KR100868329B1

KR100868329B1 - 효소를 이용한 고분지 아밀로오스 및 아밀로펙틴클러스터의 제조방법

Info

Publication number: KR100868329B1
Application number: KR1020070010737A
Authority: KR
Inventors: 박진희; 송상훈; 이강표
Original assignee: 씨제이제일제당 (주)
Priority date: 2007-02-01
Filing date: 2007-02-01
Publication date: 2008-11-12
Also published as: WO2008093911A1; US20100168061A1; KR20080072244A; CN101595226A; US20120296079A1; JP2010516289A; EP2115154A4; EP2115154A1

Abstract

본 발명은 효소를 이용한 고분지 아밀로펙틴 클러스터 및 고분지 아밀로오스를 제조하는 방법에 관한 것으로, 알파글루카노트랜스퍼레이즈 또는 브랜칭엔자임이 전분에 존재하는 아밀로펙틴 클러스터간의 연결사들을 가수분해하여 아밀로펙틴 클러스터를 생산하는 동시에 브렌칭엔자임이 아밀로오스에 분지측쇄사슬을 부착시켜 분지 아밀로오스를 제조하고, 여기에 말토제닉 아밀레이즈를 처리하여 상기로부터 생성된 아밀로펙틴 클러스터 및 분지 아밀로오스의 긴 측쇄를 절단하여 짧은 측쇄로 만드는 동시에 측쇄에 알파-1,6-결합으로 당을 전이시킴으로써 전분으로부터 고분지 아밀로펙틴 클러스터, 고분지 아밀로오스 또는 분지 올리고당을 효과적으로 제조할 수 있는 뛰어난 효과가 있다.

고분지 아밀로펙틴 클러스터, 고분지 아밀로오스, 말토제닉 아밀레이즈, 알파글루카노 트랜스퍼레이즈, 브랜칭엔자임

Description

효소를 이용한 고분지 아밀로오스 및 아밀로펙틴 클러스터의 제조방법{A method for preparing enzymatically highly branched-amylose and amylopectin cluster}

도 1은 BSMA(Bacillus stearothermophilus maltogenic amylase) 및 α-GTase(4-α-glucanotransferase) 또는 브랜칭엔자임(branching enzyme)을 이용하여 아밀로펙틴 또는 전분으로부터 고분지 아밀로펙틴 클러스터 및 고분지 아밀로오스를 제조하는 공정도를 도시하고 있다.

도 2는 바실러스 써틸리스(Bacillus subtilis)168에서 브랜칭엔자임의 클로닝에 관한 것이다.

도 3은 이 콜라이(E. coli) MC1061에서 생산된 바실러스 써틸리스 168 유래 브랜칭엔자임의 정제단계별 시료의 전기영동 사진도이다.

도 4는 브랜칭엔자임 재조합 단백질의 다양한 pH 조건에 따른 효소활성을 나타낸 것이다.

도 5는 브랜칭엔자임 재조합 단백질의 온도에 따른 활성을 나타낸 것이다.

도 6은 α-GTase를 이용하여 아밀로펙틴으로부터 클러스터를 제조할 때 분자량 감소를 SEC-MALLS를 이용하여 측정한 것이다.

도 7은 아밀로펙틴 클러스터 및 고분지 아밀로펙틴 클러스터의 측쇄길이 분포를 분석한 크로마토그램이다.

도 8은 분지 아밀로오스 및 고분지 아밀로오스의 측쇄길이 분포를 분석한 크로마토그램이다.

도 9는 아밀로펙틴 클러스터 및 분지 아밀로오스를 기질로 이용하고 BSMA를 작용시켜 고분지 아밀로오스와 고분지 아밀로펙틴 클러스터를 제조할 때 부차적으로 생기는 분지 올리고당의 TLC 크로마토그램이다.

본 발명은 효소를 이용한 고분지 아밀로오스 및 아밀로펙틴 클러스터의 제조방법에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 본 발명은 브랜칭엔자임 또는 알파글루카노트랜스퍼레이즈가 아밀로펙틴을 가수분해하여 아밀로펙틴 클러스터를 제조하고, 동시에 브랜칭엔자임이 아밀로오스에 당측쇄를 분지시켜 분지 아밀로오스를 제조하고, 상기로부터 생성된 아밀로펙틴 클러스터 및 분지 아밀로오스로부터 말토제닉 아밀레이즈의 당전이 작용을 이용하여 고분지 아밀로펙틴 클러스터, 고분지 아밀로오스 또는 분지 올리고당을 제조하는 방법에 관한 것이다.

수용성이 크며 장내에서 효소에 의한 분해가 천천히 이루어지며 갑작스런 혈당치의 상승을 막아주고, 지속적인 열량공급으로 인하여 운동능력향상의 효과를 줄 수 있는 신규 기능성 물질인 고분지 아밀로펙틴 클러스터 및 고분지 아밀로오스의 효과적인 제조가 요구되고 있다.

알파글루카노트랜스퍼레이즈 또는 브랜칭엔자임은 아밀로펙틴의 클러스터간 의 사이를 가수분해하여 아밀로펙틴 클러스터를 생산한다. 또한, 브랜칭엔자임은 아밀로오스에 처리하였을 때에는 분지 아밀로오스를 생산한다. 말토제닉 아밀레이즈는 전분을 주로 말토오스 단위로 가수분해함과 동시에 비환원성 말단에 당전이를 시킴으로써, 아밀로펙틴 클러스터 및 분지 아밀로오스의 비환원성 말단에 글루코오스 분자들이 적어도 하나 이상의 알파-1,6-결합으로 연결된 고분지 아밀로펙틴 클러스터 및 분지 아밀로오스를 생산한다.

따라서, 본 발명의 목적은 말토제닉 아밀레이즈와 알파글루카노트랜스퍼레이즈 또는 브랜칭엔자임을 이용하여 신규 기능성 물질인 고분지 아밀로펙틴 클러스터와 고분지 아밀로오스를 제조하고자 한다.

본 발명의 상기 목적은 바실러스 서틸리스(Bacillus subtilis) 168에서 분리된 브랜칭엔자임을 아밀로오스와 20~40℃에서 2 내지 6시간동안 반응시켜 분지 아밀로오스를 제조하고, 상기 분지 아밀로오스에 바실러스 스테아로써모필러스(Bacillus stearothmophilus)에서 분리된 말토제닉 아밀레이즈를 첨가하여 45~65℃에서 10~14시간 반응시켜 고분지 아밀로오스를 제조함으로써 달성하였다. 또한, 찹쌀전분에 써머스 스코토덕터스(Thermus scotoductus)에서 분리된 알파글루카노트랜스퍼레이즈를 가하여 65~85℃에서 10분 내지 1시간동안 반응시켜 아밀로펙틴 클러스터를 제조하고, 상기 아밀로펙틴 클러스터에 바실러스 스테아로써모필러스(Bacillus stearothmophilus)에서 분리된 말토제닉 아밀레이즈를 첨가하여 45~65℃에서 2~6시간 반응시켜 고분지 아밀로펙틴 클러스터를 생산함으로써 달성하였다.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 바실러스 서브틸리스 유래의 브랜칭엔자임 또는 써머스 스코토덕 터스 유래의 알파글루카노트랜스퍼레이즈를 전분 용액에 가하여 아밀로펙틴 클러스터 또는 분지 아밀로오스를 생산하는 단계와, 상기 아밀로펙틴 클러스터 또는 분지 아밀로오스에 바실러스 스테아로써모필러스 유래의 말토제닉 아밀레이즈를 첨가하여 고분지 아밀로펙틴 클러스터, 고분지 아밀로오스 또는 분지 올리고당을 생산하는 단계로 구성된다.

본 발명은 브랜칭엔자임 또는 알파글루카노트랜스퍼레이즈 및 말토제닉 아밀레이즈를 전분과 반응시켜 고분지 아밀로오스, 고분지 아밀로펙틴 클러스터 또는 분지 올리고당을 제조하는 방법을 제공함을 특징으로 한다.

상기 전분은 전분, 전분이 함유된 곡물 또는 아밀로펙틴과 아밀로오스에서 선택할 수 있다.

본 발명의 고분지 아밀로오스 제조방법은 바실러스 서브틸리스 유래의 브랜칭엔자임을 아밀로오스에 가하여 20~40℃에서 2 내지 6시간 동안 반응시켜 분지 아밀로스를 제조하는 단계와, 상기 분지 아밀로오스에 바실러스 스테아로써모필러스 유래의 말토제닉 아밀레이즈를 첨가하여 45~65℃에서 10~14시간 반응시는 단계를 포함함을 특징으로 한다. 또한, 본 발명의 고분지 아밀로펙틴 클러스터의 제조방법은 써머스 스코토덕터스 유래의 알파글루카노트랜스퍼레이즈를 찹쌀전분에 첨가하여 65~85℃에서 10분 내지 1시간동안 반응시켜 아밀로펙틴 클러스터를 제조하는 단계와, 상기 아밀로펙틴 클러스터에 바실러스 스테아로써모필러스 유래의 말토제닉 아밀레이즈를 첨가하여 45~65℃에서 2~6시간 반응시키는 단계를 포함함을 특징으로 한다.

본 발명에서 사용되는 알파글루카노트랜스퍼레이즈와 브랜칭엔자임 및 말토제닉 아밀레이즈는 통상의 효소로 천연형 원핵 또는 진핵생물로부터 분리 및 정제된 것 일수 있으며, 이의 유전자를 유전자 재조합 기술로 인위적으로 발현시켜 제 조한 것일 수 있다.

본 발명에서는 알파글루카노트랜스퍼레이즈의 경우 써머스 스코토덕터스(Thermus scotoductus)로부터 클로닝된 알파글루카노트랜스퍼레이즈 유전자를 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) ISW1214에 형질전환하여 발현 및 정제한 효소를 사용하였고, 브랜칭엔자임의 경우 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 168에서 클로닝된 브랜칭엔자임 유전자를 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)에 형질전환하여 발현 및 정제한 효소를 사용하며, 말토제닉 아밀레이즈의 경우 바실러스 스테아로써모필러스(Bacillus stearothermophilus)에서 클로닝된 말토제닉아밀레이즈 유전자를 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) LK87에 형질전환하여 발현 및 정제한 효소를 사용하였다.

상기 효소 중 브랜칭엔자임은 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 168로부터 분리 또는 유전공학적인 방법으로 제조될 수 있다. 본 발명에 따른 일 실시예에서 다음의 단계를 거쳐 브랜칭엔자임을 생산한다:

(a) 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 168에서 분리된 브랜칭엔자임을 코딩하는 DNA 서열을 벡터에 삽입하여 재조합 벡터를 제조하는 단계; (b) 상기 재조합 벡터를 숙주세포에 도입하여 형질전환체를 제조하는 단계; 및, (c) 상기 형질전환체를 배양하여 아밀레이즈를 생산하는 단계.

상기 (a) 단계에서, 브랜칭엔자임을 코딩하는 서열은 통상의 발현용 벡터, 예컨대 pET-22b(+) 벡터에 삽입하여 재조합 벡터를 제조할 수 있으나, 상기 발현용 벡터는 숙주세포의 종류에 따라 적합한 벡터를 선택하여 사용할 수 있다. 본 발명 에서는 일 실시예로 도 2의 DNA 개열지도를 갖는 p6xHTKNd 벡터를 제조하였다.

상기 (b) 단계는 형질전환하는 단계로, 숙주세포는 원핵생물, 진핵생물 또는 진핵생물 유래 세포일 수 있으며, 예컨대 대장균, 유산균, 효모, 곰팡이 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 형질전환방법은 통상의 공지방법으로 용이하게 실시할 수 있다.

상기 (c) 단계는 형질전환체를 배양하는 단계로, 숙주세포에 따라 적합한 배지를 선택할 수 있으며, 배양 조건 역시 숙주세포에 따라 달리 적용할 수 있다. 본 발명의 일 실시예로 제조한 에스케리치아 콜라이(Escherichia coli) MC1061은 가나마이신이 첨가된 LB배지에서 30~37℃에서 16~20시간 배양하면 다량의 브랜칭엔자임 재조합 단백질을 생산할 수 있다.

또한 브랜칭엔자임의 생산방법은 상기 (c) 단계 이후에, 형질전환체 균체로부터 아밀레이즈 재조합 단백질을 정제하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 정제단계는 형질전환체 균체를 파쇄하는 단계, 상등액을 취하여 니켈 친화성 크로마토그래피를 실시하는 단계를 포함할 수 있다.

상기한 브랜칭엔자임 생산방법은, 모균주를 이용한 생산방법에 비하여 배양온도를 낮추어 실시함으로써 미생물 배양비용을 줄일 수 있는 효과가 있으며 또한 효소의 생산성을 증가시킬 수 있다.

본 발명의 아밀레이즈는 통상의 공지된 방법으로 용이하게 제조할 수 있으며, 이는 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자에게 자명한 것이다.

상기 방법에 따라 제조된 고분지 아밀로펙틴 클러스터 및 고분지 아밀로오 스는 분자량 측정 및 고성능 이온교환 크로마토그래피로 확인한다. 또한, 제조된 고분지 아밀로펙틴 클러스터 및 고분지 아밀로오스는 SEC-MALLS(Size Exclusion Chromatography-Multi Angle Laser Light Scattering)를 이용하여 분자량을 측정하고 이소아밀레이즈와 반응하여 알파-1,6-결합을 절단한 후 고분지 아밀로펙틴 클러스터 및 고분지 아밀로오스의 조성을 고성능 이온교환크로마토그래피를 이용하여 동정할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 고분지 아밀로펙틴 클러스터는 다음의 반응을 통해 생산 및 확인할 수 있다:

호화된 찹쌀 전분에 50~100U/g(찹쌀 전분 1g당 50~100unit)의 알파클루카노트랜스퍼레이즈를 넣어 반응시켜 아밀로펙틴 클러스터를 생산하는 단계와,

상기 단계에서 반응정지시킨 반응액에 100~500U/g(아밀로펙틴 클러스터 1g당 100~500unit)의 말토제닉 아밀레이즈를 첨가시켜 45~65℃에서 2~6시간 동안 반응시켜 고분지 아밀로펙틴 클러스터를 생산하는 단계.

상기 각각의 단계에서 SEC-MALLS를 통해 분자량을 측정하면, 찹쌀 전분의 분자량인 약 10⁸에 비해 아밀로펙틴 클러스터의 분자량은 약 10⁵정도이고, 고분지 아밀로펙틴 클러스터는 약 10⁴정도의 분자량이 측정된다.

상기 아밀로펙틴 클러스터와 고분지 아밀로펙틴 클러스터에 0.2~1U/mg의 이소아밀레이즈(기질 1mg당 0.2~1unit)를 처리하여 45~60℃에서 24~48시간 동안 반응시켜 알파-1,6-결합을 절단한 후 고성능 이온교환크로마토그래피를 통해 조성을 확 인할 수 있다.

상기 고분지 아밀로펙틴 클러스터의 경우 DP값이 13개 이상일 경우 분지된 정도의 확인이 어려워 베타-아밀레이즈를 처리하여 분지된 조성을 확인하면, 분자량이 10⁴~ 10⁵이고 DP 6 ~ 23 길이의 알파-1,6-결합을 갖는 고분지 아밀로펙틴 클러스터가 생성된 것을 확인할 수 있다.

또한 본 발명의 일 실시예에 따르면, 고분지 아밀로오스는 다음의 공정을 통해 생산된다:

아밀로오스(감자 유래의 타입 III, 시그마)와 50~100U/mg의 브랜칭엔자임(기질 1mg당 50~100unit)을 반응시켜 분지 아밀로오스를 얻는 단계와,

상기 반응물에 0.2~1U/g의 말토제닉 아밀레이즈(기질 1mg 0.2~1unit)를 추가적으로 반응시켜 고분지 아밀로오스를 생산하는 단계.

상기 분지 아밀로오스와 고분지 아밀로오스에 0.2~1U/mg의 이소아밀레이즈(기질 1mg당 0.2~1unit)와 반응시켜 알파-1,6-결합을 절단하여 고성능 이온교환크로마토그래피를 실시하면, 알파-1,4-결합 이외에 DP 8~18의 새로운 알파-1,6-결합을 갖는 고분지 아밀로오스가 생성됨을 알 수 있다.

또한, 본 발명의 일 실시예에 따르면, 고분지 아밀로펙틴 클러스터 생산 시 반응 중에 생성되는 소당류들을 Whatman K5F 실리카겔 TLC 플레이트에서 분석하면 긴 말토올리고당류가 BDP 2개에서 5개 정도의 분지 올리고당으로 전환됨을 알 수 있다.

본 발명에서 “분지”라는 용어는 글루코오스들이 알파-1,4-결합으로 이루어진 것 이외에 알파-1,6-결합으로 가지를 쳐서 연결되어 있는 상태를 말한다. 또한, “DP”는 “degree of polymerization”의 약어로서 글루코오스의 개수를 의미한다. 본 발명에서는 이소아밀레이즈에 의해 알파-1,6-결합이 잘린 후의 글루코오스의 개수로 분지 상태로 있던 branch chain의 길이이다. 본 발명에서는 DP가 6이상인 것을 “고분지”된 것으로 정하였다.

또한, BDP는 "branched degree of polymerization"의 약어로서 분지 올리고당의 경우는 그 분자량이 작고 TLC 분석으로 분지 정도를 확인할 수 있으므로 이소아밀레이즈 처리 없이 BDP 갯수로 표시하였다.

본 발명은 고분지 아밀로오스 또는 고분지 아밀로펙틴 클러스터를 유효성분으로 포함하는 항당뇨, 항비만 또는 지속성 에너지 공급 효과가 있는 가공건강식품을 제공함을 특징으로 한다.

본 발명에서 “지속성 에너지 공급 효과가 있는”은 고분지된 아밀로펙턴 클러스터 또는 아밀로오스는 효소에 의한 가수분해가 느려 에너지를 지속적으로 공급할 수 있음을 뜻한다.

표 1에 따르면, 글루코아밀레이즈(알파-1,4-결합과 알파-1,6-결합을 모두 가수분해하나, 알파-1,4-결합에 대한 가수분해능이 더 큼)에 의한 아밀로펙틴 클러스터와 고분지 아밀로펙틴 클러스터의 가수분해 속도를 비교해 보면, 아밀로펙틴 클러스터가 글루코아밀레이즈에 의한 가수분해에 있어서 Kcat이 크고 Km이 작으므로 가수분해가 빠르게 일어남을 알 수 있다. Km이 작을수록 efficiency가 커서 기 질과의 결합이 강하고, 생성물을 잘 생성한다. 반면에, Km이 클수록 efficiency가 작아 기질과의 결합이 약하다. Kcat이 클수록 단위시간 당 기질을 생성물로 옮기는 분자수가 많다. 따라서, 고분지 아밀로펙틴 클러스터는 글루코아밀레이즈에 의해 천천히 끝까지 가수분해되는 것을 알 수 있다. 즉, 고분지 될수록 서서히 가수분해되면서 생성물을 만들어 내고 이에 따라 지속적으로 에너지를 공급할 수 있는 것이다.

이하 본 발명의 실시예를 기재한다. 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐 본 발명이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

[실시예]

실시예 1: 바실러스 서틸리스 168로부터 브랜칭엔자임의 클로닝 및 효소생산과 그 특성

1-1. 브랜칭엔자임 유전자 클로닝

브랜칭엔자임 유전자를 분리하기 위하여 정방향 프라이머 F-glgB (5'-GAAAGGATGATTCCATGGCCGCTGCCAGC-3', 역방향 프라이머 R-glgB (5'AAAGAGGAGAGATAAAAAGATGAAAAAACAATGTGTAGCCA-3'를 각각 제작하고, 이것을 바실러스 서틸리스 168 ATCC 23857D-5 염색체 DNA와 Ex Taq polymerase(다카라 슈조 코퍼레이션), Ex Taq buffer, dNTP mixture와 혼합하여 중합효소 연쇄반응(PCR)을 실시하였다. 중합효소연쇄반응은 코벳(Corbett)사의 US/7500 realtime PCR system을 사용하였다. 그 첫 번째 단계로 95℃에서 5분 동안 1회 반응시켜주었고, 두 번째 단계로 94℃에서 30초, 55℃에서 30초 72℃에서 3분간의 반응을 30번 반복하였다. 마지막 단계로 72℃에서 7분 동안 반응하였고, 4℃에서 4분 동안 식혀준 후 종합효소연쇄반응을 종결하였다. 이 과정을 통하여 약 1.8kb의 PCR산물을 수득하였고 상기 PCR산물은 제한효소 NcoI과 XhoI으로 처리하고, 이를 동일한 제한효소로 처리한 p6xHTKNd 발현벡터와 라이게이션하여 p6xHTKNDglgB를 제조하였다. 도 2에 p6xHTKNDglgB의 개열지도를 간략히 도시하였다. p6xHTKNDglgB 벡터는 브랜칭엔자임 유전자를 포함하며, 상기 브랜칭엔자임 유전자의 3' 말단에 6개의 부가적인 아미노산 잔기(6-Histidine)를 포함하고 있다.

형질전환을 위하여, 5㎖ LB 액체 배지에 숙주 세포인 이 콜라이(E. coli) MC1061(뉴 일글랜드 바이오랩 인코퍼레이션)을 접종하여 37℃에서 12시간 배양하고, 배양액 1.0㎖을 새로운 LB액체 배지 50㎖에 접종하여 600nm에서 흡광도가 0.5가 될 때까지 배양하였다. 배양액 1.5㎖을 4℃에서 원심분리(7000×g, 5분)하여 균체를 회수한 뒤 0.75㎖의 형질전환용액 (50mM CaCl₂)으로 현탁하여 얼음 속에서 30분간 방치하였다. 현탁액 0.15㎖에 500ng의 상기 라이게이션한 용액을 혼합하고, 얼음 속에서 1시간 방치한 후 42℃에서 2분간 열충격을 주었다. 여기에 0.8㎖의 LB 액체 배지를 넣고 37℃에서 1시간 배양시킨 후, 가나마이신(최종농도 100 mg/㎖)을 함유한 LB 한천 배지에 평판도말하여 내성을 보이는 균주를 1차 선별하였다.

1차 선별된 균주를 가나마이신이 포함된 LB 액체 배지 5㎖에 접종하여 37℃에서 12시간 배양하고, 원심분리하여 균체를 수득하였다. 플라스미드 분리 키트로 회수된 균체로부터 플라스미드를 분리하고 NcoI과 XhoI 제한효소로 절단하여, 약 1.8kb의 브랜칭엔자임 유전자가 포함되어 있음을 확인하였다.

1-2. 형질전환체 제조

상기에서 제조한 p6xHTKNDglgB 벡터를 이 콜라이 (E. coli) MC1061로 형질전환시킨 후 가나마이신 내성 균주를 선별하였다. 선별한 형질전환체는 암피실린이 함유된 LB 액체 배지 3L에 접종하여 37℃에서 16시간 배양하였다.

1-3. 정제

상기에서 선별한 형질전환주는 배양한 후 원심분리(4℃, 7,000×g, 30분)하여 균체를 회수하고, 300mM NaCl과 10mM 이미다졸이 함유된 50mM Tris-HCl 완충용액(pH 7.5)에 현탁한 후 초음파 분쇄하였다. 원심분리하여 상등액을 취하고, 70℃에서 20분간 열처리한 다음 원심분리(10,000×g, 30분)하여 상등액을 수득하였다. 상등액은 Ni-NTA 친화력 크로마토그래피에 주입하여 정제하였다(도 3 참조).

1-4. 효소 역가 및 pH 특성

50mM Tris-HCl 완충용액(pH 7.5)에 용해된 0.1% 아밀로오스 기질용액 25㎕를 50mM Tris-HCl 완충용액 25㎕에 넣고 30℃에서 20분간 반응시킨 후, 요오드-염산 용액을 넣어 반응정지 및 발색을 하여 660nm에서 흡광도를 측정하였다. 흡광도는 아밀로오스 표준 곡선과 비교하여 1분당 1㎍/㎖의 아밀로오스가 줄어들 때의 효소량을 1Unit으로 정하였다.

효소의 최적 pH를 결정하기 위해, 다양한 pH 범위의 베타-사이클로덱스트린 용액에 대한 상대적 역가를 측정하였다.

50mM 소듐아세테이트 완충용액(pH 4.0~6.0), 50mM 소듐포스페이트 완충용액(pH 6.0~8.0), 50mM Tris-HCl 완충용액(pH 7.0~10.0) 각각에 용해된 0.1% (w/v) 아밀로오스 기질용액 25㎕에 각각의 완충용액으로 희석된 기질용액 25㎕을 넣고 30℃에서 20분간 반응시켜, 상대적 효소활성을 측정하였다.

도 4는 브랜칭엔자임 재조합 단백질의 다양한 pH 조건에 따른 효소활성을 나타낸 것으로, 브랜칭엔자임은 pH 7.5에서 최적의 역가를 가지며 pH 9.0~10.0에서 50% 이상의 역가를 유지하였다.

1-5. 온도 특성

브랜칭엔자임의 최적온도를 결정하기 위해, 50mM Tris-HCl 완충용액(pH 7.5)에 용해된 0.1%(w/v) 아밀로오스 기질용액 25㎕에 25℃에서 60℃ 범위의 다양한 온도에서 5분간 열처리한 후 브랜칭엔자임 25㎕를 넣고 각각의 온도에서 20분간 반응시켜, 상대적 효소활성을 측정하였다.

도 5는 브랜칭엔자임 재조합 단백질의 온도에 따른 활성을 나타낸 것으로, 30℃에서 최적 역가를 보였다.

실시예 2: 아밀로펙틴 클러스터의 제조

2-1. 제조

전분은 찹쌀 전분을 사용하였다.

알파글루카노트랜스퍼레이즈는 써머스 스코토덕터스(Thermus scotoductus) ATCC 27978로부터 클로닝된 알파글루카노트랜스퍼레이즈 유전자를 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) ISW1214 (다카라 슈조 코퍼레이션)에 형질전환하여 이로부터 알파글루카노트랜스퍼레이즈를 발현시킨 다음 니켈 친화력 크로마토그래피로 정제하여 준비하였다.

찹쌀 전분을 25mM 포스페이트 완충용액(pH 6.5)을 이용하여 5% 용액을 준비하였고, 이를 끓는 물에서 20분간 유지시켜 호화시켰다. 호화된 전분 용액을 75℃에서 알파글루카노트랜스퍼레이즈를 100U/g(찹쌀 전분 1g당 100unit)을 넣어주고 30분간 반응시킨 후 반응정지를 위하여 반응액을 30분간 끓여주었다.

2-2 분자량 측정: SEC-MALLS(Size Exclusion Chromatography-Multi Angle Laser Light Scattering)

찹쌀 전분 0.5%(5mg/㎖)와 아밀로펙틴 클러스터 0.5%(5mg/㎖)을 준비하고 1시간 이상 끓여준 후 SEC-MALLS에 주입하여 분자량을 분석하였다. 사용된 MALLS는 와트 테크놀로지(Wyatt Technology)사의 MALLS 시스템을 사용하였고, 칼럼은 쇼덱스사의 SUGAR KS-806(8.0mmID×300mm)와 SUGAR KS-804(8.0mmID×300mm)을 연결하여 사용하였다. 도 6에 그 결과를 도시하였다.

실시예 3: 아밀로펙틴 클러스터로부터 고분지 아밀로펙틴 클러스터의 제조

3-1. 고분지 아밀로펙틴 클러스터의 제조

말토제닉 아밀레이즈는 바실러스 스테아로써모필러스(Bacillus stearothermophilus) KCTC 0114BP로부터 클로닝된 말토제닉 아밀레이즈 유전자를 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) LK87(고려대, 생명과학대학원. Improvement of the production of foreign proteins using a heterologous secretion vector system in Bacillus subtilis: effects of resistance to glucose-mediated catabolite repression. Mol Cells. 1997 Dec 31;7(6):788-94.)에 형질전환하여 이로부터 말토제닉 아밀레이즈를 발현시킨 다음 니켈 친화력 크로마토그래피로 정제하여 준비하였다.

실시예 1의 반응정지시킨 반응액에 말토제닉 아밀레이즈를 100U/g(아밀로펙틴 클러스터 1g당 100unit) 첨가시켜 55℃에서 4시간 동안 반응하였다. 반응 후 반응정지를 위하여 30분 이상을 끓여준 후 변성된 단백질을 제거하기 위해 12,000rpm에 20분간 원심분리하였고, 반응액에 남아있는 염을 제거하기 위하여 반응액을 양이온교환수지(C100FL, 푸롤라이트 코퍼레이션)와 음이온 교환수지(A400, 푸롤라이트 코퍼레이션)에 통과시켜 주었다. 그 후 잔당류를 제거하기 위하여 두 배 부피의 에탄올을 첨가하여 고분자의 당들을 침전시켰고 이것을 다시 원심분리하여 상층액은 제거하고 침전물만을 동결건조하여 분말화하였다.

3-2. 반응액의 고성능이온교환크로마토그래피의 분석

반응 후 생성된 아밀로펙틴 클러스터와 고분지 아밀로펙틴 클러스터의 측쇄 분포 및 조성을 확인하기 위하여 두 물질을 각각 25mM 소듐 아세테이트 완충용액 (pH 4.3)에 용해시켜 1% 용액을 만든 후, 이소아밀레이즈를 0.5U/mg(기질 1mg당 0.5unit)을 처리하여 60℃에서 48시간 동안 반응시켜 주었다. 알파-1,6-결합이 절단된 각각의 반응물을 고성능 이온교환크로마토그래피(GP40 gradient pump, 디오넥스 코퍼레이션)에 CaroboPAC^TM PA1 (4x50mm) 칼럼을 이용하여 분석하였다. 고분지 아밀로펙틴 클러스터의 경우, DP13 이상부터는 고성능 이온교환크로마토그래피로 분석 시 분지 된 부분의 구분이 난해하여 알파-1,6-결합이 절단된 고분지 아밀로펙틴 클러스터에 베타-아밀레이즈를 처리하여 분지된 부분의 분석을 용이하게 했다(도 7 참조).

실시예 4: 글루코아밀레이즈에 의한 고분지 아밀로펙틴 클러스터의 가수분해속도

기질로서 아밀로펙틴 클러스터와 고분지 아밀로펙틴 클러스터에 대한 아스퍼질러스 나이거(Aspergilus niger)에서 분리된 글루코아밀레이즈(플루카 바이오케미카)의 가수분해 속도를 각각 측정하였다.

50mM 소듐아세테이트 완충용액(pH 4.5)에 용해된 여러 농도의 기질용액 50㎕을 50℃에서 5분간 열처리한 후 글루코아밀레이즈 50㎕(0.3 U)을 넣고 60℃에서 5분 동안 30초 내지 1분 간격으로 20㎕씩 반응 시료를 취한 후, 0.1N NaOH 20㎕와 섞어 반응을 종결시켰다. 기질인 아밀로펙틴 클러스터나 고분지 아밀로펙틴 클러스 터가 가수분해되는 양은 GOD-POD방법(글루코오스 측정용 시약, 아산제약)을 이용하여 측정하였다.

표 1은 아밀로펙틴 클러스터와 고분지 아밀로펙틴 클러스터에 대한 글루코아밀레이즈의 가수분해 반응속도를 GOD-POD방법을 이용하여 분석한 후 정량한 결과를 나타낸 것이다.

	Km[mg/㎖]	kcat[s^-1]	kcat/Km[S^-1(mg/㎖)^-1]
아밀로펙틴 클러스터	1.14(±0.3)	52.4(±3.8)	45.9(±3.34)
고분지 아밀로펙틴 클러스터	4.15(±0.2)	45.9(±2.4)	11.1(±1.1)

실시예 5: 분지 아밀로오스와 고분지 아밀로오스의 제조

5-1. 분지 아밀로오스의 제조

분지 아밀로오스의 생산을 위해 90% DMSO(다이메틸 썰프옥사이드)에 용해시킨 0.2% 아밀로오스(감자 유래의 타입 III, 시그마) 10㎖을 준비하였다. 여기에 200mM Tris-HCl 완충액(pH 7.5) 10㎖을 섞어준 후, 브랜칭엔자임 50U/mg(기질 1mg당 50U)을 넣고 최종 반응액 부피가 40㎖이 되도록 증류수를 넣어주어 30℃에서 4시간 동안 반응시켰다. 반응 후 반응 정지를 위해 100℃의 끓는 물에서 10분간 가열하였다. 반응 후 다이메틸 썰프옥사이드와 염을 제거하기 위하여 두 배 부피의 100% 에탄올을 넣어주고 -20℃에서 30분 동안 저장한 후 4℃에서 12,000rpm으로 20분간 원심분리를 하여 분지 아밀로오스를 침전시키고 상층액은 제거하였다.

5-2. 고분지 아밀로오스의 제조

고분지 아밀로오스의 생산을 위하여 실시예 5-1의 반응물을 50mM 소듐 씨트레이트 완충액(pH 6.5)으로 잘 교반, 용해시킨 후, BSMA를 0.5U/mg(기질 1mg당 0.5Unit)을 넣어주고 50℃에서 12시간 동안 반응하였다. 반응 후 반응 정지를 위하여 100℃의 끓는 물에서 10분간 가열하였다. 가열 후 생성된 소당류들을 제거하기 위하여 두 배 부피의 100% 에탄올을 넣어주고 -20℃에서 30분 동안 저장한 후 4℃에서 12,000rpm으로 20분간 원심분리를 하여 고분지 아밀로오스를 침전시키고 상층액은 제거하였다.

5-3. 생산된 분지 아밀로오스 및 고분지 아밀로오스의 측쇄 분석

반응 후 생산된 분지 아밀로오스와 고분지 아밀로오스의 측쇄 분포 및 조성을 확인하기 위하여 두 물질을 각각 25mM 소듐 아세테이트 완충용액(pH 4.3)에 용해시켜 1% 용액을 만든 후, 이소아밀레이즈를 0.5U/mg(기질 1mg당 0.5unit)을 처리하여 60℃에서 48시간 동안 반응시켜 주었다. 알파-1,6-결합이 절단된 각각의 반응물을 고성능 이온교환크로마토그래피(GP40 gradient pump, 디오넥스 코퍼레이션)에 CaroPAC^TM PA1(4×50mm) 칼럼을 이용하여 분석하였다.

도 8에서 분지 아밀로오스와 비교하여 고분지 아밀로오스의 경우 분지된 부분이 새로 생성되었음을 알 수 있다.

실시예 6: 고분지 아밀로펙틴 클러스터 반응액의 분지올리고당 분석

고분지 아밀로펙틴 클러스터 생산 시 반응 중에 생성되는 소당류들을 분석하기 위하여 말토제닉 아밀레이즈와 아밀로펙틴 클러스터와의 반응에서 0.5, 1, 3, 5, 15시간 등 시간대별로 시료를 취하였다. 각각 취한 시료에 두 배 부피의 에탄올을 첨가하였고, -20℃에서 30분 동안 저장한 후 4℃에서 12,000rpm으로 20분간 원심분리를 하여 거대분자는 침전시키고 상층액만을 취하였다. 각각의 상층액은 얇은막 크로마토그래피 분석법에 의하여 분석되었다. 각 시료를 Whatman K5F 실리카겔 TLC 플레이트에 1㎕씩 로딩하고, 이소프로필 알코올, 에틸 아세테이트 및 증류수의 비가 3:1:1(v/v/v)인 전개용액에서 1회 전개시킨 후, 건조시켜 0.3%(w/v) N-(1-나프틸)-에틸렌다이아민과 5%(w/v) 황산을 함유한 메탄올에 담갔다 꺼낸 후 110℃ 오븐에서 10분 동안 발색시켰다.

도 9에 나타난 바와 같이, 반응 시간이 지나감에 따라 긴 말토올리고당류가 BDP 2개에서 5개 정도의 분지 올리고당으로 전환됨을 알 수 있다.

상기 실시예를 통해 살펴본 바와 같이, 본 발명은 효소를 이용한 고분지 아밀로펙틴 클러스터 및 고분지 아밀로오스를 제조하는 방법에 관한 것으로, 알파글루카노트랜스퍼레이즈 또는 브랜칭엔자임이 전분에 존재하는 아밀로펙틴 클러스터간의 연결사들을 가수분해하여 아밀로펙틴 클러스터를 생산하는 동시에 브렌칭엔자임이 아밀로오스에 분지측쇄사슬을 부착시켜 분지 아밀로오스를 제조하고, 여기에 말토제닉 아밀레이즈를 처리하여 상기로부터 생성된 아밀로펙틴 클러스터 및 분지 아밀로오스의 긴 측쇄를 절단하여 짧은 측쇄로 만드는 동시에 측쇄에 알파-1,6-결합으로 당을 전이시킴으로써 전분으로부터 고분지 아밀로펙틴 클러스터, 고분지 아밀로오스 또는 분지 올리고당을 효과적으로 제조할 수 있는 뛰어난 효과가 있다.

Claims

써머스 소코토덕터스(Thermus scotoductus) 유래의 알파글루카노트랜스퍼레이즈를 찹쌀전분에 가하여 65~85℃에서 10분 내지 1시간동안 반응시켜 아밀로펙틴 클러스터를 수득하는 단계;

상기 아밀로펙틴 클러스터에 바실러스 스테아로써모필러스(Bacillus stearothermophilus) 유래의 말토제닉 아밀레이즈를 첨가하여 45~65℃에서 2~6시간 반응시키는 단계를 포함함을 특징으로 하는 분자량이 10⁴~10⁵이고, 중합도(DP) 6~23의 알파-1,6-결합을 갖는 고분지 아밀로펙틴 클러스터의 제조방법.
바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 유래의 브랜칭엔자임을 아밀로오스에 가하여 20~40℃에서 2 내지 6시간동안 반응시켜 분지 아밀로오스를 수득하는 단계;

상기 분지 아밀로오스에 바실러스 스테아로써모필러스 유래의 말토제닉 아밀레이즈를 첨가하여 45~65℃에서 10~14시간 반응시키는 단계를 포함함을 특징으로 하는 알파-1,4-결합 이외에 중합도(DP) 8~18의 알파-1,6-결합을 갖는 고분지 아밀로오스의 제조방법.
제 1항 기재의 방법에 따라 제조된 고분지 아밀로펙틴 클러스터를 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 항당뇨, 항비만 또는 지속성 에너지 공급 효과를 갖는 가공건강 식품.
제 2항 기재의 방법에 따라 제조된 고분지 아밀로오스를 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 항당뇨, 항비만 또는 지속성 에너지 공급 효과를 갖는 가공건강 식품.
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