KR100864746B1 - 이중 구획 포장 내에 레티노이드, 레티노이드 부스터 및피토에스트로겐을 포함하는 피부 관리 제품 - Google Patents

이중 구획 포장 내에 레티노이드, 레티노이드 부스터 및피토에스트로겐을 포함하는 피부 관리 제품 Download PDF

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Abstract

약 0.001% 내지 약 10%의 레티노이드를 포함하는 제 1 조성물; 약 0.0001% 내지 약50%의 1종 이상의 레티노이드 부스터(booster) 및 약 0.001% 내지 약 10%의 피토에스트로겐을 포함하는 제 2 조성물; 제 1 조성물을 저장하기 위한 제 1 구획; 및 제 2 조성물을 저장하기 위한 제 2 구획을 포함하며, 여기에서 제 1 및 제 2 구획은 서로 연결되어 있는 안정한 피부 관리 제품.
레티노이드, 레티노이드 부스터, 피토에스트로겐

Description

이중 구획 포장 내에 레티노이드, 레티노이드 부스터 및 피토에스트로겐을 포함하는 피부 관리 제품{SKIN CARE PRODUCT CONTAINING RETINOIDS, RETINOID BOOSTER AND PHYTOESTROGENS IN A DUAL COMPARTMENT PACKAGE}
본 발명은 이중 구획 포장의 제 1 구획 내에 레티노이드를 포함하고 제 2 구획 내에 레티노이드 부스터(booster) 시스템 및 피토에스트로겐을 포함하는 안정한 피부 관리 조성물에 관한 것이다.
레티노이드(예를 들면, 레티놀 및 레티닐 에스테르)는 미용 제품에 일반적으로 사용되는 성분이다. 레티놀(비타민 A)은 인체에서 자연적으로 생성되는 내인성 화합물이며 정상적인 상피 세포 분화에 필수적이다. 천연 및 합성 비타민 A 유도체는 다양한 피부 질병의 치료에 광범위하게 사용되어 왔으며 피부 회복 또는 재생제로서 사용되어 왔다. 레티노산은 다양한 피부 상태, 예를 들면 여드름, 주름, 건선, 노화성 반점 및 변색을 치료하는데 사용되어 왔다. 예를 들면, 발퀴스트, 에이.(Vahlquist, A.) 등의 문헌[J. Invest. Dermatol., Vol. 94, Holland D.B. and Cunliffe, W.J.(1990), pp. 496-498]; 엘리스, 씨.엔.(Ellis, C.N.) 등의 문헌["Pharmacology of Retinols in Skin", Basel, Karger, Vol.3, (1989), pp. 249-252]; 및 PCT 특허 출원 제 WO 93/19743 호를 참고한다.
그러나 레티노이드 대사는 레티노이드를 이롭지 못한 부산물로 전환시켜서 피부 상태를 치료할 수 있는 이로운 레티노산의 양을 감소시킬 수 있다. 그러므로 몇몇 선행기술 참고문헌은 여드름, 주름, 건선, 노인성 반점 및 변색과 같은 피부 상태의 치료를 돕기 위해 다양한 천연 활성제를 사용하는 것을 교시한다. 예를 들면, 피토에스트로겐(즉, 에스트로겐 유사 활성을 가지며 식물에서 발견되는 천연 화합물)의 미용 및 치료 목적을 위한 사용이 증가되고 있다. 에스트로겐 및 에스트로겐처럼 작용하는 합성 화합물은 피부 층의 두께를 증가시키며 노화 진행 피부의 주름 형성을 감소시키는 것으로 공지되어 있다. 폐경기 이후에 나타나는 피부 건조증, 피부 탄력성 상실 및 부품과 같은 피부의 변화는 에스트로겐 생산의 결핍으로 인한 것이다. 에스트로겐 요법은 피부 노화와 연관된 많은 변화를 방지하거나 늦춘다(크레이디(Creidi) 등의 문헌["Effect of a Conjugated Oestrogen Cream(Premarin(등록상표)) on Aging Facial Skin", Maturitas, 19, p.211-213, 1994]).
선행기술에 몇몇 피토에스트로겐의 미용적으로 이로운 효과에 대한 것이 개시되어 있다. 예를 들면, 미국 특허 제 5,728,726 호는 티로신 키나제 저해 활성을 위한 제니스테인의 용도를 교시한다. 아본(Avon)의 미국 특허 제 5,847,003 호 및 제 5,834,513 호는 레티노이드와 혼합된 산소산 및 산소이산의 용도를 개시한다. 아본의 두 특허 모두 항산화제 비보플라보노이드, 예컨대 제니스테인 및 다이드제인이 선택적 성분으로서 사용된다는 것을 개시한다.
그러나 피토에스트로겐은 레티놀의 산화를 유도하므로 레티놀 분해에 기여하는 것으로 발견되었다. 조성물을 전달하기 위한 다-구획 시스템이 선행기술에 기 술되었지만, 어떠한 선행기술도 피토에스트로겐을 레티노이드로부터 분리해야 하는 필요성에 대하여 개시하지 않았다. 예를 들면, 본 발명의 양수인에게 등록된 미국 특허 제 5,914,116 호는 제 1 구획은 레티노이드를 포함하고 제 2 구획은 제 2의 상이한 이로운 효과를 제공하기 위한 제 2 활성제를 포함하는, 2종의 상이한 피부 활성제를 분리시켜서 피부에 대한 이로운 효과를 이중으로 제공하기 위한 2개의 분리된 용기를 기술한다.
그러므로, 레티노이드의 피부에 대한 이로운 효과를 피토에스트로겐의 레티노이드 촉진 효과와 함께 제공하는 조성물이 여전히 요구되고 있다.
본 발명은:
약 0.001% 내지 약 10%의 레티노이드를 포함하는 제 1 조성물;
0.0001% 내지 약 50%의 1종 이상의 레티노이드 부스터 및 약 0.001% 내지 약 10%의 피토에스트로겐을 포함하는 제 2 조성물;
제 1 조성물을 저장하기 위한 제 1 구획; 및
제 2 조성물을 저장하기 위한 제 2 구획을 포함하며, 여기에서 제 1 및 제 2 구획은 서로 연결되어 있는 안정한 피부 관리 제품을 제공한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "포함하는"은 "포함하는, 만들어지는, 구성되는(구성되거나) 본질적으로 구성되는"을 의미한다. 실시예 및 비교예를 제외하고, 또는 특별한 언급이 없다면, 물질의 양 또는 비 또는 반응의 조건, 물질의 물리적 성질 및(또는) 사용을 나타내는 본 명세서에 있어서의 모든 숫자는 단어 "약"으로 수식되는 것으로 이해된다.
본 발명의 조성물은, 바람직한 성분으로서, 레티닐 에스테르, 레티놀, 레티날 및 레티노산으로부터 선택된 레티노이드, 바람직하게는 레티놀 또는 레티닐 에스테르를 포함한다. 용어 "레티놀"은 레티놀의 하기 이성질체를 포함한다: 모든-트랜스-레티놀, 13-시스-레티놀, 11-시스-레티놀, 9-시스-레티놀, 3,4-디데히드로-레티놀, 3,4-디데히드로-13-시스-레티놀; 3,4-디데히드로-11-시스-레티놀; 3,4-디데히드로-9-시스-레티놀. 바람직한 이성질체는 모든-트랜스-레티놀, 13-시스-레티놀, 3,4-디데히드로-레티놀, 9-시스-레티놀이다. 가장 바람직하게는 모든-트랜스-레티놀인데, 이의 광범위한 상업적 구입 가능성 때문이다.
레티닐 에스테르는 레티놀의 에스테르이다. 용어 "레티놀"은 상기 정의한 바와 같다. 본 발명에 사용하기에 적절한 레티닐 에스테르는 레티놀의 C1-C30에스테르, 바람직하게는 C2-C20에스테르, 가장 바람직하게는 C2, C 3 및 C16에스테르인데, 이들을 보다 일반적으로 구입할 수 있기 때문이다. 레티닐 에스테르의 예는: 레티닐 팔미테이트, 레티닐 포르메이트, 레티닐 아세테이트, 레티닐 프로피오네이트, 레티닐 부티레이트, 레티닐 발러레이트, 레티닐 이소발러레이트, 레티닐 헥사노에이트, 레티닐 헵타노에이트, 레티닐 옥타노에이트, 레티닐 노나노에이트, 레티닐 데카노에이트, 레티닐 운데카노에이트, 레티닐 라우레이트, 레티닐 트리데카노에이트, 레티닐 미리스테이트, 레티닐 펜타데카노에이트, 레티닐 헵타데코노에이트, 레티닐 스테아레이트, 레티닐 이소스테아레이트, 레티닐 노나데카노에이트, 레티닐 아라키도네이트, 레티닐 베헤네이트, 레티닐 리놀레이트, 레티닐 올레이트를 포함하는데 이것으로 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 사용하기 바람직한 에스테르는 레티닐 팔미테이트, 레티닐 아세테이트 및 레티닐 프로피오네이트로부터 선택되는데, 이들이 상업적으로 구입하기 가장 용이하며 가격이 가장 저렴하기 때문이다. 레티닐 리놀레이트 및 레티닐 올레이트가 또한 그의 효능때문에 바람직하다.
레티놀 또는 레티닐 에스테르는 본 발명의 조성물에 약 0.001% 내지 약 10%, 바람직하게는 약 0.01% 내지 약 1%, 가장 바람직하게는 약 0.01% 내지 약 0.5%의 양으로 사용된다.
레티노이드는 피부 중에서 하기 차트 1에 기술된 메커니즘에 따라서 레티노산으로 효소적으로 전환되는 것으로 알려져 있다.
표피에서의 레티놀 대사: 효소명
Figure 112003023162573-pct00001
ARAT/LART=아실 보효소 A(CoA): 레티놀 아실 트랜스퍼라제/레시틴:레티놀
아실 트랜스퍼라제
CRABPII=세포의 레티노산 결합 단백질II(Cellular Retinoic Acid Binding Protein II)
놀랍게도 특정 화합물은 ARAT/LRAT, 레티날 리덕타제, CRABPII 및 레티노산 산화(레티노산 산화는 시토크롬 P450 시스템에 의해 촉매 반응됨)를 저해하는 반면에, 특정 기타 화합물은 레티놀 데히드로게나제를 증진하는 것으로 발견되었다. 이 화합물들은 집합적으로 본 명세서에서 "부스터"로 지칭되며 상기 차트 1에서 볼 수 있는 바와 같이 군 B1 내지 B5로 지정된다. 부스터는 단독으로 또는 서로 조합하여 레티노산으로 전환될 수 있는 레티놀의 양을 증가시키고 레티노산 분해를 저해하여 레티노이드 작용을 강화한다. 부스터는 레티노이드(예를 들면, 레티놀, 레티닐 에스테르, 레티날, 레티노산)와 함께 작용하며, 레티노이드는 피부에 내인성으로 존재한다. 그러나 바람직한 조성물은 성능을 최적화하기 위하여, 부스터와 공존하도록 레티노이드를 조성물 중에 포함한다.
본 발명은 부분적으로, 조성물 중량의 약 0.0001% 내지 약 50%, 바람직하게는 약 0.001% 내지 약 10%, 가장 바람직하게는 약 0.001% 내지 약 5%의 1종 이상의 부스터 화합물 및 미용학적으로 허용 가능한 부형제를 포함하는 제 2 조성물을 포함하는데, 여기에서 부스터 화합물은 생체 내 트랜스글루타미나제 분석 시에 10mM의 단독 또는 합한 농도에서 트랜스글루타미나제를 50% 초과로 저해한다.
본 발명의 조성물에 포함되는 부스터는 하기로 구성된 군으로부터 선택된다:
(a) 둘 다 B2; B3; B4로 구성된 동일한 군으로부터 선택되는 2종의 부스터;
(b) B1/B2; B1/B3; B1/B4; B1/B5; B2/B3, B2/B4; B2/B5; B3/B4; B3/B5; B4/B5로 구성된 군으로부터 선택되는 이중 조합 부스터;
(c) B1/B2/B3; B1/B2/B4; B1/B2/B5; B1/B3/B4; B1/B3/B5; B1/B4/B5; B2/B3/B4; B2/B3/B5; B2/B4/B5; B3/B4/B5로 구성된 군으로부터 선택되는 삼중 조합 부스터;
(d) B1/B2/B3/B4; B1/B2/B3/B5; B1/B2/B4/B5; B1/B3/B4/B5; B2/B3/B4/B5로 구성된 군으로부터 선택되는 4중 조합 부스터; 및
(e) B1/B2/B3/B4/B5의 부스터의 5개 군의 조합.
바람직한 조성물은 서로 다른 군으로부터의 1종 이상의 부스터를 포함한다(즉, 상기한 바와 같은 군(b) 내지 (e)). 그러나, 상이한 군으로부터 선택된 부스터의 임의의 조합이 본 발명의 조성물에 원하는 촉진 효과를 위해 사용될 수 있다.
본 발명에 부스터로서 포함되는 화합물은 먼저 상기 화합물이 표 A에 기재된 특정 농도에서 하기 2.1 내지 2.7에 기술된 특정 효소에 대한 시험관 내 마이크로솜 분석을 통과할 수 있는가 하는 성능을 기초로하여 선택된다. 그 다음에 화합물(단독 또는 또 하나의 부스터와 조합됨)에 대하여 10mM의 단독 또는 합한 농도에서 하기한 시험관 내 트랜스글루타미나제 분석을 수행한다. 상기 조합이 50% 초과로 트랜스글루타미나제를 저해한다면, 본 발명에 사용하기 적합하다. 부스터가 개별적으로 시험되어 트랜스글루타미나제 분석을 통과한다면, 트랜스글루타미나제 분석을 통과한 또 하나의 부스터 또는 조합과 혼합될 수 있다.
본 발명에 따른 바람직한 조성물은 10mM의 각각의 농도에서 트랜스글루타미나제를 50% 초과로 저해하는 부스터의 조합을 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "콘디쇼닝(conditioning)"은 건조 피부, 여드름, 광손상 피부, 주름 발생, 노인성 반점, 노화 피부를 예방 및 치료하고, 각질층 탄력성을 증가시키며, 피부를 미백하고, 피지 분비를 조절하며, 전반적으로 피부의 상태를 좋게하는 것을 의미한다. 조성물은 박피 및 표피 분화를 증진하기 위해 사용될 수 있다.
부스터는 하기 2.1 내지 2.7의 시험관 내 마이크로솜 분석을 통과한 화합물이다. 본 발명의 화합물은 하기 표 A에 기재된 농도에서 저해하거나 촉진한다. 표 A에 기재된 적어도 넓은 범위의 %까지, (단독으로 또는 또 하나의 화합물과 조합하여) 효소에 대하여 시험관 내 트랜스글루타미나제 분석을 수행하여 본 발명의 조성물에 포함시킬 수 있는지의 여부를 결정한다.
부스터 시험 농도 및 % 저해/증가
ARAT/LRAT 분석(B1 부스터 확인)
본 발명 화합물 농도 % 저해
넓은 범위 100μM >10%
바람직한 범위 100μM >25%
가장 바람직한 범위 100μM >40%
최적 범위 100μM >50%
레티놀 데히드로게나제 분석(B2 부스터 확인)
본 발명 화합물 농도 % 증가
넓은 범위 100μM >10%
바람직한 범위 100μM >15%
가장 바람직한 범위 100μM >20%
최적 범위 100μM >25%
레티날 리덕타제 분석(B3 부스터 확인)
본 발명 화합물 농도 % 저해
넓은 범위 100μM >5%
바람직한 범위 100μM >10%
가장 바람직한 범위 100μM >20%
최적 범위 100μM >35%
CRABPII 길항제 분석(B4 부스터 확인)
본 발명 화합물:RA 비 % 저해
넓은 범위 7000:1 >25%
바람직한 범위 7000:1 >50%
가장 바람직한 범위 70:1 >25%
최적 범위 70:1 >50%
레티노산 산화 분석(B5 부스터 확인)
본 발명 화합물 농도 % 저해
넓은 범위 100μM >25%
바람직한 범위 100μM >45%
가장 바람직한 범위 100μM >70%
최적 범위 100μM >80%

화합물을 본 발명의 조성물에 포함시킬 수 있는지의 적합성을 결정하기 위해 사용되는 시험관 내 마이크로솜 분석은 다음과 같다:
1. 물질
모든-트랜스-레티놀, 모든-트랜스-레티노산, 팔미토일-CoA, 디라우로일 포스파티딜 콜린, NAD 및 NADPH를 시그마 케미칼 캄파니(Sigma Chemical Company)로부 터 구입했다. 마이크로솜 분석을 위한 레티노이드의 원액은 HPLC 등급 아세토니트릴 중에 제조했다. HPLC 분석을 위한 모든 레티노이드 표준 원액은 에탄올 중에 제조했으며, N2의 대기, -70℃에서 저장하고, 저장 시에는 호박색 조명 아래에서 얼음 위에 유지했다. 기타 화학물질 및 저해제는 미용 재료 공급자 또는 화학 회사, 예를 들면 알드리치(Aldrich) 또는 인터내셔날 플레이버스 앤드 프래그런시스 (International Flavors and Fragrances)로부터 상업적으로 구입할 수 있었다.
2. 방법
2.1 RPE 마이크로솜의 분리 (제이.씨. 사리(J. C. Sarri) & 디.엘. 브레드버그(D.L. Bredberg)의 문헌["CoA and Non-CoA Dependent Retinol Esterification in Retinal Pigment Epithelium", J. Bill Chem. 263, 8084-8090(1988)]의 변형).
50개의 동결된 망막과 제거한 수성 체액이 담긴 이등분한 소의 세안컵을 더블유. 엘. 로손 Co.(W. L. Lawson Co., 미국 네바다주 링컨)로부터 구입했다. 눈을 하룻밤동안 해동하고 착색된 홍채막을 겸자를 사용하여 박리 제거했다. 진하게 착색된 세포를 미술용 붓 또는 러버 폴리스맨(rubber policeman)으로 문질러서 각각의 세안컵을 2x0.5mL의 차가운 완충액(0.1M PO4/1mM DTT/0.25M 수크로스, pH 7)으로 세척했다. 세포 현탁액을 홍채막에 첨가하고 현탁액을 비이커 중에서 테플론 교반 바아를 사용하여 수분간 교반했다. 현탁액을 성긴 필터(스펙트라(Spectra)/Por P25μ 기공 크기 폴리에틸렌 메쉬)를 통하여 여과하여 큰 입자를 제거하고, 생성된 진하게 착색된 현탁액을 Glas-Col을 사용하여 모터 구동 테플론 균질화기로 균질화시켰다. 세포 균질물을 20,000g에서 30분간 원심분리했다 (소르발(Sorvaal) 모델 RC-5B 원심분리기, SS34 로터, 2.5x10cm 시험관 내, 14,000RPM). 생성된 상청액을 150,000g에서 60분간 더 원심분리시켰다(벡크만(Beckmann) 모델 L80 초원심분리기, SW50.1 로터, 13x51mm 시험관 내, 40,000RPM). 생성된 펠릿을 ∼5mL의 0.1M PO4/5mM DTT, pH7의 완충액에 히트 시스템즈 울트라소닉스, Inc.(Heat Systems Ultrasonics, Inc.)의 모델 W185D Sonifier Cell Disruptor를 사용하여 분산시키고, 생성 마이크로솜 분산액을 작은 시험관 내에 부분 표본으로 만들고 -70℃에서 저장했다. 마이크로솜의 단백질 농도를, 표준으로서 BSA를 사용하는 바이오라드(BioRad) 색소 결합 분석을 사용하여 측정했다.
2.2 쥐 간 마이크로솜의 분리(알. 마르티니(R. Martini) 및 엠. 머레이(M. Murray)의 문헌["Participation of P450 3A Enzymes in Rat Hepatic Microsomal Retinoic Acid 4-Hyroxylation", Archives Biochem. Biophys. 303, 57-66(1993)]의 변형).
대략 6g의 동결된 쥐의 간(Harlan Sprague Dawley 쥐로부터 얻음, 애큐릿 케미칼 앤드 사이언티픽 Corp.(Accurate Chemical and Scientific Corp.))을 3배 부피의 0.1M 트리스/0.1M KCl/1mM EDTA/0.25M 수크로스, pH 7.4에 브링크만 폴리트론 (Brinkmann Polytron)을 사용하여 균질화시켰다. 생성된 조직 현탁액을 상기한 모터 구동 테플론 균질화기 중에서 더 균질화시켰다. 생성된 균질물을 10,000g에서 30분, 20,000g에서 30분 및 30,000g에서 15분간 연속적으로 원심분리하고, 생성된 상청액을 105,000g에서 80분간 초원심분리했다. 펠릿을 상기한 바와 같은 ∼5mL의 0.1M PO4/0.1mM EDTA/5mM MgCl2, pH 7.4 중에서 초음파 처리하고 부분표본으로서 -70℃에서 저장했다. 단백질 농도를 상기한 바와 같이 측정했다.
2.3 ARAT 및 LRAT 활성 분석(B1의 확인)
하기 방법은 제이.씨. 사리 & 디.엘. 브레드버그의 문헌["ARAT & LRAT Activities of Bovine Retinal Pigment Epithelial Microsomes", Methods Enzymol., 190, 156-163(1990)]에 기술되어 있는 방법의 변형이다. 하기 완충액을 제조하고 4℃에서 저장했다: 0.1M PO4/5mM 디티오트레이톨, pH 7.0(PO4/DTT). 분석일에, 완충액의 mL 당 2mg의 BSA를 첨가하여 PO4/DTT/BSA 실시 완충액을 얻었다. 아세토니트릴 중 1mM의 레티놀 기질을 제조하고 호박색 병 내에 질소 기체 하, -20℃에서 저장했다. 실시 완충액 중 4mM 팔미토일-CoA의 용액(부분표본으로 저장) 및 에탄올 중 4mM 디라우로일 포스파티딜 콜린의 용액을 제조하고 -20℃에서 저장했다. H2O, 에탄올, 아세토니트릴 또는 DMSO 중 10mM 원액으로서 저해제를 제조했다. 50㎍/mL의 부틸화 히드록시톨루엔(BHT)을 포함하는 순수한 에탄올을 사용하여 실활 용액을 제조하고, 50㎍/mL의 BHT를 포함하는 헥산 용액을 추출을 위해 사용했다.
2드램 유리 바이알에 다음을 순서대로 첨가한다: 500μL의 총부피를 제공하 는 PO4/DTT/BSA 완충액, 5μL 아실 공여체(4mM 팔미토일-CoA 및(또는) 디라우로일 포스파디딜 콜린), 5μL의 저해제 또는 용매 블랭크(10mM 원액 또는 희석액) 다음에 대략 15㎍의 RPE 마이크로솜 단백질(대략 15μL의 ∼1mg/mL의 마이크로솜 단백질 부분표본). 37℃에서 5분간 배양하여 반응 온도를 평형화한 다음 5μL의 1mM 레티놀을 첨가한다. 바이알의 뚜껑을 덮고 5초간 와류혼합하고 37℃에서 30-90분간 배양한다. 0.5mL의 에탄올/BHT를 첨가하여 반응을 종결시킨다. 3mL의 헥산/BHT를 첨가하여 레티노이드를 추출하고, 시험관을 수초간 수회 와류혼합하고 시험관을 저속으로 5분간 원심분리하여 층을 신속하게 분리한다. 상부 헥산층을 투명한 바이알로 옮기고, 수성층을 또 하나의 3mL의 헥산/BHT로 상기한 바와 같이 재추출한다. 헥산층을 합하고 37℃에서 질소 기체 흐름 하에 가열된 알루미늄 블록 상에서 건조시켜서 헥산을 증발시킨다. 건조된 잔류물을 -20℃에서 HPLC 분석 시까지 저장한다. ARAT 및 LRAT 활성을 위한 레티닐 팔미테이트 및 레티틸 라우레이트의 양을 각각 하기하는 바와 같이 HPLC 신호를 통합하여 정량했다.
배양 용액은 40μM의 아실 공여체, 100μM 이하의 저해제, 10μM의 레티놀, 대략 30㎍/mL의 마이크로솜 단백질 및 거의 0.1M의 PO4, pH 7/5mM의 DTT/2mg/mL의 BSA를 포함한다는 것을 주목한다. 레티놀 첨가에 이은 모든 단계를 어두운 장소에서 또는 호박색 조명 아래에서 수행했다.
2.4 레티놀 데히드로게나제 활성 분석(B2의 확인)
하기 원액을 제조했다:
50mM의 KH2PO4, pH 7.4 완충액, 멸균여과.
DMSO 중 10mM의 모든 트랜스 레티놀(시그마 R7632).
멸균수 중 200mM의 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 포스페이트, 소듐염(NADP)(시그마 N0505).
적절한 용매 중 40mM의 시험 화합물(물, 완충액, 에탄올, 클로로포름 또는 DMSO).
50mM KH2PO4, pH 7.4 완충액 중 쥐 간 마이크로솜의 1:10 희석액(4㎍/㎕).
돌려서 닫는 뚜껑이 있는 2드램의 유리 바이알에, 다음 순서대로 첨가한다:
400㎕의 최종 부피를 제공하는 완충액
25㎕의 희석 마이크로솜(최종=100㎍)-대조용에 대하여는 비등 마이크로솜을 사용하고 시험 샘플에 대하여는 정상적인 마이크로솜을 사용한다.
4㎕의 200mM NADP(최종=2mM)
1㎕의 40mM 시험 화합물(최종=100μM)
8㎕의 10mM 레티놀(최종=200μM)
바이알을 37℃ 진탕 수욕에서 45분간 배양한다. 500㎕의 빙냉 에탄올을 각각의 바이알에 첨가하여 반응을 종결시킨다. 레티노이드를 빙냉 헥산으로 2회 추출한다(추출 당 2.7mL). 제 1 추출 도중에 각 샘플의 추출 효능을 모니터링하기 위한 수단으로서 레티틸 아세테이트(5㎕의 900μM 원액)를 각각의 바이알에 첨가한다. 샘플을 10초간 와류혼합한 다음 벡크만 (Beckman) GS-6R 원심분리기 중에서 5 ℃, 1000rpm에서 5분간 약하게 원심분리시켰다. 투명한 2드램 바이알로의 각각의 추출 후에 레티노이드를 포함하는 상부 헥산층을 수성층으로부터 제거한다. 헥산을 질소 기체의 온화한 흐름 중에서 증발시킨다. 건조된 잔류물을 HPLC 분석 시까지 -20℃에서 저장한다.
2.5 레티날 리덕타제 활성의 분석(B3 확인)
다음을 대체하여 모든 원액을 상기한 바와 같이 제조했다.
DMSO 중 10mM의 모든 트랜스 레틴알데히드(시그마 R2500)-레티놀 대신.
멸균수 중 200mM의 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 포스페이트, 환원형, 테트라소듐염(NADPH)(시그마 N7505)-NADP 대신.
돌려서 닫는 뚜껑이 있는 2드램 유리 바이알에 다음을 순서대로 첨가한다:
400㎕의 최종 부피를 제공하는 완충액
25㎕의 희석 마이크로솜(최종=100㎍)-대조용에 대하여는 비등 마이크로솜을 사용하고 시험 샘플에 대하여는 정상적인 마이크로솜 사용.
4㎕의 200mM NADPH(최종=2mM)
1㎕의 40mM 시험 화합물(최종=100μM)
3㎕의 10mM 레틴알데히드(최종=75μM)
상기한 바와 동일한 배양 및 추출 방법을 수행한다.
2.6 CRABPII 길항제 분석(B4 확인)
2.6.1 CRABPII의 합성
a. 발현 시스템
유전자 CRABPII를 pET 29a-c(+) 플라스미드(노바겐(Novagen)) 중에 클로닝했다. 클로닝 유전자는 강한 박테리오파지 T7 전사 및 번역 시그날에 의해 조절되었다. T7 폴리머라제의 공급은 숙주 세포 이. 콜리(E. Coli) BLR(DE 3)pLysS(노바겐)에 의해 제공되었다. 후자는 IPTG의 존재에 의해 유도되는, lacUV5 조절 하의 T7 폴리머라제의 염색체 복제물을 갖는다. 제조사(노바겐)의 프로토콜에 따른 형질전환에 의해 플라스미드가 이. 콜리 BLR(DE3)pLysS 내로 이입되엇다.
b. 유도
형질전환 세포의 하룻밤 동안의 배양물을 50㎍/mL 카나마이신 및 25㎍/mL 클로람페니콜을 포함하는 2xYT에 1:100 희석했다. 37℃에서 진탕시키면서 600nm에서의 OD가 0.6-0.8이 될 때까지 세포를 성장시켰다. 그 다음에 IPTG를 1mM의 최종 농도로 첨가하고 배양물을 2시간 동안 더 배양했다. 실온에서 10분간 5000g에서 원심분리하여 세포를 회수했다. 펠릿을 -20℃에서 저장했다.
2.6.2 정제
정제를 문헌[Norris and Li, 1997]에 기술된 방법에 따라서 수행했다.
a. 용균
동결 펠릿을 RT에서 해동하고 펠릿 1-2배 부피의 신선하게 제조된 용균 완충액(50mM 트리스-HCl, pH 8, 10%(w/v) 수크로스, 1mM EDTA, 0.05%(w/v) 소듐 아지드, 0.5mM DTT, 10mM MnCl2, 2.5mM 페닐메틸술포닐 플루오라이드, 2.5mM 벤즈아미딘, 6㎍/mL DNase)에 재현탁시켰다. 세포용해물을 실온에서 30분간 배양했다. 추 가의 용균을 초음파처리에 의해 수행했다(5회의 30초간의 얼음 상에서의 지연이 교대로 시행되는 6회의 30초간의 10,000psi에서의 버스트(burst)). 세포용해물의 불용성 분획을 4℃, 15000rpm에서의 1시간 동안의 원심분리에 의해 제거하고 상청액을 -20℃에서 저장했다.
b. 세파크릴 (Sephacryl) S300에서의 겔 여과
단계 a로부터의 상청액을 실온에서 세파크릴 S-300(파마시아(Pharmacia))의 2.5x100cm 컬럼에 로드했다. 용출 완충액은 20mM 트리스-HCl, pH 8, 0.5mM DTT, 0.05% 소듐 아지드(완충액 A)이었다. 유속은 2mL/분이었다. 수집된 2-mL 분획을 280nm에서 자외선 흡광도를 체크했다. 피크를 나타내는 분획을 CRABPII의 존재에 대하여 SDS-페이지에 의해 검사했다.
c. 음이온 교환 크로마토그래피
CRABPII를 포함하는 2mL의 겔 여과 분획을 4차 아민 음이온 교환 컬럼 FPLC(Fast Protein Liquid Chromatography) 유형 모노Q(파마시아)에 로드했다. 100% 완충액 A로부터 30% 완충액 B(100% 완충액 B=완충액 A+250mM NaCl)로의 구배 완충액을 사용하여 CRABPII를 실온에서 20분 주기로 용출했다. 1mL-분획을 매분마다 수집했다. CRABPII의 존재를 SDS 페이지에 의해 한번 더 체크했다. 동결 건조 이전에 CRABPII를 4℃에서 바이알 지지 부착물이 있는 마이크로모듈로 (Micromodulyo) 1.5K (에듀워즈 하이 배큠 인터내쇼날(Edwards High Vaccum International))를 사용하여 저장했다. 결합 분석에 사용될 때까지 제습된 샘플을 실온에서 저장했다.
d. CRABPII 존재의 검출
CRABPII의 발현 및 정제를 7-15%의 폴리아크릴아미드 겔(바이오라드)에서의 변성 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-PAGE) 분석을 사용하여 확인했다. 10μL의 샘플을 10μL의 2X 로딩 완충액(100mM 트리스-HCl pH 6.8, 4% SDS, 0.2% BPB, 20% 글리세롤, 1mM DTT)과 혼합하고 가열(80℃에서 2분)에 의해 변성시켰다. 샘플을 1X 트리스-글리신 완충액(바이오라드) 중에 침지된 겔에 로드하고 일정한 전류(25mA)를 실온에서 1시간 동안 가했다. 쿠마시 블루 염색 후에, 단백질을 벤치마크 (Benchmark) 예비염색 단백질 래더(지브코 비알엘(Gibco BRL))에 의해 측정된 그의 분자량에 따라서 확인했다.
웨스턴 블로트법을 사용하여 CRABPII의 존재를 확인했다. SDS-PAGE 상에서 분리된 단백질을 바이오라드 카세트를 사용하는 이모빌론 (Immobilon)-P 전달막(밀리포어(Millipore))에 전달시켰다. 전달은 1X 트리스-글리신 완충액(바이오라드)+10% 메탄올 중에서 이루어졌다. 전류(60mA)를 3시간 동안 가하여 단백질이 막을 통하여 이동되도록 했다. 그 후에 막을 1X TBS 중 5% 건조 우유로 실온에서 1시간 차단하고 동일한 완충액 중 CRABPII에 대한 1차 항체(마우스 항클론 5-CRA-B3의 1/1000 희석물)로 4℃에서 하룻밤동안 프로브했다. 다음날, 막을 PBS로 세척(3x5분)한 다음 1:2000 희석의 2차 항체, 퍼옥시다제 접합 항-마우스 항체(ECLTM, 아머샴(Amersham))와 실온에서 1시간 동안 배양했다. 막을 1xPBS(3x5분)으로 세척하고 ECL 검출 키트를 제조사(아머샴) 지시에 따라서 사용하여 단백질을 검출했다.
정제된 CRABPII의 농도는 BSA 키트(피어스(Pierce))를 사용하여 검출했다.
2.6.3 방사능 결합 분석
220pmol의 CRABPII를 20mM 트리스-HCl 완충액, pH 7.4 중에서 15pmol의 방사능 모든 트랜스 레티노산(NEN)과 70μL의 총 부피로 배양했다. 경쟁 분석을 위해, 과량의 또 하나의 리간드(6670:1, 670:1 또는 70:1)를 혼합물에 첨가했다. 실온, 어두운 장소에서 1시간 동안 반응을 진행시켰다. 결합된 모든-트랜스 레티노산으로부터 비결합 모든 트랜스 레티노산을 분리하기 위하여, 6kD의 컷-오프 미니크로마토그래피 컬럼(바이오라드)을 사용했다. 마이크로플렉스 (Microplex) 매니폴드를 제조사(파마시아) 지시에 따라서 사용하여 저장 완충액을 버렸다. 샘플을 컬럼에 로드하고 30분간 중력에 의해 분리시켰다. CRABPII에 결합된 레티노산("RA")이 여액 중에 나타나며 유리 RA는 컬럼 중에 잔류했다. 여액의 방사능을 신틸레이션 카운터에 의해 측정했다.
2.7 NADPH 의존 레티노산 산화의 분석(B5 확인)
하기 방법은 알. 마르티니 및 엠. 머레이의 문헌["Participation of P450 3A Enzymes in Rat Hepatic Microsomal Retinoic Acid 4-Hyroxlation", Archives Biochem. Biophys. 303, 57-66(1993)]에 기술된 방법의 변형이다. 하기 분석 완충액을 제조하고 4℃에서 저장했다: 0.1M PO4/0.1mM EDTA/5mM MgCl2, pH7.4. 분석일에, 완충액 중 60mM의 NADPH 용액을 제조했다. 저해제 원액, 산성화 에탄올/BHT 실활 용액 및 헥산/BHT를 상기한 바와 같이 제조한다. 15mM의 원액(DMSO 중)을 에 탄올로 희석하여 1mM 레티노산 실시 용액을 제조했다.
2드램 바이알에, 다음 순서대로 첨가한다: 500μL의 최종 부피를 제공하기 위한 분석 완충액, 20μL의 60mM NADPH, 5μL의 저해제 또는 용매 블랭크, 다음에 대략 2mg의 쥐 간 마이크로솜 단백질. 37℃에서 5분간 배양한 다음에, 5μL의 1mM 레티노산 실시 용액을 첨가한다. 37℃에서 60분간 배양을 계속한다-바이알에 뚜껑을 덮지 않았는데, 산화 과정은 NADPH에 더하여 분자 O2를 필요로 하기 때문이다. 상기한 바와 같이 산성화 에탄올/BHT로 종결시키고 헥산/BHT로 추출한다. 신속하게 용출되는 극성 레티노산 대사물(4-옥소 레티노산으로 예상됨)을 하기와 같이 HPLC 시그날의 통합에 의해 정량한다.
레티노산 첨가 이후의 모든 단계를 어두운 장소 또는 호박색 조명 아래에서 수행했다는 것을 주목한다. 최종 배양 용액은 2.4mM의 NADPH, 100μM 이하의 저해제, 10μM의 레티노산, 대략 4mg/mL의 쥐 간 마이크로솜 단백질 및 거의 0.1M PO4/0.1mM EDTA/5mM MgCl2를 포함했다.
개개 레티노이드의 HPLC 분석
각각의 바이알 잔류물을 100μL의 메탄올로 용해시켜서 HPLC에 의한 레티노이드 정량 샘플을 제조했다. 용액을 1mL 쉘 바이알 내의 150μL의 유리 원추형 시험관으로 옮기고, 뚜껑을 긴밀하게 닫고, 워터스 (Waters) 715 오토샘플러 (Autosampler)에 놓았다. 60μL의 부분 표본을 즉시 주입하고 레티노이드 함량에 대해 분석했다.
크로마토그래피 장치는 워터스 600 구배 조절기/펌프, 워터스 966 포토다이오드 어레이 (Photodiode Array) 검출기 및 워터스 474 스캐닝 플루오레센스 (Scanning Fluorescence) 검출기로 구성되었다. 2개의 HPLC 프로토콜을 레티노이드 분석에 사용했다. ARAT 및 LRAT 분석을 위해, 레티놀 및 레티놀 에스테르의 분리를 워터스 3.9x300mm C18 노바팩 (Novapak) 역상 분석 컬럼 및 워터스 센트리 노바팩 (Waters Sentry NovaPak) C18 가드 컬럼에 의해 1mL/분의 유속으로 조정된 80:20(v/v) 메탄올/THF 등속도 이동상을 사용하여 10분간 수행했다. 용출물을 325nm에서의 흡광도 및 325ex/480em에서의 형광도에 대하여 모니터링했다. 에이.비. 바루아(A. B. Barua)의 문헌["Analysis of Water-Soluble Compounds: Glucoronides", Methods Enzymol. 189, 136-145(1990)]에 의해 기술된 구배 시스템의 변형을 이용하는 레티놀 및 레티노산 산화 분석을 위해 보다 짧은 워터스 3.9x150mm C18 노바팩 역상 분석 컬럼 및 워터스 센트리 노바팩 C18 가드 컬럼을 사용하여 레티노산 및 알콜을 분리했다. 이 시스템은 10mM 암모늄 아세테이트를 포함하는 68:32(v/v)의 메탄올/물로부터 4:1(v/v)의 메탄올:디클로로메탄까지의 20분간의 선형 구배 후의 5분간의 1mL/분 유속의 유지로 구성되었다. 컬럼 용출물을 300nm에서 400nm까지 모니터링했다.
이들 프로토콜은 각 분석에 적절한 레티노산, 알콜, 알데히드 및(또는) 에스테르를 확실하게 용해시킬 수 있는 성능 및 분리의 상대적 신속성을 기준으로 하여 선택되었다. HPLC에 의한 개개 레티노이드의 확인은 미지 피크 체류 시간과 구할 수 있는 검증된 레티노이드 표준과의 정확한 매치 및 미지 피크의 구할 수 있는 검 증된 레티노이드에 대한 UV 스펙트럼 분석(300-400nm)을 기초로 했다.
트랜스글루타미나제 분석에서의 추가 시험에 적합한 부스터는 하기 표 B1 내지 B5에 기재된 부스터를 포함하지만 이것으로 제한되는 것은 아니다.



ARAT/LRAT 저해제(B1)
부류 화합물 % 저해전체TG(-ROH/RE) 전체 TG(IC50) % 저해ARAT(10㎛) % 저해ARAT(100㎛) % 저해LRAT(10㎛) % 저해LRAT(100㎛)
카로테노이드 크로세틴 3.75E-05 15% 34% 0 15%
지방산 아미드 & 기타 계면활성제 아세틸 스핀고신 6.78E-06 19%+/-12 62%+/-11 10%+/-10 50%+/-18
지방산 아미드 & 기타 계면활성제 C13 베타-히드록시 산/아미드 17% 28% 25%
지방산 아미드 & 기타 계면활성제 피마자유 MEA 3.25E-05
지방산 아미드 & 기타 계면활성제 코카미도프로필 베타인 25%
지방산 아미드 & 기타 면활성제 코코 히드록시에틸이미다졸린 2.84E-07 68% 68%
지방산 아미드 & 기타 계면활성제 코코아미드-MEA(또는 코코일 모노에탄올아미드) 11% 13% 34%
지방산 아미드 & 기타 계면활성제 글리세롤-PCA-올레이트 41%+/-6 58%+/-2
지방산 아미드 & 기타 계면활성제 헥사노아미드 20%
지방산 아미드 & 기타 계면활성제 헥사노일 스핀고신 9.99E-05 28%+/-4 37%+/-9
지방산 아미드 & 기타 계면활성제 히드록시에틸-2-히드록시-C12 아미드 3.29E-05 35% 35%
지방산 아미드 & 기타 계면활성제 히드록시에틸-2-히드록시-C16 아미드 25% 30%
지방산 아미드 & 기타 면활성제 라우로일 사르코신 20%
지방산 아미드 & 기타 계면활성제 리도카인 12% 0

부류 화합물 % 저해전체TG(-ROH/RE) 전체 TG(IC50) % 저해ARAT(10㎛) % 저해ARAT(100㎛) % 저해LRAT(10㎛) % 저해LRAT(100㎛)
지방산 아미드 & 기타 계면활성제 리놀레아미드-DEA(또는 리놀레오일 디에탄올아미드) 59% 12%+/-13 43%+/-3 11%+/-9 51%+/-15
지방산 아미드 & 기타 계면활성제 리놀레아미드-MEA(또는 리놀레오일 모노에탄올아미드) 1.61E-05 14% 35% 20%+/-8 35%
지방산 아미드 & 기타 계면활성제 리놀레아미도프로필 디메틸아민 69%+/-18 75%+/-4
지방산 아미드 & 기타 계면활성제 멜린아미드 64%+/-15 43%+/-2 21
지방산 아미드 & 기타 계면활성제 미리스토일 사르코신 41%+/-14 11%+/-11
지방산 아미드 & 기타 계면활성제 올레일 베타인 2.80E-05 47%
지방산 아미드 & 기타 계면활성제 팔미트아미드-MEA 6% 23% 12% 33%
지방산 아미드 & 기타계면활성제 스테아릴히드록시아미드 10% 10%
지방산 아미드 &기타 계면활성제 위트레흐트(Utrecht)-1 21% 43% 54% 51% 48%+/-6
지방산 아미드 &기타 계면활성제 위트레흐트-2 3.47E-06 42% 83%+/-9 51% 92%+/-3
플라보노이드 나린제닌 33% 14%
향료 알릴 알파-이오논 16%+/-14 22%+/-23 17%+/-10 36%/-7
향료 알파-다마스콘 3.35E-04 67%+/-27 83%+/-12 87%+/-6 98%+/-1
향료 알파-이오논 9.27E-04 45%+/-27 49%+/-30
향료 알파-메틸 이오논 67% 77%
향료 알파-테르피네올 26% 25%
향료 베타-다마스콘 45% 84% 52% 92%
향료 브라마놀 70% 75%
향료 다마스케논 23% 70% 29% 79%
향료 델타-다마스콘 58% 87% 64% 95%

부류 화합물 % 저해 전체TG(-ROH/RE) 전체 TG(IC50) % 저해ARAT (10㎛) % 저해ARAT (100㎛) % 저해LRAT(10㎛) % 저해LRAT(100㎛)
향료 디히드로 알파-이 오논 13% 18%
향료 에틸 사프라네이트 51% 49%
향료 펜칠 알콜 12% 4%
향료 감마-메틸 이오논 21% 38%
향료 이소부틸 이오논 8% 45%
향료 이소시클로제라니올 18% 16%
향료 이소다마스콘 80% 92%
향료 리랄 1.27E-04 76% 71%
향료 산타론 23% 12%
향료 산타놀 15% 43%
향료 팀베롤 34% 33%
향료 토날리드 50% 33%
향료 트라세올리드 41% 21%
혼합 코코 트리메틸암모늄 C1- 27%
혼합 우로솔 산 1.46E-6 21% 28%
비환형 향료 시트랄 20%
비환형 향료 시트로넬롤 30% 0
비환형 향료 파르네솔 9.35E-05 23%+/-18 53%+/-18 10%+/-7 53%+/-19
비환형 향료 제라니올 7.83E-03 13% 32%
비환형 향료 제라닐 제라니올 38%+/-12 81%+/-6 16%+/-9 77%+/-13
비환형 향료 리나툴 28% 0
비환형 향료 노나디에네알 20%
비환형 향료 슈도이오논 12% 37%
포스포리피드 디옥틸포스파티딜 에탄올아민 23% 50%+/-2 0 17%+/-17
우레아 디메틸이미다졸리디논 22%
우레아 이미다졸리디닐 우레아 35%

레티놀 데히드로게나제 활성제(B2)
부류 화합물 % 증가 레티놀 데히드로게나제
포스포리피드 포스파티딜 콜린 21% 증가
포스포리피드 스핀고마이엘린 26% 증가

레틴알데히드 리덕타제 저해제(B3)
부류 화합물 전체 TG(IC50) % 저해 레티날 리덕타제
알데히드 바닐린 9.70E-03 6%
지방산 아라키드산 20%
지방산 아라키드산 49%
지방산 리놀레산 1.63E-04 62%+/-2
지방산 리놀렌산 1.34E-04 54%+/-16
지방산 미리스트산 1.72E-05 26%
혼합 암사크린 6.26E-06 22%+/-8
혼합 카르벤옥솔론 3.61E-07 26%+/-2
혼합 글리시르레틴산 8.64E-06 38%=/-1
포스포리피드 포스파티딜 에탄올아민 37%

CRABPII 길항제(B4)
부류 화합물 전체 TG(IC50) % 저해 CRABPII
지방산 엘라이드산 6.50E-05 >50%
지방산 헥사데칸디오산 1.30E-04 >50%
지방산 12-히드록시스테아르산 2.91E-05 >50%
지방산 이소스테아르산 6.88E-05 >50%
지방산 아마인유 >50%

레티노산 산화 저해제(B5)
부류 화합물 전체 TG(IC50) % 저해레티노산 (10μM) % 저해레티노산 (100μM)
이미다졸 비포나졸 89% 100%
이미다졸 클림바졸 4.47E-06 80% 92%
이미다졸 클로트리마졸 76% 85%
이미다졸 에코나졸 88% 100%
이미다졸 케토코나졸 1.85E-07 84% 84%
이미다졸 미코나졸 2.78E-07 74% 86%
지방산 아미드 & 기타 계면활성제 라우릴 히드록시에틸이미다졸린 4.67E-07
지방산 아미드 & 기타 계면활성제 올레일 히드록시에틸아미다졸린 3.02E-05 54% 80%
플라보노이드 퀘르세틴 6.29E-05 40% 74%
쿠마린 쿠마린
퀴놀린 (7H-벤즈이미다조[2,1-a]벤즈[de]-이소퀴놀린-7-온 8.59E-07
퀴놀린 히드록시퀴놀린(카르보스티릴) 3.64E-04
퀴놀린 메티라폰(2-메틸-1,2-디-3-피리딜-1-프로판) 47%

부스터 또는 그의 조합은 하기 트랜스글루타미나제 분석 시 10mM의 농도에서 트랜스글루타미나제(하기에는 "TGase")를 50% 이상 저해한다.
TGase 분석
본 발명 화합물 농도 % 저해
넓은 범위 10mM >50%
바람직한 범위 1mM >50%
가장 바람직한 범위 100μM >50%
최적 범위 10μM >50%

트랜스글루타미나제 분석 및 각화세포 분화
표피에서의 말단 분화 도중에, 각화 엔벨로프(CE)로 공지된 15nm 두께의 단백질 층이 세포 주위의 내부 표면에 형성된다. CE는 표피에서 발현되는 2종 이상 의 상이한 트랜스글루타미나제(TGase)의 작용에 의해 촉매 반응되는 Nε-(Y-글루타밀)리신 이소디펩티드 결합의 형성에 의해 함께 가교결합된 여러 별개의 단백질로 구성된다. TGase I은 표피의 분화된 층, 특히 과립층 중에서 풍부하게 발현되지만, 비분화 기본 표피에서는 존재하지 않는다. 그러므로 TGase I은 TGase I의 다량이 보다 더 분화된 상태를 나타내는 표피 각화세포 분화의 유용한 지표이다. 하기 실시예에서 TGase I 항체를 사용하는 ELISA 기초 TGase I 분석을 사용하여 배양된 각화세포의 분화 상태를 분석했다.
각화세포(상기한 바와 같이 배양됨)를 96웰 플레이트에 웰 당 200㎕ 배지 중 4,000-5,000 세포의 밀도로 도포했다. 2 내지 3일간의 배양 후에 또는 세포가 ∼50%로 밀집될 때까지 배양 후에 배지를 시험 화합물을 포함하는 배지로 교체했다(시험 당 5개의 동형배양물). 세포를 96시간 더 배양한 후에 배지를 흡인하고 플레이트를 -70℃에서 저장했다. 플레이트를 동결기로부터 꺼내고, 세포를 200㎕의 1xPBS로 2회 세척했다. 세포를 실온(R/T)에서 1시간 동안 TBS/5% BSA(세척 완충액, 소혈청 알부민)와 함께 배양했다. 다음에 TGase 1차 항체를 첨가했다: 세척 완충액 중에 1:2000으로 희석된 50㎕의 단클론성 항-TGase I Ab B.C.. 1차 항체를 37℃에서 2시간 배양한 다음 세척 완충액으로 6회 세정했다. 세포를 세척 완충액 중에 1:4000 희석된 50㎕의 2차 항체(Fab 단편, 퍼옥시다제 접합 항-마우스 IgG, 아머샴으로부터 구입)와 2시간 동안 37℃에서 배양한 다음, 세척 완충액으로 3회 세척했다. 세척 완충액으로 세정한 후에, 세포를 PBS로 3회 세정했다. 비색 전개를 위해, 세포를 100㎕의 기질 용액(10ml의 0.1M 시트레이트 완충액, pH 5.0 중 4mg의 o-페닐디아민 및 3.3㎕의 30% H2O2)과 함께 정확히 5분간, R/T의 어두운 장소(알루미늄 호일 아래)에서 배양했다. 50㎕의 4N H2SO4를 첨가하여 반응을 정지시켰다. 96웰 플레이트 UV 분광광도계 중에서, 492nm에서의 샘플 흡광도를 측정했다. 5개의 동형배양물 중에서, 4개를 둘 다의 항체로 처리하고, 다섯번째는 TGase 백그라운드 대조용으로 사용했다. TGase의 양을 측정하고 대조용의 백분율로서 기록했다.
트랜스글루타미나제 양을 하기와 같이 측정하고 상기 표 B1 내지 B5에 다음 둘 중 하나로서 기재했다:
(i) %(부스터+레티놀 저해/대조용 저해)-%(ROH 저해/대조용 저해), 이것은 레티놀 단독에 비하여 추가된 부스터+레티놀 유도 TGase 저해 효과의 척도이다, 또는
(ii) 다중 부스터 농도의 저해 효과가 시험될 때의 IC50 값, 이것은 TGase를 50% 저해하는, 10-7M의 일정한 농도의 레티놀과 혼합된 부스터의 농도를 제공한다.
IC50값은 본 발명에서 벤치마크로서 사용된다.
트랜스글루타미나제 분석에서 시험하기 위한 부스터의 최상 군
B1 화합물
1. 지방산 아미드 이들은 상업적으로 용이하게 구입할 수 있으며 계면활성제라는 추가의 이점을 가지므로 미용 제제에 적합한한 유탁액 제조를 돕는다.
2. 세라미드 이들은 또한 각질층 벽 세라마이드의 전구체로서 작용할 수 있다.
3. 카로티노이드 이들은 어느 정도 UV 프로텍션을 제공할 수 있으며 천연 착색제로서 작용한다.
4. 플라보노이드 천연 항산화제
5. 환형 향료 이들은 상업적으로 용이하게 구입할 수 있으며 또한 제품의 향료로서 사용될 수 있다.
6. 비환형 향료 이들은 제품의 향료로서 사용될 수 있다.
7. 포스포리피드 동족체 이들은 벽 성분의 발생에 영양분을 공급하도록 피부세포에 의해 이용될 수 있다.
8. 우레아 이들은 상업적으로 용이하게 구입할 수 있으며 제품에 대한 보존제로서도 작용할 수 있다.

B2 화합물
1. 포스파티딜 콜린 레티놀 데히드로게나제의 가장 활성인 활성제로서 가장 바람직하다.
2. 스핀고마이엘린

B3 화합물
아라키돈산 리놀레산 리놀렌산 미리스트산 각질층 벽을 유지하는데 유용할 수 있는 지방산
리놀레산 리놀렌산 필수지방산
아라키돈산 미리스트산 비-필수지방산
글리시르레틴산 식물 원료로부터 용이하게 얻을 수 있는 다환 트리테르펜 카르복실산
포스파티딜 에탄올아민 세포막 내로 혼입될 수 있다.

B4 화합물
헥사데칸디오산 12-히드록시스테아르산 이소스테아르산 포화지방산
아마인유 엘라이드산 불포화지방산
엘라이드산 이소스테아르산 헥사데칸디오산 실온에서 고체
아마인유 12-히드록시스테아르산 실온에서 액체

B5 화합물
비포나졸 클림바졸 클로트리마졸 에코나졸 케토코나졸 미코나졸 안티미코틱스(antimicotics)
클림바졸 상업적으로 용이하게 구입할 수 있다.
라우릴 히드록시에틸이미다졸린 상업적으로 용이하게 구입할 수 있으며 계면활성제라는 추가의 이점도 가지므로 미용 제제에 적합한 유탁액 제조를 돕는 화합물
퀘르세틴 항산화제 성질을 갖는 천연 발생 플라보노이드
쿠마린 천연 착색제
퀴놀린 이소퀴놀린
메티라폰

피토에스트로겐
본 발명의 일부분으로서, 레티노이드의 피부에 대한 이로운 효과를 피토에스트로겐이 상승적으로 증진하는 것이 놀랍게도 발견되었다. 본질적으로, 피토에스트로겐은 피부의 레티노이드에 대한 감수성을 증가시킨다.
그러므로, 본 발명은 제 2 조성물 중에 약 0.001% 내지 약10%의 1종 이상의 피토에스트로겐을 포함한다.
피토에스트로겐은 플라보노이드, 예컨대 에스트로겐 플라보노이드, 제니스테인, 다이드제인, 글리시틴, 비오카닌 A, 포르모노네틴 및 이퀄과 그의 혼합물, 제니스테인 및 다이드제인의 아세틸 및 말로닐 에스테르, 및 제니스테인 및 다이드제인의 글루코시드를 포함한다. 상기 리스트는 제한적이지 않으며, 당업계 숙련인에게 공지된 기타 피토에스트로겐을 포함할 수 있다.
이중 구획 포장
레티노이드를 포함하는 조성물은 전반적으로 불안정하고 화학적으로 분해될 수 있다. 게다가, 놀랍게도 부스터가 레티노이드의 이로운 효과를 증진하여 이롭기도 하지만, 레티노이드의 화학적 불안정에도 기여를 하는 것으로 발견되었다. 두 성분이 단일 배합물에 포함될 때 부스터 유도 레티놀 불안정화는 촉진된 레티노이드 조성물의 전체 효능을 현격하게 감소시킨다. 그러므로, 레티노이드 부스터의 이로운 효과는 그대로 제공하면서 레티노이드 파괴를 방지하기 위하여, 본 발명은 제 1 구획 내에 레티노이드를 포함하는 제 1 조성물을 포함하고 제 2 구획 내에 1종 이상의 레티노이드 부스터를 포함하는 제 2 조성물을 포함하는 이중 구획 포장을 제공한다. 제 1 조성물은 피부에 제 1의 이로운 효과를 제공하며 제 2 조성물은 제 1의 이로운 효과를 촉진하거나 증진하는 역할을 한다.
추가적인 레티노이드 증진 효과 때문에, 피토에스트로겐이 본 발명의 필수 성분이다. 제니스테인 및 다이드제인과 같은 피토에스트로겐은 레티노이드와 상승적으로 작용하여 피부에 이로운 효과를 제공한다. 그러나 피토에스트로겐은 산화에도 기여하므로, 레티노이드를 분해한다. 그러므로, 본 발명은 피토에스트로겐을 이중 구획 포장의 제 2 구획 내 제 2 조성물의 일부분으로서 제공하여 제 1의 이로운 효과를 더 증진한다.
이중 구획 포장은 분리된 2개의 용기에 제 1 및 제 2 조성물을 제공하기 위한 목적이 달성된다면 당업계 숙련인에게 공지된 여러 방법으로 디자인될 수 있다. 한 실시태양에 있어서, 이중 구획 포장은 서로 부착된 2개의 자아 또는 병의 형태 이다. 제 2 실시태양에 있어서, 이중 구획 포장은 병/자아의 내부가 제 1 및 제 2의 구획으로 분리되도록 분할되어 있는 단일 병/자아의 형태이다. 조성물이 별개로 유지될 수 있다면 본 발명의 취지 내에서 기타 실시태앙도 구상될 수 있다.
미용학적으로 허용 가능한 부형제
본 발명에 따른 조성물은 또한 활성 성분에 대한 희석제, 분산제 또는 담체로서 작용하는 미용학적으로 허용 가능한 부형제를 제 1 조성물 및 제 2 조성물 중 하나에 또는 둘 다에 포함하여, 조성물이 피부에 도포될 때 그의 분산을 촉진한다.
물 이외의 또는 물에 추가되는 부형제는 액체 또는 고체 연화제, 용매, 연석제, 증점제 및 분말을 포함할 수 있다. 특히 바람직한 비수성 담체는 폴리디메틸 실록산 및(또는) 폴리디메틸 페닐 실록산이다. 본 발명의 실리콘은 25℃에서 약 10 내지 10,000,000센티스토크 범위의 점도를 갖는 것들일 수 있다. 특히 바람직한 것은 저 및 고 점도 실리콘의 혼합물이다. 이들 실리콘은 제너럴 일렉트릭 캄파니(General Electric Company)로부터 상표명 비카실 (Vicasil), SE 및 SF로 그리고 다우 코닝 캄파니(Dow Corning Company)로부터 상표명 200 및 550 시리즈로 구입할 수 있다. 본 발명의 조성물에 사용될 수 있는 실리콘의 양은 조성물 중량의 5 내지 95%, 바람직하게는 25 내지 90%의 범위이다.
피부에 이로운 선택적인 물질 및 미용 보조제
본 발명의 제 1 및 제 2 조성물의 하나 또는 둘 다에, 오일 또는 유성상 물질이 유화제와 함께 존재하여, 사용되는 유화제의 평균 친수성-친유성 균형(HLB)에 따라서 유중수 유탁액 또는 수중유 유탁액이 제공될 수 있다.
활성 성분의 여러 유형이 본 발명의 제 1 및 제 2 미용 조성물 중 하나 또는 둘 다에 존재할 수 있으며 하기에 기술된다. 활성제는 연화제이외의 그리고 단지 조성물의 물리적 성질만을 개선하는 성분이외의 피부 또는 모발에 이로운 물질로 정의된다. 일반적인 예는 햇빛차단제, 피부 미백제, 일광욕제를 포함하며, 이 범위로 제한되는 것은 아니다.
햇빛차단제는 자외선을 차단하기 위해 일반적으로 사용되는 물질이다. 이 화합물의 예는 PABA, 신나메이트 및 살리실레이트의 유도체이다. 예를 들면, 옥틸 메톡시신나메니트 및 2-히드록시-4-메톡시 벤조페논(옥시벤존으로도 공지되어 있음)이 사용될 수 있다. 옥틸 메톡시신나메이트 및 2-히드록시-4-메톡시 벤조페논을 각각 상표명, 파르솔 (Parsol) MCX 및 벤조페논-3으로 상업적으로 구입할 수 있다.
유탁액에 사용되는 햇빛차단제의 정확한 양은 태양의 UV 조사로부터의 원하는 보호 정도에 따라서 변화될 수 있다.
또 하나의 바람직한 선택적 성분은 필수 지방산(EFA), 즉 모든 세포의 원형질 막 형성에 필수적인 지방산으로부터 선택된다. 각화세포에 있어서, EFA 결핍은 세포를 과증식성으로 만든다. EFA를 보충하면 이것은 교정된다. EFA는 또한 표피의 지질 생합성을 증진하며 표피의 벽 형성을 위한 지질을 제공한다. 필수 지방산은 바람직하게는 리놀레산, Y-리놀렌산, 호모-Y-리놀렌산, 콜룸빈산, 에이코사-(n-6,9,13)-트리에노산, 아라키돈산, Y-리놀렌산, 팀노돈산, 헥사에노산 및 그의 혼합물로부터 선택된다.
연화제가 종종 본 발명의 미용 조성물에 혼입된다. 상기 연화제의 양은 총 조성물 중량의 약 0.5% 내지 약 50%, 바람직하게는 약 5% 내지 30%의 범위일 수 있다. 연화제는 에스테르, 지방산 및 알콜, 폴리올과 탄화수소와 같은 일반적인 화학적 범위로 분류될 수 있다.
에스테르는 모노- 또는 디-에스테르일 수 있다. 지방 디-에스테르의 허용 가능한 예는 디부틸 아디페이트, 디에틸 세바케이트, 디이소프로필 디메레이트 및 디옥틸 숙시네이트를 포함한다. 허용 가능한 분지쇄 지방산 에스테르는 2-에틸-헥실 미리스테이트, 이소프로필 스테아레이트 및 이소스테아릴 팔미테이트를 포함한다. 허용 가능한 삼염기산 에스테르는 트리이소프로필 트리리놀레이트 및 트리라우릴 시트레이트를 포함한다. 허용 가능한 직쇄 지방산 에스테르는 라우릴 팔미테이트, 미리스틸 락테이트, 올레일 에루케이트 및 스테아릴 올레이트를 포함한다. 바람직한 에스테르는 코코카프릴레이트/카프레이트(코코-카프릴레이트 및 코코-카프레이트의 혼합물), 프로필렌 글리콜 미리스틸 에테르 아세테이트, 디이소프로필 아디페이트 및 세틸 옥타노에이트를 포함한다.
적합한 지방 알콜 및 산은 탄소수 10 내지 20의 이들 화합물을 포함한다. 특히 바람직하게는 세틸, 미리스틸, 팔미트 및 스테아릴 알콜 및 산과 같은 상기 화합물이다.
연화제로서 작용할 수 있는 폴리올은 직쇄 및 분지쇄 알킬 폴리히드록실 화합물이다. 예를 들면, 프로필렌 글리콜, 소르비톨 및 글리세린이 바람직하다. 중합체 폴리올 중에서, 예컨대 폴리프로필렌 글리콜 및 폴리에틸렌 글리콜이 유용할 수 있다. 부틸렌 및 프로필렌 글리콜은 또한 침투 증진제로서 특히 바람직하다.
연화제로서 작용할 수 있는 탄화수소의 예는 탄소수 12 내지 30의 탄화수소 사슬을 갖는 것들이다. 특정 예는 광유, 석유 젤리, 스쿠알렌 및 이소파라핀을 포함한다.
본 발명의 미용 조성물 중 기능 성분의 다른 예는 증점제이다. 증점제는 보통 본 발명의 조성물 중량의 0.1 내지 20%, 바람직하게는 약 0.5% 내지 10%의 양으로 존재할 것이다. 증점제의 예는 비. 에프. 굿리치 캄파니(B. F. Goodrich Company)로부터 상표명 카르보폴 (Carbopol)로 구입할 수 있는 가교결합 폴리아크릴레이트 물질이다. 검이 사용될 수 있는데, 예컨대 크산탄, 카라기난, 젤라틴, 카라야, 펙틴 및 로커스트 빈 검이다. 특정 경우에는 증점 기능이 실리콘 또는 연화제로서 작용하는 물질에 의해 달성될 수 있다. 예를 들면, 10센티스토크 초과의 실리콘 검 및 글리세롤 스테아레이트와 같은 에스테르가 이중 기능을 갖는다.
분말이 본 발명의 미용 제품의 제 1 및 제 2 미용 조성물의 1종 또는 둘 다에 혼입될 수 있다. 이들 분말은 쵸크, 탈크, 산성백토, 고령토, 전분, 스멕틱 점토, 화학적으로 변형된 마그네슘 알루미늄 실리케이트, 유기학적으로 변형된 몬모릴로나이트 점토, 수화 알루미늄 실리케이트, 훈증 실리카, 알루미늄 전분 옥테닐 숙시네이트 및 그의 혼합물을 포함한다.
기타 보조적인 소량 성분이 또한 본 발명의 미용 제품의 제 1 및 제 2 조성물의 하나 또는 둘 다에 혼입될 수 있다. 이들 성분은 착색제, 유백제 및 향료를 포함할 수 있다. 이들 물질의 양은 조성물 중량의 0.001% 내지 20%의 범위일 수 있다.
본 발명의 미용 제품의 제 1 및 제 2 조성물은 주로 인간 피부에 대한 국소 적용을 위한 제품으로서, 특히 피부를 콘디쇼닝하고 유연하게 하기 위한 작용제로서 그리고 주름지거나 노화된 피부로 되는 것을 예방하거나 완화하기 위해 사용된다.
사용시, 적절한 용기 또는 도포기로부터의 제 1 조성물의 소량, 예를 들면 1 내지 5ml를 피부의 노출된 부분에 도포하고, 필요하다면 손 또는 손가락 또는 적합한 장치를 사용하여 피부에 펴바르고(펴바르거나) 문지른다. 동시에, 적절한 용기 또는 도포기로부터의 소량의 제 2 조성물, 예를 들면 1 내지 5ml를 피부의 노출된 부분에 도포하고, 필요하다면 손 또는 손가락 또는 적합한 장치를 사용하여 피부에 펴바르고(펴바르거나) 문지른다. 그러므로, 치료 효과의 원하는 정도에 따라서, 제 1 및 제 2 조성물을 단독으로, 동시에 또는 연속적으로 사용할 수 있다.
제품 형태 및 포장
본 발명의 국소 피부 치료 조성물을 로션, 유체 크림, 크림 또는 겔로서 제형할 수 있다.
실시예 1
방법
레티놀(tween 80 중 50%)을 대략 50%의 수성 에탄올에 용해시켜서 용액을 제조하고 표준 96웰 분광광도계를 사용하여 96웰 플레이트 중에서 200㎕ 부피로 측정시 360nm에서 대략 0.6의 OD를 나타내는 용액을 얻었다.
부스터 분자를 대략 0.1%의 농도로 첨가하고 OD 360을 어두운 장소, 실온에서 즉시 그리고 60시간 후에 상기한 바와 같이 측정했다. 60시간 후의 OD를 보정(0.85로 나눔)하여 플레이트로부터의 용매의 증발에 의한 레티놀 농도의 상승을 계산했다.
결과
부스터 레티놀 손실 속도의 상승 배수
시트랄 3.1
시트로넬롤 1.5
코카미드 DEA 1.9
쿠마린 1.4
다마스콘 3.7
1,3 디메틸 2 이미다졸리디논 1.4
제라니올 1.3
18b 글리세르헤틴산 1.6
8-OH 퀴놀린 1.5
N-라울로일 사르코신 2.6
리날로올 2.0
리놀레아미드 DEA 3.0
리놀레산 3.4
알파 이오논 1.3
아마인유 1.5

시험된 부스터는 레티놀 불안정성을 현저하게 증가시켰다.
이러한 이유로 인해 레티놀 단독에 대하여 필요한 정도에 비하여 상당히 더 양호한 레티놀의 안정성을 제공하는 제형/포장 옵션을 부스터가 사용될 때 사용하는 것이 필수적이다.
실시예 2
트랜스글루타미나제 발현의 상승적 저해가 B1 및 B5 활성 화합물의 레티놀과의 조합에 의해 발생되는지의 여부를 알기 위해, 활성 화합물이 레티놀 존재하에 개별적으로 시험될 때의 활성 화합물의 투여량 반응 프로파일(IC50 값 포함)을 측정했다. 이 데이타를 사용하여 각 활성 화합물의 적절한 준최대 저해 농도를 측정함으로써, 활성 화합물 혼합물의 레티놀 존재 시의 상승 효과를 확인할 수 있었다. 두 화합물의 상승작용을 증명하기 위해, 시험에 대하여 최대 IC20인 농도, 즉 레티놀의 트랜스글루타미나제 발현 20% 저해를 개별적으로 촉진하는 화합물 농도를 선택하는 것이 필수적이다. 2종의 상기 화합물은 40%의 합해진 저해를 가져야 한다. 농도를 결정하기 위한 이 방법을 사용하여, 시험되는 2종 화합물의 상승작용을 검출하기 위한 40-100%의 추가적인 트랜스글루타미나제 저해에 대한 윈도우를 얻었다. 보다 도전적인 농도 범위는 단독으로는 레티놀의 촉진된 글루타미나제 저해를 나타내지 않는 화합물의 선택 농도일 것이다. 그러나 본 연구에서 본 발명자들은 보다 도전적인 범위를 선택했다. 본 발명자들은 최소 유효 트랜스글루타미나제 저해 농도보다 10배 및 100배 낮은 화합물의 농도를 선택했다. 그렇게 매우 낮은 농도를 사용하여 상승적 조합을 확인하는 것은 가장 효과적인 유효 상승 조합이 확인되었다는 것을 의미할 것이다.
하기 표의 데이타는 최소 저해 화합물의 농도보다 2log 낮은 화합물의 농도를 나타낸다. 이들은 B1/B5 조합 연구에 사용된 농도였다.
화합물 농도
B1 화합물
리놀레오일 모노에탄올아미드 1.00E-06
팔미트아미드 모노에탄올아미드 1.00E-06
파르네솔 3.16E-06
헥실 스핀고신 1.00E-06
위트레흐트-2 3.16E-08
올레오일 베타인 3.16E-07
올레오일 히드록시에틸이미다졸린 1.00E-08
코코일 히드록시에틸아미다졸린 1.00E-09
우르솔산 1.00E-08
알파-이오논 3.16E-05
B5 화합물
케토코나졸 1.00E-09
미코나졸 3.16E-09
클림바졸 1.00E-08
아미노 벤조트리아졸 1.00E-06
3,4-디히드록시퀴놀린 1.00E-06
2-히드록시퀴놀린 3.16E-06

B1 및 B5 활성 화합물과 레티놀과의 조합에 의한 트랜스글루타미나제 발현의 상승적 저해를 연구하기 위해, 화합물의 선택된 조합을 상기 표에 주어진 농도에서 시험했다. 하기 데이타를 얻었다:
조합 B1 화합물 B5 화합물 평균% 대조용 TGase
B1/B5 파르네솔 케토코나졸 84%
B1/B5 헥사노일 스핀고신 미코나졸 68%
B1/B5 헥사노일 스핀고신 케토코나졸 64%
B1/B5 헥사노일 스핀고신 3,4-디히드퀴놀린 89%
B1/B5 헥사노일 스핀고신 아미노벤조트라이졸 81%
B1/B5 헥사노일 스핀고신 클림바졸 63%
B1/B5 올레오일 베타인 케토코나졸 81%
B1/B5 올레오일 히드록시에틸이미다졸린 클림바졸 52%
B1/B5 코코일 히드록시에틸이미다졸린 클림바졸 71%
B1/B5 우르솔산 2-히드록시퀴놀린 74%
B1/B5 알파-이오논 미코나졸 84%
B1/B5 알파-이오논 케토코나졸 82%
B1/B5 알파-이오논 2-히드록시퀴놀린 76%
B1/B5 위트레흐트-2 아미노벤조트리아졸 82%
B1/B5 리놀레오일 모노에탄올아미드 케토코나졸 93%
B1/B5 리놀레오일 모노에탄올아미드 클림바졸 94%
B1/B5 나린제닌 케토코나졸 100%
B1/B5 퀘르세틴 클림바졸 92%
B1/B5 피마자유 모노에탄올아미드 클림바졸 98%
B1/B5 피마자유 모노에탄올아미드 클로트리마졸 100%

B1/B5 조합의 효능은 두 부류로 분류되는데-특히 효과적인 조합(상기 표에서 굵은 글씨)과 약간 효과적인 조합(굵은 글씨 아님)이다. 특정한 B1/B5 조합이 기타 조합보다 양호하게 수행된다는 것은 예측되지 않았었다. 약간만 효과적인 조합은 (i) 지방산 아미드+아졸, (ii) 히드록시지방산 아미드+아졸 및 (iii) 나린제닌/퀘르세틴+아졸이었다. 효과적인 조합은 하기 부류의 B1 부스터와 함께 선택된 B5 부스터를 포함했다: 지방 히드록시에틸 이미다졸린 계면활성제, 환형 지방족 불포화 화합물, 다환 트리테르펜, n-치환 지방산 아미드.
실시예 3
본 실시예는 레티노이드와 피토에스트로겐의 상승작용을 나타낸다.
(a) 세포 배양 방법:
25-30세 여성 자원자의 햇빛 차단된 팔 안쪽에서 얻은 성인의 섬유아세포를 여기에서 사용했다. 세포를 10% FBS를 포함하는 1:1 DMEM/Hams F12 배지 중에서, 정상적인 대기 산소 압력하 5% CO2 대기 중에서 37℃를 유지하면서 배양했다. 제 3 경로 성인 섬유아세포를 12웰 플레이트 내의 10% FBS와의 DMEM 배지 중에서 2500세포/ml/웰의 접종 밀도로 성장시켰다. 80% 밀집 시에 세포를 무혈청 및 무페놀레드(PRF) DMEM 배지로 2회 세정했다. 피토-화합물에 의한 4시간 동안의 예비처리를 수행한 다음에 레티노이드를 투여하고 48시간 동안 배양했다. 배양 후에, 웰을 1xPBS로 2회 세척하고 세포 단층을 100㎕의 세포 용균 완충액(1xPBS, 1% Triton X, 0.5% 소듐 데옥시콜레이트, 프로테아제 저해제(이소프로판올 중 100mg/ml PMSF, 10㎕/ml) 포함 0.1% SDS를 포함한다) 중에서 회수했다. 현탁액을 14000rpm에서 10분간 회전시키고, 상청액을 수집하고, 이 상청액의 부분표본을 단백질 정량에 사용했다. 단백질 농도를 Pierce 단백질 키트를 사용하여 측정했다. 100㎕ 상청액(세포용해물)의 나머지를 40㎕의 샘플 완충액(노벡스(NOVEX)) 및 0.5% Beta 메르캅토에탄올(BME)의 혼합물 중에서 5분간 샘플을 비등시켜서 변성시켰다. 동량의 단백질을 16% 트리스-글리신 겔에 SDS 페이지에 의한 단백질 분석 및 CRABP-2 단백질 발현에 대한 웨스턴 이뮤노-블로팅(Western Immuno-blotting)을 위해 로드했다.
(b) 세포 레티노산 결합 단백질 2(CRABP-2)의 검출:
세포 내에서, 레티놀 및 레티노산은 특정한 세포 내 결합 단백질에 결합되는데, 2종의 주요 단백질은 CRABP-1 및 2이다(루스(Roos) 등의 문헌[Pharmacological reviews: 50, 315-333, 1988]). 이들 단백질은 레티노이드 대사에 있어서 저장 또는 이동 단백질 모두로서 작용하여 레티노이드의 세포 내 농도를 조절하는 역할을 한다. 레티놀의 과다하거나 부족한 양은 세포사를 포함하는 세포 손상을 야기하므로 레티노이드 및 그의 결합 단백질을 일정한 양으로 조절하는 것이 세포 생존에 매우 중요하다. 이 단백질의 양은 세포 내에서 레티노산의 양에 의해 조절된다. 세포의 레티노이드의 양이 많을수록 CRABP-2의 발현이 증가된다. 그러므로, 이 단백질의 세포 내 양이 세포의 레티노이드 활성도의 척도이다. 피부 세포는 다량의 CRABP-2를 표피 및 진피에서 모두 포함한다. 시험관 내 섬유아세포 중에서 레티노이드 투여에 대한 CRABP-2 반응이 인간 피부 반응을 예측하는 레티노이드 생활성의 재현 가능한 척도이다(엘더(Elder) 등의 문헌[J. Invest Dermatol., 106:517-521, 1996]). CRABP-2의 증가는 또한 증가된 표피 분화 및 피부 레티노이드 작용에 관련된다. 그러므로, 이들 연구에 있어서 본 발명자들은 증가된 표피 분화(피부 콘디쇼닝 및 건조 피부에 대한 효과) 및 피부 콜라겐 및 세포외 매트릭스 합성(노화방지, 주름방지 효과)을 유도하는 레티노이드 활성도의 척도로서 섬유아세포의 CRABP-2 발현을 이용했다.
섬유아세포 중 CRABP-2의 양을 측정하기 위해 동량의 세포 상청액의 단백질을 도트 블로트(dot blot) 장치 내 니트로셀룰로스 블로트에 제조사의 지시에 따라 서 로드하고, 면역 염색을 표준 절차에 따라서 CRABP-2에 대한 단클론성 항체를 사용하여 수행했다. CRABP-2 단백질 밴드를 도트 블로트 내에 산타 크루즈 바이오테크놀로지(Santa Cruz Biotechnology)(미국 캘리포니아주 산타크루즈)로부터 구입한 화학발광분석계 시스템을 사용하여 가시화했다. 필름 중 밴드를 농도계 스캐닝에 의해 정량하고 삼중 샘플로부터의 데이터를 대조용의 %로서 계산하고 하기 표에 대조용에 비교한 % 증가로서 기재했다(대조용이 100%) +/- SD 삼중 샘플.
실시예 4
본 실시예는 피토에스트로겐 플라보노이드 존재 시의 레티놀의 안정성을 보여준다.
레티놀을 수성 에탄올(1:1 물:에탄올) 중에 10% 용액으로 용해시켰다. 이 용액을 0.001%(대략 30μM)로 희석했다. 이 용액에 의해 96웰 플레이트 분광광도계 중에서 360nm에서 약 0.35의 흡광도 단위를 얻었다.
제니스테인, 다이드제인의 수성 에탄올 원액을 0.1%, 0.01% 또는 0.001%로서 제조했다. 96웰 플레이트 중 200㎕의 0.001% 레티놀 용액에 20㎕의 플라보노이드(즉, 1-10 희석)를 첨가하여 0.01, 0.001 및 0.0001%의 최종 플라보노이드 농도를 얻었다. 플레이트를 혼합하고 초기 OD 기록을 360nm에서 취했다. 플레이트를 실온, 어두운 장소에서 2일까지 배양하고 연속적으로 기록을 8, 24 및 48시간에 얻었다. 이들 시점에서의 OD 기록을 0시간 시점 기록으로 정규화했다. 레티놀 안정성을 0시간의 레티놀(OD 기록)에 대한 %로서 기록했다. 데이터를 표 5에 나타내었다.
실시예 5
하기 2개의 표에서, 제니스테인 및 다이드제인과 레티노이드 사이의 상승작용을 시험했다. 두 연구에서 모두 제니스테인을 세포에 DMSO:에탄올에 가용성인 형태로 전달했다. 1μM 제니스테인만으로 CRABP-2를 현격하게 촉진했다. 제니스테인 및 다이드제인 모두 상승 방식으로 레티노이드의 활성을 촉진했다. 레티닐 아세테이트를 제외한 모든 시험된 레티노이드가 제니스테인 및 다이드제인과 함께 상승작용을 나타내었다. 이들 데이터는 피토에스트로겐 플라보노이드 제니스테인 및 다이드제인이 가용성 형태로 세포에 공급될 때 레티노이드 활성을 상승적으로 증진한다는 본 발명자들의 청구 내용을 뒷받침한다.
제니스테인 및 레티노이드 사이의 상승작용
CRABP-2 생산 % 대조용 대조용에 대한 p값 레티노이드에 대한 p값 상승작용
p<0.05 p<0.05
대조용 0.29+/-0.07 100+/-27 1
10nM 레티노산 1.24+/-0.29 428+/-101 0.0055 1
1nM 레티노산 0.97+/-0.47 335+/-162 0.068 1
100nM 레티닐 리놀레이트 0.52+/-0.3 181+/-110 0.28 1
100nM 레티닐 팔미테이트 1.26+/-0.51 434+/-177 0.032 1
100NM 레티닐 아세테이트 0.60+/-0.32 209+/-118 0.19 1
1μM 제니스테인 1.9+/-0.71 655+/-247 0.018
1μM 제니스테인+10nM 레티노산 4.18+/-0.31 1441+/-108 3.23E-5 2.96E-04 있음
1μM 제니스테인+1nM 레티노산 4.01+/-0.61 1383+/-394 0.00049 0.012 있음
1μM 제니스테인+100nM 레티닐 리놀레이트 4.08+/-1.14 1408+/-213 0.0045 0.000982 있음
1μM 제니스테인+100nM 레티닐 팔미테이트 4.32+/-0.13 1489+/-47 160E-06 5.76E-04 있음
1μM 제니스테인+100nM 레티닐 아세테이트 2.32+/-0.91 800+/-313 1.80E-02 3.80E-02 없음

다이드제인 및 레티노이드의 상승작용
CRABP-2 생산 % 대조용 대조용에 대한 p값 레티노이드에 대한 p값 상승작용
p<0.05 p<0.05
대조용 0.29+/-0.07 100+/-27 1
10nM 레티노산 1.24+/-0.29 428+/-101 0.0055 1
1nM 레티노산 0.97+/-0.47 335+/-162 0.068 1
100nM 레티닐 리놀레이트 0.52+/-0.3 181+/-110 0.28 1
100nM 레티닐 팔미테이트 1.26+/-0.51 434+/-177 0.032 1
100NM 레티닐 아세테이트 0.60+/-0.32 209+/-118 0.19 1
1μM 다이드제인 1.49+/-0.66 513+/-227 0.035
1μM 다이드제인+10nM 레티노산 3.42+/-1.01 1181+/-350 0.0059 0.023 있음
1μM 다이드제인+1nM 레티노산 3.52+/-0.47 1213+/-163 0.000309 0.027 있음
1μM 다이드제인+100nM 레티닐 리놀레이트 3.29+/-0.14 1136+/-142 0.00024 0.00078 있음
1μM 다이드제인+100nM 레티닐 팔미테이트 2.51+/-0.19 865+/-65 4.90E-05 1.69E-02 있음
1μM 다이드제인+100nM 레티닐 아세테이트 2.27+/-1.4 782+/-489 0.07 0.11 없음

실시예 6
실시예 5: 하기 표는 제니스테인 및 다이드제인의 레티놀 불안정화에 대한 효과를 보여준다. 실험은 방법 부분에서 기술된 바와 같이 수행되었다. 이중 측정으로부터의 OD 기록을 평균내고 여기에 기록했다.
제니스테인 존재 시의 레티놀의 안정성
시간(hr) 0% 제니스테인 0.0001% 0.001% 0.01%
8 92 84 82 82
24 86 76 74 80
48 81 77 73 76

다이드제인 존재 시의 레티놀의 안정성
시간(hr) 0% 다이드제인 0.0001% 0.001% 0.01%
8 92 82 80 73
24 86 78 79 69
48 81 76 76 68

어떠한 작용제도 존재하지 않을 때 레티놀 단독으로는 천천히 분해된다(8시간 8%, 24시간 14% 및 48시간 19%). 그러나, 제니스테인 및 다이드제인이 존재하면 레티놀의 분해는 가속화된다. 8시간의 짧은 시간 동안, 16-18%의 레티놀이 이들 플라보노이드의 존재하에 분해되었다. 이것은 제니스테인 및 다이드제인 모두가 레티놀의 불안정성을 현저하게 증가시킨다는 것을 제안한다. 이로 인해 특별한 포장, 즉 레티놀에 대한 하나의 구획 및 플라보노이드에 대한 또 하나의 구획을 포함하는 포장을 레티노이드 및 플라보노이드를 포함하는 제품에 사용해야할 필요성이 야기되었다.
본 발명이 어느 정도 상세하게 그리고 그의 특정한 바람직한 실시태양을 참고로 하여 설명되었지만, 당업계의 숙련인은 기술된 내용에 대하여 다양한 변형, 변화 및 치환이 본 발명의 취지 및 범위 내에서 가능할 수 있다는 것을 인정할 것이다. 이들 모든 변형 및 변화는 기술되고 청구된 본 발명의 범위 내일 것이며, 본 발명은 하기 청구범위에 의해서만 제한되고 그러한 청구범위는 적합하게 광범위하게 이해될 것이다. 본 출원 전반에 걸쳐, 다양한 문헌이 인용되었다. 이들 문헌은 본 명세서의 참고문헌으로 인용된다.

Claims (10)

  1. 0.001% 내지 10%의 레티노이드를 포함하는 제 1 조성물;
    바닐린, 아라키드산, 리놀레산, 미리스트산, 암사크린, 카르벤옥솔론, 글리시르레틴산, 포스파티딜 에탄올아민, 스핀고마이엘린, 포스파티딜콜린 및 그의 혼합물로 이루어진 군에서 선택되는 0.0001% 내지 50%의 1종 이상의 레티노이드 부스터(booster), 및 제니스테인, 다이드제인, 글리시틴, 비오카닌 A, 포르모노네틴, 이퀄 및 그의 혼합물로 이루어진 군에서 선택되는 0.001% 내지 10%의 1종 이상의 피토에스트로겐을 포함하는 제 2 조성물;
    제 1 조성물을 저장하기 위한 제 1 구획; 및
    제 2 조성물을 저장하기 위한 제 2 구획을 포함하며, 여기에서 제 1 및 제 2 구획은 서로 연결되어 있고,
    상기 레티노이드가 여드름, 주름, 건선, 노화성 반점 및 변색을 개선하는 효과를 제공하고, 상기 부스터 및 상기 피토에스트로겐이 여드름, 주름, 건선, 노화성 반점 및 변색을 개선하는 효과를 증강시키는
    안정한 피부 관리 제품.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 제 2 조성물이 2종 이상의 상기 레티노이드 부스터를 0.0001% 내지 50%의 양으로 포함하는 안정한 피부 관리 제품.
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 피부 콘디쇼닝(conditioning)을 위해 상기 제 1 조성물 및 제 2 조성물이 피부에 국소적으로 도포되는 안정한 피부 관리 제품.
  6. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 레티노산의 여드름, 주름, 건선, 노화성 반점 및 변색을 개선하는 효과를 모방하기 위해 상기 제 1 조성물 및 제 2 조성물이 피부에 도포되는 안정한 피부 관리 제품.
  7. 삭제
  8. 삭제
  9. 삭제
  10. 삭제
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