KR101732552B1 - 안정화된 면역글로불린가변도메인 선별방법 및 선별된 도메인의 응용 - Google Patents

안정화된 면역글로불린가변도메인 선별방법 및 선별된 도메인의 응용 Download PDF

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Abstract

본 발명은 Tat 신호서열에 목적 단백질과 항생제 내성 단백질을 결합시킨 융합단백질을 코딩하는 유전자 구조체(construct)를 제조하고, 이를 대장균에서 발현시켜 수용성(soluble)이며 열역학적 안정성이 우수한 목적 단백질, 특히 인간 생식세포 유래 면역글로불린 가변도메인(Immunoglobulin variable domain, VH 또는 VL)인 목적 단백질을 선별하는 Tat-경로 기반 단백질 수용성 스크리닝(TAPE : Tat-Associated Protein Engineering)이라고 명명된 방법 및 상기 TAPE 방법에 의해 선별된 수용성이며 열역학적 안정성이 우수한 인간 VH 및 VL 도메인 항체 및 인간 VH 및 VL 도메인 항체 골격(scaffold)에 대한 것이다.
또한, 본 발명은 TAPE 방법에 의해 선별된 VH 또는 VL 도메인 항체 골격에 무작위적(random) CDR 서열을 포함하는 라이브러리 및 그 제조방법에 대한 것이며, 그러한 라이브러리를 이용하여 선별된 목적 단백질에 결합능을 가지는 VH 또는 VL 도메인 항체 및 그러한 도메인 항체를 포함하는 치료용 약제학적 조성물에 대한 것이다.

Description

안정화된 면역글로불린가변도메인 선별방법 및 선별된 도메인의 응용 {Screening and Engineering Method of Super-Stable Immunoglobulin Variable Domains and Their Uses}
본 발명은 Tat 신호서열에 목적 단백질과 항생제 내성 단백질을 결합시키고, 이를 대장균에서 발현시켜 수용성(soluble)이며 열역학적 안정성이 우수한 목적단백질, 특히 인간 생식세포 유래 면역글로불린 가변도메인(Immunoglobulin variable domain, VH 또는 VL)인 목적 단백질을 선별하는 Tat 경로기반 단백질 수용성 스크리닝 (TAPE : Tat-Associated Protein Engineering)이라고 명명된 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한, TAPE 방법에 의해 선별된 수용성이며 열역학적 안정성이 우수한 인간 VH 및 VL 도메인 항체 및 인간 또는 재조합 VH 및 VL 도메인 항체 골격(scaffold)에 대한 것이다. 본 발명은 더욱이, 그러한 VH 및 VL 도메인 항체 및 그러한 항체 골격(scaffold)의 아미노산 서열 및 이를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드에 대한 것이다.
본 발명에 따라 선별된 인간 또는 재조합 VH 또는 VL 골격(scaffold)을 포함하는 VH 또는 VL 도메인 항체는 CDR 서열과 무관하게 해당 인간 또는 재조합 VH 및 VL 도메인 항체 골격을 가질 경우, 여전히 수용성이며 열역학적 안정성을 유지한다.
또한 본 발명은 TAPE 방법에 의해 선별된 인간 또는 재조합 VH 또는 VL 도메인 항체 골격에 무작위적(random) CDR 서열을 포함하는 라이브러리 및 그 제조방법에 대한 것이다.
본 발명은 그러한 라이브러리를 이용하여 선별된 목적 단백질에 결합능을 가지는 VH 또는 VL 도메인 항체, 그러한 도메인 항체의 아미노산 서열 및 이를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드에 대한 것이다.
단편화된 작은 크기의 항체는 기존의 단일항체(monoclonal antibody, mAb)와는 다른 생리화학적 특성상 차별성으로 인하여 기존의 항체치료제의 한계를 극복할 수 있는 항체 형태로 유망하다. 일반적인 단편화 항체는 단일쇄 항체(single chain antibody : scFv), Fab(Fragment antibody-binding), VH나 VL과 같은 이뮤노글로불린 가변영역 항체(Immunoglobulin variable domain antibody) 등이 있고, 이들의 변형 형태인 텐덤(tendom) scFv, 다이아바디(diabody), 미니바디(minibody) 등이 있다(Better et al., Science 1988 240(4855): 1041-3; Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 1988 85(16):5879-83; Bird et al., Science 1988 242(4877):423-6; Pei et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 1997 94(18):9637-42; Iliades et al., FEBS Lett. 1997 409(3):437-41; Ward et al., Nature 1989 341(6242):544-6).
기존의 단일항체와 비교할 때 단편 또는 소형 항체의 경우는 Fc(crystallizable fragment)의 기능이 상실된 경우가 대부분이기 때문에, Fc의 존재로 인한 혈중 반감기 (half-life) 증대 및 세포살해 기능 (effector function) 등의 효과를 기대할 수 없다는 단점이 있다.
그러나 작은 크기의 단편화 항체는 기존 전 항체(whole antibody)의 큰 크기로 인한 단점인 구조적으로 숨겨져 있는 에피토프(epitope) 접근의 한계성, 약물 침투성(penetration) 및 분포(biodistribution), 형태의 가변성 (format flexibility), 높은 생산 비용 등의 한계를 극복할 수 있는 차세대 항체의 형태로 부각되고 있다(Zhao et al., Blood 2007 110(7):2569-77; Holliger et al., Nat. Biotechnol. 2005 23(9):1126-36; Hudson et al., Med. Microbiol. Immunol. 2009 198(3):157-74; Enever et al., Curr. Opin. Biotechnol. 2009 20(4):405-11).
더 나아가, 각종 단편 및 소형 항체는 화학적 또는 재조합 단백질 융합의 방법으로 연결하여 이중 또는 다중 특이성을 쉽게 구현할 수 있는 장점이 있다.
이러한 장점을 활용하여 최근 기존 항체의 Fc 기능을 모듈(module) 화된 형태로 다중 특이성을 도입하면 단점으로 지적되어온 이펙터(effector) 기능 및 짧은 혈중반감기의 보완이 가능한 형태로 발전하고 있다. 예를 들어 사람 혈장 알부민 (Human Serum Albumin)에 대한 결합특이성을 가진 단편 또는 소형항체를 모듈로 도입하여 이중특이성 항체를 구현하여 혈중 반감기를 늘이거나, 자연살해세포 (Natural Killer)나 T 세포와 같은 면역기능의 세포에 특이적으로 친화적인 소형항체를 모듈로 도입하여 항체에 세포살해기능을 부여할 수 있다(Els et al., J Biol Chem. 2001 9; 276(10):7346-50; Bargou et al., Science 2008 321(5891):974-7; etal., Mol. Cancer Ther. 2008 7(8):2288-97).그리고 서로 다른 작용모드를 기대하는 두 가지 이상의 분자타겟에 대하여 하나의 항체에 특이성을 부여할 수 있는 형태로 설계가 가능하기 때문에 항체의 효능과 경제성을 획기적으로 개선시킬 수 있는 가능성을 열어준다.
인간항체의 구조에서 항원 특이적 결합의 기능을 가진 최소한의 단위는 경쇄 또는 중쇄의 N-말단에 위치하는 가변 도메인인 중쇄 가변영역 도메인(VH : heavy chain variable domain)와 경쇄 가변영역 도메인 (VL : light chain variable domain)이다. 각각의 두 N-말단은 서로 상보적인 구조로 진화하였으므로 플라즈마 B 세포로부터 단일클론 항체가 생산될 때 경쇄와 중쇄가 합체되는 과정에서 VH와 VL은 비공유 결합형태의 복합체를 이루며 이를 통하여 구조적 안정성을 유지한다. 인간항체 가변도메인 VH 세그먼트(segment)의 경우 에피토프에 결합하는 CDR(Complementary Determinant Region) 부분을 제외한 프레임 부분의 아미노산 서열의 상동성에 따라 7개의 패밀리(family)로 구분 (VH1, VH2, VH3, VH4, VH5, VH6, VH7) 되며 각 패밀리는 3가지에서 22가지 고유의 아미노산 서열이 포함되어 있다. 경쇄의 VL의 경우는 V kappa와 V lamda로 구분되며 각각 V Kappa는 6가지, V lamda는 10가지 패밀리로 분류된다(Chothia et al., 1992 J. Mol. Biol. 227, 799-917; Tomlinson et a.,l 1995 EMBO J. 14, 4628-4638; Williams et al., J. Mol. Biol. 264, 220-232). 수많은 VH 및 VL은 서로의 상호 친화 정도에 따라 선호되는 VH/VL 짝짓기 조합이 있다고 알려져 있으며 항체 레퍼토어(repertoire)의 다양성을 증대 시키는데 이러한 유전자의 조합에 의한 재배열(combinatorial rearrangement)이 중요한 역할을 한다고 알려져 있다 (Ruud et al., J. Mol. Biol. 1999, 285, 895-901).
결합된 형태의 VH/VL은 6개의 CDR 조합에 따라 서로 상보적으로 특정 항원에 대한 결합 특이성을 부여한다. 경쇄의 가변도메인에 3개 (light chain CDR1, 2, 및 3), 중쇄의 가변도메인에 3개 (heavy chain CDR1, 2, 및 3), 총6개의 CDR이 항원의 결합에 참여하고 있다. 인간 생식계열 염기서열 분석을 통한 연구결과에 의하면 각각의 CDR의 다양성은 대부분 중쇄 가변도메인의 CDR3에 의해 결정된다는 것이 밝혀졌다. 따라서 이러한 분석결과는 항원의 결합 특이성 또한 중쇄의 CDR3의 가변성에 의해 대부분 결정될 수 있다는 점을 시사한다.(J. Mol. Recogni. 2000, 13, 167-187).
이와는 다르게, 낙타와 라마와 같은 계열의 동물 및 상어와 같은 연골구조를 가진 어류의 경우 경쇄 구조가 존재하지 않은 단일 중쇄 구조의 항체를 가지고 있다. 따라서 이러한 항체의 가변도메인은 오로지 중쇄 단일가변도메인 (Camelid 및 Shark 각각 VHH및 VNAR)으로 이루어져 있으며 항원결합 및 중화능력에 있어서는 경쇄의 가변도메인과 중쇄의 가변도메인이 동시에 항원의 결합에 참여하는 인간항체에 비하여 아무런 부족함이 없다고 알려져 있다. 인간의 경우 중쇄 질환 (heavy chain diseases)를 가진 환자 (Hendershot et al., J. Cell. Biol. 1987 104(3):761-7; Prelli et al., J. Immunol. 1992 148(3): 949-52) 외에는 VH 또는 VL이 단독으로 존재하는 경우는 매우 드물다. 왜냐하면 VH 또는 VL의 구조적 상보성으로 인하여 단독으로 분리할 경우 구조적으로 불안정하고 단백질 응집(aggregation)현상이 쉽게 일어나기 때문이다. 부분적으로 이러한 단백질 뭉침 현상은 VH와 VL이 접하는 부위는 주로 소수성의 아미노산 잔기 (hydrophobic patch)가 분포하고 이로 인한 소수성 상호친화작용 (hydrophobic interaction)에 기인한다고 알려져 있다. 낙타항체의 경우는 특이적으로 VH/VL 접경 표면에 위치하는 아미노산의 경우 인간항체와는 달리 친수성 특성을 가진 아미노산 잔기가 노출되어 있음을 알 수 있는데, 특히 낙타항체와 가장 유사한 아미노산 서열을 가진 인간 VH3 패밀리와 특이적으로 다른 네 지점의 아미노산을 테트라드(tetrad)라고 부르며 카밧 넘버링 시스템(Kabat numbering system, Kabat et al., 1991 J. Immunol. 147(5), 1709-1719) 으로 37, 44, 45, 및 47번 아미노산을 일컫는다. 이러한 아미노산 서열의 차이로 단일가변도메인 항체 (VHH)의 안정성을 설명하기도 한다. 때때로 인간 가변도메인 항체에 테트라드 위치의 아미노산을 낙타 항체의 친수성 아미노산으로 교체 (G44E/L45R/W47G)하여 개량된 낙타화(camelized) 항체를 만들려는 시도가 있었다.
그 결과 물리화학적 특성에 있어서 어느 정도 수용성이 개선되기도 했지만(Coppieters et al., Arthritis Rheum. 2006 54(6):1856-66; Dolk et al., Proteins. 2005 59(3):555-64; Ewert et al., Biochem. 2002 41(11):3628-36; Kortt et al., J. Protein Chem. 1995 14(3):167-78; Martin et al., Protein Eng. 1997 10(5):607-14), 오히려 단백질 발현 수율이 떨어지고 열안정성이 감소하는 등, 낙타항체 만큼의 안정성을 확보하기는 어려웠다(Davies et al., FEBS Lett. 1994 Feb 21;339(3):285-90; Aires et al., J. Mol. Biol. 2004 340(3):525-42). 이에 대한 원인으로는 인간항체의 VH/VL 접경 부위의 아미노산을 변형시켰을 경우 해당부위의 베타 시트(beta-sheet) 구조에 변형이 유발되기 때문으로 밝혀진 바 있다(Riechmann et al., J. Mol. Biol. 1996 259(5):957-69). 낙타항체에서 CDR3 부분은 인간항체에 비하여 비정상적으로 긴 루프(loop) 구조를 가지고 있다. 구조학적 분석에 의하면 이 루프 구조가 인간항체의 VH/VL 접경 부위에 해당하는 위치까지 접혀 들어가 있는 것이 밝혀졌고 이러한 특이적 구조가 접경부분에 위치하고 있는 일부분 소수성 패치(patch)를 가려줌으로써 보호막 효과를 나타내어 낙타 항체의 안정화에 도움을 준다고 이론이 제시된 바 있다(Joost et al., 2010 Drug Discovery Today: Tehcnologies 7(2), 139-146).
이러한 보호막 효과는 인간항체에서는 상대적으로 짧은 CDR3 루프 구조로 인하여 기대하기가 어렵다. 결론적으로 인간 단일 가변 도메인은 그 자체로는 낙타 도메인 항체에 비하여 부족한 물리화학적 특성을 가지기 때문에 특정 항원에 대한 결합 리간드의 뼈대구조(scaffold)로서 활용하기에는 부족하다. 이를 극복하기 위한 방법으로 단순히 낙타항체의 구조적 시그네처(signature)인 테트라드(tetrad) 아미노산을 교체하는 것으로는 충분하지 못하며, 추가적으로 단백질구조적인 설계와 분자진화적 스크리닝 방법이 필요하다.
자연계에 존재하는 인간면역글로불린 가변도메인 (VH 또는 VL)은 항원결합 특성을 유지할 수 있는 최소 크기의 항체 (단일클론항체의 1/2 크기) 이므로 기존의 단일클론항체와 비교하여 치료 단백질로서의 물성과 치료효과에 있어서 차별성을 기대할 수 있다는 점에서, 가변도메인 중 하나만을 가지는 인간 항체의 개발에 대한 수요는 높아지고 있지만, 그럼에도 불구하고 VH 또는 VL이 단독으로 존재할 때 자체의 단백질의 응집(aggregation) 현상 및 불안정적 성향은 특정 항원에 대한 결합 골격구조 (binding scaffold)로 개발하는 데 있어 극복해야 할 주요한 장애물로 남아 있다.
따라서 항체단편 및 소형 항체의 경우 일반적인 단일클론 항체가 제공해 줄 수 없는 장점을 제공하고 자체의 경쟁력을 가지기 위해서는 물질자체의 강건한 (robust) 제약학적 및 물리화학적 특성의 확보가 중요하다.
인간 중쇄 또는 경쇄의 가변 도메인을 자체적으로 안정시키기 위하여 종래에도 몇몇 분자 진화적 단백질공학 기법이 시도되었다(Barthelemy et al., J. Biol. Chem. 2008 283(6):3639-54). VH의 CDR 변형 라이브러리로부터 파지 디스플레이 (phage display) 시스템을 구축한 후 선별 단계에서 열변형 스트레스를 가한 후 프로테인 A(protein A) 결합 활성이 살아있는 VH를 선별하였다. 이러한 방법을 통하여 낙타의 도메인 항체처럼 물리적으로 수용성이 증대되고 단백질 열변성 후 가역적 재폴딩(reversible folding)이 가능한 CDR 변형 인간 VH를 선별한 보고가 있으며(Jespers et al., Nat. Biotechnol. 2004 22(9):1161-5), 열변성 처리 없이 CDR3 부위와 프레임 부분에 돌연변이를 유도한 다양한 라이브러리를 제작하고 같은 방법으로 파지 디스플레이 후 높은 프로테인 A 결합 활성을 보이는 VH를 선별하고, 선별된 VH를 인간 생식세포 계열의 야생형(wild type) VH와 비교하였을 때 열역학적으로 안정하고 수용성 발현이 증대된 돌연변이 VH를 얻을 수 있었음을 확인할 수 있었다는 보고도 있다(Barthelemy et al., J Biol Chem. 2008 283(6):3639-54). 파지 디스플레이 시스템에서는 목적단백질의 N-말단에 융합된 pelB 단백질의 Sec 신호(signal) 서열에 의하여 목적단백질이 Sec 경로로 유도된다. 그러나 이 경우 내재적인 단백질 이동경로의 한계로 인하여 대장균 사이토플라즘(cytoplasm) 내에서 이미 폴딩된 단백질은 경로를 통과 할 수 없다. 왜냐하면 일반적인 파지 디스플레이의 경우 대장균의 대표적인 단백질 이동경로인 Sec 경로를 이용하고 이 경로의 특성상 목적단백질은 세포질 내의 샤페론(chaperon)의 도움을 받아 3차 구조를 이루지 않은 선형(linear) 구조의 형태로 세포막을 통과하기 때문이다. 자연계상에서 존재하는 Sec 경로 특이적 단백질들은 특징적으로 단백질 전사 직후 SecB라는 샤페론의 도움으로 폴딩되지 않은 선형 상태로 세포질에 존재한다. SecB의 안내에 따라 세포내막에 존재하는 Sec A, SecYEG, 및 SecDFYajC로 이루어진 트랜스로케이즈(translocase) 복합체로 이동된 Sec 경로 대상 단백질은 3차 구조를 이루지 않은 선형 상태로 막을 통과하게 되며 통과된 아미노산 사슬은 세포막간(periplasm)에 이르러서야 비로소 DsbA와 DsbB의 산화, 환원 작용에 의해 이황화결합을 포함한 완벽한 3차 구조를 이룬다(Baneyx and Mujacic Nature Biotech. 2004, 22, 1399~1408). 따라서, 만약 어떤 단백질이 자체의 특성상 세포질에서 폴딩과 3차 구조의 형성이 빠르게 일어난다면, 이 단백질은 Sec 경로로 디자인된 파지 디스플레이 스크리닝 시스템과는 서로 호환성이 없다.
또한 박테리아 융단이 깔린 플레이트에서 플라크(plaque) 사이즈의 크기를 기준으로 클론을 직접 선별하였을 때 물리화학적 개선된 야생형 VH를 골라낼 수 있었다는 보고도 있다(To et al., J. Biol. Chem. 2005 280(50):41395-403). 그러나 플레이트 기반 스크리닝은 대규모 처리가 불가능 하므로 라이브러리 크기를 줄이기 위하여 생체외(in vitro)에서 프로테인 A 선별 과정을 거친 VH3 패밀리만을 대상으로 최초 시작 라이브러리를 제작하였다.
한편, 재조합 단백질의 폴딩(folding) 특성을 개선하기 위해서, 유전적 진화방법이 시도되었는데(Maxwell et al., Protein Sci. 1999 8(9):1908-11; Wigley et al., Nat. Biotechnol. 2001 19(2):131-6; Cabantous et al., Nat Biotechnol. 2005 23(1):102-7; Waldo GS. Curr. Opin. Chem. Biol. 2003 7(1):33-8), 재조합 단백질의 폴딩 특성 개선을 위한 대표적인 방법 중의 하나는 관심 단백질과 유전자 재조합 기술로 융합되어 있는 리포터 단백질(reporter protein)의 활성도를 측정함으로써 간접적으로 관심 단백질의 폴딩 정도를 측정할 수 있다. 하지만 실제 관심 단백질이 단독형태로 존재할 때 폴딩을 정확히 반영할 수 없는 한계가 있다.
또한 단백질의 수용성을 증대시키기 위하여, 박테리아 고유의 폴딩 품질 검사 기능을 가진 단백질 이동 경로인 Tat(Twin-arginine translocation) 경로를 단백질 폴딩 여부를 구별하는 생물학적 경계막(filter)으로 활용한 분자 진화방법도 개발되었다. 구체적으로, 대장균 내에서 관심 단백질을 리포터 유전자와 Tat 신호서열 (Tat signal sequence)과 융합시켜 Tat 경로로 발현시킨 후 단백질의 폴딩과 수용성 여부에 따라 Tat ABC 트랜스로케이스 복합체(translocase complex)의 단백질 폴딩 검증 기능을 거치게 한다. 만약 목적 단백질이 충분히 수용성을 가지고 있을 경우, 목적 단백질과 리포터 단백질로 이루어진 융합단백질은 대장균 내벽을 통과하여 주변세포질(periplasm)에 도달하게 된다. 주변세포질에 도달한 융합단백질은 항생제내성 측정 등의 방법으로 검출함으로서 원하는 수용성 특성을 가진 단백질을 스크리닝할 수 있다(Fisher et al., Protein Sci. 2006 15(3):449-58). 자연계의 Tat 경로 기질 단백질이 아닌 재조합 단백질을 Tat 경로에 응용하였을 경우도 유의성 있게 단백질의 수용성 및 안정성에 비례하여 Tat 경로를 통과함을 알 수 있다(Lim et al., Protein Sci. 2009 18(12):2537-49). 또한 Tat 경로를 이용하여 대장균 세포질 내에서 단백질 폴딩이 일어나는 단일쇄 항체(single chain antibody : scFv)를 효과적으로 선별할 수 있다는 점이 보고된 바 있다(Fisher AC and DeLisa MP. J Mol Biol. 2009 385(1): 299-311). 상기 문헌에 따르면, 비수용성으로 대장균에서 발현되는 scFv13 를 주형 염기서열로 하여 실험실적으로 분자 진화 (molecular directed evolution)를 성공적으로 이룰 수 있었다. scFv 내에 존재하는 이중 황화결합(disulfide bond)는 약 4-6 kcal/mol의 수준으로 단백질 분자의 안정화에 기여한다. 이 결합은 박테리아의 주변 세포질이나 진핵세포의 세포질 망상 구조(endoplasmic reticulum : ER)에서와 같은 산화적인 환경(oxidized environment)에서 이루어진다. 박테리아의 주변 세포질은 DsbA와 세포안 막(inner membrane)에 존재하는 DsbB사이의 전자 흐름을 통하여 항상 산화조건을 유지하고 있다. 따라서 scFv13 변형 라이브러리로부터 Tat 경로를 인위적으로 통과 하여 선별된 scFv13 변형 단백질의 경우는 산성조건의 주변 세포질이 아닌 환원조건의 세포질 내에서 이중 황화 결합 형성 없이 자체적으로 자발적 폴딩(self-folding)된 인트라바디(intrabody)들이 우선적으로 선별된다. 구체적으로, 단백질을 Tat 경로로 이끄는 핵심적인 경로 신호서열(signal sequence)을 목적단백질의 N-말단(terminal)에 융합시키고 목적단백질의 C-말단에 보고 단백질 (reporter gene) 기능을 할 수 있도록 TEM-1 베타-락타메이즈(beta-lactamase)를 융합시킨 유전자를 대장균에서 발현시키면 삼중기능 융합단백질(Tripartide)이 발현된다.
발현된 삼중기능 단백질은 Tat 경로로 향하게 되고 세포내막에 존재하는 트랜스로케이즈(Translocase) 복합체인 Tat ABC 작용기작(machinery)에 의해 단백질 폴딩 검증을 거친다. 많은 재조합 단백질 중에서 오로지 수용성이 있는 것만 Tat 경로의 특이적인 작용기작(machinery)들과 호환성이(compatible) 유지됨이 여러 연구결과에서 밝혀졌다(Sanders et al., Mol. Microbiol. 2001 41(1):241-6; DeLisa et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 2003 100(10):6115-20; Matos et al., EMBO J. 2008 27(15):2055-63; Fisher AC and DeLisa MP. J. Mol. Biol. 2009 385(1): 299-311; Lim et al., Protein Sci. 2009 18(12): 2537-49).
하지만, 상기와 같은 단백질의 폴딩 특성 개선을 위한 방법이 도메인 항체, 특히 VH 또는 VL 도메인 항체 등의 선별에 적용된 경우는 없다.
결론적으로, 지금까지의 인간 VH 도메인 항체의 공학적 변형 및 스크리닝은 예외 없이 파지 디스플레이 및 프로테인 A 결합(binding) 활성에 기초한 방법으로 이루어져 왔다(Kristensen P and Winter G. Fold. Des. 1998 3(5):321-8; Sieber et al., Nat. Biotechnol. 1998 16(10):955-60; Jung et al., J. Mol. Biol. 1999 294(1):163-80; Worn A and Pluckthun A. J. Mol. Biol. 2001 305(5): 989-1010).
따라서, 보다 효율적으로 수용성이고, 열역학적 안정성이 높은 VH 도메인 항체를 선별하는 방법에 대한 개발 필요성이 절실하며 더 나아가 선별된 도메인 항체의 특성을 활용하여 효능이 향상된 최소단위의 차세대 항체개발이 시급한 상황이다.
본 발명은 상기와 같은 문제를 해결하고자, 수용성이고, 열역학적 안정성이 높은 VH 또는 VL 도메인 항체를 효율적으로 선별할 수 있는 TAPE(Tat-Associated Protein Engineering)라고 명명된 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 TAPE 방법에 의해 선별된 수용성이며 열역학적 안정성이 우수한 인간 VH 및 VL 도메인 항체 및 인간 또는 재조합 VH 및 VL 도메인 항체 골격(scaffold)을 제공하며, 그러한 VH 및 VL 도메인 항체 및 그러한 항체 골격(scaffold)의 아미노산 서열 및 이를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
본 발명에 따라 선별된 인간 또는 재조합 VH 또는 VL 골격(scaffold)을 포함하는 VH 또는 VL 도메인 항체는 CDR 서열과 무관하게 해당 인간 또는 재조합 VH 및 VL 도메인 항체 골격을 가질 경우, 여전히 수용성이며 열역학적 안정성을 유지한다.
또한 본 발명은 TAPE 방법에 의해 선별된 인간 VH 또는 VL 도메인 항체 골격에 무작위적(random) CDR 서열을 포함하는 라이브러리 및 그 제조방법을 제공한다.
본 발명은 그러한 라이브러리를 이용하여 선별된 목적 단백질에 결합능을 가지는 VH 또는 VL 도메인 항체, 그러한 도메인 항체의 아미노산 서열 및 이를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드에 대한 것이다.
본 발명에서는 인간면역글로불린 가변 도메인 라이브러리(library) 또는 조합(combinatorial) 라이브러리로부터 높은 수용성을 지니며, 열역학적 안정성이 높은 리간드, 특히 VH 및 VL 도메인 항체를 효율적으로 선별할 수 있는 TAPE(Tat-Associated Protein Engineering)라고 명명된 방법을 제공한다.
또한, 본 발명에서는 상기 리간드를 선별하기 위한 시스템, 벡터 및 숙주세포를 제공하며, 상기 TAPE 방법에 의해 선별된 리간드, 특히 VH 및 VL 도메인 항체를 제공한다.
특히, 놀랍게도, 본 발명에 따른 TAPE 방법에 의해 선별된 VH 도메인 항체는 높은 수용성과 열 안정성을 가지고 있을 뿐 아니라, VH 도메인 항체 골격, 즉, FR1 내지 FR4의 프레임이 유지되는 한, 삽입되는 CDR 서열, 즉 CDR1 내지 CDR3의 서열과 무관하게 높은 수용성과 열 안정성이 유지될 수 있음을 발견하였다.
이와 같은 관점에서 본 발명은 본 발명의 TAPE 방법에 의해 선별된 VH 도메인 항체 골격, 즉 FR1 내지 FR4의 프레임 및 이러한 VH 도메인 항체의 골격에 무작위적(randomized)인 인간 유래 또는 조합 CDR 서열, 즉 CDR1 내지 CDR3의 서열이 삽입된 VH 도메인 항체의 라이브러리 및 이의 구축방법을 제공한다.
또한, 상기 구축된 라이브러리로부터 목적하는 타겟에 대한 결합능을 가지는 VH 도메인 항체를 선별하는 방법을 제공한다.
본 발명에서 제공되는 높은 수용성과 열안정성을 가지는 VH 도메인 항체 골격, 즉 FR1 내지 FR4의 프레임은 다음과 같은 아미노산 서열을 가진다.
FR1의 아미노산 서열 :
X0VQLX1X2X3GX4X5X6X7X8PGX9SX10X11X12X13CX14X15X16GX17X18X19 - 식 1)
상기 식 1)에서,
X0은 E 또는 Q이고,
X1는 V 또는 L이고,
X2는 E 또는 Q이고,
X3은 S 또는 A이고,
X4는 G 또는 A이고,
X5는 G, M, N, V 또는 E이고,
X6은 L, V 또는 W이고,
X7은 V, K, A 또는 I이고,
X8은 Q, K 또는 H이고,
X9는 G, T, A, R, E, S 또는 T이고,
X10은 L, V, R 또는 M이고,
X11은 R 또는 K이고,
X12는 L, I 또는 V이고,
X13은 S, A 또는 T이고,
X14는 A, E, V, R, I, K, T 또는 S이고,
X15은 A, G, P, V 또는 T이고,
X16은 S, F, 또는 Y이고,
X17은 F, Y, R, G 또는 L이고,
X18는 T, A, S, N, T, P, I, N, H 또는 A이고,
X19는 F, L, V 또는 C이다.
FR2의 아미노산 서열 :
WX20RX21X22PGX23GX24X25X26X27X28 - 식 2)
상기 식 2)에서
X20은 V, A 또는 L이고,
X21은 Q, N, R, I, K, Y, V, M, S, Q, W, F, L, V 또는 C이고,
X22는 A, G, K, S, V, M 또는 T이고,
X23는 K, Q, E, R 또는 T이고,
X24는 L, N, I, P, Y, T, V, W, A, R, M 또는 S이고,
X25은 V 또는 E이고,
X26은 W, I, V, P, F, H, M, Y, L, C 또는 R이고,
X27은 V, M, I 또는 L이고,
X28은 S, A 또는 G이다.
FR3의 아미노산 서열
X29X30X31X32X33X34X35X36X37X38X39X40X41X42X43X44X45X46X47X48X49X50X51DX52X53X54YX55CX56X57 - 식 3)
상기 식 3)에서,
X29는 R, H, Q 또는 T이고,
X30은 F, V, L 또는 I이고,
X31은 T, S 또는 I이고,
X32는 I, L, V, M 또는 R이고,
X33은 S, T 또는 D이고,
X34는 R, A, V, N 또는 I이고,
X35는 D, N 또는 A이고,
X36은 N, T, D, I, R, K, Y 또는 E이고,
X37은 A, S, V 또는 T이고,
X38은 K, R, T, Q, V, E, M, N 또는 I이고,
X39는 N, R, T, K, S, D 또는 V이고,
X40은 T, M, S, V, I, Y 또는 A이고,
X41은 L, V, A 또는 M이고,
X42는 F, Y, N, D, H 또는 S이고
X43은 L 또는 M이고,
X44는 Q, E, H 또는 N이고,
X45는 M,L, V, I 또는 W이고,
X46은 N, T, K, D, Y, I 또는 S이고,
X47은 S 또는 N이고,
X48은 L 또는 V이고,
X49는 R, K 또는 T이고
X50은 D, A, S, P, T, V, I 또는 S이고,
X51은 E, A, D 또는 S이고,
X52는 T, N 또는 S이고,
X53은 S, A 또는 G이고,
X54는 V, I, L 또는 M이고,
X55는 Y 또는 F이고,
X56은 A, G, V 또는 S이고,
X57은 R, S, K, T, L, N 또는 F이다.
FR4의 아미노산 서열
X58GX59GX60X61VTVSS - 식 4)
상기 식 4)에서,
X58은 W, C, Y, G, S 또는 A이고,
X59는 Q, R 또는 L이고,
X60은 A, T, I 또는 V이고,
X61은 L, M, P, V 또는 T이다.
또한 본 발명은 상기 VH 도메인 항체 골격, 즉 FR1 내지 FR4의 프레임의 아미노산 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
보다 바람직하게는 본 발명에서 제공되는 높은 수용성과 열안정성을 가지는 VH 도메인 항체 골격, 즉 FR1 내지 FR4의 프레임은 다음과 같은 아미노산 서열을 가진다.
FR1의 아미노산 서열 :
X0VQLX1X2SGGX5X6X7X8PGX9SX10RX12SCX14X15SGX17X18X19 - 식 5)
상기 식 5)에서,
X0은 E 또는 Q이고,
X1는 V 또는 L이고,
X2는 E 또는 Q이고,
X5는 G, N, V 또는 E이고,
X6은 L 또는 V이고,
X7은 V 또는 K이고,
X8은 Q, K 또는 H이고,
X9는 G, T, A, R, E 또는 T이고,
X10은 L 또는 V이고,
X12는 L 또는 V이고,
X14는 A, E, V, I, K 또는 S이고,
X15은 A, G 또는 V 이고,
X17은 F, Y, R, G 또는 L이고,
X18는 T, A, S, N, T, P, I, N, H 또는 A이고,
X19는 F, L, V 또는 C이다.
FR2의 아미노산 서열 :
WVRX21X22PGX23GX24X25X26X27X28 - 식 6)
상기 식 6)에서,
X21은 Q, N, R, I, K, Y, V, M, S, Q, W, F, L, V 또는 C이고,
X22는 A, G, K, S 또는 M이고,
X23는 K, Q, E, R 또는 T이고,
X24는 L, N, I, P, Y, T, V, W, A, R, M 또는 S이고,
X25은 V 또는 E이고,
X26은 W, I, V, P, F, H, M, Y, L, C 또는 R이고,
X27은 V, M, I 또는 L이고,
X28은 S, A 또는 G이다.
FR3의 아미노산 서열 :
RX30TX32SX34DX36X37X38X39X40X41X42X43X44X45X46X47X48X49X50X51DTA X54YX55CX56X57 - 식 7)
상기 식 7)에서,
X30은 F, V, L 또는 I이고,
X32는 I, L, V 또는 M 이고,
X34는 R, A, V 또는 I이고,
X36은 N, T, D, I, R, K, Y 또는 E이고,
X37은 A, S, V 또는 T이고,
X38은 K, R, T, Q, V, E, M, N 또는 I이고,
X39는 N, R, T, K, S, D 또는 V이고,
X40은 T, M, S, V, I, Y 또는 A이고,
X41은 L, V, A 또는 M이고,
X42는 F, Y, N, D, H 또는 S이고
X43은 L 또는 M이고,
X44는 Q, E, H 또는 N이고,
X45는 M, L, V, I 또는 W이고,
X46은 N, T, K, D, Y, I 또는 S이고,
X47은 S 또는 N이고,
X48은 L 또는 V이고,
X49는 R, K 또는 T이고
X50은 D, A, S, P, T, V, I 또는 S이고,
X51은 E, A, D 또는 S이고,
X54는 V, I, L 또는 M이고,
X55는 Y 또는 F이고,
X56은 A,G,V 또는 S이고,
X57은 R,S,K,T, L, N 또는 F이다.
FR4의 아미노산 서열 :
X58GQGX60X61VTVSS - 식 8)
상기 식 8)에서,
X58은 W, C, Y, G, S 또는 A이고,
X60은 A, T, I 또는 V이고,
X61은 L, M, V 또는 T이다.
또한 본 발명은 상기 VH 도메인 항체 골격, 즉 FR1 내지 FR4의 프레임의 아미노산 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
보다 바람직하게는 본 발명에서 제공되는 높은 수용성과 열안정성을 가지는 VH 도메인 항체 골격, 즉 FR1 내지 FR4의 프레임은 표 1에 기재된 아미노산 서열을 가진다.
표 1. 선별된 VH 도메인 항체 골격의 FR1 내지 FR4의 프레임의 아미노산 서열
골격명 FR1 FR2 FR3 FR4
MG1X8 QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTF WVRQAPGKGLVWVS RFTISRDNAKNTLFLQMNSLRDEDTSVYYCAR WGQGALVTVSS
MG2X1 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTF WVRQAPGKGLEWVS RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAS WGQGTLVTVSS
MG2X1-34 QVQLVESGGNVVQPGTSLRLSCAASGFTF WVRQAPGKGLEWVA RFTISRDNSRNTVFLQMTSLRAEDTAVYYCGR WGQGILVTVSS
MG2X2-12 QVQLVQSGAEVKKPGASVKISCEASGYAF WVRQAPGQGLEWMG RVTLTRDTSTRTVYMELKNLRSADTGVYYCAR WGQGTLVTVSS
MG2X2-13 EVQLLESGGGVVQPGKSLRLSCVGSGFSF WVRQAPGKGLEWLA RFTISRDNSKTMVNLQMNSLRPDDTAVYFCAR WGQGTLVTVSS
MG3X1 QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCVASGFNF WLRQAPGKGLEWVA RFTISRDNSKNTLYLEMNSLRPEDTAVYYCAK CGQGTLVTVSS
MG3X10 EVQLVESGGGLVKPGGSLRVSCAASGFTF WVRQAPGKGLEWVG RFTISRDDSKNMVYLQMNSLKTEDTAVYYCTT YGQGTLVTVSS
MG4X1-8 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSF WVRQGPGEGLVWLS RFTISRDNAKNTVYLEMNSVRVDDTAVYYCVS WGQGALVTVSS
MG4X1-33 QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCEASGFPF WVRQAPGKGLEWVS RFTISRDDSTNTLYLQVNSLRAEDTAVYYCAK WGRGTLVTVSS
MG4X1-35 EVQLLESGGGLVKPGGSLRLSCVGSERSF WVRQAPGKGLEWVA RFTVSRDNVQKSLDLQMDSLRAEDTAVYFCAR WGQGTTVTVSS
MG4X3-27 EVQLLESGGGLAQSGGSLRLSCAASGFTF WVRQAPGKGLEWIS RFTISRDIAKNSLYLQMNSLRDEDTAVYYCAK WGQGALVTVSS
MG4X4-2 EVQLVQSGAEVKKPGESLRISCRGSGYRF WARDKPGKGLEWIG HVTISSDRSVSVAYLQWDSLKASDNGIYYCAL WGQGTLVTVSS
MG4X4-4 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCVPSGFTF WVRQAPGKGLVWVS RFTISRDNAEDTLFLQMNSLRVDDTAVYYCVR WGQGVLVTVSS
MG4X4-25 QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCIASGFSL WVRRSPGKGLEWVA RFTVSRDNAKNSLFLQMNNVRPEDTALYFCAR WGQGTMVTVSS
MG4X4-44 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTF WVRQAPGKGLEWVA RFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTALYYCAR WGQGTLVTVSS
MG4X5-30 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTF WVRQAPGKGLEWLS RFTISRNNAKNSLYLQMNSLRVDDTAVYYCAR WGQGTLVTVSS
MG4X6-27 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTF WVRQGPGKGLEWVA RFTISRDNAENSLYLQVNSLRAEDTAIYYCAK WGQGALVTVSS
MG4X6-48 EVQLLESGGGVVQPGRSLRLSCEVFGFTL WVRQAPGRRLEWVA RFTISRDIATNRLYLQMRSLRAEDTALYYCAR WGQGTLVTVSS
MG4X7-15 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSF WVRQAPGKGLEWVS RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRVEDTAVYYCAV WGQGTTVTVSS
MG4X8-24 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTF WVRQAPGKGLEWVS RFTISRDNSNNTLYLQMNSLRADDTAVYFCAK WGQGTLVTVSS
MG0.5X-1 QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTF WVRQVPGKGLEWVA RFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAN WGQGTLVTVSS
MG0.5X-3 QVQLVESGGGLVQPGGSLTLSCAASGFTF WVRQAPGTGLLWLS RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR WGXGTMVTVSX
MG0.5X-4 EVQLLESGGMLVKPGESLRLSCVGSGLIF WVRHAPGKGLEWVG RLSISRDDSMNTVYLDIYNLKIDDTGVYYCTF WGQGTPVTVSS
MG0.5X-14 EVQLLESGGGLVHAGGSVRLSCAASGFTF WVRQAPGKGLEWVA RFTISRDNSKNSMYLQMNSLRVEDTAVYYCAR WGQGTVVTVSS
MG0.75X-4 QVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTF WLRQAPGKGPEYVA RFIISRDDSNDMLYLEMISLKSEDTAVYYCSD GSQGTLVTVSS
MG2X-5 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTF WVRQAPGKGLEWVS RFTISRDNSKNTLYLHMNSLRAEDTAVYYCVK WGQGTLVTVSS
MG2X-15 QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTF WVRQAPGKGLEWVS RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAK WGQGTLVTVSS
MG4X-5 QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCEASGLHF WVRQAPGKGLEWVA RFTVSRDNSRNTLYLQMKSLSAEDTAVYYCAK WGQGTMVTVSS
MG1-4 QVQLVEAGGGLVQPGGSLRLACAASGFTF WVRQAPGKGLEWIS RFTISRDNSQNSLFLQMNSLRAEDTAVYYCAT WGQGTMVTVSS
MG1-6 EVQLVQSGAEVKKPGESLRKSCKGSGYSF WVRQMPGKGLEWMG HVTISVDKSISTAYLQWSSLKASDSAMYYFL WGQGTLVTVSS
MG1-7 QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTF WVRQAPGKGLEWVA RFTISRDNAKNSLYLQMNSLRDEDTAVYYCAR WGQGTLVTVSS
MG1-8 EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTF WVRQAPGQGLEWMG RVTMTRDTSSTTAYMELNRLTSDDTAVYFCAR WGQGTLVTVSS
MG1-9 EVQLVEAGGGLVQPGGSLRLACAASGFTF WVRQAPGKGLEWIS RFTISRDNAQNSLFLQMNSLRAEDTAVYYCAT WGQGTMVTVSS
MG1-10 EVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSGYSF WVRQMPGRGLEWLG QVTMSANRSISTAYLQWSSLKASDTGIYYCAT WGQGTTVTVSS
MG5-1 QVQLVESGGGLIQPGESLRLSCEAFGFTV WVRQAPGKGLEWVS RFTISRDSTQNTVHLQMNSLTAEDTAVYYCAR WGQGTLVTVSS
MG5-2 EVQLVQSGAELKKPGSSVKVSCTSSGGSF WVRQAPGQGLEWMG RLILSVDEPTRTVYMELTSLRSDDTAMYYCAR WGQGTTVTVSS
MG5-4 EVQLLESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTF WVRQAPGKGLEWVS RFTISRDNAKDSLYLQMNSLRPEDTALYYCAR WGQGTMVTVSS
MG5-5 EVQLLESGGGVVQPGRSLRLSCVASGFTF WVRQAPGKGLEWVS RFTISRDYSNKIVHLEMDSLRAEDTAVYFCVR WGQGTLVTVSS
MG5-6 EVQLLESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTF WVRQAPGKGLECVA RFTISRDDSRDMLYLQMNNLKTEDTAVYYCSD SSQGTLVTVSS
MG5-7 EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCTTSGFSF WVRQAPGKGLEWVS RFTISRDDSKSIVYLQMSSLQTEDTAVYYCSR WGRGTLVTVSS
MG5-9 EVQLLESGGGLVRPGGSLRLSCSASGFAF WVRQAPGKGLEWVS TISRDNAKNSVYLQMNSLRAEDSAVYFCAR WGQGTLVTVSS
MG10-1 QVQLVESGGNVVQPGTSLRLSCAASGFTF WVRQAPGKGLEWVA RFTISRDNSRNTVFLQMTSLRAEDTAVYYCGR WGQGILVTVSS
MG10-2 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLTCVGYGFTF WVRQAPGKGPEWVA RFTISRDNAKDSLYLQMDSLRPEDTAVYYCAR APQGTLVTVSS
MG10-4 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFIL WVRQAPGKGLVWVS QFTISRDNAKNTLYLQMNSLRVEDTAVYYCAR WGQGTMVTVSS
MG10-5 EVQLLESGGGVVHPGRSLRLSCAVSGFSL WVRQAPDKGLEWVA RFTVSRDISKNTVYLQMNSLRAEDTALYYCAR WGQGTMVTVSS
MG10-6 EVQLLESGGGLVQPGGSRRLSCAASGFTF WFRQGPGKGLEWVA RFTISRDDSKNSLSLQMDSLRTEDTAVYYCVR WGQGTVVTVSS
MG10-8 QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCVASGFAF WVRQTPGRGLEWLA RFTISRDNSNNTVYLEMNSLRPEDSAIYYCAK WGLGTVVTVSS
MG10-10 QVQLVESGGVVVQPGGSLRLSCAASGFTF WVRQAPGKGLEWVS RFTISRDNSKNSLYLQMNSLRTDETALYYCV WGQGTLVTVSS
MG2 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTF WVRQAPGKGLEWVS RFTISRDNAKNSLYLQMNSLRTDETAVYYCAR WGQGTTVTVSS
M5G EVQLLQSGGGWVKPGGSLRLSCAASGFIC WVRQAPGKGLEWVG RFTISIDESRNALFLHMNSLTTDDTAVYYCST WGQGTLVTVSS
MG6 EVQLLESGGVVVQPGRSLRLSCAASGFTF WVRQAPGKGLEWVA RFTVSRDTSTNTLYLQMNSLRVEDTAVYYCAR WGQGTLVTVSS
MG7 QMQLVQSEAEVKKPGASMKVSCKASGYTF WVRQATGQGLEWMG RVTMTRNTSISTAYMELSSLTSADTAVYYCAR WGQGTLVTVSS
MG10 QVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSGYSF WVRQMPGKGLEWMG QVTISADKSISTAFLQWNSLKASDTAMYYCAR WGLGTLVTVSS
또한 본 발명은 상기 VH 도메인 항체 골격, 즉 FR1 내지 FR4의 프레임의 아미노산 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
특히, 상기 프레임의 일부 아미노산 서열의 변이를 통해 개량된 VH 도메인 항체 골격, 즉 FR1 내지 FR4의 프레임은 표 2에 기재된 아미노산 서열을 가진다.
표 2. 아미노산 변이된 VH 도메인 항체 골격의 FR1 내지 FR4의 프레임의 아미노산 서열
골격명 FR1 FR2 FR3 FR4
MG8-21 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTF WVRNAPGKGNEIVS RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAS WGQGTLVTVSS
MG2-12L EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTF WVRRAPGKGIEVVS RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAS WGQGTLVTVSS
MG2-7I EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTF WVRIAPGKGPEPVS RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAS WGQGTLVTVSS
MG2-9I EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTF WVRKAPGKGYEPVS RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAS WGQGTLVTVSS
MG2-10I EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTF WVRNAPGKGYEIVS RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAS WGQGTLVTVSS
MG2-11I EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTF WVRYAPGKGYEFVS RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAS WGQGTLVTVSS
MG2-12I EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTF WVRVAPGKGIEPVS RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAS WGQGTLVTVSS
MG2-32 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTF WVRMAPGKGPEHVS RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAS WGQGTLVTVSS
MG2-34 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTF WVRSAPGKGVEMVS RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAS WGQGTLVTVSS
MG2-40 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTF WVRTAPGKGTEMVS RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAS WGQGTLVTVSS
MG2-46 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTF WVRCAPGKGYEFVS RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAS WGQGTLVTVSS
MG2-47 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTF WVRIAPGKGLEMVS RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAS WGQGTLVTVSS
MG2-48 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTF WVRMAPGKGLEYVS RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAS WGQGTLVTVSS
MG2-51 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTF WVRYAPGKGTEFVS RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAS WGQGTLVTVSS
MG2-53 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTF WVRQAPGKGVEWVS RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAS WGQGTLVTVSS
MG2-55 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTF WVRWAPGKGPEFVS RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAS WGQGTLVTVSS
MG2-57 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTF WVRFAPGKGREWVS RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAS WGQGTLVTVSS
MG2-58 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTF WVRFAPGKGCELVS RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAS WGQGTLVTVSS
MG2-59 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTF WVRKAPGKGLETVS RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAS WGQGTLVTVSS
MG2-60 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTF WVRNAPGKGLECVS RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAS WGQGTLVTVSS
MG2-64 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTF WVRCAPGKGWEVVS RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAS WGQGTLVTVSS
MG4-12 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTF WVRLAPGKGVELVS RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAS WGQGTLVTVSS
MG4-13 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTF WVRFAPGKGAEWVS RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAS WGQGTLVTVSS
MG4-17 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTF WVRLAPGKGREWVS RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAS WGQGTLVTVSS
MG4-18 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTF WVRYAPGKGVEFVS RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAS WGQGTLVTVSS
MG4-20 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTF WVRFAPGKGLEMVS RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAS WGQGTLVTVSS
MG4-28 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTF WVRVAPGKGTERVS RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAS WGQGTLVTVSS
MG4-2 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTF WVRIAPGKGMEMVS RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAS WGQGTLVTVSS
MG4-32 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTF WVRAAPGKGPELVS RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAS WGQGTLVTVSS
MG4-33 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTF WVRVAPGKGYEHVS RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAS WGQGTLVTVSS
MG4-34 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTF WVRVAPGKGLECVS RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAS WGQGTLVTVSS
MG4-5 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTF WVRVAPGKGPETVS RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAS WGQGTLVTVSS
MG4-6 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTF WVRMAPGKGSEVVS RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAS WGQGTLVTVSS
MG4-7 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTF WVRLAPGKGTEMVS RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAS WGQGTLVTVSS
MG8-11 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTF WVRTAPGKGAEWVS RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAS WGQGTLVTVSS
MG8-12 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTF WVRWAPGKGKEVVS RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAS WGQGTLVTVSS
MG8-13 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTF WVRQAPGKGIEPVS RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAS WGQGTLVTVSS
MG8-14 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTF WVRQAPGKGPEWVS RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAS WGQGTLVTVSS
MG8-4 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTF WVRQAPGKGPEVVS RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAS WGQGTLVTVSS
MG8-5 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTF WVRTAPGKGIEIVS RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAS WGQGTLVTVSS
MG8-6 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTF WVRIAPGKGVEIVS RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAS WGQGTLVTVSS
MG8-8 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTF WVRAAPGKGLEVVS RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAS WGQGTLVTVSS
본 발명에 따른 VH 도메인 항체 골격, 즉 FR1 내지 FR4의 프레임의 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역은
FR1-X-FR2-X-FR3-X-FR4 - 식 9),
로 표시되는 아미노산 서열을 가진다. 상기 식 9)에서 X는 좌측으로부터 차례로 CDR1, CDR2 및 CDR3을 의미한다.
구체적으로, 본 발명에 따른 FR1 내지 FR4의 프레임의 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역은 표 3 및 표 4에 기재된 바와 같이 서열번호 37 내지 89 및 서열번호 90 내지 131에 따른 아미노산 서열을 가진다.
표 3. 선별된 VH 도메인 항체 골격의 FR1 내지 FR4의 프레임을 포함하는 VH영역의 아미노산 서열
골격명 서열
번호		 VH 영역의 아미노산 서열
(X는 좌측부터 CDR1, CDR2 및 CDR3을 의미한다)
MG1X8 49 QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTF-X-WVRQAPGKGLVWVS-X-RFTISRDNAKNTLFLQMNSLRDEDTSVYYCAR-X-WGQGALVTVSS
MG2X1 50 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTF-X-WVRQAPGKGLEWVS-X-RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAS-X-WGQGTLVTVSS
MG2X1-34 51 QVQLVESGGNVVQPGTSLRLSCAASGFTF-X-WVRQAPGKGLEWVA-X-RFTISRDNSRNTVFLQMTSLRAEDTAVYYCGR-X-WGQGILVTVSS
MG2X2-12 52 QVQLVQSGAEVKKPGASVKISCEASGYAF-X-WVRQAPGQGLEWMG-X-RVTLTRDTSTRTVYMELKNLRSADTGVYYCAR-X-WGQGTLVTVSS
MG2X2-13 53 EVQLLESGGGVVQPGKSLRLSCVGSGFSF-X-WVRQAPGKGLEWLA-X-RFTISRDNSKTMVNLQMNSLRPDDTAVYFCAR-X-WGQGTLVTVSS
MG3X1 54 QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCVASGFNF-X-WLRQAPGKGLEWVA-X-RFTISRDNSKNTLYLEMNSLRPEDTAVYYCAK-X-CGQGTLVTVSS
MG3X10 55 EVQLVESGGGLVKPGGSLRVSCAASGFTF-X-WVRQAPGKGLEWVG-X-RFTISRDDSKNMVYLQMNSLKTEDTAVYYCTT-X-YGQGTLVTVSS
MG4X1-8 56 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSF-X-WVRQGPGEGLVWLS-X-RFTISRDNAKNTVYLEMNSVRVDDTAVYYCVS-X-WGQGALVTVSS
MG4X1-33 57 QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCEASGFPF-X-WVRQAPGKGLEWVS-X-RFTISRDDSTNTLYLQVNSLRAEDTAVYYCAK-X-WGRGTLVTVSS
MG4X1-35 58 EVQLLESGGGLVKPGGSLRLSCVGSERSF-X-WVRQAPGKGLEWVA-X-RFTVSRDNVQKSLDLQMDSLRAEDTAVYFCAR-X-WGQGTTVTVSS
MG4X3-27 59 EVQLLESGGGLAQSGGSLRLSCAASGFTF-X-WVRQAPGKGLEWIS-X-RFTISRDIAKNSLYLQMNSLRDEDTAVYYCAK-X-WGQGALVTVSS
MG4X4-2 60 EVQLVQSGAEVKKPGESLRISCRGSGYRF-X-WARDKPGKGLEWIG-X-HVTISSDRSVSVAYLQWDSLKASDNGIYYCAL-X-WGQGTLVTVSS
MG4X4-4 61 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCVPSGFTF-X-WVRQAPGKGLVWVS-X-RFTISRDNAEDTLFLQMNSLRVDDTAVYYCVR-X-WGQGVLVTVSS
MG4X4-25 62 QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCIASGFSL-X-WVRRSPGKGLEWVA-X-RFTVSRDNAKNSLFLQMNNVRPEDTALYFCAR-X-WGQGTMVTVSS
MG4X4-44 63 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTF-X-WVRQAPGKGLEWVA-X-RFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTALYYCAR-X-WGQGTLVTVSS
MG4X5-30 64 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTF-X-WVRQAPGKGLEWLS-X-RFTISRNNAKNSLYLQMNSLRVDDTAVYYCAR-X-WGQGTLVTVSS
MG4X6-27 65 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTF-X-WVRQGPGKGLEWVA-X-RFTISRDNAENSLYLQVNSLRAEDTAIYYCAK-X-WGQGALVTVSS
MG4X6-48 66 EVQLLESGGGVVQPGRSLRLSCEVFGFTL-X-WVRQAPGRRLEWVA-X-RFTISRDIATNRLYLQMRSLRAEDTALYYCAR-X-WGQGTLVTVSS
MG4X7-15 67 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSF-X-WVRQAPGKGLEWVS-X-RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRVEDTAVYYCAV-X-WGQGTTVTVSS
MG4X8-24 68 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTF-X-WVRQAPGKGLEWVS-X-RFTISRDNSNNTLYLQMNSLRADDTAVYFCAK-X-WGQGTLVTVSS
MG0.5X-1 69 QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTF-X-WVRQVPGKGLEWVA-X-RFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAN-X-WGQGTLVTVSS
MG0.5X-3 70 QVQLVESGGGLVQPGGSLTLSCAASGFTF-X-WVRQAPGTGLLWLS-X-RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR-X-WGXGTMVTVSX
MG0.5X-4 71 EVQLLESGGMLVKPGESLRLSCVGSGLIF-X-WVRHAPGKGLEWVG-X-RLSISRDDSMNTVYLDIYNLKIDDTGVYYCTF-X-WGQGTPVTVSS
MG0.5X-14 72 EVQLLESGGGLVHAGGSVRLSCAASGFTF-X-WVRQAPGKGLEWVA-X-RFTISRDNSKNSMYLQMNSLRVEDTAVYYCAR-X-WGQGTVVTVSS
MG0.75X-4 73 QVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTF-X-WLRQAPGKGPEYVA-X-RFIISRDDSNDMLYLEMISLKSEDTAVYYCSD-X-GSQGTLVTVSS
MG2X-5 74 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTF-X-WVRQAPGKGLEWVS-X-RFTISRDNSKNTLYLHMNSLRAEDTAVYYCVK-X-WGQGTLVTVSS
MG2X-15 75 QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTF-X-WVRQAPGKGLEWVS-X-RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAK-X-WGQGTLVTVSS
MG4X-5 76 QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCEASGLHF-X-WVRQAPGKGLEWVA-X-RFTVSRDNSRNTLYLQMKSLSAEDTAVYYCAK-X-WGQGTMVTVSS
MG1-4 77 QVQLVEAGGGLVQPGGSLRLACAASGFTF-X-WVRQAPGKGLEWIS-X-RFTISRDNSQNSLFLQMNSLRAEDTAVYYCAT-X-WGQGTMVTVSS
MG1-6 78 EVQLVQSGAEVKKPGESLRKSCKGSGYSF-X-WVRQMPGKGLEWMG-X-HVTISVDKSISTAYLQWSSLKASDSAMYYFL-X-WGQGTLVTVSS
MG1-7 79 QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTF-X-WVRQAPGKGLEWVA-X-RFTISRDNAKNSLYLQMNSLRDEDTAVYYCAR-X-WGQGTLVTVSS
MG1-8 80 EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTF-X-WVRQAPGQGLEWMG-X-RVTMTRDTSSTTAYMELNRLTSDDTAVYFCAR-X-WGQGTLVTVSS
MG1-9 81 EVQLVEAGGGLVQPGGSLRLACAASGFTF-X-WVRQAPGKGLEWIS-X-RFTISRDNAQNSLFLQMNSLRAEDTAVYYCAT-X-WGQGTMVTVSS
MG1-10 82 EVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSGYSF-X-WVRQMPGRGLEWLG-X-QVTMSANRSISTAYLQWSSLKASDTGIYYCAT-X-WGQGTTVTVSS
MG5-1 83 QVQLVESGGGLIQPGESLRLSCEAFGFTV-X-WVRQAPGKGLEWVS-X-RFTISRDSTQNTVHLQMNSLTAEDTAVYYCAR-X-WGQGTLVTVSS
MG5-2 84 EVQLVQSGAELKKPGSSVKVSCTSSGGSF-X-WVRQAPGQGLEWMG-X-RLILSVDEPTRTVYMELTSLRSDDTAMYYCAR-X-WGQGTTVTVSS
MG5-4 85 EVQLLESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTF-X-WVRQAPGKGLEWVS-X-RFTISRDNAKDSLYLQMNSLRPEDTALYYCAR-X-WGQGTMVTVSS
MG5-5 86 EVQLLESGGGVVQPGRSLRLSCVASGFTF-X-WVRQAPGKGLEWVS-X-RFTISRDYSNKIVHLEMDSLRAEDTAVYFCVR-X-WGQGTLVTVSS
MG5-6 87 EVQLLESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTF-X-WVRQAPGKGLECVA-X-RFTISRDDSRDMLYLQMNNLKTEDTAVYYCSD-X-SSQGTLVTVSS
MG5-7 88 EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCTTSGFSF-X-WVRQAPGKGLEWVS-X-RFTISRDDSKSIVYLQMSSLQTEDTAVYYCSR-X-WGRGTLVTVSS
MG5-9 89 EVQLLESGGGLVRPGGSLRLSCSASGFAF-X-WVRQAPGKGLEWVS-X-TISRDNAKNSVYLQMNSLRAEDSAVYFCAR-X-WGQGTLVTVSS
MG10-1 90 QVQLVESGGNVVQPGTSLRLSCAASGFTF-X-WVRQAPGKGLEWVA-X-RFTISRDNSRNTVFLQMTSLRAEDTAVYYCGR-X-WGQGILVTVSS
MG10-2 91 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLTCVGYGFTF-X-WVRQAPGKGPEWVA-X-RFTISRDNAKDSLYLQMDSLRPEDTAVYYCAR-X-APQGTLVTVSS
MG10-4 92 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFIL-X-WVRQAPGKGLVWVS-X-QFTISRDNAKNTLYLQMNSLRVEDTAVYYCAR-X-WGQGTMVTVSS
MG10-5 93 EVQLLESGGGVVHPGRSLRLSCAVSGFSL-X-WVRQAPDKGLEWVA-X-RFTVSRDISKNTVYLQMNSLRAEDTALYYCAR-X-WGQGTMVTVSS
MG10-6 94 EVQLLESGGGLVQPGGSRRLSCAASGFTF-X-WFRQGPGKGLEWVA-X-RFTISRDDSKNSLSLQMDSLRTEDTAVYYCVR-X-WGQGTVVTVSS
MG10-8 95 QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCVASGFAF-X-WVRQTPGRGLEWLA-X-RFTISRDNSNNTVYLEMNSLRPEDSAIYYCAK-X-WGLGTVVTVSS
MG10-10 96 QVQLVESGGVVVQPGGSLRLSCAASGFTF-X-WVRQAPGKGLEWVS-X-RFTISRDNSKNSLYLQMNSLRTDETALYYCV-X-WGQGTLVTVSS
MG2 97 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTF-X-WVRQAPGKGLEWVS-X-RFTISRDNAKNSLYLQMNSLRTDETAVYYCAR-X-WGQGTTVTVSS
MG5 98 EVQLLQSGGGWVKPGGSLRLSCAASGFIC-X-WVRQAPGKGLEWVG-X-RFTISIDESRNALFLHMNSLTTDDTAVYYCST-X-WGQGTLVTVSS
MG6 99 EVQLLESGGVVVQPGRSLRLSCAASGFTF-X-WVRQAPGKGLEWVA-X-RFTVSRDTSTNTLYLQMNSLRVEDTAVYYCAR-X-WGQGTLVTVSS
MG7 100 QMQLVQSEAEVKKPGASMKVSCKASGYTF-X-WVRQATGQGLEWMG-X-RVTMTRNTSISTAYMELSSLTSADTAVYYCAR-X-WGQGTLVTVSS
MG10 101 QVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSGYSF-X-WVRQMPGKGLEWMG-X-QVTISADKSISTAFLQWNSLKASDTAMYYCAR-X-WGLGTLVTVSS
표 4. 아미노산 변이된 VH 도메인 항체 골격의 FR1 내지 FR4의 프레임을 포함하는 VH 영역의 아미노산 서열
골격명 서열
번호		 VH 영역의 아미노산 서열
(X는 좌측부터 CDR1, CDR2 및 CDR3을 의미한다)
MG8-21 102 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTF-X-WVRNAPGKGNEIVS-X-RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAS-X-WGQGTLVTVSS
MG2-12L 103 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTF-X-WVRRAPGKGIEVVS-X-RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAS-X-WGQGTLVTVSS
MG2-7I 104 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTF-X-WVRIAPGKGPEPVS-X-RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAS-X-WGQGTLVTVSS
MG2-9I 105 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTF-X-WVRKAPGKGYEPVS-X-RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAS-X-WGQGTLVTVSS
MG2-10I 106 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTF-X-WVRNAPGKGYEIVS-X-RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAS-X-WGQGTLVTVSS
MG2-11I 107 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTF-X-WVRYAPGKGYEFVS-X-RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAS-X-WGQGTLVTVSS
MG2-12I 108 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTF-X-WVRVAPGKGIEPVS-X-RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAS-X-WGQGTLVTVSS
MG2-32 109 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTF-X-WVRMAPGKGPEHVS-X-RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAS-X-WGQGTLVTVSS
MG2-34 110 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTF-X-WVRSAPGKGVEMVS-X-RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAS-X-WGQGTLVTVSS
MG2-40 111 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTF-X-WVRTAPGKGTEMVS-X-RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAS-X-WGQGTLVTVSS
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MG4-6 134 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTF-X-WVRMAPGKGSEVVS-X-RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAS-X-WGQGTLVTVSS
MG4-7 135 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTF-X-WVRLAPGKGTEMVS-X-RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAS-X-WGQGTLVTVSS
MG8-11 136 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTF-X-WVRTAPGKGAEWVS-X-RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAS-X-WGQGTLVTVSS
MG8-12 137 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTF-X-WVRWAPGKGKEVVS-X-RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAS-X-WGQGTLVTVSS
MG8-13 138 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTF-X-WVRQAPGKGIEPVS-X-RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAS-X-WGQGTLVTVSS
MG8-14 139 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTF-X-WVRQAPGKGPEWVS-X-RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAS-X-WGQGTLVTVSS
MG8-4 140 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTF-X-WVRQAPGKGPEVVS-X-RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAS-X-WGQGTLVTVSS
MG8-5 141 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTF-X-WVRTAPGKGIEIVS-X-RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAS-X-WGQGTLVTVSS
MG8-6 142 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTF-X-WVRIAPGKGVEIVS-X-RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAS-X-WGQGTLVTVSS
MG8-8 143 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTF-X-WVRAAPGKGLEVVS-X-RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAS-X-WGQGTLVTVSS
또한 본 발명은 상기 VH 도메인 항체 골격, 즉 FR1 내지 FR4의 프레임의 아미노산 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
본 발명을 상세히 설명하기에 앞서, 본 발명에서 사용된 용어 및 약어를 먼저 정의하여 본 발명의 이해를 돕기로 한다.
인간 면역글로불린 가변도메인 : 인간의 면역글로불린 G (Immunoglobulin G)의 구조를 이루고 있는 12개의 도메인 (VH, CH1, CH2, CH3, VL, CL 각각 한 쌍) 중 항원의 결합에 직접 참여하는 가변 도메인인 중쇄 가변 도메인 (Heavy chain variable domain, VH) 또는 경쇄 가변 도메인(Light chain variable domain, VL)을 의미한다. VH 또는 VL은 9개의 베타-시트 사슬(beta-sheet strand)이 교차하고 있는 구조를 가지고 있다. VH의 경우 N-말단으로부터 시작하여 두 번째와 세 번째 베타-시트 사이, 네 번째와 다섯 번째 사이, 여덟 번째와 아홉 번째 사이에 가변구간(variable region)이 존재하는데, 이를 각각 CDR (Complementary Determinant Region) 1, CDR2, CDR3라고 일컫는다. VH의 N-말단으로부터 CDR1 구간을 제외한 첫 번째와 두 번째 베타-시트(beta-sheet) 구간 전체를 프레임 1(Frame 1, FR1)이라고 하고, 세 번째와 네 번째 베타-시트 구간을 포함하는 CDR1과 CDR2 사이 구간 프레임 2(Frame 2, FR2)라고 하고, CDR2와 CDR3 사이 구간을 프레임 3(Frame 3, FR3)라고 하고, CDR3 이후의 구간을 프레임 4(Frame 4, FR4)라고 한다. 각각의 프레임은 가변 도메인임에도 불구하고 항원과의 결합에는 직접 참여하지 않으며, 이 구간은 인간 면역글로불린 상에서 대부분의 아미노산 서열이 일정하게 보존되어있다. 프레임 구간의 아미노산 서열의 상동성 (homology)에 따라 VH는 총 7가지 패밀리(family)로 구분되며 (VH1, 2, 3, 4, 5, 6 및 7), VL은 Vkappa와 Vlamda로 구분되며 VKappa는 6가지, Vlamda는 10가지 family로 분류된다(Chothia et al., 1992 J Mol Biol 227, 799-917; Tomlinson et a.,l 1995 EMBO J 14, 4628-4638; Williams et al., J Mol Biol 264, 220-232).
CDR(Complementary Determinant Region) : 초가변영역(hypervariable region)이라고도 하며, 항체의 구조 중에서 중쇄 또는 경쇄의 가변 도메인 내에 위치하며 항원의 에피토프와의 직접적인 결합에 참여하는 구간을 의미한다. 각 가변 도메인은 3개의 CDR 구간이 있으며 다양한 길이의 아미노산으로 구성되어 있다.
항체 골격(scaffold) : 항체의 구조 중에서 항원에 직접 결합하는 초가변영역(hypervariable region), 즉 CDR을 제외한 나머지 구조로서 CDR 변형 라이브러리 제작시 아미노산 염기서열이 유지되는 부분을 의미한다. 즉, 항체의 아미노산 서열 중에 초가변영역인 CDR1, CDR2 및 CDR3을 제외한 나머지 아미노산 서열을 의미한다. 본 발명에서는 인간 면역글로불린 가변도메인 중에서 CDR1, CDR2 및 CDR3을 제외한 나머지 영역인 프레임(FR: frame) 1 내지 프레임 4를 모두 합친 영역을 의미한다.
즉, 본 발명에서의 VH 도메인 항체 골격은 VH 도메인 항체 중에서 CDR1 내지 CDR3를 제외한 프레임(FR: frame) 1 내지 프레임 4를 모두 합친 영역을 의미하는 것이다.
이러한 항체 골격은 목적하는 타겟(target)에 결합하는 단백질, 특히 VH 도메인 항체 선별을 위한 CDR 변형 라이브러리 제작을 위한 골격으로 활용할 수 있다.
도메인 항체(Domain antibody) : 광의의 의미에서 인간 면역글로불린 구조를 이루고 있는 도메인 중 일부를 포함하는 특정한 항원에 결합할 수 있는 변형된 형태의 단백질을 의미한다. 협의의 의미에서는 인간 면역글로불린 가변 도메인 (VH 또는 VL)을 치료용 항체로 사용하기에 적합한 형태로 변형한 형태를 의미한다.
특히 단일 도메인 항체 (single domain antibody)의 경우에는 일반적으로 중쇄로만 이루어진 단일중쇄항체 (single heavy chain antibody)로 부터 유래한 가변 도메인을 의미한다. 단봉낙타류 (dromedary) 유래의 단일 도메인 항체는 VHH(heavy chain variable domain from single heavy chain antibody)라 하고 상어와 같은 연골어류 유래의 단일 도메인 항체는 VNAR(Variable new antigen receptor)라 부른다.
본 발명에서의 단일 도메인 항체, 예를 들어 VH 도메인 항체 또는 VL 도메인 항체는 특별한 한정이 없는 한, 인간 유래의 가변도메인 중 중쇄 또는 경쇄 하나로만 구성된 항체를 의미한다.
목적단백질 : TAPE 방법에 있어서, 라이브러리에서 단백질 특성 향상을 위해 선별하고자 하는 대상 관심단백질(protein of interest)을 의미한다. 본 발명에서는 pET-TAPE 발현 벡터의 Tat 신호서열과 TEM-1 베타 락타메이즈 유전자 사이에 기능적으로 연결되는 유전자에 의해 인코딩(encoding)되는 단백질을 의미한다. 수용성 특성이 요구되는 단백질이면 어느 것이나 제한 없이 사용가능한데, 인간 항체 및 그 단편, 수용체 또는 수용체 리간드 등을 포함하며, 특히 인간 생식세포 유래 자연형(natural) 인간 면역글로불린 가변도메인 및 그의 인위적 돌연변이 단백질을 모두 포함한다.
리간드 : 라이브러리에서 선별된 목적단백질 중 특정 리셉터 또는 타겟으로 하는 단백질에 결합능력이 있는 단백질을 의미한다.
다중특이성 (multi-specific) : 하나 이상의 에피토프에 대하여 특이적 결합을 할 수 있는 항체의 특성을 의미한다. 한 개의 대상 물질에 두 개 이상의 에피토프을 인지하는 특성을 의미할 수도 있으며, 두 개 이상의 대상 물질에 결합하는 특성을 의미하기도 한다.
융합단백질 : 핵산으로 인코딩된 최소한 두 개 이상의 기능이 다른 단백질 또는 펩타이드가 서로 기능적으로 연결되어 있는 단백질로서 예를 들어, Tat 신호서열과 목적단백질이 기능적으로 연결되어 있는 것들을 의미한다. 여기에 추가적으로 TEM-1 베타-락타메이즈와 같은 보고유전자 (reporter gene) 또는 6xHis 및 플래그(Flag)와 같은 태그(Tag) 등이 연결될 수도 있다. 기능적으로 서로 연결된 단백질의 유전자는 발현벡터 상에서 하나의 프로모터(유도형, 지속형, 기타)에 의해 발현이 조절된다.
자연형 또는 야생형(wild type) : 자연계상에서 얻을 수 있는 유전자 또는 그 유전자의 산물 (예를 들어 단백질)을 의미한다. 이는 인위적 또는 자연적으로 유전자의 서열이 바뀌어 산물이 다른 특성으로 바뀌는 돌연변이(mutant), 다중성(polymorphism), 변이(variant)와 상반되는 개념이다.
상기와 같은 용어 및 약어의 정의에 따라 본 발명을 상세히 설명하기로 한다.
상기 설명한 바와 같이 본 발명에 따른 TAPE 방법 및 이를 위한 TAPE 시스템은 Tat 신호서열에 목적 단백질과 항생제 내성 단백질이 결합된 유전자 구조체(construct)를 제조하고, 이를 포함하는 벡터를 숙주세포, 특히 대장균에 형질전환시킴으로써, 융합단백질을 대장균에서 발현시켜 수용성(soluble)이며 열역학적 안정성이 우수한 인간 생식세포 유래 면역글로불린 가변도메인(Immunoglobulin variable domain, VH 또는 VL)이나 리간드 등의 목적 단백질을 선별할 수 있는 방법 및 그러한 방법을 수행하기 위한 시스템이다.
"Tat 신호서열 (Tat signal sequence)"은 Tat(Twin-arginine translocation) 경로에 의해 인지되는 서열이다. 박테리아에서는 세포질에서 세포내막을 통과하는 경로로 단백질을 유도하며, 엽록체(chloroplast)에서는 스트로마(stroma)에서 틸라코이드(thylakoid)로 이동하는 경로를 유도한다. 일반적으로 Tat 신호서열은 다음의 세 가지 모티프(motif)로 구분된다. 양전하를 띄는 N-말단 모티프인 n-영역(region), 중간의 소수성(hydrophobic) 아미노산으로 이루어진 h-영역, C-말단 모티프인 c-영역으로 이루어져 있다. 여러 Tat 신호서열을 분석한 결과 n-영역과 h-영역에 걸쳐서 Tat 신호서열의 특징적 보존 서열인 S/T-R-R-x-F-L-K이 존재한다는 것이 밝혀졌다. 이 중 두 개의 아르기닌(arginine : R)은 모든 Tat 신호서열에 있어서 변함이 없다는 이유로 트윈-아르기닌(Twin-arginine)이라는 이름이 붙여졌다.
Tat 신호서열은 TorA, CuoO, DmsA, FdnG, FdoG, HyaA, NapA, Suf1, WcaM, TagT, YcbK, YcdB, YdhX와 YnfE 등에서 선택될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 세포질 내에서 샤페론들 또는 다양한 보조인자(cofactor)들과 결합을 통해 완전한 3차 구조를 이루는 단백질들은 Tat 경로를 통하여 세포막을 이동하며 박테리아의 일반적인 세포막 이동 경로인 Sec 신호와는 서로 부합되지 않는다. 즉, Tat ABC로 이루어진 트랜스로케이즈(translocase) 복합체에 의해서 세포질에서 폴딩이 이루어져 완벽한 3차 구조가 형성된 단백질만 인지하므로 Sec 경로와는 다른 특성의 단백질의 이동 경로에 관여한다 (Baneyx and Mujacic, Nat. Biotech. 2004, 22, 1399~1408).
본 발명에 따른 TAPE 방법은 상기와 같은 Tat-신호경로의 특성을 이용한 것으로, 라이브러리(예를 들어, 인간 VH 도메인 라이브러리) 유래의 목적 단백질이 TAPE 스크리닝 시스템 경로를 통과하려면 세포질 내에서 완전히 폴딩되어 Tat ABC 트랜스로케이즈 복합체에 의해 인지되어야 하므로, 따라서, 세포내막에 존재하는 이 복합체는 Tat 경로에 적합한 기질만을 걸러내는 적합성 필터(fitness filter) 역할을 수행한다고 할 수 있다. 그러므로 다른 여러 연구에 의하여 밝혀졌듯이 단백질이 대체적으로 세포질에서 정확하게 폴딩이 이루어졌을 때만 Tat 경로를 통과하며 대체적으로 단백질의 수용성 및 빠른 폴딩 여부에 종속적인 특징을 보인다는 점을 이용한 것이다(DeLisa et al., 2003 PNAS 100(10): 6115-6120; Snaders et al., 2001 Mol Microbiol 41(1): 241-246; Matos et al., 2008 EMBO J 27(15): 2055-2063; Fisher et al., 2006 Protein Sci 15(3): 449-458; Lim et al., 2009 Protein Sci 18(12): 2537-2549). 본 발명에서 사용될 수 있는 Tat 경로 신호 서열은 상기 살핀 바와 같이 TorA, CueO, DmsA, FdnG, FdoG, HyaA, NapA, Suf1, WcaM, YagT, TcbK, YcdB, YdhX 및 YnfE 단백질의 신호 서열 중에 선택되는 것이 바람직하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
즉, Tat 경로의 특성상 단백질 폴딩이 이루어지는 대장균의 세포질은 이황화결합을 이룰 수 없는 환원 조건이기 때문에 VH 도메인 항체 라이브러리 중 특이적으로 이황화결합의 도움이 없이 자발적으로(autonomously) 빠르고 정확한 폴딩이 이루어지는 VH 도메인을 걸러낼 수 있다. 환원 환경 내에서 기능을 가진 항체로 자발적으로 폴딩하는 항체를 찾는 것은 환원 환경의 세포질 내에 존재하는 특정 타겟 항원에 작용하는 항체, 즉 인트라바디(intrabody)의 개발에 있어서 핵심적인 요소이다. 본원 발명의 스크리닝 시스템을 통해 선별을 거친 생식세포의 인간 VH 도메인 또는 변형된 (engineered) VH 도메인이 어떤 물리화학적 특성을 보일 지는 선별된 VH 도메인의 특성 분석을 통해서만 알 수 있다. 이렇게 세포질 내에서의 자발적인 폴딩을 이루는 목적 단백질의 특성이 더 나아가 항체치료제로서의 어떤 물리화학적 특성 (예를 들어, 단백질 수용성, 단백질 열역학적 안정성, 장기보관 안정성, 및 단백질 구조적 안정성 등)에 기여할 것인지는 단순히 예측하기 어렵다. 본원 발명의 목적은 위와 같은 TAPE 방법을 도입 및 개발하고 이를 단백질 공학에 적용시키는 것이며, 좀 더 구체적으로 이 스크리닝 방법을 통해 개량된 인간 면역글로불린 가변도메인 항체 (VH 또는 VL)의 선별에 응용하고 이로부터 나온 향상된 물성의 가변도메인 항체를 신규 치료용 항체의 개발을 위한 골격구조(scaffold)로 응용하는 것이다.
본 발명에 따른 TAPE 방법은 종래의 방법과 비교하면 다음과 같은 장점을 가진다.
종래의 파지 디스플레이(phage display) 기술을 이용하여 도메인 항체 라이브러리에 온도와 같은 일정한 스트레스를 준 후 프로테인 A(protein A)에 붙는 활성을 측정하여 패닝을 수행하는 방법(Jepsers L. et al., Nat. Biotechnol. 2004 22(9): 1161-5; Barthelemy P. A. et al., J. Biol. Chem. 2008 283(6): 3639-54) 등을 통해 NIH 그룹의 경우는 특별한 선별을 거치지 않고 실험적으로 우연히 도메인형태로 안정한 m0라는 도메인을 발견한 바 있다(J. Biol. Chem. 2009 May 22; 284(21): 14203-4210).
하지만 본 발명에서는 대장균의 Tat 경로를 이용한 TAPE 방법을 이용하여 높은 수용성 및 열적 안정성을 가지는 인간 면역글로불린 가변 도메인을 용이하게 선별할 수 있다.
또한 플레이트 기반의 스크리닝 방법을 이용하여 Tat 신호 서열이 포함된 라이브러리로부터 수용성의 단백질을 발굴하는 방법도 알려져 있다. 하지만 이 방법은 항생제가 포함된 고형배지(플레이트)에 일정 배율로 희석된 발현균주를 도말하여 항생제 내성으로 살아남은 개별 클론을 확보하는 과정을 거쳐야만 하므로(Fisher A. C. et al., Protein Sci. 2006 Mar. 15(3): 449-58) Fisher A. C. et al., J. Mol. Biol. 2009 385(1): 299-311), 플레이트 기반의 스크리닝 방법상 한계로 인해, 하나의 플레이트에 105 개 이상의 개별 클론를 분리하기 힘들다. 일반적인 결합 활성을 선별하기 위한 목적의 항체 라이브러리의 크기가 109 내지 1010 개인 것을 감안한다면 보통 크기의 라이브러리를 위와 같은 방법으로 모두 소화하기는 물리적으로 매우 어렵기 때문에 스크리닝에 있어서 하이 쓰루풋(high throughput) 형태를 구현하기가 실질적으로 어려운 결과를 초래한다. 또한 종래의 방법(예를 들어 ISELATE)을 사용하였을 경우 많은 경우에 있어서 플레이트에서 항생제 내성으로 선별된 개별 균주의 플라즈미드 구조 유전자 염기서열을 확인해 보면 목적유전자가 단편화된 형태로 클로닝 되어 짧은 형태의 단백질이 발현되는 경우 또는 목적유전자가 없이 보고(reporter) 유전자 (예를 들어 TEM1-1 β-lactamase)만 존재하는 경우가 종종 발견된다(Fisher A. C. et al., J. Mol. Biol. 2009 385(1): 299-311). 이렇게 펩타이드 수준 (10~20 개의 아미노산으로 구성)의 짧은 단백질은 2차 3차 구조에 영향을 많이 받지 않기 때문에 그 자체로 매우 수용성이 높은 경우가 많아 결과적으로 위양성(false positive)으로 나타내게 된다. 기존의 Tat 기반 단백질 폴딩 선별방법(예를 들어 ISELATE, Fisher JMB 2009)에서는 이런 위양성의 비율이 항생제 내성을 이용한 선별 차수가 늘어날수록 증폭되는 경향이 있어 수용성 단백질의 스크리닝을 불가능하게 만드는 실질적인 장애로 작용한다. 따라서, 대부분의 이러한 방법들은 대규모의 라이브러리를 검사하기 보다는 수용성을 확보하기 어려운 목적 단백질의 소규모 크기의 돌연변이 라이브러리로부터(105 내지 106 크기) 단백질 변형을 통하여 수용성 발현을 확보하여 결정구조를 연구하기 위한 목적으로 이용한다(P'elacq et al., Nat Biotechnol. 2002 20(9):927-32; Yang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 2003 100(2): 455-60).
하지만, 본 발명에 따른 TAPE 방법은 기존의 고형배지(플레이트)를 기반으로 하는 단백질 수용성 선별방법 대신에 라이브러리 전체를 선별항생제(예를 들어 앰피실린)가 포함된 액체배지에 접종하는 방식으로, 배지의 부피를 늘릴 경우 한번에 스크리닝에 적용할 수 있는 라이브러리(대장균) 크기에 대한 제한이 없어지므로 하이 쓰루풋 스크리닝(high throughput screening)이 가능해진다. 그리고 이미 설명한 바와 같이 종래의 방법에 있어서는 항생제가 포함된 액체배지에서 라이브러리를 선별한 다음 라이브러리의 발현벡터로(예를 들어 pET-TAPE)의 클로닝 과정 중의 자체 접합(self-ligation)된 공벡터(mock 벡터)와 위에서 언급한 펩타이드 수준의 유전자 단편이 들어간 클론이 위양성으로 존재할 확률이 매우 높다. 이러한 리가제(ligase)를 이용한 클로닝 방법의 내재적 문제로 인하여 야기되는 펩타이드 수준 크기의 유전자 단편으로 인한 위양성 문제를 해결하기 위한 방편으로서, 회수된 대장균으로부터 총 플라스미드를 회수하여 이미 디자인된 목적단백질과 TEM-1 베타-락타메이즈 융합단백질 발현 유전자 양쪽 끝단에 제한효소를 처리하여 온전한 크기의 선별 유전자를 젤 전기영동(gel electrophoresis) 및 젤 용출(gel elution) 방법으로 분리하면 TAPE 방법에 의해 일차로 선별된 모든 진양성(true positive) VH 도메인 유전자만을 빠짐없이 회수 할 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 TAPE 방법은 반복적인 항생제 내성 선별차수가 늘어남에도 불구하고 위양성이 증폭되지 않고 완전한 목적단백질의 유전자 구조체(construct)만 포함된 진양성(true positive) 클론만 항생제 내성의 정도에 따라 선별할 수 있다는 장점도 가지고 있다.
구체적으로, 본 발명에 따른 TAPE 시스템은 목적 단백질, 특히 중쇄 가변 도메인의 N-말단에 Tat-신호 서열이 기능적으로 연결되어 있고, C-말단에는 항생제 내성 단백질, 특히 성숙된 (자체 Sec 경로 신호 서열이 제외된) TEM-1 베타-락타메이즈(beta-lactamase) 등의 항생제 내성을 부여하는 단백질이 기능적으로 연결되어 있는 융합 단백질을 코딩하는 유전자 구조체를 이용한다.
TAPE 시스템 또는 이를 이용한 TAPE 방법은 상기 유전자 구조체가 숙주 세포, 특히 대장균에 형질전환된 후, 항생제를 첨가한 배양조건에서, Tat-신호 서열에 의해 항생제 내성 단백질이 수용성 형태로 제대로 폴딩되어 발현된 대장균만이 생존할 수 있는 원리를 이용하는 것이다.
하나의 숙주 세포에는 하나의 유전자 구조체만을 형질전환시킴으로써, 생존한 숙주 세포에 포함된 목적 단백질은 수용성 형태로 제대로 폴딩된 것이라고 볼 수 있다.
또한, 상이한 목적 단백질을 코딩하는 유전자 구조체가 형질전환된 다수의 숙주 세포군, 특히 대장균 군을 이용하여 본 발명에 따른 TAPE 방법을 통해 대규모 하이쓰루풋(high throughput) 방식으로 수용성 목적 단백질을 선별할 수 있다.
TAPE 방법은,
(1) 목적 단백질, 특히 중쇄 가변 도메인의 N-말단에 Tat-신호 서열이 기능적으로 연결되어 있고, C-말단에는 항생제 내성 단백질이 기능적으로 연결되어 있는 융합 단백질을 코딩하는 유전자 구조체로 형질전환된 숙주 세포군을 항생제가 포함된 액상 배지에서 배양하는 단계;
(2) 항생제 내성 E. coli로부터 플라즈미드 DNA를 회수하는 단계;
(3) 회수된 플라스미드 DNA에서 목적 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 회수하는 단계;
(4) 회수된 핵산 서열로부터 목적 단백질의 서열을 확인하여 선별하는 단계; 를 포함하여 구성되며,
특히, (3) 단계 이후,
(3') 회수된 핵산 서열을 다시 Tat-신호서열을 코딩하는 유전자 및 항생제 내성 부여 유전자에 작동가능하게 연결시킨 유전자 구조체를 제작하고, 이를 다시 숙주세포군에 형질전환 시키는 단계; 또는
(3") 별도의 유전자 구조체 제작 없이 회수된 핵산서열을 포함하는 플라즈미드를 곧바로 숙주세포군에 형질전환시키는 단계; 중에서 선택된 하나의 단계를 추가적으로 포함할 수 있다.
(3") 단계는 (3') 단계에 비해 보다 신속하게 다음 단계가 진행될 수 있다는 장점이 있다.
단계 (1) 내지 단계 (3') 또는 (3")은 2 라운드(round) 이상 반복할 수 있는데, 이러한 반복적인 과정에 의해 수용성이며 안정화 수준이 높은 목적 단백질을 선별할 수 있다.
(1) 단계 내지 (3') 단계 또는 (3") 단계가 2회 이상 반복될 경우, 최종적으로 (3') 단계 또는 (3") 단계 이후 (4) 단계에서 목적 단백질의 서열을 확인하여 선별하는 단계를 수행하여 목적 단백질을 동정(identification)할 수 있다.
TAPE 방법을 보다 구체적으로 살펴보면,
(1) 숙주 세포, 특히 대장균 세포질에서 목적 단백질, 특히 인간 가변 도메인 라이브러리를 융합단백질 형태로 발현한다. 여기서 각각의 숙주 세포, 특히 대장균은 하나의 특정 융합단백질만 발현한다. 여기서 융합단백질은 Tat 경로 신호서열이 목적단백질, 예를 들어, 인간 면역글로불린 가변 도메인, 특히 VH의 N-말단에 기능적으로 연결되어 있고 C-말단에는 성숙된 (자체 Sec 경로 신호 서열이 제외된) TEM-1 베타-락타메이즈(beta-lactamase) 등의 항생제 내성을 부여하는 단백질이 기능적으로 연결되어 있다.
(2) 융합단백질이 발현된 라이브러리를 항생제가 포함된 액체선별 배지에 접종하여 선별압력(selection pressure)을 가한다. 이때 액체선별 배지에 포함되는 항생제의 농도는 0.1 mg/ml을 기준 (1x)으로 최초 라운드에서의 농도가 1x, 2x, 3x, 4x 또는 5x, 8x 또는 10x가 될 수 있다. 이때 사용하는 항생제는 앰피실린(ampicillin) 또는 카베니실린(carbenicillin) 등을 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 상기 단계 (1)에서 사용되는 항생제 내성 단백질에 따라서 사용될 수 있는 적절한 항생제라면 모두 제한 없이 사용 가능하다. 발현된 융합단백질은 목적단백질의 특성에 따라 Tat 경로를 거쳐 세포막간으로 이동하거나, 목적단백질의 특성상 이동에 실패한, 즉 수용성을 지니지 못하는 융합단백질은 봉입체(inclusion body)를 형성하거나 또는 Tat 프루프 리딩(proof reading) 기작으로 인하여 세포질 내에서 소멸(degradation)된다. Tat 경로의 폴딩 검색기능을 통과하여 주변세포질(periplasm)로 융합단백질이 이동한 대장균만이 목적단백질의 C-말단에 기능적으로 연결된 TEM-1 베타-락타메이즈 등의 항생제 내성 부여 단백질의 작용에 의하여 항생제가 포함된 액체선별 배지에서 내성을 획득할 수 있다.
(3) 액체선별배지에서 살아남은 대장균을 회수하여 플라스미드(plasmid) DNA를 회수한 다음, 이미 디자인된 제한효소를 처리하여 전체 융합단백질 중 목적단백질과 베타-락타메이즈 등의 항생제 내성 부여 단백질의 융합부분만을 인코딩 하는 핵산만을 전기영동 및 젤 추출 방법 등으로 회수하거나, 또는
(3') 액체선별배지에서 살아남은 대장균을 회수하여 플라스미드 DNA를 회수한 다음, 이를 실시예 5에서 기술한 바와 같이 바로 대장균에 형질전환하여 다음 라운드로 진행한다.
(4) 회수된 핵산을 다시 Tat 경로 신호서열 부분과 다시 기능적으로 연결시키기 위하여 목(mock) 벡터 (pET-TAPE)에 클로닝한다.
이후 다시 1)~3)의 과정을 반복하여 라이브러리로부터 원하는 특성의 단백질을 발현하는 유전자의 비율을 강화(enrichment)할 수 있다. 이때 다음 라운드(round)의 액체배지 선별은 이전의 라운드보다 더 높은 항생제 농도에서 실시할 수 있다.
본 발명에서의 목적 단백질, 특히 TAPE 방법에 의해 선별될 수 있는 목적단백질은 목적하는 기능을 가진 어떠한 형태의 단백질도 이용가능하며, 바람직하게는 특정 타겟에 대한 결합능력이 있는 단백질 (scFv, 인트라바디, 도메인 항체, Fab), 수용체 단백질, 특히 TCR(T-cell receptor) 또는 수용체 리간드 등이 이용될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며, 특히 바람직하게는 도메인 항체, 예를 들어 VH 도메인 항체 또는 VL 도메인 항체가 적합하다.
본 발명에서의 목적 단백질은 돌연변이를 가진 것일 수 있다. 목적 단백질의 돌연변이 유발을 위해 특정 부위의 아미노산이 무작위 변이될 수 있도록 디자인된 올리고머를 합성하고 이를 이용한 오버래핑(over-lapping) 중합연쇄반응(PCR)을 이용하거나 DNA 폴리머라제(polymerase)의 에러(error) 비율을 인위적으로 증가시킨 중합반응조건으로 무작위 부위의 무작위 변이를 유발하는 방법(error-prone PCR)과 같은 증폭을 기반으로 하는 돌연변이 방법이 이용될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에서의 목적 단백질을 포함하는 융합단백질은 분리 정제 또는 검출( detection)을 용이하게 하기 위하여, C-말단에 특정한 아미노산 서열로 이루어진 태그(Tag)를 포함할 수 있다. 이러한 태그는 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상적으로 사용되는 태그를 제한 없이 사용가능한데, 예를 들어 6xHis 태그, 플래그 태그(Flag tag), c-myc 태그 등에서 선택될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 또한, 정제 공정은 가변 도메인 종류 예를 들어 VH3에 따라 단백질 A 친화도 컬럼을 사용하여 수행될 수 있다.
융합단백질 발현을 위한 벡터로는 대장균에서 발현가능한 것으로 본 발명이 속하는 기술분야에서 알려진 어떠한 벡터라도 제한 없이 사용가능한데, 이러한 벡터의 비제한적인 예로서는 pET22b(Novagen), pAE34(AthenaES), pET9a (Novagen) 또는 pMK (Lim HK et al. Production Characteristics of Interferon-a Using an L-arabinose Promoter System in a High-cell-density Culture. Appl. Microbiol. Biotechnol. 53(2): 201-208.) 등이 있다. 프로모터로는 lac 프로머터(promoter), T7 프로머터, 아라비노스(arabinose) 프로머터 등이 융합단백질의 발현 유도를 위해 사용될 수 있다.
TAPE 방법을 사용하여 선별된 라이브러리로부터 목적 유전자만을 회수하여 새로운 발현벡터로 클로닝하여 N-말단과 C-말단에 각각 있었던 Tat 신호(signal)와 TEM-1 베타-락타메이즈 없이 목적 단백질만을 단독으로 발현시킨 후, 개별 hit 들의 정제과정을 거친다. 이때 목적 단백질의 C-말단에 정제 및 분석을 용이하게 수행하기 위하여 태그를 포함시켜 정제 과정을 용이하게 수행할 수 있는데, 사용될 수 있는 태그는 상기 설명한 바와 같이 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상적으로 사용되는 태그를 제한 없이 사용가능한데, 예를 들어 6xHis 태그, 플래그 태그(Flag tag), c-myc 태그 등에서 선택될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 또한, 정제 공정은 가변 도메인 종류 예를 들어 VH3에 따라 단백질 A 친화도 컬럼을 사용하여 수행될 수 있다.
본 발명에 따른 TAPE 방법에 의해 사용된 라이브러리의 종류에 따라 원하는 특성을 가지는 리간드를 선별할 수 있다. 이러한 리간드에는 면역글로불린 가변 도메인, 특히 도메인 항체와 수용체 및 수용체 리간드 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 특히 상기 리간드는 야생형(wild type) 뿐 아니라, 상기 설명한 바와 같이 라이브러리 등에 돌연변이를 유발하여, 리간드에 돌연변이가 유도된 것일 수 있다.
또한, 선별된 리간드는 통상의 방법을 통해 그러한 리간드를 코딩하는 유전자 서열, 즉 염기서열을 수득할 수 있다.
본 발명의 TAPE 방법을 통해 수득된 리간드, 예를 들어, 생식라인 염기서열에서 선별한 수용체, 수용체 리간드, VH 및 VL을 포함하는 야생형 리간드 또는 이들의 조합 라이브러리에서 선별된 돌연변이 리간드는 결합단백질로서 바람직한 물리화학적 특성을 보임을 확인하였다. 특히 수용성, 장기보존 안정성, 환원 환경의 세포질 내에서 자체적으로 폴딩할 수 있는 능력, 열역학적 안정성이 향상됨을 확인할 수 있었다.
특히 바람직한 리간드는 예를 들어 인간 면역세포 cDNA 라이브러리로부터 수득된 인간면역글로불린 가변 도메인 및 그 돌연변이체이다. 상기 돌연변이는 특정 야생형 인간 면역글로불린 가변 도메인의 프레임(frame) 부분의 특정한 위치에 NNK 프라이머(primer) 등을 이용하여 아미노산을 변형시킨 라이브러리를 사용하여 선별, 수득될 수 있다.
본 발명에 따른 TAPE 방법에 의해 선별된 중쇄 또는 경쇄 가변영역 도메인, 즉 VH 또는 VL 도메인 항체는 해당 인간 VH 또는 VL 도메인의 골격을 가지며, CDR 서열과 무관하게 여전히 수용성 및 열역학적 안정성을 유지한다.
따라서 상기와 같은 특성을 이용하여, 본 발명을 통해 선별된 높은 수용성과 열역학적 안정성 등을 가진 우수한 물성의 VH 골격은 목적하는 타겟, 즉 항원을 표적으로 하는 특정 리간드, 즉 도메인 항체를 수득하기 위한 라이브러리의 골격구조(scaffold)로 활용될 수 있다. 구체적으로, 선별된 돌연변이 VH 도메인 항체의 골격을 유지하면서, 무작위 CDR 서열을 삽입하여 라이브러리를 구축하고, 이로부터 패닝(panning) 등의 통상의 방법을 사용하여 목적하는 타겟, 즉 항원에 결합능을 가지는 항체를 선별할 수 있다.
구체적으로는 통상적인 파지 디스플레이 방법 등과 유사하게 고정된 목적하는 항원에 결합한 VH 도메인 항체를 제외한 나머지 결합하지 않는 VH 도메인 항체를 용출(elution)하여 선별할 수 있으며, 상기 고정된 목적하는 항원에 결합하지 않는 VH 도메인 항체를 용출하는 과정을 2회 이상 반복하여 보다 높은 목적하는 항원에 대한 결합능을 가지는 VH 도메인 항체를 선별할 수 있다.
상기 설명한 바와 같이 본 발명에서 수득된 VH 도메인 항체의 골격을 이용하여 CDR 돌연변이 라이브러리를 구축하기 위해 해당 가변구간(인간면역글로불린 가변도메인일 경우 해당 도메인의 CDR)을 다양한 길이, 즉 아미노산 잔기의 개수를 변화시키거나, 특정 아미노산 잔기를 다른 무작위 아미노산으로 바꾸거나 CDR 내의 초가변영역(hyper variable region)의 몇몇 특정 부위만을 무작위 변형할 수 있다.
따라서 본 발명은 TAPE 방법에 의해 선별된 VH 또는 VL 도메인 항체의 골격에 무작위적(random) CDR 서열을 포함하는 라이브러리 및 그 제조방법을 제공하며, 그러한 라이브러리를 이용하여 원하는 타겟 단백질에 결합능을 가지는 VH 또는 VL 도메인 항체를 선별하는 방법 및 그러한 방법에 의해 선별된 VH 또는 VL 도메인 항체를 제공하며, 선별된 도메인 항체의 아미노산 서열 및 이를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
이러한 방법에 따라 인간 단일 가변 도메인항체, 특히 VH 도메인 항체의 물성을 개선시켜 기존의 자연계상에서는 얻을 수 없는 정도의 수용성과 열역학적 안정성이 확보된 인간 단일 가변도메인 항체, 특히 VH 도메인 항체를 수득할 수 있다.
본 발명에서 제공되는 TAPE 방법은 높은 수용성, 열적 안정성, 장기보존 안정성을 지니는 목적 단백질을 용이하게 선별해낼 수 있으며,
특히 TAPE 방법을 통해 선별된 인간 VH 및 VL 도메인 항체 골격의 경우, 다양한 CDR 변형, 즉 CDR 서열과 무관하게 높은 수용성 및 열적 안정성을 유지하는 우수한 특성을 나타내었다.
따라서, 선별된 인간 VH 또는 VL 도메인 항체의 골격을 이용하여 CDR 서열을 무작위 또는 논리적(rational)으로 돌연변이시킨 라이브러리 구축이 가능하며, 구축된 라이브러리로부터 치료용 약품에 이용될 수 있는 우수한 특성을 지닌 도메인 항체를 선별해낼 수 있다.
도 1은 TAPE 방법에 의한 선별된 수용성 단백질의 선별능력을 나타내는 도면.
도 2는 TAPE 방법으로 수용성 단백질을 선별하는 방법에 관한 모식도.
(a) 숙주 세포군을 항생제가 포함된 액상 배지에서 배양하는 단계
(b) 숙주 세포군의 성장곡선을 항생제의 농도에 따라 확인하는 단계
(c) 플라스미드를 회수하여 목적 단백질을 코딩하는 핵산의 유무를 확인하는 단계
(d) 회수된 핵산 서열을 다시 Tat-신호서열을 코딩하는 유전자 및 항생제 내성 부여 유전자에 작동 가능하게 연결시킨 유전자 구조체를 제작하고, 이를 다시 숙주세포군에 형질전환 시키는 단계 혹은 회수된 플라스미드를 직접 숙주세포군에 형질전환 시키는 단계
도 3은 인간 면역글로불린 중쇄 가변도메인 유전자 라이브러리로부터 TAPE 방법을 이용하여 선별된 인간 VH 도메인의 아미노산 서열을 나타내는 도면.
(a) 선별된 인간 VH 도메인의 FR1, CDR H1, FR2, 및 CDR H2 서열
(b) 선별된 인간 VH 도메인의 FR3, CDR H3 및 FR4 서열
도 4는 인간 면역글로불린 중쇄 가변도메인 유전자 라이브러리로부터 TAPE 방법을 이용하여 선별된 인간 VH 도메인의 대장균에서의 발현양상을 SDS-PAGE를 이용하여 분석한 결과를 나타내는 도면.
sol은 세포파쇄 후 수용성 분획(soluble fraction)을, Incl은 세포파쇄 후 비수용성 분획(insoluble fraction0을 의미하며, 화살표는 해당 VH 분자량 위치의 밴드를 표시
(a) 기존에 수용성이 좋은 것으로 알려진 VH 도메인의 발현양상
(b) 왼쪽 박스는 인간 생식세포로부터 유래 인간면역글로불린 중쇄가변도메인 라이브러리로부터 무작위로 선별한 VH, 오른쪽 박스는 TAPE 방법에 의해 선별된 VH 도메인의 발현양상
도 5는 TAPE 방법에 의해 1차 선별된 VH 도메인 항체 골격의 변형 라이브러리의 제조 방법을 나타내는 도면.
도 6은 VH 도메인 항체 골격의 변형 라이브러리를 이용하여 TAPE 방법에 의해 선별된 인간 VH 도메인의 아미노산 서열을 나타내는 도면.
(a) 선별된 인간 VH 도메인의 FR1, CDR H1, FR2, 및 CDR H2 서열
(b) 선별된 인간 VH 도메인의 FR3, CDR H3 및 FR4 서열
도 7은 VH 도메인 항체 골격의 변형 라이브러리를 이용하여 TAPE 방법에 의해 선별된 인간 VH 도메인의 대장균에서의 발현양상을 SDS-PAGE를 이용하여 분석한 결과를 나타내는 도면.
1 레인은 낙타 도메인 항체 VHH, 2 레인은 CDR 합성 인간 도메인항체 HEL4, 3 레인은 MG2X1, 4에서 32 레인은 프레임 변형 라이브러리로부터 선별된 VH 골격의 발현 양상을 나타냄.
각 레인별 프레임은,
레인4:MG8-14 레인5:MG2-47 레인6:MG2-55 레인7:MG2-57 lane8:MG2-59
레인9:MG4-2 레인10:MG4-5 레인11:MG4-6 레인12:MG4-7
레인13:MG4-12 레인14:MG4-13 레인15:MG4-17 레인16:MG4-20
레인17:MG4-28 레인18:MG4-32 레인19:MG4-33 레인20:MG8-4
레인21:MG8-5 레인22:M8-6 레인23:MG8-8 레인24:MG8-11
레인25:MG8-12 레인26:MG8-13 레인27:MG2-7I 레인28:MG2-9I
레인29:MG2-10I 레인30:MG2-11I 레인31:MG2-12I 레인32:MG2-12L
도 8은 VH 도메인 항체 골격의 변형 라이브러리를 이용하여 TAPE 방법에 의해 선별된 인간 VH 도메인의 원편광 이색성 분광계(CD) 비교 결과를 나타내는 도면.
도 9는 VH 도메인 항체 골격의 변형 라이브러리를 이용하여 TAPE 방법에 의해 선별된 인간 VH 도메인의 원편광 이색성 분광계(CD) 비교 결과를 나타내는 도면.
도 10은 TAPE 방법에 의해 선별된 VH 도메인의 장기 보관 안정성을 나타내는 도면.
도 11은 변형된 CDR 길이를 갖는 변형 라이브러리 제작 방법을 나타내는 도면.
도 12는 항원결합력을 향상시키기 위한 전략적 라이브러리 돌연변이 위치를 나타내는 도면.
(a) FR1, CDR H1, 및 FR2 서열
(b) CDR H2 및 FR3 서열
(c) CDR H3 및 FR4 서열
도 13은 선택적 CDR 돌연변이 라이브러리 제작 방법을 나타내는 도면.
도 14는 CDRH3 변형시, CDRH3의 아미노산 잔기 갯수에 따른 VH 골격의 대장균에서의 발현양상을 SDS-PAGE로 분석한 결과를 나타내는 도면.
(a) CDRH3의 아미노산 잔기 갯수가 7인 경우
(b) CDRH3의 아미노산 잔기 갯수가 8인 경우
(c) CDRH3의 아미노산 잔기 갯수가 9인 경우
(d) CDRH3의 아미노산 잔기 갯수가 10인 경우
(e) CDRH3의 아미노산 잔기 갯수가 11인 경우
(f) CDRH3의 아미노산 잔기 갯수가 12인 경우
(g) CDRH3의 아미노산 잔기 갯수가 13인 경우
(h) CDRH3의 아미노산 잔기 개수 변화가 없는 경우
이하 본 발명을 실시예와 첨부된 도면을 참조하여 상세히 설명한다. 그러나 이들은 본 발명을 보다 상세하게 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 권리범위가 하기의 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. TAPE 시스템 구축을 위한 pET-TAPE 의 제조
Tat(Twin-arginine transport) 시스템 기반 단백질 수용성 스크리닝 시스템을 구축하기 위하여, pET9a 벡터에 목적 단백질 N-말단에 Tat 기질 단백질인 TorA (E. coli trimethylamine N-oxide reductase)의 경로 신호서열(signal sequence)인 ssTorA를 연결하고 C-말단에 TEM-1 베타-락타메이즈를 연결하여 pET-TAPE을 제작하였다.
단, Tat 경로로 유도하는 신호서열은 위에서 언급한 바와 같이 ssTorA에 한정되지 않고 모든 Tat 경로 단백질의 신호서열이 이용될 수 있음은 통상의 기술자에게는 자명한 것이다. 또한 사용하는 벡터는 pET9a (New England Biolab)뿐만 아니라 아라비노스 유도 프로모터(Arabinose induction promoter)를 사용하는 DpMA (대한민국특허 1996-007784), 락(lac) 프로모터를 사용하는 pAE34 등 본 발명의 목적에 부합하는 어떠한 벡터라도 이용가능함 역시 통상의 기술자에게는 자명하다.
pET9a를 벡터로 사용하는 경우 최적화된 배양조건에서 IPTG에 의하여 ssTorA, 목적 단백질, 및 TEM-1 베타-락타메이즈로 이루어진 융합단백질의 발현이 유도되면 신호 서열(signal sequence)의 가이드에 따라 융합 단백질은 Tat 이동 경로를 거치게 된다. 이때 Tat 기작(machinery) (Tat A, B, C)에 의하여 수용성이며 폴딩이 완성된 융합단백질만 세포내막을 통과하게 되고 결과적으로 목적단백질의 폴딩 특성에 의하여 목적단백질에 연결된 TEM-1 베타-락타메이즈는 대장균의 세포주변질(periplasm)로 이동하게 된다. 세포주변질의 TEM-1 베타-락타메이즈의 존재 여부에 따라 대장균의 항생제 내성을 결정된다.
본 발명에서는 인간면역글로불린 중쇄가변도메인의 선별을 위한 스크리닝의 시스템으로서 pET-TAPE 벡터의 ssTorA와 TEM-1 베타-락타메이즈 사이에 목적유전자인 인간 면역글로불린 중쇄 가변도메인 라이브러리를 삽입하였다.
좀더 자세히 실험과정을 설명하면 다음과 같다. ssTorA 유전자와 인간면역글로불린 중쇄가변도메인 VH 패밀리 타입(Family type) 2의 대표적인 유전자(Stefan Ewert et al., Stability improvement of antibodies for extracellular and intracellular applications: CDR grafting to stable frameworks and structure-based framework engineering. Methods 34 (2004) 184-199)의 융합유전자는 DNA 올리고머 합성과 중복연쇄중합반응(Overlapping polymerase chain reaction)을 통하여 합성하였다 (Genscript USA Inc., US). 합성된 ssTat-VH2 유전자를 주형으로 하고 NdeI 염기서열을 포함한 5' 방향 프라이머(서열번호 1)와 NotI, 6Xhis, BamHI 염기서열을 포함한 3' 방향 프라이머 (서열번호 2)를 이용하여 연쇄중합반응을 유도하였다.
PCR 반응은 상기 두 개의 프라이머와 1 mM, 0.5 U I-pfu DNA 중합효소 (iNtRON), 각 2.5 mM의 4가지 dNTP, 및 5 ㎕의 10X 반응 버퍼로 구성하였고, 증류수로 최종 부피가 50 ㎕가 되도록 보충하였다. PCR은 반응은 95℃에서 2분 노출 후, 94℃에서 15초, 56℃에서 15초, 72℃에서 30초 노출을 30회 반복하고, 마지막으로 72℃에서 5분간 반응시켰다. 증폭된 DNA는 1% 아가로즈젤에 로딩하여 전기영동을 수행한 뒤 QIAquick 젤 적출 키트 (QIAGEN, Valencia, CA, USA)로 분리 하였다.
PCR을 통하여 증폭된 NdeI-ssTorA-VH2-NotI-6xHis-BamHI 유전자는 pET9a 벡터의 멀티클로닝 사이트(Multi-Cloning Site : MCS)에 존재하는 NdeI과 BamHI 절단 위치에 삽입하여 pET9a-ssTorA-VH2 플라스미드를 제작하였다. TEM-1 β-lactamase (bla) 유전자를 주형으로 하여 5'-프라이머 (서열번호 3), 3'-프라이머 (서열번호 4)로 PCR 반응을 수행하여 분리한 NotI-TEM-1 베타-락타메이즈-BamHI 조각을 pET9a-ssTorA-VH2의 NotI과 BamHI 절단 위치에 삽입하고 pET-TAPE이라 명명하였다. 이후 라이브러리 제작은 pET-TAPE 에서 VH2 부분을 제거하고 라이브러리 유전자를 삽입하는 방법으로 수행하였다. 구축한 TAPE 시스템이 해당 단백질의 수용성(solubility)에 의존적인지 확인하기 위하여 이미 대장균에서 수용성 발현(soluble expression) 정도가 알려진 대표적인 자연형 인간 면역글로불린 도메인항체(Dp47d, VH2, VH3) 및 음성(VH3-Bla, no signal sequence), 양성 (ssTorA-Bla, no target protein) 대조군 유전자를 pET-TAPE에 도입한 후, TEM-1 베타-락타메이즈의 항생제 내성 정도를 측정하여 보았다. VH 패밀리 타입 2는 대체적으로 대장균 발현 시 수용성 발현이 매우 불리함이 알려져 있고 VH3 와 DP47d는 대장균에서 수용성 발현이 상대적으로 양호하다고 알려져 있다 (Ewert et al., Stability improvement of antibodies for extracellular and intracellular applications: CDR grafting to stable frameworks and structure-based framework engineering. Methods 34 (2004) 184-199).
구체적으로는 이미 단백질의 수용성 정도가 알려진 대조군 인간 면역글로불린 중쇄 가변도메인들과 음성 (pET-TAPE에 VH 패밀리 타입 3의 대표적 유전자를 삽입하고 ssTorA를 제거하여 TEM-1 베타-락타메이즈가 세포주변질로 도달하지 못하게 한 구조체(construct) 및 양성(pET-TAPE 자체로 VH 유전자를 삽입하지 않고 ssTorA과 연결하여 TEM-1 베타-락타메이즈만을 발현시키는 구조체 대조군을 TAPE 시스템에 장착한 후 항생제 포함 배양액에 접종하여 수용성 정도에 따른 항생제 내성 정도를 생균수를 측정하였다. 사용된 배지는 앰피실린 50 ㎍/ml이 포함된 LB 배지를 사용하였으며, IPTG로 3 시간 유도하여 살아있는 세포 수를 계산하였다.
그 결과 해당 유전자의 알려진 수용성은 pET-TAPE 시스템 하에서 항생제 내성의 정도와 비례하는 결과를 보였다(도 1 참조). 도 1에서 단위 세포농도당 카운트(count)가 많을수록 항생제 내성이 강함을 의미한다.
실시예 2. 인간생식세포 유래 면역글로불린 중쇄 가변도메인(VH) 라이브러리 제조
인간 간(Liver), 말초혈액단핵세포(peripheral blood mononuclear cell : PBMC, 비장(Spleen), 갑상선(Thyroid)에서 얻은 mRNA로 부터 역전사(reverse transcription)를 통해 cDNA 라이브러리를 확보하였다.
이로부터 인간 면역글로불린 중쇄 가변도 메인의 DNA 서열을 확보하기 위하여 서열번호 5 내지 서열번호 13에 기재된 혼합 프라이머를 디자인 하여 인간 생식세포계열에서 가용한 모든 인간중쇄가변도메인 유전자를 확보하였다. 확보한 인간중쇄가변도메인 유전자 라이브러리는 pET-TAPE의 NdeI/BamHI 사이트에 삽입하여 약 108 크기의 라이브러리를 완성하였다.
구체적으로는 인간 비장, 말초혈액단핵세포, 간, 흉선에서 추출한 RNA (Clontech, Madison, WI, US)로부터 역전사 반응을 통하여 cDNA 제조하였다. AMV 역전사 효소와 RNase 억제제는 프로메가(Madison, WI, USA)에서 구입하였다. 각각의 RNA를 1 ㎕의 dNTP 혼합물(0.2 mM) 과 1 ㎕의 올리고dT 프라이머와 혼합하고 뉴클리아제가 제거된 물을 총부피가 12 ㎕가 되도록 투여하였다. RNA를 변성시키기 위해 혼합물을 65℃에서 배양한 후 4 ㎕의 5X 스트랜드버퍼, 1 ㎕의 RNase 억제제, 2 ㎕의 0.1 M DTT를 투여하였다. 역전사 반응을 42℃에서 15분간 진행시키고 70℃ 에서 15분간 두었다. PCR에 사용된 프라이머는 각 패밀리 타입별 VH 도메인을 얻기 위하여 여러 개의 축퇴(degenerative) 프라이머를 동시에 사용하였다.
서열번호 5부터 13까지 (표 5 참조)로 기재되는 순방향 (Forward) NcoI 서열 포함 프라이머 및 서열번호 14 및 15 (표 5 참조)로 기재되는 역방향(Reverse) NotI 서열 포함 프라이머(Intergrated DNA Technologies, Inc., Coralville, Iowa, US)를 사용하였다. 주형으로 역전사 반응을 통해 제작된 cDNA, 상기 프라이머 각각 10 pmolar, 0.5 U의 I-pfu DNA 중합효소 (Interon, 대한민국), 4가지 dNTP 각 2.5 mM, 5 ㎕의 10X 버퍼를 이용하여 DNA를 증폭하였다. PCR 조건은 95℃에서 2분 노출 후, 94℃에서 20초, 56℃에서 20초, 72℃에서 2분 노출을 30회 반복하고, 마지막으로 72℃에서 7분간 반응시켰다. PCR 이후 반응 혼합물을 1% 아가로즈 젤을 이용한 전기영동으로 분리하였으며, 이어서 젤 추출 키트(QIAGEN, Valencia, CA, USA)로 정제하였다. 증폭된 PCR 산출물과 pET9a-TAPE 플라스미드는 NcoI과 NotI 제한효소로 절단하였으며, PCR 정제 키트(QIAGEN)와 젤 적출 키트로 각각 정제하였다. 증폭된 VH 유전자를 pET9a-TAPE의 NcoI과 NotI 절단 위치에 삽입함으로써 인간생식세포 유래 VH 라이브러리 플라스미드를 제작하였다. 제작된 라이브러리는 에탄올 침전법을 이용하여 농축하였다.
대장균 ElectroMAX DH5a-E(Invitrogen, Carlsbad, CA, US)은 electrophoration(BTX model ECM630, Holliston, MA, USA)을 통하여 1 ㎕의 DNA로 형질전환 하였다. 라이브러리 크기를 검증하기 위해서 형질전환 된 대장균을 10-4~10-8으로 순차적으로 희석하여 카나마이신이 포함된 LB 한천 배지에 배양 후 콜로니 수를 계산하였다.
그 결과 VH1 패밀리의 라이브러리 크기가 9.1x106, VH3의 크기가 1.56x109, VH5의 크기가 6.05x108 개임을 확인하였다. 이중 50개의 단일 콜로니를 무작위로 분리하여 카나마이신이 포함된 LB 액상 배양액에 배양 후 각각의 플라스미드를 DNA 정제 키트(QIAGEN, Valencia, CA, USA)를 이용하여 분리한 후 확보한 VH 유전자의 염기서열을 확인한 결과 90% 이상의 유전자가 전사가능한 형태로 유지되고 있음을 확인하였다.
표 5. 본 발명에서 사용된 프라이머 서열
Figure 112015016356472-pct00001
Figure 112015016356472-pct00002
여기서, K는 G 또는 T, S는 C 또는 G, R은 A 또는 G, M은 A 또는 C, 그리고 N은 A, T, G 또는 C를 의미함.
본 발명에서의 "항체 서열 순번 시스템"은 면역글로불린 가변도메인인 VH 또는 VL의 아미노산 서열에 번호를 부여하는 시스템을 의미한다. 항체의 CDR은 그 아미노산의 개수가 항체마다 다르기 때문에 수많은 종류의 개별 VH 또는 VL에 대하여 보존 아미노산 서열(예를 들어 프레임 부분)과 가변부분에 일정하게 정한 규칙으로 N-말단을 시작으로 순번을 부여할 필요가 있다. 대표적으로 Kabat, Chothia, 및 IMGT 순번부여(numbering) 시스템이 있으며, 각각은 CDR 부분의 아미노산에 어떤 순서로 번호를 부여하는 가에 따라 달라진다. 본 발명에 있어서는 카밧(Kabat) 순번 부여 시스템을 이용한다. 예를 들어 카밧 시스템에서는 CDR1 부분의 아미노산의 번호를 지정할 때 다음과 같은 원칙으로 지정한다. 기본적인 전제는 항체의 가변구간 (CDR) 내에서도 아미노산 변이의 정도에 따라 초가변구간(hypervariable region)과 이를 구조적으로 지탱하고 있는 기본구조(canonical structure)로 구분할 수 있다는 점이다. 예를 들어, VH의 첫 번째 보존프레임인 프레임 1이 30번째에 끝나고 첫 번째 가변구간(CDR1) 중에서 기본구조(canonical structure)인 31번째 아미노산부터 35번째 아미노산을 각 31번부터 35번으로 우선 지정한 후, 만약 35번째 이상의 아미노산이 프레임 2 부분과 일치하지 않은 가변 아미노산으로 판단되면 그 다음 부터는 35a, 35b, 35c 등등으로 극가변구간이 끝날 때 까지 차례로 번호를 부여한다. 따라서 카밧 시스템에 의하면 프레임 2 구간은 반드시 36번으로 시작하게 되어있다. 카밧 순번부여 시스템에 의한 CDR2 부분의 순번 부여의 경우도 마찬가지로 CDR2에서 반드시 존재하는 기본구조인 50번에서 52번까지 아미노산에 대하여 먼저 번호가 부여되고 그 다음 부터는 52a, 52b, 52c 등등으로 순서대로 지정한 후 이어서 나오는 뒷부분의 CDR2의 기본구조에 대해서는 53번부터 65번 까지 차례로 번호를 부여한다. 따라서 프레임 3의 아미노산은 반드시 66번부터 시작한다. CDR3의 경우도 마찬가지로 CDR3이 시작하는 기본구조 95번부터 100번 까지 번호를 우선 부여하고, 다음 순서의 극가변구간의 아미노산을 차례대로 100a, 100b, 100c 등등의 순서로 부여한다. 이어서 CDR3 뒷부분의 기본구조에 101 번부터 102번까지 번호를 부여한다. 따라서 이후 연결되는 마지막 프레임 4 부분은 반드시 103번으로 시작하게 되어있다.
실시예 3. TAPE(Tat-associated protein engineering)를 통한 인간생식세포 유래 VH 라이브러리 스크리닝
(1) 인간생식세포 유래 VH 라이브러리 구축
대장균 T7 Express LysY/Iq을 전기천공법(electroporation) 방법으로 pET-TAPE 라이브러리로 형질전환하였다. 이후 SOC 배양액에서 37℃, 한 시간 배양 후, 50 ㎍/ml (1X) 카바니실린이 포함된 LB 배양액에 접종, 배양하였다. 대장균의 OD 값이 0.6 이 되었을 때 원심분리를 이용하여 대장균을 회수하고, 플라스미드 DNA 정제 키트 (QIAGEN, Valencia, CA, USA)를 이용하여 분리 후, 제한효소 NcoI 과 BamHI으로 절단하였다. 절단된 유전자는 VH 라이브러리와 β-lactamase 유전자를 포함하고 있으며 이는 이후 액상패닝 과정에서 유발될 가능성이 있는 긍정적 오류(false positive)를 배제하기 위해서이다. pET-TAPE 플라스미드도 제한효소 NcoI과 BamHI으로 절단하였다. 절단 후 각 DNA는 젤 적출키트(QIAGEN)으로 정제하였다. 카바니실린 LB 배양액에서 선별된 pET9a-TAPE 라이브러리로부터 수득한 VH 유전자를 pET-TAPE의 NcoI과 BamHI 절단 위치에 삽입하였고 이를 다시 대장균 T7 Express LysY/Iq에 전기 트랜스포메이션 하였다. 이후 액상 패닝은 배양액 상의 카바니실린 농도를 250 ㎍/ml (5X), 500 ㎍/ml (10X)로 높여 가면서 위의 과정을 반복 수행 하였다. 각 과정의 모식도는 도 2에 도시된 바와 같다.
최종적으로 각 카바니실린 농도 별 액상 패닝을 거친 후 앰피실린이 포함된 LB 아가 플레이트에서 단독 콜로니를 50개 골라서 앰피실린이 포함된 액상 배지에 배양하였다. 이후, 플라스미드를 회수하여 염기서열을 분석하였다. 선별된 클론의 VH 도메인 특성을 분석하기 위한 배양 방법은 다음과 같다. 대장균 DH5a 과 T7 Express LysY/Iq는 NEB(New England BioLabs, INC., Beverly, MA, US)에서 구입하였다. 대장균은 pET-TAPE 플라스미드 계열을 포함하고 있는 겨우 50 ㎍/ml 농도의 카나마이신이 포함된 LB 배양액에서 배양하였고, pET22b 벡터를 포함하고 있는 경우는 50 ㎍/ml 앰피실린 혹은 카바니실을 첨가하였다. Seed 배양을 위해서 LB 고형배지에서 단일 콜로니 형태로 분리한 클론을 상기한 항생제가 포함된 LB 액상 배양액에 접종한 후 이로부터 37℃, 200rpm 으로 12시간 이상 배양하였다. 단백질 발현을 유도하기 위해서 Seed 배양액의 세포농도가 1:100로 희석되도록 배양 배지에 접종하였다.
(2) 인간생식세포 유래 VH 라이브러리 스크리닝 결과
상기 기술한 바와 같이 만든 인간 면역글로불린 중쇄 가변 도메인 유전자 라이브러리로부터 상기 TAPE 시스템을 이용하여 스크리닝된 자연형 인간 VH 도메인 항체의 아미노산 서열을 도 3에 나타내었으며, 표 1에 스크리닝된 자연형 인간 VH 도메인 항체의 골격, 즉, FR1 내지 FR4의 서열을 기재하였다.
그 결과 최종 3차 액상 패닝에서 분리한 총 154개의 VH 서열 중 반복적으로 나온 동일 서열은 한번만 표시하였을 경우 총 54개의 독특한(unique) 서열을 확보할 수 있었다. 총 154개의 서열 중 96%에 해당하는 148의 서열이 VH3 패밀리 타입으로 판명되었다. VH3 패밀리는 인간 면역글로불린 중쇄 가변 도메인 7개의 패밀리 중 가장 수용성이 상대적으로 높다고 알려져 왔으므로 이는 본 발명의 TAPE 시스템을 이용한 스크리닝이 통계적으로 유의하게 수용성에 기반한 선별능력을 보여줌을 증명해주는 결과이다.
그리고 개별 54개의 서열 중 19개 서열의 프레임 서열이 독특한 것으로 나타났으며 그 중 13가지가 또한 VH3 패밀리 타입으로 분류되었다.
선별된 개별 VH 유전자를 보고유전자인 TEM-1 베타-락타메이즈 없이 단독으로 대장균에서 발현시켰을 때 과연 수용성 발현 수준이 어느 정도 되는지 알아보기 위하여 VH 발현 유도 후 수용성 분획(soluble fraction)과 비수용성 분획(insoluble fraction)을 분리한 후 SDS-PAGE를 통해 각종 대조군 VH 도메인과 비교하여 보았다 (도 4 참조).
해당 유전자를 발현 벡터는 pET-22b(+)에 클로닝하였고 숙주세포로 E. coli NEBT7에 형질전환(transformation)시켜 발현하였다. 골격(scaffold)들의 발현 조건으로는 37℃, 200rpm 조건에서 배양을 한뒤, OD가 0.6~0.8이 되었을 때 1mM IPTG로 유도(induction) 하고 25℃, 180rpm 조건에서 3.5 시간 후 세포를 회수하였다.
단백질의 수용성 및 비수용성 분획 분리는 B-PER Reagent (Thermo scientific)를 이용하였다. 세포를 파쇄 한 뒤, 세포 침지(cell down)를 통하여 수용성 분획(상등액 부분)을 얻을 수 있었으며, 침전물(pellet)을 PBS로 세척한 뒤, 용해 버퍼(solubilization buffer, pH 7.4, 50mM NaH2PO4, 6M UREA, 0.5M NaCl, 4mM DTT)로 재현탁(resuspension) 하여 비수용성 분획을 얻었다. 이들의 발현은 SDS-PAGE를 이용하여 분석하였다.
그 결과 라이브러리에서 선별과정을 거치지 않고 무작위로 선택한 VH 도메인의 경우 (1,2,3) 대부분 단백질 발현유도 후 수용성 분획에 해당 크기의 VH가 거의 없을 알 수 있고, TAPE 선별과정을 거친 VH 도메인의 경우, MG4x4-44, MG4x4-25, MG10-10, MG2x1) 수용성 발현이 확연히 증가되어 있음을 알 수 있다(도 4(b) 참조). 일반적으로 수용성 발현 정도가 뛰어나다고 알려진 VH 도메인 (VH2, VH3, VH6, DP47d, HEL4)과 비교하였을 경우도 TAPE 시스템 선별을 거친 VH의 경우가 상대적으로 수용성 발현 비율이 매우 뛰어남을 알 수 있다.
실시예 4. MG2x1 VH 골격 기반 프레임 변형 합성 라이브러리의 제조
TAPE 방법에 의해 선별된 최적의 자연형 인간 면역글로불린 중쇄 가변 도메인 (VH) 후보군 중 MG2X1 VH 골격을 기반으로 추가적인 용해성과 안정성을 부여하기 위하여, VH의 구조적인 분석에 입각하여 전략적(rational)으로 선택된 특정 7군데의 아미노산 부위에 돌연변이를 도입하는 "프레임 변형 합성 라이브러리"를 구축하였다.
MG2X1 VH 골격에서의 아미노산 돌연변이 위치는 카밧 넘버링(Kabat numbering) 시스템을 기준으로 도 6의 네모 박스(
Figure 112015016356472-pct00003
)로 표시된 부위이다.
구체적으로 TAPE 방법으로 1차 선별한 MG2X1 골격을 기반으로 하여, MG2X1 VH 골격 서열에 돌연변이를 유발하였는데, 구체적으로 돌연변이를 유발하기 위한 연쇄중합반응 전략은 다음과 같다.
전체 유전자 서열을 두 개의 조각으로 나누어 연쇄중합반응을 할 수 있는 프라이머를 제작하였다. 첫 번째 조각의 3' 프라이머와 두 번째 조각의 5' 프라이머에 돌연변이를 유도하는 프라이머를 제작하여 각각의 유전자 조각을 PCR을 통하여 만든 후 (표 5 서열 17 및 18 참조) 두 유전자 조각의 겹침 (overlapping) PCR을 통하여 최종 MG2X1 기반 프레임 변형 합성 라이브러리를 구축하였다 (표 5 서열 18 및 19 참조; 도 5 참조). 증폭된 DNA는 아가로즈 젤에서 분리하였으며 NcoI과 NotI 제한효소를 처리한 후 pET-TAPE 벡터에 삽입하여 pET-TAPE 프레임 변형 중쇄가변도메인 합성 라이브러리를 제작하였다.
실시예 5. TAPE(Tat-associated protein engineering) 시스템을 통한 MG2X1 VH 골격 기반 변형 VH 도메인의 선별
상기 기술한 바와 같이 본 발명의 TAPE 시스템을 이용하여 용해성과 안정성을 향상된 새로운 합성 VH 골격을 선별하였다. TAPE을 수행할 때 락탐계 항생제 카바니실린(Carbenicillin)은 50 ㎍/ml (이하 "1X TAPE"라고 함), 100 ㎍/ml (이하 "2X TAPE"라고 함), 200 ㎍/ml (이하 "4X TAPE"라고 함), 400 ㎍/ml (이하 "8X TAPE"라고 함) 순으로 농도를 높여가며 각 단계를 진행하였다.
1X TAPE을 거친 후 20개의 단독 콜로니의 염기서열을 분석한 결과, TEM-1 β-락타메이즈 유전자만 포함하는 pET-TAPE 라이브러리는 발견되지 않음을 확인함으로써, 궁극적으로 본 발명의 TAPE 시스템에 의하여 위양성(false positive)을 스크리닝 초기 단계에서 배제할 수 있음을 확인하였다. 이후 2X, 4X, 8X TAPE을 진행할 때, NcoI, BamHI 제한효소 반응 후 VH 유전자만 회수하여 다시 TAPE 시스템에 도입하는 방법과, 이러한 클로닝 작업 없이 세포 배양액에서 분리한 pET-TAPE VH 플라즈미드 라이브러리를 그대로 대장균에 형질전환하는 방법을 동시해 수행하였다. 두 가지 방법에서 모두 위양성(false positive) 콜로니는 발견되지 않았다. 최종적으로 8X 액상 패닝을 거친 후 앰피실린이 포함된 LB 고형배지에서 단독 콜로니를 50개 골라서 액상 배양하고 이로부터 플라스미드를 회수하여 아미노산 서열을 분석하였다.
그 결과 7 군데의 변형 위치 중 카밧 순번 부여 시스템을 기준으로 50번 및 58번의 위치가 특정 아미노산으로 편중되어 선택되는 현상을 발견하였다. 구체적으로, 41개 중 16개의 클론에서 50번 알라닌(Alanine)이 트립토판(Tryptophan)으로, 41개 중 24개의 클론에서 58번 타이로신(tyrosine)이 트립토판(Tryptophan)으로 변형된 것을 확인하였다. 나머지 위치의 아미노산들은 특별한 편중현상이 관찰되지 않았다.
표 2. 아미노산 변이된 VH 도메인 항체 골격의 FR1 내지 FR4의 프레임의 아미노산 서열
Figure 112015016356472-pct00004
Figure 112015016356472-pct00005

실시예 6. 스크리닝된 VH 골격 후보군의 분리정제 및 물리화학적 성질 분석
선별해 낸 인간유래의 VH 골격 후보군 (도 3 참조) 과 합성 돌연변이를 통한 VH 골격 후보군 (도 6 참조)의 물리화학적 성질을 규명하기 위하여 세 가지 분석을 실시하였다.
첫 번째는 VH 골격 후보군의 수용성 정도를 확인하기 위하여 대장균에서의 단독발현 시 수용성 발현 비율을 확인하였고 두 번째는 각 골격 후보의 열역학적 안정성을 확인하기 위하여 원편광 이색성 분광 측정법(Circular Dichroism, CD)를 수행하였으며, 세번째로 단독으로 정제한 골격 후보의 단백질의 응집현상회피(aggregation free) 특성을 젤 여과 크로마토그래피(gel filteration chromatography)를 통한 단량체(monomer)의 비율과 장기보존 안정성으로 확인하였다.
(1) 스크리닝된 후보 VH 골격 후보군의 분리 및 정제
선별된 유전자를 대장균 발현 벡터에 옮겨 단독으로 발현하였다. NcoI 제한효소 염기서열을 포함하는 5' 프라이머 (표 6 서열 21)와 XhoI 을 포함하는 3' 프라이머 (표 6 서열 22)를 이용하여, pET-TAPE-VH 후보군 플라스미드를 주형으로 PCR을 수행하였다. VH 후보에 대응하는 DNA 단편을 PCR로 증폭하고, NcoI 과 XhoI 제한효소로 처리한 후, pET22b(+) 플라스미드 벡터의 NcoI과 XhoI 절단 위치에 삽입함으로써 pET22b-VH 플라스미드를 제작하였다. 제작된 플라스미드는 대장균 T7 Express LysY/Iq에 형질전환한 뒤 단일 콜로니를 분리하여 각각 100 ㎍/mL 앰피실린, 20mM MgCl2, 2%(w/v)글루코오스가 포함된 SB 배양액에 접종하였다. 배양액의 흡광도(Optical Density)가 0.6이 되었을 때 1mM IPTG를 첨가하였으며 단백질 발현을 위해 25 에서 4시간 배양하였다. 배양액은 원심분리를 통해 대장균을 회수한 뒤, 인산염 완충 식염수 (Phosphate-buffered Saline, PBS)에 재현탁(resuspension) 하였다. 부유된 대장균은 세포벽 분쇄를 위해 4회 얼리고 녹이는 과정을 거쳤으며, 원심분리를 통해 상등액을 회수하였다. 회수한 상등액에 NaCl을 0.5M이 되도록 첨가하고 5N NaOH를 이용하여 pH를 7.4로 맞춘 후 0.22 ㎛ 필터로 여과하였다. 단백질의 분리는 Ni-NTA 친화 크로마토그래피를 이용하여 수행하였으며, 세척과정은 100 mM 이미다졸(imidazole)에서, 용리과정은 300 mM 이미다졸에서 실시하였다. 정제된 단백질은 인비트로젠에서 구입한 NuPAGE 4-12% Bis-Tris 젤에서 전기영동한 뒤 쿠마시 블루(Coomassie blue) 염색을 통해 분리된 단백질을 확인하였다. 용리된 단백질은 PD-10 탈염(desalting) 컬럼 (GE Healthcare Life Science, Piscataway, NJ, USA)을 통해 인산염완충식염수(PBS)로 완충액 교체를 수행하였다.
표 6. 본 발명에서 사용된 프라이머 서열
Figure 112015016356472-pct00006
여기서, K는 G 또는 T, S는 C 또는 G, R은 A 또는 G, M은 A 또는 C, 그리고 N은 A, T, G 또는 C를 의미함.
(2) 스크리닝된 VH 후보군의 대장균에서 수용성 발현 정도 분석
MG2X1 VH 골격을 기반으로 한 프레임 변형 라이브러리로부터 TAPE을 통하여 1차로 선별한 VH의 대장균에서의 수용성 발현 양상을 확인하기 위하여 상기 실시예 3의 (2)와 같은 방법으로 해당 VH만을 단독으로 발현한 후 수용성 분획과 비수용성 분획을 분리하여 SDS-PAGE로 분석하였다.
그 결과, 인간면역글로불린 중쇄가변도메인 라이브러리에서 분리한 자연형 MG2X1과 비교하여 수용성 발현이 향상된 VH 골격후보들을 얻을 수 있었다. 도 7에 도시된 바와 같이 대부분 선별된 VH는 대장균에서 수용성으로 발현되었다.
특히 MG8-14, MG2-55, MG4-5, MG4-13, 및 MG8-4 골격 후보(도 7에서 화살표 표시)의 수용성 발현이 우수함을 확인할 수 있었고, 수용성 발현이 우수하였던 VH 들은 비수용성 분획에 있어서 VH의 발현비율을 분석한 결과 비수용성 발현 비율이 감소함을 확인할 수 있었다(도 7 참조).
(3) 열역학적 안정성 분석
VH 골격 후보군에 대한 이차원 단백질 구조를 분석을 통한 열역학적 안정성을 규명하기 위하여 TAPE 과정을 거쳐 선별한 후 정제한 VH 골격 후보군에 대하여 원편광 이색성 분광 측정법(Circular Dichroism, CD)으로 Tm(melting temperature ; 전체 수용액상 단백질의 50%가 열변성을 일으키는 온도)을 계산하였다.
폴딩 비율은 가열전 흡광도에 대한 특정 온도에서의 흡광도 비율이다. 온도 변화에 따른 235nm 파장에서 흡광도를 관측하였다. 이로부터 얻은 시그모이드 곡선(sigmoidal curve)으로부터 폴딩 비율(folding faction)이 50%로 줄어드는 시점에서의 온도를 나타낸다.
자연형 인간 면역글로불린 중쇄 가변 도메인 라이브러리와 MG2x1 VH 골격 기반 프레임 변형 합성 라이브러리로부터 선별한 골격 후보를 정제하여 0.2 ~ 0.3 mg/ml 농도로 희석한 후 spectropolarimeter (Jasco J-715 model, Jascoinc, Easton, MD, USA)를 사용하여 CD (Jasco J-715 model, Jascoinc, Easton, MD, USA)를 측정하였다. 25~85℃ 온도 범위에서 1분에 1 씩 올려가면서 235 nm 파장에서 CD 신호를 기록하여 측정하였다.
일반적으로 자연형 인간 면역글로불린 중쇄 가변 도메인(VH)은 단독으로 수용액상에 존재할 경우 대부분 단백질 응집현상이 일어나므로 수용액상의 단백질을 분석하는 CD 분석특성상 측정이 불가능하다.
응집현상이 일어나지 않는 특이한 VH, 예를 들어, MG3-10 (표 7 참조)과 같은 자연형 VH의 경우 일반적으로 CD 분석에 의한 Tm 값은 약 45℃를 나타낸다. 이를 기준으로 비교하였을 때, 인간면역글로불린 중쇄가변도메인 라이브러리로부터 TAPE 시스템을 거쳐서 선별된 자연형 MG4x4-44, MG4x4-25, MG10-10, 및 MG2x1의 경우 Tm 값이 55℃ 에서 60℃ 사이로 측정되어 평균적인 자연형 VH와 비교할 때 약 10℃ 이상 열역학적 안정성이 향상되었음을 확인하였다 (도면 8 및 표 7 참조).
MG2x1 VH 골격 기반 프레임 변형 합성 라이브러리로부터 TAPE 시스템을 거쳐 선별된 VH (예를 들어, MG2-12I, MG2-12L, MG4-13, MG8-4, MG8-14 등)의 Tm의 경우 평균 60℃에서 70℃ 수준으로 측정되어 평균 20℃ 이상 열역학적 안정성이 향상되었음을 확인하였다 (도면 9 및 표 7 참조).
표 7. 인간 면역글로블린 가변 도메인 라이브러리로부터 TAPE을 거쳐 분리한 도메인 항체들의 Tm 값
Figure 112015016356472-pct00007
(4) 스크리닝된 VH 응집(aggregation) 정도 분석
장기보관(long-term incubation)에 따른 후보 VH 프레임의 응집(aggregation)을 측정함으로써 단백질 안정성을 조사하였다. 0.2~0.8 mg/mL의 농도로 정제된 VH 골격 후보군들을 37℃에서 60%의 습도로 보관하였다. 약 20일 동안의 보관 중 일정 간격으로 샘플을 취하여 원심분리를 통해 응집된 단백질을 제거한 후 수용액 상태로 남아있는 단백질의 농도를 측정하고 그 비율을 계산하였다.
또한 NuPAGE 4-12% Bis-Tris 젤에서 전기영동한 뒤 쿠마시 블루(Coomassie blue) 염색을 통해 남아있는 단백질의 품질을 확인하였다. 그 결과 인산염 완충 식염수(PBS)에 녹아져 있는 단백질 대부분이 가속조건(37℃)에서 60일 이상 단백질 응집 없이 안정되게 유지됨을 알 수 있었다. 각각의 데이타 점들은 초기 단백질량을 1로 하였을 때, 수용액 상에서 응집되지 않고 남아있는 단백질량의 비율을 나타낸다(도 10 참조).
실시예 7. 후보 VH 골격에 항원결합력을 주기 위한 CDRH3 길이 별 변형 라이브러리 구축
인간생식세포 유래 VH 라이브러리로부터 TAPE 방법으로 선별된 MG2x1과, 프레임 변형 라이브러리로부터 TAPE으로 선별된 MG8-4와 MG8-14의 골격 구조에 항원결합력의 다양성을 주기 위하여 해당 골격의 CDRH3 부분에 아미노산 길이별 (7개 ~ 13개) CDR3 변형 라이브러리를 구축하였다. 이는 기존의 연구를 통해 인간 VH 도메인의 안정성에 가장 적합하고 표적단백질과의 결합능을 가지고 있는 VH 도메인의 CDR3 길이가 7개에서 13개라는 것에서 유추하였다(Christoper J Bond. et al., J. Mol. Biol. 2005 348: 699-709). 또한, 아미노산을 NNK 뉴클레오티드(nucleotide)로 코딩함으로써, NNN과 NNS보다 정지코돈의 비율을 낮추면서도 20개 모든 아미노산을 코딩할 수 있도록 하였다. 더욱이, R94S NNK 라이브러리는 앞서 서술된 방법에 의해 구조화됨으로서 세린에서 아르기닌으로 치환된 CDR3의 유연성이 강화되었다.
중합효소연쇄반응 오류를 최소화하기 위하여, 프레임 1 내지 프레임 3을 포함하는 주형 DNA 단편을 중합연쇄반응(PCR)으로 구축하였다. 주형으로 MG2x1, MG8-4 및 MG8-14 cDNA에 각각 10 pmolar의 5' 프라이머(표 6의 서열번호 23)와 3' 프라이머(표 6의 서열번호 24), 0.5 U의 I-pfu DNA 중합효소, 각 2.5 mM의 4가지 dNTP, 5 ㎕의 10X 버퍼를 이용하여 DNA를 증폭하였다. PCR은 94 에서 2분 노출 후, 94℃에서 20초, 56℃에서 20초, 72℃에서 25초 노출을 25회 반복하고, 마지막으로 72℃에서 5분간 반응시키는 조건에서 25회 반복 수행하였다
상기한 주형 DNA에 항원결합력의 다양성을 주기 위하여 CDRH3의 길이가 7개에서 13개까지 되도록 하는 조합 CDRH3 라이브러리가 들어간 프라이머(서열번호 25 내지 서열번호 31)를 제작하고 구축된 DNA 단편을 주형으로, 5' 프라이머, 길이별 돌연변이 유발 3' 프라이머(서열번호 25 내지 서열번호 31)를 이용하여 PCR을 통해 "길이별 CDR3 변형 라이브러리"를 구축하였다. PCR은 다음 조건에서 25회 반복 수행하였다:
94℃에서 2분 노출 후, 94℃에서 20초, 56℃에서 20초, 72℃에서 40초 노출을 25회 반복하고, 마지막으로 72℃에서 5분간 반응시켰다. 도 11은 항원결합력의 다양성을 주기 위한 길이별 CDRH3 변형 라이브러리를 구축 모식도를 나타낸다.
실시예 8. 후보 VH 골격에 항원 결합력 다양성을 주기 위한 전략적(rational) CDR 변형 라이브러리 구축
실시예 7과 같은 목적으로 MG2x1 또는 MG8-4 또는 MG8-14 기반 골격 VH에 항원결합력 다양성을 주기 위한 CDR 변형 라이브러리를 구축하였다. 실시예 7에서 CDRH3 길이별 다양성을 준 것과 달리, CDR 길이는 유지한 채 돌연변이를 유발시켰을 시 항원결합력을 갖게 되리라 예상되는 서열만을 전략적(rational)으로 선택하여 해당 유전자에 무작위 돌연변이를 도입하였다. 세 개의 CDR의 길이는 고정한 채, 구조 분석을 통하여 항원과 결합할 수 있는 가능성을 보이는 위치(SDRs : Specific Determining Residues)에만 선택적으로 돌연변이를 유도하였다. 이는 CDR중 최소한의 위치에만 돌연변이를 유도시킴으로써, CDR 변형으로 인한 안정성 변화와 면역원성(immunogenecity) 문제를 최소화 시킬 수 있다는 장점이 있다. SDR과 관련하여, SDS는 SWISS-Model 시스템을 통한 모델링 시스템과 캐노니칼(canonical) 구조의 파악을 통하여 선정하거나, 또는 모델링 데이터와 뉴클레오티드 특성에 따른 예상 결합능을 참조하여 선정하였다.
또한, 아미노산을 항원결합력이 다른 아미노산보다 높다고 알려진 타이로신(tyrosine)과 세린(serine)의 비율을 상대적으로 올린 편중 뉴클레오티드를 도입하여 같은 라이브러리 크기에서도 CDR 결합 가능성이 높은 클론의 비율이 높도록 디자인 하였다(Akiko Koide et al. et al., PNAS 2007 104(16): 6632-6637). 돌연변이 유발 위치는 도 12에 나타내었다. 도 12에 나타낸 바와 같이, CDR1, CDR2 및 CDR3 각각에 돌연변이를 유발시키기 위하여 유전자를 3개의 부분으로 나누어 돌연변이를 도입하였다. 프레임 MG2x1 또는 프레임 MG8-4, MG8-14 cDNA를 주형으로 하여 다음과 같은 방법으로 각각의 조각을 PCR 방법으로 확보하였다.
MG8-4와 MG8-14의 첫 번째 DNA 조각은 5' 프라이머(서열번호 23)와 3' 프라이머(서열번호 39), 두 번째 DNA 조각은 5' 프라이머(서열번호 40)와 3' 프라이머(서열번호 41), 세 번째 DNA 조각은 5' 프라이머(서열번호 42)와 3' 프라이머(서열번호 43)를 사용하여 PCR을 통해 CDR 변형 라이브러리를 합성하였다.
그리고 MG2x1의 첫 번째 DNA 조각은 5' 프라이머(서열번호 23)와 3' 프라이머(서열번호 45), 두 번째 DNA 조각은 5' 프라이머(서열번호 46)와 3' 프라이머(서열번호 47), 세 번째 DNA 조각은 5' 프라이머(서열번호 48)와 3' 프라이머(서열번호 43)를 사용하여 PCR을 통해 CDR 변형 라이브러리를 합성하였다.
DNA 조각의 합성 프라이머는 각각 10 pmolar, 0.5 U의 vent DNA 중합효소, 각 10 mM의 4 가지 dNTP, 5 ㎕의 10X 버퍼를 이용하여 PCR을 수행하였다.
PCR은 94℃에서 2분 노출 후, 94℃에서 15초, 56℃에서 20초, 72℃에서 25초 노출을 25회 반복하고, 마지막으로 72℃에서 5분간 반응시켰다. 상기 반응을 통하여 얻어진 주형 단편 3개와 5' 프라이머(서열번호 23)와 3' 프라이머(서열번호 44)를 이용한 겹침 PCR(Overlapping PCR)을 통해 전체 크기의 전략적 CDR 변형 라이브러리를 완성하였다. PCR은 94℃에서 2분 노출 후, 94℃에서 20초, 56℃에서 20초, 72℃에서 40초 노출을 25회 반복하고, 마지막으로 72℃에서 5분간 반응 조건으로 수행하였다. 도 13은 항원결합력의 다양성을 주기 위한 전략적(rational) CDR 변형 라이브러리 구축 모식도를 나타낸다.
실시예 9. TAPE으로 선별한 VH 골격기반 라이브러리 (CDR3 길이 별 변형 라이브러리 및 전략적 CDR 변형 라이브러리)의 CDR 변형이 단백질 안정성에 미치는 영향 조사
CDR 변형이 VH 골격구조의 안정성에 미치는 영향 확인을 위하여 CDRH3 길이 7~13개의 합성 라이브러리 및 CDRH1, CDRH2 및 CDRH3의 특정 위치에 전략적으로 돌연변이를 도입한 라이브러리에서 무작위로 유전자를 선별하여(각 CDR 변형 라이브러리당 약 8개의 유전자를 선별) 단독 발현 벡터에 클로닝 하였다. 발현 벡터는 pET-22b(+)를 이용하였고 이를 숙주세포인 E.coli DH5a에 형질전환(transformation)하였다. 형질전환된 콜로니(colony)들을 무작위로 선별한 뒤 서열을 분석하여, 정지 코돈(Stop codon) 없이 전체의 유전자를 잘 보존하고 있는 플라스미드를 분리하여 숙주세포인 E.coli NEBT7에 다시 형질전환시켜 해당 유전자의 발현을 유도하였다. 발현 조건으로는 37℃, 200 rpm 조건에서 배양을 한 뒤, OD가 0.6~0.8이 되었을 때 1 mM IPTG로 유도하고 25℃, 180 rpm 조건에서 3.5 시간 후 수확하였다. 단백질의 수용성 및 비수용성 부분의 분리는 실시예 3과 같은 방법으로 수행하였다.
각각의 CDR 변형 라이브러리에서 무작위로 선별한 VH를 단독 발현한 후 수용성 및 비수용성 부분으로 나누어 SDS-PAGE로 분석한 결과 CDRH3의 길이가 7 개인경우 하나의 시료를 제외하고 모두 수용성으로 발현됨을 확인할 수 있었다(도 14(a) 참조).
CDRH3의 길이가 8개인 경우 8개의 시료 중 7개의 시료가 수용성으로 발현됨을 확인하였다(도 14(b) 참조). CDRH3의 길이가 9개인 경우 모든 시료가 수용성으로 발현됨을 확인하였다(도 14(c) 참조). CDRH3의 길이가 10개인 경우 9개의 시료 중 8개가 수용성으로 발현됨을 확인하였다(도 14(d) 참조). CDRH3의 길이가 11개인 경우 9개의 시료 모두 수용성으로 발현됨을 확인하였다(도 14(e) 참조). CDRH3의 길이가 12개인 경우 8개 중 6개의 시료에서 수용성으로 발현됨을 확인하였다(도 14(f) 참조). CDRH3의 길이가 13개인 경우 7개 중 6개의 시료에서 수용성으로 발현됨을 확인하였다(도 14(g) 참조). 전략적 CDR 변형 라이브러리의 경우 모든 시료가 수용성으로 발현됨을 확인하였다. 종합적으로 TAPE 방법으로 선별한 VH 도메인 항체의 프레임을 기반으로 만든 CDR 변형 라이브러리에서 CDR 변형에도 불구하고 전반적으로 수용성 발현이 안정하게 이루어짐을 확인하였다(도 14 및 표 8 참조).
표 8. CDR 변형 도입 이후 VH의 수용성 발현 빈도
Figure 112015016356472-pct00008
실시예 10. TAPE 방법으로 선별된 VH 골격을 갖는 VH 도메인 항체 라이브러리를 이용한 디스플레이 기술 기반 VH 도메인 항체 후보군의 선별
본 발명에서 TAPE 방법으로 선별된 VH 골격을 갖는 VH 도메인 항체 라이브러리를 이용하여 VH 도메인 항체 후보군의 선별하기 위해 사용될 수 있는 디스플레이 기술은 파지 디스플레이(Phage Display), 이스트 디스플레이(Yeast Display), 및 리보솜 디스플레이(Ribosome Display) 등이 바람직하지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
파지 디스플레이란 박테리오파지의 캡시드 단백질에 외래 펩타이드와 단백질을 삽입, 융합시켜 파지 표면에 외래 단백질을 발현되도록 하는 기술이다(Smith et al., Science 1985 228(4705): 1315-1317). 본 발명에서는 고정된 파지의 표면에 발현되는 융합단백질에 목표로 하는 항원을 결합하여 강한 결합력을 지닌 도메인 항체를 선별하였다.
특정 항원에 대한 결합능을 가지는 VH 선별을 위해, 아래 명시된 패닝(Panning) 기법이 사용되었다.(Carlos F. Barbas III et al. Phage Display - A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press);
파지미드 벡터(pComb3X) 안에 클로닝된 VH 라이브러리 클로닝(실시예 7 및 8);
VH 도메인은 파지 단부에서 발현;
목적 단백질과 발현된 VH 도메인을 접촉;
목적 단백질에 우수한 결합능을 가지는 VH 도메인을 선별한다.
파지 단부에 발현된 VH 도메인과 목적 단백질을 접촉시킨 후, 비결합 파지를 씻어내고 VH 도메인-목적 단백질 복합체를 용출시킨다. 결과적으로 발현된 VH 도메인 파지만을 농축하였다.
앞서 기술한 패닝(panning) 과정을 5~6회 반복함으로써, 표적 항원에 강하게 결합하는 VH 도메인 항체를 선별할 수 있다.
본 발명에서는 또한 효모(yeast) 표면 발현벡터에 VH 라이브러리 (실시예 7 및 8)를 클로닝한 후 효모 표면에 VH 도메인을 발현시킨 뒤 표적 단백질과 결합시켜 결합능이 좋은 도메인만을 선별하여 용출하는 이스트 디스플레이(Yeast display) 기법을 사용하였다(Ginger Chao. et al., Nature Protocol 2006 1(2): 755-768). 표적 단백질에 태그(tag)를 부착하거나 바이오틴을 표지시키고, 이를 디스플레이 된 VH 도메인과 반응시킨 후 결합된 단백질을 표적하는 형광단백질과 디스플레이 된 VH 도메인을 표적하는 형광단백질을 각각 표지하였다. FACS(Fluorescence Activated Cell Sorting)를 이용하여 원하는 영역에 나타나는 표지 된 효모-표적단백질 복합체만을 용출시켜 표적 단백질에 특이적인 VH 도메인을 디스플레이 한 효모세포만을 회수하였다.
본 발명에서는 또한 특정 항원에 결합력을 가지는 VH를 선별하기 위하여 선별한 VH 골격을 코딩하는 mRNA에 정지 코돈(termination codon)을 제거하여 in vitro 단백질 합성을 시행하였고, 단백질과 함께 그에 상응하는 mRNA가 같이 연결된 리보솜 복합체를 형성시키는 리보솜 디스플레이(ribosome display) 기법을 사용하였다. (Mingyue H. et al., Nature Protocol 2007 4(3):281-288). 목표 항원에 대한 패닝(panning)을 실시하여 원하는 항체를 갖고 있는 복합체를 선별하였고, 결과적으로 목적하는 복합체를 농축할 수 있었다. 선별된 mRNA는 DNA로 역전사 되어 목표에 도달할 때까지 이 과정을 3~4회 반복하였다. 실시예 7 및 8에 의해 만들어진 항원 결합 라이브러리를 상기 방법에 의하여 스크리닝을 실시하였을 경우 목표 항원에 강하게 결합하고, 안정한 물성 예를 들어, 높은 용해도, 열 안정성 및 장기 보관 안정성을 지닌 VH 도메인 항체를 선별할 수 있었다.
서술한 세 가지 스크리닝 기법에 따라 인간혈청알부민(HSA)와 인간 표피성장 인자 수용체3(HER3)에 높은 친화성을 가지는 VH 도메인을 HSA 또는 HER3를 목표 항원으로 사용하여 선별할 수 있었다. 선별된 VH 도메인들은 대장균에서 VH 골격을 유지하고, 수용성으로 높은 생산성을 보였다.
표 9에 목표 항원 HSA와 HER3에 높은 친화도를 가지는 VH의 아미노산 서열과 친화도를 나타내었다.
표 9. 목표 항원 HSA 와 HER3를 사용하여 CDRH3 길이에 따른 라이브러리로부터 선별된 아미노산 서열 및 친화도.
Figure 112015016356472-pct00009
서열목록 1 내지 48은 본 발명에 사용된 프라이머 서열이다.
서열목록 49는 골격명 MG1X8에 대한 VH 영역의 아미노산 서열이다.
서열목록 50은 골격명 MG2X1에 대한 VH 영역의 아미노산 서열이다.
서열목록 51은 골격명 MG2X1-34에 대한 VH 영역의 아미노산 서열이다.
서열목록 52는 골격명 MG2X2-12에 대한 VH 영역의 아미노산 서열이다.
서열목록 53은 골격명 MG2X2-13에 대한 VH 영역의 아미노산 서열이다.
서열목록 54는 골격명 MG3X1에 대한 VH 영역의 아미노산 서열이다.
서열목록 55는 골격명 MG3X10에 대한 VH 영역의 아미노산 서열이다.
서열목록 56은 골격명 MG4X1-8에 대한 VH 영역의 아미노산 서열이다.
서열목록 57은 골격명 MG4X1-33에 대한 VH 영역의 아미노산 서열이다.
서열목록 58은 골격명 MG4X1-35에 대한 VH 영역의 아미노산 서열이다.
서열목록 59는 골격명 MG4X3-27에 대한 VH 영역의 아미노산 서열이다.
서열목록 60은 골격명 MG4X4-2에 대한 VH 영역의 아미노산 서열이다.
서열목록 61은 골격명 MG4X4-4에 대한 VH 영역의 아미노산 서열이다.
서열목록 62는 골격명 MG4X4-25에 대한 VH 영역의 아미노산 서열이다.
서열목록 63은 골격명 MG4X4-44에 대한 VH 영역의 아미노산 서열이다.
서열목록 64는 골격명 MG4X5-30에 대한 VH 영역의 아미노산 서열이다.
서열목록 65는 골격명 MG4X6-27에 대한 VH 영역의 아미노산 서열이다.
서열목록 66은 골격명 MG4X6-48에 대한 VH 영역의 아미노산 서열이다.
서열목록 67은 골격명 MG4X7-15에 대한 VH 영역의 아미노산 서열이다.
서열목록 68은 골격명 MG4X8-24에 대한 VH 영역의 아미노산 서열이다.
서열목록 69는 골격명 MG0.5X-1에 대한 VH 영역의 아미노산 서열이다.
서열목록 70은 골격명 MG0.5X-3에 대한 VH 영역의 아미노산 서열이다.
서열목록 71은 골격명 MG0.5X-4에 대한 VH 영역의 아미노산 서열이다.
서열목록 72는 골격명 MG0.5X-14에 대한 VH 영역의 아미노산 서열이다.
서열목록 73은 골격명 MG0.75X-4에 대한 VH 영역의 아미노산 서열이다.
서열목록 74는 골격명 MG2X-5에 대한 VH 영역의 아미노산 서열이다.
서열목록 75는 골격명 MG2X-15에 대한 VH 영역의 아미노산 서열이다.
서열목록 76은 골격명 MG4X-5에 대한 VH 영역의 아미노산 서열이다.
서열목록 77은 골격명 MG1-4에 대한 VH 영역의 아미노산 서열이다.
서열목록 78은 골격명 MG1-6에 대한 VH 영역의 아미노산 서열이다.
서열목록 79는 골격명 MG1-7에 대한 VH 영역의 아미노산 서열이다.
서열목록 80은 골격명 MG1-8에 대한 VH 영역의 아미노산 서열이다.
서열목록 81은 골격명 MG1-9에 대한 VH 영역의 아미노산 서열이다.
서열목록 82는 골격명 MG1-10에 대한 VH 영역의 아미노산 서열이다.
서열목록 83은 골격명 MG5-1에 대한 VH 영역의 아미노산 서열이다.
서열목록 84는 골격명 MG5-2에 대한 VH 영역의 아미노산 서열이다.
서열목록 85는 골격명 MG5-4에 대한 VH 영역의 아미노산 서열이다.
서열목록 86은 골격명 MG5-5에 대한 VH 영역의 아미노산 서열이다.
서열목록 87은 골격명 MG5-6에 대한 VH 영역의 아미노산 서열이다.
서열목록 88은 골격명 MG5-7에 대한 VH 영역의 아미노산 서열이다.
서열목록 89는 골격명 MG5-9에 대한 VH 영역의 아미노산 서열이다.
서열목록 90은 골격명 MG10-1에 대한 VH 영역의 아미노산 서열이다.
서열목록 91은 골격명 MG10-2에 대한 VH 영역의 아미노산 서열이다.
서열목록 92는 골격명 MG10-4에 대한 VH 영역의 아미노산 서열이다.
서열목록 93은 골격명 MG10-5에 대한 VH 영역의 아미노산 서열이다.
서열목록 94는 골격명 MG10-6에 대한 VH 영역의 아미노산 서열이다.
서열목록 95는 골격명 MG10-8에 대한 VH 영역의 아미노산 서열이다.
서열목록 96은 골격명 MG10-10에 대한 VH 영역의 아미노산 서열이다.
서열목록 97은 골격명 MG2에 대한 VH 영역의 아미노산 서열이다.
서열목록 98은 골격명 MG5에 대한 VH 영역의 아미노산 서열이다.
서열목록 99는 골격명 MG6에 대한 VH 영역의 아미노산 서열이다.
서열목록 100은 골격명 MG7에 대한 VH 영역의 아미노산 서열이다.
서열목록 101은 골격명 MG10에 대한 VH 영역의 아미노산 서열이다.
서열목록 102는 골격명 MG8-21에 대한 VH 영역의 아미노산 서열이다.
서열목록 103은 골격명 MG2-12L에 대한 VH 영역의 아미노산 서열이다.
서열목록 104는 골격명 MG2-7I에 대한 VH 영역의 아미노산 서열이다.
서열목록 105는 골격명 MG2-9I에 대한 VH 영역의 아미노산 서열이다.
서열목록 106은 골격명 MG2-10I에 대한 VH 영역의 아미노산 서열이다.
서열목록 107은 골격명 MG2-11I에 대한 VH 영역의 아미노산 서열이다.
서열목록 108은 골격명 MG2-12I에 대한 VH 영역의 아미노산 서열이다.
서열목록 109는 골격명 MG2-32에 대한 VH 영역의 아미노산 서열이다.
서열목록 110은 골격명 MG2-34에 대한 VH 영역의 아미노산 서열이다.
서열목록 111은 골격명 MG2-40에 대한 VH 영역의 아미노산 서열이다.
서열목록 112는 골격명 MG2-46에 대한 VH 영역의 아미노산 서열이다.
서열목록 113은 골격명 MG2-47에 대한 VH 영역의 아미노산 서열이다.
서열목록 114는 골격명 MG2-48에 대한 VH 영역의 아미노산 서열이다.
서열목록 115는 골격명 MG2-51에 대한 VH 영역의 아미노산 서열이다.
서열목록 116은 골격명 MG2-53에 대한 VH 영역의 아미노산 서열이다.
서열목록 117은 골격명 MG2-55에 대한 VH 영역의 아미노산 서열이다.
서열목록 118은 골격명 MG2-57에 대한 VH 영역의 아미노산 서열이다.
서열목록 119는 골격명 MG2-58에 대한 VH 영역의 아미노산 서열이다.
서열목록 120은 골격명 MG2-59에 대한 VH 영역의 아미노산 서열이다.
서열목록 121은 골격명 MG2-60에 대한 VH 영역의 아미노산 서열이다.
서열목록 122는 골격명 MG2-64에 대한 VH 영역의 아미노산 서열이다.
서열목록 123은 골격명 MG4-12에 대한 VH 영역의 아미노산 서열이다.
서열목록 124는 골격명 MG4-13에 대한 VH 영역의 아미노산 서열이다.
서열목록 125는 골격명 MG4-17에 대한 VH 영역의 아미노산 서열이다.
서열목록 126은 골격명 MG4-18에 대한 VH 영역의 아미노산 서열이다.
서열목록 127은 골격명 MG4-20에 대한 VH 영역의 아미노산 서열이다.
서열목록 128은 골격명 MG4-28에 대한 VH 영역의 아미노산 서열이다.
서열목록 129는 골격명 MG4-2에 대한 VH 영역의 아미노산 서열이다.
서열목록 130은 골격명 MG4-32에 대한 VH 영역의 아미노산 서열이다.
서열목록 131은 골격명 MG4-33에 대한 VH 영역의 아미노산 서열이다.
서열목록 132는 골격명 MG4-34에 대한 VH 영역의 아미노산 서열이다.
서열목록 133은 골격명 MG4-5에 대한 VH 영역의 아미노산 서열이다.
서열목록 134는 골격명 MG4-6에 대한 VH 영역의 아미노산 서열이다.
서열목록 135는 골격명 MG4-7에 대한 VH 영역의 아미노산 서열이다.
서열목록 136은 골격명 MG8-11에 대한 VH 영역의 아미노산 서열이다.
서열목록 137은 골격명 MG8-12에 대한 VH 영역의 아미노산 서열이다.
서열목록 138은 골격명 MG8-13에 대한 VH 영역의 아미노산 서열이다.
서열목록 139는 골격명 MG8-14에 대한 VH 영역의 아미노산 서열이다.
서열목록 140은 골격명 MG8-4에 대한 VH 영역의 아미노산 서열이다.
서열목록 141은 골격명 MG8-5에 대한 VH 영역의 아미노산 서열이다.
서열목록 142는 골격명 MG8-6에 대한 VH 영역의 아미노산 서열이다.
서열목록 143은 골격명 MG8-8에 대한 VH 영역의 아미노산 서열이다.
<110> MOGAM BIOTECHNOLOGY RESEARCH INSTITUTE <120> SCREENING AND ENGINEERING METHOD OF SUPER-STABLE IMMUNOGLOBULIN VARIABLE DOMAINS AND THEIR USES <160> 143 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1 gccatatgaa caataacgat ctctttcagg catcacgt 38 <210> 2 <211> 59 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 gcggatccat ggtggtgatg gtggtgtgcg gccgctgaag agacggtcac caacgtgcc 59 <210> 3 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 gcgcggccgc acacccagaa acgctggtg 29 <210> 4 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 gcggatcctt accaatgctt aatcagtgag gc 32 <210> 5 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 gcgctagcca ggtkcagctg gtgcag 26 <210> 6 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 gcgctagcca ggtccagctt gtgcag 26 <210> 7 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 7 gcgctagcsa 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<400> 16 gcgcggccgc tgaggagaca gtgac 25 <210> 17 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 17 gcccatggga agtccaactg gttgaatctg gtggcggttt agtt 44 <210> 18 <211> 114 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 18 agttgaaccg ccagagccgg aaatmnntga gacmnnttcm nnacctttgc ctggcgcmnn 60 acgcacccag cccatagcat aagaagaaaa ggtaaagcca cttgcagcac agct 114 <210> 19 <211> 63 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 19 atttccggct ctggcggttc aactnnktac nnkgatagcg ttaaaggtcg tttcacaatc 60 tcc 63 <210> 20 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 20 gcgcggccgc actgctcaca gtaaccaggg taccctg 37 <210> 21 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 21 gcccatggga agtccaactg gttgaatctg gtggc 35 <210> 22 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 22 gcctcgagac tgctcacagt aaccagggta ccct 34 <210> 23 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 23 gcgctagcga agtccaactg gttgaatctg gtggc 35 <210> 24 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 24 actggcgcag taatacactg cggtatc 27 <210> 25 <211> 101 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 25 gcagatcttg aggagacagt gaccagggtt ccctggcccc amnnmnnmnn mnnmnnmnnm 60 nntctggcgc agtaatacac tgcggtatct tcagcacgca g 101 <210> 26 <211> 104 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 26 gcagatcttg aggagacagt gaccagggtt ccctggcccc amnnmnnmnn mnnmnnmnnm 60 nnmnntctgg cgcagtaata cactgcggta tcttcagcac gcag 104 <210> 27 <211> 107 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 27 gcagatcttg aggagacagt gaccagggtt ccctggcccc amnnmnnmnn mnnmnnmnnm 60 nnmnnmnntc tggcgcagta atacactgcg gtatcttcag cacgcag 107 <210> 28 <211> 110 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 28 gcagatcttg aggagacagt gaccagggtt ccctggcccc amnnmnnmnn mnnmnnmnnm 60 nnmnnmnnmn ntctggcgca gtaatacact gcggtatctt cagcacgcag 110 <210> 29 <211> 113 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 29 gcagatcttg aggagacagt gaccagggtt ccctggcccc amnnmnnmnn mnnmnnmnnm 60 nnmnnmnnmn nmnntctggc gcagtaatac actgcggtat cttcagcacg cag 113 <210> 30 <211> 116 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 30 gcagatcttg aggagacagt gaccagggtt ccctggcccc amnnmnnmnn mnnmnnmnnm 60 nnmnnmnnmn nmnnmnntct ggcgcagtaa tacactgcgg tatcttcagc acgcag 116 <210> 31 <211> 119 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 31 gcagatcttg aggagacagt gaccagggtt ccctggcccc amnnmnnmnn mnnmnnmnnm 60 nnmnnmnnmn nmnnmnnmnn tctggcgcag taatacactg cggtatcttc agcacgcag 119 <210> 32 <211> 101 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 32 gcagatcttg aggagacagt gaccagggtt ccctggcccc amnnmnnmnn mnnmnnmnnm 60 nnggaggcgc agtaatacac tgcggtatct tcagcacgca g 101 <210> 33 <211> 104 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 33 gcagatcttg aggagacagt gaccagggtt ccctggcccc amnnmnnmnn mnnmnnmnnm 60 nnmnnggagg cgcagtaata cactgcggta tcttcagcac gcag 104 <210> 34 <211> 107 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 34 gcagatcttg aggagacagt gaccagggtt ccctggcccc amnnmnnmnn mnnmnnmnnm 60 nnmnnmnngg aggcgcagta atacactgcg gtatcttcag cacgcag 107 <210> 35 <211> 110 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 35 gcagatcttg aggagacagt gaccagggtt ccctggcccc amnnmnnmnn mnnmnnmnnm 60 nnmnnmnnmn nggaggcgca gtaatacact gcggtatctt cagcacgcag 110 <210> 36 <211> 113 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 36 gcagatcttg aggagacagt gaccagggtt ccctggcccc amnnmnnmnn mnnmnnmnnm 60 nnmnnmnnmn nmnnggaggc gcagtaatac actgcggtat cttcagcacg cag 113 <210> 37 <211> 116 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 37 gcagatcttg aggagacagt gaccagggtt ccctggcccc amnnmnnmnn mnnmnnmnnm 60 nnmnnmnnmn nmnnmnngga ggcgcagtaa tacactgcgg tatcttcagc acgcag 116 <210> 38 <211> 119 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 38 gcagatcttg aggagacagt gaccagggtt ccctggcccc amnnmnnmnn mnnmnnmnnm 60 nnmnnmnnmn nmnnmnnmnn ggaggcgcag taatacactg cggtatcttc agcacgcag 119 <210> 39 <211> 63 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 39 ctgacgcacc cagcccatag catannnnnn aaannnaaag ccacttgcag cacagcttaa 60 gcg 63 <210> 40 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 40 tatgctatgg gctgggtgcg t 21 <210> 41 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 41 gctatcatcg taccaagttg aaccgccnnn gccggaaatc aatgagac 48 <210> 42 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 42 ggcggttcaa cttggtacga tgatagc 27 <210> 43 <211> 69 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 43 tccctggccc cagtagtcag gagcnnnagt nnncggnnna tgtctggcgc agtaatacac 60 tgcggtatc 69 <210> 44 <211> 53 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 44 gcggatcctg aggagacagt gaccagggtt ccctggcccc agtagtcagg agc 53 <210> 45 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 45 acgcacccaa gacatagcat annnnnnaaa nnnaaagcca cttgcagcac agcttaagcg 60 60 <210> 46 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 46 tatgctatgt cttgggtgcg t 21 <210> 47 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 47 aacgctatca gcgtaataag ttgaaccgcc nnngccggaa atagctgaga c 51 <210> 48 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 48 ggcggttcaa cttattacgc tgatagcgtt 30 <210> 49 <211> 89 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> MG1X8 <400> 49 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Xaa Trp Val 20 25 30 Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Val Trp Val Ser Xaa Arg Phe Thr 35 40 45 Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Phe Leu Gln Met Asn Ser 50 55 60 Leu Arg Asp Glu Asp Thr Ser Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Xaa Trp Gly 65 70 75 80 Gln Gly Ala Leu Val Thr Val Ser Ser 85 <210> 50 <211> 89 <212> PRT <213> Unknown 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Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ser Xaa Trp Gly 65 70 75 80 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 85 <210> 138 <211> 89 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> MG8-13 <400> 138 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Xaa Trp Val 20 25 30 Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Ile Glu Pro Val Ser Xaa Arg Phe Thr 35 40 45 Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser 50 55 60 Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ser Xaa Trp Gly 65 70 75 80 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 85 <210> 139 <211> 89 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> MG8-14 <400> 139 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Xaa Trp Val 20 25 30 Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Pro Glu Trp Val Ser Xaa Arg Phe Thr 35 40 45 Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser 50 55 60 Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ser Xaa Trp Gly 65 70 75 80 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 85 <210> 140 <211> 89 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> MG8-4 <400> 140 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Xaa Trp Val 20 25 30 Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Pro Glu Val Val Ser Xaa Arg Phe Thr 35 40 45 Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser 50 55 60 Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ser Xaa Trp Gly 65 70 75 80 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 85 <210> 141 <211> 89 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> MG8-5 <400> 141 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Xaa Trp Val 20 25 30 Arg Thr Ala Pro Gly Lys Gly Ile Glu Ile Val Ser Xaa Arg Phe Thr 35 40 45 Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser 50 55 60 Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ser Xaa Trp Gly 65 70 75 80 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 85 <210> 142 <211> 89 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> MG8-6 <400> 142 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Xaa Trp Val 20 25 30 Arg Ile Ala Pro Gly Lys Gly Val Glu Ile Val Ser Xaa Arg Phe Thr 35 40 45 Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser 50 55 60 Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ser Xaa Trp Gly 65 70 75 80 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 85 <210> 143 <211> 89 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> MG8-8 <400> 143 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Xaa Trp Val 20 25 30 Arg Ala Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Val Val Ser Xaa Arg Phe Thr 35 40 45 Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser 50 55 60 Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ser Xaa Trp Gly 65 70 75 80 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 85

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  21. 하기 FR1 내지 FR4의 아미노산 서열을 갖는 수용성 VH 도메인 항체 골격.
    (1) FR1 : X0VQLX1X2X3GX4X5X6X7X8PGX9SX10X11X12X13CX14X15X16GX17X18X19
    상기 FR1의 아미노산 서열에 있어서,
    X0은 E 또는 Q이고,
    X1는 V 또는 L이고,
    X2는 E 또는 Q이고,
    X3은 S 또는 A이고,
    X4는 G 또는 A이고,
    X5는 G, M, N, V 또는 E이고,
    X6은 L, V 또는 W이고,
    X7은 V, K, A 또는 I이고,
    X8은 Q, K 또는 H이고,
    X9는 G, T, A, R, E, S 또는 T이고,
    X10은 L, V, R 또는 M이고,
    X11은 R 또는 K이고,
    X12는 L, I 또는 V이고,
    X13은 S, A 또는 T이고,
    X14는 A, E, V, R, I, K, T 또는 S이고,
    X15은 A, G, P, V 또는 T이고,
    X16은 S, F, 또는 Y이고,
    X17은 F, Y, R, G 또는 L이고,
    X18는 T, A, S, N, T, P, I, N, H 또는 A이고,
    X19는 F, L, V 또는 C이다.
    (2) FR2 : WX20RX21X22PGX23GX24X25X26X27X28
    상기 FR2의 아미노산 서열에 있어,
    X20은 V, A 또는 L이고,
    X21은 Q, N, R, I, K, Y, V, M, S, Q, W, F, L, V 또는 C이고,
    X22는 A, G, K, S, V, M 또는 T이고,
    X23는 K, Q, E, R 또는 T이고,
    X24는 L, N, I, P, Y, T, V, W, A, R, M 또는 S이고,
    X25은 V 또는 E이고,
    X26은 W, I, V, P, F, H, M, Y, L, C 또는 R이고,
    X27은 V, M, I 또는 L이고,
    X28은 S, A 또는 G이다.
    (3) FR3 : X29X30X31X32X33X34X35X36X37X38X39X40X41X42X43X44X45X46X47X48X49X50X51DX52X53X54 YX55CX56X57
    상기 FR3의 아미노산 서열에 있어,
    X29는 R, H, Q 또는 T이고,
    X30은 F, V, L 또는 I이고,
    X31은 T, S 또는 I이고,
    X32는 I, L, V, M 또는 R이고,
    X33은 S, T 또는 D이고,
    X34는 R, A, V, N 또는 I이고,
    X35는 D, N 또는 A이고,
    X36은 N, T, D, I, R, K, Y 또는 E이고,
    X37은 A, S, V 또는 T이고,
    X38은 K, R, T, Q, V, E, M, N 또는 I이고,
    X39는 N, R, T, K, S, D 또는 V이고,
    X40은 T, M, S, V, I, Y 또는 A이고,
    X41은 L, V, A 또는 M이고,
    X42는 F, Y, N, D, H 또는 S이고
    X43은 L 또는 M이고,
    X44는 Q, E, H 또는 N이고,
    X45는 M,L, V, I 또는 W이고,
    X46은 N, T, K, D, Y, I 또는 S이고,
    X47은 S 또는 N이고,
    X48은 L 또는 V이고,
    X49는 R, K 또는 T이고
    X50은 D, A, S, P, T, V, I 또는 S이고,
    X51은 E, A, D 또는 S이고,
    X52는 T, N 또는 S이고,
    X53은 S, A 또는 G이고,
    X54는 V, I, L 또는 M이고,
    X55는 Y 또는 F이고,
    X56은 A, G, V 또는 S이고,
    X57은 R, S, K, T, L, N 또는 F이다.
    (4) FR4 : X58GX59GX60 X61VTVSS
    상기 FR4의 아미노산 서열에 있어,
    X58은 W, C, Y, G, S 또는 A이고,
    X59는 Q, R 또는 L이고,
    X60은 A, T, I 또는 V이고,
    X61은 L, M, P, V 또는 T이다.
  22. 제21항에 있어서, 상기 FR1 내지 FR4는 하기 아미노산 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 VH 도메인 항체 골격.
    (1) FR1 : X0VQLX1X2SGGX5X6X7X8PGX9SX10RX12SCX14X15SGX17X18X19
    상기 FR1의 아미노산 서열에서,
    X0은 E 또는 Q이고,
    X1는 V 또는 L이고,
    X2는 E 또는 Q이고,
    X5는 G, N, V 또는 E이고,
    X6은 L 또는 V이고,
    X7은 V 또는 K이고,
    X8은 Q, K 또는 H이고,
    X9는 G, T, A, R, E 또는 T이고,
    X10은 L 또는 V이고,
    X12는 L 또는 V이고,
    X14는 A, E, V, I, K 또는 S이고,
    X15은 A, G 또는 V 이고,
    X17은 F, Y, R, G 또는 L이고,
    X18는 T, A, S, N, T, P, I, N, H 또는 A이고,
    X19는 F, L, V 또는 C이다.
    (2) FR2 : WVRX21X22 PGX23GX24X25X26X27X28
    상기 FR2의 아미노산 서열에서,
    X21은 Q, N, R, I, K, Y, V, M, S, Q, W, F, L, V 또는 C이고,
    X22는 A, G, K, S 또는 M이고,
    X23는 K, Q, E, R 또는 T이고,
    X24는 L, N, I, P, Y, T, V, W, A, R, M 또는 S이고,
    X25은 V 또는 E이고,
    X26은 W, I, V, P, F, H, M, Y, L, C 또는 R이고,
    X27은 V, M, I 또는 L이고,
    X28은 S, A 또는 G이다.
    (3) FR3 : RX30TX32SX34DX36X37X38X39X40X41X42X43X44X45X46X47X48X49X50X51DTAX54YX55CX56X57
    상기 FR3의 아미노산 서열에서,
    X30은 F, V, L 또는 I이고,
    X32는 I, L, V 또는 M 이고,
    X34는 R, A, V 또는 I이고,
    X36은 N, T, D, I, R, K, Y 또는 E이고,
    X37은 A, S, V 또는 T이고,
    X38은 K, R, T, Q, V, E, M, N 또는 I이고,
    X39는 N, R, T, K, S, D 또는 V이고,
    X40은 T, M, S, V, I, Y 또는 A이고,
    X41은 L, V, A 또는 M이고,
    X42는 F, Y, N, D, H 또는 S이고,
    X43은 L 또는 M이고,
    X44는 Q, E, H 또는 N이고,
    X45는 M,L, V, I 또는 W이고,
    X46은 N, T, K, D, Y, I 또는 S이고,
    X47은 S 또는 N이고,
    X48은 L 또는 V이고,
    X49는 R, K 또는 T이고
    X50은 D, A, S, P, T, V, I 또는 S이고,
    X51은 E, A, D 또는 S이고,
    X54는 V, I, L 또는 M이고,
    X55는 Y 또는 F이고,
    X56은 A,G,V 또는 S이고,
    X57은 R,S,K,T, L, N 또는 F이다.
    (4) FR4 : X58GQGX60 X61VTVSS
    상기 FR4의 아미노산 서열에서,
    X58은 W, C, Y, G, S 또는 A이고,
    X60은 A, T, I 또는 V이고,
    X61은 L, M, V 또는 T이다.
  23. 제21항에 있어서, 하기 FR1 내지 FR4의 아미노산 서열을 가지는 골격 중에서 선택된 것을 특징으로 하는 VH 도메인 항체 골격.
    Figure 112015016356472-pct00010
    Figure 112015016356472-pct00011

    Figure 112015016356472-pct00012
    Figure 112015016356472-pct00013
    Figure 112015016356472-pct00014

    Figure 112015016356472-pct00015
  24. 제21항에 있어서, 하기 FR1 내지 FR4의 아미노산 서열을 가지는 골격 중에서 선택된 것을 특징으로 하는 VH 도메인 항체 골격.
    Figure 112015016356472-pct00016

    Figure 112015016356472-pct00017

    Figure 112015016356472-pct00018
    Figure 112015016356472-pct00019
  25. 제21항에 있어서, 상기 골격은 서열번호 50, 102, 136 내지 143로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 VH 도메인 항체 골격.
  26. 제21항 내지 제25항 중 어느 한 항에 따른 VH 도메인 항체 골격을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드.
  27. 제21항 내지 제25항 중 어느 한 항에 따른 VH 도메인 항체 골격을 가지는 VH 도메인 항체.
  28. 제27항에 따른 VH 도메인 항체를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드.
  29. 제21항 내지 제25항 중 어느 한 항에 따른 VH 도메인 항체 골격에 인간 유래 무작위(random) CDRH1, CDRH2 및 CDRH3이 삽입된 VH 도메인 항체 라이브러리.
  30. 제29항에 있어서, 삽입된 CDRH3의 아미노산 잔기는 5~15개임을 특징으로 하는 VH 도메인 항체 라이브러리.
  31. 제29항에 있어서, 삽입된 CDRH3의 아미노산 잔기는 7~13개임을 특징으로 하는 VH 도메인 항체 라이브러리.
  32. 삭제
  33. 삭제
  34. 제29항에 있어서, 상기 라이브러리는 미감작(naive), 합성 또는 면역 라이브러리인 것을 특징으로 하는 VH 도메인 항체 라이브러리.
  35. 제29항에 따른 라이브러리를 이용하여, 목적하는 항원에 대한 결합능을 가지는 VH 도메인 항체의 선별 방법.
  36. 제35항에 있어서, 상기 목적하는 항원에 대한 결합능을 가지는 VH 도메인 항체의 선별은, 고정된 목적 항원에 결합된 VH 도메인 항체를 제외하고, 고정된 목적 항원에 결합하지 않는 VH 도메인 항체를 용출(elution)시켜 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  37. 제35항에 있어서, 상기 목적하는 항원에 결합하지 않는 VH 도메인 항체의 용출은 2회 이상 반복되는 것을 특징으로 하는 방법.
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Families Citing this family (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106986934B (zh) * 2012-08-22 2021-09-14 财团法人牧岩生命工学研究所 超稳定免疫球蛋白可变结构域的筛选和改造方法及其应用
EP3816625A1 (en) 2013-05-06 2021-05-05 Scholar Rock, Inc. Compositions and methods for growth factor modulation
GB201419899D0 (en) * 2014-11-07 2014-12-24 Univ Kent Canterbury Biopharmaceutical production method
EP4183806A3 (en) 2014-11-12 2023-08-02 Seagen Inc. Glycan-interacting compounds and methods of use
US9879087B2 (en) 2014-11-12 2018-01-30 Siamab Therapeutics, Inc. Glycan-interacting compounds and methods of use
KR101692629B1 (ko) * 2015-07-14 2017-01-03 계명대학교 산학협력단 매시브 플래카드 제어 장치 및 그 방법
IL302822A (en) 2015-11-12 2023-07-01 Seagen Inc Compounds interacting with glycans and methods of use
US10845367B2 (en) * 2016-05-04 2020-11-24 Abilita Bio, Inc. Modified multispanning membrane polypeptides and methods of use thereof to screen therapeutic agents
EP3541847A4 (en) 2016-11-17 2020-07-08 Seattle Genetics, Inc. COMPOUNDS INTERACTING WITH GLYCANE AND METHODS OF USE
KR102653141B1 (ko) 2017-03-03 2024-04-01 씨젠 인크. 글리칸-상호작용 화합물 및 사용 방법
EP3459968A1 (en) * 2017-09-20 2019-03-27 Numab Innovation AG Novel stable antibody variable domain framework combinations
CA3076972C (en) * 2017-09-29 2023-09-26 Mogam Institute For Biomedical Research Anti-bcma antibody having high affinity for bcma and pharmaceutical composition for treatment of cancer, comprising same
KR102115300B1 (ko) * 2018-06-01 2020-05-26 재단법인 목암생명과학연구소 항체 라이브러리 및 이를 이용한 항체 스크리닝 방법
CN108893487A (zh) * 2018-07-19 2018-11-27 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所 一种含有C-Myc蛋白融合标签的植物表达质粒载体及其载体的构建方法
EP3898658A1 (en) * 2018-12-21 2021-10-27 Vib Vzw Fusion protein with a toxin and scaffold protein

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2007016591A2 (en) * 2005-08-01 2007-02-08 Cornell Research Foundation, Inc. Compositions and methods for monitoring and altering protein folding and solubility

Family Cites Families (22)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR960007784B1 (ko) 1993-07-02 1996-06-12 포항종합제철 주식회사 일산화탄소(co)가스 센서 및 그 제조방법
IL127127A0 (en) 1998-11-18 1999-09-22 Peptor Ltd Small functional units of antibody heavy chain variable regions
WO2000034308A2 (en) 1998-12-10 2000-06-15 Washington University Protein transduction system and methods of use thereof
EP1214352A2 (en) 1999-09-07 2002-06-19 Viventia Biotech Inc. Enhanced phage display libraries of human vh fragments and methods for producing same
CA2447832C (en) 2000-12-22 2012-09-25 Jamshid Tanha Phage display libraries of human vh fragments
JP2005289809A (ja) * 2001-10-24 2005-10-20 Vlaams Interuniversitair Inst Voor Biotechnologie Vzw (Vib Vzw) 突然変異重鎖抗体
HUE048922T2 (hu) * 2002-05-22 2020-09-28 Novartis Ag Immunglobulin vázrégiók, amelyek intracelluláris környezetben fokozott stabilitást mutatnak, továbbá eljárások azonosításukra
GB0226729D0 (en) 2002-11-15 2002-12-24 Medical Res Council Intracellular antibodies
CN101412759A (zh) * 2003-01-10 2009-04-22 埃博灵克斯股份有限公司 治疗性多肽,其同源物、其片段及其在调节血小板介导的聚集方面的应用
CA2531482A1 (en) 2003-06-30 2005-01-20 Centocor, Inc. Engineered anti-target immunoglobulin derived proteins, compositions, methods and uses
UA89481C2 (uk) 2003-09-30 2010-02-10 Центокор, Инк. Еритропоетинові міметичні шарнірно-серцевинні міметитіла людини, композиції, способи та застосування
WO2005097184A2 (en) * 2004-03-26 2005-10-20 Human Genome Sciences, Inc. Antibodies against nogo receptor
SI3530673T1 (sl) 2004-09-03 2022-08-31 Genentech, Inc. Humanizirani antagonisti proti beta7 in njihove uporabe
EP2360473A1 (en) * 2005-08-22 2011-08-24 Cornell Research Foundation Compositions and methods for analyzing protein interactions
EA200801515A1 (ru) 2006-01-24 2009-02-27 Домантис Лимитед Лиганды, которые связывают il-4 и/или il-13
CA2637881A1 (en) * 2006-01-31 2007-08-09 Republic Of Korea (Republic Of National Fisheries Research And Developme Nt Institute) Production of a soluble native form of recombinant protein by the signal sequence and secretional enhancer
AU2007249408A1 (en) 2006-05-09 2007-11-22 Genentech, Inc. Binding polypeptides with optimized scaffolds
CN101720368A (zh) * 2007-03-09 2010-06-02 中国抗体制药有限公司 储备多样性最大化的功能性人化抗体文库之构建及应用
US20100285567A1 (en) * 2007-06-18 2010-11-11 Kai Bao Tat signal peptides for producing proteins in prokaryotes
EP2238165B1 (en) * 2008-01-07 2017-07-05 Government of the United States of America, as represented by the Secretary, Department of Health and Human Services Anti-hiv domain antibodies and method of making and using same
ES2746559T3 (es) 2011-01-28 2020-03-06 Nat Res Council Canada Modificación genética de dominios de inmunoglobulina
CN106986934B (zh) * 2012-08-22 2021-09-14 财团法人牧岩生命工学研究所 超稳定免疫球蛋白可变结构域的筛选和改造方法及其应用

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2007016591A2 (en) * 2005-08-01 2007-02-08 Cornell Research Foundation, Inc. Compositions and methods for monitoring and altering protein folding and solubility

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