gIII-scFv-LHC; sistema de un vector) o bien a partir de un plásmido independiente (pBR322-C-g III o pUC19-C-g III y derivados; sistema de dos vectores).

Construcción de vectores que expresan scFv y proteínas de recubrimiento de fago modificadas mediante ingeniería

Los casetes de expresión de proteína de recubrimiento de fago para el sistema de dos vectores se construyeron como sigue: se elaboraron dos casetes de expresión diferentes flanqueados por sitios de restricción únicos NheI y HindIII en los extremos ubicando un residuo de cisteína impar en el N-terminal expuesto del dominio N1 de la pIII (C-gIII) madura de longitud total o en el N-terminal del dominio pIIICT de la proteína truncada (aminoácidos 216 a 406 de la proteína pIII; C-gIIICT) (figura 6 b+c)). Ambos casetes de expresión se encuentran bajo el control de la región del operador/promotor lac y comprenden la secuencia señal ompA, aminoácidos DYCDIEF y la pIII o pIIICT ORF (las secuencias de aminoácidos completas se dan en la tabla 3). Se obtuvieron plásmidos que expresan las proteínas pIII modificadas insertando estos casetes de NheI-HindIII en el plásmido pBR322 y pUC19 mediante los sitios únicos NheI y HindIII o XbaI y HindIII, respectivamente. Como ejemplo, el mapa del vector de pBR-C-gIII se representa en la figura 6a. Los plásmidos resultantes, pBR-C-gIII, pBR-C-gIIICT, pUC-C-gIII y pUC-C-gIIICT, se transformaron conjuntamente con fagémidos de pMorphX7-LHC que expresaban el scFv modificado (ejemplo 1) en E.coli TG1 seleccionando para ambos marcadores de antibiótico.

En el sistema de un vector tanto las proteínas de recubrimiento de fago modificadas así como el scFv modificado se expresaron a partir de un fagémido dicistrónico bajo el control de la región de operador/promotor lac. El primer casete de expresión comprende la secuencia señal ompA, los aminoácidos DYCDIEF y el ORF para la proteína de recubrimiento de fago respectiva o una parte de la misma. El residuo de cisteína impar se unió al N-terminal expuesto del dominio N1 de la pIII madura de longitud total (C-gIII), al N-terminal de la proteína III truncada (aminoácidos 216 a 406 de proteína p III; C-gIIICT) y al N-terminal de proteína IX (C-gIX), respectivamente (las secuencias de aminoácido se dan en la tabla 4). El segundo casete de expresión comprende la secuencia señal phoA, el ORF del scFv respectivo, un ligador corto (PGGSG), una etiqueta de 6x histidina (6His; Hochuli et al., 1988) y el residuo de cisteína simple (véase pMorphX7-LHC, tabla 1). La secuencia del vector completa de pMorph18-C-gIII-hag2-LHC que codifica para la pIII de longitud total modificada, así como hag2 de scFv modificado y el mapa del vector respectivo se dan en la figura 7 a+b. Las proteínas de recubrimiento de fago diferentes pueden intercambiarse mediante EcoRI y StuI en un procedimiento de clonación de tres fragmentos debido a un segundo sitio EcoRI en el extremo 3' de los scFv. Los diferentes scFv modificados mediante ingeniería pueden clonarse mediante los sitios únicos MfeI y HindIII. Un derivado de este vector, pMorph20-C-gIII-hag2-LHC, contiene un sitio único EcoRI en el extremo 3' del scFv mientras que el segundo sitio (entre la secuencia señal ompA y el ORF de gIII) se sometió a deleción mediante mutagénesis silenciosa en PCR. Este constructo permite la clonación de scFv o agrupaciones scFv mediante los sitios únicos SphI y EcoRI.

Unión de scFv a proteínas de recubrimiento de fago mediante enlaces disulfuro

Pueden producirse fagos para aplicaciones de cribado biológico usando el fago auxiliar VCSM13 siguiendo los protocolos convencionales (Kay et al., 1996). Además de la proteínas de fago auxiliares, se expresaron conjuntamente proteína de recubrimiento de fago modificado mediante ingeniería y scFv modificado soluble a partir de los sistemas de un o de dos vectores descritos anteriormente. Para demostrar que los scFv se unen a las proteínas de fago de recubrimiento modificado mediante ingeniería a través de puentes disulfuro y se incorporan en partículas de fago, se corrieron fagos que presentaban scFv en SDS PAGE en condiciones no reductoras y reductoras. Se realizó un análisis de inmunotransferencia de tipo Western con antisueros anti-pIII y anti-Flag M1.

Se produjeron fagos según procedimientos convencionales usando fago auxiliar VCSM13 (Kay et al., 1996). Se incubaron previamente fagos en PBS con DTT 5 mM o sin DTT (condiciones reductoras y no reductoras, respectivamente) durante 30 minutos a temperatura ambiente antes de añadir tampón de carga de SDS sin agentes reductores tales como DTT o \beta-mercaptoetanol. Se corrieron 1-5 x 10^{10} fagos por carril en un SDS PAGE al 4-15% (BioRad) y se sometieron a inmunotransferencia sobre membranas de PVDF. Para la inmunotransferencia de tipo Western anti-pIII, la membrana se bloqueó en MPBST (tampón PBS que contenía leche en polvo al 5% y Tween 20 al 0,05%) y se reveló con anti-pIII de ratón (dilución 1:250; Mobitec) como anticuerpo primario, conjugado de anti-ratón-IgG-AP (dilución 1:10000; SIGMA) como anticuerpo secundario y comprimidos de BCIP/NPT (SIGMA) como sustrato. Para la inmunotransferencia de tipo Western anti-Flag M1, la membrana se bloqueó en MTBST-CaCl_{2} (tampón TBS que contenía leche en polvo al 5%, Tween 20 al 0,05% y CaCl_{2} 1 Mm) y se reveló con anti-Flag M1 de ratón (dilución 1:5000; Sigma) como anticuerpo primario, conjugado de anti-ratón-IgG-AP (dilución 1:10000; SIGMA) como anticuerpo secundario y comprimidos de BCIP/NPT (SIGMA) como sustrato.

Las bandas específicas que migran a la altura esperada para el scFv unido a la pIII de longitud total podrían mostrarse tanto en el sistema de un vector, como en el de dos. Esta señal sólo puede observarse en condiciones no reductoras y desaparece con DTT indicando que pIII y scFv están unidos mediante enlaces disulfuro (scFv-S-S-pIII). Como ejemplo para el sistema de dos vectores, en la figura 8 se muestra una inmunotransferencia de tipo Western antiFlag M1 y anti-pIII para scFv MacI-5. Cuando se expresa el scFv sin cisteínas adicionales (pMorph7x-MacI-5-LH), únicamente puede detectarse scFv libre cohesionando a fagos en la inmunotransferencia de tipo Western anti-Flag M1 (carril, 8, figura 8A). Cuando se añade una cisteína adicional al scFv (pMorphX7-MacI-5-LHC), difícilmente pueden observarse esas bandas y aparece una banda que migra a la altura de los dímeros de scFv (scFv-S-S-scFv y/o (scFv-SH)_{2}) (y una banda adicional desconocida (scFv-S-SX)) (carril 7, figura 8A). Cuando los scFv modificados mediante ingeniería se expresan conjuntamente con una pIII modificada mediante ingeniería que contiene una cisteína adicional en el N-terminal (pMorphX7-MacI-5-LHC y pBR-C-gIII) las señales se desplazan hasta un peso molecular correspondiente a heterodímeros scFv-pIII (scFv-S-S-pIII) (carril 6, figura 8A). Tal como se esperó, esta señal de scFv-S-S-pIII no puede observarse cuando se expresan conjuntamente scFv no modificados con la pIII modificada (pMorphX7-MacI-5-LH y pBR-C-gIII), aunque en cada carril se cargan números de partículas de fagos similares (carril 5, figura 8A). En presencia de agentes reductores, las señales predominantes se obtienen a partir de scFv libres para todos los sistemas de expresión (carriles 1-4, figura 8A). En la inmunotransferencia de tipo Western anti-pIII, puede observarse proteína III libre (pIII-SH y/o pIII) para todos los sistemas de expresión tanto en condiciones reductoras, como no reductoras (carriles 1- 8, figura 8B). Las bandas específicas que migran a la altura esperada para dímeros de proteína II unidos por enlace disulfuro (pIII-S-S-pIII) únicamente pueden detectarse en condiciones no reductoras cuando se expresa la proteína III modificada (carriles 5 y 6 de la figura 8B). Únicamente cuando tanto el scFv modificado, mediante ingeniería como la proteína III modificada mediante ingeniería se expresan conjuntamente, aparece una banda adicional que migra a la altura de scFv y proteína III unidos por enlace disulfuro (scFv-S-S-pIII) además de los dímeros de proteína III unidos por enlaces disulfuro (carril 6, figura 8B). Esta banda corresponde en tamaño a la señal de scFv-S-S-pIII detectada en la inmunotransferencia de tipo Western anti-Flag M1 (véase el carril 6, figura 8A) y es sensible al DTT (véase el carril 2, figura 8A). Las bandas sensibles al DTT migran a la altura de scFv y proteína III unidos por enlace disulfuro, detectándose tanto con antisueros anti-Flag M1, como anti-pIII, y se observaron también cuando scFv modificado mediante ingeniería y pIII modificada mediante ingeniería se expresaron conjuntamente a partir del mismo fagémido (pMorph18-C-pIII-scFv-LHC). Como ejemplo de este sistema de un vector en las figuras 9A y 9B se muestran, respectivamente, inmunotransferencias de tipo Western anti-Flag M1 y anti-pIII para scFv hag2 e inmunotransferencias de tipo Western anti-pIII para scFv AB1.1 y MacI-5.

Funcionalidad de scFv presentados en fagos modificados

Para mostrar que los scFv presentados son funcionales con respecto al reconocimiento del antígeno específico, se realizaron ELISA del fago. Los análisis se realizaron para los HuCAL scFv MacI-5 y hag2. Para el sistema de dos vectores, pMorphX7-LHC se transformó conjuntamente con pBR-C-gIII, pBR-C-gIIICT, pUC-C-gIII y pUC-C-gIIICT, respectivamente. Se analizaron tres constructos de un vector diferentes, concretamente pMorph18-C-gIII-scFv-LHC, pMorph18-C-gIIICT-scFv-LHC y pMorph18-D-gIX-scFv-LHC. Para demostrar que los scFv se unen a las proteínas de recubrimiento de fago modificadas mediante ingeniería a través de enlaces disulfuro, se realizaron ELISA del fago tanto en condiciones reductoras, como no reductoras.

Se produjeron fagos según los procedimientos convencionales usando fago auxiliar VCSM13 y se determinaron las titulaciones del fago (Kay et al., 1996). Placas Nunc Maxisorp de microtitulación (nº 442404) se recubrieron con antígeno específico o antígeno de control (BSA, Sigma nº A7906) durante 12 horas a 4ºC en una cantidad de 5 \mug/pocillo en PBS y se bloquearon con PBS que contenía leche descremada en polvo al 5% durante 2 h. Los fagos se incubaron previamente en PBS que contenía 2,5% de leche descremada en polvo, Tween 20 al 0,05%, así como DTT 5 mM, si correspondía, durante 2 h a temperatura ambiente antes de aplicarse al pocillo de ELISA recubierto con antígeno a un intervalo de concentración de entre 6,4 x 10^{6} y 1 x 10^{11} fagos por pocillo. Tras la unión durante 1 h a TA, se eliminaron los fagos unidos de manera inespecífica mediante lavado con PBS que contenía Tween 20 al 0,05% y los fagos unidos se detectaron en ELISA usando un conjugado anti-M13-HRP (Amersham Pharmacia Biotech nº 27-9421-01) y azul BM soluble (Boehringer Mannheim nº 1484281). Se midió la absorbancia a 370 nm. Las señales de ELISA obtenidas con el antígeno específico se compararon con las del antígeno de control. Pudo mostrarse la unión específica de fagos que presentaban scFv al antígeno para los constructos de C-gIII, C-gIIICT y C-gIX en el formato de un vector. También se sometieron a prueba a C-gIII y C-gIIICT y, ambas, demostraron funcionar en sistemas de dos vectores. Como ejemplo, en las figuras 10-13, se presentan cuatro ELISA de este tipo para scFv MacI-5. En todos los casos en los que las proteínas de recubrimiento de fago se modifican mediante ingeniería con un residuo de cisteína adicional, las señales de ELISA aumentan significativamente en comparación con las señales de pMorphX7-LHC en las que sólo scFv lleva una cisteína adicional. Cuando se añadió DTT 5 mM a los fagos antes de la unión de antígeno durante la etapa de incubación previa, la señal de ELISA disminuyó hasta casi los niveles de fondo para los tres constructos de recubrimiento de fago modificados mediante ingeniería, así como los fagos pMorphX7-LHC no modificados mediante ingeniería, mientras que el DTT no tuvo un efecto muy importante sobre los fagos de presentación convencionales (pMorph13; figura 13). Esto muestra que tanto para los fagos modificados mediante ingeniería, como para los no modificados mediante ingeniería, los enlaces de disulfuro son esenciales para la presentación funcional de scFv en fagos y, por tanto, para la unión específica de fagos que presentan scFv al
antígeno.

Enriquecimiento de fagos modificados que presentan scFv en experimentos de "biblioteca dopada"

Para demostrar que fagos no modificados mediante ingeniería que presentan scFv pueden enriquecerse sobre antígeno específico, se realizó un experimento de "biblioteca dopada": se mezclaron fagos específicos con un elevado exceso de fagos inespecíficos y se realizaron tres series de cribado sobre antígeno específico. Se determinó el enriquecimiento para fagos específicos tras cada serie. El análisis se realizó para los dos HuCAL scFv hag2 y MacI-5 en el sistema de un vector pMorph18-C-gIII-scFv-LHC.

Se mezclaron los fagos derivados de pMorph18-C-gIII-hag2-LHC y pMorph18-C-gIII-MacI-5-LHC en proporciones de 1:10^{5} (cribado de pMorph18-C-gIII-hag2-LHC) así como 10^{5}:1 (cribado de pMorph18-C-gIII-MacI-5-LHC). Se realizaron tres series de cribado sobre el antígeno específico hag2 y MacI-5, respectivamente. Los fagos se prepararon mediante los procedimientos convencionales y se bloquearon previamente mediante la mezcla 1:1 con PBSTM (PBS, leche descremada en polvo al 5%, Tween 20 al 0,1%) e incubación durante 2 h a TA. Se recubrieron pocillos de microtitulación Nunc Maxisorp (nº442404) con antígeno específico (así como BSA) a una concentración de 5 \mug/pocillo en PBS durante una noche a 4ºC, y posteriormente se bloquearon con 400 \mul de PBSM (PBS, leche descremada en polvo al 5%) durante 2 h a TA. Durante la primera serie, se aplicaron 10^{11} fagos bloqueados previamente por pocillo y se incubaron durante 1 h a TA sobre un agitador de placas de microtitulación. Se retiró la disolución de fago y los pocillos se lavaron 3 veces con PBST (PBS, Tween 20 al 0,05%) y 3 veces con PBS. Se eluyeron los fagos unidos con trietilamina 100 mM según los protocolos convencionales y se usaron para la infección de células TG1. Además, los fagos residuales se eluyeron mediante infección directa de las células TG1 añadidas a los pocillos. Tras cada serie de cribado sobre antígeno específico, se determinó la proporción de fagos específicos con respecto a inespecíficos mediante el análisis de al menos 91 células infectadas independientes mediante PCR. La PCR se realizó según los protocolos convencionales usando colonias simples como fuente de molde y oligonucleótidos específicos para VH CDR3 y VL CDR3 de cada scFv como cebadores. Tras 2 series de cribado, se obtuvieron \sim0% de clones positivos (0 de 93 clones analizados) para el cribado de pMorph18-C-gIII-hag2-LHC y se obtuvieron \sim3% de clones positivos (3 de 91 clones analizados) para el cribado de pMorph18-C-gIII-MacI-5-LHC. Tras 3 series de cribado, los clones específicos se enriquecieron hasta \sim79% (92 de 117 clones analizados) para el cribado de pMorph18-C-gIII-hag2-LHC y hasta \sim100% (229 de 229 clones analizados) para el cribado de pMorph18-C-gIII-MacI-5-LHC.

Enriquecimiento de fagos modificados que presentan scFv en cribados de agrupaciones preseleccionadas

Para demostrar que pueden seleccionarse fagos modificados mediante ingeniería que presentan scFv de una agrupación diversa, se realizaron cribados de bibliotecas preseleccionadas. Las agrupaciones tras una serie de cribado convencional, se sometieron a subclonaciones en el formato de un vector modificado mediante ingeniería y el cribado se continuó hasta tres series más (cribados de presentación-cys).

Se realizaron cribados frente a los siguientes antígenos: (i) ICAM1 que comprende la parte extracelular de ICAM1 maduro (aminoácidos 1-454) más aminoácidos CGRDYKDDDK HHHHHH que contiene la M2-Flag y la etiqueta de 6 x histidina. (ii) N1-MacI que comprende los aa 1-82 de la proteína del gen III de fago M13 que contiene un residuo de metionina adicional en el N-terminal más un ligador corto en el C-terminal (N1), fusionado a un polipéptido que contiene los aminoácidos 149-353 de la cadena alfa CR-3 humano (SWISS-PROT entrada P11215) más la secuencia C-terminal IEGRHHHHHH que incluye la etiqueta de 6x histidina; y (iii) N1-Np50 que comprende N1 fusionado a un polipéptido que contiene los aminoácidos 2-366 de NF\kappaB p50 más los aminoácidos EFSHHHHHH que incluye la etiqueta 6x histidina. Los vectores de expresión para N1-MacI y N1-Np50 se basan en el vector pTFT74 (Freund et al., 1993) (la secuencia del vector completa de pTFT74-N1-hag-HIPM se da en la figura 2). La expresión, la purificación y el replegamiento se realizó tal como se describió (Krebber, 1996; Krebber et al., 1997).

Inicialmente, se realizó una serie de cribado convencional de la biblioteca de anticuerpo HuCAL-scFv (documento WO 97/08320; Knappik et al., 2000) según los protocolos convencionales. Brevemente se recubrieron placas de microtitulación Maxisorp (Nunc; nº442404) con el antígeno respectivo disuelto en PBS y se bloquearon con leche en polvo descremada al 5% en PBS. Se añadieron 1-5 x 10^{12} fago de HuCAL scFv durante 1 h a 20ºC. Tras varias etapas de lavado con PBST (PBS, Tween 20 al 0,05%) y PBS, se eluyeron los fagos unidos con trietilamina 100 mM o glicina 100 mM pH 2,2, se neutralizaron inmediatamente con Tris/HCl 1 M pH 7,0 y se usaron para la infección de células TG1. Adicionalmente, se eluyeron los fagos residuales mediante infección directa de células TG1 añadidas a los pocillos. Los cribados frente a N1-Np50 usaron la biblioteca de HuCAL-scFv completa (agrupaciones \kappa y \lambda combinadas), en los cribados frente a N1-MacI, las agrupaciones de cadena ligera \lambda y \kappa se mantuvieron separadas. Frente a ICAM1 se realizó una serie de cribado convencional de la parte de la cadena ligera \lambda de HuCAL-scFv y posteriormente de las cadenas pesadas seleccionadas combinadas con la biblioteca completa de las cadenas ligera \lambda. La biblioteca optimizada en las cadenas ligeras resultante presentó una diversidad de 1,4 x 10^{7}.

Los scFv de las agrupaciones respectivas se sometieron a subclonación en el vector pMorph20-C-gIII-scFv-LHC (formato de un vector) mediante los sitios únicos SphI y EcoRI. Posteriormente, se realizaron tres series de cribado de presentación-cys. Los fagos se prepararon mediante los procedimientos convencionales y se bloquearon previamente mediante la mezcla 1:1 con PBSTM (PBS, leche descremada en polvo al 5%, Tween 20 al 0,1%) e incubación durante 2 h a TA. Se recubrieron los pocillos de una placa Nunc Maxisorp (nº442404) con antígenos específicos a una concentración de 5 \mug/pocillo en PBS durante una noche a 4ºC, y posteriormente se bloquearon con 400 \mul de PBSM (PBS, leche descremada en polvo al 5%) durante 2 h a TA. Para cada serie de cribado de presentación-cys, se aplicaron entre 1 x 10^{10} y 4,5 x 10^{11} fagos bloqueados previamente por pocillo y se incubaron durante 1 h a TA sobre un agitador de placas de microtitulación. Se retiró la disolución del fago y los pocillos se lavaron con PBST (PBS, Tween 20 al 0,05%) y PBS con unas condiciones de rigurosidad crecientes. La 1ª serie se lavó 3 veces rápido y 2 veces durante 5 min con PBST y PBS, respectivamente, la 2ª serie 1 vez rápido y 4 veces durante 5 min con PBST y PBS, respectivamente, y la 3ª serie 10 veces rápido y 5 veces durante 5 min con PBST y PBS, respectivamente. Se eluyeron los fagos unidos con trietilamina 100 mM según los protocolos convencionales y se usaron para la infección de células TG1. Además, los fagos residuales se eluyeron mediante infección directa de las células TG1 añadidas a los
pocillos.

Tras cada serie de cribado, se determinó el número de fagos específicos de antígeno en un ELISA. N1-MacI, N1-Np50 e ICAM-Strep (que comprende aminoácidos 1-455 de ICAM1 maduro más SAWAHPQFEK que contiene la etiqueta Strep II) se usaron como antígenos respectivamente. Para garantizar una expresión de nivel elevado los scFv seleccionados se sometieron a subclonación en el vector de expresión pMorphX7-FS (tabla 1). La subclonación se realizó en dos etapas. En primer lugar se aislaron los fragmentos scFv de pMorph20-C-gIII-scFv-LHC mediante AflII y EcoRI, a continuación los fragmentos se volvieron a digerir con SphI y se clonaron en el vector pMorphX7-FS digerido con EcoRI/SphI. Este procedimiento garantizó que sólo se sometieran a subclonación los scFv del vector pMorph20-C-gIII-scFv-LHC y se excluyera cualquier contaminación con scFv de un vector de expresión o presentación convencional. La expresión de los scFv y su sometimiento a prueba en ELISA frente a los antígenos respectivos se realizó según los procedimientos convencionales. Los clones que mostraron una señal de al menos 3 veces por encima de los valores de fondo en el ELISA se consideraron positivos. Los resultados se resumen en la tabla 5. Para demostrar que los scFv seleccionados se unen de manera fuerte y específica a su antígeno respectivo, se seleccionaron varios clones positivos tras 2 series de cribado de presentación-cys y se volvieron a someter a prueba por cuadruplicado en un ELISA de especificidad sobre seis antígenos diferentes (figuras 14 y 15). Puede demostrarse claramente el enriquecimiento de los agentes de unión específicos de antígeno. Ya después de dos series de cribado de presentación-cys de las agrupaciones preseleccionadas frente a N1-MacI, N1-Np50 e ICAM1, entre el 80% y el 97% de los clones sometidos a prueba fueron positivos en ELISA. La afinidad de algunos de los scFv seleccionados se determinó en valores de Kd y Biacore en el intervalo de 1 nM a 2,2 \muM. Los resultados son similares a los factores de enriquecimiento y afinidades obtenidas en un cribado convencional de las agrupaciones respectivas realizadas en paralelo. Algunos de los scFv se seleccionaron independientemente mediante presentación-cys, así como cribado convencional.

Elución de fagos modificados mediante ingeniería que presentan scFv mediante agentes reductores

A la hora de detectar bibliotecas de presentación de fago en el cribado biológico el problema sigue siendo cómo recuperar mejor los fagos que se han unido a la diana deseada. Normalmente, esto se logra mediante la elución con tampones apropiados, o bien usando un gradiente de pH o de sal, o bien mediante la elución específica usando una diana soluble. Sin embargo, los agentes de unión más interesantes que se unen con gran afinidad a la diana podrían perderse mediante ese enfoque. Una opción con fagos de presentación-cys modificados mediante ingeniería es que los complejos de bacteriófagos específicos y de diana puedan tratarse con agentes reductores, por ejemplo, mediante incubación con DTT, para escindir el enlace disulfuro entre scFv y la proteína de recubrimiento de fago y para recuperar las partículas de bacteriófago específicas.

Los cribados de las agrupaciones preseleccionadas frente a N1-Mac1 se realizaron según el protocolo descrito anteriormente. Los fagos se eluyeron bien según el protocolo convencional con trietilamina 100 mM y una infección directa de células TG1 mediante fagos residuales, o mediante incubación de los pocillos con DTT 20 mM en tampón Tris pH 8,0 durante 10 min. Tras cada serie de cribado la agrupación de scFv seleccionados se sometió a subclonación en el vector de expresión pMorphX7-FS según el procedimiento de dos etapas descrito anteriormente, y se determinó el número de scFv específicos de N1-MacI en ELISA. Para demostrar que los scFv seleccionados se unen de manera fuerte y específica a su antígeno respectivo, se seleccionaron varios clones positivos y se volvieron a someter a prueba por triplicado en un ELISA de especificidad. Puede demostrarse claramente el enriquecimiento de agentes de unión específicos de antígeno para ambos procedimientos de elución. Tras dos ciclos de cribado de la agrupación-\kappa MacI y la agrupación-\lambda MacI se obtuvo un número de clones positivos a ELISA dos veces y cinco veces superior para la elución con agentes reductores, en comparación con la elución convencional.

Ejemplo 2.2

Presentación de Fab

El ejemplo 2.1 muestra que los fragmentos de cadena sencilla funcionales pueden presentarse en fagos modificados mediante ingeniería a través de enlaces disulfuro. A continuación, se describirán experimentos que muestran que esto mismo es verdad para los Fab. La cisteína se modificó mediante ingeniería en diferentes posiciones del fragmento de anticuerpo Fab. Estos Fab se expresan conjuntamente en la misma célula bacteriana junto con la pIII de longitud completa basándose en un sistema de dos vectores.

Construcción de vectores que expresan Fab y pIII modificada mediante ingeniería

Se expresaron cadenas pesadas y ligeras del fragmento Fab a partir de un fagémido dicistrónico bajo el control de la región del operador/promotor lac. El primer casete de expresión comprende la secuencia señal ompA y el dominio variable y constante de la cadena ligera, el segundo casete de expresión comprende la secuencia señal phoA y el dominio variable y constante de la cadena pesada. La cadena pesada y ligera no se unen mediante un enlace disulfuro. Los módulos que contienen la cisteína modificada mediante ingeniería se ubican en el C-terminal de o bien la cadena ligera, o bien la pesada. Se compararon varios constructos que diferían en la composición de aminoácido de los módulos y se resumen en la tabla 6. Como ejemplo, en la figura 16 a+b se dan la secuencia del vector completa de pMorphX10-Fab-VL-LHC-VH-FS que codifica para el Fab MacI-5 modificado y el mapa del vector respectivo.

Se usaron dos plásmidos diferentes para la expresión de pIII de longitud completa. El plásmido pBR-C-gIII ya se ha descrito anteriormente. El casete de expresión respectivo comprende la secuencia señal ompA, los aminoácidos DYCDIEF y el ORF de pIII bajo el control de la región de operador/promotor de la lactosa (tabla 3, figura 6). Alternativamente, se usó el plásmido pBAD-SS-C-gIII. Aquí el casete de expresión respectivo comprende la secuencia señal de pIII, aminoácidos TMACDIEF y el ORF de pIII bajo el control de la región de operador/promotor de la arabinosa (tabla 3). Para la construcción de pBAD-SS-C-gIII, se amplificó el fragmento que codifica para la cisteína modificada por ingeniería más pIII a partir de pUC-C-gIII mediante PCR introduciendo los sitios de restricción NcoI y HindIII y se clonó en el vector comercialmente disponible pBAD/gIII A (Invitrogen). Los plásmidos pBR-C-gIII o pBAD-SS-C-gIII se transformaron conjuntamente con los fagémidos de pMorphX10-Fab respectivos que expresan la Fab modificada en E. coli TG1 seleccionando para ambos marcadores de antibiótico.

Descripción de las interacciones Fab - antígeno

Se usaron tres Fab diferentes, derivando todos de una biblioteca de anticuerpos combinatoria humana (HuCAL; documento WO 97/08320; Knappik et al., 2000) para la evaluación de una presentación de Fab sobre fago modificado mediante ingeniería. Los genes consenso HuCAL VH y VL (descritos en el documento WO 97/08320), y las secuencias CDR3 de los Fab se dan en la tabla 2. El Fab MacI-5 se deriva de scFv MacI-5 descrito anteriormente y se convirtió en el formato Fab (en la figura 16a se da el mapa del vector completo de pMorphX10-Fab-MacI5-VL-LHC-VH-FS). Los Fab MacI-A8 e ICAM1-C8 se aislaron directamente a partir de una de las bibliotecas HuCAL-Fab. Se seleccionó el clon MacI-A8 frente al antígeno MacI-Strep, que comprende una metionina N-terminal, los aminoácidos 149-353 de cadena alfa de CR-3 humano (SWISS-PROT entrada P11215) y los aminoácidos SAWSHPQFEK que incluyen la etiqueta Strep II (Schmidt et al., 1996). La expresión y la purificación se realizaron según Schmidt y Skerra (1994). Se usó N1-MacI como antígeno correspondiente para ELISA. N1-MacI se describió anteriormente, y comprende una metionina N-terminal, los aminoácidos 1-82 de la proteína del gen III madura del fago M13 más un ligador corto (N1), los aminoácidos 149-353 de cadena alfa CR-3 humano (SWISS-PROT entrada P11215) y aminoácidos IEGRHHHHHH que incluyen la etiqueta de 6x histidina. Se seleccionó el clon ICAM1-C8 frente al antígeno ICAM1 descrito anteriormente, que comprende la parte extracelular de ICAM1 maduro (aminoácidos 1-454) más aminoácidos CGRDYKDDDK HHHHHH que contienen el M2-Flag y las etiquetas de 6x histidina. Se usó el mismo antígeno para ensayos de ELISA así como en el experimento de la biblioteca dopada.

Unión de Fab a proteínas de recubrimiento de fago mediante enlaces disulfuro

Para demostrar que los Fab se unen a pIII mediante puentes disulfuro y se incorporan en partículas de fago, se corrieron los fagos respectivos en SDS PAGE en condiciones no reductoras y reductoras. Se realizaron análisis de inmunotransferencia de tipo Western con anticuerpos que detectan la pIII, la cadena pesada, la cadena ligera lambda y la cadena ligera kappa, respectivamente. Todos los constructos descritos en la tabla 6 se analizaron y los resultados se muestran para pMorhX10-ICAM1C8-VL-LHC-VH-FS más pBAD-SS-C-gIII y pMorhX10-macIA8-VL-LHC-VH-MS más pBAD-SS-C-gIII como ejemplo en las figuras 17 y 18.

Se produjeron fagos usando fago auxiliar VCSM13 siguiendo protocolos convencionales (Kay et al., 1996). Adicionalmente a las proteínas de fago auxiliares, la proteína de recubrimiento de fago modificado mediante ingeniería y Fab modificado soluble se expresaron conjuntamente a partir del sistema de dos vectores. Se incubaron previamente fagos en PBS con o sin DTT 20 mM (condiciones reductoras y no reductoras, respectivamente) durante 1 h a temperatura ambiente antes de añadir tampón de carga de SDS sin agentes reductores tales como DTT o \beta-mercaptoetanol. Se corrieron 1 x 10^{10} fagos por carril en un SDS PAGE al 12% (BioRad) y se sometieron a inmunotransferencia sobre membranas de nitrocelulosa (Schleicher y Schuell). Para la inmunotransferencia de tipo Western anti-pIII, la membrana se bloqueó en MTBST (tampón Tris 50 mM pH 7,4, que contenía leche en polvo al 5% y Tween 20 al 0,05%) y se reveló con ratón anti-pIII (dilución 1:250; Mobitec) como anticuerpo primario, conjugado anti-ratón-IgG-HRP (dilución 1:5000; SIGMA) como anticuerpo secundario y azul BM para POD (peroxidasa) precipitante (Roche nº1442066) como sustrato. Para la detección de la cadena pesada, la cadena ligera kappa y la ligera lambda se usaron, respectivamente, los anticuerpos primarios anti-Fd (dilución 1:5000; el sitio de unión PC075), anti-kappa humana (dilución 1:5000; Sigma K4377) y anti-lambda humana (dilución 1:500, Sigma L-6522).

En las inmunotransferencias de tipo Western anti-pIII, pudo detectarse proteína III libre (SH-pIII y/o pIII) para todos los sistemas de expresión tanto en condiciones reductoras, como no reductoras (figuras 17 y 18). Cuando se expresan conjuntamente tanto Fab modificado mediante ingeniería, como proteína III modificada mediante ingeniería una señal que migra a la altura de un heterodímero de cadena ligera y proteína III (VL-CL-SS-pIII) aparece en condiciones no reductoras. Adicionalmente, puede observarse una banda que migra a la altura esperada para dímeros de proteína III unida por enlace disulfuro (pIII-SS-pIII) (carriles 11 y 12, figuras 17, 18). Tanto los hetero-, como los homodímeros desaparecen cuando las muestras se tratan con DTT (carriles 5 y 6, figuras 17 y 18), o cuando se expresan conjuntamente Fab modificados mediante ingeniería con pIII no modificada mediante ingeniería (carriles 3, 4, 9 y 10, figuras 17 y 18). El heterodímero en este caso de cadena ligera unida a la pIII de cadena total también pudo detectarse con los anticuerpos anti-cadena ligera en geles no reductores, pero estuvo ausente en condiciones reductoras. Adicionalmente, pudo detectarse una banda que migra a la altura esperada para el homodímero de la cadena ligera (VL-CL-SS-VL-CL) (datos no mostrados). Se obtuvieron resultados similares para todos los constructos descritos en la tabla 6, y no se detectaron diferencias significativas entre los vectores pBR-C-gIII y pBAD-SS-C-gIII para el suministro de pIII modificada por ingeniería (datos no mostrados).

Funcionalidad de Fab presentados en fagos modificados mediante ingeniería

Para mostrar que los Fab presentados son funcionales con respecto al reconocimiento del antígeno específico, se realizaron ELISA de fago. Los análisis se realizaron para los HuCAL Fab MacI-5, MacI-A8 y ICAM1-C8. Se compararon todos los formatos que diferían en la posición de la cisteína en Fab (tabla 6). Para demostrar que los Fab se unen a las proteínas de recubrimiento de fago modificadas mediante ingeniería mediante enlaces de disulfuro, se realizaron ELISA de fago tanto en condiciones reductoras, como no reductoras.

Se transformaron conjuntamente los fagémidos respectivos que expresaban el Fab modificado con pBR-C-gIII y se realizó la producción de fago en condiciones convencionales (Kay et al., 1996). Los fagos de presentación de Fab convencionales (pMorph18-Fab) sirvieron como control positivo, un vector de expresión de fagémido para la expresión de Fab no modificado mediante ingeniería (pMorphX9-Fab-FS) sirvió como control negativo. Placas Nunc Maxisorp de microtitulación (nº 442404) se recubrieron con antígeno específico o antígeno de control (BSA, Sigma nº A7906) durante 12 horas a 4ºC en una cantidad de 5 \mug/pocillo en PBS y se bloquearon con PBS que contenía leche descremada en polvo al 5%, Tween 20 al 0,05% durante 1 h. Los fagos se incubaron previamente en PBS que contenía leche descremada en polvo al 5%, Tween 20 al 0,05%, y DTT 10 mM, si correspondía, durante 1 h a temperatura ambiente antes de aplicarse al pocillo de ELISA recubierto con antígeno a un intervalo de concentración de entre 1 x 10^{8} y 1 x 10^{10} fagos por pocillo. Tras unir durante 1 h a TA, se eliminaron fagos unidos de manera inespecífica mediante lavado con PBS que contenía Tween 20 al 0,05% y PBS. Los fagos unidos se detectaron en ELISA usando un conjugado anti-M13-HRP (Amersham Pharmacia Biotech nº 27-9421-01) y azul soluble BM (Roche nº 1484281). Se midió la absorbancia a 370 nm. Las señales de ELISA obtenidas con el antígeno específico se compararon con las del control. Se analizaron hasta tres preparaciones de fago independientes y en las figuras 19 a 22 se facilitan los valores medios.

Pudo demostrarse la unión específica de fagos que presentaban Fab al antígeno para todos los formatos de dos vectores diferentes (figuras 19-21, carriles 1-4). Para Fab MacI-5 no se detectaron diferencias significativas entre los cuatro formatos (figura 19), mientras que el constructo pMorphX10-Fab-VL-LHC-VH-FS mostró de manera reproducible los mejores resultados para Fab MacI-A8 e ICAM1-C8 (figuras 20 y 21). Cuando se añadió DTT 10 mM a los fagos antes de la unión de antígeno durante la etapa de incubación previa, la señal de ELISA disminuyó hasta casi los niveles de fondo para todos los fagos de presentación-cys, mientras que el DTT no tuvo un efecto principal sobre los fagos de presentación convencionales (pMorph18-Fab) (mostrado para Fab MacI-5 en la figura 22). Esto muestra que los enlaces de disulfuro son esenciales para la presentación funcional de Fab en fagos y, por tanto, para la unión específica de fagos que presentan Fab al antígeno.

Enriquecimiento de fagos modificados mediante ingeniería que presentan Fab en experimentos de biblioteca dopada

Para demostrar que fagos modificados mediante ingeniería que presentan Fab pueden enriquecerse sobre antígeno específico, se realizó un experimento de "biblioteca dopada": se mezclaron fagos específicos con un elevado exceso de fagos inespecíficos y se realizaron tres ciclos de cribado sobre antígeno específico. Se determinó el enriquecimiento para fagos específicos tras cada ciclo. El análisis se realizó para HuCAL Fab ICAM1-C8 en el sistema de dos vectores pMorphX10-Fab-VL-LHC-VH-FS más pBAD-SS-C-gIII.

Se mezclaron fagos modificados mediante ingeniería que presentaban ICAM1-C8 y MacI-A8 en proporciones de 1:10^{5}. Se realizaron tres ciclos de cribado sobre el antígeno ICAM1. Los fagos se prepararon mediante procedimientos convencionales y se bloquearon previamente mediante mezcla 1:1 con PBSTM (PBS, leche descremada en polvo al 5%, Tween 20 al 0,1%) y se incubaron durante 2 h a TA. Se recubrieron pocillos de una placa Maxisorp Nunc (nº442404) con antígeno específico a una concentración de 5 \mug/pocillo en PBS durante una noche a 4ºC, y posteriormente se bloquearon con 400 \mul de PBSM (PBS, leche descremada en polvo al 5%) durante 2 h a TA. Durante el primer ciclo, se aplicaron 10^{11} fagos bloqueados previamente por pocillo y se incubaron durante 1 h a TA sobre un agitador de placas de microtitulación. Se retiró la disolución de fago y los pocillos se lavaron 3 veces con PBST (PBS, Tween 20 al 0,05%, 1 vez rápido, 2 x 5 min) y 3 veces con PBS (1 vez rápido, 1 x 5 min). Se eluyeron los fagos unidos con trietilamina 100 mM según protocolos convencionales. Además, los fagos residuales se eluyeron mediante infección directa de las células añadidas a los pocillos. Como una infección directa de células TG1 que albergan pBAD-SS-C-gIII no fue lo suficientemente eficaz, se usaron fagos eluídos para la infección de células TG1, se amplificaron y a continuación se usaron para la infección de células TG1 que albergan pBAD-SS-C-gIII. Así se restauró el sistema de dos vectores y se realizó el siguiente ciclo de cribado. Aunque no se observaron diferencias entre los dos plásmidos para la expresión de pIII modificado mediante ingeniería (pBR-C-gIII y pBAD-SS-C-gIII) con respecto al ELISA de fago y WB (inmunotransferencia de tipo Western), la infección de las células TG1 que albergaban pBR-C-gIII no fue tan eficaz como la infección de células TG1 que albergaban pBAD-SS-C-gIII. Tras cada ciclo de cribado, se determinó la proporción de fagos específicos con respecto inespecíficos mediante el análisis de al menos 92 células infectadas independientes mediante PCR. La PCR se realizó según los protocolos convencionales usando colonias únicas como fuente de molde y oligonucleótidos específicos para la cadena ligera lambda (cebado en la región variable 4), la cadena ligera kappa (cebado en la región variable 3) y una secuencia vectorial en el sentido 5' del fragmento Fab (cebador M13-rev comercial, NEB) como cebadores. Se esperaban fragmentos de aproximadamente 420 pb de longitud para Fab lamda (IXCAM1-C8) y 290 pb para Fab kappa (MacI-A8). Tras 2 ciclos de cribado, se obtuvieron un 61% de clones positivos (57 de 93 clones analizados), que pudieron enriquecerse hasta el 100% (92 de 92 clones analizados) tras el tercer ciclo.

Bibliografía

Ausubel, F. M., Brent, R., Kingston, R. E., Moore, D. D., Sedman, J. G., Smith, J. A. & Struhl, K. eds. (1999). Current Protocols in Molecular Biology. New York: John Wiley and Sons.

Bass, S., Greene, R. & Wells, J.A. (1990) Hormone phage: an enrichment method for variant proteins with altered binding properties. Proteins: Structure, Function and Genetics 8, 309-314.

Bird, R.E., Hardman, K.D., Jacobson, J.W., Johnson, S., Kaufman, B.M., Lee S.M., Lee T., Pope S.H., Riordan G.S. & Whitlow M. (1988). Single-chain antigen-binding proteins [published erratum appears in (1989). Science 244, 409]. Science 242, 423-6.

Brinkmann, U., Reiter, Y., Jung, S., Lee, B. & Pastan, 1. (1993). A recombinant immunotoxin containing a disulfide-stabilized Fv fragment. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90, 7538-7542.

Crameri, R., & Suter, M. (1993). Display of biologically active proteins on the surface of filamentous phages: a cDNA cloning system for selection of functional gene products linked to the genetic information responsible for their production. Gene 137, 69-75.

Crissman, J. W. & Smith, G. P. (1984). Gene-III protein of filamentous phages: evidence for a carboxy-terminal domain with a role in morphogenesis. Virology 132, 445-455.

Dunn, l. S. 1996. Phage display of proteins. Curr. Opin. Biotechnol. 7: 547-553.

Freund, C., Ross, A., Guth, B., Plückthun, A. & Holak, T. A. (1993). Characterization of the linker peptide of the single-chain Fv fragment of an antibody by NMR spectroscopy. FEBS Lett. 320, 97-100.

Gao, C., Mao, S., Lo, C.-H. L., Wirsching, P., Lerner, R. A., & Janda, K. D. (1999). Making artificial antibodies: A format for phage display of combinatorial heterodimeric arrays. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96, 6025-6030.

Ge, L., Knappik, A., Pack, P., Freund, C. & Plückthun, A. (1995). Expressing antibodies in Escherichia coli. Antibody Engineering. A Practical Approach (Ed. C.A.K. Borrebaeck). IRL Press, Oxford, pp. 229-266.

Glockshuber, R., Malia, M., Pfitzinger, 1. & Plückthun, A. (1992). A comparison of strategies to stabilize immunoglobulin Fv-fragments. Biochemistry 29, 1362-1366.

Greenwood J., Willis A.E. & Perham R.N. (1991) Multiple display of foreign peptides on a filamentous bacteriophage. Peptides from Plasmodium falciparum circumsporozoite protein as antigens. J. Mol. Biol. 220, 821-827.

Hiatt, A. (1990). Antibodies produced in plants. Nature 344, 469-470.

Hiatt, A. & Ma, J.K. (1993). Characterization and applications of antibodies produced in plants. Int. Rev. Immunol. 10, 139-152.

Hochuli, E., Bannwarth, W., Dóbeli, H., Gentz, R. & Stüber, D. (1988). Genetic approach to facilitate purification of recombinant proteins with a novel metal chelate adsorbent. Bio/Technology 6, 1321-1325.

Hopp, T.P., Prickett, K.S., Price, V.L., Libby, R.T., March, C.J., Cerretti, D.P., Urdal, D.L. & Conlon, P.J. (1988). A short polypeptide marker sequence useful for recombinant protein identification and purification. Bio/
Technology 6, 1204-1210.

Horwitz, A. H., Chang, C. P., Better, M., Hellstrom, K. E. & Robinson, R. R. (1988). Secretion of functional antibody and Fab fragment from yeast cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85, 8678-8682.

Huston, J.S., Levinson, D., Mudgett-Hunter, M., Tai, M.S., Novotny, J., Margolies, M.N., Ridge, R.J., Bruccoleri, R.E., Haber, E. & Crea, R. (1988). Protein engineering of antibody binding sites. Recovery of specific activity in an anti-digoxin single-chain Fv analogue produced in Escherichia coli. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 85, 5879-5883.

Jespers L. S., Messens J. H., De Keyser A., Eeckhout D., Van d. B., I, Gansemans Y. G., Lauwereys M. J., Vlasuk G. P. & Stanssens P. E. (1995). Surface expression and ligand-based selection of cDNAs fused to filamentous phage gene VI. Biotechnology (N.Y.) 13, 378-382.

Kay, B. K., Winter, J. & McCafferty, J., eds. (1996). Phage display of peptides and proteins: a laboratory manual. Academic Press, Inc., San Diego.

Knappik, A. & Plückthun, A. (1994). An improved affinity tag based on the FLAG peptide for detection and purification of recombinant antibody fragments. BioTechniques 17, 754-761.

Knappik, A., Ge, L., Honegger, A., Pack, P., Fischer, M., Wellnhofer, G., Hoess, A., Wdlle, J., Plückthun, A. & Vimekás, B. (2000). Fully synthetic Human Combinatorial Antibody Libraries (HuCAL) based on modular consensus frameworks and CDRs randomized with trinucleotides. J. Mol. Biol. 296, 57-86.

Krebber, C. (1996). Selektiv infektiöse Phagen: In vivo Selektion auf Interaktionen zwischen Protein und Ligand. Dissertation at the University of Zurich.

Krebber, C., Spada, S., Desplancq, D., Krebber, A., Ge, L. & Plückthun, A. (1997). Selectively-infectioe phage (SIP): A mechanistic dissection of a novel in vivo selection for protein-ligand interactions. J. Mol. Biol. 268, 607-618.

Lindner, P., Guth, B., Wülfing, C., Krebber, C., Steipe, B., Müller, F. & Plückthun, A. (1992). Purification of native proteins from the cytoplasm and periplasm of Escherichia coli using IMAC and histidine tails: a comparison of proteins and protocols. Methods: A Companion to Methods Enzymol. 4, 41-56.

Maruyama I. N., Maruyama H. I. & Brenner S. (1994) Lambda foo: a lambda phage vector for the expression of foreign proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91, 8273-8277.

\newpage

McGregor, D. (1996). Selection of proteins and peptides from libraries displayed on filamentous bacteriophage. Mol. Biotechnol. 6: 155-162.

Mikawa Y. G., Maruyama I. N. & Brenner S. (1996). Surface display of proteins on bacteriophage lambda heads. J. Mol. Biol. 262, 21-30.

Model, P. & Russel, M. (1988). Filamentous bacteriophage. p 375-456. In R. Calendar (ed.), The bacteriophages, vol. 2, Plenum, New York, N.Y.

Nyyssönen, E., Penttila, M., Harkki, A., Saloheimo, A., Knowles, J. K. & Keranen, S. (1993). Efficient production of antibody fragments by the filamentous fungus Trichoderma reesei. Bio/Technology 11, 591-595.

Parmley S. F. & Smith G.P. (1988) Antibody-selectable filamentous fd phage vectors: affinity purification of target genes. Gene 73, 305-318.

Potter, K. N., Li, Y. & Capra, J. D. (1993). Antibody production in the baculovirus expression system. Int. Rev. Immunol. 10, 103-112.

Ridder, R., Schmitz, R., Legay, F. & Gram, H. (1995). Generation of rabbit monoclonal antibody fragments from a combinatorial phage display library and their production in the yeast Pichia pastoris. Bio/Technology 13, 255-260.

Riechmann, L. & Holliger, P. (1997). The C-terminal domain of TolA is the co-receptor for filamentous phage infection of E.coli. Cell 90, 351-360.

Sambrook, J., Fritsch, E. F. & Maniatis, T. (1989). Molecular Cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, USA.

Schmidt, T.G. & Skerra, A. (1994). One-step affinity purification of bacterially produced proteins by means of the "Strep tag" and immobilized recombinant core streptavidin. J. Chromatogr. A 676, 337-345.

Schmidt, T.G., Koepke, J., Frank, R., Skerra, A. (1996). Molecular interaction between the Strep-tag affinity peptide and its cognate target, streptavidin. J. Mol. Biol. 255, 753-766.

Skerra, A. & Plückthun, A. (1988). Assembly of a functional immunoglobulin Fv fragment in Escherichia coli. Science 240, 1038-1041.

Smith G. P. (1985). Filamentous fusion phage: novel expression vectors that display cloned antigens on the virion surface. Science 228, 1315-1317.

Stengele, L, Bross, P., Garcés, X., Giray, J. & Rasched, 1. (1990). Dissection of functional domains in phage fd adsorption protein. J. Mol. Biol. 212, 143-149.

Stemberg N. & Hoess R. H. (1995). Display of peptides and proteins on the surface of bacteriophage lambda. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92, 1609-1613.

Trill, J. J., Shatzman, A. R. & Ganguly, S. (1995). Production of monoclonal antibodies in COS and CHO cells. Curr. Opin. Biotechnol. 6, 553-560.

Ward, V. K., Kreissig, S. B., Hammock, B. D. & Choudary, P. V. (1995). Generation of an expression library in the baculovirus expression vector system. J. Virol. Methods 53, 263-272.

Whitelam, G. C., Cockbum, W. & Owen, M. R. (1994). Antibody production in transgenic plants. Biochem. Soc. Trans. 22, 940-944.

Wu, X. C., Ng, S. C., Near, R. 1. & Wong, S. L. (1993). Efficient production of a functional single-chain antidigoxin antibody via an engineered Bacillus subtilis expression-secretion system. Bio/Technology 11, 71-76.

TABLA 1 Secuencia de aminoácidos de módulos ORF entre los sitios EcoRI y HindIII de los vectores pMorphX7-hag2-FS, pMorphX7-hag2-LH, pMorphX7-hag2-LCH y pMorphX7-hag2-LHC

1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

TABLA 2 Secuencia de aminoácidos de HuCAL scFv y HuCAL Fab*

2

TABLA 3 Secuencia de aminoácidos de proteínas de recubrimiento de fago modificadas mediante ingeniería del vector pBR-C-gIII y derivados

3

La cisteína modificada mediante ingeniería se escribe en negrita

La secuencia de las proteínas de recubrimiento de fago de tipo natural está subrayada

TABLA 4 Secuencia de aminoácido de proteínas de recubrimiento de fago modificadas mediante ingeniería del vector pMorph18-C-gIII-scFv-LHC y derivados

4

La cisteína modificada mediante ingeniería se escribe en negrita

La secuencia de las proteínas de recubrimiento de fago de tipo natural está subrayada

TABLA 5 Cribado de presentación-cys de agrupaciones preseleccionadas

5

Nd: no determinada

^{a} N1-MacI, N1-Np50: número de clones tras una serie de cribado convencional; ICAM1: diversidad de la agrupación optimizada en cadena ligera.

^{b} número de positivos a ELISA de las agrupaciones preseleccionadas respectivas.

TABLA 6 Secuencia de aminoácidos de módulos del fragmento Fab modificado mediante ingeniería

6

La cisteína modificada mediante ingeniería está escrita en negrita

Claims (29)

1. Método para presentar un/una (poli)péptido/proteína sobre la superficie de una partícula de bacteriófago que comprende:

producir o permitir la unión de dicho/-a (poli)péptido/proteína tras la expresión a un elemento del recubrimiento proteico de dicha partícula de bacteriófago, produciéndose dicha unión por la formación de un enlace disulfuro entre un primer residuo de cisteína comprendido en dicho/-a (poli)péptido/proteína y un segundo residuo de cisteína comprendido en dicho elemento del recubrimiento proteico.

\vskip1.000000\baselineskip

2. Método según la reivindicación 1, en el que dicho segundo residuo de cisteína está presente en una posición de aminoácido correspondiente en una proteína de recubrimiento de tipo natural de un bacteriófago.

3. Método según la reivindicación 2, en el que dicho elemento del recubrimiento proteico es una proteína de recubrimiento de tipo natural de un bacteriófago.

4. Método según la reivindicación 2, en el que dicho elemento del recubrimiento proteico es una variante truncada de una proteína de recubrimiento de tipo natural de un bacteriófago, comprendiendo dicha variante truncada al menos esa parte de dicha proteína de recubrimiento de tipo natural que produce la incorporación de dicha proteína de recubrimiento en el recubrimiento proteico de la partícula de bacteriófago.

5. Método según la reivindicación 2, en el que dicho elemento del recubrimiento proteico es una variante modificada de una proteína de recubrimiento de tipo natural de un bacteriófago, en el que dicha variante modificada puede incorporarse en el recubrimiento proteico de la partícula de bacteriófago.

6. Método según la reivindicación 1, en el que dicho segundo residuo de cisteína no está presente en una posición de aminoácido correspondiente en una proteína de recubrimiento de tipo natural de un bacteriófago.

7. Método según la reivindicación 6, en el que dicha segunda cisteína se ha introducido artificialmente en una proteína de recubrimiento de tipo natural de un bacteriófago.

8. Método según la reivindicación 6, en el que dicha segunda cisteína se ha introducido artificialmente en una variante truncada de una proteína de recubrimiento de tipo natural de un bacteriófago.

9. Método según la reivindicación 6, en el que dicha segunda cisteína se ha introducido artificialmente en una variante modificada de una proteína de recubrimiento de tipo natural de un bacteriófago.

10. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 9, en el que dicha segunda cisteína está presente en, o en las proximidades de, el C- o el N-terminal de dicho elemento del recubrimiento de fago de dicha partícula de bacteriófago.

11. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en el que dicho bacteriófago es un bacteriófago filamentoso.

12. Método según la reivindicación 11, en el que dicho elemento del recubrimiento proteico de la partícula de bacteriófago es o se deriva de la proteína de recubrimiento de tipo natural pIII.

13. Método según la reivindicación 11, en el que dicho elemento del recubrimiento proteico de la partícula de bacteriófago es o se deriva de la proteína de recubrimiento de tipo natural pIX.

14. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, que comprende:

(a) proporcionar una célula huésped que albergue una secuencia de ácido nucleico que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica para dicho/-a (poli)péptido/proteína;

(b) producir o permitir la expresión de dicha secuencia de ácido nucleico; y

(c) producir o permitir la producción de partículas de bacteriófago en dicha célula huésped.

\vskip1.000000\baselineskip

15. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, en el que dicho/-a (poli)péptido/proteína comprende una inmunoglobulina o un fragmento funcional de la misma.

16. Método según la reivindicación 15, en el que dicho fragmento funcional es un fragmento scFv o Fab.

\newpage

17. Secuencia de ácido nucleico que codifica para una variante modificada de una proteína de recubrimiento de tipo natural de un bacteriófago, en la que dicha variante modificada consiste en:

(a) una o más partes de dicha proteína de recubrimiento de tipo natural de un bacteriófago, en la que una de dichas partes comprende al menos esa parte que produce o permite la incorporación de dicha proteína de recubrimiento en el recubrimiento de fago; y

(b) entre uno y seis residuos de aminoácido adicionales no presentes en las posiciones de aminoácido correspondientes en una proteína de recubrimiento de tipo natural de un bacteriófago, en la que uno de dichos residuos de aminoácido adicionales es un residuo de cisteína.

\vskip1.000000\baselineskip

18. Secuencia de ácido nucleico que codifica para una variante modificada de una proteína de recubrimiento de tipo natural de un bacteriófago, en la que dicha variante modificada consiste en:

(a) una o más partes de dicha proteína de recubrimiento de tipo natural de un bacteriófago, en la que una de dichas partes comprende al menos esa parte que produce o permite la incorporación de dicha proteína de recubrimiento en el recubrimiento de fago;

(b) entre uno y seis residuos de aminoácido adicionales no presentes en las posiciones de aminoácido correspondientes en una proteína de recubrimiento de tipo natural de un bacteriófago, en la que uno de dichos residuos de aminoácido adicionales es un residuo de cisteína; y

(c) una o más secuencias de péptido con fines de purificación y/o detección.

\vskip1.000000\baselineskip

19. Vector que comprende el ácido nucleico según la reivindicación 17 ó 18.

20. Vector según la reivindicación 19, que comprende además una o más secuencias de ácido nucleico que codifican para un/una (poli)péptido/proteína que comprende un segundo residuo de cisteína.

21. Vector según la reivindicación 20, en el que dicho/-a (poli)péptido/proteína comprende una inmunoglobulina o un fragmento funcional de la misma.

22. Célula huésped que comprende la secuencia de ácido nucleico según la reivindicación 17 ó 18, el vector según una cualquiera de las reivindicaciones 19 a 21.

23. Variante modificada de una proteína de recubrimiento de tipo natural, en la que la variante modificada está codificada por la secuencia de ácido nucleico según la reivindicación 17 ó 18, el vector según una cualquiera de las reivindicaciones 19 a 21 o se produce por la célula huésped según la reivindicación 22.

24. Partícula de bacteriófago que presenta un/una (poli)péptido/proteína unido(a) a su superficie, produciéndose dicha unión por la formación de un enlace disulfuro entre un primer residuo de cisteína comprendido en dicho/-a (poli)péptido/proteína y un segundo residuo de cisteína comprendido en un elemento del recubrimiento proteico de dicha partícula de bacteriófago, en la que dicha partícula de bacteriófago contiene una secuencia de ácido nucleico para la expresión de dicho/-a (poli)péptido/proteína.

25. Partícula de bacteriófago según la reivindicación 24, en la que dicha secuencia de ácido nucleico es el vector según la reivindicación 20 ó 21.

26. Colección diversa de partículas de bacteriófago según una cualquiera de las reivindicaciones 24 ó 25, en la que cada una de dichas partículas de bacteriófago presenta un/una (poli)péptido/proteína de una colección diversa de (poli)péptidos/proteínas.

27. Método para obtener un/una (poli)péptido/proteína que tiene una propiedad deseada, que comprende,

(a) proporcionar la colección diversa de partículas de bacteriófago según la reivindicación 26; y

(b) detectar dicha colección diversa y/o seleccionar de dicha colección diversa para obtener al menos una partícula de bacteriófago que presenta un/una (poli)péptido/proteína que tenga dicha propiedad deseada.

\vskip1.000000\baselineskip

28. Método según la reivindicación 27, en el que dicha propiedad deseada es la unión a una diana de interés.

29. Método según la reivindicación 28, en el que la etapa (b) comprende además:

(ba) poner en contacto dicha colección diversa de partículas de bacteriófago con la diana de interés;

(bb) eluir partículas de bacteriófago que no se unen a la diana de interés;

(bc) eluir partículas de bacteriófago que se unen a la diana de interés, tratando en condiciones reductoras los complejos de diana de interés y bacteriófagos que se unen a dicha diana de interés formados en la etapa (ba).