KR100906789B1 - Monoclonal specific to human neural precursor cell and its use - Google Patents

Abstract

본 발명은 인간 신경전구체세포를 특이적으로 인식하는 단일클론항체 및 이를 분비하는 하이브리도마에 관한 것이다. 상기 단일클론항체는 신경전구체세포의 neutral glycolipid를 특이적으로 인식하는 항체로, 인간 신경전구체세포 및 줄기세포에서 유래한 인간 신경전구체 분리에 효과적으로 사용할 수 있다.The present invention relates to monoclonal antibodies that specifically recognize human neuroprogenitor cells and hybridomas that secrete them. The monoclonal antibody is an antibody that specifically recognizes the neutral glycolipid of neural precursor cells, and can be effectively used for separation of human neural precursors derived from human neural precursor cells and stem cells.

신경전구체세포, 단일클론항체, 52-A11 Neuroprogenitor Cells, Monoclonal Antibodies, 52-A11

Description

인간 신경전구체세포에 대한 단일클론항체 및 그의 이용{Monoclonal specific to human neural precursor cell and its use} Monoclonal antibody to human neural precursor cells and its use {monoclonal specific to human neural precursor cell and its use}

도 1은 Zhang 방법(Zhang et al., Nat. Biotechnol., 19: 1129 - 1133, 2001)을 이용하여 배양한 인간 신경전구체 세포 Miz-hES1에 대한 생쥐 단일 클론항체 제조에 대한 모식도이고, 1 is a schematic diagram of the preparation of a mouse monoclonal antibody against human neural precursor cell Miz-hES1 cultured using Zhang method (Zhang et al., Nat. Biotechnol., 19: 1129-1133, 2001),

도 2는 다양한 신경세포와 배아줄기세포 및 신경전구체세포에 대한 단일클론항체 52-A11의 결합력을 유세포 분석기로 분석한 것이고,2 is a flow cytometry analysis of the binding capacity of monoclonal antibody 52-A11 to a variety of neurons and embryonic stem cells and neural precursor cells,

도 3은 다양한 형태의 신경전구체세포에 대한 단일클론항체 52-A11의 결합력을 면역세포화학적 방법으로 관찰한 것이고, 3 shows the binding of monoclonal antibody 52-A11 to neuronal precursor cells of various forms by immunocytochemical method.

도 4는 다양한 신경세포와 배아줄기세포 및 신경전구체세포에 대한 단일클론항체 52-A11의 결합력을 면역세포화학적 방법으로 관찰한 것이고, Figure 4 is an observation of the binding capacity of monoclonal antibody 52-A11 to various neurons and embryonic stem cells and neuroprogenitor cells by immunocytochemical method,

도 5는 또 다른 인간배아줄기세포인 HSF6에서 유도된 미분화 신경전구체세포 에 대한 네스틴, TuJ1, 52-A11의 발현도를 면역세포화학적 방법으로 관찰한 것이고,Figure 5 is an expression of nestin, TuJ1, 52-A11 expression in undifferentiated neuroprogenitor cells derived from another human embryonic stem HSF6 by immunocytochemical method,

도 6는 Glioblastoma 세포주 A172에서 분리한 glycolipid에 대한 단일클론항체 52-A11의 의 결합력 관찰한 것으로, glycolipid는 acidic glycolipid와 neutral glycolipid로 나누어 thin layer chromatography로 전개한 뒤 Orcinol/H₂SO₄ 로 염색하거나, 단일클론항체 52-A11으로 면역염색을 실시하였다. FIG. 6 shows the binding of monoclonal antibody 52-A11 to glycolipid isolated from Glioblastoma cell line A172. The glycolipid was divided into acidic glycolipid and neutral glycolipid and developed by thin layer chromatography, or stained with Orcinol / H ₂ SO ₄ . Immunostaining was performed with monoclonal antibody 52-A11.

본 발명은 인간 신경전구체세포를 특이적으로 인식하는 단일클론항체 및 이를 분비하는 하이브리도마에 관한 것이다. The present invention relates to monoclonal antibodies that specifically recognize human neuroprogenitor cells and hybridomas that secrete them.

줄기세포(stem cell)는 생물의 조직을 구성하는 다양한 세포들로 분화할 수 있는 세포로서 배아, 태아 및 성체의 각 조직에서 얻을 수 있는 분화(differentiation)되기 전 단계의 미분화 세포들을 총칭한다. 줄기세포는 분화 자극(환경)에 의하여 특정 세포로 분화가 진행되며, 세포분열이 정지된 분화된 세포와는 달리 세포분열에 의해 자신과 동일한 세포를 생산(self-renewal)할 수 있어 증식(proliferation; expansion)하는 특성이 있으며, 다른 환경 또는 다른 분화 자 극에 의해 다른 세포로도 분화될 수 있어 분화에 유연성(plasticity)을 가지고 있는 것이 특징이다.Stem cells are cells capable of differentiating into the various cells constituting the tissues of living organisms, which collectively refer to the undifferentiated cells of different stages that can be obtained in each tissue of the embryo, fetus and adult. Stem cells are differentiated into specific cells by differentiation stimulation (environment), and unlike differentiated cells in which cell division is stopped, they can proliferate because they can produce the same cells as themselves by cell division. It is characterized by the fact that it is able to differentiate into other cells by different environment or different stimulation, and has plasticity in differentiation.

줄기세포는 크게 배아(embryo)에서 얻어지고 모든 세포로 분화될 수 있는 잠재력(totipotent)을 지닌 전분화능(pluripotency)의 배아줄기세포(embryonic stem cell, ES cell)와 각 조직에서 얻어지는 다분화능(multipotency)의 성체줄기세포(adult stem cell)로 구분된다. 배아발생 초기인 포배기(blastocyte)의 세포내괴(inner cell mass)는 장차 태아를 형성할 부분으로서, 이 세포 내괴로부터 형성된 배아줄기세포는 이론적으로 한 개체를 구성하는 모든 조직의 세포로 분화될 수 있는 잠재력을 지닌 줄기세포이다. 즉, 배아줄기세포는 무제한적으로 증식이 가능한 미분화 세포이고, 모든 세포로 분화할 수 있으며 성체줄기세포와 달리 배(germ) 세포도 만들 수 있어 다음세대로 유전될 수 있다. 이에 반하여, 태아 발생과정이 진행되어 각 장기가 형성되는 과정에 도입되면 각각의 장기에는 그 장기에 특이한 줄기세포(tissue specific stem cells; primary stem cells)가 존재하여 각 장기를 형성하는 분화 과정에 참여하게 된다. 이와 같이 조직 특이적 줄기세포는 일반적으로 분화할 수 있는 그 분화능력이 그 조직을 구성하는 세포로만 한정되게 되며(multipotent or unipotent), 성인이 된 후에도 대부분의 장기에는 각 장기에 특이한 줄기세포가 남아 있게 되어 정상적 또는 병리적으로 발생하는 세포의 손실을 보충하게 된다. Stem cells are largely derived from embryos and have a potential to differentiate into all cells, pluripotency embryonic stem cells (ES cells) and multipotency from each tissue. ) Into adult stem cells. The inner cell mass of the blastocyte, the earliest embryonic development, is the part that will form the fetus in the future. Embryonic stem cells formed from this cell mass can theoretically differentiate into cells of all tissues that make up an individual. It is a stem cell with potential. That is, embryonic stem cells are undifferentiated cells capable of unlimited proliferation, can differentiate into all cells, and, unlike adult stem cells, can make germ cells and can be inherited to the next generation. In contrast, when fetal development proceeds and is introduced into the formation of each organ, each organ has a tissue specific stem cell (primary stem cells) to participate in the differentiation process forming each organ. Done. As described above, tissue-specific stem cells generally have differentiation ability to differentiate only to cells constituting the tissue (multipotent or unipotent), and even after adulthood, most organs retain specific stem cells in each organ. To compensate for the loss of normal or pathological cells.

인간 배아줄기세포는 인간 배아(blastocyst) 형성시 세포내괴(inner cell mass)만을 분리하여 배양함으로써 제조되는데, 현재 전 세계적으로 만들어진 인간 배아줄기세포는 불임시술 뒤 남은 냉동배아로부터 얻어졌다. 이 세포의 특징은 모든 세포로 분화가능한 잠재력(totipotent)을 갖고 있어, 어떠한 조직 세포로도 분화될 수 있으며, 또한 사멸하지 않고(immortal) 미분화 상태에서 배양가능하며 배 세포(germ cell)의 제조도 가능하므로 다음세대로 유전될 수 있는 특징을 가지고 있다(Thomson et al., Science, 282: 1145-1147, 1998; Reubinoff et al., Nat . Biotechnol., 18: 399-404, 2000). 배아줄기세포의 배양은, 1981년 처음으로 생쥐의 배아줄기세포 배양법이 확립된 후(Evans et al., Nature, 292: 151-156, 1981), 1996년 영장류에서의 전분화능 배아줄기세포 배양법(Thomson et al., Biol . Reprod., 55: 254-259, 1996)이 개발되었고, 1998년 미국의 톰슨(Thomson) 등에 의해 인간 배아줄기세포 배양법이 확립되었다(Thomson et al., Science, 282: 1145-1147, 1998). 생쥐 배아줄기세포 연구에 비해 인간 배아줄기세포 연구는 아주 짧은 역사를 지니고 있지만, 인간 배아줄기세포 연구를 통해 인간의 난치성 질병을 치유하거나 인간의 초기발생 기전을 밝힐 수 있으므로, 현재 그 연구가 활발히 진행되고 있다.Human embryonic stem cells are prepared by separating and culturing only inner cell mass when forming human blastocysts. Currently, human embryonic stem cells made worldwide are obtained from frozen embryos remaining after infertility. This cell is characterized by its ability to differentiate into all cells, so that it can differentiate into any tissue cell, and can also be cultured in immortal and undifferentiated state and also to prepare germ cells. It is possible to inherit the next generation (Thomson et al.) al ., Science , 282: 1145-1147, 1998; Reubinoff et al ., Nat . Biotechnol ., 18: 399-404, 2000). Embryonic stem cells were cultured after the first embryonic stem cell culture was established in 1981 (Evans et al. al ., Nature , 292: 151-156, 1981), 1996. Differentiation of pluripotent embryonic stem cells in primates (Thomson et al. al ., Biol . Reprod ., 55: 254-259, 1996) and human embryonic stem cell culture method was established in 1998 by Thomson et al. (Thomson et al. al ., Science , 282: 1145-1147, 1998). Human embryonic stem cell research has a very short history compared to mouse embryonic stem cell research, but research on human embryonic stem cells can cure human refractory diseases or reveal the early mechanism of human development. It is becoming.

파킨슨병(Parkinson's disease), 알쯔하이머병, 탈수초질환(demyelinating disease), 루게릭병(amyotro- phic lateral sclerosis) 및 척추손상에 의한 사지마비 등의 뇌신경 퇴행성 질환은 뇌신경조직에 특정 신경세포의 영구적 손실 및 기능장애에 의해 초래되며 뇌신경조직은 손상 시 스스로의 재건이 상당히 제한되어 있으므로 현재까지 이들 질환에 대한 근본적인 치료법이 없는 실정이다. 뇌 신경조직이 신경세포 간의 시냅스에 의한 회로에 의해 그 기능을 담당하고 있다는 점을 고려할 때, 손상된 뇌조직의 재건을 위해서는 신경줄기세포로부터 신경세포의 분화 유도, 분화된 신경세포로부터 표적물로 축색의 연장 및 새로운 기능적 시냅스 형성이 도모되어야 한다. 아직까지 이들 각 단계가 어떤 기전에 의한 것인지 알려지지 않았는데 이는 적절한 실험 시스템이 구축되지 않았기 때문이다.Cerebral neurodegenerative diseases, such as Parkinson's disease, Alzheimer's disease, demyelinating disease, amyotro- phic lateral sclerosis, and limb paralysis due to spinal injury, are associated with permanent loss of certain nerve cells and It is caused by dysfunction, and since brain nerve tissues are quite limited in their reconstruction when damaged, there is no fundamental treatment for these diseases. Considering that brain nerve tissue is responsible for its function by the synaptic circuit between nerve cells, in order to reconstruct damaged brain tissue, it is necessary to induce differentiation of nerve cells from neural stem cells, and to target axons from differentiated nerve cells to targets. Extension and new functional synapse formation should be promoted. It is not yet known what mechanism each of these steps is due to because no appropriate experimental system has been established.

초기 신경 배양물(primary neuronal culture)이나 암 유전자를 도입한 신경세포주는 이미 분화가 끝났거나 암 세포주라는 이유로 그 이용에 한계가 있으나 신경줄기세포는 시험관 내(in vitro)에서 미토겐(mitogen)에 의해 증식을 유도할 수 있고, 여러 가지 방법으로 분화도 유도할 수 있으므로 이를 이용한 연구는 다양한 뇌질환 치료에 응용할 수 있을 것이다(Rosaria, et al., J. Neurochem. 89, 286-306, 2004). Although neuronal cell lines that have introduced primary neuronal cultures or cancer genes have limited use because they are already differentiated or are cancer cell lines, neural stem cells are induced by mitogen in vitro. Proliferation can be induced and differentiation can be induced in a number of ways, so the research using it may be applied to various brain diseases (Rosaria, et al., J. Neurochem. 89, 286-306, 2004).

한편, 인간 신경줄기세포는 태아나 성인조직에서 얻을 수 있으나 이는 윤리적인 문제가 따르며, 많은 환자들에게 필요한 만큼의 충분한 양을 얻을 수 없다. 중뇌(midbrain)의 흑질(substantia nigra)에 위치한 도파민성 신경세포(dopaminergic neuron)가 점차적으로 죽거나 손상되면서 야기되는 퇴행성 뇌신경질환인 파킨슨병이 태아의 중뇌조직 이식으로 뚜렷한 호전을 보였으나, 환자 한 사람당 발생 6 내지 10주된 낙태아 6 내지 10명 정도의 뇌 조직에서 분리한 전구세포가 필요하는 등의 실질적인 어려움이 있다(Kordower et al., J. Comp. Neurobiol ., 370: 203-230, 1996). 배아줄기세포로부터 다수의 도파민성 신경세포의 전구세포(dopaminergic neuronal precursor cells)를 배양해 낼 수 있다면 윤리적 문제도 피할 수 있고, 무제한적으로 유도해 낼 수 있음으로 그 치유의 길은 아주 밝은 편 이다. 실제로 생쥐 배아줄기세포 연구에서 밝혀진 결과에 의하면, 줄기세포로부터 얻어진 동일한 네스틴(Nestin)-양성의 줄기세포는 적당한 분화조건에 따라 신경세포세포로 분화될 수 있으며, 질환동물모델 생쥐에다 이식하였을 때 그 병세가 호전될 수 있는 것으로 보고 된 바 있다(Kim et al., Nature , 418: 50-56, 2002; Lee et al., Nature Biotechnol. 18: 675-679, 2000). 이러한 연구결과는 인간 배아줄기세포에서 얻어진 네스틴-양성 세포로부터 기능성 신경세포를 배양해 낼 수 있음을 시사해 주었다. 실제로 인간 배아줄기세포에서 신경 전구세포를 유도하여 다양한 기능성 신경세포로 분화시킬 수 있음이 보고 되었다(Zhang et al., Nat . Biotechnol ., 19: 1129 - 1133, 2001; Reubinoff et al., Nat. Biotechnol ., 19: 1134 - 1140, 2001).Human neural stem cells, on the other hand, can be obtained from fetuses or adult tissues, but this is accompanied by ethical problems, and many patients cannot obtain sufficient amounts as needed. Parkinson's disease, a degenerative brain neuropathy caused by the gradual death or damage of dopaminergic neurons located in the substantia nigra of the midbrain, has shown a marked improvement in fetal midbrain tissue transplantation. There are practical difficulties, such as the need for progenitor cells isolated from the brain tissues of about 6 to 10 abortions 6 to 10 weeks of development (Kordower et al ., J. Comp. Neurobiol ., 370: 203-230, 1996). . If you can cultivate dopaminergic neuronal precursor cells from embryonic stem cells, you can avoid ethical problems and induce them indefinitely. In fact, mouse embryonic stem cell studies show that the same Nestin-positive stem cells obtained from stem cells can be differentiated into neuronal cells under appropriate differentiation conditions, and when transplanted into diseased animal models of mice. The condition has been reported to improve (Kim et. al ., Nature , 418: 50-56, 2002; Lee et al., Nature Biotechnol. 18: 675-679, 2000). These findings suggest that functional neurons can be cultured from nestin-positive cells obtained from human embryonic stem cells. Indeed, it has been reported that human embryonic stem cells can induce neural progenitor cells to differentiate into various functional neurons (Zhang et al. al ., Nat . Biotechnol ., 19: 1129-1133, 2001; Reubinoff et al ., Nat. Biotechnol ., 19: 1134-1140, 2001).

뇌질환 세포 치료법에서 배아줄기세포를 이용하여 신경줄기세포로의 분화 유도가 이루어지면 그 다음 중요한 것은 다량의 신경 줄기세포만을 순수 분리해 내 직접 사용하거나 다음 단계의 기능성 신경세포로 분화를 유도하는 것이다. 현재까지 인간 신경줄기세포를 동정하기 위한 마커들은 대부분 세포내 존재하는 것으로 중간적 필라멘트인(intermediate filament) 네스틴(Nestin)(Lendhal, et al., Cell 60:585-595, 1990), Vimentin(Kilpatrick et al., Neuron 10:255-265, 1993), A2B5(Mujtaba, et al., Dev. Biol. 214:113-127, 1999), RNA 결합 단백질 Musashi-1(Good, et al Genomics 2:382-384, 1998)등이 있으며, 세포표면에 존재하는 마커로는 PSA-NCAM(polysialylated neuronal cell adhesion molecule)과 CD133(Uchida, et al., PNAS 97:14720-14725, 2000)이 있다. PSA-NCAM 항체는 메닝고코커스 그룹 B(Meningococcus Group B) 다당류에 대해 만들어진 단일클론항체로서, 생쥐의 배아 또는 성체에서 약 180kD 당단백질인 NCAM의 폴리시알로실(polysialosyl) 단위를 인식하며, 유세포분석기(Flow cytometry)에 이용이 불가능하여 세포분리에는 이용할 수 없다(Rougon, G. et al., J. Cell. Biol. 103, 2429-2437, 1986). CD133 항체는 사람 조혈모세포인 CD34 양성세포에서 발현하는 약 97 kD 단백질을 인식하는 항체로서, CD133은 신경줄기세포에서도 발현이 확인되었다. 그러나, 이들 마커와 이에 대한 항체로는 복잡한 신경전구체의 분화과정을 정확히 규정하기 힘들며, 표면 분자인 CD133을 제외하고는 신경줄기세포를 온전하게 분리하는데 응용할 수 없다. 따라서 신경줄기세포의 연구와 응용 및 분리를 위한 더 많은 세포표면 마커의 개발이 절실하다. In the treatment of brain disease cells, when embryonic stem cells are used to induce differentiation into neural stem cells, the next important step is to purely separate a large number of neural stem cells and use them directly or to induce differentiation into functional neurons of the next stage. To date, most markers for identifying human neural stem cells are intracellular, which is an intermediate filament of nestin (Lendhal, et al., Cell 60: 585-595, 1990), Vimentin (Kilpatrick). et al., Neuron 10: 255-265, 1993), A2B5 (Mujtaba, et al., Dev. Biol. 214: 113-127, 1999), RNA binding protein Musashi-1 (Good, et al Genomics 2: 382 -384, 1998), and surface markers include polysialylated neuronal cell adhesion molecules (PSA-NCAMs) and CD133 (Uchida, et al., PNAS 97: 14720-14725, 2000). PSA-NCAM antibodies are monoclonal antibodies made against Meningococcus Group B polysaccharides that recognize polysialosyl units of NCAM, about 180 kD glycoproteins in embryonic or adult mice, and are flow cytometers. It cannot be used for flow cytometry and cannot be used for cell separation (Rougon, G. et al., J. Cell. Biol. 103, 2429-2437, 1986). The CD133 antibody is an antibody that recognizes about 97 kD protein expressed in CD34 positive cells, which are human hematopoietic stem cells, and CD133 was also expressed in neural stem cells. However, these markers and antibodies against them make it difficult to precisely define the differentiation process of complex neural precursors and cannot be applied to intact separation of neural stem cells except for CD133, a surface molecule. Therefore, the development of more cell surface markers for research, application and isolation of neural stem cells is urgently needed.

이러한 배경 하에서, 본 발명자는 인간 배아줄기세포에서 분화를 유도한 인간 신경전구체세포의 표면 분자를 특이적으로 인식하는 단일클론항체 및 이를 분비하는 하이브리도마 세포를 선별해내고, 상기 하이브리도마로부터 생산되는 항체가 신경전구체세포의 다분화능을 포함한 특성분석 및 줄기세포를 이용한 세포 치료법에 응용하기 위한 신경전구체세포 분리에 사용될 수 있음을 발견하여 본 발명을 완성하였다. Under this background, the present inventors screened monoclonal antibodies that specifically recognize the surface molecules of human neuroprogenitor cells that induced differentiation in human embryonic stem cells and hybridoma cells secreting them, and from the hybridomas. The present invention has been completed by discovering that the produced antibody can be used for the characterization including the multipotency of neural progenitor cells and for the separation of neural progenitor cells for application to cell therapy using stem cells.

본 발명의 목적은 인간 신경전구체세포에 특이적으로 결합하는 단일클론항체를 제공하는 것이다. 특히 상기 항체는 신경전구체세포의 neutral glycolipid를 특 이적으로 인식하는 항체이다.An object of the present invention is to provide a monoclonal antibody that specifically binds to human neuroprogenitor cells. In particular, the antibody is an antibody that specifically recognizes the neutral glycolipid of neural precursor cells.

본 발명의 또 다른 목적은 상기한 단일클론항체를 분비하는 하이브리도마를 제공하는 것이다.Still another object of the present invention is to provide a hybridoma which secretes the monoclonal antibodies described above.

본 발명의 또 다른 목적은 상기한 단일클론항체를 포함하는 인간 신경전구체세포 분리용 조성물을 제공하는 것이다.Still another object of the present invention is to provide a composition for separating human neuroprecursor cells comprising the monoclonal antibody described above.

본 발명의 또 다른 목적은 상기한 단일클론항체를 포함하는 인간 신경전구체세포 검정 키트를 제공하는 것이다.It is another object of the present invention to provide a human neural precursor cell assay kit comprising the monoclonal antibody described above.

하나의 양태로서, 본 발명은 인간 신경전구체세포에 특이적으로 결합하는 단일클론항체에 관한 것이다. 보다 특히, 상기 항체는 신경전구체세포의 neutral glycolipid를 특이적으로 인식하는 항체이다.In one embodiment, the present invention relates to monoclonal antibodies that specifically bind human neuroprogenitor cells. More particularly, the antibody is an antibody that specifically recognizes the neutral glycolipid of neural precursor cells.

구체적 양태에서, 본 발명은 수탁번호 KCTC 10744BP의 하이브리도마에 의해 분비되는, 인간 신경전구체세포에 특이적으로 결합하는 단일클론항체 52-A11를 제공한다.In a specific embodiment, the present invention provides monoclonal antibody 52-A11 that specifically binds human neuroprogenitor cells secreted by hybridoma of Accession No. KCTC 10744BP.

본 발명에서 용어 “단일클론항체”란 단일한 항원성 부위(단일 에피토프)에 대해서 지시되어 이와 특이적인 결합을 하는 단백질 분자를 의미한다. As used herein, the term “monoclonal antibody” refers to a protein molecule that is directed to a single antigenic site (single epitope) and binds specifically thereto.

항원의 특정 에피토프를 인식하여 항원-항체 복합체를 형성하는 항체의 주요 부위는 중쇄 및 경쇄의 가변 영역, 특히 CDR(complementarity determining region)이 이러한 복합체 형성에 기여하므로, 본 발명은 상기한 본 발명의 단일클론항체의 가변 영역, 특히 CDR을 포함하는 이의 키메릭 항체, 인간화 항체 등을 본 발명의 범위에 포함한다. 또한, 본 발명은, 상기한 바와 같은 결합 특성을 갖는 한, 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 완전한 형태뿐만 아니라 항체 분자의 기능적인 단편을 포함한다. 항체 분자의 기능적인 단편이란 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 뜻하며 Fab, F(ab'), F(ab')₂ 및 Fv 등이 있다.The main site of an antibody that recognizes a specific epitope of an antigen to form an antigen-antibody complex is that the variable regions of the heavy and light chains, in particular the complementarity determining region (CDR), contribute to the formation of such complexes. Variable regions of clonal antibodies, particularly chimeric antibodies, humanized antibodies and the like, including CDRs, are included within the scope of the present invention. The present invention also encompasses functional fragments of antibody molecules as well as complete forms having two full length light chains and two full length heavy chains as long as they have the binding properties as described above. A functional fragment of an antibody molecule refers to a fragment having at least antigen binding function and includes Fab, F (ab '), F (ab') ₂ and Fv.

본 발명자는 미분화된 인간 배아줄기세포에서 분화 유도한 인간 신경전구체세포에 특이적인 단일클론항체를 생산하기 위해, 인간 신경전구세포구를 대량으로 배양하고 그 특성을 분석한 후 배양 세포가 인간 신경전구체세포임을 확인하고, 이를 생쥐에 면역 주사한 후 분리한 비장세포를 암세포와 융합하여 제조한 하이브리도마로부터 본 발명의 단일클론항체 52-A11를 분리, 정제하고, 상기 항체가 인간 신경전구체세포에 특이적으로 결합함을 확인하였다. 특히, 본 발명의 단일클론항체는 공지된 CD1333 항체 및 NCAM 항체가 인식하는 항원과는 다른 항원을 인식하는 새로운 항체임을 확인하였는데, 실시예 5 내지 8에서 기술된 바와 같이 본 발명의 따른 항체는 미분화된 신경전구체세포의 neutral glycolipid를 특이적으로 인식함을 확인하였다.In order to produce monoclonal antibodies specific for differentiation-induced human neural progenitor cells from undifferentiated human embryonic stem cells, the present inventors cultured human neural progenitor cells in large quantities and analyzed the characteristics thereof. The monoclonal antibody 52-A11 of the present invention was isolated and purified from a hybridoma prepared by fusion of cancer cells with the isolated splenocytes after immunization with mice, and the antibody was specific for human neuroprogenitor cells. It was confirmed that the binding. In particular, it was confirmed that the monoclonal antibody of the present invention is a novel antibody that recognizes an antigen different from that of the known CD1333 antibody and the NCAM antibody. As described in Examples 5 to 8, the antibody of the present invention is undifferentiated. It was confirmed that specifically recognize the neutral glycolipid of the neural precursor cells.

또 다른 양태로서, 본 발명은 상기한 바와 같은 본 발명의 단일클론항체를 생산하는 하이브리도마에 관한 것이다.In another aspect, the present invention relates to a hybridoma producing the monoclonal antibody of the present invention as described above.

구체적 실시에서, 본 발명의 하이브리도마는 인간 신경전구체세포를 스크래퍼로 긁어 모아 DNAse를 처리한 후 잘게 쪼갠 후 생쥐에 복강에 주입한 후 상기 생쥐의 비장에서 림파구를 분리하여 상기 림파구를 골수종 암세포와 융합하여 제조하였다.In a specific embodiment, the hybridoma of the present invention scrapes human neuroprogenitor cells with a scraper, treats them with DNAse, chops them, injects them into the abdominal cavity, and then separates the lymphocytes from the spleen of the mice with myeloma cancer cells. Prepared by fusing.

상기의 특징을 가지는 단일클론항체 52-A11을 분비하는 하이브리도마를 하이브리도마 52-A11(수탁번호: KCTC 10744BP)라 명명하고, 이를 2004년 12월 9일자로 KCTC(Korean Collection for Type Cultures, 대한민국 대전시 유성구 어은동 52번지 한국생명공학연구원)에 수탁하였다. The hybridoma secreting monoclonal antibody 52-A11 having the above characteristics was named hybridoma 52-A11 (Accession Number: KCTC 10744BP), and as of December 9, 2004, KCTC (Korean Collection for Type Cultures) And Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology, 52 Eun-dong, Yuseong-gu, Daejeon, Korea.

단일클론 항체를 분비하는 하이브리도마는 이를 시험관내에서 또는 생체 내에서 대량으로 배양할 수 있다. Hybridomas secreting monoclonal antibodies can be cultured in large quantities in vitro or in vivo.

상기한 하이브리도마가 생산하는 단일클론 항체는 정제하지 않고 사용할 수도 있으나, 최선의 결과를 얻기 위해서는 본 발명이 속하는 기술 분야에 잘 알려져 있는 방법에 따라 고순도(예컨대, 95% 이상)로 정제하여 사용하는 것이 바람직하다. 이러한 정제 기술로는, 예를 들어 겔 전지영동, 투석, 염 침전, 크로마토그래피 등의 정제 방법을 이용하여 배양 배지 또는 복수액(ascites fluid)으로부터 분리될 수 있다. The monoclonal antibodies produced by the hybridomas may be used without purification, but in order to obtain the best results, they are purified using high purity (eg, 95% or more) according to methods well known in the art. It is desirable to. Such purification techniques can be separated from the culture medium or ascites fluid using purification methods such as, for example, gel electrophoresis, dialysis, salt precipitation, chromatography.

본 발명의 구체적 실시에서는 본 발명의 단일클론항체의 대량 생산을 위해, 하이브리도마를 생쥐의 복강에 주사하여 복수액에서 배양하고 이를 단백질 G-세파로스(sepharose) 컬럼 크로마토그래피을 이용하여 분리하였다.In a specific embodiment of the present invention, for mass production of the monoclonal antibody of the present invention, hybridomas were injected into the abdominal cavity of mice, cultured in ascites fluid, and isolated using protein G-sepharose column chromatography.

또 다른 양태로서, 본 발명은 상기한 단일클론항체를 포함하는 인간 신경전구체세포 분리용 조성물에 관한 것이다. 또 다른 양태로서, 본 발명은 상기한 단일클론항체를 사용하여 인간 신경전구체세포를 분리하는 방법에 관한 것이다.As another aspect, the present invention relates to a composition for separating human neuroprecursor cells comprising the monoclonal antibody described above. In another aspect, the present invention relates to a method for separating human neuroprogenitor cells using the monoclonal antibodies described above.

본 발명의 단일클론항체는 세포치료를 위해 이식될 세포 중에 존재하는 신경전구체세포가 아닌 세포를 제거하기 위해 사용될 수 있으며, 신경전구체세포 만을 선택적으로 분리하기 위해서, 본 발명의 단일클론항체를 공지의 겔과 직접 또는 링커 등을 통하여 간접적으로 커플링(예를 들어, 공유결합)시킬 수 있다. 그 외도 구슬(bead)이나 폴리머(polymer)등이 있으나 이로 제한되지는 않는다. The monoclonal antibody of the present invention can be used to remove cells that are not neuroprogenitor cells present in cells to be transplanted for cell therapy, and in order to selectively separate neuroprogenitor cells only, the monoclonal antibody of the present invention is known. Coupling (eg, covalently) may be performed directly with the gel or indirectly via a linker or the like. In addition, there are beads, polymers, etc., but is not limited thereto.

또 다른 양태로서, 본 발명은 상기한 단일클론항체를 포함하는 인간 신경전구체세포의 검정 키트에 관한 것이다.In another aspect, the present invention relates to a kit for assaying human neuroprogenitor cells comprising the monoclonal antibodies described above.

본 발명의 단일클론항체는 항원-항체 복합체 반응을 통해 인간 신경전구체세포를 특이적으로 검출하기 위해 사용될 수 있다. The monoclonal antibodies of the present invention can be used to specifically detect human neuroprogenitor cells through antigen-antibody complex reactions.

이러한 검정 키트에는 본 발명의 단일클론항체 뿐만 아니라 면역학적 분석에 사용되는 당 분야에서 일반적으로 사용되는 도구, 시약 등이 포함된다. 이러한 도구/시약으로는 적합한 담체, 검출 가능한 신호를 생성할 수 있는 표지 물질, 용해제, 세정제, 완충제, 안정화제 등이 포함하나 이로 제한되지 않는다. 표지 물질이 효소인 경우에는 효소 활성을 측정할 수 있는 기질 및 반응 정지제를 포함할 수 있다. 적합한 담체로는, 이에 한정되지는 않으나, 가용성 담체, 예를 들어 당 분야에 공지된 생리학적으로 허용되는 완충액, 예를 들어 PBS, 불용성 담체, 예를 들 어 폴리스틸렌, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리에스테르, 폴리아크릴로니트릴, 불소 수지, 가교 덱스트란, 폴리사카라이드, 라텍스에 금속을 도금한 자성 미립자와 같은 고분자, 기타 종이, 유리, 금속, 아가로스 및 이들의 조합일 수 있다. Such assay kits include monoclonal antibodies of the invention as well as tools, reagents, and the like commonly used in the art for use in immunological assays. Such tools / reagents include, but are not limited to, suitable carriers, labeling materials capable of producing detectable signals, solubilizers, detergents, buffers, stabilizers, and the like. If the labeling substance is an enzyme, it may include a substrate and a reaction terminator capable of measuring enzyme activity. Suitable carriers include, but are not limited to, soluble carriers such as physiologically acceptable buffers known in the art, such as PBS, insoluble carriers such as polystyrene, polyethylene, polypropylene, polyester , Polyacrylonitrile, fluorine resin, crosslinked dextran, polysaccharides, polymers such as magnetic fine particles plated with latex metal, other paper, glass, metal, agarose and combinations thereof.

항원-항체 복합체의 형성 및 분석법은 유세포 분석법(flow cytometry), 조직면역염색, 면역세포화학법, 방사능면역분석법(RIA), 효소면역분석법 (ELISA), 웨스턴 블럿(Western Blotting), 면역침전 분석법(Immunoprecipitation Assay), 면역확산 분석법(Immunodiffusion assay), 보체 고정 분석법(Complement Fixation Assay), 단백질 칩(protein chip)등에 의해 이루어 질 수 있으며 이로 제한되지 않는다. 본 발명의 바람직한 실시예에서는 유세포 분석법, 면역세포화학법, 웨스턴 블랏으로 항원-항체간 특이적인 인식부위를 확인하였다. The formation and analysis of antigen-antibody complexes include flow cytometry, tissue immunostaining, immunocytochemistry, radioimmunoassay (RIA), enzyme immunoassay (ELISA), western blotting, immunoprecipitation assay ( Immunoprecipitation assays, immunodiffusion assays, complement fixation assays, protein chips, and the like, but are not limited thereto. In a preferred embodiment of the present invention, specific recognition sites of antigen-antibody were identified by flow cytometry, immunocytochemistry, and Western blot.

항원-항체 복합체의 형성을 정성 또는 정량적으로 측정가능하게 하는 라벨에는 효소, 형광물, 리간드, 발광물, 미소입자(microparticle), 레독스 분자 및 방사선 동위원소등이 있으며, 반드시 이로 제한되는 것은 아니다. 검출 라벨로 이용 가능한 효소에는 β-글루쿠로니다제, β-D-글루코시다제, β-D-갈락토시다제, 우레아제, 퍼옥시다아제, 알칼라인 포스파타아제, 아세틸콜린에스테라제, 글루코즈 옥시다제, 헥소키나제와 GDPase, RNase, 글루코즈 옥시다제와 루시페라제, 포스포프럭토키나제, 포스포에놀피루베이트 카복실라제, 아스파르테이트 아미노트랜스페라제, 포스페놀피루베이트 데카복실라제, β-라타마제 등이 있으며 이로 제한되지 않는다. 형광물에는 플루오레신, 이소티오시아네이트, 로다민, 피코에리테린, 피코시아닌, 알로피코시아닌, o-프탈데히드, 플루오레스카민 등이 있으며 이로 제한되 지 않는다. 리간드에는 바이오틴 유도체 등이 있으며 이로 제한되지 않는다. 발광물에는 아크리디늄 에스테르, 루시페린, 루시퍼라아제 등이 있으며 이로 제한되지 않는다. 미소입자에는 콜로이드 금, 착색된 라텍스 등이 있으며 이로 제한되지 않는다. 레독스 분자에는 페로센, 루테늄 착화합물, 바이올로젠, 퀴논, Ti 이온, Cs 이온, 디이미드, 1,4-벤조퀴논, 하이드로퀴논, K₄ W(CN)₈ , [Os(bpy)₃]²⁺ , [RU(bpy)₃]²⁺, [MO(CN)₈]^4- 등이 있으며 이로 제한되지 않는다. 방사선동위원소에는 ³H, ¹⁴C, ³²P, ³⁵S, ³⁶Cl, ⁵¹Cr, ⁵⁷Co, ⁵⁸Co, ⁵⁹Fe, ⁹⁰Y, ¹²⁵I, ¹³¹I, ¹⁸⁶Re 등이 있으며 이로 제한되지 않는다. Labels that enable qualitative or quantitative measurement of antigen-antibody complex formation include, but are not limited to, enzymes, fluorescent materials, ligands, luminescent materials, microparticles, redox molecules, and radioisotopes. . Enzymes available as detection labels include β-glucuronidase, β-D-glucosidase, β-D-galactosidase, urease, peroxidase, alkaline phosphatase, acetylcholinesterase, and glucose oxy Multidose, Hexokinase and GDPase, RNase, Glucose Oxidase and Luciferase, Phosphofructokinase, Phosphoenolpyruvate Carboxylase, Aspartate Aminotransferase, Phosphopyruvate Decarboxylase, β- Latamases and the like, but are not limited thereto. Fluorescent materials include, but are not limited to, fluorescein, isothiocyanate, rhodamine, phycoerythrin, phycocyanin, allophycocyanin, o-phthalaldehyde, fluorescamine, and the like. Ligands include, but are not limited to, biotin derivatives. Luminescent materials include, but are not limited to, acridinium ester, luciferin, luciferase, and the like. Microparticles include, but are not limited to, colloidal gold, colored latex, and the like. Redox molecules include ferrocene, ruthenium complex, biologen, quinone, Ti ion, Cs ion, diimide, 1,4-benzoquinone, hydroquinone, K ₄ W (CN) ₈ , [Os (bpy) ₃ ] ²⁺ , [RU (bpy) ₃ ] ²⁺ , [MO (CN) ₈ ] ^4-, and the like. Radioisotopes include, but are not limited to, ³ H, ¹⁴ C, ³² P, ³⁵ S, ³⁶ Cl, ⁵¹ Cr, ⁵⁷ Co, ⁵⁸ Co, ⁵⁹ Fe, ⁹⁰ Y, ¹²⁵ I, ¹³¹ I, ¹⁸⁶ Re, and the like.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 내용이 하기 실시 예에 한정되는 것은 아니다.Hereinafter, the present invention will be described in detail by way of examples. However, the following examples are merely to illustrate the invention is not limited to the contents of the present invention.

<< 실시예Example 1> 인간 신경전구체세포의 배양 1> Culture of Human Neural Precursor Cells

본 발명자들은 인간 배아줄기세포 Miz-hES1을 성삼의료재단 미즈메디병원으로부터 분양 받아서, 인간 배아줄기세포로부터 Zhang 등의 방법으로 (Zhang et al., Nat . Biotechnol., 19: 1129 - 1133, 2001) 인간 신경전구체세포로 분화시켜 hNP1이라 명명하였다(도 1). 상기의 인간 신경전구체세포를 N2 배지(DMEM/F12, 25㎍/㎖ 인슐린(insulin, Sigma), 100㎍/㎖ 트랜스페린(transferrin, Sigma), 60μM 푸트레신(putrescine, Sigma), 20nM 프로게스테론(progesterone, Sigma), 30nM 소듐셀레나이트(sodium selenite, Sigma), 2㎍/㎖ 헤파린(heparin, Sigma), 20ng/㎖ bFGF(Invitrogen))에서 배양하고, 배지는 2일에 한번씩 교체 배양하였으며, 6일 간격으로 계대배양하였다. 계대배양은 0.25% 트립신(trypsin)/0.1 mM EDTA 2㎖을 넣고 37℃에서 3분간 처리한 후, 트립신 활성을 억제하기 위하여 10%혈청이 포함된 N2 배지 8㎖에 부유시킨 다음 1200rpm, 3분 동안 원심분리하여 상기의 신경전구체세포만을 분리한 후, 0.1% 폴리-L-오르니틴(Poly-L-orithine)과 1㎍/㎖의 피브로넥틴(Fibrinectin)으로 코팅된 100㎜ 플레이트에 2 × 10⁶개의 세포를 접종시킨 후 배양하였다.The inventors of the present invention received human embryonic stem cell Miz-hES1 from Mizmedi Hospital of Sungsam Medical Foundation, and from human embryonic stem cells by Zhang et al. al ., Nat . Biotechnol., 19: 1129-1133, 2001), differentiated into human neuroprogenitor cells and named hNP1 (FIG. 1). Human neuroprogenitor cells were treated with N2 medium (DMEM / F12, 25 μg / ml insulin (insulin, Sigma), 100 μg / ml transferrin (Sigma), 60 μM putrescine (Sigma), 20 nM progesterone (progesterone). , Sigma), 30 nM sodium selenite (Sigma), 2 ㎍ / ㎖ heparin (heparin, Sigma), 20ng / ㎖ bFGF (Invitrogen), the culture medium was replaced every 2 days, 6 days Subcultured at intervals. For subculture, 2 ml of 0.25% trypsin / 0.1 mM EDTA was treated at 37 ° C. for 3 minutes, and then suspended in 8 ml of N2 medium containing 10% serum to inhibit trypsin activity, followed by 1200 rpm for 3 minutes. After centrifugation to separate only the neural progenitor cells, 2 × 10 ⁶ on a 100 mm plate coated with 0.1% Poly-L-orithine and 1 μg / ml fibronectin Cells were seeded and cultured.

<< 실시예Example 2> 생쥐  2> mice 하이브리도마의Hybridoma 제조 Produce

<2-1> 생쥐에 인간 신경전구체세포의 면역주사<2-1> Immunization of Human Neural Precursor Cells in Mice

상기 실시예 <1>의 방법으로 배양한 인간 신경전구체세포를 스크래퍼(scraper)로 긁어모아 파이펫팅을 수행하여 단일세포로 분리한 후, 37℃에서 30분간 DNase(80 Units/㎖)를 처리한 다음, PBS로 2회 세척하였고, 약 2× 10⁶의 세포를 200㎕의 PBS에 부유시킨 상기 신경전구체세포를 Balb/c 생쥐(한국생명공학연구원 실험동물실)의 복강에 3주 간격으로 3회 반복 투여한 후 채혈하여 항체형성을 확인하였다. 항체형성의 확인은 FACS를 수행하였고, 세포융합 3일 전에 상기 세포 부유물을 추가로 주사하였다.Human neural progenitor cells cultured by the method of Example <1> were scraped and scraped into pipettes to separate them into single cells, and then treated with DNase (80 Units / ml) for 30 minutes at 37 ° C. Next, the cells were washed twice with PBS, and the neuroprecursor cells suspended in 200 μl of PBS at about 2 × 10 ⁶ cells were injected into the abdominal cavity of Balb / c mice (Korea Institute of Bioscience and Biotechnology) at 3 week intervals. After repeated administrations, blood was collected to confirm antibody formation. Confirmation of antibody formation was performed with FACS, and the cell suspension was further injected 3 days before cell fusion.

<2-2> 단일클론 항체를 생산하는 생쥐 <2-2> Mice Producing Monoclonal Antibodies 하이브리도마의Hybridoma 제조 Produce

피더(feeder) 세포를 채취하기 위하여, 세포융합 하루 전에 건강한 생쥐의 복막에 DMEM(GIBC0) 배지를 20㎖을 채웠다 다시 빨아내는 방법으로 복강 내에 있는 세포를 채취한 다음 원심분리하여 얻은 세포와 정상 비장을 갈아서 추출한 세포를 섞은 다음 20% 우태아혈청을 넣고 웰당 1× 10⁵개 세포가 되도록 96웰 플레이트에 분주하여 37℃, CO₂ 배양기에서 배양하였다. 비장세포와 융합할 NS1 골수종 세포주(myeloma, ATCC, USA)는 10%의 우태아혈청이 함유된 RPMI-1640(GIBCO사) 배지에서 2주 동안 배양하여 준비하였다. To collect feeder cells, one day prior to cell fusion, 20 ml of DMEM (GIBC0) medium was filled in the peritoneum of healthy mice and re-sucked to collect cells in the abdominal cavity, followed by centrifugation and normal spleen. The cells were collected by mixing, mixed with 20% fetal bovine serum, and dispensed into 96-well plates so that 1 × 10 ⁵ cells per well were incubated at 37 ° C. in a CO ₂ incubator. NS1 myeloma cell line (myeloma, ATCC, USA) to be fused with splenocytes was prepared by incubating for 2 weeks in RPMI-1640 (GIBCO) medium containing 10% fetal calf serum.

상기 실시예 <2-1>에서와 같이 인간 신경전구체세포로 면역시킨 생쥐로부터 비장을 채취하여 RPMI-1640(GIBCO사) 배지로 세척하고 유리봉으로 분쇄한 후 세포 부유물을 15㎖ 튜브로 옮긴 후 수분동안 방치하여 가라앉으면 상층액을 새 튜브로 옮긴 후 세포수를 계수하였고, NS1 세포를 원심분리하여 취한 후 10 ㎖ RPMI-1640에 현탁하여 세포수를 계수하였다. 1×10⁷개의 NS1 세포와 1×10⁸개의 비장세포를 50㎖ 튜브에 옮겨 섞은 다음 200×g로 5분 동안 원심분리하여 상층액을 제거하고, 37℃의 물이 채워진 비이커에 2분간 방치한 후 천천히 흔들면서 1 ㎖ PEG 용액(GIBCO사)을 1분 동안 첨가하였다. 100×g, 2분간 원심분리하여 상등액을 제거한 후 5 ㎖의 RPMI-1640 배지를 3분에 걸쳐 서서히 넣은 후, 다시 5㎖의 RPMI-1640 배지를 2분에 걸쳐 서서히 첨가하였다. 200×g로 원심분리하여 세포들을 회수하고, 20% 우태아혈청이 함유된 RPMI-1640 배지 30 ㎖에 조심스럽게 현탁하였다. 37℃, CO₂ 배양기에서 30분간 방치한 후 미리 배양하여 둔 MEF 세포(피더 세포)가 깔린 96웰 플레이트에 웰당 70㎕씩 1×10⁵개의 세포가 되도록 접종하여 37℃, CO₂ 배양기에서 배양하였다. 다음날 70 ㎕ HAT를 첨가하고 3일 간격으로 HAT 배지에서 2주 이상 키우면서 자라는 콜로니를 관찰하였다.Spleens were collected from mice immunized with human neuroprogenitor cells as in Example <2-1>, washed with RPMI-1640 (GIBCO) medium, crushed with a glass rod, and the cell suspension was transferred to a 15 ml tube. After standing for several minutes, the supernatant was transferred to a new tube, and the number of cells was counted. NS1 cells were collected by centrifugation, and suspended in 10 ml RPMI-1640 to count the number of cells. Transfer 1 × 10 ⁷ NS1 cells and 1 × 10 ⁸ splenocytes to a 50 ml tube, mix and centrifuge at 200 × g for 5 minutes to remove supernatant, and leave in a beaker filled with water at 37 ° C. for 2 minutes. After shaking slowly, 1 ml PEG solution (GIBCO) was added for 1 minute. After removing the supernatant by centrifugation at 100 x g for 2 minutes, 5 ml of RPMI-1640 medium was added slowly over 3 minutes, and then 5 ml of RPMI-1640 medium was slowly added over 2 minutes. Cells were harvested by centrifugation at 200 × g and carefully suspended in 30 ml of RPMI-1640 medium containing 20% fetal calf serum. After incubating for 30 minutes in a 37 ° C, CO ₂ incubator, inoculate the cells into 96 well plates pre-cultivated with MEF cells (feeder cells) at 70 μl per well to give 1 × 10 ⁵ cells at 37 ° C and CO ₂ incubator. It was. The next day, 70 μl HAT was added and colonies were grown while growing in HAT medium for 3 days or more at 3 days intervals.

항체가 발현되는 클론을 선별하기 위하여 샌드위치 ELISA(Sandwich Enzyme Linked Immunosorbent Assay) 방법을 사용하였다. 항-마우스 IgG 또는 IgM 항체를 2㎍/㎖로 코팅한 플레이트에 하이브리도마 배양액 100 ㎕을 첨가해 37℃에서 1시간 동안 반응시키고, 다시 항-마우스 IgG 또는 IgM의 HRP(horseradish peroxidase, Sigma사)의 1/5,000 희석액을 넣어 1시간 동안 반응시켰다. 0.05%의 트윈-20(Tween-20, Sigma)을 첨가한 PBS로 플레이트를 3회 세척하고, OPD(Sigma)와 H₂O₂가 포함된 기질용액을 첨가한 후, 492 ㎚에서 흡광도를 측정하여 항체를 생산하는 클론을 우선적으로 선별하였다.Sandwich Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA) was used to select clones expressing antibodies. 100 μl of hybridoma culture solution was added to a plate coated with 2 μg / ml of anti-mouse IgG or IgM antibody, and reacted at 37 ° C. for 1 hour, and again HRP (horseradish peroxidase, Sigma) of anti-mouse IgG or IgM was added. 1 / 5,000 diluent was added and reacted for 1 hour. The plate was washed three times with PBS added with 0.05% Tween-20 (Sigma), and the absorbance was measured at 492 nm after adding the substrate solution containing OPD (Sigma) and H ₂ O _2. Clones that produce antibodies were preferentially selected.

<< 실시예Example 3> 인간 신경전구체세포에 결합하는 단일클론항체의 제조 3> Preparation of Monoclonal Antibody Binding to Human Neural Precursor Cells

<3-1> 인간 신경전구체세포에 결합하는 단일클론항체를 생산하는 <3-1> Producing Monoclonal Antibody Binding to Human Neural Precursor Cells 하이브리도마Hybridoma 클론의 선발 Selection of clones

상기 <실시예 2>의 방법으로 제조한 클론 중에서, 비교적 안정하게 항체들을 분비하는 하이브리도마 상층액의 인간 신경전구체세포에 대한 결합능을 조사하였 다. 구체적으로, 배양한 인간 신경전구제세포에 세포분리 완충액(cell dissociation buffer, GIBCO)으로 37℃, 40분 동안 처리하여 뭉쳐 있는 인간 신경전구체세포를 단일세포로 분리한 뒤, 40 ㎕ 스트레이너(strainer)를 통과시켜 2 × 10⁵개의 세포를 유세포 분석기(Flow cytometry)에서 분석하였다. 먼저 단일세포화된 인간 신경전구체세포를 PBA(1%의 BSA를 PBS에 용해)용액에 부유시키고 각각의 항체 상층액을 4℃에서 30분간 반응시켰다. 4℃에서 1300rpm으로 5분 동안 원심분리하여 상층액을 제거한 후 PBA로 2회 세척하였다. 여기에 항-마우스 Ig-FITC(BD)를 200배 희석해서 4℃, 30분 동안 반응시킨 다음 PBA 용액으로 2회 세척하고, PI(Propidium Iodide) 음성인 세포들만 골라 FACS 칼리버(caliber)가 장착된 유세포 분석기로 인간 신경전구체세포에 대한 결합능을 분석하였다.Of the clones prepared by the method of <Example 2>, the binding capacity of the hybridoma supernatants that secrete antibodies to human neuroprogenitor cells was relatively stable. Specifically, the cultured human neuroprogenitor cells were treated with a cell dissociation buffer (GIBCO) at 37 ° C. for 40 minutes to separate the aggregated human neuroprogenitor cells into single cells, followed by 40 μl strainer (strainer). 2 x 10 ⁵ cells were analyzed by flow cytometry. First, single-celled human neural progenitor cells were suspended in PBA (1% BSA dissolved in PBS) solution and each antibody supernatant was reacted at 4 ° C. for 30 minutes. The supernatant was removed by centrifugation at 1300 rpm for 5 minutes at 4 ° C. and washed twice with PBA. The anti-mouse Ig-FITC (BD) was diluted 200-fold, reacted at 4 ° C. for 30 minutes, washed twice with PBA solution, and selected only for PI (Propidium Iodide) negative cells and equipped with a FACS caliber. The flow cytometer was used to analyze the binding capacity to human neuroprogenitor cells.

그 결과, 인간 신경전구체세포에 결합하는 항체를 분비하고, 확실하게 안정성을 유지하는 인간 신경전구체세포에 대한 특이성을 유지한 항체를 분비하는 하이브리도마 52-A11를 선발하였다.As a result, hybridomas 52-A11 were secreted which secrete antibodies which bind to human neuroprogenitor cells and secrete antibodies which retain specificity to human neuroprecursor cells which are reliably stable.

상기 단일클론항체 52-A11를 분비하는 하이브리도마를 하이브리도마 52-A11(수탁번호: KCTC 10744BP)라 명명하고, 이를 2004년 12월 9일자로 KCTC(Korean Collection for Type Cultures, 대한민국 대전시 유성구 어은동 52번지 한국생명공학연구원)에 수탁하였다.The hybridoma secreting the monoclonal antibody 52-A11 was named hybridoma 52-A11 (Accession Number: KCTC 10744BP), and as of December 9, 2004, KCTC (Korean Collection for Type Cultures, Yuseong-gu, Daejeon, Korea) It was entrusted to the Korea Institute of Bioscience and Biotechnology, 52 Eun-dong.

<3-2> 생쥐 단일클론항체의 정제<3-2> Purification of Mouse Monoclonal Antibodies

상기 실시예 <3-1>에서 선별한 하이브리도마에서 단일클론항체 52-A11를 분리하였다. 구체적으로, 52-A11 항체를 정제하기 위하여, 일주일 전에 0.5 ㎖의 프리스탄(pristane)을 접종한 Balb/c 생쥐의 복강에 상기 하이브리도마 세포를 ㎖당 1 X 10⁷개의 세포수로 0.5 ㎖의 인산완충액에 용해시켜 주사하고, 주사 10-14일 후 주사기로 복수를 추출하고, 상기 복수를 원심분리하여 상층액만 모았다. 상기 복수액 1 ㎖에 인산완충액을 첨가하여 2 ㎖로 희석시켰다. 또한, 1 nM의 EDTA와 0.02%의 NaN₃을 상기 복수액에 첨가하고, 0.22 ㎛ 여과기로 여과하였다. 단백질 G-세파로스 컬럼(Pharmacia, 스웨덴)을 사용하여 4℃에서 2시간 동안 회전하면서 항체를 결합시키고 컬럼을 똑바로 세워서 혈청 분리관을 이용하여 컬럼의 벽면을 세척액(0.5 M의 NaCl, 0.1 M의 Tris, pH 8.0)으로 세척하고, 컬럼을 페리스타틱 펌프(peristatic pump)에 연결하여 세척액으로 충분히 세척하였다. 세척 완료 후, 0.2M의 글리신(glycin)-HCl(pH 2.7)으로 항체를 용출하였다. 이때, 미리 준비한 1M의 Tris(pH 9.0)를 포함한 튜브에 상기 용출액을 완충시켰다. Monoclonal antibody 52-A11 was isolated from the hybridomas selected in Example <3-1>. Specifically, in order to purify the 52-A11 antibody, 0.5 ml of the hybridoma cells at 1 × 10 ⁷ cells per ml were injected into the abdominal cavity of Balb / c mice inoculated with 0.5 ml of pristane a week before. It was dissolved in phosphate buffer of and injected, 10-14 days after injection, the ascites were extracted with a syringe, and the ascites were centrifuged to collect only the supernatant. Phosphoric acid buffer was added to 1 ml of the ascites solution and diluted to 2 ml. Further, 1 nM EDTA and 0.02% NaN ₃ were added to the ascites liquid and filtered with a 0.22 μm filter. Binding the antibody while rotating for 2 hours at 4 ° C. using a protein G-Sepharose column (Pharmacia, Sweden) and use the serum separator to wash the wall of the column using a serum separation tube (0.5 M NaCl, 0.1 M Tris, pH 8.0), and the column was connected to a peristatic pump to wash well with washing solution. After washing was complete, the antibody was eluted with 0.2 M glycine-HCl (pH 2.7). At this time, the eluate was buffered in a tube containing 1M Tris (pH 9.0) prepared in advance.

<< 실시예Example 4> 단일클론항체의 특이성 분석 4> Specificity Analysis of Monoclonal Antibodies

상기 실시예<3-2>에서 정제한 52-A11 항체의 인간 신경전구체세포 (hNP1)에 대한 결합능을 형광 세포염색을 통하여 상기 실시예<3-1>과 동일한 방법으로 조사하였다(도 2). 그 결과, 단일클론항체 52-A11가 신경전구체세포에 결합하는 것을 볼 수 있다. 인간신경전구체세포 이외의 세포에 대한 결합능을 알아보기 위해, 인 간신경줄기세포주인 HB1.F3와 embryonic carcinoma 세포주인 Ntera2, neuroblastma인 SHSY5Y, primary glioblastoma, 인간배아줄기세포인 Miz-hES1 및 PBL(peripheral blood lymphocyte)을 분리, 배양한 후, 단일클론항체 52-A11과 반응시켜 본 결과, 상기 항체 52-A11이 HB1.F3, Ntera2, SHSY5Y, primary glioblastoma, Miz-hES1와는 결합하고 PBL과는 결합하지 않는 결과를 보여 주었다(도 2). 도 2에서 회색바탕은 음성대조군으로 2차 항체만 포함한 것이고, 실선은 52-A11 항체의 각 세포에 대한 결합도이다.The binding capacity of the 52-A11 antibody purified in Example <3-2> to human neuroprogenitor cells (hNP1) was examined in the same manner as in Example <3-1> through fluorescent cell staining (FIG. 2). . As a result, it can be seen that monoclonal antibody 52-A11 binds to neural precursor cells. To investigate the binding capacity of cells other than human neural progenitor cells, HB1.F3, a human neural stem cell line, and Ntera2, an embryonic carcinoma cell line, SHSY5Y, a neuroblastma, primary glioblastoma, and Miz-hES1, a human embryonic stem cell, and peripheral blood lymphocytes) were isolated and cultured, and then reacted with monoclonal antibody 52-A11. As a result, the antibody 52-A11 binds to HB1.F3, Ntera2, SHSY5Y, primary glioblastoma, and Miz-hES1, but does not bind to PBL. The results were shown (FIG. 2). In FIG. 2, the gray background is a negative control group containing only the secondary antibody, and the solid line is the binding degree of each cell of the 52-A11 antibody.

<< 실시예Example 5> 인간 태아 유래의 신경전구체에 대한 특이성 분석 5> Specificity analysis of neuroprecursors derived from human fetus

<5-1> 인간 태아 신경 전구체 배양<5-1> Human Fetal Neural Precursor Culture

Cambrex (www.cambrex.com)사에서 구입한 인간 신경 전구체 세포 (NHNP)를 Cambrex사의 배양키트 NPMM을 사용하여 sphere상태로 유지하면서 배양하고, 일주일 단위로 glass pipette을 이용하여 하나의 sphere를 4-5개 조각으로 나누고, 이틀 간격으로 배지를 교체 배양하였다. 배양한 인간 전구체 세포는 24 well plate에서 Poly-Orinithine (15μg/ml)으로 밤새 코팅하고, PBS로 두 차례 세척하고, Laminin (1μg/ml) 밤새 코팅하고, 다시 PBS로 두 차례 세척한 12mm cover slip 위에 신경전구체세포의 신경구를 성장배지에 부유시켜 접종하고, 접종한 다음날 항원-항체간 특이부위를 염색하여 현미경으로 관찰하였다.     Human neural progenitor cells (NHNP) purchased from Cambrex (www.cambrex.com) were incubated while maintaining the sphere state using Cambrex Inc.'s culture kit NPMM. Divided into 5 pieces and the medium was alternately cultured every two days. Cultured human precursor cells were coated overnight with Poly-Orinithine (15 μg / ml) in 24 well plates, washed twice with PBS, coated with Laminin (1 μg / ml) overnight, and washed twice with PBS again. The neurospheres of the neural precursor cells were inoculated on the growth medium to be inoculated, and the day after the inoculation, the antigen-antibody specific sites were stained and observed under a microscope.

<5-2> 인간 신경전구체 세포의 분열 및 <5-2> Division of Human Neuroprogenitor Cells and 마커Marker 확인 Confirm

분열하는 신경 전구체를 관찰하기 위해, 배양된 세포를 10 μM BrdU (5'-bromodeoxyuridine)로 2시간 동안 배양한 후, 4% paraformaldehyde (PFA)로 10분 동안 고정하고, 2 N HCl로 10분 실온에서 반응시켰다. 이 세포를 0.1 M sodium borate buffer (pH 8.3)로 10분 동안 중화시키고, 인산완충용액(PBS, pH 7.4)으로 세척하고, anti-BrdU antibody (1:500 dilution Sigma)와 토끼 anti-nestin 항체로 37C에서 2시간 동안 반응시킨 후 fluorescein isothiocyanate (FITC)-conjugated anti-mouse IgG antibody (1:200 dilution; Vector)와 FITC-conjugated anti-rabbit IgG 로 1시간동안 실온에서 반응을 수행하였다. 4',6-diamidine-2'-phenylindole dihydrochloride (DAPI)로 대조 염색하고, Vectashield로 mounting한 후 현미경에서 관찰하였다. 그 결과, 인간신경전구체세포가 분열하는 세포를 염색하는 BrdU에 염색이 되고, 신경전구체세포에서 발현되는 nestine이 염색됨을 알 수 있었다.(도 3A). 인간 전구체세포에서 단일클론항체 52-A11 항원이 발현하는지 관찰하기 위하여 먼저 상기 신경전구체세포를 실시예 <5-1>과 동일한 방법으로 코팅한 cover slip위에 배양하고, 4% 파라포름알데하이드로 실온에서 20분 동안 고정하고 0.1%BSA/PBS로 5분 동안 3회 세척하고, 10% normal goat serum, 0.3% triton X-100, 0.1% BSA를 함유한 PBS 용액으로 실온에서 1시간동안 블라킹하고, 10% normal goat serum, 0.1% BSA을 함유한 PBS 용액에서 1차 항체인 52-A11(1:100)를 4℃에서 밤새 반응시켰다. PBS 용액으로 수차례 세척하고, 2차 항체를 반응시켰다. 사용한 2차 항체 는 52-A11 (IgM)항체 경우 FITC 결합된 anti-생쥐 IgM (Vector)를 200배 희석하여 차광된 조건하에서 사용하였다. 0.1% BSA/PBS로 5분씩 3회 세척 후, 물로 2회 세척하고, DAPI가 포함된 Vectashield로 마운팅(mounting)하여 형광현미경으로 염색을 관찰하였다. 그 결과, 신경구 전체 중 가운데 일부에서 단일클론 항체 52-A11에 염색됨을 관찰하였고(도 3B), 이 세포가 migration 하면서 뻗어나온 neurite 경우에는 52-A11항원이 다량 관찰됨을 알 수 있었다 (도 3C).To observe the dividing neural precursors, the cultured cells were incubated with 10 μM BrdU (5'-bromodeoxyuridine) for 2 hours, then fixed with 4% paraformaldehyde (PFA) for 10 minutes, and 10 minutes room temperature with 2N HCl. Reaction at The cells were neutralized with 0.1 M sodium borate buffer (pH 8.3) for 10 minutes, washed with phosphate buffer (PBS, pH 7.4) and washed with anti-BrdU antibody (1: 500 dilution Sigma) and rabbit anti-nestin antibody. After reacting at 37C for 2 hours, the reaction was performed at room temperature for 1 hour with fluorescein isothiocyanate (FITC) -conjugated anti-mouse IgG antibody (1: 200 dilution; Vector) and FITC-conjugated anti-rabbit IgG. Control staining with 4 ', 6-diamidine-2'-phenylindole dihydrochloride (DAPI), mounting with Vectashield and observed under a microscope. As a result, it can be seen that BrdU stains the cells in which human neural progenitor cells divide, and the nestine expressed in neural precursor cells is stained (FIG. 3A). In order to observe the expression of the monoclonal antibody 52-A11 antigen in human precursor cells, the neural progenitor cells were first cultured on a coated cover slip in the same manner as in Example <5-1>, followed by 4% paraformaldehyde at room temperature. Fix for 20 minutes and wash three times with 0.1% BSA / PBS for 5 minutes, block with PBS solution containing 10% normal goat serum, 0.3% triton X-100, 0.1% BSA for 1 hour at room temperature, The primary antibody, 52-A11 (1: 100), was reacted overnight at 4 ° C. in a PBS solution containing 10% normal goat serum and 0.1% BSA. Washed several times with PBS solution and the secondary antibody was reacted. The secondary antibody used was a 200-fold dilution of FITC-bound anti-mouse IgM (Vector) for 52-A11 (IgM) antibody under shaded conditions. After washing three times with 0.1% BSA / PBS three times, washed twice with water, and mounted with a Vectashield containing DAPI was observed by staining with a fluorescent microscope. As a result, some of the whole neurospheres were stained with monoclonal antibody 52-A11 (FIG. 3B), and it was found that a large amount of 52-A11 antigen was observed in the case of neurite stretched out as the cells migrated (FIG. 3C). .

<< 실시예Example 6> 다른 신경전구체 세포에 대한 반응성 6> responsiveness to other neuroprogenitor cells

Zhang등의 방법으로 (Zhang et al., Nat . Biotechnol ., 19: 1129 - 1133, 2001)로 배양한 Miz-hES1을 배아체(Embryoid Body, EB)로 만든 후, 배양접시에서 매일 배지를 교체 배양하면서 4일 동안 배양하고, 15ml 튜브으로 옮겨 EB를 가라앉히고, HBSS로 2회 세척 후, 0.1% 폴리-L-오르니틴(Poly-L-orithine)과 1㎍/㎖의 피브로넥틴(Fibrinectin)으로 코팅 (O/F coating) 된 배양접시에서 bFGF가 함유된 N2배지로 이틀에 한번 교체배양하면서 14일간 배양하였다. 약 14일 내지 21일 사이에rosette가 많이 생긴 것을 확인한 후, 100 mm 배양 접시에 2ml의 트립신을 약 3분간 처리하여 배양접시로부터 세포를 떨어뜨린 후, trypsin inhibitor가 함유된 N2 배지를 첨가하여 트립신 반응을 종결시켰다. 세포를 15ml 튜브에 옮겨 살짝 가라앉히고, 가라앉은 rosette만 사용하여 다른 O/F로 코팅된 배양접시로 옮겨주면 rosette가 바닥에 붙어 뻗아 나갔다. 바닥에 붙어 뻗다가 약 1주일 내지 2주일 지나면 신경구(sphere)가 생기기 시작하였다. media는 2일에 한 번씩 교체 배양하거나, bFGF를 적정농도로 첨가하였다. 그런 후에, 신경줄기세포 마커인 CD133 항체(1:10)로 염색해보니 세포 중 일부가 염색됨을 볼 수 있었다(도 3E). 또 이 rosette를 단일클론항체 52-A11을 사용하여 상기 방법으로 염색해보니, 대부분의 세포가 염색되는 것이 관찰 되었다(도3D). 또, 인간 신경 전구체로 만든 세포주에 대한 단일클론항체 52-A11 항체의 염색결과에서는 대부분의 세포에서 염색됨을 관찰할 수 있었다(도 3F).Zhang et al . (Zhang et al ., Nat . Biotechnol ., 19: 1129-1133, 2001), Miz-hES1 incubated with an embryonic body (Embryoid Body, EB), and then incubated for 4 days while replacing the culture medium in a culture dish daily, and transferred to a 15ml tube EB After rinsing, washing with HBSS twice and bFGF in O / F coated culture dish with 0.1% Poly-L-orithine and 1 μg / ml Fibrnectin The culture was incubated for 14 days with a replacement culture containing N2 medium once every two days. After confirming that a lot of rosette occurred between about 14 days and 21 days, the cells were removed from the culture dish by treating 2 ml of trypsin for about 3 minutes in a 100 mm culture dish, and then trypsin was added by adding N2 medium containing trypsin inhibitor. The reaction was terminated. The cells were transferred to a 15 ml tube and allowed to settle slightly. Using only the submerged rosettes, they were transferred to another O / F-coated petri dish where the rosettes stuck to the bottom. After about a week or two weeks, the neurospheres began to form. The media was incubated once every two days, or bFGF was added at an appropriate concentration. Then, staining with the neural stem cell marker CD133 antibody (1:10) showed that some of the cells were stained (FIG. 3E). When the rosette was stained by the above method using monoclonal antibody 52-A11, it was observed that most cells were stained (Fig. 3D). In addition, the staining results of the monoclonal antibody 52-A11 antibody against a cell line made of human neural precursors were observed to stain in most cells (FIG. 3F).

다른 인간배아줄기세포인 HSF6(Abeyta, et al. Hum. Mol. Genet. 13:601-608, 2004)에서 유래한 인간 신경전구체세포에 대한 결합능도 면역세포화학적(immunocytochemistry) 분석을 통하여 조사하였다(도 4). HSF6세포를 CF1 피더에서 배양 후 1주일 간격으로 collagenase IV 30분 처리하고, 스크래퍼로 긁어서 가라앉은 cell을 사용하여 계대하였다. HSF6를 지지세포인 PA6에서 1주일 동안 ITSA배지 (2.5 μg/㎖ insulin, 25 μg/㎖ transferrin, 30 nM sodium selenite, 0.2 mM ascorbic acid)에서 키우고 collagenase를 처리하여 PA6-shh(shh이 transfection된 cell)에서 1주일 배양하고 다시 collagenase처리하여 O/F(폴리-L-오르니틴(15 μg/ml)과 피브로넥틴(1 μg/ml)) 코팅된 접시에서 ITSA와 bFGF 20ng/ml로 1주 내지 2주 동안 배양하여 신경 전구체 세포를 만들었다 (Park, et al., J. Neurochem. 92:1265-1276, 2005). 이 세포들 4% 파라포름알데하이드로 실온에서 20분 동안 고정하고 0.1%BSA/PBS로 5분 3회 세척하고, 10% normal goat serum, 0.3% triton X-100 및 0.1% BSA가 함유된 PBS 완충용액으로 실온에서 1시간 동안 블라킹 한 후, 1차 항체를 10% normal goat serum 및 0.1% BSA가 함유된 PBS 완충 용액에서 4℃ 조건으로 밤새 반응시켰다. 이중염색을 위하여, 52-A11 외 1차 항체는 생쥐 항-네스틴(nestin)(1:1000), 토끼 항-TuJ1(1:2000), 토끼 항- GFAP(1:400)등을 사용하였고, 그에 상응하는 2차 항체로, 52-A11 (IgM)항체 경우 FITC 결합된 anti-생쥐 IgM (Sigma)를 100배 희석해 사용하였다. 0.1% BSA/PBS로 5분씩 3회 세척 후 물로 2회 세척하고 DAPI가 포함된 Vectashield로 마운팅(mounting)하여 형광현미경으로 염색을 관찰하였다. The binding capacity of human neuroprogenitor cells derived from other human embryonic stem cells, HSF6 (Abeyta, et al. Hum. Mol. Genet. 13: 601-608, 2004), was also investigated by immunocytochemistry analysis. 4 ). HSF6 cells were treated with collagenase IV for 30 minutes at 1 week intervals after incubation in CF1 feeder, and passaged using scraped and sunk cells. HSF6 was grown in a supporting cell PA6 for 1 week in ITSA medium (2.5 μg / ml insulin, 25 μg / ml transferrin, 30 nM sodium selenite, 0.2 mM ascorbic acid) and treated with collagenase to PA6-shh (shh transfected cells). Incubated for 1 week and collagenase again for 1 to 2 with 20 ng / ml of ITSA and bFGF in O / F (poly-L-ornithine (15 μg / ml) and fibronectin (1 μg / ml) coated plates Incubation for weeks resulted in neural progenitor cells (Park, et al., J. Neurochem. 92: 1265-1276, 2005). The cells were fixed with 4% paraformaldehyde for 20 minutes at room temperature and washed three times for 5 minutes with 0.1% BSA / PBS, and buffered with PBS containing 10% normal goat serum, 0.3% triton X-100 and 0.1% BSA. After blocking for 1 hour at room temperature with the solution, the primary antibody was reacted overnight at 4 ℃ in PBS buffer solution containing 10% normal goat serum and 0.1% BSA. For dual staining, 52-A11 and other primary antibodies were used as mouse anti-nestine (1: 1000), rabbit anti-TuJ1 (1: 2000), rabbit anti-GFAP (1: 400), and the like. As a corresponding secondary antibody, a 52-A11 (IgM) antibody was used in a 100-fold dilution of FITC bound anti-mouse IgM (Sigma). After washing three times with 0.1% BSA / PBS three times for five minutes, and then washed twice with water and stained with a fluorescent microscope by mounting with a Vectashield containing DAPI.

그 결과, 52-A11 항체와 인간 신경전구체세포의 마커인 네스틴의 염색부위가 거의 일치하였으며(도4A), 초기 뉴런의 마커인 TuJ1와의 이중염색에서는 일치되는 부분이 달랐고(도4B), astrocyte마커인 GFAP와의 이중 염색에서는 염색되는 부위가 확연히 다름을 알 수 있었다(도4C). 이런 결과로부터 52-A11항체가 분화되기 전의 신경전구체세포의 마커를 인식하는 새로운 항체임을 확인할 수 있었다.As a result, the 52-A11 antibody and the staining site of nestin, a marker of human neuroprogenitor cells, were almost identical (Fig. 4A), and in the double staining with TuJ1, a marker of early neurons, the coincidence was different (Fig. 4B). In the double staining with the marker GFAP it can be seen that the sites to be stained is significantly different (Fig. 4C). From these results, it was confirmed that the 52-A11 antibody is a novel antibody that recognizes markers of neuroprogenitor cells before differentiation.

<< 실시예Example 7> 분화 유도된 신경전구체 세포에서 52-A11항원의 발현 7> Expression of 52-A11 Antigen in Differentiation-Induced Neuroprogenitor Cells

상기 실시예 6 에서처럼 HSF6 인간배아줄기세포에서 인간 신경 전구체 세포를 만든 다음 bFGF를 뺀 상태에서 ITSA 배지로 일주일 이상 O/F coating 한 배양접시에서 배양하면서 분화를 유도하였다. bFGF를 빼기 전 상태를 0 day로 한 후 1일 3일 7일 을 배양하면서 상기 실시예 6과 동일한 방법으로, 항체 52-A11, 생쥐 항-네스틴(nestin)(1:1000), 토끼 항-TuJ1(1:2000)와 DAPI로 각 분화 유도된 인간 신경 전구체 세포를 날짜 0,1,3,7일 별로 염색을 하였다. 도 5에서 보이는 것처럼 분화 유도 후 날짜가 지날수록 뉴런 분화마커인 TuJ1은 점점 증가하였으나, 신경 전구체 마커인 nestin의 발현은 점점 감소하였고, 52-A11항원의 발현도 점점 감소하는 것을 볼 수 있다. 이런 결과는 52-A11 항원이 신경전구체 마커인 nestin처럼 미분화 상태의 신경전구체에 특이적으로 발현되는 새로운 마커임을 말해준다.      As in Example 6, human neural progenitor cells were made from HSF6 human embryonic stem cells, and differentiation was induced by culturing in a culture dish coated with ITSA medium for at least one week with bFGF. Antibody 52-A11, mouse anti-nestine (1: 1000), rabbit anti Differentiation-induced human neural progenitor cells with -TuJ1 (1: 2000) and DAPI were stained every 0,1,3,7 days. As shown in FIG. 5, TuJ1, a neuronal differentiation marker, increased gradually as the date passed after induction of differentiation, but the expression of the neural precursor marker nestin gradually decreased, and the expression of 52-A11 antigen also decreased gradually. These results indicate that the 52-A11 antigen is a novel marker that is specifically expressed in undifferentiated neuro precursors, such as nestin, a neuro precursor precursor.

<< 실시예Example 8> 신경종양 세포주에서 52-A11항원의 분석  8> Analysis of 52-A11 Antigen in Neuronal Cell Lines

<8-1><8-1> 모든 지질 추출법All lipid extraction methods

glioblastoma 세포주 A172를 배양 한 후 수확하고 PBS로 2회 세척하고 Wet weight 측정하여 (모든 이하 볼륨은 이 wet weight를 기준으로) 20 volume의 chloroform:methanol(2:1)로 세포를 부유시키고, 3분 동안 sonication 하고, vortex 하고, 4℃에서 12시간 이상 반응시킨 후, 윈심분리해서 (2,000 x g, 5min, 4℃) 상층액을 냉장보관하였다 (1차 상층액). 침전물을 20 volume의 chloroform:methanol (1:1)로 세포를 부유시키고, 3분 동안 sonication 하고, vortex 하고, 4℃에서 12시간 이상 반응시킨 후, 원심분리(2,000 x g, 5 min, 4℃)해서 상층액을 다시 냉장보관하였다 (2차 상층액). 다시 침전물에 20 volume의 chloroform:methanol (1:2)로 세포를 부유시킨 후, 3분 동안 sonication 하고, vortex 하고, 4℃에서 12시간 이상 반응시킨 후, 원심분리(2,000 x g, 5min, 4℃)해서 상층액을 냉장보관하였다(3차 상층액). 1, 2, 3차 상층액을 혼합하여 유리비이커에 옮겨 담고, N2 gas로 1/4 vol까지 건조시켰다. 단백질을 침전시키기 위하여 -20℃에서 밤새 방치하였다. 원심분리(3,000 x g, 15min, 4℃)한 후 상층액을 유리 비이커에 옮겨 담고, N2 gas로 완전히 건조시켰다. 10 volume의 chloroform:methanol (2:1) 넣고, chloroform:methanol volume의 0.2 vol NaCl 첨가하고 4분 동안 Sonication하고, 3분 동안 vortex한 후, 원심분리(2,000 x g, 10min, 4℃)하여 상층액과 하층액으로 나눴다.     Incubate the glioblastoma cell line A172, harvest it, wash twice with PBS, measure the wet weight (all sub-volumes based on this wet weight) and float the cells with 20 volumes of chloroform: methanol (2: 1) for 3 minutes. After sonication, vortex, and reacted at 4 ° C. for at least 12 hours, the resulting supernatant was refrigerated (2,000 × g, 5 min, 4 ° C.) by refrigeration (primary supernatant). The precipitate was suspended in 20 volumes of chloroform: methanol (1: 1), sonicated for 3 minutes, vortexed, and reacted at 4 ° C. for at least 12 hours, followed by centrifugation (2,000 xg, 5 min, 4 ° C.). The supernatant was then refrigerated again (secondary supernatant). Again, the cells were suspended in 20 mL of chloroform: methanol (1: 2) in the precipitate, sonicated for 3 minutes, vortexed, and reacted at 4 ° C. for at least 12 hours, followed by centrifugation (2,000 xg, 5 min, 4 ° C.). The supernatant was refrigerated (tertiary supernatant). The primary, secondary and tertiary supernatants were mixed and transferred to a glass beaker and dried to 1/4 vol with N 2 gas. It was left overnight at -20 ° C to precipitate the protein. After centrifugation (3,000 × g, 15min, 4 ° C.), the supernatant was transferred to a glass beaker and dried completely with N 2 gas. Add 10 volumes of chloroform: methanol (2: 1), add 0.2 vol NaCl of chloroform: methanol volume, sonicate for 4 minutes, vortex for 3 minutes, and centrifuge (2,000 xg, 10min, 4 ℃) for supernatant And divided into substratum.

상층액(hydophilic phase = acidic lipids)은 long neutral glycolipid, ganglioside, sulfatide를 포함하는 액으로 새 유리 비이커로 옮긴 후 10 volume의 chloroform:methanol(2:1) 넣고, chloroform:methanol volume의 0.2 volume의 NaCl 첨가하여 부유 한 후 4분 동안 Sonication하고, 3분 동안 vortex한 후, 원심분리(2,000xg, 10min, 4℃)하여 상층액만 새 유리 비이커로 옮겼다. 하층액(hydophobic phase)은 short neutral glycolipid, sphingomyelin, ceramide를 포함하는 층으로 10 volume의 chloroform:methanol (2:1) 넣고, chloroform:methanol volume의 0.2 volume NaCl 첨가 부유시킨 후, 4분 동안 Sonication하고, 3분 동안 vortex한 후, 원심분리(2,000xg, 10min, 4℃)하여 상층액을 버리고 하층액만 새 유리 비이커로 옮겼다.     The supernatant (hydophilic phase = acidic lipids) is a solution containing long neutral glycolipid, ganglioside, and sulfatide. Transfer to a new glass beaker, add 10 volumes of chloroform: methanol (2: 1), and 0.2 volume NaCl of chloroform: methanol volume. After the addition was suspended and sonicated for 4 minutes, vortexed for 3 minutes, centrifuged (2,000xg, 10min, 4 ° C) and only the supernatant was transferred to a new glass beaker. The lower layer (hydophobic phase) is a layer containing short neutral glycolipid, sphingomyelin, ceramide, and 10 volumes of chloroform: methanol (2: 1) is added, 0.2 volume NaCl of chloroform: methanol volume is added, suspended, and sonicated for 4 minutes. After vortex for 3 minutes, centrifugation (2,000xg, 10min, 4 ℃) discarded the supernatant and only the lower layer was transferred to a new glass beaker.

이 두 상하층액을 1-2 ml 정도 남을 때 까지 N2 gas로 말리고, 최종 부피가 1-2ml 정도 남았을 때 에펜돌프 튜브로 옮긴 후 액체질소에 급속냉동 시키고 Speed-Vec을 이용하여 완전히 건조시켰다. 완전히 건조시킨 lipid sample을 methanol:chloroform(1:1,v/v)용액 200- 500 ul에 부유시켰다.       The two supernatants were dried with N2 gas until 1-2 ml remained, and when the final volume remained 1-2 ml was transferred to the Eppendorf tube and then rapidly frozen in liquid nitrogen and completely dried using Speed-Vec. The completely dried lipid sample was suspended in 200-500 ul of methanol: chloroform (1: 1, v / v) solution.

< 8-2> <8-2> GlycolipidsGlycolipids 항원의  Antigenic immunoblottingimmunoblotting

polyisobutylmethacrylate (PIBM)을 chloroform : n-hexane(1:9)에 넣고 밤새 스터링하며 녹인 후 0.4%로 희석하여 준비하였다. HPTLC plate를 0.4% PIBM로 실온에서 1분간 coating하고, chloroform/n-hexane이 완전히 증발시키기 위하여 플레이트를 후드에서 30분 동안 건조시켰다. 이 플레이트를 Orcinol-H₂SO₄로 전개된 시료를 검출 분석하였다(도 6A). 그 결과 산성 지질(acid lipid)과 중성지질 (neutral lipid)이 잘 분리되어 전개되어 있음을 알 수 있었다. 또 immunoblotting을 수행하기 위해 1% BSA가 함유된 PBS용액(pH 7.4)으로 실온에서 1 시간 블라킹을 수행하고, 단일클론항체 52-A11 (1.7 ug/ml)를 1:1000배 희석하여 1 차 항체에 대한 반응을 수행하고, PBST(0.1% Tween 20 in PBS) 용액으로 1분간 4회 세척하고, 항-생쥐 IgM-HRP를 1:2000희석 하여 실온에서 1시간 동안 반응시킨 후 PBST용액으로 1분간 4회 세척한 후, ECL 검출 용액 (Amersham)으로 발색하여 관찰하였다 (도 6B). 그 결과 단일클론항체 52-A11이 인식하는 항원은 중성 당지질(neutral glycolipid)임을 알 수 있었고, 좀 더 작은 크기의 밴드는 큰 분자의 중성 당지질처럼 같은 항원을 포함하는 또 다른 중성 당지질이거나 큰분자의 중성 당지질의 단편으로 추정된다. Polyisobutylmethacrylate (PIBM) was added to chloroform: n-hexane (1: 9), stirred overnight, and then dissolved in 0.4%. The HPTLC plate was coated with 0.4% PIBM for 1 minute at room temperature and the plate was dried in the hood for 30 minutes to allow the chloroform / n-hexane to evaporate completely. This plate was detected and analyzed for samples developed with Orcinol-H ₂ SO ₄ (FIG. 6A). As a result, it was found that acid lipid and neutral lipid were well separated and developed. In order to perform immunoblotting, blocking was performed at room temperature with 1% BSA-containing PBS solution (pH 7.4) for 1 hour, and monoclonal antibody 52-A11 (1.7 ug / ml) was diluted 1: 1000 times in primary. The reaction was performed on the antibody, washed 4 times with PBST (0.1% Tween 20 in PBS) solution for 1 minute, and anti-mouse IgM-HRP was diluted 1: 2000 and reacted at room temperature for 1 hour, followed by 1 with PBST solution. After washing for 4 min, color development was observed with ECL detection solution (Amersham) (FIG. 6B). As a result, the antigen recognized by monoclonal antibody 52-A11 was neutral glycolipid, and the smaller sized band was another neutral glycolipid or a large molecule containing the same antigen as the neutral glycolipid of the large molecule. It is assumed to be a fragment of neutral glycolipids.

상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 단일클론항체는 인간 신경전구체세포를 특이적으로 인식하므로, 인간 신경전구체세포의 연구 및 세포 치료시 인간 신경전구체 분리에 유용하게 이용될 수 있다.As described above, since the monoclonal antibody of the present invention specifically recognizes human neural progenitor cells, it may be usefully used for the separation of human neural precursors during research and treatment of human neural precursor cells.

Claims (6)

삭제delete 수탁번호 KCTC 10744BP의 하이브리도마에 의해 분비되는, 인간 신경전구체세포에 특이적으로 결합하는 단일클론항체 52-A11.Monoclonal antibody 52-A11 that specifically binds to human neuroprogenitor cells secreted by hybridoma of Accession No. KCTC 10744BP. 수탁번호 KCTC 10744BP로 수탁된 하이브리도마.Hybridomas deposited with accession number KCTC 10744BP. 제2항의 항체를 포함하는, 인간 신경전구체세포 분리용 조성물.A composition for separating human neuroprogenitor cells comprising the antibody of claim 2. 제2항의 항체를 포함하는, 인간 신경전구체세포 검정 키트.A human neuroprecursor cell assay kit comprising the antibody of claim 2. 제 4항의 조성물을 포함하는, 인간신경전구체세포 분리 키트.Human neural precursor cell separation kit comprising the composition of claim 4.

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