KR100866671B1

KR100866671B1 - 피부에 대한 레틴산의 효과를 모방하는 화합물을 함유하는피부 컨디셔닝 조성물

Info

Publication number: KR100866671B1
Application number: KR1020027017950A
Authority: KR
Inventors: 스튜어트 파톤 그레인져; 이안 리차드 스코트; 로버트 마크 도노반; 수잔느 테클리츠 요브스트; 리사 리카멜리
Original assignee: 유니레버 엔.브이.
Priority date: 2000-06-30
Filing date: 2001-06-25
Publication date: 2008-11-04
Also published as: JP2004501952A; US8226933B2; KR20030011937A; BR0112142A; CN1662216A; US20040043044A1; US8409550B2; CA2412788C; AU2001279687B2; CZ20024220A3; US20080234342A1; CN1662216B; WO2002002074A3; EP1333800B1; CA2412788A1; US20120258061A1; ZA200210288B; MXPA02012865A; ES2524559T3; AU7968701A

Abstract

본 발명은 0.0001％ 내지 약 50％의 레티노이드 부스터의 조합물과 약 0.001％ 내지 약 10％의 레티노이드를 조합하여 포함하는 스킨 케어 제품을 제공한다.

피부 컨디셔닝 조성물, 레틴산, 레티놀, 레티노이드, 부스터, 국소 적용

Description

피부에 대한 레틴산의 효과를 모방하는 화합물을 함유하는 피부 컨디셔닝 조성물 {Skin Conditioning Compositions Containing Compounds for Mimicking the Effect on Skin of Retinoic Acid}

본 발명은 피부에 대한 레틴산의 효과를 모방하는 특정 화합물을 함유하는 피부 미용 컨디셔닝 조성물에 관한 것이다.

레티놀 (비타민 A)은 인체에서 천연적으로 발생되는 내인성 화합물이며 정상적인 상피 세포 분화에 필수적인 것이다. 천연 및 합성 비타민 A 유도체는 다양한 피부 질환의 치료에 광범위하게 사용되어 왔으며 피부 회복제 또는 피부 재생제로서 사용되어 왔다. 레틴산은 다양한 피부 상태, 예를 들면 여드름, 주름, 건선, 노화성 반점 및 변색 치료에 사용되어 왔다. 예를 들어, 문헌 ([Vahlquist, A. et al., J. Invest. Dermatol., Vol. 94, Holland D.B. and Cunliffe, W.J. (1990), pp.496-498], [Ellis, C.N. et al., "Pharmacology of Retinols in Skin", Vasel, Karger, Vol. 3, (1989), pp.249-252], [Lowe, N. J. et al., "Pharmacology of Retinols in Skin", Vol. 3, (1989), pp.240-248], PCT 특허 출원 WO 93/19743) 등을 참조한다.

레티놀 에스테르 및 레티놀은 피부에서 다음의 메카니즘에 따라 효소적으로 레틴산으로 전환된다고 여겨진다:

본 발명은 특정 화합물들이 레티닐 에스테르 및 레티놀의 레틴산으로의 전환을 향상시킨다는 발견을 토대로 한다. 상기 화합물들은 총괄하여 "부스터 (boosters)"라 지칭하며, 특정 화합물의 부스팅 메카니즘에 따라 B1군 내지 B5군으로 분류한다. 상기 부스터 군의 메카니즘은 다음과 같다: ARAT/LRAT (아실보조효소A (AcylCoenzymeA) (CoA):레티놀 아실 트랜스퍼라제/레시틴:레티놀 아실 트랜스퍼라제) 활성 억제 (B1), 레티놀 데히드로게나제 활성 향상 (B2), 레티날 리덕타제 활성 억제 (B3), CRABP-II (세포의 레틴산 결합 단백질 II, Cellular Retinoic Acid Binding Protein II)와 레틴산의 결합 길항 (B4) 및 시토크롬 P450-의존성 레틴산 산화 억제 (B5).

부스터 단독 또는 부스터의 조합물은 레티노이드의 레틴산으로의 전환을 증가시키고 레틴산 분해를 방지함으로써 레티노이드의 작용을 강화시킨다. 부스터는 피부에 내재적으로 존재하는 레티노이드 (예를 들어 레티놀, 레티닐 에스테르, 레티날, 레틴산)과 함께 작용한다. 그러나, 바람직한 조성물은 성능을 최적화하기 위해 부스터 또는 부스터들의 조합물과 함께 조성물 중에 레티노이드도 포함한다.

그레인져 (Granger) 등의 여러 특허 문헌들은 레티놀 및 레티닐 에스테르의 효능 개선을 위한 미용 조성물 중 레티노이드 부스터들의 용도를 기재하고 있다 (미국 특허 제5759556호, 동 제5756109호, 동 제5747051호, 동 제5716627호, 동 제5811110호, 동 제5536740호, 동 제5747051호, 동 제5599548호, 동 제5955092호, 동 제5885595호, 동 제5759556호, 동 제5693330호). 이들 특허 문헌에 기재된 부스터는 클래스 B1 및 B5로 제한된다. 또한, 존슨앤존스(Johnson & Johnson)에 의한 일련의 특허 문헌들은 클래스 5의 부스터 분자에 속하는 분자들의 용도를 기재하고 있다 (미국 제5028628호, 동 제5037829호, 동 제5151421호, 동 제476852호, 동 제5500435호, 동 제5583136호, 동 제5612354호).

레티노이드 부스터로서 작용하는 분자들은 미용 제품에 통상적인 성분들이다. 미용 조성물 중 이들의 용도를 고려한 선행 기술들이 상당수 있다. 동일한 조성물 중 이들 분자 2종 이상의 용도를 고려한 선행 기술들도 꽤 있다. 이러한 선행 기술의 몇몇 예는 미국 제5,665,367호, 동 제5747049호, 동 제5853705호, 동 제5766575호 및 동 제5849310호 등에 기재되어 있다.

그러나, 선행 기술은 부스터 분자들의 조합에서 비롯되는 상승효과는 기술하지 않았다. 부스터 분자들의 조합으로 인해 레티노이드 활성이 상승작용적으로 (synergistic) 부스팅된다는 관찰 결과는 예상치 못했던 발견이었다. 선행 기술은 부스터 분자들의 최적 농도 또는 비율 또는 부스터 분자들 대 레티노이드의 비율에 관해서는 고려하지 않았다. 따라서, 본 발명은 미용제용 레티노이드를 부스터 분 자들과 가장 적절한 농도 또는 비율로 조합함으로써, 레티노이드의 효능을 실질적으로 개선시킨다는 점에서 신규하다.

본 발명에 사용하기에 적합한 부스터들의 클래스는 하기 표 B1 내지 표 B5에 열거한 부스터 등이 있으나, 이에 제한되지 않는다.

가장 우수한 군의 부스터들

B1 화합물

1. 지방산 아미드: 상업적으로 쉽게 입수할 수 있을 뿐 아니라 계면활성제로서의 잇점도 지니므로, 미용 제제에 적합한 에멀젼 생성에 도움이 됨

2. 세라미드: 각질층 장벽 (barrier) 세라미드의 전구체로서 작용할 수도 있음

3. 카로티노이드: 약간의 자외선 차단 효과를 제공하며 천연 착색제로서 작용할 수 있음

4. 플라바노이드: 천연 산화방지제

5. 고리형 방향성 물질 (fragrances): 상업적으로 쉽게 입수할 수 있을 뿐 아니라, 이를 사용하면 제품에 방향성을 부여할 수 있음

6. 비고리형 방향성 물질: 이를 사용하여 제품에 방향성을 부여할 수 있음

7. 인지질 유사체: 피부 세포에 의한 장벽 성분들 생성시에 이용될 수 있음

8. 우레아: 상업적으로 쉽게 입수할 수 있을 뿐 아니라, 제품에 대한 방부제로서도 작용함

B2 화합물

1. 포스파티딜 콜린: 레티놀 데히드로게나제의 가장 활성이 높은 활성제로서 가장 바람직함.

2. 스핑고마이엘린

B3 화합물

-아라키돈산, 리놀레산, 리놀렌산, 미리스트산: 각질층 장벽 유지에 유용할 수 있는 지방산

-리놀레산, 리놀렌산: 필수 지방산

-아라키돈산, 미리스트산: 비필수 지방산

-글리시레틴산: 식물 공급원으로부터 쉽게 수득되는 폴리시클릭 트리터펜 카르복실산

-포스파티딜 에탄올아민: 세포막으로 혼입될 수 있음.

B4 화합물

-헥사데칸디오산, 12-히드록시스테아르산, 이소스테아르산: 포화 지방산

-아마인유, 엘라이드산: 불포화 지방산

-엘라이드산, 이소스테아르산, 헥사데칸디오산: 실온에서 고체임

-아마인유, 12-히드록시스테아르산: 실온에서 액체임

B5 화합물

-비포나졸, 클림바졸, 클로트리마졸, 에코나졸, 케토코나졸, 미코나졸: 항균제 (Antimicotics)

-클림바졸: 상업적으로 쉽게 입수할 수 있음

-라우릴 히드록시에틸이미다졸린: 상업적으로 쉽게 입수할 수 있을 뿐 아니라 계면활성제로서의 잇점도 지니므로, 미용 제제에 적합한 에멀젼 생성에 도움이 되는 화합물

-퀘르세틴: 산화방지제 성질을 갖는 천연 발생 플라바노이드

-쿠마린: 천연 착색제

-퀴놀린, 이소퀴놀린

-메티라폰

본 발명은 부분적으로 약 0.0001 중량％ 내지 약 50 중량％, 바람직하게는 0.001 중량％ 내지 10 중량％, 가장 바람직하게는 0.001％ 내지 5 중량％의 부스터 또는 부스터들의 조합물 및 미용상 허용되는 비히클을 함유하는 피부 컨디셔닝 조성물을 포함한다.

본 발명의 조성물에 포함되는 부스터 또는 이의 조합물은

(a) B2, B3, B4로 이루어진 군에서 선택된 부스터,

(b) B1/B2, Bl/B3, B1/B4, B1/B5, B2/B3, B2/B4, B2/B5, B3/B4, B3/B5, B4/B5로 이루어진 군에서 선택된 부스터들의 2-원 조합물,

(c) B1/B2/B3, B1/B2/B4, B1/B2/B5, B1/B3/B4, B1/B3/B5, B1/B4/B5, B2/B3/B4, B2/B3/B5, B2/B4/B5, B3/B4/B5로 이루어진 군에서 선택된 부스터들의 3-원 조합물,

(d) B1/B2/B3/B4, B1/B2/B3/B5, B1/B2/B4/B5, B1/B3/B4/B5, B2/B3/B4/B5로 이루어진 군에서 선택된 부스터들의 4-원 조합물, 및

(e) 5개 군 부스터들의 조합물인 B1/B2/B3/B4/B5

로 이루어진 군에서 선택된다

바람직한 조성물은 레티노이드를 조성물의 약 0.001 중량％ 내지 약 10 중량％로 포함한다.

부스터로서 본 발명에 포함되는 화합물은 상기 화합물이 표 A에 열거한 특정 농도에서 하기의 <2.1> 내지 <2.7>에 기재한 바와 같은 특이적 효소에 대한 시험관내 분석을 통과하는 능력이 있느냐를 근거로 선택된다. 비록 본원에서 명시하지 않았다고 할지라도 이러한 부스터는 본 발명에 속한다. 다른 방법으로는, 화합물이 하기에 기재한 분석법에서 효소를 충분히 억제하거나 충분히 향상시키는 경우, 이는 레티노이드와 조합하여 각질세포 (피부 세포)에 대한 레틴산의 효과를 모방하는 작용을 할 것이므로, 본 발명의 범위에 포함된다.

본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "컨디셔닝"은 건성 피부, 여드름, 광손상된 피부, 주름의 발생, 노화성 반점, 피부 노화의 방지 및 치료, 각질층의 탄력성 증가, 피부색의 밝기 증가 (lightening), 피지 분비의 조절 및 일반적으로 피부의 질 향상을 의미한다. 상기 조성물을 사용하여 피부 박리 및 표피 분화를 개선시킬 수 있다.

본 발명의 제품에는 상기 선택된 화합물들이 존재하기 때문에 레티노이드의 성능이 실질적으로 개선된다.

본 발명의 조성물은 바람직한 성분으로서 레티닐 에스테르, 레티놀, 레티날 및 레틴산으로부터 선택된 레티노이드를 함유하며, 바람직하게는 레티놀 또는 레티닐 에스테르를 함유한다. 용어 "레티놀"은 모든-트랜스-레티놀, 13-시스-레티놀, 11-시스-레티놀, 9-시스-레티놀, 3,4-디데히드로-레티놀, 3,4-디데히드로-13-시스-레티놀, 3,4-디데히드로-11-시스-레티놀, 3,4-디데히드로-9-시스-레티놀과 같은 레티놀 이성질체를 포함한다. 바람직한 이성질체는 모든-트랜스-레티놀, 13-시스-레티놀, 3,4-디데히드로-레티놀, 9-시스-레티놀이다. 모든-트랜스-레티놀이 광범위하게 시판되고 있으므로 가장 바람직하다.

레티닐 에스테르는 레티놀의 에스테르이다. 용어 "레티놀"은 상기에서 정의하였다. 본 발명에 사용하기 적합한 레티닐 에스테르는 레티놀의 C₁-C₃₀ 에스테르, 바람직하게는 C₂-C₂₀ 에스테르, 가장 바람직하게는 C₂, C₃, 및 C₁₆ 에스테르인데, 이는 이들이 보다 수월하게 입수할 수 있기 때문이다. 레티닐 에스테르의 예로는 레티닐 팔미테이트, 레티닐 포르메이트, 레티닐 아세테이트, 레티닐 프로피오네이트, 레티닐 부티레이트, 레티닐 발레레이트, 레티닐 이소발레레이트, 레티닐 헥사노에이트, 레티닐 헵타노에이트, 레티닐 옥타노에이트, 레티닐 노나노에이트, 레티닐 데카노에이트, 레티닐 운데칸데이트, 레티닐 라우레이트, 레티닐 트리데카노에이트, 레티닐 미리스테이트, 레티닐 펜타데카노에이트, 레티닐 헵타데카노에이트, 레티닐 스테아레이트, 레티닐 이소스테아레이트, 레티닐 노나데카노에이트, 레티닐 아라키도네이트, 레티닐 베헤네이트, 레티닐 리놀리에이트 및 레티닐 올리에이트 등이 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에 사용하기 바람직한 에스테르는 레티닐 팔미테이트, 레티닐 아세테이트 및 레티닐 프로피오네이트로부터 선택되는데, 이는 이들이 상업적으로 가장 쉽게 입수할 수 있어서 가장 저렴하기 때문이다. 또한, 레티닐 리놀리에이트 및 레티닐 올리에이트도 이들의 효능으로 인해 바람직하다.

본 발명의 조성물 중 레티놀 또는 레티닐 에스테르의 사용량은 약 0.001％ 내지 약 10％, 바람직하게는 약 0.01％ 내지 약 1％, 가장 바람직하게는 약 0.01％ 내지 약 0.5％이다.

본 발명의 조성물의 필수 성분은 하기의 <2.1> 내지 <2.7>에 기재한 시험관내 분석을 통과하는 화합물이다. 본 발명에 사용하기 적합한 화합물은 표 A에 열거한 농도에서 효소를 표 A에 열거한 억제율(％) 이상으로 억제하거나 표 A에 열거한 증가율(％) 이상으로 향상시킨다.

제A장: 부스터의 확인

<표 A: 부스터 시험 농도 및 억제율(％)/증가율(％)>

ARAT / LRAT 분석 (B1 부스터를 확인하기 위한 분석)
본 발명	화합물 농도	억제율(％)
무난함	100 μM	> 10％
바람직함	100 μM	> 25％
가장 바람직함	100 μM	> 40％
최적	100 μM	> 50％

레티놀 데히드로게나제 분석 (B2를 확인하기 위한 분석)
본 발명	화합물 농도	증가율(％)
무난함	100 μM	> 10％
바람직함	100 μM	> 15％
가장 바람직함	100 μM	> 20％
최적	100 μM	> 25％

레티날 리덕타제 분석 (B3을 확인하기 위한 분석)
본 발명	화합물 농도	억제율(％)
무난함	100 μM	> 5％
바람직함	100 μM	> 10％
가장 바람직함	100 μM	> 20％
최적	100 μM	> 35％

CRABPII 길항제 분석 (B4를 확인하기 위한 분석)
본 발명	화합물: 레틴산 비율	억제율(％)
무난함	7,000 : 1	> 25％
바람직함	7,000 : 1	> 50％
가장 바람직함	70 : 1	> 25％
최적	70 : 1	> 50％

레틴산 산화 분석 (B5 부스터를 확인하기 위한 분석)
본 발명	화합물 농도	억제율(％)
무난함	100 μM	> 25％
바람직함	100 μM	> 45％
가장 바람직함	100 μM	> 70％
최적	100 μM	> 80％

화합물을 본 발명의 조성물에 포함시키는 것과 관련한 적합성을 결정하기 위해 사용한 시험관내 미소체 분석은 다음과 같다:

1. 재료

모든-트랜스-레티놀, 모든-트랜스-레틴산, 팔미토일-CoA, 디라우로일 포스파티딜 콜린, NAD 및 NADPH를 시그마 케미칼 캄파니 (Sigma Chemical Company)로부터 구입하였다. 미소체 분석을 위한 레티노이드 스톡 용액을 HPLC 등급의 아세토니트릴 중에 구성했다. HPLC 분석을 위한 모든 레티노이드 표준 스톡 용액을 에탄올 중에서 제조하여 N₂ 분위기하에 -70℃에 저장하였고, 저장고에서 꺼낼 때에는 어두 운 조명 (amber lighting)하에 얼음상에서 유지시켰다. 다른 화학물질 및 억제제는 알드리치 (Aldrich) 또는 인터내셔널 플레이버스 앤드 프래그런세스 (International Flavours and Fragrances) 등의 미용 재료 공급업체 또는 화학 회사로부터 구입할 수 있다.

2. 방법

2.1. RPE 미소체의 단리 ((1)로부터 변형시킴)

망막 및 방수를 제거하고 냉동시켜 절단한 소 안구 (eyecup) 50개를 미국 네브라스카주 링컨에 소재하는 더블유.엘. 로손 코포레이션 (W. L. Lawson Co.)으로부터 구입하였다. 상기 눈들을 밤새 해동시키고 겸자를 이용하여 색깔이 있는 홍채막 (iridescent membrane)을 벗겨내어 제거했다. 각각의 안구마다 실험용 브러쉬 또는 고무 채집기를 이용하여 짙은 색으로 착색된 세포를 문지르면서 차가운 완충액 (0.1 M P0₄/1 mM DTT/0.25 M 수크로스, pH 7) 0.5 ㎖로 2회 세척했다. 상기 세포 현탁액에 홍체막을 넣고, 이 현탁액을 수분 동안 비커에서 테프론 (Teflon) 교반 막대와 함께 교반시켰다. 상기 현탁액을 공극 크기가 큰 필터 (공극 크기: 925 μ, 스펙트라/포르 (Spectra/Por) 폴리에틸렌 메쉬)를 통해 여과하여 커다란 입자들을 제거했으며, 생성된 짙은 색상의 현탁액을 모터에 의해 구동되는 테프론 균질화기가 장착된 글라스-콜 (Glas-Col)을 이용하여 균질화시켰다.

상기 세포 균질화액을 20,000 g에서 30분 동안 원심분리했다 (SS34 로터를 사용한 소르발 (Sorvaal) 모델 RC-5B 원심분리기, 2.5 ×1O cm 튜브에 넣어 14,000 rpm에서 수행). 생성된 상층액을 60분 동안 150,OOO g에서 더 원심분리했다 (SW50.1 로터를 사용한 벡크만 (Beckman) 모델 L80 초원심분리기, 13 × 51 mm 튜브에 넣어 40,000 rpm에서 수행). 히트 시스템스 울트라소닉스, 인크. (Heat Systems Ultrasonics, Inc.)의 모델 W185D 소니파이어 셀 디스럽터 (Sonifier Cell Disruptor)를 이용하여, 상기에서 생성된 펠렛을 완충액 (0.1 M P0₄/5 mM DTT, 약 5 ㎖, pH 7) 중에 분산시키고, 생성된 미소체 분산물을 작은 튜브들에 분취하여 -70℃에서 저장했다. BSA를 표준물로서 사용하는 바이로래드 다이 (BioRad Dye) 결합 분석법을 통해 미소체의 단백질 농도를 측정했다.

2.2. 래트 간 미소체의 단리 (4)

냉동된 래트 간 대략 6 g (애큐레이트 케미칼 앤드 사이언티픽 코포레이션 (Accurate Chemical and Scientific Corp.)으로부터 구입한 할란 스프라그 돌리에서 수득함)을 3배 부피의 완충액 (0.1 M 트리스/0.1 M KCl/1 mM EDTA/0.25 M 수크로스, pH 7.4) 중에서 브린크만 폴리트론 (Brinkmann Polytron)을 사용하여 균질화했다. 생성된 조직 현탁액을 상기 모터에 의해 구동되는 테프론 균질화기를 통해 더욱 균질화시켰다. 생성된 균질화액을 10,000 g에서 30분, 20,000 g에서 30분, 30,000 g에서 15분씩 연속적으로 원심분리하고, 생성된 상층액을 80분 동안 105,000 g에서 초원심분리했다. 펠렛을 상기 기재한 바와 같은 완충액 (0.1 M P0₄/O.1 mM EDTA/5 mM MgCl₂, 약 5 ㎖, pH 7.4) 중에서 초음파 처리하고 분취하여 -70℃에서 저장했다. 상기 기재한 바와 같이 단백질 농도를 측정했다.

2.3. ARAT 및 LRAT 활성 분석 (B1을 확인하기 위한 분석)

하기한 방법은 문헌 (2)에 기재된 방법을 변형시킨 것이다. 완충액 (0.1 M PO₄/5 mM 디티오트레이톨, pH 7.0 (PO₄/DTT))을 제조하여 4℃에 저장했다. 분석 당일에, 완충액 1 ㎖ 당 BSA 2 mg을 첨가하여 P0₄/DTT/BSA 작동 완충액을 제조했다. 1 mM 레티놀 기질을 아세토니트릴 중에서 제조하고 갈색 병에 넣어 질소 기체하에 -20℃에 저장했다. 작동 완충액 중 4 mM 팔미토일-CoA 용액 (분취하여 저장함) 및 에탄올 중 4 mM 디라우로일 포스파티딜 콜린을 제조하여 -20℃에 저장했다. 억제제를 H₂0, 에탄올, 아세토니트릴 또는 DMSO 중 1O mM 스톡 용액으로 제조했다. 50 ㎍/㎖ 부틸화 히드록시톨루엔 (BHT)을 함유하는 순수한 에탄올을 사용하여 급냉용 용액을 제조하고, 50 ㎍/㎖ BHT를 함유하는 헥산 용액을 사용하여 추출했다.

2 dram 유리 바이알에, 아실 공여체 (4 mM 팔미토일-CoA 및(또는) 디라우로일 포스파티딜 콜린) 5 ㎕, 억제제 또는 용매 블랭크 (10 mM 스톡 또는 보다 희석시킨 희석물) 5 ㎕을 첨가한 후에 RPE 미소체 단백질을 대략 15 ㎍ (약 1 mg/㎖의 미소체 단백질 분취액 대략 15 ㎕) 첨가하고, P0₄/DTT/BSA 완충액을 이용하여 총 부피 500 ㎕로 구성했다. 상기 혼합물을 5분 동안 37℃에서 인큐베이션시켜 반응 온도로 맞춘 후에 1 mM 레티놀 5 ㎕을 첨가했다. 바이알의 뚜껑을 닫고 5초 동안 볼텍싱했다가 30 내지 90분 동안 37℃에서 인큐베이션시켰다. 에탄올/BHT 0.5 ㎖을 첨가하여 반응물을 급냉시켰다. 상기 튜브에 헥산/BHT 3 ㎖을 첨가하고 수초 동안 여러 회 볼텍싱했다가 저속에서 5분 동안 원심분리하여 층들이 신속하게 분리되도 록 함으로써 레티노이드를 추출했다. 상부층의 헥산을 깨끗한 바이알로 덜어 내고, 상기 기재한 바와 같은 헥산/BHT를 3 ㎖ 더 사용하여 수성층을 재추출했다. 헥산층을 합하고, 이를 37℃에서 질소 기류하에 가열된 알루미늄 블록상에서 건조시켜 헥산을 증발시켰다. 건조시킨 잔류물은 HPLC 분석시까지 -20℃에 저장해 두었다. 하기에 기재한 바와 같이, HPLC 신호를 통합하여 레티닐 팔미테이트 및 레티닐 라우레이트의 양을 각각 ARAT 및 LRAT 활성에 대해 정량하였다.

인큐베이션 용액은 40 μM 아실 공여체, 100 μM 이하의 억제제, 10 μM 레티놀, 대략 30 ㎍/㎖의 미소체 단백질 및 거의 0.1 M의 P0₄/pH 7/5 mM DTT/2 mg/㎖ BSA를 함유한다는 것을 인식해야 한다. 레티놀 첨가 이후의 모든 단계는 빛을 차단하거나 어두운 조명하에 수행하였다.

2.4. 레티놀 데히드로게나제 활성에 대한 분석 (B2를 확인하기 위한 분석)

하기의 스톡 용액들을 제조하였다:

멸균 여과한 50 mM KH₂PO₄, pH 7.4 완충액,

DMSO 중 10 mM 모든-트랜스-레티놀 (시그마 R7632),

멸균수 중 200 mM 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 포스페이트, 나트륨 염 (NADP) (시그마 N0505),

적절한 용매 (물, 완충액, 에탄올, 클로로포름 또는 DMSO) 중 40 mM 시험 화합물,

50 mM KH₂PO₄, pH 7.4 완충액 중 래트 간 미소체의 1 : 10 희석물 (4 ㎍/㎕).

나사형 뚜껑이 있는 2 dram 유리 바이알에

희석된 미소체 25 ㎕ (최종 = 100 ㎍) (- 끓인 미소체를 대조군으로 사용하였으며, 통상의 미소체를 시험 샘플로 사용하였음),

200 mM NADP 4 ㎕ (최종 = 2 mM),

40 mM 시험 화합물 1 ㎕ (최종 = 100 μM),

10 mM 레티놀 8 ㎕ (최종 = 200 μM)

를 첨가하고, 완충액을 이용하여 총 부피 400 ㎕로 구성했다.

상기 바이알들을 37℃에서 진탕 수조에서 45분 동안 인큐베이션했다. 각 바이알에 빙냉 에탄올 500 ㎕을 첨가하여 반응물을 급냉시켰다. 레티노이드를 빙냉 헥산 (1회 추출 당 2.7 ㎖)을 2회 사용하여 추출했다. 제1 추출하는 동안, 각 샘플에서의 추출 효율을 모니터링하면서 각 바이알에 레티닐 아세테이트 (900 μM 스톡 5 ㎕)를 첨가하였다. 샘플들을 10초 동안 볼텍싱한 후에 벡크만 GS-6R 원심분리기 중에서 5분 동안 1,000 rpm, 5℃에서 완만하게 원심분리했다. 각 회의 추출 후에, 레티노이드를 함유하는 최상부층의 헥산을 수성층으로부터 깨끗한 2 dram 바이알로 옮겼다. 헥산은 완만한 질소 기류하에 증발시켰다. 이어서, 건조시킨 잔류물은 HPLC 분석시까지 -20℃에 저장해 두었다.

2.5. 레티날 리덕타제 활성에 대한 분석 (B3을 확인하기 위한 분석)

모든 스톡 용액을 상기와 같이 제조하되, 다음과 같은 몇가지는 교체했다:

DMSO 중 10 mM 모든-트랜스-레틴알데히드 (시그마 R2500) - 레티놀 대신임.

멸균수 중 200 mM 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 포스페이트, 환원된 형태, 테트라나트륨 염 (NADPH) (시그마 N7505) - NADP 대신임.

나사형 뚜껑이 있는 2 dram 유리 바이알에

200 mM NADPH 4 ㎕ (최종 = 2 mM),

40 mM 시험 화합물 1 ㎕ (최종 = 100 μM),

10 mM 레틴알데히드 3 ㎕ (최종 = 75 μM)

를 첨가하고, 완충액을 이용하여 총 부피 400 ㎕로 구성했다.

이어서, 상기에 상세하게 기재한 바와 동일한 인큐베이션 및 추출 공정을 수행했다.

2.6. CRABPII 길항제에 대한 분석 (B4를 확인하기 위한 분석)

2.6.1. CRABPII의 합성

a. 발현계

CRABPII 유전자를 pET 29a-c(+) 플라스미드 (노바겐 (Novagen) 제품)에 클로닝했다. 클로닝된 유전자는 박테리오파지 T7에 의한 강한 전사 및 번역 신호에 의해 조절된다. T7 중합효소 공급원은 숙주 세포인 대장균 BLR(DE3)pLysS (노바겐 제품)이었다. 이는 lacUV5에 의한 조절을 받으며 IPTG 존재시에 유도되는 T7 중합효소의 염색체 카피를 갖는다.

상기 플라스미드를 제조업체 (노바겐)의 프로토콜에 따라 형질 전환에 의해 대장균 BLR(DE3)pLysS 세포로 이동시켰다.

b. 유도

형질전환된 세포들의 철야 배양물을 50 ㎍/㎖ 가나마이신 및 25 ㎍/㎖ 클로르암페니콜을 함유하는 2 ×YT에 1 : 100으로 희석시켰다. 세포를 37℃에서 600 nm에서의 OD값이 0.6 내지 0.8에 도달할 때까지 진탕하에 성장시켰다. 이어서, IPTG를 최종 농도 1 mM로 첨가하고, 상기 배양물을 2시간 더 인큐베이션시켰다. 5,000 g에서 10분 동안 실온에서 원심분리하여 세포를 수거했다. 펠렛을 -20℃에 저장했다.

2.6.2. 정제

문헌 [Norris and Li, 1997]에 기재된 방법에 따라 정제하였다.

a. 용균

냉동된 펠렛을 실온에서 해동시켜 펠렛의 1 내지 2배 부피의 신선하게 제조된 용균 완충액 (50 mM 트리스-HCl, pH 8, 10％ (w/v) 수크로스, 1 mM EDTA, 0.05％ (w/v) 아지드화 나트륨, 0.5 mM DTT, 10 mM MnCl₂, 2.5 mM 불화 페닐메틸술포닐, 2.5 mM 벤즈아미딘, 6 ㎍/㎖ DNase) 중에 재현탁시켰다. 상기 용균물을 30분 동안 실온에서 인큐베이션시켰다. 초음파 (얼음상에서 30초 동안 10,000 psi의 초음파 처리를 6회 수행하고 30초 동안 중단함, 5회)를 사용하여 더 용균시켰다. 이를 4℃에서 15,000 rpm에서 1시간 동안 원심분리하여 용균물의 불용성 분획을 제거하고, 상층액을 -20℃에 저장했다.

b. 세파크릴 S300상에서의 겔 여과

상기 단계 (a)로부터의 상층액을 세파크릴 S-300 컬럼 (2.5 ×100 cm, 파마시아 (Pharmacia) 제품)에 실온에서 로딩하였다. 용출 완충액은 완충액 A (20 mM 트리스-HCl, pH 8, 0.5 mM DTT, 0.05％ 아지드화 나트륨)이었다. 유속은 2 ㎖/분이었다. 수집된 2 ㎖ 분획물을 280 nm에서의 자외선 흡광도에 대해 검사하였다. 피크를 대표하는 분획들을 SDS-PAGE를 통해 CRABPII의 존재에 대해 시험하였다.

c. 음이온-교환 크로마토그래피

CRABPII을 함유하는 겔 여과 분획물 2 ㎖를 4차 아민 음이온-교환 컬럼 FPLC (Fast Protein Liquid Chromatography)형 monoQ (파마시아 제품)에 로딩하였다. 100％ 완충액 A로부터 30％ 완충액 B (100％ 완충액 B = 완충액 A + 250 mM NaCl)로의 구배 완충액을 이용하여 CRABPII를 실온에서 20분에 걸쳐 용출하였다. 매분마 1 ㎖-분획을 수집했다. 다시 한번, SDS-PAGE를 통해 CRABPII의 존재를 검사하였다. CRABPII를 4℃에 저장했다가, 바이알 플랫폼 부착부가 장착된 마이크로모듈료 (Micromodulyo) 1.5 K (에드워즈 하이 배큠 인터내셔널 (Edwards High Vacuum International) 제품)를 사용하여 동결건조시켰다. 건조된 샘플을 결합 분석에 사용할 때까지 실온에 저장했다.

d. CRABPII의 존재 검출

CRABPII의 발현 및 정제를 7 내지 15％ 폴리아크릴아미드 겔 (바이오래드 (BioRad) 제품)상에서의 변성 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동 (SDS-PAGE) 분석법을 통해 입증했다. 샘플 10 ㎕을 2 ×로딩 완충액 (100 mM 트리스-HCl pH 6.8, 4％ SDS, 0.2％ BPB, 20％ 글리세롤, 1 mM DTT) 10 ㎕과 혼합하고 가열 (2분, 80℃)하여 변성시켰다. 상기 샘플을 1 ×트리스-글리신 완충액 (바이오래드 제품) 중에 담궈둔 겔상에 로딩하고, 1시간 동안 실온에서 일정한 전류 (25 mA)를 인가하였다. 쿠마시 블루 염색후에, 벤츠마르크 프리-스테인드 (Benchmark pre-stained) 단백질 래더 (ladder) (깁코 BRL (Gibco BRL) 제품)를 사용하여 결정되는 바에 따라, 단백질을 이의 분자량으로 확인하였다.

웨스턴 블롯을 이용하여 CRABPII의 존재를 확인하였다. SDS-PAGE상에서 분리된 단백질들을 바이오래드 카세트를 사용하여 임모빌론-P (Immobilon-P) 수송막 (밀리포어 (Millipore) 제품)에 이동시켰다. 1 ×트리스-글리신 완충액 (바이오래드 제품) + 10％ 메탄올 중에서 이동시켰다. 전류 (60 mA)를 3시간 동안 인가하여 단백질이 막을 통해 이동되도록 하였다. 이후에, 1 ×TBS 중 5％ 분유를 이용하여 상기 막을 1시간 동안 실온에서 차단하고, 동일한 완충액 중 CRABPII에 대한 1차 항체 (마우스 항-클로날 5-CRA-B3의 1/1,000 희석물)로 4℃에서 밤새 프로빙했다. 다음날, 막을 PBS (3 ×5분)로 세척한 후에 2차 항체인 퍼옥시다제와 접합된 항-마우스 항체 (ECLTM, 아머샴 (Amersham) 제품)의 1 : 2,000 희석물과 함께 1시간 동안 실온에서 인큐베이션시켰다. 상기 막을 1 ×PBS (3 ×5분)로 세척하고, ECL 검출 키트를 제조업체 (아머샴)의 지시에 따라 사용하여 단백질을 검출했다.

BSA 키트 (피어스 (Pierce) 제품)를 통해, 정제된 CRABPII의 농도를 측정했다.

2.6.3. 방사선활성 결합 분석

CRABPII 220 pmol을 15 pmol 방사선활성 모든-트랜스-레틴산 (NEN)와 함께 20 mM 트리스-HCl 완충액 (pH 7.4) 중에서 총 부피 70 ㎕로 인큐베이션시켰다. 경쟁적 분석을 위해서, 다른 리간드를 과량 (6670 : 1, 670 : 1 또는 70 : 1)으로 첨가하여 혼합했다. 빛을 차단하고 1시간 동안 실온에서 반응시켰다. 결합된 모든-트랜스-레틴산으로부터 결합되지 않은 모든-트랜스-레틴산을 분리하기 위해서, 6 kD 컷-오프 미니크로마토그래피 컬럼 (바이오래드 제품)을 사용했다. 마이크로플렉스 매니폴드 (Microplex manifold)를 제조업체 (파마시아)의 지시에 따라 사용하여 저장 완충액을 버렸다. 상기 샘플을 컬럼에 로딩하고, 중력에 의해 30분의 기간에 걸쳐 분리시켰다. CRABPII에 결합된 레틴산 ("RA")은 여액 중에 존재한 반면, 유리 RA는 컬럼에 잔류했다. 섬광계수기를 통해 여액의 방사선활성을 측정했다.

2.7. NADPH-의존성 레틴산 산화에 대한 분석 (B5를 확인하기 위한 분석)

하기한 방법은 문헌 (4)에 기재된 방법을 변형시킨 것이다. 분석 완충액 (0.1 M PO₄/0.1 mM EDTA/5 mM MgCl₂, pH 7.4)을 제조하여 4℃에 저장했다. 분석 당일에, 완충액 중 60 mM NADPH 용액을 제조했다. 억제제 스톡, 산성화시킨 에탄올/BHT 급냉용 용액 및 헥산/BHT를 상기 기재한 바와 같이 제조했다. 1 mM 레틴산 작동 용액은 15 mM 스톡 (DMSO 중)을 에탄올로 희석하여 제조했다.

2 dram 바이알에, 60 mM NADPH 20 ㎕, 억제제 또는 용매 블랭크 5 ㎕를 첨가한 후에 래트 간 미소체 단백질을 대략 2 mg 첨가하고, 분석 완충액을 이용하여 총 부피 500 ㎕로 구성했다.

상기 혼합물을 5분 동안 37℃에서 인큐베이션한 다음, 1 mM 레틴산 작동 용액 5 ㎕를 첨가했다. 인큐베이션을 60분 동안 37℃에서 계속하면서, 산화 과정에는 NADPH 뿐 아니라 0₂ 분자 역시 필요하기 때문에 바이알의 뚜껑은 닫지 않았다. 상기 기재한 바와 같이, 산성화시킨 에탄올/BHT로 급냉시키고, 헥산/BHT로 추출했다. 하기에 기재한 바와 같이, HPLC 신호를 통합하여 신속하게 용출된 극성 레틴산 대사물질 (4-옥소 레틴산이라 추정됨)을 정량하였다.

레틴산 첨가 이후의 모든 단계는 빛을 차단하거나 어두운 조명하에 수행하였다. 최종 인큐베이션 용액은 2.4 mM NADPH, 100 μM 이하의 억제제, 10 μM 레틴산, 대략 4 mg/㎖의 래트 간 미소체 단백질 및 거의 0.1 M의 PO₄/0.1 mM EDTA/5 mM MgCl₂를 함유했다.

개개의 레티노이드의 HPLC 분석

각 바이알 중의 상기 잔류물을 메탄올 100 ㎕로 용해시켜, HPLC를 통해 레티노이드 정량하기 위한 샘플을 제조했다. 상기 용액을 1 ㎖ 쉘 바이알에 들어있는 150 ㎕ 유리 원뿔형 튜브에 넣어 뚜껑을 꽉 닫았고, 이를 워터스 715 오토샘플러 (Waters 715 Autosampler)에 넣었다. 분취액 60 ㎕를 즉시 주입하고 레티노이드 함량을 분석했다.

크로마토그래피 기계는 워터스 600 구배 조절기/펌프, 워터스 996 포토다이오드 어레이 (Photodiode Array) 검출기 및 워터스 474 스캐닝 플루오레슨스 (Scanning Fluorescence) 검출기로 구성된 것이었다. 레티노이드 분석에는 2가지 HPLC 프로토콜을 사용했다. ARAT 및 LRAT 분석을 위해, 80 : 20 (v/v) 메탄올/THF 등용매 이동상 (유속은 1 ㎖/분으로 조정함)을 사용한 워터스 3.9 ×300 mm C18 노바팍 (Novapak) 역상 분석용 컬럼 및 워터스 센트리 노바팍 C18 가드 (Sentry NovaPak C18 guard) 컬럼을 통해 10분 동안 레티놀 및 레티놀 에스테르를 분리했다. 325 nm에서의 흡광도 및 325 ex/480 em에서의 형광도를 이용하여 용출액을 모니터링했다.

문헌 [Barua (5)]에 기재된 구배 시스템을 변형시켜 레티놀 및 레틴산 산화를 분석하기 위해, 더 짧은 워터스 3.9 ×150 mm C18 노바팍 역상 분석용 컬럼 및 워터스 센트리 노바팍 C18 가드 컬럼을 사용하여 레티노이드 산 및 알콜을 분리했다. 이 시스템은 20 분간의 선형 구배로 10 mM 아세트산암모늄을 함유하는 68 : 32 (v/v) 메탄올/물로부터 4 : 1 (v/v) 메탄올 : 디클로로메탄 (이것으로 5분 더 수행함) (유속은 1 ㎖/분으로 고정시킴)으로 구성되었다. 컬럼 용출물을 300 nm 내지 400 nm에서 모니터링했다.

이들 프로토콜은 각각의 분석시에 관련된 레티노이드 산, 알콜, 알데히드 및(또는) 에스테르를 명백하게 밝힐 수 있으며 분리가 비교적 신속하게 이루어질 수 있느냐를 기준으로 선택된 것이다. HPLC를 통한 개개의 레티노이드 확인은 미지의 피크의 보유 시간이 입수할 수 있는 신뢰성있는 레티노이드 표준물의 경우와 정확하게 매치되는가와 미지의 피크의 UV (300 내지 400 nm) 스펙트럼 분석이 입수할 수 있는 신뢰성있는 레티노이드의 경우와 정확하게 매치되는가를 바탕으로 한 다.

참고문헌

본 발명에 사용하기 적합한 부스터로는 하기 표 B1 내지 표 B5에 열거한 부스터 등이 있으나, 이에 제한되지 않는다. 하기의 표는 부스터 클래스 (B1 내지 B5), 상기 화합물의 화학적 명칭 및 부스터들의 확인에 사용한 적절한 분석 (즉, B1의 경우에는 ARAT/LRAT, B2의 경우에는 레티놀 데히드로게나제, B3의 경우에는 레틴알데히드 억제, B4의 경우에는 CRABP 결합, 및 B5의 경우에는 레틴산 산화 억제) 결과를 제공한다.

레티놀 데히드로게나제 활성제 (B2)
클래스	화합물	레티놀 데히드로게나제 증가율(％)
인지질	포스파티딜 콜린	21％ 증가
인지질	스핑고마이엘린	26％ 증가

레틴알데히드 리덕타제 억제제 (B3)
클래스	화합물	전체 TG (IC₅₀)	레티날 리덕타제 억제율(％)
알데히드	바닐린	9.70E-03	6％
지방산	아라키드산		20％
지방산	아라키돈산		49％
지방산	리놀레산	1.63E-04	62％ ±2
지방산	리놀렌산	1.34E-04	54％ ±16
지방산	미리스트산	1.72E-05	26％
기타	암사크린	6.26E-06	22％ ±8
기타	카르벤옥솔론	3.61E-07	26％ ±2
기타	글리시레틴산	8.64E-06	38％ ±1
인지질	포스파티딜 에탄올아민		37％

CRABPII 길항제 (B4)
클래스	화합물	전체 TG (IC₅₀)	CRABPII 억제율(％)
지방산	엘라이드산	6.50E-05	> 50％
지방산	헥사데칸디오산	1.30E-04	> 50％
지방산	12-히드록시스테아르산	2.91E-05	> 50％
지방산	이소스테아르산	6.88E-05	> 50％
지방산	아마인유		> 50％

제B장. 부스터 조합물의 효과

부스터 분자들의 조합물의 효과를 평가하기 위한 분석은 5개 클래스 부스터들 각각의 효과 평가를 포함할 필요가 있다. 단일 효소 분석은 1개 클래스의 부스터 분자에 대해서만 특이적이기 때문에 이러한 목적에 적합하지 않다. 단일 부스터 분자들의 효과 및 부스터 분자들의 조합물의 효과와 관련해서는, 각질세포에서 의 레티노이드 농도를 반영하는 분석이 필요하다. 이러한 이유로, 트랜스글루타미나제 (Tgase) 분석법을 이용했다. Tgase는 단백질 내에서 공유 결합적 가교의 형성을 촉매하는 칼슘-의존성 효소이다. 여러 Tgase 효소들은 각질세포의 막에 결합되어 있으며, 표피 세포의 성숙에 중요하다. 이 효소는 레틴산에 의해 억제된다. 레틴산의 농도가 높을 수록, Tgase 발현이 더욱 억제된다. Tgase는 각질세포 분화 및 각질세포에 대한 레티노이드 효과 모두에 관한 훌륭한 마커이다.

피부 분화의 마커로서의 트랜스글루타미나제

표피가 최종적으로 분화되는 과정 동안, 세포 주변부의 내면에는 각질세포막 (CE)이라고도 공지되어 있는 15 nm 두께의 단백질 층이 형성된다. CE는 표피에서 발현된 2종 이상의 상이한 트랜스글루타미나제 (TGase)의 작용을 통해 촉매된 NΣ-(γ-글루타밀) 라이신 이소디펩티드 결합의 형성에 의해 서로 가교된 수많은 별개의 단백질들로 구성된다. TGase I은 표피의 분화된 층, 특히 과립층에서 풍부하게 발현되지만, 미분화된 기저 표피에는 존재하지 않는다. 따라서, TGase I은 표피의 각질세포 분화에 대한 유용한 마커이며, TGase I 수준이 높다는 것은 더욱 분화된 상태를 지시하는 것이다. 하기의 실시예에서는 TGase I 항체를 사용한 ELISA 기재의 TGase I 분석을 이용하여 배양된 각질세포의 분화 상태를 평가했다.

각질세포 (상기 기재한 바와 같이 배양함)를 96-웰 플레이트에 웰 당 배지 200 ㎕ 중 4,000 내지 5,000개 세포의 밀도로 플레이팅했다. 2 내지 3일 동안 인큐베이션시킨 후에, 또는 세포가 약 50％ 전면생장할 때까지 인큐베이션시킨 후에, 상기 배지를 시험 화합물을 함유하는 배지로 교체했다 (시험 당 5벌로 시험). 세 포를 96시간 더 배양한 후에 배지를 흡인해내고 플레이트를 -70℃에 저장했다. 냉동실에서 플레이트를 꺼내고, 1 ×PBS 200 ㎕로 세포를 2회 세척했다. 세포를 1시간 동안 실온에서 (R/T) TBS/5％ BSA (세척 완충액, 소 혈청 알부민)와 함께 인큐베이션시켰다. 이어서, TGase 1차 항체를 첨가했다: 세척 완충액 중에 1 : 2,000로 희석한 모노클로날 항-Tgase I Ab B.C. 50 ㎕. 1차 항체를 2시간 동안 37℃에서 인큐베이션한 후에, 세척 완충액으로 6회 헹궜다. 이어서, 세포를 세척 완충액 중에 1 : 4,000으로 희석한 2차 항체 (Fab 단편, 퍼옥시다제와 접합된 항-마우스 IgG, 아머샴 제품) 50 ㎕와 함께 2시간 동안 37℃에서 인큐베이션한 다음, 세척 완충액으로 3회 헹궜다. 세척 완충액으로 헹군 후에, 세포를 PBS로 3회 헹궜다. 비색 전개를 위해, 세포를 100 ㎕ 기질 용액 (0.1 M 시트르산 완충액 (pH 5.0) 10 ㎖ 중 o-페닐렌디아민 4 mg 및 30％ H₂0₂ 3.3 ㎕)과 함께 정확하게 5분 동안 R/T에서 빛을 차단하여 (알루미늄 호일에 싸서) 인큐베이션시켰다. 4 N H₂SO₄ 50 ㎕를 첨가하여 반응을 중단시켰다. 96-웰 플레이트 UV 분광광도계를 이용하여 492 nm에서 샘플들의 흡광도를 판독했다. 5벌의 실험물 중, 4개에는 두가지 항체를 모두 처치하였고, 나머지 한개는 Tgase 백그라운드 (background) 대조군으로 사용했다. TGase 수준을 측정하고 대조군에 대한 비율(％)로 나타냈다.

Tgase 분석에 관한 상세한 기재:

실험 개시 전에, 부스터 분자들의 조합물의 효과를 측정하기 위하여, 표준 Tgase 분석 조건을 조사하였다. 완전히 입증된 Tgase 분석 조건은 다음과 같이 수 립되었다:

A. 시약

-세포: 인간 각질세포 신생아 인간 포피

(T75 플라스크 중 P2,

96-웰 분석 플레이트 중 P3)

-1차 항체: 바이오제네시스 (Biogenesis) 제품

TGm 특이적 모노클로날 Ab B.C1 (카탈로그 번호; 5560 -6006)

-2차 Ab: 아머샴 제품 (카탈로그 번호; NA9310)

퍼옥시다제로 표지된 항-마우스 Ig F(ab)₂

-기질 용액:

10 ㎖ 인산-시트르산 완충액 중

o-페닐렌디아민 4.0 mg, 시그마 P-7288

30％ H₂O₂ 3.3 ㎕ 시그마 H-1909

B. 배지/완충액

각질세포 성장 배지 클로네틱스 (Clonetics) 제품

(KGM, Keratinocyte Growth Media) (카탈로그 번호; 3111)

인산염 완충 염수;

Ca/MgCl₂ 없는 라이프 테크놀로지 (Life Technology)

둘베코스 (Dulbecco's) 제품 (카탈로그 번호; 14200-075)

트리스 완충 염수

차단 완충액 바이오래드 제품

(1 ×TBS + 5％ 분유) (카탈로그 번호;170-6404)

세척 완충액 시그마 제품(카탈로그 번호; P-7949)

(0.05％ Tween 20 + TBS 중 1％ 분유)

인산-시트르산 완충액:

0.2 M 이염기 인산 나트륨 및 시그마 제품 (카탈로그 번호; S-9763)

0.1 M 시트르산 시그마 제품 (카탈로그 번호; C-1909)

의 1 : 1 혼합물

4 N H₂SO₄

C. 배양 용품

-96-웰 폴리프로필렌 코스타 (Costar) 제품

마이크로타이터 플레이트 (카탈로그 번호; 3595)

-96-웰 폴리프로필렌 코스타 제품

U-바닥 플레이트 (카탈로그 번호; 3794)

-T75-통풍용 뚜껑 장착 코스타 제품 (카탈로그 번호; 3376)

D: 기계/장치

-바이오테크 (Biotek) 모델 EL 340 바이오-테크 인스투먼츠, 인크.

마이크로플레이트 판독기 (Bio-tek Instuments Inc.) 제품

-멀티프로브 II 패카드 (Packard) 제품

E: 세포 배양 절차

96-웰 플레이트로 각질세포의 접종

1. KGM 배지 (각각의 마이크로타이터 플레이트에서 3 ×10⁵ 세포/12 ㎖ 배지를 사용함)에서 3,000 세포/200 ㎕/웰의 농도로 각질세포의 현탁액을 제조하였다.

2. 각질세포 현탁액 200 ㎕를 안쪽 60 웰에만 각각 이동시켰다.

3. KGM 배지 200 ㎕를 바깥쪽 웰에 열적 평형을 유지하면서 피펫팅하였다.

4. 각각의 플레이트를 37℃ 및 5％ CO₂에서 3일 동안 인큐베이션시키거나, 또는 세포가 약 50％ 전면생장할 때까지 인큐베이션했다.

각질세포에의 샘플 처치

5. 샘플 스톡 용액을 DMSO 중에 제조했다.

6. 샘플을 원하는 농도로 희석하여 DMSO의 최종 분석 농도가 0.1％가 되게 하였다.

7. 샘플 20 ㎕를 웰에 옮기고, KGN 배지 180 ㎕를 첨가하여 최종 분석 부피를 200 ㎕로 하였다.

8. 플레이트를 37 ℃에서 72 시간 동안 5％ CO₂에서 인큐베이션하였다.

9. 각 웰에서 배지를 완전히 제거하였다.

10. 웰을 1×PBS 200 ㎕로 2회 헹궜다.

11. 최종적으로, 이들을 1.5시간 이상 동안 -70 ℃에 냉동시켰다.

F: 트랜스글루타미나제 분석

1.블록:

1 시간 동안 실온에서 차단 완충액 200 ㎕/웰로 플레이트를 인큐베이션하였다.

2. 1차 항체:

차단 완충액을 흡인하였다. 2 시간 이상 동안 37 ℃에서 TGm-특이적 모노클로날 항체 B.C1 (세척 완충액 중에 1:2,000로 희석) 100 ㎕/웰로 인큐베이션하였다. 1차 항체를 백그라운드 대조군 웰에 첨가하지 않았다.

3. 세척 완충액으로 웰을 6회 헹궜다.

4. 2차 항체:

2 시간 동안 37 ℃에서 퍼록시다제 표지된 항-마우스 IgF(ab)2 단편 (세척 완충액 중에 1:4,000로 희석) 100 ㎕/웰로 인큐베이션하였다.

5. 세척 완충액 (200 ㎕ 추가)으로 웰을 3회 헹구고, 헹군 후마다 흡인하였다.

6. 트윈이 없는 PBS로 웰을 3회 헹궜다.

7. 정확히 5 분 동안 실온에서 100 ㎕/웰 기질 용액으로 인큐베이션하였다.

8. 50 ㎕/웰 4N H₂SO₄로 반응을 중단시켰다.

9. 바이오-테크 플레이트 판독기로 492 nm에서 흡광도를 판독하였다.

I. 최적화 연구

A. 시간 경과에 따른 트랜스글루타미나제 생산

시간 경과 실험을 수행하여 96-웰 플레이트에서 배양한 각질세포에서 트랜스글루타미나제 생산에 대한 최적 인큐베이션 시간을 측정하였다 (4,000 세포/웰). 1.2 mM CaCl₂의 존재하의 인큐베이션 뿐 아니라, 레틴산 및 레티놀의 투여량 반응 분석을 포함하는 다중 변수로 상기 시간 경과 연구를 수행했다. 대조군 세포 (0.1％ DMSO)에서는 트랜스글루타미나제 생산에 변화가 없었으나, 레틴산 및 레티놀 모두 5일간의 인큐베이션 기간에 걸쳐 트랜스글루타미나제 생산이 투여량에 의존하여 억제됨을 나타냈다. 가장 두드러진 레티노이드 효과를 제2일 및 제3일에 관찰하였다. 최대 억제는 레틴산 및 레티놀의 최고 농도 (1 μM)에서 트랜스글루타미나제 생산이 각각 85％ 및 55％로 억제된 제2일에 관찰되었다. 또한, 세포 밀도 (3,000 세포/웰 및 5,000 세포/웰)를 변화시키면서 동일한 실험을 수행하였고, 필적할만한 결과를 관찰하였다.

B: DMSO 민감도

각질세포에서 트랜스글루타미나제 생산에 미치는 영향에 대해 0 내지 2％ 범위의 여러 농도의 DMSO를 시험하였다. 분석은 DMSO 농도에 민감하였으며, 0.5％ 초과의 DMSO에서 활성을 상당히 억제했다. 그리하여, 후속 샘플 농도 연구에서 0.1％의 최종 분석 농도를 선택하였다.

C: 투여량 반응 곡선: 레틴산 및 레티놀

상기 데이타에 기초하여, 제3일을 최적 시간으로 선택하였으며, 0.1％ DMSO를 추가의 시험에 사용할 농도로 선택하였다. 0.1％ DMSO 존재하에 레틴산 및 레티놀로 추가의 투여량 반응 실험을 수행하였으며, 제3일에 트랜스글루타미나제 생산을 분석했다. 레틴산 및 레티놀에 의한 Tgase 억제에 대해 우수한 투여량 반응이 관찰되었다. 10^-7M 레티놀은 선형 농도 범위에서 Tgase를 억제하였다. 그러므로, 이 농도의 레티놀을 선택하여 부스터 조합물을 평가하였다.

D: 부스터 또는 부스터의 조합물을 시험하는 데 사용하는 최종 조건

레티놀 및 부스터와 함께 각질세포를 인큐베이션시킨 날 3 일

최종 DMSO 농도 0.1％ 미만

레티놀 농도 10^-7 M (0.1μM)

부스터 농도` 10 mM 내지 0.1 nM

상기 조건을 사용하여, 상이한 모든 부스터 (B1-B5)에 대한 투여량 반응을 시험하여 조합물로 시험할 부스터의 최적(best) 농도를 확인하였다.

트랜스글루타미나제 양을 측정하고, 하기 표의 B1 내지 B5에 하기 (i) 또는 (ii)로 나타냈다:

(i) 레티놀 단독에 대한 부스터 + 레티놀 유도된 TGase 억제의 상가 효과를 측정한 (부스터 + 레티놀 억제/대조군 억제)％ - (ROH 억제/대조군 억제)％, 또는

(ii) 여러개의 부스터 농도의 억제 효과를 검사하였을 때 IC₅₀ 값 - 이는 TGase를 50％ 억제하는, 10^-7 M의 일정한 레티놀 농도와 조합한 부스터 농도로 제공됨.

부스터 조합물 및 부스터 비율:

놀랍게도, 특정 화합물이 상이한 메카니즘에 의하여 레티놀 또는 레티닐 에스테르로부터 내인성 수준의 레틴산 형성을 증가시킨다는 것을 밝혀냈다. 본원에서 이들 화합물을 총체적으로 "레티노이드 부스터"로 명명한다. 이들은 ARAT/LRAT의 억제제 (B1 부스터), 레틴알데히드 리덕타제의 억제제 (B3 부스터), CRABP-2에 결합하는 레틴산의 억제제 (B4 부스터) 및 시토크롬 P450 효소에 의해 촉진되는 레틴산 산화 억제제 (B5 부스터), 또는 레티놀 데히드로게나제를 향상시키거나 활성화시키는 특정 기타 화합물 (B2 부스터)을 포함한다. 이들 부스터는 본원에서 상기 차트 1에 나타낸 바와 같이 B1 내지 B5 군으로 명한다.

부스터 단독 또는 부스터의 조합물은 레틴산으로의 전환에 이용가능한 레티놀의 양을 증가시키고 레틴산의 분해를 억제함으로써 레티노이드의 작용을 강화시킨다. 부스터는 피부에 내재하는 레티노이드 (예를 들어, 레티놀, 레티닐 에스테르, 레티날, 레틴산)와 함께 작용한다. 그러나, 바람직한 조성물은 성능을 최적화하기 위해 부스터와 함께 조성물 중에 레티노이드도 포함한다.

본 발명은 부분적으로는, 1종 이상의 부스터 화합물, 또는 2-원, 3-원, 4-원 또는 5 개의 부스터 조합물을 조성물의 약 0.0001％ 내지 약 50％, 바람직하게는 0.001％ 내지 10％, 가장 바람직하게는 0.001％ 내지 5 중량％ 함유하는 제2 조성물을 포함한다. 하기에 나타낸 특정 비율에서 0.001％ 내지 5％의 부스터 조합물과 미용상 허용되는 비히클의 조합 농도는 시험관내 트랜스글루타미나제 분석에서 트랜스글루타미나제를 50％ 이상 억제한다.

본 발명의 조성물에 포함된 부스터는 하기와 같이 이루어진 군에서 선택된다:

a. 모두 B2, B3 및 B4로 이루어진 군에서 선택된 2 개의 부스터;

b. B1/B2; B1/B3, B1/B4; B1/B5; B2/B3, B2/B4; B2/B5; B3/B4, B3/B5; B4/B5로 이루어진 군에서 선택된 부스터의 2-원 조합물;

c. B1/B2/B3; B1/B2/B4; B1/B2/B5; B1/B3/B4; B1/B3/B5; B1/B4/B5; B2/B3/B4; B2/B3/B5; B2/B4/B5; B3/B4/B5로 이루어진 군에서 선택된 부스터의 3-원 조합물;

d. B1/B2/B3/B4; B1/B2/B3/B5; B1/B2/B4/B5; B1/B3/B4/B5; B2/B3/B4/B5로 이루어진 군에서 선택된 부스터의 4-원 조합물; 및

e. 5 개 군의 부스터 B1/B2/B3/B4/B5의 조합물.

부스터 대 부스터의 비율:

전술한 조합물 중에 서로 다른 클래스의 부스터 (B1 내지 B5)는 Tgase 활성을 적어도 50％ 이하로 억제하기 위해 하기 나타낸 특정 비율에서 미용 제품 중에 0.001％ 내지 5％의 최적 농도를 갖는다:

본 발명	부스터 대 부스터의 비율	농도
무난함	1:10,000 내지 10,000:1	100 mM 내지 1nM
바람직	1:1,000 내지 1,000:1	10 mM 내지 10 nM
가장 바람직	1:100 내지 100:1	1 mM 내지 100 nM
최적	1:10 내지 10:1	0.1 mM 내지 1 μM

레티노이드 대 부스터 비율:

바람직한 조성물은 성능을 최적화시키기 위하여 부스터 또는 부스터의 조합물과 공존하는, 조성물 중의 레티노이드 (예를 들어, 레티놀, 레티닐 에스테르, 및 레틴알데히드)를 포함한다.

최적 성능을 위해, 레티노이드 대 부스터의 농도는 하기 주어진 비율로 조성물 중에 존재해야 한다:

본 발명	부스터 대 레티노이드의 비율	농도
무난함	10,000:1 내지 1:10,000	100 mM-1 nM 부스터; 0.001-10％ 레티노이드
바람직	1,000:1 내지 1:1,000	10 mM-10 nM 부스터; 0.001-10％ 레티노이드
가장 바람직	100:1 내지 1:100	1 mM-100 nM 부스터; 0.01-1％ 레티노이드

실시예에 사용된 개개의 부스터들의 농도

본 발명의 목적이 활성 화합물과 레티놀의 조합물에 의한 트랜스글루타미나제 발현의 상승적 억제를 확립하는 것이기 때문에, 레티놀의 존재하에 개별적으로 시험했을 때 활성 화합물의 투여량 반응 프로파일 (IC₂₀ 및 IC₅₀ 값)을 결정하는 것이 필수적이다. B2-B4에 속한 부스터의 상세한 투여량 반응은 하기 표의 IC₅₀ 및 IC₂₀ 다음에 나타낸다. 각각의 활성 화합물의 적합한 하위-최대 억제 농도를 확인하는 데 이 데이타를 사용하여, 레티놀의 존재하에 활성 화합물의 혼합물의 추정되는 상승 효과를 확인할 수 있었다. 하기 표의 데이타는 IC₅₀ 및 IC₂₀ (대조군의 80％)값 및 부스터의 조합물의 상승 효과를 시험할 때 사용한 농도를 나타냈다.

2 개의 화합물의 상승 작용을 입증하기 위하여, 시험 농도를 최대 IC₂₀, 즉, 개별적으로 레티놀의 Tgase 발현 억제를 20％ 올리는 화합물의 농도로 선택하는 것이 필수적이다. 이러한 2가지 화합물은 40％의 상가 억제를 가져야 한다. 이러한 전략을 사용하여 농도를 결정하면 검사중인 2 개의 화합물의 상승 작용을 검색하기 위한 추가의 억제에 대하여 40-100％의 창을 남겨둔다.

더욱 엄격한 농도 기준은 화합물이 단독으로는 억제 효과를 나타내지 않으나, 조합될 때 억제를 나타내는 농도를 선택하는 것이다. 그러나, 본 발명자들은 이 연구에서 훨씬 더욱 엄격한 기준을 선택했다. 본 발명자들은 최소의 유효 Tgase 억제 농도 보다 10 내지 1,000배 더 낮은 화합물 농도를 선택했다. 이러한 매우 낮은 농도를 사용한 상승작용적 조합물의 확인은 가장 효과적인 상승작용적 조합물이 확인되었음을 의미한다.

ND: 검출되지 않음 또는 분명한 투여량 반응이 관찰되지 않음. 상승 효과를 위해, 광범위한 농도 (10^-5 내지 10^-9M의 4 차수 규모(order of magnitude))를 시험하였다.

클래스 B2 내지 클래스 B4 부스터에 대한 투여량 반응

하기 표는 클래스 B2 내지 클래스 B4에 속하는 부스터들의 투여량 반응에 대한 데이타를 포함한다. 부스터들의 농도는 몰 농도이며, 4벌의 실험물의 평균 Tgase 수준 및 표준 편차를 대조군의 비율(백분율) (0.1％ DMSO 및 10^-7 M 레티놀)로 표현하였다. 수치가 높을 수록 (100에 가까울수록 또는 그 이상일수록) Tgase의 억제가 없음을 나타냈다. 수치가 낮을 수록, 그 농도에서 더 강력하게 억제되었음을 나타냈다. IC₅₀ 및 IC₂₀ 값은 이 투여량 반응 표로부터 계산하여 상기 표에 나타내었다.

부스터의 2-원 조합물을 사용한 Tgase 억제의 상승작용

2 개의 서로 다른 클래스의 부스터와 레티놀의 조합물에 의한 Tgase 발현의 상승작용적 억제를 조사하기 위하여, 화합물의 선택된 조합물을 상기 표에 주어진 농도에서 시험하였다. 시험한 농도는 Tgase 활성의 최소 억제에 필요한 농도 (즉, IC₂₀)보다 1 log 차수 (order of magnitude) 작은 농도였다. 화합물을 단독 및 조합하여 시험하고, Tgase의 억제율(％)을 각 화합물 및 조합물에 대하여 기록하였다.

하기 예는 가능한 모든 2-원 조합물 (B1/B2; B1/B3, B1/B4; B1/B5; B2/B3, B2/B4; B2/B5; B3/B4, B3/B5; B4/B5)의 상승작용적 조합물이다. 조합물의 억제율(％)이 함께 첨가된 각 화합물의 억제율보다 클 때, 그것을 상승 효과 (즉, 조합물에 의한 억제율은 화합물 1 + 화합물 2의 억제율보다 큼)로 나타냈다. 하기 표의 모든 2-원 조합물의 예는 상승작용적으로 Tgase를 억제하였다.

부스터의 3-원 조합물을 사용한 Tgase 억제의 상승작용

3 개의 서로 다른 클래스의 부스터와 레티놀의 조합물에 의한 Tgase 발현의 상승작용적 억제를 조사하기 위하여, 화합물의 선택된 조합물을 시험하였다. 시험한 농도는 Tgase 활성의 최소 억제에 필요한 농도 (즉, IC₂₀)보다 1 log 차수 작은 농도였다. 화합물을 단독 및 조합하여 시험하고, Tgase의 억제율(％)을 각 화합물 및 조합물에 대하여 기록하였다. 하기 예는 모든 가능한 3-원 조합물 (B1/B2/B3; B1/B2/B4; B1/B2/B5; B1/B3/B4sB1/B3/B5; B1/B4/B5; B2/B3/B4; B2/B3/B5; B2/B4/B5; B3/B4/B5)의 상승작용적 조합물이다. 조합물의 억제율(％)이 함께 첨가된 각 화합물의 억제율보다 클 때, 그것을 상승 효과 (즉, 조합물에 의한 억제율은 화합물 1 + 화합물 2+ 화합물 3의 억제율보다 큼)로 나타냈다. 하기 표의 모든 3- 원 조합물의 예는 10^-7M 레티놀의 존재하에 상승작용적으로 Tgase를 억제했다.

부스터들의 4-원 조합물을 사용한 Tgase 억제의 상승작용

4 개의 서로 다른 클래스의 부스터와 레티놀의 조합물에 의한 Tgase 발현의 상승작용적 억제를 조사하기 위하여, 화합물의 선택된 조합물을 시험하였다. 시험한 농도는 Tgase 활성의 최소 억제에 필요한 농도 (즉, IC₂₀)보다 1 log 차수 작은 농도였다. 화합물을 단독 및 조합하여 시험하고, Tgase의 억제율(％)을 각 화합물 및 조합물에 대하여 기록하였다. 하기 예는 모든 가능한 4-원 조합물 (B1/B2/B3/B4; B1/B2/B3/B5; B1/B2/B4/B5; B1/B3/B4/B5; B2/B3/B4/B5;)의 상승작용적 조합물이다. 4 개의 부스터의 조합물의 억제율(％)과 3 개의 부스터 조합물에 의한 억제율의 차가 30％ 이상인 경우 (즉, 4 개 부스터 조합물의 억제율(％)이 3 개의 부스터 조합물의 억제율(％) + 30％ 이상인 경우), 상승 효과를 확인했다. 하기 표의 모든 4-원 조합물은 상승 효과를 나타냈다.

미용상 허용되는 비히클

또한, 본 발명의 조성물은 활성 성분에 대하여 희석제, 분산제 또는 운반체로 작용하는 미용상 허용되는 비히클을 조성물 중에 포함하여, 조성물이 피부에 적용될 때 이들의 분산을 용이하게 한다.

물 이외의 비히클 또는 물과 함께 첨가되는 비히클은 액상 또는 고상 연화제, 용제, 습윤제, 증점제 및 산제를 포함할 수 있다. 특히 바람직한 비-수성 운반체는 폴리디메틸 실록산 및(또는) 폴리디메틸 페닐 실록산이다. 본 발명의 실리콘은 25 ℃에서 약 10 내지 10,000,000 센티스트로크의 범위의 점도인 것일 수 있다. 저점도와 고점도 실리콘의 혼합물이 특히 바람직하다. 이러한 실리콘은 제네럴 일렉트릭 컴파니(General Electric Company)에서 상표명 비카실(Vicasil), SE 및 SF로, 다우 코닝 컴파니(Dow Corning Company)에서 상표명 200 및 550 시리즈로 구입할 수 있다. 본 발명의 조성물에 이용할 수 있는 실리콘의 양은 조성물의 5 내지 95 중량％, 바람직하게는 25 내지 90 중량％의 범위이다.

임의의 피부에 이로운 재료 및 미용 보조제

오일 또는 오일성 재료는 유화제와 함께 존재하여 사용되는 유화제의 평균 친수-친유 균형(MLB)에 크게 의존하는 수중유 에멀젼 또는 유중수 에멀젼을 제공할 수 있다.

여러 형태의 활성 성분들이 본 발명의 미용 조성물에 존재할 수 있다. 다양한 형태의 활성 성분이 본 발명의 미용 조성물에 존재할 수 있다. 활성제는 연화제 및 조성물의 물리적 특성을 단순히 개량시키는 본 발명의 성분 이외의 피부 또는 모발에 이로운 제제로 정의된다. 이 카테고리로만 제한되지 않으나, 일반적인 예로는 썬스크린, 피부 미백제, 및 태닝제를 들 수 있다.

썬스크린은 자외선을 차단하는 데 통상적으로 사용되는 제료이다. 화합물의 예로는 PABA, 신나메이트 및 살리실레이트의 유도체를 들 수 있다. 예를 들어, 옥틸 메톡시신나메이트 및 2-히드록시-4-메톡시 벤조페논 (옥시벤존으로도 공지됨)을 사용할 수 있다. 옥틸 메톡시신나메이트 및 2-히드록시-4-메톡시 벤조페논은 상표명 파르솔(Parsol) MCX 및 벤조페논-3으로 각각 구입할 수 있다.

에멀젼에 사용되는 썬스크린의 정확한 양은 태양의 UV 조사량으로부터 원하는 보호 정도에 따라 변할 수 있다.

다른 바람직한 임의의 성분은 필수 지방산 (EFA), 즉, 모든 세포의 혈장 막 형성에 필수적인 지방산으로부터 선택된다. 각질세포에서 EFA 결핍은 세포를 과다 증식시킨다. EFA의 보충은 이를 보완한다. 또한, EFA는 표피의 지질 생합성을 향상시키고, 표피의 장벽 형성을 위한 지질을 제공한다. 필수 지방산은 리놀레산, γ-리놀렌산, 호모-γ-리놀렌산, 콜룸빈산, 에이코사-(n-6,9,13)-트리에노산, 아라키돈산, γ-리놀렌산, 팀노돈산, 헥사엔산 및 이들의 혼합물 중에서 선택하는 것이 바람직하다.

연화제가 본 발명의 화장 조성물에 종종 혼입된다. 이러한 연화제의 양은 전체 조성물의 약 0.5％ 내지 약 50％, 바람직하게는 약 5％ 및 30 중량％이다. 연화제는 에스테르, 지방산 및 알콜, 폴리올 및 탄화수소와 같은 일반적인 화학 카테고리로 분류될 수 있다.

에스테르는 모노- 또는 디-에스테르일 수 있다. 허용되는 지방 디-에스테르의 예로는 디부틸 아디페이트, 디에틸 세바케이트, 디이소프로필 디메레이트, 및 디옥틸 숙시네이트를 들 수 있다. 허용되는 분지쇄 지방 에스테르는 2-에틸-헥실 미리스테이트, 이소프로필 스테아레이트 및 이소스테아릴 팔미테이트를 들 수 있다. 허용되는 3가 염기산 에스테르는 트리이소프로필 트리리놀리에이트 및 트리라우릴 시트레이트를 들 수 있다. 허용되는 직쇄 지방 에스테르는 라우릴 팔미테이트, 미리스틸 락테이트, 올레일 에루케이트 및 스테아릴 올리에이트를 들 수 있다. 바람직한 에스테르는 코코카프릴레이트/카프레이트 (코코-카프릴레이트와 코코카프레이트의 블렌드), 프로필렌 글리콜 미리스틸 에테르 아세테이트, 디이소프로필 아디페이트 및 세틸 옥타노에이트를 들 수 있다.

적합한 지방 알콜 및 산은 탄소수 10 내지 20의 화합물을 들 수 있다. 세 틸, 미리스틸, 팔미트 및 스테아릴 알콜 및 산이 특히 바람직하다.

연화제로서 작용할 수 있는 폴리올로는 직쇄 및 분지쇄 알킬 폴리히드록실 화합물을 들 수 있다. 예를 들면, 프로필렌 글리콜, 소르비톨 및 글리세린이 바람직하다. 또한, 폴리프로필렌 글리콜 및 폴리에틸렌 글리콜과 같은 중합체 폴리올이 유용할 수 있다. 또한, 부틸렌 및 프로필렌 글리콜이 투과성 향상제로서 특히 바람직하다.

연화제로 사용될 수 있는 탄화수소의 예로는 탄소수 12 내지 30의 탄화수소 쇄를 갖는 것을 들 수 있다. 구체적인 예로는 광유, 바셀린, 스쿠알렌 및 이소파라핀을 들 수 있다.

본 발명의 미용 조성물 안에서 다른 카테고리의 기능성 성분은 증점제이다. 증점제는 통상적으로 조성물의 0.1 내지 20 중량％, 바람직하게는 약 0.5％ 내지 10 중량％의 양으로 존재할 수 있다. 증점제의 예로는 비.피. 굳리치 컴파니(B. F. Goodrich Company)에서 상표명 카르보폴(Carbopol)로 구입할 수 있는 가교된 폴리아크릴레이트 재료를 들 수 있다. 검은 예를 들면 크산탄, 카라게난, 젤라틴, 카라야, 펙틴 및 로커스트빈 검 (locust beans gum)을 사용할 수 있다. 특정 환경하에, 증점 기능은 실리콘 또는 연화제로 작용하는 재료에 의해 달성될 수 있다. 예를 들어, 10 센티스트로크를 초과한 실리콘 검 및 글리세롤 스테아레이트 등의 에스테르가 이중 작용성을 갖는다.

산제가 본 발명의 미용 조성물에 혼입될 수 있다. 이들 산제는 백악, 활석, 퓰러토, 카올린, 전분, 스멕타이트(smectite) 점토, 화학적으로 개질된 마그네슘 알루미늄 실리케이트, 유기적으로 개질된 몬트모릴로나이트 점토, 수화된 알루미늄 실리케이트, 발연 실리카, 알루미늄 전분 옥테닐 숙시네이트 및 이들의 혼합물을 들 수 있다.

또한, 다른 보조제 미량 성분이 본 발명의 미용 조성물에 혼입될 수 있다. 이들 성분은 착색제, 유백제 및 향료를 포함할 수 있다. 이들 재료의 양은 본 발명의 조성물의 0.001 중량％ 내지 20 중량％ 이하의 범위일 수 있다.

조성물의 용도

본 발명에 따른 조성물은 주로 인간 피부에 국소적으로 적용되는 제품으로서, 특히 피부 컨디셔닝제 및 피부 유화제, 및 주름 또는 피부 노화를 방지하거나 감소시키는 제제이다.

사용시에, 적합한 용기 또는 적용기로부터 소량의 조성물, 예를 들면 1 내지 5 ㎖를 피부의 노출 부위에 적용하고, 경우에 따라, 손 또는 손가락 또는 적합한 장치를 이용하여 피부에 펴바르고(거나) 문지른다.

제품 형태 및 포장

본 발명의 국소적 피부 트리트먼트 조성물은 로션, 유액 크림, 크림 또는 젤로 제제화될 수 있다. 조성물은 조성물의 고유 점도 및 의도한 용도에 적합한 용기에 포장할 수 있다. 예를 들면, 로션 또는 에멀젼 크림을 병 또는 롤-볼 적용기, 또는 캡슐, 또는 추진제로 구동되는 에어로졸 장치 또는 손가락으로 작동하기에 적합한 펌프가 장착된 용기에 포장할 수 있다. 조성물이 크림인 경우, 튜브 또는 뚜껑이 있는 병 등의 변형되지 않는 병 또는 쥐어짤 수 있는 용기에 간편하게 저장할 수 있다.

따라서, 본 발명은 또한 본원에서 정의한 바와 같은 미용상 허용되는 조성물을 함유하는 밀폐 용기를 제공한다.

Claims

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(a) 레티닐 에스테르, 레티놀, 레티날 및 레틴산으로 이루어진 군으로부터 선택된 레티노이드 0.01％ 내지 10％;

(b) 지방산 아미드, 세라미드, 카로티노이드, 플라바노이드, 고리형 방향성 물질 (fragrances), 비고리형 방향성 물질, 인지질 유사체, 우레아, 포스파티딜 콜린, 스핑고마이엘린, 아라키돈산, 리놀레산, 리놀렌산, 미리스트산, 글리시레틴산, 포스파티딜 에탄올아민, 헥사데칸디오산, 12-히드록시스테아르산, 이소스테아르산, 아마인유, 엘라이드산, 비포나졸, 클림바졸, 클로트리마졸, 에코나졸, 케토코나졸, 미코나졸, 라우릴 히드록시에틸이미다졸린, 퀘르세틴, 쿠마린, 퀴놀린, 이소퀴놀린, 메티라폰으로 이루어진 군으로부터 선택되되, 이들 중 항균제를 필수적으로 포함하는 1종 이상의 화합물;

(c) 미용상 허용되는 비히클; 및

(d) 지방 알콜 또는 지방산 또는 둘 다

를 포함하며, 상기 (b) 화합물은 레티노이드에서 레틴산으로의 전환을 증가시킴으로써 레티노이드의 활성을 증가시키고, ARAT/LRAT (아실보조효소A (AcylCoenzymeA) (CoA):레티놀 아실 트랜스퍼라제/레시틴:레티놀 아실 트랜스퍼라제) 활성 억제, 레티놀 데히드로게나제 활성 향상, 레티날 리덕타제 활성 억제, CRABP-II (세포의 레틴산 결합 단백질 II, Cellular Retinoic Acid Binding Protein II)와 레틴산의 결합 길항 및 시토크롬 P450-의존성 레틴산 산화 억제로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 작용을 야기시키는 것인 피부 관리용 (skin care) 조성물.
제8항에 있어서, 항균제가 비포나졸, 클림바졸 또는 이들의 혼합물인 피부 관리용 조성물.
제8항에 있어서, 항균제가 클림바졸인 피부 관리용 조성물.
제8항에 있어서, 지방 알콜이 세틸 알콜인 피부 관리용 조성물.
제8항에 있어서, (b) 화합물이 피부 관리용 조성물의 약 0.001％ 내지 50％를 구성하는 피부 관리용 조성물.
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제8항에 있어서, 리놀레오일 모노에탄올아미드, 리놀레오일 디에탄올아미드, 팔미토일 모노에탄올아미드, 팔미토일 디에탄올아미드, 코코일 모노에탄올아미드, 코코일 디에탄올아미드 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된 지방산 아미드를 함유하지 않는 피부 관리용 조성물.