ES2327382T3 - Metodos para presentar (poli)peptidos/proteinas en particulas de bacteriofagos a traves de enlaces disulfuro. - Google Patents
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Abstract
Método para presentar un/una (poli)péptido/proteína sobre la superficie de una partícula de bacteriófago que comprende: producir o permitir la unión de dicho/-a (poli)péptido/proteína tras la expresión a un elemento del recubrimiento proteico de dicha partícula de bacteriófago, produciéndose dicha unión por la formación de un enlace disulfuro entre un primer residuo de cisteína comprendido en dicho/-a (poli)péptido/proteína y un segundo residuo de cisteína comprendido en dicho elemento del recubrimiento proteico.
Description
Métodos para presentar
(poli)péptidos/proteínas en partículas de bacteriófagos a
través de enlaces disulfuro.
La presente invención se refiere a métodos para
presentar (poli)péptidos/proteínas en la superficie de
partículas de bacteriófago uniendo los/las
(poli)péptidos/proteínas a través de enlaces disulfuro.
Smith demostró por primera vez en 1985 que un
fago filamentoso tolera fragmentos de proteína extraños insertados
en su proteína del gen III (pIII), y pudo demostrar que los
fragmentos de proteína se presentan en la superficie del fago
(Smith, 1985). Ladner extendió ese concepto a la detección de
repertorios de (poli)péptidos y/o proteínas presentadas en
la superficie del fago (documento WO 88/06630; documento WO
90/20809) y, desde entonces, la presentación de fago ha
experimentado una evolución espectacular y ha dado como resultado
unos logros sustanciales.
Se han desarrollado varios formatos para
construir y detectar bibliotecas de presentación en fago de
(poli)péptidos/proteínas, y un gran número de artículos de
revisión y monografías cubren y resumen estos desarrollos (por
ejemplo, Kay et al., 1996; Dunn, 1996; McGregor, 1996).
Con mayor frecuencia, se han usado sistemas
basados en fagos filamentosos.
Inicialmente propuesta como una presentación de
fragmento Fv (FEcs) de cadena simple (documento WO 88/
06630; véase además el documento WO 92/01047), el método se ha expandido rápidamente a la presentación del inhibidor de la tripsina pancreática bovina (BPTI, "bovine pancreatic trypsin inhibitor") (documento WO 90/02809), bibliotecas de péptidos (documento WO 91/19818), hormona del crecimiento humana (documento WO 92/09690), y otras proteínas diversas incluyendo la presentación de proteínas multiméricas tales como fragmentos Fab (documentos WO 91/17271; WO 92/01047).
06630; véase además el documento WO 92/01047), el método se ha expandido rápidamente a la presentación del inhibidor de la tripsina pancreática bovina (BPTI, "bovine pancreatic trypsin inhibitor") (documento WO 90/02809), bibliotecas de péptidos (documento WO 91/19818), hormona del crecimiento humana (documento WO 92/09690), y otras proteínas diversas incluyendo la presentación de proteínas multiméricas tales como fragmentos Fab (documentos WO 91/17271; WO 92/01047).
Para anclar el péptido o la proteína a la
superficie del bacteriófago filamentoso, la mayoría de las veces se
emplean fusiones a proteínas de recubrimiento de fago. Se prefieren
fusiones a proteína del gen III (Parmley y Smith, 1988) o
fragmentos de los mismos (Bass et al., 1990), y proteína del
gen VIII (Greenwood et al., 1991). En un caso, se ha usado
gen VI (Jespers et al., 1995), y recientemente, se ha usado
una combinación de gen VII y gen IX para la presentación de
fragmentos Fv (Gao et al., 1999).
Adicionalmente, también se ha logrado la
presentación de fago en el fago lambda. En ese caso, se han usado
la proteína del gen V (Maruyama et al., 1994), proteína del
gen J, y proteína del gen D (Sternberg y Hoess, 1995; Mikawa et
al., 1996).
Además de usar fusiones genéticas, se han unido
proteínas o péptidos extraño a superficies de fago a través de
dominios de asociación. En el documento WO 91/17271, se sugirió el
uso de una etiqueta presentada sobre un fago y un ligando de unión
a la etiqueta fusionado al péptido/proteína que va a presentarse
para lograr una presentación no covalente.
Se persiguió un concepto similar para la
presentación de bibliotecas de ADNc (Crameri y Suter, 1993). Ahí se
uso la interacción jun/fos para mediar la presentación de fragmentos
de ADNc. En su constructo, residuos de cisteína adicionales que
flanquean ambos extremos de jun, así como de fos, estabilizaron
adicionalmente la interacción formando dos enlaces disulfuro.
Como alternativa y además de la presentación en
fago de scFv, la presentación de Fv estabilizado mediante enlaces
disulfuro (dsFv) en fago mostró una estabilidad mejorada y una mejor
unión que permitieron el aislamiento de fragmentos Fv novedosos a
partir de bibliotecas de presentación en fago (Brinkmann et
al., 1995). Se mostró que los componentes de un dsFv podían
secretarse, plegarse y montarse en el periplasma de E. coli
para formar un dsFv funcional presentado en un fago y que este fago
con dsFv podía unirse específicamente a antígeno y enriquecerse
selectivamente a partir de bibliotecas de fagos grandes.
A la hora de detectar bibliotecas de
presentación en fago en el cribado biológico ("biopanning") el
problema sigue siendo cómo recuperar mejor el fago que se unió a la
diana deseada. Normalmente, esto se logra mediante elución con
tampones apropiados, bien usando un gradiente de pH o un gradiente
de sal, o bien mediante elución usando una diana soluble. Sin
embargo, los agentes de unión más interesantes que se unen con gran
afinidad a la diana podrían perderse mediante ese enfoque. Se han
concebido métodos alternativos que tratan de superar ese problema,
o bien proporcionando una señal de escisión entre el/la
(poli)péptido/proteína que se está presentando y su
componente de fusión, o bien entre la diana de interés y su vehículo
que ancla la diana a una superficie sólida.
Adicionalmente, todos los enfoques referidos
anteriormente en el presente documento requieren el uso de proteínas
de fusión que comprenden al menos parte de una proteína de
recubrimiento de fago y un/una (poli)péptido/proteína
extraño(-a). Especialmente en el caso de usar gen III como
componente para péptidos/proteínas que van a presentarse, esto
conduce a varios problemas. En primer lugar, el producto de
expresión del gen III es tóxico para la célula huésped, lo cual
requiere una estricta regulación de las proteínas de fusión del gen
III. En segundo lugar, la expresión de productos del gen III puede
hacer a las células huésped resistentes a la infección con fago
auxiliar requerida para la producción de partículas de fago
progenie. Y finalmente, los acontecimientos de recombinación entre
los constructos de fusión del gen III y las copias de tipo natural
del gen III conducen a artefactos no deseados. Adicionalmente, dado
que hay que usar al menos el dominio C-terminal de
la proteína del gen III que comprende aproximadamente 190
aminoácidos con el fin de lograr la incorporación de la proteína de
fusión en el recubrimiento de fago, el tamaño de los vectores que
comprenden las secuencias de ácido nucleico es bastante mayor,
conduciendo a una disminución en la eficacia de la transformación.
Sin embargo, la eficacia de la transformación es un factor crucial
para la producción de bibliotecas muy grandes. Adicionalmente, para
la caracterización de (poli)péptido/proteínas obtenidos tras
la selección a partir de una biblioteca de presentación en fago,
normalmente, el/la (poli)péptido/proteína vuelven a clonarse
en vectores de expresión con el fin de retirar el componente de
fusión de la proteína de recubrimiento, o con el fin de crear nuevas
proteínas de fusión tal como mediante fusión a enzimas para la
detección o a dominios de multimerización. Sería ventajoso tener un
sistema que permitiera una expresión directa sin volver a clonar, y
un acoplamiento directo del/de la (poli)péptido/proteína a
otros restos.
Adicionalmente, la mayoría de estos enfoques
(excepto para el trabajo de Jespers et al. (1995), el
documento WO 91/17271, y de Crameri y Suter (1993) mencionados
anteriormente en el presente documento) se limitan a la
presentación de (poli)péptidos/proteínas que tienen un
N-terminal libre, dado que los/las
(poli)péptidos/proteínas tienen que fusionarse en el
C-terminal con una proteína de recubrimiento de
fago. Especialmente en el caso de bibliotecas de ADNc, o en el caso
de proteínas que requieren un C-terminal libre para
ser funcional, sería muy deseable tener un método simple que no
requiera la generación de las fusiones en
C-terminal.
Por tanto, el problema técnico que subyace a la
presente invención es desarrollar un sistema simple, fiable que
permita la presentación de (poli)péptidos/proteínas en
partículas de fago sin la necesidad de usar proteínas de fusión con
proteínas de recubrimiento de fago. Adicionalmente, existe una
necesidad de un método que permita recuperar
(poli)péptidos/proteínas de unión fuerte de una manera más
fiable.
La solución a este problema técnico se logra
proporcionando las realizaciones caracterizadas en las
reivindicaciones. Por consiguiente, la presente invención permite
crear y detectar fácilmente bibliotecas grandes de
(poli)péptidos/proteínas presentadas en la superficie de
partículas de bacteriófago. El enfoque técnico de la presente
invención es la unión de (poli)péptidos/proteínas mediante
enlaces disulfuro a la superficie de partículas de fago.
Por tanto, la presente invención se refiere a un
método para presentar un/una (poli)péptido/proteína sobre la
superficie de una partícula de bacteriófago que comprende:
producir o permitir la unión de dicho/-a
(poli)péptido/proteína tras la expresión a un elemento del
recubrimiento proteico de dicha partícula de bacteriófago,
produciéndose dicha unión por la formación de un enlace disulfuro
entre un primer residuo de cisteína comprendido en dicho/-a
(poli)péptido/proteína y un segundo residuo de cisteína
comprendido en dicho elemento del recubrimiento proteico.
\vskip1.000000\baselineskip
En el contexto de la presente invención, el
término "bacteriófago" se refiere a virus bacterianos que
forman paquetes que consisten en un recubrimiento proteico que
contiene ácido nucleico requerido para la replicación de los fagos.
El ácido nucleico puede ser ADN o ARN, bien de cadena doble o
simple, lineal o circular. Los bacteriófagos, tal como el fago
lambda o un fago filamentoso (tal como M13, fd, o f1), son bien
conocidos por el experto en la técnica. En el contexto de la
presente invención, el término "partículas de bacteriófago" se
refiere a las partículas según la presente invención, es decir, a
partículas que presentan un/una (poli)péptido/proteína a
través de enlaces disulfuro.
Durante el montaje de los bacteriófagos, las
proteínas de recubrimiento pueden empaquetar diferentes secuencias
de ácido nucleicos, siempre que comprendan una señal de
empaquetamiento. En el contexto de la presente invención, el
término "secuencias de ácido nucleico" contenidas en
bacteriófagos o partículas de bacteriófago se refiere a secuencias
de ácido nucleico o vectores que tienen la capacidad de empaquetarse
mediante proteínas de recubrimiento de bacteriófago durante el
montaje de bacteriófagos o partículas de bacteriófago.
Preferiblemente, dichas secuencias de ácido nucleico o vectores se
derivan de genomas de bacteriófago que aparecen en la naturaleza, y
comprenden, por ejemplo, en el caso de fago filamentoso, vectores de
fago y fagémidos. Los últimos son plásmidos que contienen una señal
de empaquetamiento y un origen de replicación de fago además de
características de plásmido.
El término "(poli)péptido" se
refiere a moléculas que consisten en una o más cadenas de múltiples,
es decir, dos o más, aminoácidos unidos mediante enlaces
peptídicos.
El término "proteína" se refiere a
(poli)péptidos en los que al menos parte del
(poli)péptido tiene o puede adquirir una disposición
tridimensional definida formando estructuras secundarias,
terciarias, o cuaternarias, dentro y/o entre sus cadena(s)
(poli)peptídica(s). Esta definición comprende
proteínas tales como proteínas que aparecen en la naturaleza o
proteínas al menos parcialmente artificiales, así como fragmentos o
dominios de proteínas enteras, siempre que estos fragmentos o
dominios puedan adquirir una disposición tridimensional definida
tal como se describió anteriormente.
Ejemplos de (poli)péptidos/proteínas que
consisten en una cadena son fragmentos de anticuerpo Fv de cadena
simple, y ejemplos para (poli)péptidos/proteínas que
consisten en más cadenas son fragmentos de anticuerpo
Fab.
Fab.
Cuando el primer residuo de cisteína se sitúa en
el C-terminal del/de la
(poli)péptido/proteína, el formato de
presentación corresponde a la situación de presentación convencional fusionándose el C-terminal genéticamente al elemento de la proteína de recubrimiento de fago. Sin embargo, usando el N-terminal del/de la (poli)péptido/proteína, el formato de presentación puede revertirse como en el sistema pJuFO de Crameri y Suter referido anterior-
mente.
presentación corresponde a la situación de presentación convencional fusionándose el C-terminal genéticamente al elemento de la proteína de recubrimiento de fago. Sin embargo, usando el N-terminal del/de la (poli)péptido/proteína, el formato de presentación puede revertirse como en el sistema pJuFO de Crameri y Suter referido anterior-
mente.
El término "superficie de una partícula de
bacteriófago" se refiere a la parte de una partícula de
bacteriófago que está en contacto con el medio en el que está
contenida la partícula y que es accesible. La superficie se
determina por las proteínas que forman parte del recubrimiento de
fago (los elementos del recubrimiento proteico de la partícula) que
se monta durante la producción de fago en células huésped
apropiadas.
El término "tras la expresión" se refiere a
la situación en la que el ácido nucleico que codifica para dicho/a
(poli)péptido/proteína se expresa en una célula huésped antes
de la unión del (poli)péptido/proteína a dicho
recubrimiento, a diferencia de los enfoques en los que se está
expresando el ácido nucleico que codifica para las proteínas de
fusión con proteínas de recubrimiento de bacteriófago. La expresión
del ácido nucleico que codifica para dicho/-a
(poli)péptido/proteína y la etapa de producir o permitir la
unión puede realizarse en etapas y/o medios separados. Sin embargo,
preferiblemente, la expresión y la etapa de producir o permitir la
unión se realizan secuencialmente en una célula huésped apropiada.
El término "en el que dicha unión se produce mediante la
formación de un enlace disulfuro" se refiere a una situación, en
la que el enlace disulfuro es responsable de la unión, y en la que
no se ha fusionado de manera recombinante un dominio de interacción,
para la interacción con un segundo dominio presente en el/la
(poli)péptido/proteína, a dicho elemento del recubrimiento
proteico, tal como por ejemplo es el caso del sistema pJuFo (Crameri
y Suter, 1993).
En una realización preferida, la partícula de
bacteriófago que presenta el/la (poli)péptido/proteína
contiene una secuencia de ácido nucleico que codifica para el/la
(poli)péptido/proteína.
En la técnica se conocen bien métodos para la
construcción de moléculas de ácido nucleico que codifican para
un/una (poli)péptido/proteína según la presente invención,
para la construcción de vectores que comprenden dichas moléculas de
ácido nucleico, para la introducción de dichos vectores en células
huésped seleccionadas apropiadamente, para producir o permitir la
expresión de dichos/-as (poli)péptidos/proteínas (véase, por
ejemplo, Sambrook et al., 1989; Ausubel et al., 1999;
Ge et al., 1995). Más conocidos son los métodos para la
introducción de material genético requerido para la generación de
bacteriófagos de progenie o partículas de bacteriófago en células
huésped apropiadas, y para producir o permitir la generación de
dichos bacteriófagos de progenie o partículas de bacteriófago
(véase, por ejemplo, Kay et al., 1996).
En una realización más preferida, la presente
invención se refiere a un método, en el que dicho segundo residuo
de cisteína está presente en una posición de aminoácido
correspondiente en una proteína de recubrimiento de tipo natural de
un bacteriófago.
En una realización todavía más preferida, la
presente invención se refiere a un método, en el que dicho elemento
del recubrimiento proteico es una proteína de recubrimiento de tipo
natural de un bacteriófago.
El término "proteína de recubrimiento de tipo
natural" se refiere a aquellas proteínas que forman el
recubrimiento de fago de bacteriófagos que se producen
naturalmente. En el caso de bacteriófagos filamentosos, dichas
proteínas de tipo natural son la proteína del gen III (pIII), la
proteína del gen VI (pVI), la proteína del gen VII (pVII), proteína
del gen VIII (pVIII), y la proteína del gen IX (pIX). Las
secuencias, incluyendo las diferencias entre los elementos muy
relacionados de los bacteriófagos filamentosos tales como f1, fd, y
M13, se conocen bien por el experto en la técnica (véase, por
ejemplo, Kay et al., 1996).
En una realización más preferida, dicho elemento
del recubrimiento proteico es una variante truncada de una proteína
de recubrimiento de tipo natural de un bacteriófago, comprendiendo
dicha variante truncada al menos esa parte de dicha proteína de
recubrimiento de tipo natural que produce la incorporación de dicha
proteína de recubrimiento en el recubrimiento proteico de la
partícula de bacteriófago.
El término "variante truncada" se refiere a
proteínas derivadas de las proteínas de tipo natural referidas
anteriormente, que se modifican mediante deleción de al menos parte
de las secuencias de tipo natural. Esto comprende variantes tales
como variantes de proteína del gen III truncadas que se han hallado
en mutantes de bacteriófago (Crissman y Smith, 1984) o que se han
generado en el transcurso de los métodos de presentación en fago
convencionales (Por ejemplo, Bass et al., 1990; Krebber,
1996). Por ejemplo, dicha variante truncada puede consistir, o
incluir, el dominio C-terminal de la proteína del
gen III. Para identificar las variantes truncadas según la presente
invención, puede fusionarse una etiqueta de detección a la variante,
y puede establecerse un ensayo para determinar si la variante se
incorpora al recubrimiento de fago de las partículas de bacteriófago
formadas en presencia de la variante.
Truncando una proteína de tipo natural mediante
la deleción de una parte de la proteína de tipo natural, puede
volverse disponible un residuo de cisteína que en la proteína de
tipo natural estaba formando un enlace disulfuro con una segunda
cisteína comprendida en la parte delecionada.
\newpage
En una realización todavía más preferida, dicho
elemento del recubrimiento proteico es una variante modificada de
una proteína de recubrimiento de tipo natural de un bacteriófago, en
el que dicha variante modificada puede incorporarse en el
recubrimiento proteico de la partícula de bacteriófago.
Un experto en la técnica conoce bien los métodos
para lograr la modificación de una proteína de tipo natural según
la presente invención, e implican técnicas convencionales de
clonación y/o mutagénesis. En la técnica se conocen bien métodos
para la construcción de moléculas de ácido nucleico que codifican
para una variante de proteína de tipo natural utilizada en un
método según la presente invención, para la construcción de vectores
que comprende dichas moléculas de ácido nucleico, incluyendo la
construcción de vectores de fago y/o fagémidos, para la
introducción de dichos vectores en células huésped seleccionadas
apropiadamente, para producir o permitir la expresión de dicha
proteína modificada (véase, por ejemplo, Sambrook et al.,
1989; Ausubel et al., 1999; Kay et al., 1996). Para
identificar variantes modificadas según la presente invención, puede
fusionarse una etiqueta de detección a la variante, y puede
establecerse un ensayo para determinar si la variante puede o se
incorpora en el recubrimiento de fago de partículas de bacteriófago
formada en presencia de la variante.
En una realización más preferida, dicho segundo
residuo de cisteína no está presente en una posición de aminoácido
correspondiente en una proteína de recubrimiento de tipo natural de
un bacteriófago.
En una realización preferida, dicha segunda
cisteína se ha introducido artificialmente en una proteína de
recubrimiento de tipo natural de un bacteriófago.
En el contexto de la presente invención, el
término "introducido artificialmente" se refiere a una
situación en la que una proteína de recubrimiento de tipo natural
se ha modificado por medio de, por ejemplo, medios recombinantes.
Por ejemplo, puede manipularse un ácido nucleico que codifica para
una proteína de recubrimiento de tipo natural mediante
procedimientos convencionales para introducir un codón de cisteína
que crea una secuencia de ácido nucleico que codifica para una
proteína de recubrimiento modificada, en los que se introduce
artificialmente un residuo de cisteína mediante inserción en, o
adición de dicho residuo de cisteína a, dicha al menos parte de una
proteína de recubrimiento modificada o de tipo natural, o mediante
sustitución de un residuo de aminoácido comprendido en dicha al
menos parte de una proteína de tipo natural o modificada por dicho
residuo de cisteína, o mediante fusión de dicha al menos parte de
una proteína de recubrimiento modificada o de tipo natural con
un/una (poli)péptido/proteína que comprende dicho segundo
residuo de cisteína, o mediante cualquier combinación de dichas
inserciones, adiciones, sustituciones o fusiones. Con la expresión
del ácido nucleico que comprende un codón de cisteína introducido
de manera recombinante de este tipo, se forma una variante de la
proteína de tipo natural que comprende un residuo de cisteína.
En una realización más preferida, dicha segunda
cisteína se ha introducido artificialmente en una variante truncada
de una proteína de recubrimiento de tipo natural de un
bacteriófago.
En una realización todavía más preferida, dicha
segunda cisteína se ha introducido artificialmente en una variante
modificada de una proteína de recubrimiento de tipo natural de un
bacteriófago.
Un experto en la técnica conoce bien los métodos
para lograr la introducción artificial según la presente invención,
e implican técnicas convencionales de clonación y/o mutagénesis. En
la técnica se conocen bien los métodos para la construcción de
moléculas de ácido nucleico que codifican para una variante
modificada de una proteína de tipo natural utilizada en un método
según la presente invención, para la construcción de vectores que
comprenden dichas moléculas de ácido nucleico, para la introducción
de dichos vectores en células huésped seleccionadas apropiadamente,
para producir o lograr la expresión de dichas proteínas de fusión
(véase, por ejemplo, Sambrook et al., 1989; Ausubel et
al., 1999).
En otra realización, la presente invención se
refiere a un método, en el que dicha segunda cisteína está presente
en, o en las proximidades de, el C- o el N-terminal
de dicho elemento del recubrimiento de fago de dicha partícula de
bacteriófago.
El término "en las proximidades de" se
refiere a una extensión de hasta 15, o más preferiblemente, hasta 10
aminoácidos, contados en ambos casos desde o bien el N- o el
C-terminal de dicho/-a
(poli)péptido/proteína, siempre que el N- o
C-terminal se sitúe en el exterior del
bacteriófago.
Todavía más preferido es un método, en el que
dicho bacteriófago es un bacteriófago filamentoso. El experto en la
técnica conoce bien los bacteriófagos filamentosos tales como M13,
fd, o f1.
En el caso de un bacteriófago filamentoso, se
prefiere particularmente un método, en el que dicho elemento del
recubrimiento proteico de la partícula de bacteriófago es o se
deriva de la proteína de recubrimiento de tipo natural pIII.
Más preferido es un método, en el que dicho
elemento del recubrimiento de proteína de la partícula de
bacteriófago es o se deriva de la proteína de recubrimiento de tipo
natural pix.
En el contexto de la presente invención, el
término "se deriva" se refiere a una modificación, en la que la
proteína modificada puede incorporarse en el recubrimiento proteico
de la partícula de bacteriófago. Preferiblemente, aquellas partes
de la proteína modificada que corresponden a la proteína de tipo
natural muestran una identidad de aminoácido que supera
aproximadamente el 70%, de manera preferible aproximadamente el 80%,
lo más preferible aproximadamente el 90% en comparación con la
secuencia de tipo natural correspondiente.
En una realización todavía más preferida de la
presente invención, el método comprende:
(a) proporcionar una célula huésped que albergue
una secuencia de ácido nucleico que comprende una secuencia de
ácido nucleico que codifica para dicho/-a
(poli)péptido/proteína;
(b) producir o permitir la expresión de dicha
secuencia de ácido nucleico; y
(c) producir o permitir la producción de
partículas de bacteriófago en dicha célula huésped.
\vskip1.000000\baselineskip
En el contexto de la presente invención, el
término "producir o permitir la expresión" describe el cultivo
de células huésped en condiciones tales que la secuencia de ácido
nucleico se expresa. En la técnica se conocen bien los métodos para
la construcción de moléculas de ácido nucleico que codifican para
un/una (poli)péptido/proteína según la presente invención,
para la construcción de vectores que comprenden dichas moléculas de
ácido nucleico, para la introducción de dichos vectores en células
huésped seleccionadas apropiadamente, para producir o permitir la
expresión de (poli)péptidos/proteínas (véase, por ejemplo,
Sambrook et al., 1989; Ausubel et al., 1999). Mejor
conocidos son los métodos para la introducción del material genético
requerido para la generación de bacteriófagos de progenie o
partículas de bacteriófago en células huésped apropiadas, y para
producir o permitir la generación de dichos bacteriófagos de
progenie o partículas de bacteriófago (véase, por ejemplo, Kay et
al., 1996). La etapa de producir o permitir la producción de
partículas de bacteriófago puede requerir el uso de fagos
auxiliares apropiados, por ejemplo, en el caso de trabajar con
fagémidos.
Las etapas (b) y (c) pueden realizarse
secuencialmente, en cualquier orden, o simultáneamente.
En una realización más, dicho/-a
(poli)péptido/proteína comprende una inmunoglobulina o un
fragmento funcional del mismo/-a.
En este contexto, "inmunoglobulina" se usa
como sinónimo de "anticuerpo". El término "fragmento
funcional" se refiere a un fragmento de una inmunoglobulina que
conserva el resto de unión a antígeno de una inmunoglobulina.
Fragmentos de inmunoglobulina funcionales según la presente
invención pueden ser fragmentos Fv (Skerra y Plückthun, 1988), ScFv
(Bird et al., 1988; Huston et al., 1988), Fv unido con
disulfuro (Glockshuber et al., 1992; Brinkmann et
al., 1993), Fab, F(ab')_{2} u otros fragmentos bien
conocidos por el experto en la técnica, que comprenden el dominio
variable de una inmunoglobulina o un fragmento de
inmunoglobulina.
Se prefiere particularmente un fragmento Fvsc o
Fab.
En una realización preferida, la presente
invención se refiere a una secuencia de ácido nucleico que codifica
para una variante modificada de una proteína de recubrimiento de
tipo natural de un bacteriófago, consistiendo dicha variante
modificada en:
(a) una o más partes de dicha proteína de
recubrimiento de tipo natural de un bacteriófago, en la que una de
dichas partes comprende al menos esa parte que produce o permite la
incorporación de dicha proteína de recubrimiento en el
recubrimiento de fago; y
(b) entre uno y seis residuos de aminoácido
adicionales no presentes en las posiciones de aminoácido
correspondientes en una proteína de recubrimiento de tipo natural
de un bacteriófago, en la que uno de dichos residuos de aminoácido
adicionales es un residuo de cisteína.
\vskip1.000000\baselineskip
En el contexto de la presente invención, una
variante modificada mediante sustitución de un residuo de aminoácido
en una secuencia de proteína de recubrimiento de tipo natural por
un residuo de cisteína puede contemplarse como una variante
compuesta de dos partes de dicha proteína de tipo natural unidas por
un residuo de cisteína adicional. De manera correspondiente, las
variantes de una proteína de recubrimiento de tipo natural que
comprende varias mutaciones en comparación con la secuencia de tipo
natural pueden contemplarse como que están compuestas de varias
partes de tipo natural, en las que las partes individuales están
unidas por los residuos mutados. Sin embargo, dichas variantes
también pueden resultar de la adición de hasta seis residuos,
incluyendo un residuo de cisteína, a o bien el C y/o bien al
N-terminal de la proteína de recubrimiento de tipo
natural.
Más preferida es una secuencia de ácido nucleico
que codifica para una variante modificada de una proteína de
recubrimiento de tipo natural de un bacteriófago, en la que dicha
variante modificada consiste en:
(a) una o más partes de dicha proteína de
recubrimiento de tipo natural de un bacteriófago, en la que una de
dichas partes comprende al menos esa parte que produce o permite la
incorporación de dicha proteína de recubrimiento en el
recubrimiento de fago;
(b) entre uno y seis residuos de aminoácido
adicionales no presentes en las posiciones de aminoácido
correspondientes en una proteína de recubrimiento de tipo natural
de un bacteriófago, en la que uno de dichos residuos de aminoácido
adicionales es un residuo de cisteína; y
(c) una o más secuencias de péptido con fines de
purificación y/o detección.
\vskip1.000000\baselineskip
Particularmente preferidos son péptidos que
comprenden al menos cinco residuos de histidina (Hochuli et
al., 1988), que pueden unirse a iones metálicos, y pueden, por
tanto, usarse para la purificación de la proteína a la que se
fusionan (Lindner et al., 1992). La invención también
proporciona restos adicionales tales como las etiquetas
habitualmente usadas c-myc y FLAG (Hopp et
al., 1988; Knappik y Plückthun, 1994), o la etiqueta Strep
(Schmidt y Skerra, 1994; Schmidt et al., 1996).
La variante modificada puede comprender además
residuos de aminoácido requeridos para la clonación, para la
expresión, o el transporte proteico. Los residuos de aminoácido
requeridos para la clonación pueden incluir residuos codificados
por secuencias de ácidos nucleicos que comprenden secuencias de
reconocimiento para endonucleasas de restricción que se incorporan
con el fin de permitir la clonación de las secuencias de ácido
nucleico en los vectores apropiados. Los residuos de aminoácido
requeridos para la expresión pueden incluir residuos que conducen a
un aumento de la solubilidad o estabilidad del/de la
(poli)péptido/proteína. Los residuos de aminoácido
requeridos para el transporte proteico pueden incluir secuencias de
señalización responsables del transporte de la variante modificada
del periplasma de E. coli y/o residuos de aminoácidos que
facilitan la escisión eficaz de dichas secuencias de señalización.
Los residuos de aminoácido adicionales requeridos para fines de
clonación, expresión, transporte proteico, purificación y/o
detección referidos anteriormente, son restos numerosos bien
conocidos por el experto en la técnica.
En otra realización, la presente invención se
refiere a un vector que comprende una secuencia de ácido nucleico
según la presente invención.
En una realización preferida, el vector
comprende además una o más secuencias de ácido nucleico que codifica
para un/una (poli)péptido/proteína que comprende un segundo
residuo de cisteína.
En una realización más preferida, dicho/-a
(poli)péptido/proteína comprende una inmunoglobulina o un
fragmento funcional de la misma.
En el caso de los fragmentos de anticuerpo Fv de
cadena simple referidos anteriormente en el presente documento, el
vector comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica para
los dominios VH y VL unidos por un conector de
(poli)péptido, y en el caso de fragmentos de anticuerpo Fab,
el vector comprende dos secuencias de ácido nucleico que codifican
para cadenas VH-CH y VL-CL.
En una realización adicional, la presente
invención se refiere a una célula huésped que contiene una secuencia
de ácido nucleico según la presente invención o un vector según la
presente invención.
En el contexto de la presente invención el
término "célula huésped" puede ser cualquiera de varias usadas
habitualmente en la producción de proteínas heterólogas, incluyendo
pero no limitándose a bacterias, tales como Escherichia coli
(Ge et al., 1995), o Bacillus subtilis (Wu et
al., 1993), hongos, tales como levaduras (Horwitz et al,
1988; Ridder et al., 1995) u hongos filamentosos (Nyyssönen
et al., 1993), células de plantas (Hiatt y Ma, 1993;
Whitelam et al., 1994), células de insectos (Potter et
al., 1993; Ward et al., 1995), o células de mamífero
(Trill et al., 1995).
En una realización todavía más preferida, la
presente invención se refiere a una variante modificada de una
proteína de recubrimiento de bacteriófago de tipo natural codificada
por una secuencia de ácido nucleico según la presente invención, un
vector según la presente invención o producido por una célula
huésped según la presente invención.
La memoria descriptiva también describe una
partícula de bacteriófago que presenta un/una
(poli)péptido/proteína en su superficie que puede obtenerse
mediante un método que comprende:
producir o permitir la unión de dicho/-a
(poli)péptido/proteína tras la expresión de un elemento del
recubrimiento proteico de dicha partícula de bacteriófago,
produciéndose dicha unión por la formación de un enlace disulfuro
entre un primer residuo de cisteína comprendido en dicho
(poli)péptido/proteína y un segundo residuo de cisteína
comprendido en dicho elemento del recubrimiento proteico.
\vskip1.000000\baselineskip
En otra realización, la presente invención se
refiere a una partícula de bacteriófago que presenta un/una
(poli)péptido/proteína unida a su superficie, produciéndose
dicha unión por la formación de un enlace disulfuro entre un primer
residuo de cisteína comprendido en dicho/-a
(poli)péptido/proteína y un segundo residuo de cisteína
comprendido en un elemento del recubrimiento proteico de dicha
partícula de bacteriófago, en la que dicha partícula de
bacteriófago contiene una secuencia de ácido nucleico para la
expresión de dicho/-a (poli)péptido/proteína.
En una realización preferida, la partícula de
bacteriófago contiene además un vector que comprende una o más
secuencias de ácido nucleico que codifican para dicho/-a
(poli)péptido/proteína.
En una realización más preferida de la presente
invención, la partícula de bacteriófago contiene un vector según la
presente invención, en la que dicho vector comprende una secuencia
de ácido nucleico que codifica para una proteína de recubrimiento
de bacteriófago de tipo natural modificada y además una o más
secuencias de ácido nucleico que codifican para un/una
(poli)péptido/proteína, y lo más preferiblemente que
comprenden al menos un dominio funcional de una
inmunoglobulina.
Por analogía, las realizaciones preferidas del
método de la presente invención referido anteriormente en el
presente documento, se aplican a los bacteriófagos de la presente
invención.
En una realización adicional, la presente
invención se refiere a una colección diversa de partículas de
bacteriófago según la presente invención, en el que cada una de
dichas partículas de bacteriófago presenta un/una
(poli)péptido/proteína de una colección diversa de
(poli)péptidos/proteínas. Una "colección diversa de
partículas de bacteriófago" puede designarse también como una
"biblioteca" o una "pluralidad de partículas de
bacteriófago". Cada elemento de una biblioteca de este tipo
presenta un elemento distinto de la biblioteca.
En el contexto de la presente invención el
término "colección diversa" se refiere a una colección de al
menos dos partículas o moléculas que difieren en al menos parte de
sus composiciones, propiedades y/o secuencias. Por ejemplo, una
colección diversa de (poli)péptidos/proteínas es un conjunto
de (poli)péptidos/proteínas que difieren en al menos una
posición de aminoácido de su secuencia. Una colección diversa de
(poli)péptidos/proteínas de este tipo puede obtenerse de
varias maneras, por ejemplo, mediante mutagénesis aleatoria de al
menos un codón de una secuencia de ácido nucleico que codifica
un/una (poli)péptido/proteína inicial, usando una PCR
propensa al error para amplificar una secuencia de ácido nucleico
que codifica para un/una (poli)péptido/proteína inicial, o
usando cadenas de mutación ("mutator strains") como células
huésped en un método según la presente invención. Estos y los
métodos adicionales o alternativos para la generación de colecciones
diversas de (poli)péptidos/proteínas se conocen bien por el
experto en la técnica. Una "colección diversa de partículas de
bacteriófago" pueden designarse como una biblioteca o una
pluralidad de partículas de bacteriófago. Cada elemento de una
biblioteca de este tipo presenta un elemento distinto de la
biblioteca.
En otra realización, la invención se refiere a
un método para obtener un/una (poli)péptido/proteína que
tiene una propiedad deseada que comprende:
(a) proporcionar la colección diversa de
partículas de bacteriófago según la presente invención; y
(b) detectar dicha colección diversa y/o
seleccionar de dicha colección diversa para obtener al menos una
partícula de bacteriófago que presenta un/una
(poli)péptido/proteína que tenga dicha propiedad deseada.
\vskip1.000000\baselineskip
En el contexto de la presente invención el
término "propiedad deseada" se refiere a una propiedad
predeterminada que debe tener uno de los/las
(poli)péptidos/proteínas de la colección diversa de
(poli)péptidos/proteínas y que constituye la base para la
detección y/o selección de la colección diversa. Tales propiedades
comprenden propiedades tales como la unión a una diana, el bloqueo
de una diana, la activación de una reacción mediada por diana, la
actividad enzimática, y propiedades adicionales que se conocen bien
por el experto en la técnica. Dependiendo del tipo de propiedad
deseada, un experto en la técnica podrá identificar el formato y las
etapas necesarias para realizar la detección y/o selección.
El más preferido es un método en el que dicha
propiedad deseada es la unión a una diana de interés.
Dicha diana de interés puede presentarse a dicha
colección diversa de partículas de bacteriófago de varias maneras
bien conocidas por el experto en la técnica, tal como recubierta
sobre superficies para el cribado biológico en fase sólida
("solid phase biopanning"), unida a partículas tales como
perlas magnéticas para el cribado biológico en disolución, o
presentada en la superficie de células para el cribado biológico de
células enteras o el cribado biológico en cortes de tejido. Las
partículas de bacteriófago que se hayan unido a dicha diana pueden
recubrirse por varios métodos bien conocidos por el experto en la
técnica, tal como mediante elución con tampones apropiados, o bien
usando un gradiente de pH o de sal, o bien mediante elución
específica usando una diana soluble.
En una realización preferida, el método para
obtener un/una (poli)péptido/proteína comprende
adicionalmente:
(ba) poner en contacto dicha colección diversa
de partículas de bacteriófago con la diana de interés;
(bb) eluir partículas de bacteriófago que no se
unen a la diana de interés;
(bc) eluir partículas de bacteriófago que se
unen a la diana de interés, tratando en condiciones reductoras los
complejos de diana de interés y bacteriófagos que se unen a dicha
diana de interés formados en la etapa (ba).
\vskip1.000000\baselineskip
En condiciones reductoras, tales como por la
incubación con DTT, los enlaces disulfuro se escinden permitiendo
así recuperar las partículas de bacteriófago específicas para más
series de cribado biológico y/o para la identificación de la/las
(poli)péptidos/proteínas que se unen específicamente a dicha
diana.
Figura 1a: mapa del vector de constructo
pMorphX7-hag2-LH.
Figura 1b: secuencia del vector de
pMorphX7-hag2-LH.
Figura 2: secuencia del vector de
Ptft74-N1-hag-HIPM
Figura 3: secuencia del vector de
Pqe60-MacI
Figura 4: Unión específica de scFv presentado
en fagos no modificados mediante ingeniería.
Los fagos derivados de constructos
pMorphX7-MacI5-LCH,
pMorphX7-MacI5-LHC y
pMorphX7-MacI5-LH se produjeron
mediante procedimientos convencionales y se incubaron previamente en
PBSTM o bien con DTT 5 mM (+DTT) o bien sin DTT. Se recubrieron
placas de microtitulación Maxisorp Nunc-Immuno con 5
\mug/pocillo de antígeno específico (MacI, columnas oscuras) así
como con antígeno de control inespecífico (BSA, columnas claras) y
se incubaron con 1 x 10^{10} fagos/pocillo, respectivamente. Se
detectaron fagos unidos mediante conjugado
anti-M13-HRP y sustrato soluble
azul BM. Se usaron fagos derivados a partir de un vector de
presentación de fago convencional pMorph13-MacI5
como control (3 x 10^{7} fagos/pocillo). Los detalles del
experimento se dan en el ejemplo 1.
Figura 5: Unión específica de scFv presentado
en fagos no modificados mediante ingeniería.
Los fagos derivados de constructos
pMorphX7-hag2-LCH,
pMorphX7-hag2-LHC y
pMorphX7-hag2-LH se produjeron
mediante procedimientos convencionales y se incubaron previamente
en PBSTM o bien con DTT 5 mM (+DTT) o bien sin DTT. Se recubrieron
placas de microtitulación Maxisorp Nunc-Immuno con 5
\mug/pocillo de antígeno específico (N1-hag,
columnas oscuras) así como con antígeno de control inespecífico
(BSA, columnas claras) y se incubaron con 1 x 10^{10}
fagos/pocillo, respectivamente. Se detectaron fagos unidos mediante
conjugado anti-M13-HRP y sustrato
soluble azul BM. Se usaron fagos derivados a partir de un vector de
presentación de fago convencional pMorph13-hag2
como control (3 x 10^{7} fagos/pocillo). Los detalles del
experimento se dan en el ejemplo 1.
Figura 6a: Mapa del vector de constructo
pbr-C-gIII.
Figura 6b: Secuencia de casete de expresión
para pIII de longitud total con un residuo de cisteína
N-terminal (C-gIII).
Figura 6c: Secuencia de casete de expresión
para pIII truncado con un residuo de cisteína
N-terminal (C-gIIICT).
Figura 7a: Mapa del vector de constructo
pMorph18-C-gIII-hag2-LHC.
Figura 7b: Secuencia del vector de
pMorph18-C-gIII-hag2-LHC.
Figura 8: Detección de scFv
MacI-5 presentado en fagos modificados mediante
ingeniería - sistema de dos vectores.
Los fagos derivados de constructos
pMorphX7-MacI-5-LH/pBR-C-gIII
(carriles 1 y 5),
pMorphX7-MacI-5-LHC/
pBR-C-gIII (carriles 2 y 6), pMorphX7-MacI-5-LHC (carriles 3 y 7) y pMorphX7-MacI-5-LH (carriles 4 y 8) se produjeron mediante procedimientos convencionales. Se incubaron previamente 1-5 x 10^{10} fagos en PBS con DTT (carriles 1-4) o sin DTT (carriles 5-8). Se añadió tampón de carga de SDS sin agentes reductores, los fagos se aplicaron a un gel de PAA en SDS al 4-15% Ready y se analizaron en inmunotransferencias. La detección de los scFv asociados con fagos se realizó mediante anticuerpo anti-FLAG M1, conjugado anti-ratón-IgG-AP y sustrato Fast BCIP/NPT (6A) y mediante anticuerpo anti-pIII, conjugado anti-ratón-IgG-AP y sustrato Fast BCIP/NPT (6B). El marcador de intervalo bajo (Amersham nºRPN756) se marca como M. Los datos experimentales se dan en el ejemplo 2.1.
pBR-C-gIII (carriles 2 y 6), pMorphX7-MacI-5-LHC (carriles 3 y 7) y pMorphX7-MacI-5-LH (carriles 4 y 8) se produjeron mediante procedimientos convencionales. Se incubaron previamente 1-5 x 10^{10} fagos en PBS con DTT (carriles 1-4) o sin DTT (carriles 5-8). Se añadió tampón de carga de SDS sin agentes reductores, los fagos se aplicaron a un gel de PAA en SDS al 4-15% Ready y se analizaron en inmunotransferencias. La detección de los scFv asociados con fagos se realizó mediante anticuerpo anti-FLAG M1, conjugado anti-ratón-IgG-AP y sustrato Fast BCIP/NPT (6A) y mediante anticuerpo anti-pIII, conjugado anti-ratón-IgG-AP y sustrato Fast BCIP/NPT (6B). El marcador de intervalo bajo (Amersham nºRPN756) se marca como M. Los datos experimentales se dan en el ejemplo 2.1.
Figura 9: Detección de scFv presentado en
fagos modificados mediante ingeniería - sistema de un
vector.
Los fagos derivados de constructos
pMorph18-C-gIII-hag2-LHC
(carriles 1-8; 7A),
pMorph18-C-gIII-AB1.1-LHC
(carriles 1, 2, 5 y 6; 7B), y
pMorph18-C-gIII-MacI-5-LHC
(carriles 3, 4, 7 y 8; 7B) se produjeron mediante procedimientos
convencionales. Se incubaron previamente 1-5 x
10^{10} fagos en PBS con DTT (carriles 1, 2, 5 y 6; 7A y carriles
1-4; 7B) o sin DTT (carriles 3, 4, 7 y 8; 7A y
carriles 5-8; 7B). Se añadió tampón de carga de SDS
sin agentes reductores, los fagos se aplicaron a un gel de PAA en
SDS al 4-15% Ready y se analizaron en
inmunotransferencias. La detección de los scFv asociados con fagos
se realizó mediante anticuerpo anti-FLAG M1,
conjugado
anti-ratón-IgG-AP y
sustrato Fast BCIP/NPT (carriles 1-4; 7A) y mediante
anticuerpo anti-pIII, conjugado
anti-ratón-IgG-AP y
sustrato Fast BCIP/NPT (carriles 5-8; 7A y carriles
1-8; 7B). El marcador de intervalo bajo (Amersham
nºRPN756) se marca como M. Los detalles experimentales se dan en el
ejemplo 2.1.
\newpage
Figura 10: Unión específica de scFv
presentado en fagos modificados mediante ingeniería - Comparación de
los diferentes sistemas de dos vectores.
Los fagos derivados de constructos
pMorphX7-MacI-5-LHC/pBR-C-gIII
(1),
pMorphX7-MacI-5-LHC/pBR-C-gIIICT
(2),
pMorphX7-MacI5-LHC/pUC-C-gIII
(3),
pMorphX7-MacI-5-LHC/pUC-C-gIIICT
(4),
pMorphX7-MacI-5-LHC
(5),
pMorphX7-MacI-5-LH
(6) y el vector de presentación de fago convencional
pMorph13-MacI-5 (7) se produjeron
mediante procedimientos convencionales. Se recubrieron placas de
microtitulación Maxisorp Nunc-Immuno con 5
\mug/pocillo de antígeno específico (MacI) así como con antígeno
de control inespecífico (BSA, datos no mostrados) y se incubaron
con una gama de 6,4 x 10^{6} y 1x10^{11} fagos/pocillo. Se
detectaron fagos unidos mediante conjugado
anti-M13-HRP y sustrato azul BM. Los
detalles experimentales se dan en el ejemplo 2.1.
Figura 11: Unión específica de scFv
presentado en fagos modificados - Comparación de los sistemas de uno
y dos vectores.
Los fagos derivados de constructos
pMorphX7-MacI-5-LHC/pBR-C-gIII
(1),
pMorphX7-MacI-5-LHC/pBR-C-gIIICT
(2),
pMorph18-C-gIII-MacI-5-LHC
(3),
pMorph18-C-gIIICT-MacI-5-LHC
(4), y
pMorphX7-MacI-5-LHC
(5) se produjeron mediante procedimientos convencionales. Se
recubrieron placas de microtitulación Maxisorp
Nunc-Immuno con 5 \mug/pocillo de antígeno
específico (MacI, columnas oscuras) así como con antígeno de control
inespecífico (BSA, columnas claras) y se incubaron con 1 x
10^{10} y 1 x 10^{9} fagos, respectivamente. Se detectaron
fagos unidos mediante conjugado
anti-M13-HRP y sustrato azul BM. Los
detalles experimentales se dan en el ejemplo
2.1.
2.1.
Figura 12: Unión específica de scFv
presentado en fagos modificados mediante ingeniería - Comparación de
proteínas del gen IX y del gen III modificadas mediante ingenería
en el sistema de un vector.
Los fagos derivados de constructos
pMorph18-C-gIII-MacI-5-LHC
(1),
pMorph18-C-gIIICT-MacI-5-LHC
(2),
pMorph18-C-gIX-MacI-5-LHC
(3),
pMorphX7-MacI-5-LHC
(4) y el vector de presentación de fago convencional
pMorph13-MacI-5 (5) se produjeron
mediante procedimientos convencionales. Se recubrieron placas de
microtitulación Maxisorp Nunc-Immuno con 5
\mug/pocillo de antígeno específico (MacI, columnas oscuras) así
como con antígeno de control inespecífico (BSA, columnas claras) y
se incubaron con 1 x 10^{10}, 1 x 10^{9} y 1 x 10^{8} fagos,
respectivamente. Se detectaron fagos unidos mediante conjugado
anti-M13-HRP y sustrato azul BM. Los
detalles experimentales se dan en el ejemplo 2.1.
Figura 13: Unión específica de scFv
presentado en fagos modificados mediante ingeniería - Impacto del
DTT.
Los fagos derivados de constructos
pMorph18-C-gIII-MacI-5-LHC
(1),
pMorph18-C-gIIICT-MacI-5-LHC
(2),
pMorph18-C-gIX-MacI-5-LHC
(3),
pMorphX7-MacI-5-LHC
(4) y el vector de presentación de fago convencional
pMorph13-MacI-5 (5) se produjeron
mediante procedimientos convencionales y se incubaron previamente en
PBSTM, o bien con DTT 5 mM (+) o sin DTT (-). Se recubrieron placas
de microtitulación Maxisorp Nunc-Immuno con 5
\mug/pocillo de antígeno específico (MacI, columnas oscuras) así
como con antígeno de control inespecífico (BSA, columnas claras) y
se incubaron con 1 x 10^{10} fagos, respectivamente. Se
detectaron fagos unidos mediante conjugado
anti-M13-HRP y sustrato azul BM.
Los detalles experimentales se dan en el ejemplo 2.1.
Figura 14: Especificidad de scFv
seleccionados - cribado de agrupaciones preseleccionadas frente a
N1-MacI.
Se expresaron scFv seleccionados tras dos series
del cribado de presentación-cys frente al antígeno
N1-MacI a partir de la agrupación de la
cadena-\kappa (1-5) y
cadena-\lambda (6-8) según los
procedimientos convencionales. Se recubrieron placas de 384
pocillos (Maxisorp; Nunc) con 0,1 \mug/pocillo de leche en polvo
(A), BSA (B), FITC-BSA (C, FITC acoplado a BSA),
N1-hag (D), N1-Np50 (E) y
N1-MacI (N1-MacI) y se incubaron con
10 \mul de disolución de scFv, respectivamente. Se detectaron
scFv unidos mediante una mezcla de anti-Flag M1,
anti-Flag M2 y conjugado
anti-ratón-IgG-AP,
así como, sustrato de fluorescencia AttoPhos (Roche nº1484281). Cada
scFv se sometió a prueba por cuadruplicado y se presentan los
valores medios.
Figura 15: Especificidad de scFv
seleccionados - Cribado de agrupaciones preseleccionadas frente a
N1-Np50.
Se expresaron scFv seleccionados tras dos series
del cribado de presentación-cys frente al antígeno
N1-Np50 (1-8) según los
procedimientos convencionales. Se recubrieron placas de 384 pocillos
(Maxisorp; Nunc) con 0,1\mug/pocillo de leche en polvo (A), BSA
(B), FITC-BSA (C, FITC acoplado a BSA),
N1-hag (D), N1-MacI (E) y
N1-Np50 (N1-Np50) y se incubaron con
10 \mul de disolución de scFv, respectivamente. Se detectaron scFv
unidos mediante una mezcla de anti-Flag M1,
anti-Flag M2 y conjugado
anti-ratón-IgG-AP,
así como, sustrato de fluorescencia AttoPhos (Roche nº1484281).
Cada scFv se sometió a prueba por cuadruplicado y se presentan los
valores medios.
Figura 16a: Mapa del vector de constructo
pMorphX10-Fab-MacI5-VL-LHC-VH-FS.
Figura 16b: Secuencia del vector completa de
pMorphX10-Fab-MacI5-VL-LHC-VH-FS.
\newpage
Figura 17: Detección de Fab
ICAM1-C8 presentado en fagos modificados mediante
ingeniería.
Los fagos derivados de constructos
pMorphX10-Fab-ICAM1C8-VL-LHC-VH-MS/pBAD-SS-C-gIII
(carriles 5, 6, 11, 12),
pMorphX10-Fab-ICAM1C8-VL-LHC-VH-MS
(carriles 3, 4, 9, 10) y
pMorph18-Fab-ICAM1C8 (carriles 1, 2,
7, 8) se produjeron mediante los procedimientos convencionales. Se
incubaron previamente 1 x 10^{10} en PBS con DTT (carriles
1-6) o sin DTT (carriles 7-12). Se
añadió tampón de carga de SDS sin agentes reductores, los fagos se
aplicaron a un gel de PAA en SDS al 12% Ready y se analizaron en
inmunotransferencias. La detección se realizó mediante anticuerpo
anti-pIII, conjugado
anti-ratón-IgG-HRP y
sustrato de precipitación POD Azul BM. El marcador de peso
molecular de intervalo bajo (Amersham Life Science nºRPN756) se
marca como M. Experimental, los detalles se dan en el ejemplo
2.2.
Figura 18: Detección de Fab
MacI-A8 presentado en fagos modificados mediante
ingeniería.
Los fagos derivados de constructos
pMorphX10-Fab-MacIA8-VL-LHC-VH-MS/pBAD-SS-C-gIII
(carriles 5, 6, 11, 12),
pMorphX10-Fab-MacIA8-VL-LHC-VH-FS
(carriles 3, 4, 9, 10) y
pMorph18-Fab-MacIA8 (carriles 1, 2,
7, 8) se produjeron mediante los procedimientos convencionales. Se
incubaron previamente 1 x 10^{10} en PBS con DTT (carriles
1-6) o sin DTT (carriles 7-12). Se
añadió tampón de carga de SDS sin agentes reductores, los fagos se
aplicaron a un gel de PAA en SDS al 12% Ready y se analizaron en
inmunotransferencias. La detección se realizó mediante anticuerpo
anti-pIII, conjugado
anti-ratón-IgG-HRP y
sustrato de precipitación Azul BM. El marcador de peso molecular de
intervalo bajo (Amersham Life Science nºRPN756) se marca como M. Los
detalles experimentales se dan en el ejemplo 2.2.
Figura 19: Unión específica de Fab
presentados en fagos modificados mediante ingeniería - Fab
MacI-5.
Los fagos derivados de constructos
pMorphX10-Fab-MacI-5-VL-LHC-VH-FS/pBR-C-gIII
(1),
pMorphX10-Fab-MacI5-VL-VH-FS/pBR-C-gIII
(2),
pMorphX10-Fab-MacI5-VL-VH-CFS/pBR-C-gIII
(3),
pMorphX10-Fab-MacI5-VL-VH-LHC/pBR-C-gIII
(4),
pMorphX9-Fab-MacI5-FS
(5), y el vector de presentación de fago convencional
pMorph18-Fab-MacI5 (6) se produjeron mediante los procedimientos convencionales. Se recubrieron placas de microtitulación Maxisorp Nunc-Immuno con 5 \mug/pocillo de antígeno específico (N1-MacI) y se incubaron con 1 x 10^{8} (columnas claras) y 1 x 10^{9} (columnas oscuras) fagos por pocillo. Se detectaron fagos unidos mediante conjugado anti-M13-HRP y sustrato soluble azul BM. Cada columna representa el valor medio de tres preparaciones de fago independientes sometidas a prueba por duplicado. Los detalles experimentales se dan en el ejemplo 2.2.
pMorph18-Fab-MacI5 (6) se produjeron mediante los procedimientos convencionales. Se recubrieron placas de microtitulación Maxisorp Nunc-Immuno con 5 \mug/pocillo de antígeno específico (N1-MacI) y se incubaron con 1 x 10^{8} (columnas claras) y 1 x 10^{9} (columnas oscuras) fagos por pocillo. Se detectaron fagos unidos mediante conjugado anti-M13-HRP y sustrato soluble azul BM. Cada columna representa el valor medio de tres preparaciones de fago independientes sometidas a prueba por duplicado. Los detalles experimentales se dan en el ejemplo 2.2.
Figura 20: Unión específica de Fab
presentados en fagos modificados mediante ingenería - Fab
MacI-A8.
Los fagos derivados de constructos
pMorphX10-Fab-MacIA8-VL-LHC-VH-FS/pBR-C-gIII
(1),
pMorphX10-Fab-MacIA8-VL-C-VH-FS/pBR-C-gIII
(2),
pMorphX10-Fab-MacIA8-VL-VH-CFS/pBR-C-gIII
(3),
pMorphX10-Fab-MacIA8-VL-VH-LHC/pBR-C-gIII
(4),
pMorphX9-Fab-MacIA8-FS
(5), y el vector de presentación de fago convencional
pMorph18-Fab-MacIA8 (6) se
produjeron mediante los procedimientos convencionales. Se
recubrieron placas de microtitulación Maxisorp
Nunc-Immuno con 5 \mug/pocillo de antígeno
específico (N1-MacI) y se incubaron con 1 x 10^{9}
(columnas claras) y 1 x 10^{10} (columnas oscuras) fagos por
pocillo. Se detectaron fagos unidos mediante conjugado
anti-M13-HRP y sustrato soluble azul
BM. Cada columna representa el valor medio de tres preparaciones de
fago independientes sometidas a prueba por duplicado. Los detalles
experimentales se dan en el ejemplo 2.2.
Figura 21: Unión específica de Fab
presentados en fagos modificados mediante ingeniería - Fab
ICAM1-C8.
Los fagos derivados de constructos
pMorphX10-Fab-ICAM1C8-VL-LHC-VH-MS/pBR-C-gIII
(1),
pMorphX10-Fab-ICAM1C8-VL-C-VH-MS/pBR-C-gIII (2), pMorphX10-Fab-ICAM1C8-VL-VH-CMS/pBR-C-gIII (3), pMorphX10-Fab-ICAM1C8-VL-VH-LHC/pBR-C-gIII (4), pMorphX9-Fab-ICAM1C8-MS (5), pMorphX9-Fab-ICAM1C8-MS/pBR-C-gIII (6) se produjeron mediante los procedimientos convencionales. Se recubrieron placas de microtitulación Maxisorp Nunc-Immuno con 5 \mug/pocillo de antígeno específico (ICAM1, columnas oscuras) o con antígeno inespecífico (BSA, columnas claras), y se incubaron con 1 x 10^{9} fagos por pocillo. Se detectaron fagos unidos mediante conjugado anti-M13-HRP y sustrato soluble azul BM. Cada columna representa el valor medio de una preparación de fago sometida a prueba por duplicado. Los detalles experimentales se dan en el ejemplo 2.2.
pMorphX10-Fab-ICAM1C8-VL-C-VH-MS/pBR-C-gIII (2), pMorphX10-Fab-ICAM1C8-VL-VH-CMS/pBR-C-gIII (3), pMorphX10-Fab-ICAM1C8-VL-VH-LHC/pBR-C-gIII (4), pMorphX9-Fab-ICAM1C8-MS (5), pMorphX9-Fab-ICAM1C8-MS/pBR-C-gIII (6) se produjeron mediante los procedimientos convencionales. Se recubrieron placas de microtitulación Maxisorp Nunc-Immuno con 5 \mug/pocillo de antígeno específico (ICAM1, columnas oscuras) o con antígeno inespecífico (BSA, columnas claras), y se incubaron con 1 x 10^{9} fagos por pocillo. Se detectaron fagos unidos mediante conjugado anti-M13-HRP y sustrato soluble azul BM. Cada columna representa el valor medio de una preparación de fago sometida a prueba por duplicado. Los detalles experimentales se dan en el ejemplo 2.2.
Figura 22: Unión específica de Fab
presentados en fagos modificados mediante ingeniería - Impacto del
DTT.
Los fagos derivados de constructos
pMorphX10-Fab-MacI5-VL-LHC-VH-FS/pBR-C-gIII
(1),
pMorphX10-Fab-MacI5-VL-C-VH-FS/pBR-C-gIII
(2),
pMorphX10-Fab-MacI5-VL-VH-CFS/pBR-C-gIII
(3),
pMorphX10-Fab-MacI5-VL-VH-LHC/pBR-C-gIII
(4),
pMorphX9-Fab-MacI5-FS
(5), y el vector de presentación de fago convencional
pMorph18-Fab-MacI5 (6) se
produjeron mediante los procedimientos convencionales y se incubaron
previamente en PBSTM, o bien con DTT 10 mM (+) o bien sin DTT (-).
Se recubrieron placas de microtitulación Maxisorp
Nunc-Immuno con 5 \mug/pocillo de antígeno
específico (N1-MacI, columnas oscuras) así como con
antígeno de control inespecífico (BSA, columnas claras) y se
incubaron con 1 x 10^{9} fagos, respectivamente. Se detectaron
fagos unidos mediante conjugado
anti-M13-HRP y sustrato azul BM.
Cada columna representa el valor medio de una preparación de fago
sometida a prueba por duplicado. Los detalles experimentales se dan
en el ejemplo 2.2.
\newpage
Los ejemplos ilustran la invención.
En el ejemplo siguiente, todos los experimentos
de biología molecular se realizan según los protocolos
convencionales (Ausubel et al., 1999).
Todos los vectores usados son derivados de
fagémido de alto número de copias pMorphX7-LH
(figura 1a+b), un derivado de la serie del vector pCAL (documento
WO 97/08320; Knappik et al., 2000). El casete de expresión
comprende la secuencia señal phoA, un sitio de unión mínimo para el
anticuerpo monoclonal (mab) anti-FLAG M1 (Sigma
nºF-3040) (Knappik y Plückthun, 1994), un fragmento
de cadena sencilla (scFv), un ligador corto (PGGSG) y una etiqueta
de 6 x histidina (6His; Hochuli et al., 1988) (figura 1a). Se
han generado pMorphX7-LCH y
pMorphX7-LHC insertando casetes de oligonucleótidos
que codifican para Cys-6His y
6His-Cys, respectivamente, entre los sitios
AscI y HindIII únicos de pMorphX7-LH
(figura 1a, tabla 1). Todos los vectores expresan scFv soluble no
genéticamente fusionado a ninguna proteína de recubrimiento de fago.
El vector de presentación de fago convencional pMorph13, que se
basa en el vector pCAL4 descrito en el documento WO 97/08320 y
expresa una fusión de un scFv a la parte C-terminal
de la proteína de fago pIII, se usó como control positivo. Los scFv
se han intercambiado entre los vectores respectivos mediante los
sitios XbaI y EcoRI únicos (véase la figura 1a).
Todos los scFv derivan de una biblioteca de
anticuerpos combinatoria humana (HuCAL; documento WO 97/08320;
Knappik et al., 2000). Los genes consenso HuCAL VH y VL
(descritos en el documento WO 97/08320), y las secuencias CDR3 de
los scFv se dan en la tabla 2. Se seleccionó el clon hag2 frente a
un péptido de la hemaglutinina del virus de la influenza (aa
99-110 de hemaglutinina más aa flanqueantes
adicionales (mostrados en cursiva,
CAGPYDVPDYASLRSHH), y el clon MacI-5
frente a un fragmento (MacI) de cadena alfa de CR-3
humano (SWISS-PROT entrada P11215, aa
149-353 de CR-3 alfa humano
fusionado a una secuencia C-terminal que contiene
una etiqueta de 6 x histidina). Los antígenos correspondientes para
ELISA y experimentos con bibliotecas dopadas se obtuvieron tal como
sigue. El antígeno específico de hag2, N1-hag, se
produjo usando el vector de expresión
pTFT74-N1-hag-HIPM,
un derivado del vector pTFT74 (Freund et al., 1993) (figura
2). N1-hag comprende los aa 1-82 de
la proteína III del gen maduro del fago M13 que contiene un residuo
de metionina adicional en el N-terminal (N1)
fusionado a la secuencia de aminoácido PYDVPDYASLRSHHHHHH
(hag) que comprende los aa 99-110 de la
hemaglutinina del virus de la influenza y una etiqueta de 6 x
histidina (en cursiva). La expresión, la purificación y el
replegamiento de N1-hag se realizó tal como se
describió (Krebber, 1996; Krebber et al., 1997). Como
antígeno para MacI-5, se usó un fragmento
purificado (MacI) de cadena alfa de CR-3 humano
(SWISS-PROT entrada P11215) fusionado a una
etiqueta de 6 x histidina C-terminal. Concretamente,
el casete de expresión codifica para una metionina
N-terminal, los aminoácidos 149-353
de alfa CR-3 humano y los aminoácidos IEGRHHHHHH.
Este casete está flanqueado por sitios de restricción únicos
BspHI y HindIII y puede introducirse, por ejemplo, en
los sitios únicos NcoI y HindIII de
pQE-60 (QIAGEN GMBH, Hilden, Alemania), produciendo
el vector de expresión pQE60-MacI (figura 3). La
expresión y purificación se realizó usando los métodos
convencionales (The QIAexpressionist^{TM} 3ª edición: A handbook
for high-level expresión and purification of
6xHis-tagged proteins (julio de 1998). QIAGEN GMBH,
Hilden, Alemania). La albúmina sérica bovina (BSA, Sigma nºA7906) se
usó como antígeno de control negativo.
Para demostrar que los scFv presentados son
funcionales con respecto al reconocimiento de sus antígenos
específicos, se realizaron ELISA del fago. El análisis se realizó
para los dos scFv de HuCAL, hag2 y MacI-5. Se
analizaron tres sistemas de expresión que difieren en los módulos
fusionados al C-terminal del scFv, concretamente
pMorphX7-LH, pMorphX7-LHC y
pMorphX7-LCH.
Se produjeron fagos según los procedimientos
convencionales usando fago auxiliar VCSM13 (Kay et al.,
1996). Se recubrieron placas de microtitulación Nunc Maxisorp (nº
442404) con antígeno específico o antígeno de control (BSA, Sigma
nºA7906) durante 12 h a 4ºC y a una concentración de 5
\mug/pocillo en PBS. Los fagos se incubaron previamente en PBSTM
(PBS que contiene leche descremada en polvo al 5% y Tween 20 al
0,1%), bien con o bien sin DTT 5 Mm, durante 2 h a temperatura
ambiente antes de aplicarse al pocillo de ELISA recubierto con
antígeno a una concentración de 1 x 10^{10} fagos por pocillo,
excepto para pMorph13 que se usó a una concentración de 3 x
10^{7} fagos por pocillo. Tras la unión durante 1 h a temperatura
ambiente, los fagos no unidos específicamente se eliminaron por
lavado con PBS que contenía Tween 20 al 0,05% y los fagos unidos se
detectaron en ELISA usando un conjugado
anti-M13-HRP (Amersham Pharmacia
Biotech nº27-9421-01) y azul BM
soluble (Boehringer Mannheim nº1484281). Se midió la absorbancia a
370 nm. Las señales de ELISA obtenidas con el antígeno específico se
compararon con las del antígeno de control. Pudo mostrarse la unión
específica de fagos que presentaban scFv al antígeno. Como ejemplo,
en las figuras 4 y 5 se muestran dos ELISA de este tipo para scFv
hag2 y MacI-5, respectivamente. Con fagos derivados
de pMorphX7-LCH y pMorphX7-LHC se
alcanzaron señales entre 1,9 y 5,8 veces superiores el fondo.
Cuando se añadió DTT 5 mM a los fagos antes de la unión de antígeno
durante la etapa de incubación previa, la señal de ELISA disminuyó
hasta casi los niveles de fondo, mientras que el DTT no tuvo un
efecto muy importante sobre los fagos de presentación convencional
(pMorph13).
Para demostrar que fagos no modificados mediante
ingeniería que presentan scFv pueden enriquecerse sobre antígeno
específico, se realizó un experimento llamado de biblioteca dopada.
Se mezclaron fagos específicos con un elevado exceso de fagos
inespecíficos y se realizaron tres series de cribado sobre antígeno
específico. Se determinó el enriquecimiento para los fagos
específicos tras cada serie. El análisis se realizó para HuCAL scFv
hag2 y MacI-5 en el vector
pMorhX7-LHC.
Se mezclaron fagos derivados de
pMorphX7-hag2-LHC y
pMorphX7-MacI-5-LHC
en proporciones de 1:10^{5} (cribado de
pMorphX7-hag2-LHC) así como
10^{5}:1 (cribado de
pMorphX7-MacI-5-LHC).
Se realizaron tres series de cribado sobre el antígeno específico
hag2 y MacI-5, respectivamente. Los fagos se
prepararon mediante los procedimientos convencionales y se
bloquearon previamente mediante la mezcla 1:1 con PBSTM (PBS, leche
descremada en polvo al 5%, Tween 20 al 0,1%) e incubación durante 2
h a TA (temperatura ambiente). Se recubrieron los pocillos de
microtitulación Nunc (nº442404) con antígeno específico
N1-hag (así como BSA) a una concentración de 5
\mug/pocillo en PBS durante la noche a 4ºC, y posteriormente se
bloquearon con 400 \mul de PBSM (PBS, leche descremada en polvo
al 5%) durante 2 h a TA. Durante la primera serie, se aplicaron
10^{11} fagos bloqueados previamente por pocillo y se incubaron
durante 1 h a TA sobre un agitador de placas de microtitulación. Se
retiró la disolución de fago y los pocillos se lavaron 3 veces con
PBST (PBS, Tween 20 al 0,05%) y 3 veces con PBS. Se eluyeron los
fagos unidos con trietilamina 100 mM según los protocolos
convencionales y se usaron para la infección de células TG1.
Además, los fagos residuales se eluyeron mediante infección directa
de las TG1 añadidas a los pocillos. Tras cada serie de cribado
sobre el antígeno específico, se determinó la proporción de fagos
específicos con respecto inespecíficos mediante el análisis de al
menos 46 células infectadas independientes mediante PCR. La PCR se
realizó según los protocolos convencionales usando colonias simples
como fuente de molde y oligonucleótidos específicos para VH CDR3 y
VL CDR3 de cada scFv como cebadores. Tras 3 series de cribado, se
obtuvieron \sim4% de clones positivos (4 de 93 clones analizados)
para el cribado de pMorphX7-hag2-LHC
y se obtuvieron \sim90% de clones positivos (82 de 91 clones
analizados) para el cribado de
pMorphX7-MacI-5-LHC.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
2.1
El ejemplo 1 descrito anteriormente muestra que
pueden presentarse scFv funcionales sobre fagos no modificados
mediante ingeniería a través de enlaces disulfuro. Este sistema
puede mejorarse adicionalmente, por ejemplo, a través de
modificación mediante ingeniería de una cisteína expuesta sobre una
proteína de recubrimiento de fago. Una proteína de recubrimiento de
fago candidato es la proteína III (pIII) que se compone de tres
dominios N1, N2 y pIIICT. Posibles sitios para ubicar un residuo de
cisteína impar son las regiones ligadoras entre los dominios o el
N-terminal expuesto del dominio o la pIIICT en una
versión de pIII truncada. Un ejemplo adicional sería una proteína
IX de recubrimiento de fago (pIX) en la que la cisteína podría,
ligarse, por ejemplo, al N-terminal de la proteína
de longitud total. En principio, los casetes para la expresión de
tales proteínas modificadas pueden colocarse en el vector que está
proporcionando el scFv (sistema de un vector), o un vector separado
(sistema de dos vectores).
A continuación, se describirán los experimentos
en los que se modificaron mediante ingeniería tanto una versión de
pIII de longitud total, como truncada, así como de pIX. Estas
proteínas se expresaron conjuntamente en la misma célula bacteriana
junto con el scFv, bien a partir del mismo fagémido (derivados de
pMorph18-C-gIII-scFv-LHC;
sistema de un vector) o bien a partir de un plásmido independiente
(pBR322-C-g III o
pUC19-C-g III y derivados; sistema
de dos vectores).
Los casetes de expresión de proteína de
recubrimiento de fago para el sistema de dos vectores se
construyeron como sigue: se elaboraron dos casetes de expresión
diferentes flanqueados por sitios de restricción únicos NheI
y HindIII en los extremos ubicando un residuo de cisteína
impar en el N-terminal expuesto del dominio N1 de
la pIII (C-gIII) madura de longitud total o en el
N-terminal del dominio pIIICT de la proteína
truncada (aminoácidos 216 a 406 de la proteína pIII;
C-gIIICT) (figura 6 b+c)). Ambos casetes de
expresión se encuentran bajo el control de la región del
operador/promotor lac y comprenden la secuencia señal ompA,
aminoácidos DYCDIEF y la pIII o pIIICT ORF (las secuencias de
aminoácidos completas se dan en la tabla 3). Se obtuvieron
plásmidos que expresan las proteínas pIII modificadas insertando
estos casetes de NheI-HindIII en el plásmido pBR322 y
pUC19 mediante los sitios únicos NheI y HindIII o
XbaI y HindIII, respectivamente. Como ejemplo, el
mapa del vector de pBR-C-gIII se
representa en la figura 6a. Los plásmidos resultantes,
pBR-C-gIII,
pBR-C-gIIICT,
pUC-C-gIII y
pUC-C-gIIICT, se transformaron
conjuntamente con fagémidos de pMorphX7-LHC que
expresaban el scFv modificado (ejemplo 1) en E.coli TG1
seleccionando para ambos marcadores de antibiótico.
En el sistema de un vector tanto las proteínas
de recubrimiento de fago modificadas así como el scFv modificado se
expresaron a partir de un fagémido dicistrónico bajo el control de
la región de operador/promotor lac. El primer casete de expresión
comprende la secuencia señal ompA, los aminoácidos DYCDIEF y el ORF
para la proteína de recubrimiento de fago respectiva o una parte de
la misma. El residuo de cisteína impar se unió al
N-terminal expuesto del dominio N1 de la pIII madura
de longitud total (C-gIII), al
N-terminal de la proteína III truncada (aminoácidos
216 a 406 de proteína p III; C-gIIICT) y al
N-terminal de proteína IX (C-gIX),
respectivamente (las secuencias de aminoácido se dan en la tabla
4). El segundo casete de expresión comprende la secuencia señal
phoA, el ORF del scFv respectivo, un ligador corto (PGGSG), una
etiqueta de 6x histidina (6His; Hochuli et al., 1988) y el
residuo de cisteína simple (véase pMorphX7-LHC,
tabla 1). La secuencia del vector completa de
pMorph18-C-gIII-hag2-LHC
que codifica para la pIII de longitud total modificada, así como
hag2 de scFv modificado y el mapa del vector respectivo se dan en
la figura 7 a+b. Las proteínas de recubrimiento de fago diferentes
pueden intercambiarse mediante EcoRI y StuI en un
procedimiento de clonación de tres fragmentos debido a un segundo
sitio EcoRI en el extremo 3' de los scFv. Los diferentes scFv
modificados mediante ingeniería pueden clonarse mediante los sitios
únicos MfeI y HindIII. Un derivado de este vector,
pMorph20-C-gIII-hag2-LHC,
contiene un sitio único EcoRI en el extremo 3' del scFv
mientras que el segundo sitio (entre la secuencia señal ompA y el
ORF de gIII) se sometió a deleción mediante mutagénesis silenciosa
en PCR. Este constructo permite la clonación de scFv o agrupaciones
scFv mediante los sitios únicos SphI y EcoRI.
Pueden producirse fagos para aplicaciones de
cribado biológico usando el fago auxiliar VCSM13 siguiendo los
protocolos convencionales (Kay et al., 1996). Además de la
proteínas de fago auxiliares, se expresaron conjuntamente proteína
de recubrimiento de fago modificado mediante ingeniería y scFv
modificado soluble a partir de los sistemas de un o de dos vectores
descritos anteriormente. Para demostrar que los scFv se unen a las
proteínas de fago de recubrimiento modificado mediante ingeniería a
través de puentes disulfuro y se incorporan en partículas de fago,
se corrieron fagos que presentaban scFv en SDS PAGE en condiciones
no reductoras y reductoras. Se realizó un análisis de
inmunotransferencia de tipo Western con antisueros
anti-pIII y anti-Flag M1.
Se produjeron fagos según procedimientos
convencionales usando fago auxiliar VCSM13 (Kay et al.,
1996). Se incubaron previamente fagos en PBS con DTT 5 mM o sin DTT
(condiciones reductoras y no reductoras, respectivamente) durante
30 minutos a temperatura ambiente antes de añadir tampón de carga de
SDS sin agentes reductores tales como DTT o
\beta-mercaptoetanol. Se corrieron
1-5 x 10^{10} fagos por carril en un SDS PAGE al
4-15% (BioRad) y se sometieron a
inmunotransferencia sobre membranas de PVDF. Para la
inmunotransferencia de tipo Western anti-pIII, la
membrana se bloqueó en MPBST (tampón PBS que contenía leche en polvo
al 5% y Tween 20 al 0,05%) y se reveló con
anti-pIII de ratón (dilución 1:250; Mobitec) como
anticuerpo primario, conjugado de
anti-ratón-IgG-AP
(dilución 1:10000; SIGMA) como anticuerpo secundario y comprimidos
de BCIP/NPT (SIGMA) como sustrato. Para la inmunotransferencia de
tipo Western anti-Flag M1, la membrana se bloqueó en
MTBST-CaCl_{2} (tampón TBS que contenía leche en
polvo al 5%, Tween 20 al 0,05% y CaCl_{2} 1 Mm) y se reveló con
anti-Flag M1 de ratón (dilución 1:5000; Sigma) como
anticuerpo primario, conjugado de
anti-ratón-IgG-AP
(dilución 1:10000; SIGMA) como anticuerpo secundario y comprimidos
de BCIP/NPT (SIGMA) como sustrato.
Las bandas específicas que migran a la altura
esperada para el scFv unido a la pIII de longitud total podrían
mostrarse tanto en el sistema de un vector, como en el de dos. Esta
señal sólo puede observarse en condiciones no reductoras y
desaparece con DTT indicando que pIII y scFv están unidos mediante
enlaces disulfuro
(scFv-S-S-pIII).
Como ejemplo para el sistema de dos vectores, en la figura 8 se
muestra una inmunotransferencia de tipo Western antiFlag M1 y
anti-pIII para scFv MacI-5. Cuando
se expresa el scFv sin cisteínas adicionales
(pMorph7x-MacI-5-LH),
únicamente puede detectarse scFv libre cohesionando a fagos en la
inmunotransferencia de tipo Western anti-Flag M1
(carril, 8, figura 8A). Cuando se añade una cisteína adicional al
scFv
(pMorphX7-MacI-5-LHC),
difícilmente pueden observarse esas bandas y aparece una banda que
migra a la altura de los dímeros de scFv
(scFv-S-S-scFv y/o
(scFv-SH)_{2}) (y una banda adicional
desconocida (scFv-S-SX)) (carril 7,
figura 8A). Cuando los scFv modificados mediante ingeniería se
expresan conjuntamente con una pIII modificada mediante ingeniería
que contiene una cisteína adicional en el
N-terminal
(pMorphX7-MacI-5-LHC
y pBR-C-gIII) las señales se
desplazan hasta un peso molecular correspondiente a heterodímeros
scFv-pIII
(scFv-S-S-pIII)
(carril 6, figura 8A). Tal como se esperó, esta señal de
scFv-S-S-pIII no
puede observarse cuando se expresan conjuntamente scFv no
modificados con la pIII modificada
(pMorphX7-MacI-5-LH
y pBR-C-gIII), aunque en cada carril
se cargan números de partículas de fagos similares (carril 5,
figura 8A). En presencia de agentes reductores, las señales
predominantes se obtienen a partir de scFv libres para todos los
sistemas de expresión (carriles 1-4, figura 8A). En
la inmunotransferencia de tipo Western anti-pIII,
puede observarse proteína III libre (pIII-SH y/o
pIII) para todos los sistemas de expresión tanto en condiciones
reductoras, como no reductoras (carriles 1- 8, figura 8B). Las
bandas específicas que migran a la altura esperada para dímeros de
proteína II unidos por enlace disulfuro
(pIII-S-S-pIII)
únicamente pueden detectarse en condiciones no reductoras cuando se
expresa la proteína III modificada (carriles 5 y 6 de la figura
8B). Únicamente cuando tanto el scFv modificado, mediante ingeniería
como la proteína III modificada mediante ingeniería se expresan
conjuntamente, aparece una banda adicional que migra a la altura de
scFv y proteína III unidos por enlace disulfuro
(scFv-S-S-pIII)
además de los dímeros de proteína III unidos por enlaces disulfuro
(carril 6, figura 8B). Esta banda corresponde en tamaño a la señal
de scFv-S-S-pIII
detectada en la inmunotransferencia de tipo Western
anti-Flag M1 (véase el carril 6, figura 8A) y es
sensible al DTT (véase el carril 2, figura 8A). Las bandas
sensibles al DTT migran a la altura de scFv y proteína III unidos
por enlace disulfuro, detectándose tanto con antisueros
anti-Flag M1, como anti-pIII, y se
observaron también cuando scFv modificado mediante ingeniería y
pIII modificada mediante ingeniería se expresaron conjuntamente a
partir del mismo fagémido
(pMorph18-C-pIII-scFv-LHC).
Como ejemplo de este sistema de un vector en las figuras 9A y 9B se
muestran, respectivamente, inmunotransferencias de tipo Western
anti-Flag M1 y anti-pIII para scFv
hag2 e inmunotransferencias de tipo Western
anti-pIII para scFv AB1.1 y
MacI-5.
Para mostrar que los scFv presentados son
funcionales con respecto al reconocimiento del antígeno específico,
se realizaron ELISA del fago. Los análisis se realizaron para los
HuCAL scFv MacI-5 y hag2. Para el sistema de dos
vectores, pMorphX7-LHC se transformó conjuntamente
con pBR-C-gIII,
pBR-C-gIIICT,
pUC-C-gIII y
pUC-C-gIIICT, respectivamente. Se
analizaron tres constructos de un vector diferentes, concretamente
pMorph18-C-gIII-scFv-LHC,
pMorph18-C-gIIICT-scFv-LHC
y
pMorph18-D-gIX-scFv-LHC.
Para demostrar que los scFv se unen a las proteínas de
recubrimiento de fago modificadas mediante ingeniería a través de
enlaces disulfuro, se realizaron ELISA del fago tanto en
condiciones reductoras, como no reductoras.
Se produjeron fagos según los procedimientos
convencionales usando fago auxiliar VCSM13 y se determinaron las
titulaciones del fago (Kay et al., 1996). Placas Nunc
Maxisorp de microtitulación (nº 442404) se recubrieron con antígeno
específico o antígeno de control (BSA, Sigma nº A7906) durante 12
horas a 4ºC en una cantidad de 5 \mug/pocillo en PBS y se
bloquearon con PBS que contenía leche descremada en polvo al 5%
durante 2 h. Los fagos se incubaron previamente en PBS que contenía
2,5% de leche descremada en polvo, Tween 20 al 0,05%, así como DTT
5 mM, si correspondía, durante 2 h a temperatura ambiente antes de
aplicarse al pocillo de ELISA recubierto con antígeno a un
intervalo de concentración de entre 6,4 x 10^{6} y 1 x 10^{11}
fagos por pocillo. Tras la unión durante 1 h a TA, se eliminaron
los fagos unidos de manera inespecífica mediante lavado con PBS que
contenía Tween 20 al 0,05% y los fagos unidos se detectaron en ELISA
usando un conjugado anti-M13-HRP
(Amersham Pharmacia Biotech nº
27-9421-01) y azul BM soluble
(Boehringer Mannheim nº 1484281). Se midió la absorbancia a 370 nm.
Las señales de ELISA obtenidas con el antígeno específico se
compararon con las del antígeno de control. Pudo mostrarse la unión
específica de fagos que presentaban scFv al antígeno para los
constructos de C-gIII, C-gIIICT y
C-gIX en el formato de un vector. También se
sometieron a prueba a C-gIII y
C-gIIICT y, ambas, demostraron funcionar en sistemas
de dos vectores. Como ejemplo, en las figuras 10-13,
se presentan cuatro ELISA de este tipo para scFv
MacI-5. En todos los casos en los que las proteínas
de recubrimiento de fago se modifican mediante ingeniería con un
residuo de cisteína adicional, las señales de ELISA aumentan
significativamente en comparación con las señales de
pMorphX7-LHC en las que sólo scFv lleva una cisteína
adicional. Cuando se añadió DTT 5 mM a los fagos antes de la unión
de antígeno durante la etapa de incubación previa, la señal de
ELISA disminuyó hasta casi los niveles de fondo para los tres
constructos de recubrimiento de fago modificados mediante
ingeniería, así como los fagos pMorphX7-LHC no
modificados mediante ingeniería, mientras que el DTT no tuvo un
efecto muy importante sobre los fagos de presentación convencionales
(pMorph13; figura 13). Esto muestra que tanto para los fagos
modificados mediante ingeniería, como para los no modificados
mediante ingeniería, los enlaces de disulfuro son esenciales para la
presentación funcional de scFv en fagos y, por tanto, para la unión
específica de fagos que presentan scFv al
antígeno.
antígeno.
Para demostrar que fagos no modificados mediante
ingeniería que presentan scFv pueden enriquecerse sobre antígeno
específico, se realizó un experimento de "biblioteca dopada":
se mezclaron fagos específicos con un elevado exceso de fagos
inespecíficos y se realizaron tres series de cribado sobre antígeno
específico. Se determinó el enriquecimiento para fagos específicos
tras cada serie. El análisis se realizó para los dos HuCAL scFv
hag2 y MacI-5 en el sistema de un vector
pMorph18-C-gIII-scFv-LHC.
Se mezclaron los fagos derivados de
pMorph18-C-gIII-hag2-LHC
y
pMorph18-C-gIII-MacI-5-LHC
en proporciones de 1:10^{5} (cribado de
pMorph18-C-gIII-hag2-LHC)
así como 10^{5}:1 (cribado de
pMorph18-C-gIII-MacI-5-LHC).
Se realizaron tres series de cribado sobre el antígeno específico
hag2 y MacI-5, respectivamente. Los fagos se
prepararon mediante los procedimientos convencionales y se
bloquearon previamente mediante la mezcla 1:1 con PBSTM (PBS, leche
descremada en polvo al 5%, Tween 20 al 0,1%) e incubación durante 2
h a TA. Se recubrieron pocillos de microtitulación Nunc Maxisorp
(nº442404) con antígeno específico (así como BSA) a una
concentración de 5 \mug/pocillo en PBS durante una noche a 4ºC, y
posteriormente se bloquearon con 400 \mul de PBSM (PBS, leche
descremada en polvo al 5%) durante 2 h a TA. Durante la primera
serie, se aplicaron 10^{11} fagos bloqueados previamente por
pocillo y se incubaron durante 1 h a TA sobre un agitador de placas
de microtitulación. Se retiró la disolución de fago y los pocillos
se lavaron 3 veces con PBST (PBS, Tween 20 al 0,05%) y 3 veces con
PBS. Se eluyeron los fagos unidos con trietilamina 100 mM según los
protocolos convencionales y se usaron para la infección de células
TG1. Además, los fagos residuales se eluyeron mediante infección
directa de las células TG1 añadidas a los pocillos. Tras cada serie
de cribado sobre antígeno específico, se determinó la proporción de
fagos específicos con respecto a inespecíficos mediante el análisis
de al menos 91 células infectadas independientes mediante PCR. La
PCR se realizó según los protocolos convencionales usando colonias
simples como fuente de molde y oligonucleótidos específicos para VH
CDR3 y VL CDR3 de cada scFv como cebadores. Tras 2 series de
cribado, se obtuvieron \sim0% de clones positivos (0 de 93 clones
analizados) para el cribado de
pMorph18-C-gIII-hag2-LHC
y se obtuvieron \sim3% de clones positivos (3 de 91 clones
analizados) para el cribado de
pMorph18-C-gIII-MacI-5-LHC.
Tras 3 series de cribado, los clones específicos se enriquecieron
hasta \sim79% (92 de 117 clones analizados) para el cribado de
pMorph18-C-gIII-hag2-LHC
y hasta \sim100% (229 de 229 clones analizados) para el cribado
de
pMorph18-C-gIII-MacI-5-LHC.
Para demostrar que pueden seleccionarse fagos
modificados mediante ingeniería que presentan scFv de una agrupación
diversa, se realizaron cribados de bibliotecas preseleccionadas.
Las agrupaciones tras una serie de cribado convencional, se
sometieron a subclonaciones en el formato de un vector modificado
mediante ingeniería y el cribado se continuó hasta tres series más
(cribados de presentación-cys).
Se realizaron cribados frente a los siguientes
antígenos: (i) ICAM1 que comprende la parte extracelular de ICAM1
maduro (aminoácidos 1-454) más aminoácidos
CGRDYKDDDK HHHHHH que contiene la
M2-Flag y la etiqueta de 6 x histidina. (ii)
N1-MacI que comprende los aa 1-82 de
la proteína del gen III de fago M13 que contiene un residuo de
metionina adicional en el N-terminal más un ligador
corto en el C-terminal (N1), fusionado a un
polipéptido que contiene los aminoácidos 149-353 de
la cadena alfa CR-3 humano
(SWISS-PROT entrada P11215) más la secuencia
C-terminal IEGRHHHHHH que incluye la etiqueta
de 6x histidina; y (iii) N1-Np50 que comprende N1
fusionado a un polipéptido que contiene los aminoácidos
2-366 de NF\kappaB p50 más los aminoácidos
EFSHHHHHH que incluye la etiqueta 6x histidina. Los vectores
de expresión para N1-MacI y N1-Np50
se basan en el vector pTFT74 (Freund et al., 1993) (la
secuencia del vector completa de
pTFT74-N1-hag-HIPM
se da en la figura 2). La expresión, la purificación y el
replegamiento se realizó tal como se describió (Krebber, 1996;
Krebber et al., 1997).
Inicialmente, se realizó una serie de cribado
convencional de la biblioteca de anticuerpo
HuCAL-scFv (documento WO 97/08320; Knappik et
al., 2000) según los protocolos convencionales. Brevemente se
recubrieron placas de microtitulación Maxisorp (Nunc; nº442404) con
el antígeno respectivo disuelto en PBS y se bloquearon con leche en
polvo descremada al 5% en PBS. Se añadieron 1-5 x
10^{12} fago de HuCAL scFv durante 1 h a 20ºC. Tras varias etapas
de lavado con PBST (PBS, Tween 20 al 0,05%) y PBS, se eluyeron los
fagos unidos con trietilamina 100 mM o glicina 100 mM pH 2,2, se
neutralizaron inmediatamente con Tris/HCl 1 M pH 7,0 y se usaron
para la infección de células TG1. Adicionalmente, se eluyeron los
fagos residuales mediante infección directa de células TG1 añadidas
a los pocillos. Los cribados frente a N1-Np50 usaron
la biblioteca de HuCAL-scFv completa (agrupaciones
\kappa y \lambda combinadas), en los cribados frente a
N1-MacI, las agrupaciones de cadena ligera \lambda
y \kappa se mantuvieron separadas. Frente a ICAM1 se realizó una
serie de cribado convencional de la parte de la cadena ligera
\lambda de HuCAL-scFv y posteriormente de las
cadenas pesadas seleccionadas combinadas con la biblioteca completa
de las cadenas ligera \lambda. La biblioteca optimizada en las
cadenas ligeras resultante presentó una diversidad de 1,4 x
10^{7}.
Los scFv de las agrupaciones respectivas se
sometieron a subclonación en el vector
pMorph20-C-gIII-scFv-LHC
(formato de un vector) mediante los sitios únicos SphI y
EcoRI. Posteriormente, se realizaron tres series de cribado
de presentación-cys. Los fagos se prepararon
mediante los procedimientos convencionales y se bloquearon
previamente mediante la mezcla 1:1 con PBSTM (PBS, leche descremada
en polvo al 5%, Tween 20 al 0,1%) e incubación durante 2 h a TA. Se
recubrieron los pocillos de una placa Nunc Maxisorp (nº442404) con
antígenos específicos a una concentración de 5 \mug/pocillo en PBS
durante una noche a 4ºC, y posteriormente se bloquearon con 400
\mul de PBSM (PBS, leche descremada en polvo al 5%) durante 2 h a
TA. Para cada serie de cribado de presentación-cys,
se aplicaron entre 1 x 10^{10} y 4,5 x 10^{11} fagos bloqueados
previamente por pocillo y se incubaron durante 1 h a TA sobre un
agitador de placas de microtitulación. Se retiró la disolución del
fago y los pocillos se lavaron con PBST (PBS, Tween 20 al 0,05%) y
PBS con unas condiciones de rigurosidad crecientes. La 1ª serie se
lavó 3 veces rápido y 2 veces durante 5 min con PBST y PBS,
respectivamente, la 2ª serie 1 vez rápido y 4 veces durante 5 min
con PBST y PBS, respectivamente, y la 3ª serie 10 veces rápido y 5
veces durante 5 min con PBST y PBS, respectivamente. Se eluyeron los
fagos unidos con trietilamina 100 mM según los protocolos
convencionales y se usaron para la infección de células TG1. Además,
los fagos residuales se eluyeron mediante infección directa de las
células TG1 añadidas a los
pocillos.
pocillos.
Tras cada serie de cribado, se determinó el
número de fagos específicos de antígeno en un ELISA.
N1-MacI, N1-Np50 e
ICAM-Strep (que comprende aminoácidos
1-455 de ICAM1 maduro más SAWAHPQFEK que
contiene la etiqueta Strep II) se usaron como antígenos
respectivamente. Para garantizar una expresión de nivel elevado los
scFv seleccionados se sometieron a subclonación en el vector de
expresión pMorphX7-FS (tabla 1). La subclonación se
realizó en dos etapas. En primer lugar se aislaron los fragmentos
scFv de
pMorph20-C-gIII-scFv-LHC
mediante AflII y EcoRI, a continuación los fragmentos se
volvieron a digerir con SphI y se clonaron en el vector
pMorphX7-FS digerido con EcoRI/SphI.
Este procedimiento garantizó que sólo se sometieran a subclonación
los scFv del vector
pMorph20-C-gIII-scFv-LHC
y se excluyera cualquier contaminación con scFv de un vector de
expresión o presentación convencional. La expresión de los scFv y su
sometimiento a prueba en ELISA frente a los antígenos respectivos
se realizó según los procedimientos convencionales. Los clones que
mostraron una señal de al menos 3 veces por encima de los valores
de fondo en el ELISA se consideraron positivos. Los resultados se
resumen en la tabla 5. Para demostrar que los scFv seleccionados se
unen de manera fuerte y específica a su antígeno respectivo, se
seleccionaron varios clones positivos tras 2 series de cribado de
presentación-cys y se volvieron a someter a prueba
por cuadruplicado en un ELISA de especificidad sobre seis antígenos
diferentes (figuras 14 y 15). Puede demostrarse claramente el
enriquecimiento de los agentes de unión específicos de antígeno. Ya
después de dos series de cribado de presentación-cys
de las agrupaciones preseleccionadas frente a
N1-MacI, N1-Np50 e ICAM1, entre el
80% y el 97% de los clones sometidos a prueba fueron positivos en
ELISA. La afinidad de algunos de los scFv seleccionados se
determinó en valores de Kd y Biacore en el intervalo de 1 nM a 2,2
\muM. Los resultados son similares a los factores de
enriquecimiento y afinidades obtenidas en un cribado convencional
de las agrupaciones respectivas realizadas en paralelo. Algunos de
los scFv se seleccionaron independientemente mediante
presentación-cys, así como cribado convencional.
A la hora de detectar bibliotecas de
presentación de fago en el cribado biológico el problema sigue
siendo cómo recuperar mejor los fagos que se han unido a la diana
deseada. Normalmente, esto se logra mediante la elución con
tampones apropiados, o bien usando un gradiente de pH o de sal, o
bien mediante la elución específica usando una diana soluble. Sin
embargo, los agentes de unión más interesantes que se unen con gran
afinidad a la diana podrían perderse mediante ese enfoque. Una
opción con fagos de presentación-cys modificados
mediante ingeniería es que los complejos de bacteriófagos
específicos y de diana puedan tratarse con agentes reductores, por
ejemplo, mediante incubación con DTT, para escindir el enlace
disulfuro entre scFv y la proteína de recubrimiento de fago y para
recuperar las partículas de bacteriófago específicas.
Los cribados de las agrupaciones
preseleccionadas frente a N1-Mac1 se realizaron
según el protocolo descrito anteriormente. Los fagos se eluyeron
bien según el protocolo convencional con trietilamina 100 mM y una
infección directa de células TG1 mediante fagos residuales, o
mediante incubación de los pocillos con DTT 20 mM en tampón Tris pH
8,0 durante 10 min. Tras cada serie de cribado la agrupación de scFv
seleccionados se sometió a subclonación en el vector de expresión
pMorphX7-FS según el procedimiento de dos etapas
descrito anteriormente, y se determinó el número de scFv
específicos de N1-MacI en ELISA. Para demostrar que
los scFv seleccionados se unen de manera fuerte y específica a su
antígeno respectivo, se seleccionaron varios clones positivos y se
volvieron a someter a prueba por triplicado en un ELISA de
especificidad. Puede demostrarse claramente el enriquecimiento de
agentes de unión específicos de antígeno para ambos procedimientos
de elución. Tras dos ciclos de cribado de la
agrupación-\kappa MacI y la
agrupación-\lambda MacI se obtuvo un número de
clones positivos a ELISA dos veces y cinco veces superior para la
elución con agentes reductores, en comparación con la elución
convencional.
Ejemplo
2.2
El ejemplo 2.1 muestra que los fragmentos de
cadena sencilla funcionales pueden presentarse en fagos modificados
mediante ingeniería a través de enlaces disulfuro. A continuación,
se describirán experimentos que muestran que esto mismo es verdad
para los Fab. La cisteína se modificó mediante ingeniería en
diferentes posiciones del fragmento de anticuerpo Fab. Estos Fab se
expresan conjuntamente en la misma célula bacteriana junto con la
pIII de longitud completa basándose en un sistema de dos
vectores.
Se expresaron cadenas pesadas y ligeras del
fragmento Fab a partir de un fagémido dicistrónico bajo el control
de la región del operador/promotor lac. El primer casete de
expresión comprende la secuencia señal ompA y el dominio variable y
constante de la cadena ligera, el segundo casete de expresión
comprende la secuencia señal phoA y el dominio variable y constante
de la cadena pesada. La cadena pesada y ligera no se unen mediante
un enlace disulfuro. Los módulos que contienen la cisteína
modificada mediante ingeniería se ubican en el
C-terminal de o bien la cadena ligera, o bien la
pesada. Se compararon varios constructos que diferían en la
composición de aminoácido de los módulos y se resumen en la tabla 6.
Como ejemplo, en la figura 16 a+b se dan la secuencia del vector
completa de
pMorphX10-Fab-VL-LHC-VH-FS
que codifica para el Fab MacI-5 modificado y el
mapa del vector respectivo.
Se usaron dos plásmidos diferentes para la
expresión de pIII de longitud completa. El plásmido
pBR-C-gIII ya se ha descrito
anteriormente. El casete de expresión respectivo comprende la
secuencia señal ompA, los aminoácidos DYCDIEF y el ORF de pIII bajo
el control de la región de operador/promotor de la lactosa (tabla
3, figura 6). Alternativamente, se usó el plásmido
pBAD-SS-C-gIII. Aquí
el casete de expresión respectivo comprende la secuencia señal de
pIII, aminoácidos TMACDIEF y el ORF de pIII bajo el control de la
región de operador/promotor de la arabinosa (tabla 3). Para la
construcción de
pBAD-SS-C-gIII, se
amplificó el fragmento que codifica para la cisteína modificada por
ingeniería más pIII a partir de
pUC-C-gIII mediante PCR
introduciendo los sitios de restricción NcoI y HindIII y se clonó
en el vector comercialmente disponible pBAD/gIII A (Invitrogen).
Los plásmidos pBR-C-gIII o
pBAD-SS-C-gIII se
transformaron conjuntamente con los fagémidos de
pMorphX10-Fab respectivos que expresan la Fab
modificada en E. coli TG1 seleccionando para ambos marcadores
de antibiótico.
Se usaron tres Fab diferentes, derivando todos
de una biblioteca de anticuerpos combinatoria humana (HuCAL;
documento WO 97/08320; Knappik et al., 2000) para la
evaluación de una presentación de Fab sobre fago modificado
mediante ingeniería. Los genes consenso HuCAL VH y VL (descritos en
el documento WO 97/08320), y las secuencias CDR3 de los Fab se dan
en la tabla 2. El Fab MacI-5 se deriva de scFv
MacI-5 descrito anteriormente y se convirtió en el
formato Fab (en la figura 16a se da el mapa del vector completo de
pMorphX10-Fab-MacI5-VL-LHC-VH-FS).
Los Fab MacI-A8 e ICAM1-C8 se
aislaron directamente a partir de una de las bibliotecas
HuCAL-Fab. Se seleccionó el clon
MacI-A8 frente al antígeno
MacI-Strep, que comprende una metionina
N-terminal, los aminoácidos 149-353
de cadena alfa de CR-3 humano
(SWISS-PROT entrada P11215) y los aminoácidos
SAWSHPQFEK que incluyen la etiqueta Strep II (Schmidt et
al., 1996). La expresión y la purificación se realizaron según
Schmidt y Skerra (1994). Se usó N1-MacI como
antígeno correspondiente para ELISA. N1-MacI se
describió anteriormente, y comprende una metionina
N-terminal, los aminoácidos 1-82 de
la proteína del gen III madura del fago M13 más un ligador corto
(N1), los aminoácidos 149-353 de cadena alfa
CR-3 humano (SWISS-PROT entrada
P11215) y aminoácidos IEGRHHHHHH que incluyen la etiqueta de
6x histidina. Se seleccionó el clon ICAM1-C8 frente
al antígeno ICAM1 descrito anteriormente, que comprende la parte
extracelular de ICAM1 maduro (aminoácidos 1-454) más
aminoácidos CGRDYKDDDK HHHHHH que contienen el
M2-Flag y las etiquetas de 6x histidina. Se usó el
mismo antígeno para ensayos de ELISA así como en el experimento de
la biblioteca dopada.
Para demostrar que los Fab se unen a pIII
mediante puentes disulfuro y se incorporan en partículas de fago,
se corrieron los fagos respectivos en SDS PAGE en condiciones no
reductoras y reductoras. Se realizaron análisis de
inmunotransferencia de tipo Western con anticuerpos que detectan la
pIII, la cadena pesada, la cadena ligera lambda y la cadena ligera
kappa, respectivamente. Todos los constructos descritos en la tabla
6 se analizaron y los resultados se muestran para
pMorhX10-ICAM1C8-VL-LHC-VH-FS
más pBAD-SS-C-gIII y
pMorhX10-macIA8-VL-LHC-VH-MS
más pBAD-SS-C-gIII
como ejemplo en las figuras 17 y 18.
Se produjeron fagos usando fago auxiliar VCSM13
siguiendo protocolos convencionales (Kay et al., 1996).
Adicionalmente a las proteínas de fago auxiliares, la proteína de
recubrimiento de fago modificado mediante ingeniería y Fab
modificado soluble se expresaron conjuntamente a partir del sistema
de dos vectores. Se incubaron previamente fagos en PBS con o sin
DTT 20 mM (condiciones reductoras y no reductoras, respectivamente)
durante 1 h a temperatura ambiente antes de añadir tampón de carga
de SDS sin agentes reductores tales como DTT o
\beta-mercaptoetanol. Se corrieron 1 x 10^{10}
fagos por carril en un SDS PAGE al 12% (BioRad) y se sometieron a
inmunotransferencia sobre membranas de nitrocelulosa (Schleicher y
Schuell). Para la inmunotransferencia de tipo Western
anti-pIII, la membrana se bloqueó en MTBST (tampón
Tris 50 mM pH 7,4, que contenía leche en polvo al 5% y Tween 20 al
0,05%) y se reveló con ratón anti-pIII (dilución
1:250; Mobitec) como anticuerpo primario, conjugado
anti-ratón-IgG-HRP
(dilución 1:5000; SIGMA) como anticuerpo secundario y azul BM para
POD (peroxidasa) precipitante (Roche nº1442066) como sustrato. Para
la detección de la cadena pesada, la cadena ligera kappa y la ligera
lambda se usaron, respectivamente, los anticuerpos primarios
anti-Fd (dilución 1:5000; el sitio de unión PC075),
anti-kappa humana (dilución 1:5000; Sigma K4377) y
anti-lambda humana (dilución 1:500, Sigma
L-6522).
En las inmunotransferencias de tipo Western
anti-pIII, pudo detectarse proteína III libre
(SH-pIII y/o pIII) para todos los sistemas de
expresión tanto en condiciones reductoras, como no reductoras
(figuras 17 y 18). Cuando se expresan conjuntamente tanto Fab
modificado mediante ingeniería, como proteína III modificada
mediante ingeniería una señal que migra a la altura de un
heterodímero de cadena ligera y proteína III
(VL-CL-SS-pIII)
aparece en condiciones no reductoras. Adicionalmente, puede
observarse una banda que migra a la altura esperada para dímeros de
proteína III unida por enlace disulfuro
(pIII-SS-pIII) (carriles 11 y 12,
figuras 17, 18). Tanto los hetero-, como los homodímeros
desaparecen cuando las muestras se tratan con DTT (carriles 5 y 6,
figuras 17 y 18), o cuando se expresan conjuntamente Fab modificados
mediante ingeniería con pIII no modificada mediante ingeniería
(carriles 3, 4, 9 y 10, figuras 17 y 18). El heterodímero en este
caso de cadena ligera unida a la pIII de cadena total también pudo
detectarse con los anticuerpos anti-cadena ligera en
geles no reductores, pero estuvo ausente en condiciones reductoras.
Adicionalmente, pudo detectarse una banda que migra a la altura
esperada para el homodímero de la cadena ligera
(VL-CL-SS-VL-CL)
(datos no mostrados). Se obtuvieron resultados similares para todos
los constructos descritos en la tabla 6, y no se detectaron
diferencias significativas entre los vectores
pBR-C-gIII y
pBAD-SS-C-gIII para
el suministro de pIII modificada por ingeniería (datos no
mostrados).
Para mostrar que los Fab presentados son
funcionales con respecto al reconocimiento del antígeno específico,
se realizaron ELISA de fago. Los análisis se realizaron para los
HuCAL Fab MacI-5, MacI-A8 y
ICAM1-C8. Se compararon todos los formatos que
diferían en la posición de la cisteína en Fab (tabla 6). Para
demostrar que los Fab se unen a las proteínas de recubrimiento de
fago modificadas mediante ingeniería mediante enlaces de disulfuro,
se realizaron ELISA de fago tanto en condiciones reductoras, como no
reductoras.
Se transformaron conjuntamente los fagémidos
respectivos que expresaban el Fab modificado con
pBR-C-gIII y se realizó la
producción de fago en condiciones convencionales (Kay et al.,
1996). Los fagos de presentación de Fab convencionales
(pMorph18-Fab) sirvieron como control positivo, un
vector de expresión de fagémido para la expresión de Fab no
modificado mediante ingeniería
(pMorphX9-Fab-FS) sirvió como
control negativo. Placas Nunc Maxisorp de microtitulación (nº
442404) se recubrieron con antígeno específico o antígeno de control
(BSA, Sigma nº A7906) durante 12 horas a 4ºC en una cantidad de 5
\mug/pocillo en PBS y se bloquearon con PBS que contenía leche
descremada en polvo al 5%, Tween 20 al 0,05% durante 1 h. Los fagos
se incubaron previamente en PBS que contenía leche descremada en
polvo al 5%, Tween 20 al 0,05%, y DTT 10 mM, si correspondía,
durante 1 h a temperatura ambiente antes de aplicarse al pocillo de
ELISA recubierto con antígeno a un intervalo de concentración de
entre 1 x 10^{8} y 1 x 10^{10} fagos por pocillo. Tras unir
durante 1 h a TA, se eliminaron fagos unidos de manera inespecífica
mediante lavado con PBS que contenía Tween 20 al 0,05% y PBS. Los
fagos unidos se detectaron en ELISA usando un conjugado
anti-M13-HRP (Amersham Pharmacia
Biotech nº 27-9421-01) y azul
soluble BM (Roche nº 1484281). Se midió la absorbancia a 370 nm. Las
señales de ELISA obtenidas con el antígeno específico se compararon
con las del control. Se analizaron hasta tres preparaciones de fago
independientes y en las figuras 19 a 22 se facilitan los valores
medios.
Pudo demostrarse la unión específica de fagos
que presentaban Fab al antígeno para todos los formatos de dos
vectores diferentes (figuras 19-21, carriles
1-4). Para Fab MacI-5 no se
detectaron diferencias significativas entre los cuatro formatos
(figura 19), mientras que el constructo
pMorphX10-Fab-VL-LHC-VH-FS
mostró de manera reproducible los mejores resultados para Fab
MacI-A8 e ICAM1-C8 (figuras 20 y
21). Cuando se añadió DTT 10 mM a los fagos antes de la unión de
antígeno durante la etapa de incubación previa, la señal de ELISA
disminuyó hasta casi los niveles de fondo para todos los fagos de
presentación-cys, mientras que el DTT no tuvo un
efecto principal sobre los fagos de presentación convencionales
(pMorph18-Fab) (mostrado para Fab
MacI-5 en la figura 22). Esto muestra que los
enlaces de disulfuro son esenciales para la presentación funcional
de Fab en fagos y, por tanto, para la unión específica de fagos que
presentan Fab al antígeno.
Para demostrar que fagos modificados mediante
ingeniería que presentan Fab pueden enriquecerse sobre antígeno
específico, se realizó un experimento de "biblioteca dopada":
se mezclaron fagos específicos con un elevado exceso de fagos
inespecíficos y se realizaron tres ciclos de cribado sobre antígeno
específico. Se determinó el enriquecimiento para fagos específicos
tras cada ciclo. El análisis se realizó para HuCAL Fab
ICAM1-C8 en el sistema de dos vectores
pMorphX10-Fab-VL-LHC-VH-FS
más
pBAD-SS-C-gIII.
Se mezclaron fagos modificados mediante
ingeniería que presentaban ICAM1-C8 y
MacI-A8 en proporciones de 1:10^{5}. Se
realizaron tres ciclos de cribado sobre el antígeno ICAM1. Los fagos
se prepararon mediante procedimientos convencionales y se
bloquearon previamente mediante mezcla 1:1 con PBSTM (PBS, leche
descremada en polvo al 5%, Tween 20 al 0,1%) y se incubaron durante
2 h a TA. Se recubrieron pocillos de una placa Maxisorp Nunc
(nº442404) con antígeno específico a una concentración de 5
\mug/pocillo en PBS durante una noche a 4ºC, y posteriormente se
bloquearon con 400 \mul de PBSM (PBS, leche descremada en polvo al
5%) durante 2 h a TA. Durante el primer ciclo, se aplicaron
10^{11} fagos bloqueados previamente por pocillo y se incubaron
durante 1 h a TA sobre un agitador de placas de microtitulación. Se
retiró la disolución de fago y los pocillos se lavaron 3 veces con
PBST (PBS, Tween 20 al 0,05%, 1 vez rápido, 2 x 5 min) y 3 veces con
PBS (1 vez rápido, 1 x 5 min). Se eluyeron los fagos unidos con
trietilamina 100 mM según protocolos convencionales. Además, los
fagos residuales se eluyeron mediante infección directa de las
células añadidas a los pocillos. Como una infección directa de
células TG1 que albergan
pBAD-SS-C-gIII no
fue lo suficientemente eficaz, se usaron fagos eluídos para la
infección de células TG1, se amplificaron y a continuación se usaron
para la infección de células TG1 que albergan
pBAD-SS-C-gIII. Así
se restauró el sistema de dos vectores y se realizó el siguiente
ciclo de cribado. Aunque no se observaron diferencias entre los dos
plásmidos para la expresión de pIII modificado mediante ingeniería
(pBR-C-gIII y
pBAD-SS-C-gIII) con
respecto al ELISA de fago y WB (inmunotransferencia de tipo
Western), la infección de las células TG1 que albergaban
pBR-C-gIII no fue tan eficaz como la
infección de células TG1 que albergaban
pBAD-SS-C-gIII. Tras
cada ciclo de cribado, se determinó la proporción de fagos
específicos con respecto inespecíficos mediante el análisis de al
menos 92 células infectadas independientes mediante PCR. La PCR se
realizó según los protocolos convencionales usando colonias únicas
como fuente de molde y oligonucleótidos específicos para la cadena
ligera lambda (cebado en la región variable 4), la cadena ligera
kappa (cebado en la región variable 3) y una secuencia vectorial en
el sentido 5' del fragmento Fab (cebador M13-rev
comercial, NEB) como cebadores. Se esperaban fragmentos de
aproximadamente 420 pb de longitud para Fab lamda
(IXCAM1-C8) y 290 pb para Fab kappa
(MacI-A8). Tras 2 ciclos de cribado, se obtuvieron
un 61% de clones positivos (57 de 93 clones analizados), que
pudieron enriquecerse hasta el 100% (92 de 92 clones analizados)
tras el tercer ciclo.
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
La cisteína modificada mediante ingeniería se
escribe en negrita
La secuencia de las proteínas de recubrimiento
de fago de tipo natural está subrayada
La cisteína modificada mediante ingeniería se
escribe en negrita
La secuencia de las proteínas de recubrimiento
de fago de tipo natural está subrayada
Nd: no determinada
^{a} N1-MacI,
N1-Np50: número de clones tras una serie de cribado
convencional; ICAM1: diversidad de la agrupación optimizada en
cadena ligera.
^{b} número de positivos a ELISA de las
agrupaciones preseleccionadas respectivas.
La cisteína modificada mediante ingeniería está
escrita en negrita
Claims (29)
1. Método para presentar un/una
(poli)péptido/proteína sobre la superficie de una partícula
de bacteriófago que comprende:
producir o permitir la unión de dicho/-a
(poli)péptido/proteína tras la expresión a un elemento del
recubrimiento proteico de dicha partícula de bacteriófago,
produciéndose dicha unión por la formación de un enlace disulfuro
entre un primer residuo de cisteína comprendido en dicho/-a
(poli)péptido/proteína y un segundo residuo de cisteína
comprendido en dicho elemento del recubrimiento proteico.
\vskip1.000000\baselineskip
2. Método según la reivindicación 1, en el que
dicho segundo residuo de cisteína está presente en una posición de
aminoácido correspondiente en una proteína de recubrimiento de tipo
natural de un bacteriófago.
3. Método según la reivindicación 2, en el que
dicho elemento del recubrimiento proteico es una proteína de
recubrimiento de tipo natural de un bacteriófago.
4. Método según la reivindicación 2, en el que
dicho elemento del recubrimiento proteico es una variante truncada
de una proteína de recubrimiento de tipo natural de un bacteriófago,
comprendiendo dicha variante truncada al menos esa parte de dicha
proteína de recubrimiento de tipo natural que produce la
incorporación de dicha proteína de recubrimiento en el
recubrimiento proteico de la partícula de bacteriófago.
5. Método según la reivindicación 2, en el que
dicho elemento del recubrimiento proteico es una variante modificada
de una proteína de recubrimiento de tipo natural de un
bacteriófago, en el que dicha variante modificada puede
incorporarse en el recubrimiento proteico de la partícula de
bacteriófago.
6. Método según la reivindicación 1, en el que
dicho segundo residuo de cisteína no está presente en una posición
de aminoácido correspondiente en una proteína de recubrimiento de
tipo natural de un bacteriófago.
7. Método según la reivindicación 6, en el que
dicha segunda cisteína se ha introducido artificialmente en una
proteína de recubrimiento de tipo natural de un bacteriófago.
8. Método según la reivindicación 6, en el que
dicha segunda cisteína se ha introducido artificialmente en una
variante truncada de una proteína de recubrimiento de tipo natural
de un bacteriófago.
9. Método según la reivindicación 6, en el que
dicha segunda cisteína se ha introducido artificialmente en una
variante modificada de una proteína de recubrimiento de tipo natural
de un bacteriófago.
10. Método según una cualquiera de las
reivindicaciones 4 a 9, en el que dicha segunda cisteína está
presente en, o en las proximidades de, el C- o el
N-terminal de dicho elemento del recubrimiento de
fago de dicha partícula de bacteriófago.
11. Método según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 10, en el que dicho bacteriófago es un
bacteriófago filamentoso.
12. Método según la reivindicación 11, en el que
dicho elemento del recubrimiento proteico de la partícula de
bacteriófago es o se deriva de la proteína de recubrimiento de tipo
natural pIII.
13. Método según la reivindicación 11, en el que
dicho elemento del recubrimiento proteico de la partícula de
bacteriófago es o se deriva de la proteína de recubrimiento de tipo
natural pIX.
14. Método según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 12, que comprende:
(a) proporcionar una célula huésped que albergue
una secuencia de ácido nucleico que comprende una secuencia de
ácido nucleico que codifica para dicho/-a
(poli)péptido/proteína;
(b) producir o permitir la expresión de dicha
secuencia de ácido nucleico; y
(c) producir o permitir la producción de
partículas de bacteriófago en dicha célula huésped.
\vskip1.000000\baselineskip
15. Método según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 14, en el que dicho/-a
(poli)péptido/proteína comprende una inmunoglobulina o un
fragmento funcional de la misma.
16. Método según la reivindicación 15, en el que
dicho fragmento funcional es un fragmento scFv o Fab.
\newpage
17. Secuencia de ácido nucleico que codifica
para una variante modificada de una proteína de recubrimiento de
tipo natural de un bacteriófago, en la que dicha variante modificada
consiste en:
(a) una o más partes de dicha proteína de
recubrimiento de tipo natural de un bacteriófago, en la que una de
dichas partes comprende al menos esa parte que produce o permite la
incorporación de dicha proteína de recubrimiento en el
recubrimiento de fago; y
(b) entre uno y seis residuos de aminoácido
adicionales no presentes en las posiciones de aminoácido
correspondientes en una proteína de recubrimiento de tipo natural
de un bacteriófago, en la que uno de dichos residuos de aminoácido
adicionales es un residuo de cisteína.
\vskip1.000000\baselineskip
18. Secuencia de ácido nucleico que codifica
para una variante modificada de una proteína de recubrimiento de
tipo natural de un bacteriófago, en la que dicha variante modificada
consiste en:
(a) una o más partes de dicha proteína de
recubrimiento de tipo natural de un bacteriófago, en la que una de
dichas partes comprende al menos esa parte que produce o permite la
incorporación de dicha proteína de recubrimiento en el
recubrimiento de fago;
(b) entre uno y seis residuos de aminoácido
adicionales no presentes en las posiciones de aminoácido
correspondientes en una proteína de recubrimiento de tipo natural
de un bacteriófago, en la que uno de dichos residuos de aminoácido
adicionales es un residuo de cisteína; y
(c) una o más secuencias de péptido con fines de
purificación y/o detección.
\vskip1.000000\baselineskip
19. Vector que comprende el ácido nucleico según
la reivindicación 17 ó 18.
20. Vector según la reivindicación 19, que
comprende además una o más secuencias de ácido nucleico que
codifican para un/una (poli)péptido/proteína que comprende
un segundo residuo de cisteína.
21. Vector según la reivindicación 20, en el que
dicho/-a (poli)péptido/proteína comprende una inmunoglobulina
o un fragmento funcional de la misma.
22. Célula huésped que comprende la secuencia de
ácido nucleico según la reivindicación 17 ó 18, el vector según una
cualquiera de las reivindicaciones 19 a 21.
23. Variante modificada de una proteína de
recubrimiento de tipo natural, en la que la variante modificada está
codificada por la secuencia de ácido nucleico según la
reivindicación 17 ó 18, el vector según una cualquiera de las
reivindicaciones 19 a 21 o se produce por la célula huésped según la
reivindicación 22.
24. Partícula de bacteriófago que presenta
un/una (poli)péptido/proteína unido(a) a su
superficie, produciéndose dicha unión por la formación de un enlace
disulfuro entre un primer residuo de cisteína comprendido en
dicho/-a (poli)péptido/proteína y un segundo residuo de
cisteína comprendido en un elemento del recubrimiento proteico de
dicha partícula de bacteriófago, en la que dicha partícula de
bacteriófago contiene una secuencia de ácido nucleico para la
expresión de dicho/-a (poli)péptido/proteína.
25. Partícula de bacteriófago según la
reivindicación 24, en la que dicha secuencia de ácido nucleico es el
vector según la reivindicación 20 ó 21.
26. Colección diversa de partículas de
bacteriófago según una cualquiera de las reivindicaciones 24 ó 25,
en la que cada una de dichas partículas de bacteriófago presenta
un/una (poli)péptido/proteína de una colección diversa de
(poli)péptidos/proteínas.
27. Método para obtener un/una
(poli)péptido/proteína que tiene una propiedad deseada, que
comprende,
(a) proporcionar la colección diversa de
partículas de bacteriófago según la reivindicación 26; y
(b) detectar dicha colección diversa y/o
seleccionar de dicha colección diversa para obtener al menos una
partícula de bacteriófago que presenta un/una
(poli)péptido/proteína que tenga dicha propiedad deseada.
\vskip1.000000\baselineskip
28. Método según la reivindicación 27, en el que
dicha propiedad deseada es la unión a una diana de interés.
29. Método según la reivindicación 28, en el que
la etapa (b) comprende además:
(ba) poner en contacto dicha colección diversa
de partículas de bacteriófago con la diana de interés;
(bb) eluir partículas de bacteriófago que no se
unen a la diana de interés;
(bc) eluir partículas de bacteriófago que se
unen a la diana de interés, tratando en condiciones reductoras los
complejos de diana de interés y bacteriófagos que se unen a dicha
diana de interés formados en la etapa (ba).
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