KR101335485B1

KR101335485B1 - Methods for Separating and Culturing of Neural Precursor Cell from Pluripotent Stem Cells

Info

Publication number: KR101335485B1
Application number: KR1020110055685A
Authority: KR
Inventors: 김동욱; 김대성
Original assignee: 연세대학교 산학협력단
Priority date: 2011-06-09
Filing date: 2011-06-09
Publication date: 2013-12-02
Also published as: KR20120136638A

Abstract

본 발명은 전능성 줄기세포로부터 신경전구세포의 순수분리 및 유지배양 방법 및 방법에 의해 분리된 신경전구세포에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 (a) 전능성 줄기세포를 신경 로제트(neural rosette)로 분화시켜 신경전구세포를 포함하는 세포 파퓰레이션을 얻는 단계; (b) 상기 세포 파퓰레이션에 PSA-NCAM(poly-sialated neural cell adhesion molecule) 항체를 접촉시키는 단계; 및 (c) 상기 PSA-NCAM 항체 결합된 세포를 분리하는 단계를 포함하는 전능성 줄기세포로부터 신경전구세포의 순수분리 및 유지배양 방법 및 방법에 의해 분리된 신경전구세포에 관한 것이다. 본 발명에 따르면, 기존의 방법과 비교하여 분화과정을 단축하여 분화 과정 중에 생길 수 있는 변수에 의한 분화 수율이 일정하게 유지되지 못하는 단점을 극복할 수 있다. 또한 세포의 계대가 진행되어도 신경전구세포의 특성이 유지되며 본 발명의 분리방법에 의한 신경전구세포는 종양 형성능이 낮고 분화능 및 분열능이 우수한 신경전구세포로 기대된다. The present invention relates to neural progenitor cells isolated by pure separation and maintenance culture method of neural progenitor cells from pluripotent stem cells, and more specifically, (a) by differentiating pluripotent stem cells into neural rosette (neural rosette) Obtaining a cell population comprising neural progenitor cells; (b) contacting the cell population with a poly-sialated neural cell adhesion molecule (PSA-NCAM) antibody; And (c) separating neural progenitor cells from pluripotent stem cells by pluripotent stem cells comprising the step of separating the PSA-NCAM antibody-bound cells. According to the present invention, it is possible to overcome the disadvantage that the differentiation yield by the variable that can occur during the differentiation process is not kept constant compared to the conventional method. In addition, the characteristics of the neural precursor cells are maintained even as the passage of the cell is progressed, the neural precursor cells according to the separation method of the present invention is expected to be low neuronal progenitor cells with excellent tumorigenicity and differentiation capacity.

Description

전능성 줄기세포로부터 신경전구세포의 순수분리 및 유지배양 방법{Methods for Separating and Culturing of Neural Precursor Cell from Pluripotent Stem Cells}Method for Separating and Culturing of Neural Precursor Cell from Pluripotent Stem Cells}

본 발명은 전능성 줄기세포로부터 신경전구세포의 순수분리 및 유지배양 방법 및 방법에 의해 분리된 신경전구세포에 관한 것이다.
The present invention relates to neural progenitor cells separated by a method and method for pure separation and maintenance of neural progenitor cells from pluripotent stem cells.

인간 배아줄기세포로부터 신경전구세포를 유도하는 기술은 꾸준히 연구되고 있다[1-2]. 분화 유도된 신경전구세포는 특정 신경세포로 분화되거나, 신경전구세포 혹은 더 분화된 신경세포 단계에서 뇌신경계 질환 동물 모델에 이식되어 그 임상적 적용 가능성을 확인하는데 이용되고 있다[3-4]. 하지만 기존의 방법은 미분화 상태의 인간 배아줄기세포로부터 특정 신경세포로의 분화 과정까지 여러 단계의 분화 과정을 거쳐 오랜 시간이 소요되어(예컨대, 1달 이상), 분화 과정 중에 생길 수 있는 여러 변수들(실험자의 숙련도, 분화에 사용되는 시약 및 오염)에 의해 분화 수율이 일정하게 유지되지 못하는 단점이 존재하였다. 이런 문제점들을 해결하기 위해 분화 중간 단계인 신경전구세포 단계에서 그 고유의 특성, 즉 1) 신경계를 구성하는 모든 종류의 신경세포 혹은 교세포로의 분화능력, 2) 더 나아가 신호전달기전의 조절을 통해 특정 신경세포 혹은 교세포로 분화될 수 있는 능력, 3) 줄기세포의 기본특성인 자가 증식능(self-newal)을 유지하면서 증식시키는 기술을 개발하는 연구가 진행되고 있다. 일례로, 태아에서 분리한 신경줄기세포의 증식법을 응용한 구형의 신경전구체 덩어리 형태로 부유배양을 시키면서 기계적인 분쇄법을 통한 유지 배양 및 증폭 기술이 최근 개발되었다[5]. 하지만 이 방법은 순수한 신경전구세포를 유지 및 증식시키기에 실험자의 숙련도에 의해 크게 차이가 나고, 매우 많은 시간과 노력이 소모되는 방법이라는 단점이 있다. 이 문제점을 해결하기 위해 신경전구세포의 단일층 부착배양(monolayer-attachment culture) 기술이 최근 개발되고 있는 추세이다[6-7]. 이 방법은 간단히 말해 신경전구세포를 기존의 동물세포의 배양같이 배양기 바닥에 한 층의 세포로 부착시켜 트립신(trypsin)같은 효소를 이용해 계대배양을 하는 것을 말한다. 2005년 영국의 Austin Smith 박사 연구진에 의해 가장 먼저 개발된 단일층 부착배양을 통한 신경전구세포의 분리배양법을 살펴보면 인간 배아줄기세포 배양 중에 자발적으로 분화 발생한 신경상피세포(neuroepithelial cells)의 특성을 갖는 꽃모양 신경전구체(neural rosette) 덩어리를 현미경 하에서 육안으로 기계적으로 분리 및 효소 처리하여 단일 세포 현탁액으로 만든 다음 배양기 바닥에 부착시켜 특정 신경세포 분화배지에서 배양하는 방법을 이용하고 있다. 이 방법은 여러 계대(passage)를 걸쳐 유지 및 증식 배양이 되고 신경세포 혹은 교세포로의 분화 할 수 있는 능력이 있는 것으로 알려져 있다. 하지만 이러한 방식으로 배양되는 신경전구세포는 특정 신경세포 혹은 교세포로의 분화능이 현저히 떨어지는 것으로 알려져 특정 뇌신경계 질환 치료를 위한 신경세포 분화(예컨대, 파킨슨 병 치료를 위한 도파민 신경세포의 분화)에 적합하지 않는 단점이 있다[8]. 최근에 독일의 Oliver Br박사 연구진에 의해 개발된 다른 방법은 인간 배아줄기세포로부터 분화 유도된 신경 로제트를 육안 분리하여 짧게 3차원 부유배양 후 효소처리를 통해 배양기의 바닥에 재부착 시킨 상태에서 반복적인 계대 배양하는 방법이다. 이 방법을 통해서 유지 배양되는 신경전구세포는 초기단계의 신경전구세포(primitive neural precursor)의 특성을 유지하므로 세포 신호전달기전의 조절을 통해 특정 신경세포로의 분화도 가능한 것으로 알려져 있다. 하지만 이들 기존 방법들은 초기 신경전구세포를 분리할 때 실험자의 경험에 의존하는 육안 분리법을 이용하므로 매번 그 순도를 담보하지 못하거나 일부 신경전구세포가 아닌 세포가 섞여 있을 단점이 있을 수 있다. 특히 최근 인간 배아줄기세포주간의 분화특성 때문에 특정 계열(lineage)의 세포로 분화에 차이가 있다고 알려져 있다[9]. 또한 최근 개발된 체세포 리프로그래밍 기술을 이용해 수립된 인간 역분화줄기세포의 경우 인간 배아줄기세포에 비해 신경세포로의 분화능이 떨어진다는 보고가 있는 바, 다양한 배아 및 역분화 줄기세포로부터 비슷한 수율로 순수한 신경전구세포를 분리하기에 큰 어려움이 있을 것이라는 것은 충분히 예상 가능하다[10]. 따라서 어떤 종류의 전분화능 줄기세포에서도 효율적이고 고순도의 신경전구세포를 분리하여 그 성질을 유지하면서 증식배양을 하는 기술 개발이 절실하다. 따라서 본 기술은 기존에 본 연구진에 의해 개발된 모든 전분화능 줄기세포에 적용 가능한 고효율 신경분화법에 이어 개발된 기술로, 신경전구세포 단계에서 특이하게 발현되는 표면항원인 PSA-NCAM을 발현하는 세포를 MACS법을 통해 선택적으로 분리하여 고순도의 신경전구세포 만을 유지 배양 및 냉동하여 신경세포 및 교세포로 분화시키는 방법을 기술하고 있다[11]. 현재까지 특정 표면 항원을 이용한 세포 분리법을 통해 신경전구세포를 분리한 다음 그 특성을 유지하면서 장기간 유지 배양하는 기술은 알려진 바 없다.
Techniques for inducing neuronal progenitor cells from human embryonic stem cells have been steadily studied [1-2]. Differentiation-induced neuronal progenitor cells have been used to confirm their clinical applicability by transplantation into specific neurons, transplanted into neuronal progenitor cells or more differentiated neuronal cells in animal models of cerebral nervous system disease [3-4]. However, the conventional method takes a long time (for example, more than 1 month) through various stages of differentiation from undifferentiated human embryonic stem cells to specific neurons, and thus various variables that may occur during the differentiation process. Differentiation yield was not kept constant due to (proficiency of experimenter, reagent used for differentiation and contamination). In order to solve these problems, the neural progenitor cell stage, which is an intermediate stage of differentiation, has its own characteristics, that is, 1) differentiation ability into all kinds of neurons or glial cells constituting the nervous system, and 2) further control of signaling pathways. Research into developing a technology for proliferating while maintaining the ability to differentiate into specific neurons or glial cells, 3) self-newal, which is the basic characteristic of stem cells. For example, maintenance culture and amplification techniques have been recently developed by mechanical grinding, while floating culture in the form of spherical neuroprecursor masses by applying the proliferation of neural stem cells isolated from the fetus [5]. However, this method has a disadvantage in that the method of maintaining and propagating neural progenitor cells varies greatly depending on the skill of the experimenter and consumes a lot of time and effort. In order to solve this problem, a monolayer-attachment culture technology of neural progenitor cells has recently been developed [6-7]. In simple terms, neuroprogenitor cells are attached to the bottom of the incubator as a single layer of cells like culture of conventional animal cells and passaged using enzymes such as trypsin. In 2005, a study on the isolation and culture of neural progenitor cells by monolayer adhesion culture, first developed by Dr. Austin Smith of the United Kingdom, showed the characteristics of neuroepithelial cells that spontaneously differentiated during human embryonic stem cell culture. Clumps of neural rosettes are visually isolated and enzymatically processed under a microscope to form a single cell suspension, and then attached to the incubator bottom and cultured in specific neuronal differentiation media. This method is known to have the ability to maintain and propagate cultures across different passages and to differentiate into neurons or glia. However, neural progenitor cells cultured in this way are known to have significantly lowered the differentiation ability to specific neurons or glial cells and are not suitable for neuronal differentiation (eg, dopamine neuronal differentiation for the treatment of Parkinson's disease) for the treatment of certain neurological diseases. Has the disadvantage [8]. Another method, recently developed by Dr. Oliver Br, of Germany, is a repetitive process that visually separates differentiation-induced neuronal rosettes from human embryonic stem cells, briefly three-dimensional suspension cultures, and reattaches them to the bottom of the incubator through enzymatic treatment. It is a method of subculture. Neural precursor cells maintained and cultured through this method are known to be able to differentiate into specific neurons through regulation of cellular signaling mechanisms because they maintain the characteristics of the primitive neural precursor cells. However, these conventional methods use visual separation method that depends on the experimenter's experience when separating the initial neural progenitor cells, which may not be guaranteed every time or may have some non-neural progenitor cells mixed. In particular, due to the differentiation characteristics of human embryonic stem cell lines, it is known that there is a difference in differentiation into specific lineage cells [9]. In addition, human dedifferentiated stem cells established using the recently developed somatic reprogramming technology have been reported to be less differentiated into neurons than human embryonic stem cells, resulting in pure yields with similar yields from various embryos and dedifferentiated stem cells. It is quite predictable that there will be great difficulties in separating neuronal progenitor cells [10]. Therefore, the development of efficient and high-purity neural progenitor cells in any kind of pluripotent stem cells to maintain the properties of the proliferation culture development is urgently needed. Therefore, this technology was developed following the high-efficiency neural differentiation method that can be applied to all pluripotent stem cells developed by the researchers, and expresses PSA-NCAM, a surface antigen specifically expressed at the neural precursor cell stage. Is selectively isolated by MACS method to maintain and culture only high-purity neural progenitor cells and to differentiate them into neurons and glial cells [11]. Until now, there is no known technique for separating neural progenitor cells by cell separation using a specific surface antigen and then maintaining them for a long time.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
Numerous papers and patent documents are referenced and cited throughout this specification. The disclosures of the cited papers and patent documents are incorporated herein by reference in their entirety to better understand the state of the art to which the present invention pertains and the content of the present invention.

본 발명자들은 뇌신경계 질환 치료를 위한 세포 대체 치료제를 개발하기 위해 전능성 줄기세포로부터 신경전구세포의 순수분리 및 유지배양 방법을 개발하고자 노력하였다. 그 결과, 신경 마커인 PSA-NCAM 단백질의 항체를 이용하여 분리하는 경우에는 비균질 세포 파퓰레이션에서 신경전구세포를 매우 효과적으로 분리할 수 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.The present inventors endeavored to develop a pure separation and maintenance culture method of neural progenitor cells from pluripotent stem cells in order to develop a cell replacement therapy for the treatment of cerebral nervous system disease. As a result, the present invention was completed by confirming that the neuronal progenitor cells can be separated very effectively in the heterogeneous cell population when the antibody is separated using an antibody of PSA-NCAM protein, which is a neural marker.

따라서 본 발명의 목적은 전능성 줄기세포로부터 신경전구세포의 분리 방법을 제공하는 데 있다.Accordingly, an object of the present invention is to provide a method for separating neural progenitor cells from pluripotent stem cells.

본 발명의 다른 목적은 본 발명의 방법에 의해 분리된 신경전구세포를 제공하는 데 있다.Another object of the present invention is to provide a neural precursor cell isolated by the method of the present invention.

본 발명의 또 다른 목적은 본 방법에 의해 분리된 신경전구세포로부터 분화된 뉴우런(neuron)을 제공하는 데 있다.Still another object of the present invention is to provide neurons differentiated from neural progenitor cells isolated by the method.

본 발명의 다른 목적은 본 방법에 의해 분리된 신경전구세포로부터 분화된 올리고덴드로사이트(oligodendrocyte)를 제공하는 데 있다.Another object of the present invention is to provide an oligoendrocyte differentiated from neural precursor cells isolated by the method.

본 발명의 또 다른 목적은 본 방법에 의해 분리된 신경전구세포로부터 분화된 성상세포(astrocyte)을 제공하는 데 있다.
Still another object of the present invention is to provide an astrocyte differentiated from neural progenitor cells separated by the method.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
Other objects and advantages of the present invention will become more apparent from the following detailed description of the invention, claims and drawings.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 다음 단계를 포함하는 전능성 줄기세포(pluripotent stem cells)로부터 신경전구세포(neural precursor cells)의 분리 방법을 제공한다:According to one aspect of the present invention, the present invention provides a method for separating neural precursor cells from pluripotent stem cells, comprising the following steps:

(a) 전능성 줄기세포를 신경 로제트(neural rosette)로 분화시켜 신경전구세포를 포함하는 세포 파퓰레이션을 얻는 단계; (a) differentiating pluripotent stem cells into neural rosette to obtain cell populations including neural progenitor cells;

(b) 상기 세포 파퓰레이션에 PSA-NCAM(poly-sialated neural cell adhesion molecule) 항체를 접촉시키는 단계; 및(b) contacting the cell population with a poly-sialated neural cell adhesion molecule (PSA-NCAM) antibody; And

(c) 상기 PSA-NCAM 항체 결합된 세포를 분리하는 단계.
(c) isolating the PSA-NCAM antibody bound cells.

본 발명자들은 뇌신경계 질환의 치료를 위한 세포 대체 치료제를 개발하기 위하여 전능성 줄기세포를 효과적으로 분리할 수 있는 방법을 개발하고자 노력하였다. 그 결과, 항-PSA-NCAM 항체를 이용하여 세포를 분리하는 경우에 고순도의 세포전구세포를 분리할 수 있음을 확인하였다.
The present inventors endeavored to develop a method for effectively isolating pluripotent stem cells in order to develop a cell replacement therapy for the treatment of cerebral nervous system disease. As a result, it was confirmed that when the cells were separated using anti-PSA-NCAM antibody, high-purity progenitor cells could be separated.

본 발명의 전능성 줄기세포로부터 신경전구세포의 분리 방법을 각각의 단계로 나누어 상세하게 설명하면 다음과 같다:The separation method of neural progenitor cells from pluripotent stem cells of the present invention will be described in detail by dividing each step as follows:

단계 (a): 전능성 줄기세포를 신경 로제트(neural rosette)로 분화시켜 신경전구세포를 포함하는 세포 파퓰레이션의 준비 Step (a): Differentiation of pluripotent stem cells into neural rosette to prepare cell populations containing neural progenitor cells

본 발명에 따르면, 전능성 줄기세포를 신경 로제트로 분화시켜 신경전구세포를 포함하는 세포 파퓰레이션을 준비한다. According to the present invention, to differentiate the pluripotent stem cells into neural rosette to prepare a cell population including neural progenitor cells.

상기 세포 파퓰레이션은 다양하게 준비될 수 있다. 예를 들어, 전능성 줄기세포(예컨대, 배아줄기세포 및 유도 전능줄기세포)를 신경 로제트로 분화시킨 세포 파퓰레이션이다. 전능성 줄기세포를 분화시킨 결과물에는 일반적으로 모든 세포들이 분화세포를 포함하지 않으며, 비균질 파퓰레이션을 이룬다. 따라서, 신경 로제트를 세포 치료제로 이용하기 위해서는 신경전구세포를 순수하게 분리해야 한다. The cell population may be prepared in various ways. For example, cell populations that differentiated pluripotent stem cells (eg embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells) into neural rosettes. The result of the differentiation of pluripotent stem cells is generally that all cells do not contain differentiated cells and form a heterogeneous population. Therefore, neural progenitor cells must be purely separated in order to use neural rosettes as cell therapeutics.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 전능성 줄기세포는 배아줄기세포(embryonic stem cells), 배아생식세포(embryonic germ cells), 배아종양세포(embryonic carcinoma cells) 또는 유도전능줄기세포(induced pluripotent stem cells: iPSCs)이다. According to a preferred embodiment of the invention, the pluripotent stem cells are embryonic stem cells (embryonic stem cells), embryonic germ cells (embryonic germ cells), embryonic tumor cells (embryonic carcinoma cells) or induced pluripotent stem cells (induced pluripotent stem cells iPSCs).

바람직하게는 전능성 줄기세포는 배아줄기세포이다. Preferably, pluripotent stem cells are embryonic stem cells.

보다 바람직하게는, 본 발명에서 이용되는 전능성 줄기세포는 인간, 소, 말, 염소, 양, 개, 고양이, 마우스, 래트 또는 조류로부터 유래된 것이고, 가장 바람직하게는 인간 전능성 줄기세포이다. More preferably, the omnipotent stem cells used in the present invention are derived from humans, cattle, horses, goats, sheep, dogs, cats, mice, rats or birds, and most preferably human omnipotent stem cells.

보다 더 바람직하게는, 상기 세포 파퓰레이션은 전능성 줄기세포는 신경전구세포로 분화시킨 세포 파퓰레이션이며, 상기 세포 파퓰레이션은 비균질 신경전구세포를 포함한다. Even more preferably, the cell population is a cell population in which pluripotent stem cells are differentiated into neural progenitor cells, the cell population comprising heterogeneous neural progenitor cells.

본 명세서의 용어 ‘신경 로제트’는 인간 배아줄기세포의 신경분화 과정의 초기단계의 신경줄기세포를 말하며, 신경 로제트(neural rosette)는 원주형의 방사상 형태를 갖는다. 상기 신경 로제트는 Pax6 및 Sox1 같은 초기 신경외배엽(neuroectodermal)마커를 발현하는 세포로 구성되며, 다양한 뉴우론 세포 및 신경교세포로 분화할 수 있다. As used herein, the term 'nerve rosette' refers to neural stem cells at an early stage of the neural differentiation process of human embryonic stem cells, and neural rosette has a columnar radial form. The neural rosette is composed of cells expressing early neuroectodermal markers such as Pax6 and Sox1 and can differentiate into various neuronal cells and glial cells.

상기 ‘신경줄기세포’는 자기재생능 및 다분화능 세포로 신경계의 주된 세포를 생산한다. The 'nerve stem cells' produce the main cells of the nervous system as self-renewal and multipotent cells.

본 명세서의 용어 ‘세포 파퓰레이션’은 줄기세포가 신경 분화 자극에 의해 신경전구세포로 분화가 진행된 세포이다. As used herein, the term “cell population” is a cell in which stem cells are differentiated into neural progenitor cells by nerve differentiation stimulation.

상기 ‘신경 분화 자극’은 당업계에서 통상적으로 실시되는 방법들, 예를 들어, 무혈청 배지(Tropepe V et al., Direct neural fate specification from embryonic stem cells: A primitive mammalian neural stem cell stage acquired through a default mechanism. Neuron. 30:6578(2001)), FGFs(fibroblast growth factors), Wnt 및 RA(retinoic acid)와 같은 모르포겐(morphogens)의 처리(Ying QL et al. Conversion of embryonic stem cells into neuroectodermal precursors in adherent monoculture. Nat Biotechnol. 21:183186(2003))에 의해 분화 할 수 있으나, 이에 한정하지 않는다. The 'neural differentiation stimulation' is a method commonly performed in the art, for example, serum-free medium (Tropepe V et al., Direct neural fate specification from embryonic stem cells: A primitive mammalian neural stem cell stage acquired through a Neuron. 30: 6578 (2001)), treatment of morphogens such as fibroblast growth factors (FGFs), Wnt and retinoic acid (Ying QL et al. Conversion of embryonic stem cells into neuroectodermal precursors in adherent monoculture.Nat Biotechnol. 21: 183186 (2003)), but is not limited thereto.

바람직한 구현예에 따르면, 상기 비균질 신경전구세포는 CNS(central nervous system)-타입 신경전구세포 및 PNS(peripheral nervous system)-타입 신경전구세포를 포함한다. According to a preferred embodiment, the heterogeneous neuronal progenitor cells include central nervous system (CNS) -type neuronal precursor cells and peripheral nervous system (PNS) -type neuronal precursor cells.

본 명세서에 있어, 용어 ‘CNS-타입 신경전구세포’는 뉴우론(neuron), 올리고덴드로사이트(oligodendrocytes) 또는 성상세포(astrocytes)로 분화할 수 있다.In the present specification, the term 'CNS-type neuronal progenitor cells' may differentiate into neurons, oligoendrocytes or astrocytes.

본 명세서에 있어, 용어 ‘PNS-타입 신경전구세포’는 말초신경계를 이루는 세포들로 분화되는 신경능(neural crest)-타입 전구체이다. 신경능-타입 전구체는 주로 말초신경계를 이루는 신경세포를 만드는 전구세포이기는 하지만 중배엽성 세포들(예컨대, 지방세포 및 근육세포)들의 원시세포로 알려져 있어 PNS-타입 신경전구세포의 세포를 분리해 내는 과정이 요구된다.
As used herein, the term 'PNS-type neuronal progenitor cell' is a neural crest-type precursor that differentiates into cells that make up the peripheral nervous system. Neural crest-type precursors are known as primordial cells of mesodermal cells (eg, adipocytes and muscle cells), although they are primarily progenitor cells that make up nerve cells that make up the peripheral nervous system, separating the cells of PNS-type neural precursor cells. The process is required.

단계　(b)： 세포 파퓰레이션에 PSA - NCAM 　항체를 접촉 Step (b): on cell population Contact PSA - NCAM Antibodies

이어, 세포 파퓰레이션에 PSA-NCAM 항체를 접촉시킨다. The cell population is then contacted with PSA-NCAM antibody.

본 발명에서 이용되는 항체는 폴리클로날 또는 모노클로날 항체이며, 바람직하게는 모노클로날 항체이다.The antibody used in the present invention is a polyclonal or monoclonal antibody, preferably a monoclonal antibody.

PSA-NCAM에 대한 항체는 당업계에서 통상적으로 실시되는 방법들, 예를 들어, 융합 방법(Kohler and Milstein, European Journal of Immunology, 6:511-519(1976)), 재조합 DNA 방법(미국 특허 제4,816,56호) 또는 파아지 항체 라이브러리 방법(Clackson et al, Nature, 352:624-628(1991) 및 Marks et al, J. Mol . Biol ., 222:58, 1-597(1991))에 의해 제조될 수 있다. 항체 제조에 대한 일반적인 과정은 Harlow, E. and Lane, D., Using Antibodies : A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, New York, 1999; Zola, H., Monoclonal Antibodies : A Manual of Techniques, CRC Press, Inc., Boca Raton, Florida, 1984; 및 Coligan , CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY, Wiley/Greene, NY, 1991에 상세하게 기재되어 있으며, 상기 문헌들은 본 명세서에 참조로서 삽입된다. 예를 들어, 단일클론 항체를 생산하는 하이브리도마 세포의 제조는 불사멸화 세포주를 항체-생산 림프구와 융합시켜 이루어지며, 이 과정에 필요한 기술은 당업자에게 잘 알려져 있으며 용이하게 실시할 수 있다. 폴리클로날 항체는 PSA-NCAM 항원을 적합한 동물에게 주사하고, 이 동물로부터 항혈청을 수집한 다음, 공지의 친화성(affinity) 기술을 이용하여 항혈청으로부터 항체를 분리하여 얻을 수 있다.Antibodies to PSA-NCAM can be prepared by methods commonly practiced in the art, such as by fusion methods (Kohler and Milstein, European). Journal of (Clackson et al., Nature , 352: 624-628 (1991) and Marks et al., J. Immunology , 6: 511-519 (1976)), recombinant DNA methods (US Pat. No. 4,816,56) or phage antibody library methods . Mol Biol, 222:.. 58, can be prepared by 1-597 (1991)). The general process for manufacturing antibodies is Harlow, E. and Lane, D., Using Antibodies : A Laboratory Manual , Cold Spring Harbor Press, New York, 1999; Zola, H., Monoclonal Antibodies : A Manual of Techniques , CRC Press, Inc., Boca Raton, Florida, 1984; And Coligan, CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY , Wiley / Greene, NY, 1991, the disclosures of which are incorporated herein by reference. For example, the preparation of hybridoma cells producing monoclonal antibodies is accomplished by fusing an immortalized cell line with an antibody-producing lymphocyte, and the techniques necessary for this process are well known and readily practicable by those skilled in the art. Polyclonal antibodies can be obtained by injecting a PSA-NCAM antigen into a suitable animal, collecting antisera from the animal, and then isolating the antibody from the antisera using known affinity techniques.

본 명세서에서, PSA-NCAM을 언급하면서 사용되는 용어 “항체”는 PSA-NCAM에 대한 특이 항체로서, PSA-NCAM 단백질에 대해 특이적으로 결합하며, 완전한 항체 형태뿐만 아니라 항체 분자의 항원 결합 단편을 포함한다. As used herein, the term “antibody” as used to refer to PSA-NCAM is a specific antibody to PSA-NCAM, which specifically binds to PSA-NCAM protein and binds to antigen-binding fragments of antibody molecules as well as complete antibody forms. Include.

완전한 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 구조이며 각각의 경쇄는 중쇄와 다이설파이드 결합으로 연결되어 있다. 중쇄 불변 영역은 감마(γ), 뮤(μ), 알파(α), 델타(δ) 및 엡실론(ε) 타입을 가지고 서브클래스로 감마1(γ1), 감마2(γ2), 감마3(γ3), 감마4(γ4), 알파1(α1) 및 알파2(α2)를 가진다. 경쇄의 불변영역은 카파(κ) 및 람다(λ) 타입을 가진다 (Cellular and Molecular Immunology, Wonsiewicz, M. J., Ed., Chapter 45, pp. 41-50, W. B. Saunders Co. Philadelphia, PA(1991); Nisonoff, A., Introduction to Molecular Immunology, 2nd Ed., Chapter 4,pp. 45-65, sinauer Associates, Inc., Sunderland, MA (1984)). A complete antibody is a structure having two full-length light chains and two full-length heavy chains, each light chain linked by a disulfide bond with a heavy chain. The heavy chain constant region has gamma (gamma), mu (mu), alpha (alpha), delta (delta) and epsilon (epsilon) types and subclasses gamma 1 (gamma 1), gamma 2 ), Gamma 4 (gamma 4), alpha 1 (alpha 1) and alpha 2 (alpha 2). The constant region of the light chain has the kappa and lambda types (Cellular and Molecular Immunology, Wonsiewicz, MJ, Ed., Chapter 45, pp. 41-50, WB Saunders Co. Philadelphia, PA (1991); Nisonoff, A., Introduction to Molecular Immunology, 2nd Ed., Chapter 4, pp. 45-65, Sinauer Associates, Inc., Sunderland, MA (1984)).

항체 분자의 항원 결합 단편이란 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 의미하며, Fab, F(ab'), F(ab')₂ 및 Fv을 포함한다. 항체 단편 중 Fab는 경쇄 및 중쇄의 가변영역과 경쇄의 불변 영역 및 중쇄의 첫 번째 불변 영역(C_H1)을 가지는 구조로 1개의 항원 결합 부위를 가진다. Fab'는 중쇄 C_H1 도메인의 C-말단에 하나 이상의 시스테인 잔기를 포함하는 힌지 영역(hinge region)을 가진다는 점에서 Fab와 차이가 있다. F(ab')₂ 항체는 Fab'의 힌지 영역의 시스테인 잔기가 디설파이드 결합을 이루면서 생성된다. Fv는 중쇄 가변부위 및 경쇄 가변부위만을 가지고 있는 최소의 항체조각으로 Fv 단편을 생성하는 재조합 기술은 PCT 국제 공개특허출원 WO 88/10649, WO 88/106630, WO 88/07085, WO 88/07086 및 WO 88/09344에 개시되어 있다. 이중쇄 Fv(two-chain Fv)는 비공유 결합으로 중쇄 가변부위와 경쇄 가변부위가 연결되어 있고 단쇄 Fv(single-chain Fv)는 일반적으로 펩타이드 링커를 통하여 중쇄의 가변 영역과 단쇄의 가변 영역이 공유 결합으로 연결되거나 또는 C-말단에서 바로 연결되어 있어서 이중쇄 Fv와 같이 다이머와 같은 구조를 이룰 수 있다. 이러한 항체 단편은 단백질 가수분해 효소를 이용해서 얻을 수 있고(예를 들어, 전체 항체를 파파인으로 제한 절단하면 Fab를 얻을 수 있고 펩신으로 절단하면 F(ab')₂단편을 얻을 수 있다), 바람직하게는 유전자 재조합 기술을 통하여 제작할 수 있다.An antigen binding fragment of an antibody molecule means a fragment having an antigen binding function and includes Fab, F (ab ') 2, F (ab') ₂ and Fv. Fabs in the antibody fragment have one antigen-binding site in a structure having a variable region of a light chain and a heavy chain, a constant region of a light chain, and a first constant region (C _H1 ) of a heavy chain. Fab 'differs from Fab in that it has a hinge region that contains at least one cysteine residue at the C-terminus of the heavy chain C _H1 domain. The F (ab ') ₂ antibody is produced when the cysteine residue of the hinge region of the Fab' forms a disulfide bond. Recombinant techniques for producing Fv fragments with minimal antibody fragments having only heavy chain variable regions and light chain variable regions are described in PCT International Publication Nos. WO 88/10649, WO 88/106630, WO 88/07085, WO 88/07086, WO 88/09344. The double-chain Fv is a non-covalent bond, and the variable region of the heavy chain and the light chain variable region are connected to each other. The single-chain Fv generally shares the variable region of the heavy chain and the variable region of the short chain through the peptide linker Or directly connected at the C-terminus to form a dimer-like structure like the double-stranded Fv. Such an antibody fragment can be obtained using a protein hydrolyzing enzyme (for example, a Fab can be obtained by restriction of the whole antibody to papain, and F (ab ') ₂ fragment can be obtained by cleavage with pepsin) Can be produced through recombinant DNA technology.

단계(b)는 PSA-NCAM 항체를 세포 파퓰레이션에 처리하는 단계로, PSA-NCAM 항체는 CNS-타입 신경전구세포에 특이적으로 결합한다.
Step (b) is a step of processing the PSA-NCAM antibody to the cell population, the PSA-NCAM antibody specifically binds to CNS-type neuroprogenitor cells.

단계 (c): PSA - NCAM 항체 결합된 세포의 분리 Step (c): Isolation of PSA - NCAM Antibody Bound Cells

이어, PSA-NCAM 항체가 결합된 세포를 분리한다. PSA-NCAM 항체가 결합된 세포는 CNS-타입 신경전구세포이다. Then, the cells to which the PSA-NCAM antibody is bound are isolated. Cells bound to PSA-NCAM antibodies are CNS-type neuronal progenitor cells.

바람직한 구현예에 따르면, 단계 (c)에서 분리된 CNS-타입 신경전구세포는 로제트 타입 신경줄기세포(neural stem cell: NSC) 및 NSC^FGF ^/ ^EGF 특성을 모두 갖는다. According to a preferred embodiment, the CNS-type neuronal progenitor cells isolated in step (c) have both rosette type neural stem cells (NSC) and NSC ^FGF ^/ ^EGF properties.

상기 로제트 NSCs는 NSC^FGF ^/ ^EGF에 비해 훨씬 초기상태(primitive)의 신경전구세포로 모든 중추 및 말초신경계를 구성하는 세포들로 모두 분화할 수 있다. 세포신호 전달기전의 조절에 의해 특정 신경세포, 교세포로 분화할 수 있는 능력이 있으며 강한 세포분열능을 가지고 있어 동물모델에 이식하였을 경우 과증식에 의한 종양 형성이 관찰된다. 또한 PLZF 또는 DACH1같은 특정 단백질들이 발현되어 마커로 사용될 수 있다.The rosette NSCs are much more primitive neuroprogenitor cells than NSC ^FGF ^/ ^EGF and can differentiate into all the cells that make up the central and peripheral nervous system. It is capable of differentiating into specific neurons and glial cells by regulating cellular signal transduction mechanisms and has strong cell division ability. When transplanted into animal models, tumor formation due to hyperproliferation is observed. In addition, certain proteins such as PLZF or DACH1 can be expressed and used as markers.

반면에 NSC^FGF ^/ ^EGF는 분화능이 로제트 NSC에 비해 떨어져 일부 중추신경계를 구성하는 세포들로만 분화하며 특정 신경세포 및 교세포로의 분화유도가 힘든 경향이 있다. 또한 이식 시 종양 형성의 가능성이 매우 희박하다.On the other hand, NSC ^FGF ^/ ^EGF has a differentiation ability compared to rosette NSC, and differentiates only into cells constituting some central nervous system, and tends to induce differentiation into specific neurons and glial cells. There is also very little chance of tumor formation at the time of transplantation.

바람직하게는, 항체를 이용한 상기 세포 분리를 위해 형광-활성세포분류기(fluorescence-activating cell sorters: FACS), 자성활성세포분류기(magnetic activated cell sorter: MACS) 및 보체 매개성 용해(complement-mediated lysis) 방법을 이용하며, 보다 바람직하게는 MACS를 이용하여 실시한다. Preferably, fluorescence-activating cell sorters (FACS), magnetic activated cell sorters (MACS) and complement-mediated lysis for cell separation using antibodies. The method is used, and more preferably, MACS is used.

만일, 본 발명을 MACS를 이용하여 실시하는 경우, 본 발명은 다음과 같이 실시할 수 있다: If the present invention is implemented using MACS, the present invention can be implemented as follows:

본 발명에서 MACS는 직접적 표지방법 및 간접적 표지방법으로 실시할 수 있다.In the present invention, MACS can be implemented by a direct labeling method and an indirect labeling method.

예를 들어, 직접적 표지방법에 따라 MACS를 실시하는 경우, 자성입자에 결합된 PSA-NCAM 항체를 미분화 전능성 줄기세포에 결합시키고 이어 자성을 갖는 분리기(separator)에 적용하여 PSA-NCAM 항체가 결합된 미분화 전능성 줄기세포를 분리한다. For example, when MACS is performed according to a direct labeling method, PSA-NCAM antibodies bound to magnetic particles are bound to undifferentiated pluripotent stem cells and then applied to magnetic separators to bind PSA-NCAM antibodies. Undifferentiated omnipotent stem cells are isolated.

예를 들어, 간접적 표지방법에 따라 MACS를 실시하는 경우, 적합한 중개물질이 결합된 PSA-NCAM 항체를 미분화 전능성 줄기세포에 결합시킨다. 예컨대, 형광물질이 결합된 PSA-NCAM 항체를 미분화 전능성 줄기세포에 결합시킨다. 형광물질 이외에도, 중개물질은 스트렙타비딘, PSA-NCAM 항체의 Fc 부위에 특이성을 갖는 항체 및 아비딘을 포함한다. 중개물질이 결합된 PSA-NCAM 항체를 미분화 전능성 줄기세포에 결합시킨 다음, 자성입자에 결합되어 있고 상기 중개물질에 특이성을 갖는 항체를 처리한다. 그런 다음, 자성을 갖는 분리기(separator)에 적용하여 PSA-NCAM 항체가 결합된 미분화 전능성 줄기세포를 분리한다.For example, when MACS is performed according to an indirect labeling method, a PSA-NCAM antibody coupled with a suitable mediator is bound to undifferentiated omnipotent stem cells. For example, the PSA-NCAM antibody to which the fluorescent substance is bound is bound to undifferentiated omnipotent stem cells. In addition to fluorescent materials, mediators include streptavidin, antibodies having specificity to the Fc region of PSA-NCAM antibodies, and avidin. The PSA-NCAM antibody in which the mediator is bound is bound to undifferentiated pluripotent stem cells, and then the antibody is bound to the magnetic particles and treated with the antibody having specificity to the mediator. Then, it is applied to a magnetic separator (separator) to separate undifferentiated omnipotent stem cells to which the PSA-NCAM antibody is bound.

MACS는 기본적으로 면역자기 분리 과정에 따른 것으로서, 상기 과정의 일반적인 내용은 미합중국 특허 제 5,385,707 호, 제 5,541,072 호, 제 5,646,001 호, 제 6,008,002 호 및 제 6,153,411 호에 개시되어 있으며, 이용되는 자성 입자 또는 마이크로비드 및 분리기는 Miltenyi Biotech(독일연방국)에서 용이하게 구입할 수 있다.MACS is basically an immunomagnetic separation process, the general content of which is disclosed in United States Patent Nos. 5,385,707, 5,541,072, 5,646,001, 6,008,002 and 6,153,411, and the magnetic particles or micro Beads and separators are readily available from Miltenyi Biotech (Germany).

본 발명은 FACS를 이용하여 실시할 수 있다. FACS는 Flow Cytometry First Principles by Alice Longobardi Givan. ISBN 0471382248 및 Practical Flow Cytometry by Howard M. Shapiro. ISBN 0471411256에 개시된 방법에 따라 실시할 수 있다.The present invention can be practiced using FACS. FACS is Flow Cytometry First Principles by Alice Longobardi Givan. ISBN 0471382248 and Practical Flow Cytometry by Howard M. Shapiro. It may be carried out according to the method disclosed in ISBN 0471411256.

보다 더 바람직하게는 미분화 전능성 줄기세포의 분리는 MACS에 의해 실시한다. 보다 더욱 더 바람직하게는, 미분화 전능성 줄기세포의 분리는 간접적 표지를 이용하는 MACS에 의해 실시한다.Even more preferably, the isolation of undifferentiated pluripotent stem cells is performed by MACS. Even more preferably, isolation of undifferentiated omnipotent stem cells is performed by MACS using indirect labeling.

예를 들어, 형광물질로 표지된 PSA-NCAM 항체를 미분화 전능성 줄기세포에 결합시키고 이어 상기 형광물질에 특이적인 항체가 결합된 자성입자(또는 자성 마이크로비드)를 결합시키고, 그런 다음 분리기를 이용하여 미분화 전능성 줄기세포를 분리한다. 이 경우, 상기 PSA-NCAM 항체에 결합된 형광물질은 각각 다른 물질 또는 동일한 물질일 수 있다.For example, a PSA-NCAM antibody labeled with a fluorescent substance is bound to undifferentiated pluripotent stem cells, followed by binding magnetic particles (or magnetic microbeads) bound to the antibody specific for the fluorescent substance, and then using a separator. Undifferentiated omnipotent stem cells are isolated. In this case, the fluorescent materials bound to the PSA-NCAM antibodies may be different materials or the same materials, respectively.

이용 가능한 형광물질은 FITC(fluorescein isothiocyanate), PE(phycoerythrin), 에오신, 카르복시플루오르세인, 플루오르세인 아마이다이트, 로즈 벤갈, 다이라이트 플루오르, 메틸린 블루, 쿠마린 및 로다민을 포함하지만 이에 한정된 것은 아니다.Available phosphors include, but are not limited to, fluorescein isothiocyanate (FITC), phycoerythrin (PE), eosin, carboxyfluorescein, fluorescein amarite, rose bengal, dilite fluorine, methylene blue, coumarin and rhodamine .

본 발명에 따르면 상기 방법은 99% 이상의 신경전구세포 순수도(purity)를 나타낸다.
According to the invention the method exhibits at least 99% neural precursor cell purity.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 본 발명의 분리방법에 의해 신경전구세포를 제공한다. According to another aspect of the present invention, the present invention provides a neural precursor cell by the separation method of the present invention described above.

보다 바람직하게는, 상기 신경전구세포는 CNS-타입 신경전구세포이다. More preferably, the neural progenitor cells are CNS-type neural progenitor cells.

보다 더 바람직하게는, 상기 CNS-타입 신경전구세포는 로제트 타입 신경전구세포 및 NSC^FGF ^/ ^EGF 특성을 모두 갖는다.
Even more preferably, the CNS-type neural progenitor cells have both rosette type neural progenitor cells and NSC ^FGF ^/ ^EGF properties.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 본 발명에 의해 분리된 신경전구세포로부터 분화된 뉴우런을 제공한다.
According to another aspect of the present invention, the present invention provides neurons differentiated from the neural precursor cells isolated by the present invention described above.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 본 발명에 의해 분리된 신경전구세포로부터 분화된 올리고덴드로사이트를 제공한다.
According to another aspect of the present invention, the present invention provides oligodendrosite differentiated from the neural precursor cells isolated by the present invention described above.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 본 발명에 의해 분리된 신경전구세포로부터 분화된 성상세포를 제공한다.
According to another aspect of the present invention, the present invention provides astrocytes differentiated from the neural progenitor cells isolated by the present invention described above.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다: The features and advantages of the present invention are summarized as follows:

(a) 분화 과정 중에 생길 수 있는 변수에 의한 분화 수율이 일정하게 유지되지 못하는 단점을 극복할 수 있다.(a) It is possible to overcome the disadvantage that the yield of differentiation due to variables that may occur during the differentiation process is not kept constant.

(b) 세포의 계대가 진행되어도 신경전구세포의 특성이 유지될 수 있다. (b) The characteristics of neural precursor cells can be maintained even when the passage of cells is advanced.

(c) 기존의 방법과 비교하여 분화과정을 단축할 수 있으며 보다 순순한 분리방법을 제공한다. (c) Compared with existing methods, the differentiation process can be shortened and a more pure separation method can be provided.

(d) 본 발명의 분리방법에 의한 신경전구세포는 종양 형성능이 낮고 분화능 및 분열능이 우수한 신경전구세포로 기대된다.
(d) The neural progenitor cells according to the isolation method of the present invention are expected to be neuroprogenitor cells having low tumorigenicity, excellent differentiation and dividing ability.

도 1은 인간 전분화능 줄기세포로부터 신경전구세포로의 분화 유도를 보여준다. (a)는 인간 배아줄기세포로부터 신경전구세포로의 분화를 유도하기 위하여 dorsomorphin과 SB431542를 동시에 처리한 배아체(Embryoid bodies: EBs)의 모습을 보여준다. (b)는 배아체를 매트리겔 코팅된 배양기 바닥에 붙인 후 N2 배지에서 5-6일 동안 배양 중인 콜로니의 모습이다. 가운데 부분에 여러 개의 꽃모양을 나타내는 신경 로제트(neural rosette) 구조들이 관찰된다. (c)는 (b)사진의 박스부분을 확대한 사진으로, 개개의 신경 로제트 구조들이 붉은색 점선의 원으로 표시되어 있다. (d)는 신경전구세포의 전형적인 마커인 Sox1 및 Pax6로 염색한 후에 신경 로제트 구조부분을 확대하여 관찰한 사진으로 Sox1 및 Pax6는 전사인자로서 핵에 특이하게 위치하여 염색되어 핵에서 강하게 염색되어 겹쳐진 것을 볼 수 있다. (e)는 신경 로제트 구조의 가운데 루멘(lumen)부분에서 특징적으로 발현되는 Zo-1(초록색)이 확인됨을 보여준다. (f)는 신경전구세포의 또 다른 마커인 PSA-NCAM도 발현을 나타낸다.
도 2는 인간 전분화능 줄기세포로부터 분화유도 된 신경전구세포에서 관찰되는 PSA-NCAM 양성 및 음성세포를 보여준다. (a)는 분화 유도된 신경 로제트를 분리하여 N2B27 배지에서 배양 중인 세포에서 PSA-NCAM 항체로 면역염색을 해 보면 PSA-NCAM이 강하게 발현되는 신경 로제트 중심부세포와는 달리, 밖으로 이동해 나온 세포는 PSA-NCAM에 의해 염색되지 않는 것을 확인할 수 있었다. (b) 및 (c)는 MACS에 의해 분리된 PSA-NCAM 양성 및 음성세포들의 모습을 보여준다.
도 3은 MACS 후 분리된 PSA-NCAM 음성세포의 특성분석을 보여준다. (a)는 MACS 후 pass-through로 나온 PSA-NCAM 음성세포가 신경능 전구세포의 모습과 유사한 것을 보여주며, (b) 및 (c)는 신경능 전구세포의 특이적 마커인 AP2와 HNK-1 를 발현하는 것을 확인한 결과이다. (d)는 신경능 전구세포의 분화과정에 관련되어 있는 여러 전사인자들의 발현이 PSA-NCAM 양성세포에 비해 높은 것을 확인한 RT-PCR 결과를 보여준다.
도 4는 MACS 후 분리된 PSA-NCAM 양성세포의 특성분석을 분석한 결과이다. (a-b)는 MACS에 의해 분리된 후 PSA-NCAM 항체로 형광면역분석(FACS)을 한 결과 -85% 정도가 PSA-NCAM 양성으로 확인되었고, 이후 유지 배양하면서 그 비율은 -95% 로 높아진 결과이다. (c)는 Nestin과 Sox1으로 형광염색을 한 후 직접 카운팅을 한 결과 형광면역분석과 유사한 결과를 보여준다. (d-e)는 유지 배양중인 신경전구세포는 세포 모양의 큰 변화 없이 각종 신경전구세포 마커(Sox1/2, Nestin 및 Musashi1)들을 비슷한 수준으로 유지하고 있음을 확인한 면역형광염색법 결과이다. (f)는 신경전구세포 마커(Sox1 및 Pax6)의 발현을 RT-PCR을 통해서도 확인한 결과이다. 인간 텔로머레이즈 역전사효소(human Telomerase Reverse Transcriptase: hTERT)의 발현이 유지되었으며, 소 뇌(Fetal brain)의 cDNA는 대조군으로 사용하였다.
도 5는 MACS 후 유지 배양되는 신경전구세포의 자가재생산(self-renewal) 특성 및 정상 핵형의 유지를 확인한 결과이다. (a)는 분열되는 세포의 마커인 Ki67을 통한 면역염색 결과, 배양되는 신경전구세포는 계대가 진행되어도 그 분열능을 잃어버리지 않고 자가재생산 하는 것을 확인한 결과이며, (b)는 오랜 계대 배양 후에도 정상핵형을 유지하는 것을 확인한 결과이다.
도 6는 MACS 후 유지 배양되는 신경전구세포에서 SSEA4+ 세포의 존재 가능성 확인한 실험이다. MACS 후 초기에 유지 배양되는 신경전구세포에서 SSEA4로 표지되는 세포의 비율이 -7% 정도였으나 계대가 진행되면서 그 비율이 음성대조군의 비율(0.5% 수준)과 거의 유사한 0.7%로 확인되었다. 하지만 초기에 검출되는 약 7%도 미분화 세포라기보다는 초기 신경외배엽에서 확인되는 SSEA4+ 인 것으로 예측된다.
도 7는 MACS 후 유지 배양되는 신경전구세포 중 로제트 type NSC의 특성을 분석한 결과이다. (a)는 유지 배양되는 신경전구세포가 계대가 지속되어도 형태학적으로 로제트 구조를 유지하고 있으며, (b)는 로제트 type NSC 특이적 마커 (PLZF, DACH1, PLAGL1 및 NR2F)의 발현을 RT-PCR을 통해 확인한 결과이다. (c)는 특히 PLZF의 경우 계대가 지속될 때 그 발현을 면역형광염색법을 통해서 확인한 결과이다.
도 8는 MACS 후 유지 배양되는 신경전구세포 중 NSC^FGF ^/ ^EGF 의 특성을 분석한 결과이다. (a)는 유지 배양되는 신경전구세포는 NSC^FGF ^/ ^EGF 의 전형적인 마커들 중에 일부(PMP2 및 HOP)는 발현이 RT-PCR을 통해 검출되지 않으나, 일부 마커의 경우 (AQP4 및 S100b)는 발현이 확인되었다. 특히 S100b의 경우는 면역염색으로도 확인되는 바 (b)에서 볼 수 있듯이, NSC^FGF ^/ ^EGF 의 특성도 일부 보이는 것을 확인한 결과이다. 소 뇌의 cDNA를 양성대조군으로 사용하였다.Figure 1 shows the induction of differentiation from human pluripotent stem cells to neural progenitor cells. (a) shows the appearance of embryonic bodies (EBs) treated with dorsomorphin and SB431542 simultaneously to induce differentiation from human embryonic stem cells to neural progenitor cells. (b) shows the appearance of colonies incubated for 5-6 days in N2 medium after attaching the embryos to the bottom of the Matrigel coated incubator. In the center, several flower-like neural rosette structures are observed. (c) is an enlarged image of the box portion of (b), in which individual neural rosette structures are indicated by dotted red circles. (d) is an enlarged image of the structure of neural rosette after staining with Sox1 and Pax6, which are typical markers of neural precursor cells. Sox1 and Pax6 are specifically located in the nucleus as a transcription factor and stained strongly in the nucleus. You can see that. (e) shows that Zo-1 (green), which is characteristically expressed in the lumen part of the neural rosette structure, is identified. (f) also shows expression of PSA-NCAM, another marker of neural progenitor cells.
Figure 2 shows PSA-NCAM positive and negative cells observed in neural progenitor cells induced differentiation from human pluripotent stem cells. (a) shows differentiation-induced neuronal rosettes and immunostained with PSA-NCAM antibody in cells cultured in N2B27 medium. It was confirmed that it was not stained by -NCAM. (b) and (c) show the appearance of PSA-NCAM positive and negative cells isolated by MACS.
Figure 3 shows the characterization of isolated PSA-NCAM negative cells after MACS. (a) shows that PSA-NCAM negative cells pass-through after MACS are similar to those of neural progenitor cells, and (b) and (c) are AP2 and HNK- specific markers of neural progenitor cells. It is the result of having confirmed that 1 is expressed. (d) shows the results of RT-PCR confirming that the expression of several transcription factors involved in the differentiation of neuronal progenitor cells is higher than that of PSA-NCAM positive cells.
Figure 4 is the result of analyzing the characterization of PSA-NCAM positive cells isolated after MACS. (ab) was isolated by MACS, and after fluorescence immunoassay (FACS) with PSA-NCAM antibody, -85% was found to be PSA-NCAM positive, and the ratio was increased to -95% during maintenance. to be. (c) shows similar results with fluorescence immunoassay after fluorescence staining with Nestin and Sox1 and direct counting. (de) is the result of immunofluorescence staining to confirm that the neural progenitor cells in the maintenance culture maintain similar levels of various neural progenitor cell markers (Sox1 / 2, Nestin and Musashi1) without significant change in cell shape. (f) is a result of confirming the expression of neuroprogenitor markers (Sox1 and Pax6) through RT-PCR. The expression of human telomerase reverse transcriptase (hTERT) was maintained, and cDNA of the cerebellum (Fetal brain) was used as a control.
Figure 5 is a result confirming the maintenance of the self-renewal (self-renewal) characteristics and normal karyotype of the neural precursor cells maintained in culture after MACS. (a) is the result of immunostaining through Ki67, a marker of dividing cells, and the result of confirming that the neural precursor cells to be cultured do not lose their dividing ability even when passage is progressed, and (b) is even after long passage culture. This is a result confirming that the normal karyotype is maintained.
Figure 6 is an experiment confirming the presence of SSEA4 + cells in the maintenance of neuronal progenitor cells after MACS. The percentage of SSEA4-labeled cells in the neuroprogenitor cells maintained and cultured early after MACS was about -7%, but as passage progressed, the ratio was almost 0.7%, similar to that of the negative control group (0.5% level). However, about 7% initially detected is expected to be SSEA4 + found in early neuroectodermal rather than undifferentiated cells.
Figure 7 shows the results of analyzing the characteristics of rosette type NSC in the neuronal progenitor cells maintained after MACS. (a) morphologically maintains the rosette structure even when passage of the sustained culture neuronal progenitor cells, (b) RT-PCR expression of rosette type NSC specific markers (PLZF, DACH1, PLAGL1 and NR2F) This is the result confirmed through. (c) shows the results of immunofluorescence staining, especially when PLZF is passaged.
Figure 8 is the result of analyzing the characteristics of NSC ^FGF ^/ ^{EGF in} the maintenance of neuronal progenitor cells after MACS. (a) The maintenance of neuronal progenitor cells showed that some of the typical markers of NSC ^FGF ^/ ^EGF (PMP2 and HOP) were not detected through RT-PCR, but for some markers (AQP4 and S100b) Confirmed. In particular, in the case of S100b, as confirmed by the immunostaining (b), it is confirmed that the characteristics of NSC ^FGF ^/ ^EGF are also partially seen. Cerebellum cDNA was used as a positive control.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples. It is to be understood by those skilled in the art that these embodiments are only for describing the present invention in more detail and that the scope of the present invention is not limited by these embodiments in accordance with the gist of the present invention .

실시예Example

재료 및 방법Materials and methods

인간 줄기세포(hESC) 배양Human Stem Cell (hESC) Culture

인간 줄기 세포주 H9(Human Embryonic Stem Cell: hESC, P31-45, WiCell Inc, Madison, Wisconsin, 미국)를 20% KSR(Knockout Serum Replacement, Invitrogen, Carlsbad, 미국), 1×비필수 아미노산(Invitrogen, 미국), 0.1 mM β-머캅토에탄올(Sigma, St. Louis, MO, 미국) 및 4 ng/㎖ bFGF(basic fibroblast growth factor, Invitrogen, 미국)가 첨가된 DMEM-F12 배지에서 배양하였다. hESC 세포들을 유사분열적으로 정지된 STO(ATCC) 피더 세포층에서 성장시켰다. 5-7일 동안 매일 공지된 계대배양 방법[19]에 의하여 hESC 콜로니들은 신선한 피더 층에 옮겼다.
Human stem cell line H9 (Human Embryonic Stem Cell: hESC, P31-45, WiCell Inc, Madison, Wisconsin, USA) was replaced with 20% KSR (Knockout Serum Replacement, Invitrogen, Carlsbad, USA), 1 × non-essential amino acids (Invitrogen, USA ), 0.1 mM β-mercaptoethanol (Sigma, St. Louis, MO, USA) and 4 ng / ml bFGF (basic fibroblast growth factor, Invitrogen, USA) were added in DMEM-F12 medium. hESC cells were grown in mitotically stopped STO (ATCC) feeder cell layers. HESC colonies were transferred to fresh feeder layers by known subculture methods [19] daily for 5-7 days.

인간 전분화능 줄기세포의 신경전구세포 분화 유도Induction of Neuroprogenitor Cell Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells

30분 동안 IV형 콜라게나아제(Invitrogen, 미국)를 2 ㎎/㎖로 처리한 후 피더 세포층으로부터 hESC 콜로니를 분리시켜 배아체(embryoid bodies: EB) 형성을 하도록 하였으며, bFGF가 없는 ESC 배양 배지가 포함된 페트리 디쉬로 이동시켰다. EB를 형성시키는 동안, 5 의 DM(dorsomorphin, Sigma, 미국) 및 5-10 의 SB431542(Calbiochem, San Diego, CA, 미국)를 배지에 첨가하였으며, 약 4일 동안 매일 한번 배지를 교환하였다. 그 다음 EB를 20 ng/㎖ bFGF가 보충된 무혈청 신경분화배지(N2 배지 DMEM/F12 plus 1×N2 첨가제, Invitrogen, 미국)가 들어 있는 매트리겔(Matrigel, BD bioscience, Maryland, 미국)이 코팅된 35 ㎜ 배양 디쉬에 부착시켜 5-6일간 추가적으로 배양하였다. EB가 부착되어 형성된 콜로니의 중심부에는 뚜렷한 신경 로제트(neural rosette) 구조가 형성되는 것을 확인할 수 있는데 이를 해부현미경 상에서 가늘게 뽑은 파스퇴르 피펫(Pasteur pipette)을 이용해 물리적으로 분리해 낸 후, 200 p 피펫을 이용해 작은 덩어리들로 분쇄하여 다시 매트리겔이 코팅된 60 ㎜ 디쉬에 부착시켜 N2B27 배지에 (DMEM/F12에 1×N2 및 1×B27 첨가제 및 20 ng/㎖의 bFGF가 첨가된 배지)로 일주일간 추가 배양하였다.
After 30 minutes of treatment with type IV collagenase (Invitrogen, USA) at 2 mg / ml, hESC colonies were isolated from the feeder cell layer to form embryonic bodies (EB), and ESC culture medium without bFGF It was moved to the petri dish included. During the formation of EB, 5 DM (dorsomorphin, Sigma, USA) and 5-10 SB431542 (Calbiochem, San Diego, Calif., USA) were added to the medium and medium was changed once daily for about 4 days. EB was then coated with Matrigel (Matrigel, BD bioscience, Maryland, USA) containing serum-free neurodifferentiation medium (N2 medium DMEM / F12 plus 1 × N2 additive, Invitrogen, USA) supplemented with 20 ng / ml bFGF. It was attached to a 35 mm culture dish and further incubated for 5-6 days. In the center of the colonies formed by EB attachment, a clear neural rosette structure is formed, which is physically separated using a Pasteur pipette, which is finely drawn on an anatomical microscope, and then 200 p pipettes. Grind into small chunks and attach again to a Matrigel coated 60 mm dish and add to N2B27 medium for one week with 1 × N2 and 1 × B27 additive in DMEM / F12 and 20 ng / ml bFGF. Incubated.

자성면역분리법 (MACS)에 의한 PSA-NCAM 양성세포의 분리Isolation of PSA-NCAM Positive Cells by Magnetic Immunosorbent Assay (MACS)

N2B27 배지에서 일주일 간 추가 배양된 세포에 10 μM의 Y27632 (Calbiochem, 미국)을 1시간가량 처리한 다음 PBS(phosphate buffered saline)로 세척한 후, Accutase(Milipore, Messachusetts, 미국)를 약 15분간 처리하여 완전히 단일세포로 분리된 세포 현탁액을 만들었다. 그 후 MACS세포 분리 키트(Milteny, Bergisch Gladbach, 독일)로 제조사의 매뉴얼에 따라 항-PSA-NCAM-마이트로비드(Milteny, Cat#130-092-966)를 이용해 PSA-NCAM 양성세포를 분리하였다. 분리된 PSA-NCAM 양성세포 7-8×10⁶ 개를 매트리겔이 코팅된 60 mm 디쉬에 접종한 후 N2B27 배지로 배양하였다.
Cells further cultured for one week in N2B27 medium were treated with 10 μM of Y27632 (Calbiochem, USA) for 1 hour, washed with PBS (phosphate buffered saline), and then treated with Accutase (Milipore, Messachusetts, USA) for about 15 minutes. To make a cell suspension completely separated into single cells. Then MACS PSA-NCAM positive cells were isolated using anti-PSA-NCAM-Mitrobead (Milteny, Cat # 130-092-966) according to the manufacturer's manual with a cell separation kit (Milteny, Bergisch Gladbach, Germany). 7-8 × 10 ⁶ isolated PSA-NCAM positive cells were seeded on Matrigel-coated 60 mm dishes and cultured with N2B27 medium.

신경전구세포의 유지 배양 및 분화Maintenance and Differentiation of Neuroprogenitor Cells

세포가 배양 디쉬 바닥의 약 95%이상을 차지하게 되면 계대 배양을 실시하였다. 1 ㎖ Accutase를 3분간 처리한 다음 피펫을 이용해 2-3회 가볍게 피펫팅 해 준 다음 2 ㎖ PBS로 희석하였다. 1,500 rpm으로 2분간 원심 분리하여 상등액은 버리고 펠렛을 2 ㎖의 배지에 부유하여 같은 크기의 매트리겔이 코팅된 두 개의 배양 디쉬로 분주하였다. 배지는 매일 교환해 주었으며, 위와 같이 1 : 2의 비율로 약 2-3일에 한번씩 계대 배양하였다. 사용한 배지는 일반적으로 N2B27 배지를 사용하였다. 하지만 B27 첨가제가 생산 배치(Batch)에 따라 차이가 있어서 세포의 상태가 일정하게 유지가 되지 않는 경우가 종종 발생하는데 이때는 뉴로플렉스(Neuroplex) N2 및 G21 첨가제(Gemini, California, 미국)를 각각 N2 및 B27 첨가제 대신에 사용된 N2G21 배지를 N2B27 배지를 1:1로 섞은 배지(이하, NBG 배지)를 사용하여 해결하였다. 신경전구세포를 신경세포 혹은 교세포로 분화시키기 위해서는 유지 배양하던 신경전구세포를 매트리겔 젤이 코팅된 디쉬 혹은 커버슬립(coverslip) 위에 0.5-1×10⁵ cells/cm²로 부착시킨 다음 0.1% FBS(Fetal bovine serum)와 200 의 아스코르브산(ascorbic acid)를 첨가하고 다음 bFGF가 포함되지 않은 NBG 배지에서 약 2-3주간 더 배양하였다. 세포를 냉동보관 하기 위해서는 배양 중인 신경전구세포를 Accutase 처리 한 후 신경전구세포 냉동배지(N2B27 배지:DMSO(Demethyl sulfoxide):KSR=4:1:5)로 2×10⁶ cells 농도의 세포현탁액을 만들어 CryoFeezing 용기(Nalgene, Roschester, NY, 미국)에 담은 후 초저온냉동고(deep freezer)에 24시간 보관 후 액체질소 통에 보관하였다. 해동은 일반적인 N2B27 배지를 이용해 동물세포 해동법을 따랐다.
Subcultures were performed when the cells occupied about 95% or more of the bottom of the culture dish. After 1 minute Accutase treatment for 3 minutes and pipette 2-3 times using a pipette and diluted with 2 ㎖ PBS. The supernatant was discarded by centrifugation at 1,500 rpm for 2 minutes and the pellet was suspended in 2 ml of medium and dispensed into two culture dishes coated with Matrigel of the same size. The medium was exchanged daily, and passaged once every 2-3 days at a ratio of 1: 2 as above. In general, N2B27 medium was used. However, B27 additives often differ from one batch to the next, resulting in inconsistent cell conditions, with neuroplex N2 and G21 additives (Gemini, California, USA) as N2 and The N2G21 medium used in place of the B27 additive was solved using a medium mixed with N2B27 medium in a 1: 1 (hereinafter NBG medium). To differentiate neural progenitor cells into neural cells or glial cells, the neural progenitor cells that were maintained and cultured were attached at 0.5-1 × 10 ⁵ cells / cm ² on a matrigel gel-coated dish or coverslip, and then 0.1% FBS. (Fetal bovine serum) and 200 ascorbic acid (ascorbic acid) was added and then incubated for about 2-3 more weeks in NBG medium containing no bFGF. For cryopreservation of cells, Accutase treatment of cultured neural progenitor cells, and then use a cell suspension containing 2 × 10 ⁶ cells with N2B27 medium: DMSO (Demethyl sulfoxide): KSR = 4: 1: 5. It was placed in a CryoFeezing container (Nalgene, Roschester, NY, USA) and then stored in a deep nitrogen freezer (24 hours) deep liquid nitrogen container. Thawing was followed by animal cell thawing using normal N2B27 medium.

면역형광분석 (Fluorescence-activated cell sorting: FACS)Immunofluorescence (Fluorescence-activated cell sorting: FACS)

배양하던 세포를 Accutase로 단일세포로 완전히 분리한 다음 PBS로 1회 세척 후 2% BSA(bovine serum albumin)이 포함된 PBS로 4℃에서 5분간 블로킹하였다. 그 후 항-PSA-NCAM 항체(Milipore, 1:400) 및 항-SSEA4 항체(Santa Cruz, CA, 미국, 1:500)로 4℃에서 15분간 반응한 후 3회 PBS로 세척한 다음 2% BSA-PBS에 Alexa 2차 항체(Molecular Probe, Eugene, OR, 미국)로 10분간 4℃에서 반응하였다. 동일한 방법으로 3회 세척 한 다음 PBS 500 ㎕로 세포 현탁액을 만들어 FACS Caliber(BD bioscience)와 그 분석 프로그램으로 분석하였다.
The cultured cells were completely separated into single cells with Accutase, and then washed once with PBS, and then blocked with PBS containing 2% BSA (bovine serum albumin) for 5 minutes at 4 ° C. After reaction with anti-PSA-NCAM antibody (Milipore, 1: 400) and anti-SSEA4 antibody (Santa Cruz, CA, USA, 1: 500) for 15 minutes at 4 ° C., washed three times with PBS and then 2% BSA-PBS was reacted with Alexa secondary antibody (Molecular Probe, Eugene, OR, USA) for 10 minutes at 4 ° C. After washing three times in the same manner, the cell suspension was made with 500 µl of PBS and analyzed by FACS Caliber (BD bioscience) and its analysis program.

면역염색 및 정량 분석Immunostaining and Quantitative Analysis

30분간 4% 파라-포름알데히드-PBS를 이용하여 세포들을 고정시켰다. 1구획 당 0.01% 트리톤(Triton)×100/PBS(세포내 마커)으로 처리하고, 실온에서 1시간 동안 5% 당나귀 혈청(Calbiochem, CA, 미국) 혹은 2% BSA으로 블로킹 한 후 4℃에서 일차 항체로 12시간 반응하였다. 본 연구에서 이용한 세포내 마커인 일차항체는 다음과 같다: Cells were fixed with 4% para-formaldehyde-PBS for 30 minutes. Treatment with 0.01% Triton × 100 / PBS (intracellular marker) per compartment, blocked with 5% donkey serum (Calbiochem, CA, USA) or 2% BSA for 1 hour at room temperature, followed by primary at 4 ° C. The reaction was carried out for 12 hours. The primary antibodies, intracellular markers used in this study, are as follows:

Oct4(1:100, Santa Cruz Biotechnology, Santa-Cruz, CA, 미국); SSEA4 (Stage Specific Embryonic Antigen 4, 500, Santa Cruz Biotechnology); Sox1(1:200, Millipore, Billerica, MA, 미국); Pax6(1:200, DSHB, Iowa, IA, 미국), Nestin(1:1000, Millipore); α-페토프로틴(α-fetoprotein: AFP, :100, Santa Cruz Biotechnology); Tuj1(1:1000, Covance, Berkeley, CA, 미국); GFAP(Glial fibrillary acidic protein, 1:300, Millipore), O4(1:200, R&D systems), Musashi-1(1:200, R&D systems), Ki67(1:100, Novus Biologicals, Littleton, CO, 미국) Oct4 (1: 100, Santa Cruz Biotechnology, Santa-Cruz, CA, USA); Stage Specific Embryonic Antigen 4, 500, Santa Cruz Biotechnology (SSEA4); Sox1 (1: 200, Millipore, Billerica, Mass., USA); Pax 6 (1: 200, DSHB, Iowa, IA, USA), Nestin (1: 1000, Millipore); α-fetoprotein (α-fetoprotein: AFP,: 100, Santa Cruz Biotechnology); Tuj1 (1: 1000, Covance, Berkeley, CA, USA); GFAP (Glial fibrillary acidic protein, 1: 300, Millipore), O4 (1: 200, R & D systems), Musashi-1 (1: 200, R & D systems), Ki67 (1: 100, Novus Biologicals, Littleton, CO, USA )

일차 항체 반응 후, 결합시킨 일차 항체를 검출하기 위하여 형광(Alexa-Fluor 또는 594)-결합 2차 항체(Molecular Probes, Eugene, OR, 미국)를 이용하였다. 핵을 검출하기 위하여 DAPI (4-6-diamidino-2-phenylindole, Vector, Burlingame, CA, 미국)가 포함된 마운팅 용액을 이용하였다. 올림푸스 IX71 현미경과 DP71 디지털 카메라로 세포를 관찰하였으며, 이미지-프로 플러스 ver 5.1(Media Cybernetics, Silver Spring, MD, 미국)로 분석하였다. 독립적인 3번의 실험을 통해 얻어진 면역표지된 세포에 대해 7-8개의 임의표본 촬영을 통해 육안 혹은 MetaMorph (v.7.17, Molecular Devices, Sunnyvale, CA, 미국) 프로그램을 통해 카운팅 하여 정량적 평가를 실시하였다. 평균±표준오차로 값을 표현하였다. 통계적 유의성은 스튜던트 t-테스트 또는 SPSS 소프트웨어 버젼 12.0을 이용하는 One-Way ANOVA 테스트를 이용하였다.
After the primary antibody reaction, fluorescence (Alexa-Fluor or 594) -binding secondary antibodies (Molecular Probes, Eugene, OR, USA) were used to detect bound primary antibodies. In order to detect the nucleus, a mounting solution containing DAPI (4-6-diamidino-2-phenylindole, Vector, Burlingame, CA, USA) was used. Cells were observed with an Olympus IX71 microscope and DP71 digital camera and analyzed with Image-Pro Plus ver 5.1 (Media Cybernetics, Silver Spring, MD, USA). Quantitative evaluation of immunolabeled cells obtained from 3 independent experiments was visualized or counted through MetaMorph (v.7.17, Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA) program using 7-8 randomized samples. . Values are expressed as mean ± standard error. Statistical significance was used with the Student's t-test or the One-Way ANOVA test using SPSS software version 12.0.

RTRT -- PCRPCR 및 데이터 분석 And data analysis

제조사의 프로토콜에 따라 Easy-Spin total RNA 정제 키트(iNtRON Biotechnology, Seoul, 대한민국)을 이용하여 세포 내 존재하는 총 RNAs를 추출한 후, iScript cDNA 합성 키트(BioRad, Hercules, CA, 미국))를 이용하여 1 ㎍ RNAs를 역전사하였다. EmeraldAmp GT PCR 마스터 믹스(Takara Bio Inc, Shiga, 일본)를 이용하여 2700 Master Cycler(Applied Biosystems, 미국)에서 PCR 반응을 수행하였다. PCR의 조건은 다음과 같다: According to the manufacturer's protocol, using the Easy-Spin total RNA purification kit (iNtRON Biotechnology, Seoul, South Korea) to extract the total RNAs present in the cell, using the iScript cDNA synthesis kit (BioRad, Hercules, CA, USA) 1 μg RNAs were reverse transcribed. PCR reactions were performed in a 2700 Master Cycler (Applied Biosystems, USA) using an EmeraldAmp GT PCR master mix (Takara Bio Inc, Shiga, Japan). The conditions of PCR are as follows:

95℃ 3분(1 단계), 95℃ 60초, 55-58℃ 60초 및 72℃ 60초를 1사이클로 하여 총 30-38 사이클(cycles)(2단계), 72℃ 5분 최종 익스텐션(3단계). Total 30-38 cycles (2 steps), 95 ° C 3 minutes (1 step), 95 ° C 60 seconds, 55-58 ° C 60 seconds, and 72 ° C 60 seconds in one cycle, 72 ° C 5 minutes final extension (3 step).

반응이 끝난 샘플은 1% 아가로즈 젤(Agarose gel)에서 전기영동을 통해 분석하였고 이티디움 브로마이드(Ethidium Bromide)염색을 통해 젤 닥(Gel Doc) 시스템(Bio Rad, 미국)에서 증폭된 DNA 절편을 분석하였다. 적어도 3회 이상의 독립적인 실험을 통해 모든 데이터를 최종 확인하였으며, 사용된 프라이머의 서열은 표 1에 나타내었다.The reaction samples were analyzed by electrophoresis on 1% Agarose gel, and DNA fragments amplified in the Gel Doc system (Bio Rad, USA) by Ethidium Bromide staining. Analyzed. All data were finally confirmed by at least three independent experiments, and the sequences of the primers used are shown in Table 1.

타깃유전자Target gene 염기서열Base sequence 참고문헌references ActinActin 정방향Forward gctcttttccagccttccttgctcttttccagccttcctt 20 20 역방향Reverse cttctgcatcctgtcagcaacttctgcatcctgtcagcaa GAPDHGAPDH 정방향Forward accacagtccatgccatcacaccacagtccatgccatcac 21 21 역방향Reverse tccaccaccctgttgctgtatccaccaccctgttgctgta dHanddHand 정방향Forward agaagaccgacgtgaaagaggagaagaagaccgacgtgaaagaggaga 2222 역방향Reverse acacgggagtgtcctcttcgtattacacgggagtgtcctcttcgtatt SnailSnail 정방향Forward ctcctctacttcagcctcttctcctctacttcagcctctt 2222 역방향Reverse cttcatcaaagtcctgtgggcttcatcaaagtcctgtggg Foxd3Foxd3 정방향Forward caagcccaagaacagcctagtgaacaagcccaagaacagcctagtgaa 2222 역방향Reverse tgacgaagcagtcgttgagtgagatgacgaagcagtcgttgagtgaga Sox1Sox1 정방향Forward caatgcggggaggagaagtccaatgcggggaggagaagtc 2121 역방향Reverse ctctggaccaaactgtggcgctctggaccaaactgtggcg Pax6Pax6 정방향Forward ggcaacctacgcaagatggcggcaacctacgcaagatggc 2121 역방향Reverse tgagggctgtgtctgttcggtgagggctgtgtctgttcgg hTERThTERT 정방향Forward tgtgcaccaacatctacaagtgtgcaccaacatctacaag 23 23 역방향Reverse gcgttcttggctttcaggatgcgttcttggctttcaggat PLZFPLZF 정방향Forward ctatgggcgagaggagagtgctatgggcgagaggagagtg 2424 역방향Reverse tcaatacagcgtcagccttgtcaatacagcgtcagccttg DACH1DACH1 정방향Forward gtggaaaacacccctcagaagtggaaaacacccctcagaa 2424 역방향Reverse cttgttccacattgcacacccttgttccacattgcacacc PLAGL1PLAGL1 정방향Forward gcctcagtcacctcaaaagcgcctcagtcacctcaaaagc 2424 역방향Reverse cttaacctgtggggcaaagacttaacctgtggggcaaaga NR2FNR2F 정방향Forward acaggaactgtcccatcgacacaggaactgtcccatcgac 2424 역방향Reverse gatgtagccggacaggtagcgatgtagccggacaggtagc PMP2PMP2 정방향Forward caagctaggccaggaatttgcaagctaggccaggaatttg 2424 역방향Reverse ccacgcccttcattttacatccacgcccttcattttacat HOPHOP 정방향Forward gcattgacagcttcactccagcattgacagcttcactcca 2323 역방향Reverse ggaaatgctagccacaccatggaaatgctagccacaccat AQP4AQP4 정방향Forward ggaatttctggccatgcttaggaatttctggccatgctta 2424 역방향Reverse agacttggcgatgctgatctagacttggcgatgctgatct S100bS100b 정방향Forward aaagagcaggaggttgtggaaaagagcaggaggttgtgga 2424 역방향Reverse aggaaaggtttggctgctttaggaaaggtttggctgcttt

실험 결과Experiment result

인간 배아줄기세포로부터 효율적인 신경전구세포의 유도Efficient Induction of Neural Progenitor Cells from Human Embryonic Stem Cells

인간 배아줄기세포의 분화 과정에서 BMP 신호와 Activin/Nodal 신호를 각각 Dorsomorphin(5 ㎍/㎖)과 SB431542(5-10 ㎍/㎖)의 처리에 의해 억제를 하게 되면 신경 전구세포로의 분화 유도가 더욱 촉진이 된다[11]. 따라서 인간 배아줄기세포(H9)에서부터 배아체(Embryoid body; EB, 도 1a)를 만들고 dorsomorphin과 SB431542를 3-4일간 처리 한 후 매트리겔이 코팅된 배양 디쉬에 부착하였다. 배아줄기세포주 혹은 역분화 줄기세포주의 고유 분화 특성에 따라 분화가 더디게 진행되는 경우가 있는데 이런 경우 dorsormorphin과 SB431542를 처리하는 기간을 6-8 일 정도로 연장하면 해결이 가능하였다. 다음 5-6일간 bFGF(basic-fibroblast growth factor)와 인슐린이 추가로 첨가된 무혈청 신경분화배지(이후 N2 배지, 조성은 실시예의 ‘신경전구세포의 유지 배양 및 분화’에서 설명되어 있음)에서 배양을 하면 콜로니의 가운데 부분에 신경 로제트(neural rosette) 모양의 구조가 생긴다(도 1b-1c). 이 구조는 신경전구세포 특이적인 마커인 Pax6와 Sox1가 강하게 발현하며(도 1d), 꽃 모양 구조의 중심부인 루멘(lumen)에는 Zo-1이라고 하는 갭 결합(gap junction) 단백질이 강하게 발현되는 것이 면역염색을 통해 확인되므로 초기 신경전구세포 구조인 신경 로제트임을 확인할 수 있었다(도 1e). 신경 로제트 덩어리들을 해부 현미경 하에서 조심스럽게 분리하여 가벼운 피펫팅으로 작은 조각들로 부순 다음 다시 매트리겔이 코팅된 배양기에 재부착하여, bFGF와 EGF(epidermal growth factor)가 첨가된 N2B27 배지에서 일주일간 더 배양을 하면 로제트 구조를 유지하면서 신경전구세포가 활발히 증식한다. 이 상태의 신경전구세포 역시 Pax6와 Sox1이 강하게 발현이 되고 있으며, 다른 신경전구세포 마커인 PSA-NCAM에 대해 면역염색을 해 보아도 로제트 구조를 중심으로 PSA-NCAM이 강하게 발현하는 것을 확인할 수 있었다(도 1f).
Inhibition of BMP and Activin / Nodal signals by Dorsomorphin (5 µg / ml) and SB431542 (5-10 µg / ml), respectively, in the differentiation of human embryonic stem cells, induces differentiation into neural progenitor cells. Further facilitation [11]. Therefore, the embryonic body (EBryoid body; EB, Figure 1a) from human embryonic stem cells (H9) was made and treated with dorsomorphin and SB431542 for 3-4 days and then attached to the matrigel-coated culture dish. Differentiation may proceed slowly depending on the intrinsic differentiation characteristics of embryonic stem cell lines or dedifferentiated stem cell lines. In this case, prolongation of dorsormorphin and SB431542 to 6-8 days could be resolved. In serum-free neuronal differentiation medium (hereinafter N2 medium, composition further described in 'Maintenance Culture and Differentiation of Neural Precursor Cells') in the following 5-6 days with the addition of basic-fibroblast growth factor (bFGF) and insulin When cultured, a neural rosette-like structure is formed in the center of the colony (FIGS. 1B-1C). In this structure, Pax6 and Sox1, which are neuronal precursor cells-specific markers, are strongly expressed (FIG. 1D), and a gap junction protein called Zo-1 is strongly expressed in the lumen, which is the central part of the flower structure. Since it was confirmed through immunostaining, it could be confirmed that the neural rosette, which is the initial neural precursor cell structure (FIG. 1E). Carefully separate neural rosette masses under a dissecting microscope, crush into small pieces with light pipetting, and then reattach to matrigel-coated incubators for another week in N2B27 medium supplemented with bFGF and epidermal growth factor (EGF). When cultured, neural progenitor cells proliferate actively while maintaining the rosette structure. Pax6 and Sox1 are also strongly expressed in the neuroprogenitor cells in this state, and PSA-NCAM was strongly expressed centered on the rosette structure even by immunostaining for other neuroprogenitor cell markers, PSA-NCAM. 1f).

MACSMACS 법을 이용해 고수율로 With high yield PSAPSA -- NCAMNCAM 양성의 신경전구세포의 분리 Isolation of Positive Neural Progenitor Cells

이전의 연구결과들에서 로제트 구조를 이루는 세포들은 주로 중추신경계 (central nervous system: CNS)를 이루는 세포들로 분화되는 신경전구세포의 성질을 갖는다고 한다. 하지만 로제트의 가장자리 부분은 로제트 내부의 세포와는 달리 말초신경계(peripheral nervous system: PNS)를 이루는 세포들로 분화되는 신경능(neural crest) 타입의 전구체에서 확인되는 마커인 p75, HNK1 등이 발현된다고 한다[12]. 즉 로제트 구조를 아무리 육안으로 정교하게 분리하였다하더라도 세포 구성이 비균질 할 수 있다는 간접적 근거를 제시하고 있다. 본 실험에서도 분리된 신경 로제트 세포를 증식하는 과정에서 로제트 구조에서부터 이탈해 나온 일부 세포에서는 PSA-NCAM 항체에 의해 염색되지 않는 세포들이 일부 존재함을 확인할 수 있다(도 2a). 이러한 결과는 로제트 구조 밖으로 이탈해 나온 세포가 신경능 타입의 세포일 가능성이 있다는 점을 시사한다. 신경능 타입의 세포는 주로 말초신경계를 이루는 신경세포를 만드는 전구세포이기는 하지만 중배엽성 세포들(예컨대, 지방세포 및 근육세포)들의 원시세포라고도 알려져 있어, 향후 분화과정에서 이러한 세포들로 분화할 가능성 있으므로 이들을 분리해 내는 과정이 요구된다[12]. 따라서 본 실험에서는 신경 로제트의 내부구조를 이루는 세포들만을 선택적으로 분리하기 위하여 자성 비드가 결합된 PSA-NCAM 항체를 이용하여 MACS법을 통해 PSA-NCAM 양성 세포만을 선택적으로 분리하였다. MACS법은 일반적으로 형광면역분리법(Fluorescence-activated cell sorting; FACS)과 비교하여 세포 분리 과정 중 훨씬 세포에 손상을 덜 주며, 월등히 저렴한 비용으로 FACS법과 비슷한 효율로 원하는 혹은 원하지 않는 세포를 분리해 낼 수 있는 장점이 있다[13]. 간단히 그 과정을 설명하면 N2B27 배지에서 일주일간 증폭된 신경전구세포를 Accutase를 처리하여 단일세포 현탁액으로 만들고 자성 비드가 결합된 PSA-NCAM 특이적 항체와 반응시킨 후 자성에 의해 걸러진 세포만을 추출해 내는 방법이다. MACS 후 추출된 PSA-NCAM 양성세포를 매트리겔이 코팅된 배양기 바닥에 부착시키고 N2B27 배지에서 배양하면 신경전구세포의 전형적인 모양을 보이고 인접한 세포끼리 서로 모여서 다시 로제트와 유사한 구조를 형성하게 된다(도 2b). 반면에 PSA-NCAM 음성세포의 경우 신경능 전구세포의 전형적인 모습을 보이고 로제트와 같은 특별한 구조를 형성하지 않고 단일세포로 흩어져 자라고 있음을 확인하였다(도 2c). 또한 PSA-NCAM 음성세포는 신경능 전구세포의 마커인 AP2, HNK-1 및 p75 등이 강하게 염색되었고, Snail, dHand 및 FoxD3와 같은 신경능 전구세포의 분화과정에 관련된 유전자들이 PSA-NCAM 양성세포에 비해 더 많이 발현됨을 역전사-중합효소 연쇄반응 (reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR) 분석에 의해서 확인하였다(도 3a-3d). 결과적으로 인간 배아줄기세포로부터 BMP 및 Activin/Nodal 신호전달 기전의 억제를 통해 분화 유도된 신경전구세포들에서 MACS법을 통해 PSA-NCAM 양성세포들만을 선택적으로 분리하면 신경능 전구세포를 제외한 순수한 신경전구세포들이 분리될 수 있음을 확인하였다.
In previous studies, the cells that make up the rosette structure have the properties of neural progenitor cells that differentiate into cells that make up the central nervous system (CNS). However, unlike the cells in the rosette, the edge of the rosette expresses markers such as p75 and HNK1, which are found in neural crest-type precursors that differentiate into cells forming the peripheral nervous system (PNS). [12]. In other words, no matter how precisely the rosette structure is visually separated, indirect evidence suggests that cell composition may be heterogeneous. In this experiment, it can be seen that some cells which are separated from the rosette structure in the process of propagating the isolated neuronal rosette cells are not stained by the PSA-NCAM antibody. These results suggest that cells that escaped out of the rosette structure may be neuronal type cells. Neural crest type cells are known as primordial cells of mesodermal cells (eg adipocytes and muscle cells), although they are primarily progenitor cells that make up nerve cells that make up the peripheral nervous system. Therefore, the process of separating them is required [12]. Therefore, in this experiment, only PSA-NCAM positive cells were selectively isolated by MACS method using PSA-NCAM antibody in which magnetic beads were bound to selectively separate cells constituting the internal structure of neural rosette. The MACS method is generally much less damaging to the cells during the cell separation process compared to Fluorescence-activated cell sorting (FACS), and can separate the desired or unwanted cells with efficiency similar to that of the FACS method at a significantly lower cost. There is an advantage [13]. Briefly, the process of accumulating neuronal progenitor cells in N2B27 medium for one week to accutase into a single cell suspension, reacting with magnetic beads-bound PSA-NCAM-specific antibodies, and extracting only the cells filtered by magnetism to be. PSA-NCAM positive cells extracted after MACS were attached to the matrigel-coated incubator bottom and cultured in N2B27 medium, showing typical shapes of neural progenitor cells and adjacent cells gathered together to form a rosette-like structure again (FIG. 2B). ). On the other hand, PSA-NCAM negative cells showed typical appearance of neural crest progenitor cells and were scattered and grown into single cells without forming a special structure such as rosette (FIG. 2C). In addition, PSA-NCAM negative cells were strongly stained with AP2, HNK-1 and p75, markers of neural progenitor cells, and genes related to differentiation process of neural progenitor cells such as Snail, dHand and FoxD3 were PSA-NCAM positive cells. More expression was observed by reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) analysis (FIGS. 3A-3D). As a result, the selective separation of PSA-NCAM-positive cells by MACS from neural progenitor cells differentiated through the inhibition of BMP and Activin / Nodal signaling mechanisms from human embryonic stem cells, resulted in the pure neural progenitor cells excluding neural progenitor cells. It was confirmed that progenitor cells could be isolated.

분리된 신경전구세포의 증식 및 Proliferation of isolated neuronal progenitor cells and 유지배양Maintenance

MACS법에 의해 분리된 신경전구세포를 FACS법을 통해 그 수율을 확인해 보면 약 85%가 PSA-NCAM 양성 세포임을 확인할 수 있었다(도 4a). 또한 이 세포를 아래에 기술하는 방법에 의해 증식 배양하면 그 비율은 >94%로 증가하였다(도 4b). 세포 분리 후 매트리겔이 코팅된 배양 디쉬에 부착시킨 후 다른 신경 마커인 Nestin과 Sox1에 특이적인 항체를 이용해 면역 염색하여 관찰하니 육안으로도 전체 세포 중의 85% 이상임을 확인할 수 있다(도 4c). As a result of confirming the yield of neural progenitor cells separated by MACS method through FACS method, it was confirmed that about 85% were PSA-NCAM positive cells (FIG. 4A). In addition, when the cells were proliferated and cultured by the method described below, the ratio was increased to> 94% (FIG. 4B). After cell separation, the cells were attached to a matrigel-coated culture dish, and then immunostained using antibodies specific to nestin and Sox1, which are other nerve markers, to confirm that the naked eye was more than 85% of the total cells (FIG. 4C).

MACS법에 의해 분리된 신경전구세포는 60 mm 배양디쉬에 약 7-8×10⁶의 고밀도로 세포를 부착시켜 주어야 신경전구세포의 전형적인 모양을 잘 유지하면서 비교적 균일한 세포들로 유지할 수 있었다. 저밀도 (6×10⁶cells/60mm 디쉬 미만)으로 접종을 해주면 2-3일 후 배양되는 세포들에게서 신경능 전구세포의 모양(납작하고 세포체의 크기가 큰)을 보이는 세포들이 많이 관찰되었다. 고밀도로 부착시킨 후 다음날 혹은 그 다음날에 세포들이 자라 배양 디쉬 바닥을 95% 이상을 차지하게 되면 Accutase처리하여 단일 세포로 떨어뜨린 다음 1:2의 비율로 계대를 하였다. 같은 방법으로 5-6 계대가 지나면 균일한 세포 모양을 보이는 세포들이 비교적 안정된 세포 성장 속도로 유지할 수 있게 된다. 이 상태의 세포는 일반적인 세포 냉동 기법을 이용하여 액체질소에 보관하였다가 해동하여도 같은 상태를 유지할 수 있게 됨을 확인하였다. The neural progenitor cells isolated by MACS method had to be attached to the 60 mm culture dish at a high density of about 7-8 × 10 ⁶ to maintain relatively uniform cells while maintaining the typical shape of the neural progenitor cells. When inoculated at a low density (less than 6 × 10 ⁶ cells / 60 mm dish), the cells cultured after 2-3 days showed many cells showing the shape of neural progenitor cells (flat and large cell body). Accutase if cells grow more than 95% of the bottom of the culture dish the next day or the next day after high density adhesion. Treated, dropped into single cells and passaged at a ratio of 1: 2. In the same way, after 5-6 passages, cells with uniform cell appearance can be maintained at relatively stable cell growth rates. Cells in this state were stored in liquid nitrogen using a common cell freezing technique and confirmed that they could remain in the same state even after thawing.

반복적인 계대가 진행되어도 세포의 상태가 초기의 신경전구세포의 모양을 유지하는지 확인하기 위하여 약 10 계대 간격으로 신경전구세포 특이적인 마커 (Sox1, Sox2, Nestin 및 Musashi1)의 발현을 면역염색 후 정성, 정량분석을 통해 확인하였다. 그 결과 약 20 계대가 반복되어도 세포의 모양에는 큰 변화가 없었으며(도 4d) 각각의 마커 발현양에도 유의한 변화가 없음을 확인하였다(도 4e). RNA 전사체의 양을 RT-PCR을 통해 확인해 보았을 때에도 신경전구세포의 마커인 Sox1 및 Pax6의 발현양이 꾸준히 유지됨을 확인하였다(도 4f). 배양되는 신경전구세포가 활발히 세포분열을 통해 자기증식능을 유지하는지 확인해 보기 위하여 세포분열 여부를 확인할 수 있는 마커(Ki67)를 면역염색 후 정량적으로 확인해 본 결과 20 계대가 되어도 초기 계대(2-3계대)의 발현양에 비해 유의한 차이를 보이지 않았다(도 5a). 더구나 지속적인 세포분열능의 척도가 되는 텔로머레이즈 역전사효소(human Telomerase Reverse Transcriptase; hTERT)의 발현도 계대가 반복이 되어도 여전히 유지가 됨을 확인할 수 있었다(도 4e). 줄기세포는 시험관 내에서 지속적인 계대배양을 통해 염색체 이상을 나타낼 수 있다고 알려져 있다[14]. 유지 배양되고 있는 본 신경전구세포에서 염색체 이상이 나타나는지 여부를 확인하기 위해 염색체 핵형검사(karyotyping)를 실시해 본 결과 20 계대가 지난 세포에서도 정상적인 핵형을 유지하는 것을 확인하였다(도 5b). 이러한 실험적 근거들을 보아 본 방법에 의해 분리되어 계대 증식되는 신경전구세포는 고유의 마커 발현을 유지하면서 지속적으로 분열할 수 있으며 정상적인 핵형을 유지할 수 있는 세포임을 알 수 있다. 마지막으로 배양중인 세포에 신경전구세포 이외의 다른 세포가 섞여 있을 가능성을 확인해 보았다. 미분화 마커인 Oct4, 중배엽성 세포의 마커인 Brachyury 및 내배엽성 마커인 AFP의 발현 여부를 RT-PCR 및 면역염색을 통해 확인해 보았을 때 유지배양 중인 신경전구세포에서 검출이 되지 않았다. 하지만 혹시 모를 미분화 세포의 존재 가능성을 미분화세포를 확인하는 마커로 사용하는 SSEA4를 표식자로 FACS 분석을 해본 결과 MACS 분리 후 초기 계대의 세포에서 약 7% 정도의 세포가 양성으로 검출이 되나 약 10 계대 이후의 세포에서는 음성대조군과 견줄 만한 약 0.7%의 세포만이 양성으로 검출되었다(도 6). 이를 보아 초기 계대에서 검출되는 SSEA4 양성세포는 미분화 세포일 가능성 보다는 초기 신경전구세포의 표면에서 소량 검출되는 SSEA 항원 때문인 것으로 생각된다[15]. 또한 MACS법에 의해 분리 배양되는 PSA-NCAM 양성 신경전구세포에서는 신경능 분화에 관련된 마커들의 발현이 거의 검출이 되지 않는 것으로 처음 의도한 순수한 신경전구세포의 상태로 유지 배양되고 있음을 확인하였다(도 3d).
In order to confirm whether the cell state maintains the shape of the initial neural precursor cells even after repeated passages, the expression of neural precursor cell-specific markers (Sox1, Sox2, Nestin and Musashi1) is qualitatively after immunostaining at intervals of about 10 passages. , It was confirmed through quantitative analysis. As a result, even when repeated about 20 passages, there was no significant change in the shape of the cells (FIG. 4D) and there was no significant change in the amount of expression of each marker (FIG. 4E). When the amount of RNA transcript was confirmed through RT-PCR, it was confirmed that the expression levels of Sox1 and Pax6, which are markers of neural progenitor cells, were maintained steadily (FIG. 4F). In order to check whether the cultured neural progenitor cells actively maintain self-proliferative ability through cell division, a marker (Ki67) that can confirm cell division was quantitatively confirmed after immunostaining. There was no significant difference compared to the amount of expression) (Fig. 5a). In addition, it was confirmed that expression of telomerase reverse transcriptase (hTERT), which is a measure of continuous cell division capacity, was maintained even after repeated passages (FIG. 4E). Stem cells are known to show chromosomal aberrations through constant passage in vitro [14]. Chromosomal karyotyping was performed to confirm whether chromosomal abnormalities were observed in the present neuroprogenitor cells in maintenance culture, and it was confirmed that normal karyotype was maintained even after 20 passages (FIG. 5B). From these experimental evidences, neuroprogenitor cells separated and passaged by the present method can be continuously divided while maintaining intrinsic marker expression and are cells capable of maintaining a normal karyotype. Finally, it was confirmed that the cells in culture may be mixed with cells other than neural progenitor cells. Expression of undifferentiated marker Oct4, marker of mesodermal cells, Brachyury, and endogenous marker AFP was not detected by RT-PCR and immunostaining. However, FACS analysis using SSEA4, a marker for identifying undifferentiated cells, as a marker for identifying undifferentiated cells, revealed that about 7% of the cells in the early passages were positive after MACS separation. In the subsequent cells, only about 0.7% of cells comparable to the negative control group were detected as positive (FIG. 6). This suggests that the SSEA4 positive cells detected in the early passages may be due to the small amount of SSEA antigens detected on the surface of early neural progenitor cells rather than undifferentiated cells [15]. In addition, it was confirmed that in the PSA-NCAM positive neuronal progenitor cells isolated and cultured by the MACS method, the expression of markers related to neuronal differentiation was hardly detected and maintained in the state of pure neural precursor cells originally intended (Fig. 3d).

신경전구세포의 특성분석Characterization of neural progenitor cells

기존의 연구 결과에 따르면 인간 배아줄기세포로부터 분화한 신경전구세포는 크게 두 종류로 구분이 된다[8]. 그 중 하나는 로제트 타입의 신경줄기세포(rosette neural stem cells; rosette NSCs)이며 다른 하나는 bFGF와 EGF가 첨가된 신경분화배지에서 배양되고 있는 NSC, 즉 NSC^FGF ^/ ^EGF로 나뉜다. 두 세포 타입은 각기 독특한 분자 세포생리학적 특성을 지니는데 예를 들면 로제트 NSCs의 경우 NSC^FGF ^/ ^EGF에 비해 훨씬 초기상태(primitive)의 신경전구세포로 모든 중추 및 말초신경계를 구성하는 세포들로 모두 분화할 수 있다. 세포신호 전달기전의 조절에 의해 특정 신경세포, 교세포로 분화할 수 있는 능력이 있으며 강한 세포분열능을 가지고 있어 동물모델에 이식하였을 경우 과증식에 의한 종양 형성이 관찰된다. 또한 PLZF 또는 DACH1같은 특정 단백질들이 발현되어 마커로 사용될 수 있다. 반면에 NSC^FGF ^/ ^EGF는 분화능이 로제트 NSC에 비해 떨어져 일부 중추신경계를 구성하는 세포들로만 분화하며 특정 신경세포 및 교세포로의 분화유도가 힘든 경향이 있다. 또한 이식 시 종양 형성의 가능성이 매우 희박하며 S100b, AQP4 또는 PMP2 등의 단백질을 특이적으로 발현한다[8].According to the existing research results, neural progenitor cells differentiated from human embryonic stem cells are classified into two types [8]. One of them is rosette neural stem cells (rosette NSCs) and the other is divided into NSCs, NSC ^FGF ^/ ^EGF , which are incubated in neuronal differentiation medium with bFGF and EGF. Both cell types have distinct molecular cytophysiological properties, for example, rosette NSCs are primitive neuroprogenitor cells that are much more primitive than NSC ^FGF ^/ ^EGF , and all cells that make up the central and peripheral nervous system. Can differentiate. It is capable of differentiating into specific neurons and glial cells by regulating cellular signal transduction mechanisms and has strong cell division ability. When transplanted into animal models, tumor formation due to hyperproliferation is observed. In addition, certain proteins such as PLZF or DACH1 can be expressed and used as markers. On the other hand, NSC ^FGF ^/ ^EGF has a differentiation ability compared to rosette NSC, and differentiates only into cells constituting some central nervous system, and tends to induce differentiation into specific neurons and glial cells. In addition, the possibility of tumor formation at the time of transplantation is very slim and specifically expresses proteins such as S100b, AQP4 or PMP2 [8].

본 기술에 의해 분리, 유지 배양되고 있는 신경전구세포의 특성을 확인하기 위하여 위에서 기술한 두 가지 종류의 NSC를 구분할 수 있는 마커들의 발현을 면역염색과 RT-PCR을 통해 확인해 보았다. 우선 로제트 타입 NSC의 특성 중의 하나인 로제트 구조가 계대가 지속되어도 반복적으로 관찰하였다(도 7a). 특히 로제트 구조의 특징적인 세포들의 배치와 아울러 Zo-1의 특징적인 발현을 확인한바 구조적인 로제트 형성이 확인하였다(도 7a). 더욱이 로제트 NSC에 특징적으로 발현이 된다고 알려져 있는 PLZF, DACH1, NR2F 및 PLAGL1 등이 계대 진행여부에 관계없이 강하게 발현됨을 RT-PCR 분석을 통해 확인하였고, 특히 PLZF의 경우는 분석된 모든 계대의 세포에서 모두 잘 발현이 되는 것이 확인하였다(도 7b-7c). 따라서 본 기술에 의해 분리, 유지 배양되는 신경전구세포는 로제트 NSC의 특성을 가진 세포임을 알 수 있었다. 또한 NSC^FGF ^/ ^EGF의 특성을 가지고 있는지 여부를 확인하기 위하여 NSC^FGF ^/ ^EGF 특이적 마커인 PMP2, HOP, AQP4 및 S100b 등의 발현을 RT-PCR 분석을 통해 확인해 보았다. 그 결과 PMP2 및 HOP은 확인되지 않았으나 AQP4의 경우 아주 미량이, S100b의 경우는 상당한 양의 발현이 확인되었다(도 8a). 더욱이 S100b은 면역염색으로도 확인되었다(도 8b). 여기서 관찰된 놀라운 사실은 본 기술에 의해 분리, 유지배양 되고 있는 신경전구세포는 로제트 NSC의 특성 뿐 아니라 NSC^FGF ^/ ^EGF의 특성도 일부 보인다는 점이다. 이는 아마도 로제트 NSC와 NSC^FGF/EGF의 중간 정도 단계의 세포일 가능성을 보여주고 있다. 그렇다면 본 기술에 의해 분리 및 배양되는 신경전구세포는 아마도 두 세포의 장점(높은 분화능과 낮은 종양 형성능)을 모두 가진 세포라고 예측해 볼 수 있겠다.
In order to confirm the characteristics of neuronal progenitor cells isolated and maintained by the present technology, expression of markers capable of distinguishing the two types of NSC described above was confirmed through immunostaining and RT-PCR. First, the rosette structure, which is one of the characteristics of the rosette type NSC, was repeatedly observed even if passage was continued (FIG. 7A). In particular, the arrangement of the characteristic cells of the rosette structure as well as the characteristic expression of Zo-1 confirmed the structural rosette formation (FIG. 7A). Furthermore, it was confirmed by RT-PCR analysis that PLZF, DACH1, NR2F and PLAGL1, which are known to be characteristically expressed in Rosette NSC, were strongly expressed regardless of passage progression. All were well expressed (FIGS. 7B-7C). Therefore, the neural progenitor cells isolated and maintained by the present technology were found to be cells having the properties of Rosette NSC. In addition, NSC ^FGF ^/ ^EGF to determine whether it has the characteristics of NSC ^FGF ^/ ^EGF Expression of specific markers such as PMP2, HOP, AQP4 and S100b was confirmed by RT-PCR analysis. As a result, PMP2 and HOP were not confirmed, but in the case of AQP4, very small amount, and in the case of S100b, a considerable amount of expression was confirmed (FIG. 8A). Moreover, S100b was also confirmed by immunostaining (FIG. 8B). The surprising fact observed here is that the neural progenitor cells isolated and maintained by the present technology show some characteristics of NSC ^FGF ^/ ^EGF as well as those of Rosette NSC. This suggests that it is probably a medium cell between Rosette NSC and NSC ^{FGF / EGF} . If so, the neural progenitor cells isolated and cultured by this technique may be predicted to have the advantages of both cells (high differentiation and low tumorigenicity).

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
While the present invention has been particularly shown and described with reference to exemplary embodiments thereof, it is to be understood that the same is by way of illustration and example only and is not to be construed as limiting the scope of the present invention. It is therefore intended that the scope of the invention be defined by the claims appended hereto and their equivalents.

참조 문헌References

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18. Zhang S C, Wernig M, Duncan I D, Brustle O, Thomson J A, 2001, Nat.Biotechnol., 19, 1129-1133.
18. Zhang SC, Wernig M, Duncan ID, Brustle O, Thomson JA, 2001, Nat. Biotechnol., 19, 1129-1133.

19. Methods for expansion of human embryonic stem cells. Oh SK, Kim HS, Park YB, et al., Stem Cells. 2005 May;23(5):605-919. Methods for expansion of human embryonic stem cells. Oh SK, Kim HS, Park YB, et al., Stem Cells. 2005 May; 23 (5): 605-9

20. Robust enhancement of neural differentiation from human ES and iPS cells regardless of their innate difference in differentiation propensity. Kim DS, Lee JS, Leem JW, et al., Stem Cell Rev . 2010 Jun;6(2):270-81.
20.Robust enhancement of neural differentiation from human ES and iPS cells regardless of their innate difference in differentiation propensity. Kim DS, Lee JS, Leem JW, et al., Stem Cell Rev. 2010 Jun; 6 (2): 270-81.

21. Highly efficient and large-scale generation of functional dopamine neurons from human embryonic stem cells. Cho MS, Lee YE, Kim JY, et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 2008 Mar 4;105(9):3392-7.
21.Highly efficient and large-scale generation of functional dopamine neurons from human embryonic stem cells. Cho MS, Lee YE, Kim JY, et al., Proc Natl Acad Sci US A. 2008 Mar 4; 105 (9): 3392-7.

22. Generation of peripheral sensory and sympathetic neurons and neural crest cells from human embryonic stem cells. Pomp O, Brokhman I, Ben-Dor I, et al., Stem Cells . 2005 Aug;23(7):923-30.
22. Generation of peripheral sensory and sympathetic neurons and neural crest cells from human embryonic stem cells. Pomp O, Brokhman I, Ben-Dor I, et al., Stem Cells . 2005 Aug; 23 (7): 923-30.

23. Reprogramming of human somatic cells to pluripotency with defined factors.23. Reprogramming of human somatic cells to pluripotency with defined factors.

Park IH, Zhao R, West JA, et al., Nature . 2008 Jan 10;451(7175):141-6.
Park IH, Zhao R, West JA, et al., Nature . 2008 Jan 10; 451 (7175): 141-6.

24. Koch P, Opitz T, Steinbeck JA, et al., A rosette-type, self-renewing human ES cell-derived neural stem cell with potential for in vitro instruction and synaptic integration. Proc Natl Acad Sci U S A. 2009 Mar 3;106(9):3225-30.24. Koch P, Opitz T, Steinbeck JA, et al., A rosette-type, self-renewing human ES cell-derived neural stem cell with potential for in vitro instruction and synaptic integration. Proc Natl Acad Sci US A. 2009 Mar 3; 106 (9): 3225-30.

Claims

다음 단계를 포함하는 인간 유래 배아줄기세포(embryonic stem cells) 또는 iPSC(induced pluripotent stem cell)로부터 분화된 신경전구세포(neural precursor cells)의 분리 방법:
(a) 인간 유래 배아줄기세포(embryonic stem cells) 또는 iPSC를 신경 로제트(neural rosette)로 분화시켜 신경전구세포를 포함하는 세포 파퓰레이션을 얻는 단계;
(b) 상기 세포 파퓰레이션에 PSA-NCAM(poly-sialated neural cell adhesion molecule) 항체를 접촉시키는 단계; 및
(c) 상기 PSA-NCAM 항체에 결합된 세포를 분리하는 단계.
Isolation of differentiated neural precursor cells from human derived embryonic stem cells or induced pluripotent stem cells (iPSC) comprising the following steps:
(a) differentiating human-derived embryonic stem cells or iPSCs into neural rosettes to obtain cell populations including neural progenitor cells;
(b) contacting the cell population with a poly-sialated neural cell adhesion molecule (PSA-NCAM) antibody; And
(c) isolating the cells bound to the PSA-NCAM antibody.

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제 1 항에 있어서, 상기 세포 파퓰레이션은 비균질 신경전구세포를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
The method of claim 1, wherein the cell population comprises heterogeneous neuroprogenitor cells.

제 5 항에 있어서 상기 비균질 신경전구세포는 CNS(central nervous system)-타입 신경전구세포 및 PNS(peripheral nervous system)-타입 신경전구세포를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
6. The method of claim 5, wherein said heterogeneous neuronal progenitor cells comprise central nervous system (CNS) -type neuronal precursor cells and peripheral nervous system (PNS) -type neuronal precursor cells.

제 6 항에 있어서, 상기 PSA-NCAM 항체는 CNS-타입 신경전구세포에 특이적으로 결합하며 상기 단계 (c)에서 분리되는 세포는 CNS-타입 신경전구세포인 것을 특징으로 하는 방법.
The method of claim 6, wherein the PSA-NCAM antibody specifically binds to CNS-type neuroprogenitor cells and the cells isolated in step (c) are CNS-type neuroprogenitor cells.

제 7 항에 있어서, 상기 단계 (c)에서 분리된 CNS-타입 신경전구세포는 로제트 타입 신경줄기세포(neural stem cell: NSC) 및 NSC^FGF ^/ ^EGF 특성을 모두 가지는 것을 특징으로 하는 방법.
8. The method of claim 7, wherein the CNS-type neuronal progenitor cells isolated in step (c) have both Rosette type neural stem cells (NSC) and NSC ^FGF ^/ ^EGF characteristics.

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제 1 항에 있어서, 상기 방법은 99% 이상의 신경전구세포 순수도(purity)를 나타내는 것을 특징으로 하는 방법.
The method of claim 1, wherein the method exhibits at least 99% neuronal precursor cell purity.

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