KR100860291B1 - 표적 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 컴퓨터지시된 어셈블리 - Google Patents

표적 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 컴퓨터지시된 어셈블리 Download PDF

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Abstract

본 발명은 인간 게놈 데이터베이스와 같은 데이터베이스에 이용가능한 정보를 기초로 컴퓨터 지시된 폴리뉴클레오티드 어셈블리에 의한 게놈 서열 정보의 결과를 이용하기 위한 새로운 시도를 설명한다. 구체적으로, 본 발명은 표적 폴리펩티드를 암호화하는 신규한 합성 표적 폴리뉴클레오티드 서열을 선택, 합성 및 어셈블하기 위하여 사용될 수 있다. 표적 폴리뉴클레오티드는 자연(야생) 또는 모델 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 암호화되는 모델 폴리펩티드와 비교하여 증진된 또는 변경된 생물학적 활성을 나타내는 표적 폴리펩티드를 암호화할 수 있다.

Description

표적 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 컴퓨터 지시된 어셈블리{COMPUTER-DIRECTED ASSEMBLY OF A POLYNUCLEOTIDE ENCODING A TARGET POLYPEPTIDE}
본 발명은 일반적으로 생물정보학 분야, 보다 구체적으로 컴퓨터 지시된 폴리뉴클레오티드 어셈블리 방법, 알고리즘 및 장치에 관한 것이다. 본 발명은 또한 본 발명에 의해 어셈블리된 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화된 폴리펩티드 생산에 관한 것이다.
효소, 항체, 수용체 및 리간드는 생체 환경내에서 매우 특정한 생물학적 기능을 수행하기 위한 선택적 압력에 의해 진화된 폴리펩티드이다. 특정 기술에 적용하기 위한 폴리펩티드 사용은 진화적으로 선택되지 않은 환경 또는 기질에서 폴리펩티드가 기능할 것을 필요로 할 수 있다. 극한 환경에서 번성한 미생물로부터 분리된 폴리펩티드는 이들 분자가 통상 구조 및 기능에 관련하여 적응성이 있다는 막대한 증거를 제시한다. 그러나, 그 자연 한경으로부터 폴리펩티드를 분리하기 위한 방법은 비용이 들며 시간 소모적이다. 따라서, 원하는 활성을 가지는 폴리펩티드를 암호화하는 유전적 물질을 합성적으로 진화시키는 새로운 방법이 필요하다.
유전 공학 조작을 위한 유전적 물질을 얻기 위한 2가지 방법이 있다: (1) 자 연 공급원에서 유래한 DNA 또는 RNA의 형태로 폴리뉴클레오티드 분리 및 정제 또는 (2) 다양한 화학적 효소적 접근을 이용하여 폴리뉴클레오티드 합성. 전자의 접근은 이들 자신에게 구체적인 변경을 가하기 쉽지 않은 자연발생적 서열에 한정된다. 후자의 접근은 보다 복잡하고 노동 집약적이다. 그러나, 화학적 효소적 접근은 임의의 심각한 제한 없이 원하는 폴리뉴클레오티드 서열을 생성할 가능성을 비롯하여 다수의 매력적인 특징을 가진다.
올리고뉴클레오티드를 긴 폴리뉴클레오티드 단편으로 합성적 어셈블리 하기 위한 2개의 통상적인 방법이 현재 존재한다. 첫째, 합성되어질 전체 서열을 포괄하는 올리고뉴클레오티드를 우선 어닐링시키고 이후 깨진 홈은 리가제로 보수한다. 이후 단편을 직접 클로닝하거나 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)에 의해 증폭한 후 클로닝한다. 폴리뉴클레오티드는 보다 긴 서열로 시험관에서 어셈블리하기 위해 이후 사용된다. 유전자 합성을 위한 두번째의 통상의 방법은 올리고뉴클레오티드의 어닐링된 쌍에서 단일 가닥의 갭을 채우기 위해 폴리머라제를 이용한다. 폴리머라제 반응 후, 올리고뉴클레오티드의 단일 가닥 영역은 이중 가닥이 되고, 제한 엔도뉴클레아제의 절단 후에 직접 클로닝될 수 있거나 또는 상이한 이중 가닥의 단편을 리게이션함으로써 보다 긴 서열의 추가 어셈블리를 위해 사용될 수 있다. 통상적으로, 폴리머라제 반응 이후, 긴 DNA 단편의 합성을 현저하게 지연시키고 이 접근의 효능을 크게 감소시키는 각 세그먼트가 클로닝되어야 한다.
전체적으로 신규한 폴리뉴클레오티드의 생성 또는 존재하는 폴리뉴클레오티드의 실질적인 변경은 극도로 시간 소모적이고 고가이며 복잡하고 다중의 단계를 필요로 하고 일부 경우에는 불가능하다. 따라서, 임의의 원하는 서열의 합성적 폴리뉴클레오티드를 어셈블하기 위한 효과적인 수단에 대한 필요성이 크게 존재한다. 상기 방법은 보편적으로 적용될 수 있다. 예를 들어, 상기 방법은 개선된 작용을 위해 발현되고 스크리닝된 기지의 서열에 특정 치환체를 가지는 폴리뉴클레오티드의 어레이를 효과적으로 제조하기 위해 사용될 수 있다. 본 발명은 표적 폴리펩티드를 암호화하는 표적 폴리뉴클레오티드 합성을 위한 효과적이고 강력한 방법 및 조성물을 제공함으로써 이러한 필요성을 만족시킨다.
본 발명의 개요
본 발명은 전체 유전자, 염색체 세그먼트, 염색체 및 게놈을 비롯하여 핵산 서열을 제조하기 위한 빠르고, 효과적인 수단을 제공함으로써 현재 재조합 핵산 조작의 제한을 해결한다. 이러한 접근은 완전히 합성적인 접근에 기초하기 때문에, 심지어 핵산의 매우 큰 세그먼트의 구성을 방해하는 존재하는 핵산의 이용가능성과 같은 제한이 없다.
일 태양에서, 본 발명은 a) 표적 폴리뉴클레오티드 서열을 제공하는 단계; b) 5' 오버행(overhang) 및 3' 오버행을 포함하는 부분적 이중 가닥 폴리뉴클레오티드를 생성하는 1 이상의 마이너스 가닥 올리고뉴클레오티드에 어닐링된 1 이상의 플러스 가닥 올리고뉴클레오티드를 포함하는 표적 폴리뉴클레오티드 서열에 존재하는 1 이상의 개시 폴리뉴클레오티드를 동정하는 단계; c) 5' 오버행, 3' 오버행 또는 5' 오버행과 3' 오버행을 포함하는 부분적 이중 가닥 폴리뉴클레오티드를 생성 하는 1 이상의 마이너스 가닥 올리고뉴클레오티드에 어닐링된 1 이상의 플러스 가닥 올리고뉴클레오티드를 포함하고 개시 폴리뉴클레오티드와 접촉하는 표적 폴리뉴클레오티드에 존재하는 제2 폴리뉴클레오티드를 동정하는 단계로서, 제2 폴리뉴클레오티드의 1 이상의 오버행은 개시 폴리뉴클레오티드의 1 이상의 오버행에 상보적인 것인 단계; d) 5' 오버행, 3' 오버행 또는 5' 오버행과 3' 오버행을 포함하는 부분적 이중 가닥 폴리뉴클레오티드를 생성하는 1 이상의 마이너스 가닥 올리고뉴클레오티드에 어닐링된 1 이상의 플러스 가닥 올리고뉴클레오티드를 포함하고 개시 서열과 접촉하는 표적 폴리뉴클레오티드에 존재하는 제3 폴리뉴클레오티드를 동정하는 단계로서, 제3 폴리뉴클레오티드의 1 이상의 오버행이 제2 폴리뉴클레오티드의 오버행에 상보적이지 않은 개시 폴리뉴클레오티드의 1 이상의 오버행에 상보적인 것인 단계; e) 어닐링에 적합한 시간 동안 그리고 적합한 조건하에서 개시 폴리뉴클레오티드를 제2 폴리뉴클레오티드 및 제3 폴리뉴클레오티드와 접촉시키고, 이러한 접촉이 접촉성 이중 가닥 폴리뉴클레오티드를 생성하고, 개시 폴리뉴클레오티드를 양방향으로 연장되게 하는 것인 단계; f) 프라이머 연장 없이, 임의로 리게이션(ligation)에 적합한 조건하에서 리가제와 e)의 혼합물을 접촉시키는 단계; 및 g) 어닐링 및 리게이션의 반복적인 사이클을 통해 이중 가닥 폴리뉴클레오티드를 연장된 개시 폴리뉴클레오티드에 순차적으로 첨가하여 임의로 b) 내지 f)를 반복함으로써 표적 폴리뉴클레오티드가 합성되는 단계를 포함하는 표적 폴리뉴클레오티드 서열을 합성하는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 a) 모델 서열로부터 유래된 표적 폴리뉴클레오티드 서열을 제공하는 단계; b) a)의 표적 폴리뉴클레오티드 서열에 존재하는 1 이상의 개시 폴리뉴클레오티드 서열을 동정하는 단계로서, 이때 개시 폴리뉴클레오티드는 1) 제1 플러스 가닥 올리고뉴클레오티드; 2) 제1 플러스 가닥 올리고뉴클레오티드와 접촉하는 제2 플러스 가닥 올리고뉴클레오티드; 및 3) 제1 플러스 가닥 올리고뉴클레오티드에 적어도 부분적으로 상보적인 제1 접촉성 서열 및 제2 플러스 가닥 올리고뉴클레오티드에 적어도 부분적으로 상보적인 제2 접촉성 서열을 포함하는 마이너스 가닥 올리고뉴클레오티드을 포함하는 것인 단계; c) 5' 오버행 및 3' 오버행을 포함하는 부분적 이중 가닥 개시 폴리뉴클레오티드를 생성하는 b)의 마이너스 가닥 올리고뉴클레오티드에 제1 플러스 가닥 올리고뉴클레오티드 및 제2 플러스 가닥 올리고뉴클레오티드을 어닐링시키는 단계; d) a)의 표적 폴리뉴클레오티드 서열에 존재하는 제2 폴리뉴클레오티드 서열을 동정하는 단계로서, 이때 제2 폴리뉴클레오티드 서열은 개시 폴리뉴클레오티드 서열에 접촉하고 1) 제1 플러스 가닥 올리고뉴클레오티드; 2) 제1 플러스 가닥 올리고뉴클레오티드와 접촉하는 제2 플러스 가닥 올리고뉴클레오티드; 및 3) 제1 플러스 가닥 올리고뉴클레오티드에 적어도 부분적으로 상보적인 제1 접촉성 서열 및 제2 플러스 가닥 올리고뉴클레오티드에 적어도 부분적으로 상보적인 제2 접촉성 서열을 포함하는 마이너스 가닥 올리고뉴클레오티드를 포함하는 것인 단계; e) 부분적 이중 가닥 제2 폴리뉴클레오티드를 생성하는 d)의 마이너스 가닥 올리고뉴클레오티드에 제1 플러스 가닥 올리고뉴클레오티드 및 제2 플러스 가닥 올리고뉴클레오티드를 어닐링시키는 단계로서 이때 제2 폴리뉴클레오티드의 1 이상의 오버행은 개시 폴리뉴클레오티드의 1 이상의 오버행에 상보적 인 것인 단계; f) a)의 표적 폴리뉴클레오티드에 존재하는 제3 폴리뉴클레오티드를 동정하는 단계로서, 이때 제3 폴리뉴클레오티드는 개시 서열과 접촉성이고, 1) 제1 플러스 가닥 올리고뉴클레오티드; 2) 제1 플러스 가닥 올리고뉴클레오티드과 접촉성인 제2 플러스 가닥 올리고뉴클레오티드; 및 3)제1 플러스 가닥 올리고뉴클레오티드에 적어도 부분적으로 상보적인 제1 접촉성 서열 및 제2 플러스 가닥 올리고뉴클레오티드에 적어도 부분적으로 상보적인 제2 접촉성 서열을 포함하는 마이너스 가닥 올리고뉴클레오티드를 포함하는 것인 단계; g) 부분적 이중 가닥의 제2 폴리뉴클레오티드를 생성하는 f)의 마이너스 가닥 올리고뉴클레오티드에 제1 플러스 가닥 올리고뉴클레오티드 및 제2 플러스 가닥 올리고뉴클레오티드를 어니링시키는 단계로서, 제3 폴리뉴클레오티드의 1 이상의 오버행이 개시 폴리뉴클레오티드의 1 이상의 오버행에 상보적이고, 제2 폴리뉴클레오티드의 오버행에 상보적이지 않은 것인 단계; h) 어닐링에 적합한 시간 동안 그리고 적합한 조건하에서 e)의 제2 폴리뉴클레오티드 및 g)의 제3 폴리뉴클레오티드와 개시 폴리뉴클레오티드를 접촉시키는 단계로서, 상기 접촉은 접촉성 이중 가닥 폴리뉴클레오티드를 생성하고, 이때 개시 서열은 양방향으로 연장되는 것인 단계; i) 프라이머 연장 없이, 임의로 h)의 혼합물을 리게이션에 적합한 조건하에서 리가제와 접촉시키는 단계; 및 j) 어닐링 및 리게이션의 반복적인 사이클을 통해, 이중 가닥 폴리뉴클레오티드를 연장된 개시 폴리뉴클레오티드에 순차적으로 첨가하여 임의로 b) 내지 i)를 반복함으로써 표적 폴리뉴클레오티드를 합성하는 단계를 포함하는 표적 폴리뉴클레오티드를 합성하는 방법을 제공한다.
다른 태양에서, 본 발명은 a) 모델 서열로부터 유래된 표적 폴리뉴클레오티드 서열을 제공하는 단계; b) 1 이상의 마이너스 가닥 올리고뉴클레오티드에 어닐링된 1 이상의 플러스 가닥 올리고뉴클레오티드를 포함하는 표적 폴리뉴클레오티드에 존재하는 1 이상의 개시 폴리뉴클레오티드를 동정하는 단계; c) 개시 폴리뉴클레오티드의 플러스 가닥의 3' 부분에 부분적 상보성을 가지는 제1 올리고뉴클레오티드 및 개시 폴리뉴클레오티드의 마이너스 가닥의 3'부분에 부분적 상보성을 가지는 제2 올리고뉴클레오티드와 프라이머 어닐링하기에 적합한 조건하에서 개시 폴리뉴클레오티드를 접촉시키는 단계; d) 프라이머 연장에 적합한 조건하에서 1) 개시 폴리뉴클레오티드의 플러스 가닥의 3'-히드록실로부터 폴리뉴클레오티드 합성; 2) 어닐링된 제1 올리고뉴클레오티드의 3'-히드록실로부터 폴리뉴클레오티드 합성; 3)개시 폴리뉴클레오티드의 마이너스 가닥의 3'-히드록실로부터 폴리뉴클레오티드 합성; 및 4) 어닐링된 제2 올리고뉴클레오티드의 3'-히드록실로부터 폴리뉴클레오티드 합성을 촉매하여 개시 서열을 양방향 연장시킴으로써 초기의 연장된 개시 폴리뉴클레오티드를 형성하는 단계; e) 연장된 개시 폴리뉴클레오티드의 플러스 가닥의 3' 부분에 부분적 상보성을 가지는 제3 올리고뉴클레오티드 및 연장된 개시 폴리뉴클레오티드의 마이너스 가닥의 3' 부분에 부분적 상보성을 가지는 제4 올리고뉴클레오티드와 프라이머 어닐링에 적합한 조건하에서 d)의 연장된 개시 폴리뉴클레오티드를 접촉시키는 단계; f) 프라이머 연장에 적합한 조건하에서, 1) 연장된 개시 폴리뉴클레오티드의 플러스 가닥의 3'-히드록실로부터 폴리뉴클레오티드 합성; 2) 어닐링된 제3 올리고뉴클레오티드의 3'-히드록실로부터 폴리뉴클레오티드의 합성; 3) 연장된 개시 폴리뉴클레오티드의 마이너스 가닥의 3'-히드록실로부터 폴리뉴클레오티드 합성; 및 4) 어닐링된 제4 올리고뉴클레오티드의 3'-히드록실로부터 폴리뉴클레오티드 합성을 촉매하여 개시 서열을 양방향 연장시킴으로써 초기 연장된 개시 폴리뉴클레오티드를 형성하는 단계; 및 g) 필요하다면 e) 내지 f) 단계를 임의로 반복하여 표적 폴리뉴클레오티드 서열을 형성시키는 단계를 포함하는 표적 폴리뉴클레오티드를 합성하기 위한 방법을 제공한다.
본 발명은 a) 표적 폴리뉴클레오티드를 발현 벡터에 혼입하는 단계; b) 발현 벡터를 적합한 숙주 세포에 도입하는 단계; c) 표적 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화된 표적 폴리펩티드의 발현을 증진시키기 위한 시간 동안 및 그러한 조건하에서 세포를 배양하는 단계; 및 d) 표적 폴리펩티드를 분리하는 단계에 의한 본 발명의 방법에 의해 제조된 표적 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화된 표적 폴리펩티드를 분리하는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 a) 모델 서열로부터 유래된 표적 폴리뉴클레오티드 서열을 제공하는 단계; b) 각각의 다수로 존재하는 1 이상의 올리고뉴클레오티드에 부분적으로 상보적인 다수의 단일 가닥 올리고뉴클레오티드를 화학적으로 합성하는 단계로서, 이때 다수의 올리고뉴클레오티드 서열이 표적 폴리뉴클레오티드의 접촉성 서열인 것인 단계; c) 어닐링하기 적합한 시간 동안 및 그러한 조건하에서 부분적으로 상보적인 올리고뉴클레오티드를 접촉시키는 단계로서 상기 접촉은 다수의 부분적 이중 가닥 폴리뉴클레오티드를 생성하며, 이때 각 이중 가닥 폴리뉴클레오티드는 5' 오버행 및 3' 오버행을 포함하는 것인 단계; d) 다수의 이중 가닥 폴리뉴클 레오티드에 존재하는 모델 서열로부터 유래된 1 이상의 개시 폴리뉴클레오티드를 동정하는 단계; e) 프라이머 연장 없이, 개시 폴리뉴클레오티드 및 1) 상기 개시 서열의 5' 부분에 어닐링될 이중 가닥 폴리뉴클레오티드; 2) 개시 폴리뉴클레오티드의 3' 부분에 어닐링될 이중 가닥 폴리뉴클레오티드 및 3) DNA 리가제를 포함하는 혼합물을 어닐링 및 리게이션에 적합한 조건하에서 투여하는 단계로서, 이때 개시 폴리뉴클레오티드는 양방향으로 연장되는 것인 단계; f) 이어서 이중 가닥 폴리뉴클레오티드를 어닐링의 반복적 사이클을 통해 연장된 개시 폴리뉴클레오티드에 어닐링시킴으로써 표적 폴리뉴클레오티드를 생성하는 단계를 포함하는 표적 폴리뉴클레오티드를 합성하는 방법을 제공한다.
본 발명은 모델 서열로부터 유래된 표적 폴리뉴클레오티드 서열을 생성하기 위한 컴퓨터 판독가능한 매체상에 저장된 컴퓨터 프로그램을 제공하는데, 이때, 상기 프로그램은 a) 표적 폴리뉴클레오티드 서열에 포함된 개시 폴리뉴클레오티드 서열을 동정하고; b) 표적 폴리뉴클레오티드 서열을 다수의 특이한 부분적으로 상보적인 올리고뉴클레오티드로 파싱하며; c) 부분적으로 상보적인 올리고뉴클레오티드의 순차적인 첨가에 의해 개시 폴리뉴클레오티드 서열의 양방향 연장을 조절함으로써 표적 폴리뉴클레오티드 서열의 어셈블리를 조절하여 접촉성 이중 가닥 폴리뉴클레오티드를 생성하기 위한 컴퓨터 시스템을 작동시키기 위한 지시를 포함한다.
본 발명은 또한 a) 사용자에게 원하는 표적 폴리뉴클레오티드 서열에 접근(communicate)하기 위한 기회를 제공하는 단계; b) 사용자에게 원하는 표적 폴리뉴클레오티드 서열을 서버에 전달하게 하는 단계; c) 사용자에게 독특한 지시를 제공하는 단계; d) 사용자에 의해 제공된 전달된 표적 폴리뉴클레오티드 서열을 얻는 단계를 포함하는 표적 폴리뉴클레오티드 서열의 자동화된 합성 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 a) 사용자에게 모델 폴리뉴클레오티드 서열에 접근(communicate)하기 위한 메카니즘을 제공하는 단계; b) 사용자에게 임의로 필요하다면 모델 서열에 1 이상의 원하는 변경에 근접하게 하는 기회를 제공하는 단계; c) 사용자에게 모델 서열 및 원하는 변경을 서버에 전달하게 하는 단계; d) 사용자에게 독특한 지시를 제공하는 단계; e) 사용자에 의해 제공된 임의의 원하는 변경 및 전달된 모델 서열을 제공하는 단계; f)입력 장치를 통해 프로그램된 컴퓨터로 모델 폴리뉴클레오티드 서열의 적어도 일부를 포함하는 데이터를 입력하는 단계; g) 프로세서를 이용하여 원하는 변경을 포함하는 모델 폴리뉴클레오티드 서열의 서열을 결정하는 단계; h) 프로세서를 이용하여 모델 폴리뉴클레오티드 서열에 존재하는 1 이상의 개시 폴리뉴클레오티드 서열을 더 결정하는 단계; i) 프로세서를 이용하여, 모델 폴리뉴클레오티드 서열중의 개시 서열의 위치를 기준으로 변경된 모델 폴리뉴클레오티드 서열을 합성하기 위한 모델을 선택하는 단계; 및 j) 출력 장치로 1 이상의 결정 결과를 출력하는 단계를 포함하는, 폴리뉴클레오티드 서열의 자동화된 합성 방법을 더 제공한다.
달리 정의되지 않는다면, 본원에서 사용된 모든 기술 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 당업자에 의해 통상 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다. 예를 들어, 아미노산의 1 문자 및 3문자 약자 및 뉴클레오티드의 1 문자 약자는 통상적인 의미로 이해된다. 본원에서 기재된 것과 유사하거나 동일한 방법 및 물질이 본 발명의 실시 또는 테스트에 사용될 수 있으나, 적합한 방법 및 물질은 하기한 바와 같다. 또한, 물질, 방법 및 실시예는 설명만을 위한 것이며 제한을 의도한 것은 아니다. 모든 간행물, 특허 출원서, 특허, 및 기타 본원에서 언급한 참고문헌은 전체가 참고로 인용된다. 상충되는 경우, 정의부분을 포함한 본 명세서가 이를 조절할 것이다.
본 발명의 1 이상의 태양의 상세설명은 하기 도면 및 상세한 설명과 함께 설명된다. 본 발명의 다른 특징, 목적, 및 장점은 상세한 설명 및 도면 및 특허청구범위로부터 명백할 것이다.
상세한 설명
인간 게놈을 비롯하여, 복합체 게놈의 완전한 서열은 유전학에 대해 커다란 규모의 기능적 접근을 가능하게 한다. 본 발명은 인간 게놈 데이터베이스와 같은 데이터베이스에서 이용가능한 정보를 기초로 한 컴퓨터-지시된 폴리뉴클레오티드 어셈블리에 의해 게놈 서열 정보의 결과를 이용하기 위한 새로운 접근을 설명한다. 구체적으로, 본 발명은 표적 폴리펩티드를 암호화하는 신규한 합성적 표적 폴리뉴클레오티드 서열을 합성, 어셈블 및 선택하기 위하여 사용될 수 있다. 표적 폴리뉴클레오티드는 자연(야생) 또는 모델 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 암호화된 모델 폴리펩티드와 비교하여 증진되거나 변경된 생물학적 활성을 나타내는 표적 폴리펩티드를 암호화할 수 있다. 후속적으로, 발현된 표적 폴리펩티드의 활성을 조사하기 위하여 표준 분석이 사용될 수 있다, 예를 들어, 새로운 기능을 나타내는 표적 폴 리펩티드가 생성되었는지를 결정하기 위하여 또는 상응하는 모델 폴리펩티드의 기능을 수행하기 위한 그 능력을 결정하기 위하여 발현된 표적 폴리펩티드가 분석될 수 있다. 따라서, 본 발명은 컴퓨터-지시된 형태에서 모델 폴리펩티드로부터 유래된 표적 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 합성함으로써 모델 폴리펩티드를 합성적으로 진화시키기 위한 수단을 제공한다.
한 태양에서, 본 발명은 표적 폴리뉴클레오티드 서열을 제공하고, 5' 오버행 및 3' 오버행을 포함하는 부분적 이중 가닥의 폴리뉴클레오티드를 생성하는 1 이상의 마이너스 가닥 올리고뉴클레오티드에 어닐링된 1 이상의 플러스 가닥 올리고뉴클레오티드을 포함하는 표적 폴리뉴클레오티드에 존재하는 1 이상의 개시 폴리뉴클레오티드를 동정함으로써 표적 폴리뉴클레오티드를 합성하는 방법을 제공한다. 본원에서 사용된 "표적 폴리뉴클레오티드 서열"은 본 발명의 방법에 의해 합성될 수 있는 표적 폴리펩티드를 암호화하기에 적합한 임의의 핵산 서열을 포함한다. 표적 폴리뉴클레오티드 서열은 핵산 서열을 어셈블리할 수 있는 장치를 사용하여 표적 폴리뉴클레오티드를 제조하는 데에 사용될 수 있다. 통상적으로, 표적 폴리뉴클레오티드 서열은 이중 가닥 영역을 가지는 DNA의 선형 세그먼트이고; 상기 세그먼트는 상보적인 영역을 가지는 2 이상의 올리고뉴클레오티드의 하이브리드화에 의해 생성되는 충분히 긴 임의의 길이인 것일 수 있다. 표적 폴리뉴클레오티드는 100, 200, 300, 400, 800, 100, 1500, 200, 4000, 8000, 10000, 12000, 18,000, 20,000, 40,000, 80,000 또는 그 이상의 염기쌍 길이일 수 있다고 생각되어 진다. 실제로, 본 발명의 방법은 알려진 박테리아, 효모, 바이러스, 포유류, 양서류, 파 충류 또는 조류 게놈에 비할만한 길이의 전체 인공적인 게놈을 생성할 수 있다고 생각된다. 보다 구체적인 태양에서, 표적 폴리뉴클레오티드는 관심있는 폴리펩티드를 암호화하는 유전자이다. 표적 폴리펩티드는 복제의 오리진, 텔로미어(telomere), 프로모터, 인헨서, 전사 및 번역의 개시 및 종결 시그널, 인트론, 엑손 삽입 부위, 크로마틴 스캐폴드 성분 및 기타 조절 서열의 오리진(origin)과 같은 비 암호화 요소를 더 포함할 수 있다. 표적 폴리뉴클레오티드는 다중 유전자, 염색체 세그먼트, 염색체 및 심지어 전체 게놈을 포함할 수 있다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 박테리아, 효모, 바이러스, 포유류, 양서류, 파충류, 조류, 식물류, 원박테리아 및 기타 DNA 함유 생체를 비롯한 진핵 또는 원핵 생물 서열로부터 유래될 수 있다.
본원에서 사용된 "올리고뉴클레오티드"는 2 이상의 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드, 바람직하게는 3 이상을 포함하는 분자로서 정의된다. 이의 정확한 크기는 반응 온도, 염 농도, 포름아미드와 같은 변성제 존재 및 올리고뉴클레오티드가 하이브리드되려는 서열과의 상보성 정도와 같은 많은 인자에 따라 달라질 것이다.
본원에서 사용된 용어 "뉴클레오티드"는 DNA 또는 RNA에 존재하는 뉴클레오티드를 의미하는 것으로, 아데닌, 시토신, 구아닌, 티민 및 우라실을 염기로 혼입시키는 뉴클레오티드를 포함하며, 당 부분은 데옥시리보스 또는 리보스이다. 그러나, 통상의 염기, 아데닌, 시토신, 구아닌, 티민 및 우라실 중 하나와 염기 쌍을 이룰 수 있는 다른 변경된 염기가 본 발명에 사용되는 올리고뉴클레오티드에 사용 될 수 있다는 것을 인식할 것이다. 이러한 변경된 염기는 예컨대 8-아자구아닌 및 히폭산틴을 포함한다. 필요하다면, 상기 뉴클레오티드는 라벨 또는 마커를 담지할 수 있어서 프라이머 연장 생성물로 혼입할 때, 이들은, 예컨대 고체 상(solid phase) 상으로 획득하기 위해 프라이머 연장 생성물과 관련된 시그널을 증대시킨다.
"플러스 가닥" 올리고뉴클레오티드는 통상 서열을 판독할 때 처럼 5' 말단으로부터 개시하여 왼쪽으로 진행하는 짧은 단일 가닥 DNA 세그먼트를 포함한다. "마이너스 가닥" 올리고뉴클레오티드는 서열 판독할 때 처럼, 3' 말단에서 개시하여 왼쪽으로 진행하는짧은 단일 가닥 DNA 세그먼트를 포함한다. 올리고뉴클레오티드 합성 방법은 예컨대, Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach, Gate, ed., IRL Press, Oxford (1984) (본원에 전체가 참고로 인용)에서 밝혀졌다. 고체 상 합성 기술은 에컨대, 다수의 "핀스(pins)"상에 수개의 펩티드 서열의 합성을 위해 제공되었다. [참고: (See e. g., Geysen et al., J. Immun. Meth. (1987) 102: 259-274,(본원에 전체가 참고로 인용)].
단시간 동안 올리고뉴클레오티드 및 기타 중합체 서열의 큰 어레이를 형성하기 위한 추가적인 방법이 고안되었다. 구체적인 예시로서, Pirrung et al., 미국 특허 5,143,854호 (또한, PCT 출원 WO 90/15070호 참조), Fodor 등, PCT 공보 WO 92/10092호 및 Winkler 등, 미국 특허 제6,136,269호(전체가 참고로 인용)는 예컨대, 빛-지시된 합성 기술을 이용하여 중합체 서열의 큰 어레이를 형성하는 방법을 개시한다. 또한, Fodor 등, Science (1991) 251 : 767-777, (본원에 전체가 참고로 인용) 참고. 중합체 어레이 합성을 자동화하기 위하여 일부 작업이 행해졌다. 예컨대, Southern, PCT 출원 WO 89/10977호는 기질의 12개의 상이한 위치에서 3개의 상이한 단량체를 침착하기 위한 통상의 펜 플로터의 사용을 기재한다.
본원에서 사용된 "개시 폴리뉴클레오티드 서열"은 본 발명의 알고리즘에 의해 동정된 표적 폴리뉴클레오티드 서열에 포함된 서열이다. "개시 폴리뉴클레오티드"는 개시 폴리뉴클레오티드 서열의 물리적 태양이다. 표적 폴리뉴클레오티드의 리게이션 어셈블리에서, 개시 폴리뉴클레오티드는 개시 폴리뉴클레오티드와 접촉성인 후속 폴리뉴클레오티드의 하이브리드화를 위한 앵커(anchor)를 제공함으로써 어셈블리를 시작한다. 따라서, 리게이션 어셈블리에서, 개시 폴리뉴클레오티드는 부분적 이중 가닥 핵산이므로 접촉성 이중 가닥 핵산 분자를 어닐링하기 위한 단일 가닥 오버행(들)을 제공한다. 표적 폴리뉴클레오티드의 프라이머 연장 어셈블리에서, 개시 폴리뉴클레오티드는 개시 폴리뉴클레오티드와 접촉하는 후속 폴리뉴클레오티드의 하이브리드화를 위한 주형을 제공한다. 따라서, 프라이머 연장 어셈블리에 대해, 개시 폴리뉴클레오티드는 부분적 이중 가닥 또는 전체 이중 가닥일 수 있다.
한 태양에서, 본 발명의 개시 폴리뉴클레오티드는 개선된 효능을 위한 고체 지지체에 결합될 수 있다. 고체상은 다른 반응 성분으로부터 유래된 어셈블된 표적 폴리뉴클레오티드의 효과적인 분리를 가능하게 한다. 상이한 지지체가 본 방법에 적용될 수 있다. 예를 들어, 지지체는 반응 혼합물로부터 원하는 생성물을 자성으로 분리 가능하게 하는 자성 라텍스 비드 또는 자성 조절 공극 유리 비드일 수 있 다. 상기 비드에 개시 폴리뉴클레오티드를 결합하는 것은 다양한 알려진 방법, 예를 들어 카보디이미드 처리와 같은 방법에 의해 수행될 수 있다. 참고[Gilham, Biochemistry 7: 2809-2813 (1968); Mizutani and Tachbana, J. Chromatography 356: 202-205 (1986); Wolf 등, Nucleic Acids Res. 15: 2911-2926 (1987); Musso, Nucleic Acids Res. 15: 5353-5372 (1987); Lund et al., Nucleic Acids Res. 16: 10861-10880 (1988)].
고체상에 부착되는 개시 폴리뉴클레오티드는 표적 폴리뉴클레오티드의 연속된 합성을 위한 앵커로서 작용할 수 있다. 어셈블리는 리게이션 어셈블리를 위한 리가제와 함께 접촉성 폴리뉴클레오티드의 첨가 및 프라이머 연장 어셈블리를 위한 폴리머라제와 함께 올리고뉴클레오티드의 첨가에 의해 수행될 수 있다. 적절한 항온처리 시간 후, 본 방법의 결합되지 않은 성분은 세척될 수 있고 본 반응은 주형 이용의 효능을 개선시키기 위하여 다시 반복될 수 있다. 대안으로, 폴리뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드의 다른 세트는 어셈블리를 지속하기 위하여 첨가될 수 있다.
합성을 위해 효과적으로 사용될 고체상은 긴 핵산 분자의 합성을 위한 충분한 공간을 가진 공극을 포함할 수 있다. 고체상은 반응의 바람직하지 못한 임의 성분을 비특이적으로 결합시킬 수 없는 물질로 구성될 수 있다. 본 문제를 해결하는 한 방법은 긴 DNA 분자에 적합한 조절 공극 유리 비드를 이용하는 것이다. 개시 폴리뉴클레오티드는 긴 코넥터를 통해 비드에 부착될 수 있다. 코넥터의 역할은 고체 지지체의 표면으로부터 유래된 개시 폴리뉴클레오티드를 바람직한 거리에 위치시키 는 것이다.
본 발명의 방법은 개시 폴리뉴클레오티드와 접촉하고 5' 오버행, 3' 오버행 또는 5' 오버행과 3' 오버행을 포함하는 부분적 이중 가닥 폴리뉴클레오티드를 생성하는 1 이상의 마이너스 가닥 폴리뉴클레오티드에 어닐링된 1 이상의 플러스 가닥 올리고뉴클레오티드를 포함하는, 표적 폴리뉴클레오티드에 존재하는 제2 폴리뉴클레오티드 서열을 동정하는 것을 더 포함하고, 이때, 제2 폴리뉴클레오티드의 1 이상의 오버행은 개시 폴리뉴클레오티드의 1 이상의 오버행에 상보적이다. 허용되는 상보적인 영역을 가지는 2 이상의 올리고뉴클레오티드는 적절한 조건하에서 "어닐링"되어(즉, 염기쌍이룸), 이중 가닥 영역을 생성할 것이다. 어닐링(즉, 하이브리드화)하기 위하여, 올리고뉴클레오티드는 적어도 부분적으로 상보적이어야 한다. 보원에서 사용되는 용어"상보적인"은 뉴클레오티드와 관련하여, 다른 특정 뉴클레오티드와 염기쌍을 이룰 뉴클레오티드를 의미한다. 따라서, 아데노신 트리포스페이트는 유리딘 트리포스페이트 또는 티미딘 트리포스페이트에 상보적이며, 구아노신 트리포스페이트는 시티딘 트리포스페이트에 상보적이다.
본원에서 사용된 5' 또는 3' "오버행"은 단일 가닥, 즉 염기쌍을 이루지 않은 폴리뉴클레오티드의 말단인 5' 또는 3' 또는 5'와 3'상의 영역을 의미한다. 오버행은 접촉성 폴리뉴클레오티드의 오버행에 상보적인 오버행을 포함하는 접촉성 폴리뉴클레오티드의 후속적인 어닐링을 위한 수단을 제공한다. 고안된 적용예에 따라, 다양한 정도의 어닐링 선택성을 얻기 위한 어닐링의 다양한 조건을 이용하는 것이 필요할 것이다.
고 선택성을 필요로 하는 적용예에서, 통상 하이브리드를 형성하기 위한 상대적으로 엄격한 조건이 필요할 것이며, 예컨대, 약 50 ℃ 내지 약 70 ℃의 온도에서 약 0.02 M 내지 약 0.10 M NaCl로 제공되는 것과 같은 비교적 낮은 염 및/또는 고온 조건을 선택할 것이다. 이러한 높은 엄격성 조건은 올리고뉴클레오티드 및 주형 또는 표적 가닥 사이의 부정합을 있다고 해도 거의 허용하지 않는다. 통상적으로 조건은 증가하는 분량의 포름아미드의 첨가에 의해 보다 엄격성을 가질 수 있다고 여겨진다.
예컨대, 부위 지시 돌연변이유발에 의해 뉴클레오티드의 치환 유사한 것에 의한 특정 적용예에서, 낮은 엄격성 조건이 사용될 수 있다고 여겨진다. 이들 조건하에, 하이브리드화는 프로브의 서열을 통해서도 일어날 수 있으며 표적 서열은 완전하게 상보적이지 않고 1 이상의 위치에서 부정합된다. 조건들은 염 농도의 증가 및 온도의 감소에 의해 덜 엄격한 것으로 될 것이다. 예컨대, 중간 엄격성 조건은 약 37 ℃ 내지 약 55 ℃에서 약 0.1 내지 약 0.25 M로 제공될 수 있지만 낮은 엄격성 조건은 약 20 ℃에서 약 55 ℃ 범위의 온도에서 약 0.15 M 내지 약 0.9 M로 제공될 수 있다. 따라서, 하이브리드화 조건은 원하는 결과에 따라 용이하게 조작될 수 있다.
특정 구체예에서, 라벨을 이용함으로써 올리고뉴클레오티드의 하이브리드화를 결정하는 것이 유리할 것이다. 매우 다양한 적절한 라벨이 검출될 수 있는 아비딘/비오틴과 같은 형광, 방사능, 효소적 또는 다른 리간드를 포함하여 당업계에 알려져 있다. 바람직한 태양에서, 방사능 또는 기타 환경적으로 바람직하지 못한 시 약 대신에 우레아제, 알칼리 포스파타제 또는 퍼옥시다제 와 같은 효소적 택(tag) 또는 형광 라벨을 이용하는 것이 바람직할 것이다. 효소 택의 경우, 상보적인 올리고뉴클레오티드와 특이적 하이브리드화가 일어나는 지를 확인하기 위한 인간 눈 또는 분광학적으로 가시적인 검출 수단을 제공하기 위해 이용될 수 있는 비색 지시 기재가 알려져 있다.
고체상을 포함하는 구체예에서, 예컨대, 개시 뉴클레오티드의 1 이상의 올리고뉴클레오티드는 흡수되거나 아니면 선택된 매트릭스 또는 표면에 고정된다. 이후 이러한 고정된 단일 가닥 핵산은 원하는 조건하에서 상보적인 올리고뉴클레오티드와 하이브리드화 시킨다. 선택된 조건은 또한 요구되는 특정 기준(예컨대, G + C 함량, 표적 핵산 형태, 핵산 공급원, 하이브리드화 프로브의 크기 등에 따라)을 기준으로 한 특정 환경에 따를 것이다. 비특이적으로 결합된 올리고뉴클레오티드를 제거하기 위하여 하이브리드화된 표면의 세척 후에 하이브리드화가 검출되거나, 라벨을 이용하여 정량될 수 있다.
본 발명의 방법은 개시 서열과 접촉하고, 5' 오버행 또는 3' 오버행 또는 5' 오버행과 3' 오버행을 제공하는 표적 폴리뉴클레오티드에 존재하는 제3 폴리뉴클레오티드를 더 제공하며, 제3 폴리뉴클레오티드의 1 이상의 오버행은 제2 폴리뉴클레오티드의 오버행에 상보적이지 않은 개시 폴리뉴클레오티드의 1 이상의 오버행에 상보적이다.
본 방법은 개시 폴리뉴클레오티드와 제2 폴리뉴클레오티드 및 제3 폴리뉴클레오티드를 어닐링하기에 적절한 시간 동안 및 적절한 조건에서 접촉시키는 단계를 더 제공하며, 상기 접촉은 접촉성 이중 가닥 폴리뉴클레오티드를 생성하며 개시 폴리뉴클레오티드를 양방향으로 연장시킨다. 어닐링된 폴리뉴클레오티드는 리게이션에 적합한 조건하에서 리가제와 선택적으로 접촉한다. 전술한 방법은 어닐링 및 리게이션의 반복 사이클을 통해 연장된 개시 폴리뉴클레오티드에 이중 가닥 폴리뉴클레오티드를 순서대로 첨가하기 위하여 임의 반복된다.
표적 폴리뉴클레오티드 서열은 "모델 폴리뉴클레오티드 서열"로부터 유래될 수도 있고 또는 다시 설계될 수 있다. 본원에서 사용된 "모델 폴리뉴클레오티드 서열"은 모델 폴리펩티드 서열을 암호화하는 임의의 핵산 서열을 포함한다. 모델 폴리펩티드 서열은 변경된 폴리뉴클레오티드를 설계하기 위한 기초를 제공하여 원하는 변경을 혼입시키는 표적 폴리뉴클레오티드가 합성된다.
본 발명은 또한 전체 게놈 뿐 아니라 인공 유기체의 특이화된 기능 또는 속성을 수행하는 유전자 세트, 자연 또는 인공 프로모터 구성물로부터 발현된 자연 발생 유전자 또는 합성 DNA 서열로부터 유래된 인공 유전자를 암호화하는 새로운 폴리뉴클레오티드를 합성하기 위해 사용될 수 있는 방법을 제공한다. 이러한 시스템 및 게놈을 제조할 때, 본 발명은 복제-능력이 있는 이중 가닥 폴리뉴클레오티드의 합성을 제공하며, 이때 폴리뉴클레오티드는 제1 코딩 영역 발현을 지시하는 복제의 오리진, 제1 코딩 영역 및 제1 조절 요소를 가진다. 복제 능력에 의해, 폴리뉴클레오티드는 그 자신의 복제를 지시할 수 있다는 것을 의미한다. 따라서, 폴리뉴클레오티드는 그 자신의 합성을 촉진하는 데에 필요한 모든 시스-작용성 시그널를 가질 것이라고 생각된다. 이러한 측면에서, 폴리뉴클레오티드는 플라스미드 또 는 바이러스와 유사하므로 세포내에 일단 놓여지면 폴리뉴클레오티드 및 세포성 기능의 배합에 의해 복제할 수 있다.
유전자, 게놈, 유전자 세트 또는 단백질 서열을 한정하는 폴리뉴클레오티드 서열이 컴퓨터-보조 방식(후술)으로 설계되고 서열의 플러스(+) 및 마이너스(-) 가닥을 포괄하는 파싱된 올리고뉴클레오티드의 세트를 제조하기 위해 이용될 수 있다. 본원에서 사용된 "파싱된"은 표적 폴리뉴클레오티드 서열이 컴퓨터 보조 방식에 기술되어 일련의 접촉성 올리고뉴클레오티드 서열이 동정되는 것을 의미한다. 올리고뉴클레오티드 서열은 개별적으로 합성되어 표적 폴리뉴클레오티드를 제조하기 위한 발명의 방법에 사용된다. 올리고뉴클레오티드의 길이는 상당히 다양하다. 바람직하게는, 본 발명의 방법에 사용된 올리고뉴클레오티드는 약 15 내지 100 염기가 바람직하고 보다 바람직하게는 약 20 내지 50 염기이다. 구체적인 길이는 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64. 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 및 100 염기들을 포함하나, 이에 한정되지는 않는다. 크기에 따라, 부분적 상보성을 가지는 올리고뉴클레오티드는 올리고뉴클레오티드 쌍 당 5 내지 75 염기로 설계될 수 있다.
올리고뉴클레오티드는 폴리뉴클레오티드 키나제, 예를 들어, T4 폴리뉴클레오티드 키나제로 처리하는 것이 바람직하다. 올리고뉴클레오티드의 혼합 전 또는 혼합 후 또는 혼합후지만 어닐링 전에 키나싱(kinasing)을 수행할 수 있다. 어닐링 후, 올리고뉴클레오티드는 리게이션 기능을 가지는 효소로 처리된다. 예를 들어, DNA 리가제는 통상 이러한 기능을 위해 이용될 것이다. 그러나, 5' 포스포릴화를 필요로 하지 않는 토포이소머라제는 신속하게 실온에서 작용하며 리가제 대신 이용될 수 있다. 예를 들어, 25 염기에 의해 중첩되는 50 염기쌍 올리고뉴클레오티드는 올리고뉴클레오티드 어레이 합성기(OAS)에 의해 합성될 수 있다, 올리고뉴클레오티드의 5' (+) 가닥 세트는 하나의 96 웰 플레이트에 합성되고 제2 3' 또는 (-) 가닥 세트는 제2 96 웰 마이크로티터 플레이트에서 합성된다. 합성은 조절된 공극 유리 비드(CPF)상에서 행해진 후 완결된 올리고뉴클레오티드를 탈블록화하고 탈보호화해서 비드로부터 제거한다. 올리고뉴클레오티드는 냉동건조시키고 물에서 재현탁하여 폴리뉴클레오티드 키나제 및 ATP를 이용하여 리게이션이 가능하도록 5' 포스포릴화시킨다.
플레이트 상의 한 세트의 어셈블링된 올리고뉴클레오티드 서열은 혼합된 풀링 계획을 사용하여 어셈블링할 수 있다. 예를 들어, 성분 올리고뉴클레오티드의 시스템적인 풀링은 변경된 Beckman Biomek 자동화된 피펫팅 로버트 또는 다른 자동화된 실험실 워크스테이션을 이용하여 수행될 수 있다. 단편은 완충액과 효소(예컨대, Taq I DNA 리가제 또는 에게아 어셈블라제(상표))와 배합될 수 있다. 풀링은 미세웰 플레이트에서 수행될 수 있다. 각 풀링 스텝 후에, 온도는 어닐링 및 리게이션을 가능하게 하기 위해 경사지게 한 후 추가적인 풀링을 수행하였다.
표적 폴리뉴클레오티드 어셈블리는 한 세트의 중간체를 형성하는 것을 포함 한다. 한 세트의 중간체는 전술한 바와 같이, 마이너스 가닥 올리고뉴클레오티드에 플러스 가닥 올리고뉴클레오티드 어닐링시키는 것을 포함할 수 있다. 어닐링된 중간체는 단일한 마이너스 가닥 올리고뉴클레오티드에 어닐링된 단일 플러스 가닥 올리고뉴클레오티드를 제공함으로써 형성될 수 있다.
대안으로, 2 이상의 올리고뉴클레오티드는 플러스 가닥 또는 마이너스 가닥을 포함할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 표적 폴리뉴클레오티드를 어셈블하기 위해 사용될 수 있는 폴리뉴클레오티드를 구성하기 위하여(예컨대, 개시 폴리뉴클레오티드), 3 이상의 올리고뉴클레오티드가 어닐링될 수 있다. 따라서, 제1 플러스 가닥 올리고뉴클레오티드, 제1 플러스 가닥 올리고뉴클레오티드에 접촉성인 제2 플러스 가닥 올리고뉴클레오티드, 및 제1 플러스 가닥 올리고뉴클레오티드에 적어도 부분적으로 상보적인 제1 접촉성 서열 및 제2 플러스 가닥 올리고뉴클레오티드에 적어도 부분적으로 상보적인 제2 접촉성 서열을 가지는 마이너스 가닥 올리고뉴클레오티드가 부분적 이중 가닥 폴리뉴클레오티드를 형성하기 위해 어닐링될 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 5' 오버행, 3' 오버행, 또는 5' 오버행과 3' 오버행을 포함할 수 있다. 제1 플러스 가닥 올리고뉴클레오티드 및 제2 플러스 가닥 올리고뉴클레오티드는 접촉성 서열이어서 리게이션가능하다. 마이너스 가닥 올리고뉴클레오티드는 플러스 가닥 올리고뉴클레오티드 둘 다에 부분적으로 상보적이어서 올리고뉴클레오티드 둘 다를 어닐링함에 의해 "가교" 또는 :안정화제"로 작용한다. 전술한 바와 같이 어닐링된 2 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 후속적인 폴리뉴클레오티드는 접촉성인 이중 가닥 폴리뉴클레오티드를 생성하는 방식으로 표적 폴 리뉴클레오티드를 어셈블하기 위해 사용될 수 있다.
폴리뉴클레오티드를 어셈블하는 2 이상의 플러스 가닥 올리고뉴클레오티드를 사용하는 예는 도3에 도시된다. 약 25 bp가 중첩되는 각각 약 50 bp 의 3개 올리고뉴클레오티드는 "흠이 난" 중간체를 형성한다. 이들 2개의 올리고뉴클레오티드는 리가제에 의해 회합된 리게이션 기질을 제공하며 제3 폴리뉴클레오티드는 어닐링에 의해 2개의 특이적 서열을 가져오는 안정화제이고, 일부 최종 폴리뉴클레오티드 구성물을 형성시킨다. 이러한 중간체는 흠 밀봉 활동을 통해 50개 염기쌍 올리고뉴클레오티드를 단일 100개 염기 단일 가닥 폴리뉴클레오티드로 회합하는 DNA 리가제 기질을 제공한다.
어닐링된 생성물의 초기 풀링 및 형성 이후, 생성물은 점진적으로 보다 큰 폴리뉴클레오티드로 어셈블링된다. 예를 들어, 올리고뉴클레오티드의 3중체 형성 이후, 3중체 세트는 시스템적으로 회합되고 리게이션되고 어셈블링된다. 각 단계는 로봇 풀링, 리게이션 및 열적 사이클링에 의해 매개되어 어닐링 및 변성을 달성할 수 있다. 최종 단계는 어레이에서 어셈블된 조각을 모든 단편을 나타내는 완전 서열로 회합시킨다. 각 단계의 수율 효율이 100 % 미만이기 때문에, 최종 혼합물의 완전한 생성물의 잘량은 매우 작을 수 있다. 임의로, 통상 15 내지 20개의 염기이고 어셈블리의 최말단에 상보적인 추가적인 독특한 올리고뉴클레오티드 프라이머는 어닐링될 수 있고 PCR 증폭이 수행되기 때문에, 최종 전장 생성물을 증폭하고 정제할 수 있다.
본 발명의 방법은 존재하는 폴리뉴클레오티드 합성 기술에 비해 몇가지 개선 점을 제공한다. 예를 들어, 합성은 매우 빠른 합성을 가능하게 하는 미세분배 압전기 또는 미세솔레노이드 나노분배기, 보다 작은 반응 부피 및 합성 용기로서 고밀도 플레이트를 사용할 수 있다. 각 기구는 매우 높은 성능을 부여하는 1536 까지의 웰 플레이트를 사용할 것이다. 또한, 조절된 풀링은 미세채널을 통해 개별적인 올리고뉴클레오티드를 이동시키고, 조절된 방식으로 혼합/리게이션시킬 것이다. 이는 로봇 피펫팅의 필요성을 방지할 것이며 속도 및 효능을 증진시킬 것이다. 따라서, 본 발명의 방법을 수행하는 장치는 유전자 길이에 대해 전체적으로 보다 큰 성능을 부여하는 동시 반응에 대해 보다 큰 성능을 가질 것이다.
표적 폴리뉴클레오티드가 본 발명의 방법을 이용하여 합성되었다면, 기능 분석의 서열을 스크리닝할 필요가 있을 것이다. 본 발명자에 의해 특별히 숙고된 것은 칩-기재의 DNA 기술이다. 요약하면, 이들 기술은 큰 수의 유전자를 분석하기 위한 빠르고 정확한 정량적 방법을 포함한다. 올리고뉴클레오티드로 유전자에 택을 붙이거나 또는 고정된 프로브 배열을 이용하여, 고밀도 어레이로서 표적 분자를 분리하기 위한 칩 기술을 이용하고 하이브리드화를 기준으로 이들 분자를 스크린 할 수 있다.
결합 합성 및 고 처리량 스크리닝 분석의 이용은 당업자에게 잘 알려져 있다. 예를 들어, 미국 특허 제5, 807,754호; 제5, 807,683호; 제5,804,563호; 제5, 789,162호; 제5, 783,384호; 제5,770,358호; 제5,759,779호; 제5,747,334호; 제5,686,242호; 제5,198,346호; 제5,738,996호; 제5,733,743호; 제5,714,320호; 및 제5,663,046호(참고로 인용)는 표적 폴리펩티드의 활성을 결정하는 데 유용한 스크 리닝 시스템을 기재하고 있다. 이들 특허는 상이한 폴리서브유닛(폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드)의 고밀도 배열의 활성 분석 및 어셈블리에 포함된 조성물 및 방법의 다양한 측면을 교시한다. 이처럼 전술한 특허에 개시된 조성물 및 방법은 본 발명의 표적 폴리펩티드의 활성 프로필을 분석하는 데에 유용할 수 있다는 것이 숙고되었다.
다른 태양에서, 본 발명은 표적 폴리뉴클레오티드 서열을 제공하고, 이중 가닥 폴리뉴클레오티드를 생성하는 1 이상의 마이너스 가닥 올리고뉴클레오티드에 어닐링된 1 이상의 플러스 가닥 올리고뉴클레오티드를 포함하는 표적 폴리뉴클레오티드 서열에 존재하는 1 이상의 개시 폴리뉴클레오티드를 동정함으로써 표적 폴리뉴클레오티드를 합성하는 방법을 제공한다. 개시 폴리뉴클레오티드는 프라이머 어닐링하기 적합한 조건하에서 개시 폴리뉴클레오티드의 플러스 가닥 3' 부분에 부분적으로 상보성을 가지는 제1 올리고뉴클레오티드와 접촉시키고 개시 폴리뉴클레오티드의 마이너스 가닥의 3' 부분에 부분적으로 상보성을 가지는 제2 올리고뉴클레오티드와 접촉시킨다. 1) 개시 폴리뉴클레오티드의 플러스 가닥; 2) 어닐링된 제1 올리고뉴클레오티드; 3) 개시 폴리뉴클레오티드의 마이너스 가닥; 및 4) 어닐링된 제2 올리고뉴클레오티드의 3' 히드록실로부터의 폴리뉴클레오티드 합성을 이용하여 프라이머 연장을 후속적으로 수행한다. 합성은 개시 서열을 양방향으로 연장시켜서 초기 연장된 개시 폴리뉴클레오티드를 형성하게 한다. 연장된 개시 서열은 어닐링 및 프라이머 연장의 반복된 사이클에 의해 더 연장될 수 있다.
전술한 바와 같이, 올리고뉴클레오티드는 어닐링 및 리게이션 반응을 통해 폴리뉴클레오티드를 어셈블하기 위한 빌딩 블록으로써 사용될 수 있다. 대안으로, 올리고뉴클레오티드는 어닐링 및 프라이머 연장 반응을 통해 폴리뉴클레오티드를 제조하기 위한 프라이머로서 사용될 수 있다. 본원에서 사용된 "프라이머"는 정제된 제한 분해에서와 같이 자연적 발생 또는 합성적 생성된 올리고뉴클레오티드를 포함하는 결합 요소를 의미하는 것으로서, 상기 올리고뉴클레오티드는 핵산 가닥에 상보적인 프라이머 연장 생성물의 합성이 유도되는 조건하에 놓여졌을 때, 즉 DNA 폴리머라제와 같은 폴리머화를 위한 제제 및 적절한 뉴클레오티드의 존재하에 적절한 완충액("완충액"은 pH, 이온 강도, 보조인자, 등)에서 및 적절한 온도에서 합성의 개시 시점으로써 작용할 수 있다.
프라이머는 증폭의 최대 효능을 위한 단일 가닥이 바람직하지만, 대안적으로 이중 가닥이 될 수 있다. 이중 가닥이면, 프라이머는 연장 생성물을 제조하는 데에 사용되기 전에 그 가닥을 분리하기 위하여 우선 처리된다. 프라이머는 올리고데옥시리보뉴클레오티드가 바람직하다. 상기 프라이머는 폴리머화를 위한 제제의 존재하에 연장 생성물의 합성을 프라임시키기에 충분히 길어야 한다. 프라이머의 정확한 길이는 프라이머의 온도 및 공급원 및 방법의 용도를 비롯한 많은 인자들에 따라 달라질 것이다. 표적 뉴클레오티드 서열을 하이브리드화할 수 있는 단지 짧은 서열을 가지는 프라이머는 주형과 충분히 안정한 하이브리드 복합체를 형성하기 위하여 통상 낮은 온도를 필요로 한다.
본원의 프라이머는 증폭되는 각 특이적 서열의 상이한 가닥에 "거의" 상보적으로 되기 위해 선택된다. 이것은 이들의 응답선 가닥에 하이브리드화하기 위하여 충분히 상보적이어야 한다는 것을 의미한다. 따라서, 프라이머 서열은 주형의 정확한 서열을 반영할 필요가 없다. 그러나, 통상 프라이머는 Nucleic Acids Reserch 17(7) 2503-2516(1989)에 기재된 방법에 따라 또는 폴리머라제 연쇄 반응 이외의 선형 증폭 또는 증폭 기술을 이용한 이에 상응하는 반응에 따라 행하진 분석에 관한 것을 제외하고는 정확한 상보성을 가진다.
올리고뉴클레오티드의 프라이머 연장을 위한 제제는 효소를 비롯한 프라이머 연장 생성물의 합성을 이루기 위해 기능할 임의 화합물 또는 시스템일 수 있다. 이러한 목표를 위한 적당한 효소는 예컨대, 이 콜리 DNA 폴리머라제 I, 이 콜리 DNA 폴리머라제 I의 Klenow 단편, T4 DNA 폴리머라제, 기타 이용가능한 DNA 폴리머라제, 역전사효소 및 열에 안정한 효소를 비롯한 기타 효소를 포함한다. 본원에 사용된 용어 "열에 안정한 효소"는 열에 안정하고 열에 내성이며 각 핵산 가닥에 상보적인 프라이머 연장 생성물을 형성하기 위하여 적당한 방식으로 뉴클레오티드의 배합을 촉매(촉진)하는 임의의 효소를 의미하는 것이다. 일반적으로, 합성은 각 프라이머의 3' 말단에서 개시될 것이며 합성이 종료할 때까지 주형 가닥을 따라 5' 방향으로 진행될 것이다. 본 발명의 공정에 이용될 수 있는 바람직한 열에 안정한 효소는 테르무스 아쿠아티쿠스(Thermus aquaticus)로부터 추출되고 정제될 수 있는 것이다. 이러한 효소는 약 86,000 - 90,000 달톤의 분자 질량을 가진다. 테르무스 아쿠아티쿠스 균주 YT1은 미국 미드랜드 록크빌 12301 파크라운 드라이브에 소재하는 미국 모식균 배양 수집소로부터 ATCC 25, 104로 제한없이 이용가능하다.
원하는 표적 폴리뉴클레오티드를 증폭시키는 방법은 알려져 있으며 문헌상에 기재되어 있다. K. Kleppe 등 J. Mol. Biol., (1971), 56, 341-361는 원하는 DNA 서열의 증폭 방버을 개시하고 있다. 상기 방법은 단일 가닥을 형성하기 위한 DNA 듀플레스의 변성을 포함한다. 변성 단계는 원하는 DNA 서열에 인접한 영역을 하이브리드화하기 위한 충분한 과량의 2개 핵산 프라이머의 존재하에 수행된다. 냉각시, 2개 구조가 프라이머로 적절하게 복합된 전장 주형 가닥을 각각 포함하는 것으로 수득된다. DNA 폴리머라제 및 충분한 양의 각각 요구되는 뉴클레오시드 트리포스페이트가 첨가되고, 그것에 따라 2개의 오리지널 듀플렉스 분자가 얻어진다. 상기 변성 사이클, 프라이머 첨가 및 연장은 원하는 표적 폴리뉴클레오티드의 적절한 수의 복제가 얻어질 때까지 반복된다.
본 발명은 표적 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화된 표적 폴리펩티드의 발현 및 분리 방법을 더 제공한다. 본 방법은 발현 벡터로 본 발명의 방법에 의해 합성된 표적 폴리뉴클레오티드를 혼입하는 단계; 발현 벡터를 적당한 숙주 세포에 도입하는 단계; 표적 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화된 표적 폴리펩티드의 발현을 증진시키기 위한 충분한 시간 동안 및 충분한 조건하에서 숙주 세포를 배양하는 단계; 및 표적 폴리펩티드를 분리하는 단계를 포함한다.
본 발명은 변경된 표적 폴리펩티드를 생성하는 모델 폴리펩티드를 암호화하는 모델 폴리뉴클레오티드의 특정 기능적, 구조적 또는 계통발생적인 특징을 변경하기 위해 사용될 수 있다. 모델 폴리펩티드를 암호화하는 입력 또는 모델 폴리뉴클레오티드 서열은 모델 폴리펩티드의 특정 부위 또는 다수의 부위에서 아미노산 변화(또는 변이체)의 효과에 대한 잠재력을 결정하기 위해 전자적으로 조정할 수 있다. 일단 동정되면, 신규한 표적 폴리뉴클레오티드 서열은 본 발명이 방법에 의해 어셈블링되어 표적 폴리뉴클레오티드는 모델 폴리펩티드와는 상이한 특징을 가지는 표적 폴리펩티드를 암호화한다.
본 발명의 방법은 공지된 서열 및 구조 데이터베이스의 사용에 따를 수도 있다. 이들 데이터베이스는 서열 및 구조가 추가될수록 보다 더 확고해진다. 표적 폴리펩티드의 아미노산 서열 및 폴리펩티드의 3차 구조와 관련된 정보는 표적 폴리펩티드를 암호화하는 표적 폴리뉴클레오티드로 어셈블될 수 있다. 모델 폴리펩티드는 폴리펩티드의 기능에 포함되는 아미노산을 분석하기 위한 충분한 구조적 정보를 가져야 된다. 구조적 정보는 x-선 결정학, NMR, 또는 아미노산 또는 원자 수준에서 단백질의 구조를 결정하기 위한 일부 다른 기술로부터 유래될 수 있다. 일단 선택되면, 모델 폴리펩티드로부터 수득된 서열 및 구조적 정보는 표적 폴리펩티드를 포함하는 다수의 변이체 아미노산 서열을 암호화하는 다수의 폴리뉴클레오티드를 제조하기 위해 사용될 수 있다. 따라서, 모델 폴리펩티드는 표적 단백질에 유사한 전체 서열을 근거로 또는 일부 표적 폴리펩티드에 유사한 서열을 가지는 부분의 존재를 근거로 선택될 수 있다.
본원에서 사용된 "폴리펩티드"는 단량체가 알파 아미노산이고 아미드 결합을 통해 함께 회합되는 폴리머이다. 아미노산은 L-광학 이성질체 또는 D-광학 이성질체일 수 있다. 폴리펩티드는 2 이상의 아미노산 단량체 길이이고 자주 20 이상의 단량체 길이이다. 아미노산의 표준 약어가 (에컨대, 프롤린은 P) 사용된다. 이들 약어는 Stryer, Biochemistry, Third Ed., 1988, (모든 목적으로 본원에 인용)에 포함된다. 폴리펩티드에 대해, "분리된"은 성분 혼합물의 중요 성분을 예컨대, 50 중량% 이상, 60 중량% 이상, 70 중량% 이상, 80 중량% 이상, 90 중량% 이상, 또는 95 중량% 이상으로 구성된 폴리펩티드를 의미한다. 분리된 폴리펩티드는 통상 화학 합성이 또한 가능하더라도, 폴리펩티드가 생성된 유기체로부터 정제에 이해 수득된다. 폴리펩티드 정제의 방법은 예컨대 크로마토그래피 또는 면역흡착(immunoaffinity) 기술을 포함한다.
본 발명의 폴리펩티드는 나트륨 도데실 설페이트(SDS)-폴리아크릴아미드 겔 전기 영동 후 Coomassie Blue-염색 또는 검출될 폴리펩티드에 대한 결합 흡착성을 가지는 모노클로날 또는 폴리클로날 항체를 사용한 웨스턴 블롯 분석에 의해 검출될 수 있다.
본원에서 사용된 "키메라성 폴리펩티드"는 2 이상의 상이한 단백질, 보통 접촉성이 아닌 동일한 단백질의 2 이상의 영역에서 유래된 아미노산 서열 부분을 포함하는 폴리펩티드이다.
본원에서 사용된 "리간드"는 수용체에 의해 인식되는 분자이다. 본 발명에 의해 조사될 수 있는 리간드의 예로는 모든 세포 수용체, 독소 및 독물(venoms)의 작동물질(agonist) 및 길항물질, 바이러스 에피토프, 호르몬, 진정제, 스테로이드, 펩티드, 효소 기질, 보조 인자, 약물, 렉틴, 슈가, 올리고뉴클레오티드, 핵산, 올리고사카라이드 및 단백질을 포함하지만 이에 제한되는 것은 아니다.
본원에서 사용된 "수용체"는 리간드에 대한 흡착성을 가지는 분자이다. 수용체는 자연 발생적 또는 인공 분자이다. 이들은 이들과 변경 되지 않은 상태에서 또 는 다른 종들과의 응집물로서 사용될 수 있다. 수용체는 결합 원(member)들에게 공유적으로 또는 비공유적으로 직접 또는 특정 결합 기질을 통해 부착될 수 있다. 본 발명에 의해 사용될 수 있는 수용체의 예로는 항체, 세포막 수용체, 특이적 항원 결정물질에 반응성인 모노클로날 항체 및 면역혈청, 바이러스, 세포, 약물, 폴리뉴클레오티드, 핵산, 펩티드, 보조인자, 렉틴, 슈가, 폴리사카라이드, 세포성막 및 세포기관을 포함하나, 이에 한정되지는 않는다. "리간드 수용체 쌍"은 복합체를 형성하기 위한 분자 인식을 통해 배합하였다.
본 발명에 의해 합성될 수 있는 폴리펩티드의 구체예는 다음의 것을 포함하지만 이에 한정되지 않는다:
a) 미생물 수용체: 미생물의 생존에 필수적인 특이적 이동 단백질 또는 효소와 같은 미생물 수용체와 결합하는 리간드의 결정은 새로운 부류의 항생체를 발견하기 위한 유용한 도구일 것이다. 현재 사용되는 항생제에 내성이 있는 면역체계가 약해졌을 때 생기는 진균류, 프로토조아 및 박테리아에 대한 항생체가 특히 가치가 있을 것이다.
b) 효소: 예를 들어, 수용체는 신경전달물질을 전달하는 데에 책임이 있는 효소와 같은 효소의 결합 부위를 포함할 수 있다. 신경전달물질을 절단하는 효소의 작용을 조절하는 이러한 형태의 수용체를 위한 리간드의 결정은 신경전달물질의 장애 치료에 사용될 수 있는 약물의 개발에 유용하다.
c) 항체: 예를 들어, 본 발명은 관심있는 항원의 에피토프와 배합하는 항체 분자상의 리간드-결합 부위를 포함하는 수용체를 조사하는 데에 유용할 수 있다; 항원성 에피토프를 모의하는 서열의 결정은 면역원이 1 이상의 상기 서열을 기준으로 하는 백신을 개발시킬 수 있거나 또는 자가면역 질병(예컨대, "자기" 항체"의 결합을 차단함으로써)에 대한 것과 같은 것에 대한 치료학적 치료에 유용한 관련된 진단 제제 및 화합물를 개발시킬 수 있다.
d) 폴리뉴클레오티드: 폴리뉴클레오티드의 서열이 합성된 서열을 위한 수용체로서 작용하는 DNA 또는 RNA 결합 서열을 설정하기 위하여 합성될 수 있다.
e) 촉매적 폴리펩티드: 폴리머, 바람직하게는 1 이상의 반응물에서 1 이상의 생성물로의 전환을 포함하는 화학적 반응을 증진시킬 수 있는 항체. 이러한 폴리펩티드는 통상 1 이상의 반응물 또는 반응 중간체에 특이적인 결합 부위 및 결합 부위에 인접하는 활성 작용기를 포함하며, 상기 작용기는 결합된 반응무을 화학적으로 변경시킬 수 있다. 촉매적 폴리펩티드 및 기타의 것은 예컨대, PCT 공개 WO 90/05746호, WO 90/05749호, and WO 90/05785호에 기재되어 있고, 모든 목적을 위해 본원에 인용된다.
f) 호르몬 수용체: 인슐린 및 성장 호르몬 수용체와 같은 수용체에 고친화도로 결합하는 리간드의 동정은 에컨대, 당뇨병 환자가 당뇨병의 증후를 완화시키기 위해 섭취해야 하는 매일 투여물의 경구 치환물 또는 성장 호르몬의 치환물 개발에 유용하다. 다른 호르몬 수용체의 예는 혈관을 수축시키는 호르몬 수용체를 포함한다. 이러한 수용체의 결정은 혈압을 조절하기 위한 약물을 개발시킬 수 있다.
g) 진정제 수용체: 뇌에서 진정제 수용체에 결합하는 리간드 결정은 몰핀 및 관련 약물의 덜 중독성인 치환물의 개발에 유용하다.
폴리펩티드와 관련하여, 용어 "구성"은 단백질 중 원자의 3 디멘젼 배열을 의미한다. "기능"은 단백질의 임의의 측정가능한 성질을 의미한다. 단백질 기능의 예로는 촉매 작용, 기타 단백질에의 결합, 비-단백질 분자(예컨대, 약물)에의 결합 및 2 이상의 구조 형태 간의 이성질체화를 포함하지만 이에 한정되지는 않는다. "생물학적으로 관련된 단백질"은 유기체 일생에서 중요한 역할을 하는 임의 단백질을 의미한다.
중요한 구조적 모티프를 동정하기 위하여, 모델 폴리펩티드의 서열은 인지된 도메인의 1 이상의 데이터베이스, 예컨대, PROSITE 데이터베이스 도메인 (Bairoch,Nucl. Acids.Res.24:217, 1997) 또는 pfam HMM 데이터베이스(Bateman 등, (2000) Nucl. Acids. Res. 28:263)의 기재사항에 매치 여부를 검사한다. PROSITE 데이터베이스는 통상 전체 단백질 도메인을 나타내는 2 형태의 서열 사인-프로필 및 단백질 도메인의 가장 고도로 보존된 기능적 또는 구조적 측면을 통상 나타내는 패턴의 편집물이다.
본 발명의 방법은 표적 폴리펩티드의 촉매적 활성 또는 표적 폴리펩티드의 비 촉매적 활성(예컨대, 구조, 안정성, 제2 단백질 또는 폴리펩티드쇄에 결합, 핵산 분자에 결합, 소분자에 결합 및 단백질과 핵산이 아닌 거대 분자에 결합)에 효과를 가지는 다형성을 포함하는 폴리펩티드를 제조하기 위하여 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 발명은 암호화된 폴리펩티드가 특정 활성을 위하여 발현될 수 있고 스크리닝될 수 있도록 표적 폴리펩티드를 암호화하는 임의의 폴리뉴클레오티드 서열을 어셈블리하는 수단을 제공한다. 표적 폴리펩티드 중의 특정 지점에서 특정 아미 노산을 변경함으로써, 작동 온도, 작동 pH, 또는 폴리펩티드의 임의의 다른 성질이 조작되어 독특한 활성을 가진 폴리펩티드를 생성할 수 있다. 따라서, 본 발명의 방법은 관심있는 폴리펩티드의 구조 또는 기능을 처리하기 위하여 제조될 수 있다(예컨대, 선택된 활성을 증가하거나 감소시키기 위하여 또는 선택성 활성을 추가하거나 제거하기 위하여).
추가로, 본 발명의 방법은 약학 제제 또는 진단학적 제제에 의해 다형성-특이적 표적화를 위한 후보 다형성의 동정 및 분석, 약리유전자 적용예에 대한 후보 다형성의 동정 및 분석을 위해, 그리고 아미노산 다형성을 나타내는 약학적 표적의 실험 생화학적 및 구조적 분석을 위해 사용될 수 있다.
다수의 표적 폴리펩티드를 암호화하는 표적 폴리뉴클레오티드의 라이브러리가 본 발명에 의해 제조될 수 있다. 숙주 세포는 형질전환에 도움이 되는 조건하에서 접종에 의해 표적 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터의 인공적 도입에 의해 형질전환된다. 이후 형질전환된 클론의 생성 라이브러리는 활성의 표현형 분석에 관심있는 폴리펩티드의 활성을 나타내는 클론에 대해 스크리닝된다.
본 발명의 표적 폴리펩티드는 적절한 벡터로 도입(클로닝)될 수 있다. 발현을 목적으로, 본 발명의 표적 폴리펩티드를 암호화하는 표적 서열은 재조합 발현 벡터에 삽입될 수 있다. 용어 "재조합 발현 벡터"는 본 발명의 표적 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열의 삽입 또는 혼입에 의해 조작된 당업계에 알려진 플라스미드, 바이러스 또는 기타 비히클을 의미한다. 본 발현 벡터는 통상 형질전환된 세포의 표현형 선택을 가능하게 하는 특이적 유전자 뿐 아니라 복제의 오리 진, 프로모터를 포함한다. 본 발명에 사용하기에 적합한 벡터는 박테리아에 발현을 위한 T7-기재의 발현 벡터(Rosenberg 등, Gene, 56: 125, 1987), 포유류에 발현하기 위한 pMSXND 발현 벡터 (Lee and Nathans, J. Biol. Chem., 263: 3521, 1988), 곤충 세포, 컬리플라워 모자이크 바이러스, CaMV, 담배 모자이크 바이러스 TMV 에서의 발현을 위한 바큘로바이러스-유도된 벡터를 포함하지만 이에 한정되지는 않는다.
이용된 벡터에 따라, 구조성 및 유도성 프로모터, 전사 인헨서 요소, 전사 종결제 등을 비롯한 다수의 적절한 전사 및 번역 요소 중 임의의 것이 발현 벡터에 사용될 수도 있다[참조, 예컨대, Bitter 등, Methods in Enzymology, 153: 516-544,1987]. 이들 요소는 당업자에게 잘 알려져 있다.
용어 "작동적으로 연결된" 또는 "작동적으로 연관된"은 조절 서열에 의해 조절된 폴리뉴클레오티드 서열과 조절 서열 간의 기능적인 연결을 의미한다. 작동적으로 연결된 조절 서열은 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 발현된 생성물의 발현을 조절한다. 대안으로, 기능적인 연결은 인헨서 요소를 또한 포함한다.
"프로모터"는 직접 전사에 충분한 핵산 조절 서열을 의미한다. 프로모터 의존성 폴리뉴클레오티드 서열에 세포형 특이적, 조직 특이적 또는 외부 시그널 또는 제제에 의해 유도성을 제어할 수 있는 발현을 부여하기에 충분한 이들 프로모터 요소들이 본 발명에 포함된다. 이러한 요소는 천연 유전자 또는 인트론에서 5' 또는 3' 영역에 위치할 수 있다.
"유전자 발현" 또는 "폴리뉴클레오티드 서열 발현"은 뉴클레오티드 서열이 성공적인 전사 및 번역을 수행하여 전달된 뉴클레오티드 서열의 검출가능한 수준이 기능적인 생물학적 노력이 달성되도록 충분한 시간에 걸쳐 및 충분한 양으로 발현되도록 하는 공정을 의미한다.
효모에서, 구조성 또는 유도성 프로모터를 함유하는 다수의 벡터가 사용될 수 있다[참조.Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 2, Ed. Ausubel 등, Greene Publish. Assoc. & Wiley Interscience, Ch. 13,1988; Grant 등,"Expression and Secretion Vectors for Yeast,"in Methods in Enzymology, Eds. Wu & Grossman, Acad. Press, N. Y., Vol. 153, pp. 516-544,1987; Glover, DNA Cloning, Vol. II, IRL Press, Wash., D. C., Ch. 3,1986 ;"Bitter, Heterologous Gene Expression in Yeast,"Methods in Enzymology, Eds. Berger & Kimmel, Acad. Press, N. Y., Vol. 152, pp. 673-684,1987; and The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces, Eds. Strathern et al., Cold Spring Harbor Press, Vols. I and II, 1982]. ADH 또는 LEU2와 같은 구조성 효모 프로머터 또는 GAL과 같은 유도성 프로모터가 사용될 수 있다[참조. "Cloning in Yeast,"Ch. 3, R. Rothstein In: DNA Cloning Vol. 11, A Practical Approach, Ed. DM Glover, IRL Press, Wash., D. C., 1986]. 대안으로, 외부 DNA 서열을 효모 염색체에 축적하는 것을 개선하는 벡터가 사용될 수 있다.
특정 구체예에서, 표적 폴리뉴클레오티드 서열의 말단에서 텔로미어(telomere)로서 알려진 특이화된 영역을 포함하는 것이 바람직할 수 있다. 텔로미어는 염색체 말단에서 발견되는 반복된 서열이며, 절두된 말단을 가진 염색 체가 불안정하고, 다른 염색체와 융합하는 경향이 있으며 그러지 않으면 세포 분화 동안 상실된다고 오랫동안 알려져 왔다.
일부 데이터는 텔로미어가 뉴클레오단백질 복합체 및 뉴클레어 매트릭스와 상호작용한다는 것을 암시한다. 텔로미어의 추정적인 역할은 염색체를 안정화시키고 분해된 효소로부터 마단을 가리는 것을 포함한다.
텔로미어의 다른 가능한 역할은 복제에 있다. 현재 학설에 따르면, DNA 복제는 주형의 T-말단에 어닐링된 짧은 RNA 프라이머로부터 개시하는 것을 요구한다. 이 기전의 결과는 RNA 프라이머에 상응하는 영역이 복제되지 않는 "말단 복제 문제"이다. 다수의 세포 분화에 걸쳐, 이는 염색체의 점진적인 절두를 생성할 것이다. 텔레미어는 이들이 이들 효과에 의해 제거될 때까지 이러한 효과에 대한 완충액을 제공할 것이라고 생각되어진다. 표적 폴리뉴클레오티드에 포함될 수 있는 추가 구조가 동원체(centromere)이다.
본 발명의 특정 태양에서, 세포내의 핵산의 전달은 발현 구조물에서마커를 포함함으로써 생체외 또는 생체내에서 동정될 수 있다. 마커는 발현의 용이한 동정을 가능하게 하는 트랜스펙팅된 세포로의 동정가능한 변화를 생성한다.
본 발명의 발현 벡터는 표적 세포를 형질전환하는 데에 사용될 수 있다. "형질전환"은 새로운 DNA(즉, 세포에 외인성인 DNA) 혼입 후의 세포내에 유도된 유전적 변화를 의미한다. 세포가 포유류 세포인 경우, 유전적 변화는 DNA의 이 세포 게놈으로의 도입에 의해 통상 달성된다. "형질전환된 세포"는 재조합 DNA 기술을 이용하여 도입된 세포(또는 이의 선조)이다. 재조합 DNA를 이용한 숙주 세포의 형질 전환은 당업자에게 잘 알려진 통상의 기술에 의해 수행될 수 있다. 숙주가 원핵생물, 예컨대, 이 콜리인 경우, DNA 섭취가 가능한 세포가 지수 성장 상(exponential growth phase) 및 당업계에 잘 알려진 방법에 의한 CaCl2 방법에 의해 처리된 후 수집된 세포로부터 제조될 수 있다. 대안으로, MgCl2 또는 RbCl이 사용될 수 있다. 형질전환은 또한 숙주 세포의 원형질의 형성 후 또는 일렉트로포레이션에 의해 수행될 수도 있다.
본 발명의 표적 폴리펩티드는 폴리펩티드를 암호화하는 핵산의 발현에 의해 원형질에서 생성될 수 있다. 이들은 본 발명의 폴리펩티드를 암호화하는 재조합 박테리오파지 DNA, 플라스미드 DNA, 또는 코스미드 DNA 발현 벡터로 형질전환된 박테리아와 같은 미생물을 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 구성물은 시험관 분석을 위하여 큰 범위로 이 콜리에서 발현될 수 있다. 박테리아로부터의 정제는 서열이 니켈-킬레이트 크로마토그래피에 의해 한단계 정제를 위해 택을 포함하는 경우에 단순화된다. 구성물은 폴리펩티드의 분리를 단순화하기 위한 택을 포함할 수도 있다. 예를 들어, 6개 히스티딘 잔기의 폴리히스티딘 택은 단백질의 아미노 터미널 말단 또는 카르복시 터미너 말단에서 혼입될 수 있다. 폴리히스티딘 택은 니켈-킬레이트 크로마토그래피에 의해 단일 단계에서 단백질의 편리한 분리를 가능하게 한다. 본 발명의 표적 폴리펩티드는 단백질 회수시 보조용 절단 부위를 함유하기 위해 처리될 수도 있다. 대안으로, 본 발명의 폴리펩티드는 그 자리에서 분석용의 바람직한 숙주 세포에서 직접 발현될 수 있다.
숙주가 진핵생물인 경우, 인산 칼슘 공침물과 같은 DNA 트랜스펙션 방법, 미세주사와 같은 종래의 기계적 방법, 일렉트로포레이션 또는 비올리스틱(biollistic) 기술, 리포좀에 갇힌 플라스미드의 삽입 또는 바이러스 벡터가 사용될 수 있다. 진핵 세포는 헤르페스 심플렉스 티미딘 키나제 유전자와 같이 본 발명의 폴리펩티드를 암호화하는 DNA 서열과 선택성 표현형을 암호화하는 제2의 외부 DNA 분자로 공형질전환될 수도 있다. 다른 방법은 시미안 바이러스 40(SV40) 또는 소과의 파필로마 바이러스와 같은 진핵생물 바이러스 벡터를 진핵 세포를 잠재적으로 감염시키거나 형질전환시키기 위해 사용하고 단백질을 발현하는 것이다(Eukaryotic Viral Vectors, Cold Spring Harbor Laboratory, Gluzman ed., 1982). 바람직하게는, 진핵 숙주는 본원에서 기재한 바와 같이 숙주 세포로서 이용된다.
진핵 생물계, 바람직하게는 포유류 발현계는 발현된 포유류 단백질의 적당한 번역후 변경이 일어나게 한다. 유전자 생성물의 1차 전사, 글리코실화, 포스포릴화 및 유익하게는 분비의 적절한 공정을 위한 세포 수단을 소유하는 진핵 세포는 본 발명의 폴리펩티드의 발현을 위한 숙주 세포로서 사용되어야 한다. 이러한 숙주 세포주는 CHO, VERO, BHK, HeLa, COS, MDCK, Jurkat, HEK-203 및 W138을 포함할 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.
재조합 단백질의 장기간의 고수율 생산에서, 안정한 발현이 바람직하다. 복제의 바이러스 오리진을 포함하는 발현 벡터를 이용하는 것 보다, 숙주 세포가 적절한 발현 조절 요소(예컨대, 프로모터, 인헨서, 서열, 전사 종결제, 폴리아데닐화 부위 등) 및 선택성 마커에 의해 조절된 본 발명의 표적 폴리펩티드를 암호화하는 cDNA로 형질전환시킬 수 있다. 재조합 플리스미드의 선택성 마커는 선택에 대한 내성을 부여하고, 안정하게 플라스미드를 이들의 염색체에 혼입시키며, 순서대로 세포주에 클로닝되고 확장될 수 있는 중심(foci)을 형성하도록 성장하게 한다. 예를 들어, 외부 DNA의 도입 후, 처리된 세포는 풍부한 매체에서 1-2일간 성장하도록 할 수 있으며, 이후 선택성 매체로 교환된다. 다수의 선택성 시스템은 헤르페스 심플렉스 바이러스 티미딘 키나제(Wigler 등, Cell, 11: 223,1977), 하이포크산틴-구아닌 포스포리보실트랜스퍼라제(Szybalska & Szybalski, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 48: 2026,1962), 및 아데닌 포스포리보실트랜스퍼라제 (Lowy et al., Cell, 22: 817,1980)를 비롯한 것이 사용될 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다. 유전자는 tk-, hgprt- 또는 aprtcells에 각각 사용될 수 있다. 또한, 대사길항물질 내성은 메토트렉세이트(Wigler et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77: 3567,1980; O'Hare et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 8: 1527,1981); 미코페놀산에 대한 내성을 부여하는 gpt(Mulligan & Berg, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78: 2072,1981; 아미노글리코시드 G-418에 내성을 부여하는 neo (Colberre-Garapin et al., J. Mol. Biol., 150: 1,1981); 및 하이그로마이신 유전자에 내성을 부여하는 hygro (Santerre et al., Gene, 30: 147,1984)의 선택을 기초로 사용될 수 있다. 최근, 추가적인 선택성 유전자가 기재되었는데, 즉, 세포가 트립토판 대신에 인돌을 이용하게 하는 trpB; 세포가 히스티딘 대신에 히스티놀을 이용하게 하는 hisD (Hartman & Mulligan, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85: 8047,1988); 및 오르니틴 데카르복실라제 억제제에 대한 내성을 부여하는 ODC (오르니틴 데카르복실라제), 2- (디플루오로메틸)-DL-오르니틴, DFMO (McConlogue L., In: Current Communications in Molecular Biology, Cold Spring Harbor Laboratory, ed., 1987).
본 발명의 미생물 또는 진핵생물 발현된 폴리펩티드의 분리 및 정제 기술은 예컨대, 예비 크로마토그래피 분리 및 모노클로날 또는 폴리클로날 항체 또는 항원을 포함하는 것과 같은 면역학적 분리와 같은 임의의 종래의 수단에 의한 것일 수 있다.
표적 폴리뉴클레오티드 또는 표적 폴리뉴클레오티드를 함유하는 발현 구성물이 리포좀에 갇힐 수 있다. 리포좀은 인지질 이중층 막 및 내부 수성 매체를 특징으로 하는 소낭성 구조이다. 다중 라멜라 리포좀은 수성 매체에 의해 분리된 다중 지질층을 가지며 인지질이 과량의 수용액에 현탁될 때 자발적으로 형성한다. 지질 성분은 닫힌 구조의 형성 전에 자가 재배열을 수행하며 지질 이중층 사이에 물 및 용해된 용질을 가둔다. 리포좀은 헴아글루티네이팅 바이러스(HVJ)와 복합체를 형성할 수 있다. 이는 세포막과의 융합을 촉진하며 시포좀 캡슐화된 DNA의 세포 출입을 증진시키는 것으로 보였다. 다른 태양에서, 리포좀은 핵의 비-히스톤 염색체 단백질(HMG-1)과의 접합으로 복합체를 형성하거나 이용될 수 있다. 추가적인 태양에서, 리포좀은 HVJ 및 HMG-1 모두와 접합으로 복합체를 형성하거나 이용될 수 있다. 이러한 발현에서 구성물은 생체외 및 생체내에서 핵산 발현 및 이전에 성공적으로 사용되었으며, 그 후 이들은 본 발명에 적용된다. 박테리아 프로모터가 DNA 구성물에 사용되는 경우, 리포좀 내에 적절한 박테리아 폴리머라제를 포함하는 것이 바람직할 것이다.
본 발명은 정보만을 기준으로, 즉, 존재하는 유전자, DNA 분자 또는 게놈에 대한 필요조건 없이, 표적 폴리뉴클레오티드의 생성을 가능하게 하는 방법을 기재한다. 통상, 컴퓨터 소프트웨어를 이용하여, 가상의 폴리뉴클레오티드를 컴퓨터에 구성하는 것이 가능하다. 이 폴리뉴클레오티드는 예컨대 선형 스트링의 전체 인공 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 일련의 DNA 염기 G, A, T 또는 C로 구성된다. 서열의 구성을 따라, 이후 컴퓨터 소프트웨어는 특정 길이의 중첩 올리고뉴클레오티드 세트로 표적 서열을 분해함으로써 이를 분석하는 데에 사용된다. 이는 중첩 세트에서 표적 폴리뉴클레오티드의 전체 길이를 중첩하여 포괄하는 더 짧은 DNA 서열 세트를 생성한다.
통상적으로, 이들 중 10개가 한 가닥을 포함하고 이들 중 10개가 다른 가닥을 포함하는 경우 1000개 염기쌍의 유전자는 20 내지 100-mer로 분해될 수 있다. 이들은 25 내지 50개의 염기쌍으로 각 가닥상에서 중첩되도록 선택될 수 있다.
유전자 코드의 축퇴(degeneracy)는 임의의 특정 아미노산 서열의 코돈 선택시 실질적인 자유를 허용한다. 식물과 같은 형질전환 유전자 개체는 동일한 단백질 암호화하지만 유전자가 유도된 개체의 코돈과 상이할 수 있는 특정 코돈을 자주 선호한다. 예컨대, 미국 특허 제5,380,831호 Adang 등은 바실러스 투링기엔시스(Bt) 독소 유전자를 발현시키는 해충 내성의 형질전환 유전자 식물의 생성을 기재한다. Bt 결정 단백질인 해충 독소는 형질전환 유전자 식물에서 불량하게 발현되는 전장 유전자에 의해 암호화된다. 식물에서의 발현을 개선하기 위하여, 식물에서 선호되는 코돈을 함유하는 단백질을 암호화하는 합성 유전자는 천연 서열로 치환되었다. 본 발명은 Bt인 자연 살충 단백질에 종종 동일한 살충 단백질을 암호화하는 화학적으로 합성된 유전자를 그 안에 포함하는 것을 기재한다. 합성 유전자는 천연 Bt 유전자 보다 높은 수준에서 식물에 발현되기 위해 디자인되었다.
특정 폴리펩티드를 암호화하는 표적 폴리뉴클레오티드를 디자인함에 있어서, 아미노산의 수치요법(hydropathic)을 고려할 수 있다. 상호작용적인 생물학적 기능을 단백질에 부여할 때 수치요법 아미노산 인덱스의 중요성은 당업계에 통상적으로 알려져 있다. 각 아미노산은 이들의 소수성 및 하전 특성을 근거로 수치요법 인덱스를 지정하였다. 이들은 이소류신 (+4.5); 발린 (+4.2); 류신 (+3.8); 페닐알라닌 (+2.8); 시스테인/시스틴 (+2.5); 메티오닌 (+1.9); 알라닌 (+1.8); 글리신 (-0.4); 트레오닌 (47); 세린 (-0.8); 트립토판 (-0.9); 티로신 (-1.3); 프롤린 (-1.6); 히스티딘 (-3.2); 글루타메이트 (-3.5); 글루타민 (3.5); 아스파테이트 (-3.5); 아스파라긴 (-3.5); 라이신 (-3.9); 및 아르기닌 (45)이다.
특정 아미노산은 유사한 수치요법 인덱스 또는 스코어를 가지는 다른 아미노산에 의해 치환될 수 있으며 여전히 유사한 생물학적 활성을 생성할 수 있는데, 즉 여전히 생물학적인 기능으로 동일한 단백질을 수득할 수 있다. 이러한 변화를 야기함에 있어서, 수치요법 인덱스가 ±2인 아미노산의 치환이 선호되며, ±1 이내의 것이 특히 선호되고, ±0.5 이내의 것이 보다 더 특히 선호된다.
유사 아미노산의 치환은 친수성을 근거로 효과적으로 만들어질 수 있다는 것 이 또한 당업계에서 이해된다. 본원에 참고로 인용된 미국 특허 4,554,101호는 인접 아미노산의 친수성에 의해 결정되는 단백질의 보다 큰 국부적 평균 친수성은 단백질의 생물학적 성질과 관련된다는 것을 설명한다.
미국 특허 4,554,101호에 기재된 바와 같이, 다음의 친수성 값이 아미노산 잔기에 부여되었다: 아르기닌 (+3.0) ; 라이신 (+3.0); 아스파테이트 (+3.0 + 1) ; 글루타메이트 (+3.0 + 1); 세린 (+0.3); 아스파라긴 (+0.2); 글루타민 (+0.2); 글리신 (0) ; 트레오닌 (44); 프롤린 (-0.5 1); 알라닌 (45) ; 히스티딘-0.5) ; 시스테인 (-1.0); 메티오닌 (-1.3); 발린 1. 5); 류신 (-1.8); 이소류신 (-1.8); 티로신 (-2.3); 페닐알라닌 (-2.5); 트립토판 (3.4).
아미노산은 유사한 친수성 값을 가지는 다른 것으로 치환될 수 있으며 여전히 생물학적 동일성 및 면역학적 동일 성질을 얻을 수 있음이 이해된다. 상기 변화에 있어서, 친수성 값이 ±2 이내인 아미노산이 선호되고, ±1 이내인 것이 특히 선호되고, ±0.5 이내인 것이 보다 더 특히 선호된다.
상술한 바와 같이, 아미노산 치환은 통상 아미노산 측쇄 치환의 상대적 유사성, 예를 들면, 이들의 소수성, 친수성, 하전, 크기 등에 근거를 둔다. 전술한 다양한 성질을 고려하는 치환의 예는 아르기닌과 리신; 글루타메이트와 아스파테이트; 세린과 트레오닌; 글루타민과 아스파라긴; 및 발린, 루신 및 이소루신을 비롯하여, 당업자에게 잘 알려져 있다.
본 발명의 양태들은 하드웨어 또는 소프트웨어또는 이들의 배합으로 실시될 수 있다. 그러나, 바람직하게는 본 발명의 알고리즘과 공정들이 각각 1 이상의 프 로세서, 1 이상의 데이터 저장 시스템(휘발성 및 비휘발성 메모리 및/또는 저장 요소), 1 이상의 입력 장치 및 1 이상의 출력 장치를 포함하는 프로그램가능한 컴퓨터상에서 수행하는 1 이상의 컴퓨터 프로그램에서 수행된다. 프로그램 코드는 본원에서 기재된 기능을 수행하기 위하여 그리고 산출 정보를 생성하기 위하여 입력 데이터에 적용된다. 산출 정보는 공지된 방식으로 1 이상의 출력 장치에 적용된다.
각 프로그램은 컴퓨터 시스템에 접근하기 위하여 임의의 원하는 컴퓨터 언어(기계, 어셈블리, 고도의 과정 또는 목적 지향된 프로그래밍 언어를 비롯함)로 수행될 수 있다. 임의의 경우, 언어는 컴파일된 도는 해석된 언어일 수도 있다.
저장 매체 또는 장치가 본원에 기재된 과정을 수행하기 위한 컴퓨터에 의해 판독될 때, 각각의 상기 컴퓨터 프로그램은 컴퓨터를 형성하고 작동하기 위하여 일반적인 또는 특정한 목적의 프로그램가능한 컴퓨터에 의해 판독가능한 저장 매체 또는 장치(예컨대, ROM, CD-ROM, 테이프 또는 마그네틱 디스켓)상에 저장되는 것이 바람직하다. 발명적 시스템은 또한 그렇게 형성된 저장 매체가 본원에 기재된 기능을 수행하기 위하여 특정의 사전에 정의된 방식으로 컴퓨터를 작동시키는 경우, 컴퓨터 프로그램으로 형성된 컴퓨터 판독가능한 저장 매체로서 실시될 것이라고 생각될 수 있다.
따라서, 다른 태양에서, 본 발명은 표적 폴리뉴클레오티드 서열을 생성하기 위하여 컴퓨터 판독가능한 매체상에 저장된 컴퓨터 프로그램을 제공한다. 컴퓨터 프로그램은 컴퓨터 시스템이 접촉성 이중 가닥 폴리뉴클레오티드를 생성하는 부분적으로 상보적인 올리고뉴클레오티드의 순서적인 첨가에 의해 1)표적 폴리뉴클레오 티드 서열에 포함된 개시 폴리뉴클레오티드 서열을 동정; 2) 표적 폴리뉴클레오티드 서열을 다중의 독특한 부분적으로 상보적인 올리고뉴클레오티드로 분석; 및 3) 표적 폴리뉴클레오티드 서열을 개시 폴리뉴클레오티드 서열의 양방향 연장을 조절함으로써 표적 폴리뉴클레오티드 서열의 어셈블리를 조절하도록 하는 지시를 포함한다. 컴퓨터 프로그램은 폴리펩티드 서열에 상응하는 한 세트의 올리고뉴클레오티드을 생성함으로써 표적 폴리뉴클레오티드 서열을 분석하기 위한 알고리즘을 포함할 수 있다. 알고리즘은 특정 코돈 표를 이용하여 DNA 서열을 생성하기 위한 폴리펩티드 서열을 이용한다. 이후 알고리즘은 다음 방식으로 DNA 서열의 (+) 및 (-) 가닥에 상응하는 한 세트의 분석된 올리고뉴클레오티드를 생성한다.
1. DNA 서열 GENE[], 염기들의 배열은 특정 코돈표를 이용하여 단백질 서열 AA[], 아미노산 어레이로부터 생성된다. 이 콜리 형태 II 코돈의 코돈표의 예는 하기와 같다.
a. 파라미터
i. N 아미노산 잔기의 단백질 길이
ii. L = DNA 염기의 유전자의 3N 길이
iii. Q 각 성분 올리고뉴클레오티드의 길이
iv. X = Q/2 올리고뉴클레오티드 간의 중첩 길이
v. W = 3N/Q F 세트에서 올리고뉴클레오티드의 수
vi. Z = 3N/Q + 1 R 세트에서 올리고뉴클레오티드의 수
vii. F [1: W] (+) 가닥 올리고뉴클레오티드 세트
viii. R [L: Z] (-) 가닥 올리고뉴클레오티드 세트
ix. AA [1: N] 아미노산 잔기의 어레이
x. GENE [1: L] 유전자를 포함하는 염기 어레이
b. 아미노산 잔기 리스트로 구성된 단백질 서열 AA []의 수득 또는 디자인
c. 단백질 서열, AA[]로부터 DNA 서열, GENE[]의 생성
i. For I = 1 to N
ii. Translate AA[J] from codon table generating GENE [I: I+2]
iii. I = I + 3
iv. J = J+ 1
v. Go to ii
2. 두 세트의 중첩 올리고뉴클레오티드는 GENE []로부터 생성됨; F [] 는 (+) 가닥을 포괄하고, R []는 (-) 가닥을 포괄하는 상보적이고 부분적으로 중첩하는 세트이다.
a. 올리고의 F [] 세트를 생성
i. For I = 1 to W
ii. F [I] = GENE [I : I+Q-1]
iii. I = I + Q
iv. Go to ii
b. 올리고의 R 세트를 생성
i. J = W
ii. For I = 1 to W
iii. R [I] = GENE [W : W-Q]
iv. J = J-Q
v. Go to iii
c. 결과는 Q 길이의 올리고 F [] 및 R [] 의 두 세트이다.
d. 최종 2개의 마지막 올리고를 생성
i. S [l] = GENE [Q/2 : 1]
ii. S [2] = GENE [L-Q/2: L]
이어서, 올리고뉴클레오티드 세트 어셈블리는 다음의 알고리즘에 의해 확립된다:
올리고뉴클레오티드 2 세트 F [1: W] R [1: Z] S [1 : 2]
3. 1 단계
a. For I = 1 to W
b. Ligate F [I], F [I+1], R [I]; place in T [I]
c. Ligate F [I+2], R [I+1], R [I+2] T [I+1]
d. I = I + 3
e. Go to b
4. 2 단계
a. 단일 반응만 남을 때까지 다음을 실시
i. For I = 1 to W/3
ii. Ligate T [I], T [I+1]
iii. I = I + 2
iv. Go to ii
코돈표(이 콜리 부류 II 선호된 이용)
PHE TTC
SER TCT
TYR TAC
CYS TGG
TER TGA
TRP TGG
ILE ATC
MET ATG
THR ACC
LEU CTG
PRO CCG
HIS CAC
GLN CAG
ARG CGT
VAL GTT
ALA GCG
ASN AAC
LYS AAA
ASP GAC
GLU GAA
GLY GGT
표적 폴리뉴클레오티드 어셈블리에 유용한 본 발명의 알고리즘은 하기의 Perl 스크립트로서 더 기재될 수 있다. ALGORITHM 1은 단백질 서열을 이 콜리 코돈을 이용하여 폴리뉴클레오티드 서열로 전환시키는 방법을 제공한다:
#$sequence는 단일 문자 아미노산 코드에서 단백질 서열이다.
#$seqlen은 단백질 서열의 길이이다.
#$amino acid는 서열내의 개별적인 아미노산이다.
#$codon는 Gene 서열에서 개별적인 DNA 트리플렛 코돈이다.
#$DNA 서열은 DNA 염기에서 유전자 서열이다.
#$baselen는 염기중의 DNA 서열의 길이이다.
$seqlen = length ($sequence) ;
$baselen = $seqlen * 3;
for ($n = 0; $n < = $seqlen; $n++)
{
$aminoacid = substr($sequence,$n,1);
다음 리스트는 이 콜리에 대한 Perl에서 부류 II 코돈 선호를 제공한다.
if ($aminoacid eq"m") {$codon ="ATG" ;}
elsif ($aminoacid eq "f") {$codon = "TTC";}
elsif ($aminoacid eq "1") {$codon = "CTG";}
elsif ($aminoacid eq "s") {$codon = "TCT";}
elsif ($aminoacid eq "y") {$codon = "TAG";}
elsif ($aminoacid eq "c") {$codon = "TGC";}
elsif ($aminoacid eq "w") {$codon = "TGG";}
elsif ($aminoacid eq "i") {$codon = "ATC";}
elsif ($aminoacid eq "t") {$codon = "ACC";}
elsif ($aminoacid eq "p") {$codon = "CCG";}
elsif ($aminoacid eq "q") {$codon = "CAG";}
elsif ($aminoacid eq "r") {$codon = "CGT";}
elsif ($aminoacid eq "v") {$codon = "GTT" ;}
elsif ($aminoacid eq "a") {$codon = "GCG";}
elsif ($aminoacid eq "n") {$codon = "AAC" ;}
elsif ($aminoacid eq "k") {$codon = "AAA";}
elsif ($aminoacid eq "d") {$codon = "GAC";}
elsif ($aminoacid eq "e") {$codon = "GAA";}
elsif ($aminoacid eq "g") {$codon = "GGT";}
elsif ($aminoacid eq "h") {$codon = "CAC";}
else {$codon =""} ;
$DNAsequence = $DNAsequence + $codon ;
ALGORITHM 2는 폴리뉴클레오티드 서열을 표적 폴리펩티드를 암호화하는 완전 표적 폴리뉴클레오티드로 재어셈블될 수 있는 성분 순방향 및 역방향 올리고뉴클레오티드로 분석하는 방법을 제공한다:
#$oligoname는 리스트 및 각 성분 #oligonucleotide의 동정자 이름이다.
#$OL은 각 성분 올리고뉴클레오티드의 길이이다.
#$Overlap 은 각 순방향 및 각 # 역방향 올리고뉴클레오티드 사이의 염기에서 중첩길이이다.
#$sequence는 염기의 DNA 서열이다.
#$seqlen는 염기의 DNA 서열의 길이이다.
#$bas 는 서열의 개별 염기이다.
#$forseq 는 순방향 올리고뉴클레오티드 서열이다.
#$revseq 는 역방향 올리고뉴클레오티드 서열이다.
#$revcomp 는 유전자의 뒤 상보된 서열이다.
#$oligonameF- [] 는 분석된 순방향 올리고의 리스트이다.
#$oligonameR-[] 는 분석된 역방향 올리고의 리스트이다.
$0verlap = <STDIN>;
$seqlen = length ($sequence) ;
#로어케이스이면 어퍼케이스로 순방향 서열을 전환
$forseq =" "
for ($j = 0 ; $j < = seqlen-1; $j ++)
{ $bas = substr ($sequence, $j, l) ;
if ($bas eq"a") {$cfor ="A";}
elsif ($bas eq"t") {$cfor ="T" ;}
elsif ($bas eq "c") {$cfor = "C";}
elsif ($bas eq"g") {$cfor ="G";}
elsif ($bas eq"A") {$cfor = "A";}
elsif ($bas eq"T") {$cfor ="T";}
elsif ($bas eq "C") {$cfor = "C";}
elsif ($bas eq"G") {$cfor ="G" ;}
else {$cfor = "X"} ;
$forseq = $forseq. $cfor ;
print OUT "$j ＼n";
}
상기 생성된 서열의 역방향 보완물은 다음으로 동정된다:
$revcomp = " ";
for ($i = $seqlen-1 ; $i > = 0 ; $i--)
{ $base = substr ($sequence, $i, l) ;
if ($base eq"a") {$comp ="T" ;}
elsif ($base eq"t") {$comp ="A" ;}
elsif ($base eq "g") {$comp = "c";}
elsif ($base eq"c") {$comp ="G";}
elsif ($base eq"A") {$comp ="T";}
elsif ($base eq"T") {$comp ="A";}
elsif ($base eq"G") {$comp = "c";}
elsif ($base eq"C") {$comp = "G";}
else {$comp ="X"} ;
$revcomp = $revcomp. $comp;
}
#이제 파싱을 하라
#순방향 올리고 리스트를 생성하라
print OUT"Forward oligos＼n" ;
print"Forward oligos＼n" ;
$r = 1 ;
for ($i = 0; $i < = $seqlen-1 ; $i+=$OL)
{ $oligo = substr ($sequence, $i, $OL) ;
print OUT"$oligname F-$r $oligo＼n" ;
print"$oligname F-$r $oligo＼n" ;
$r = $r + 1 ;
#순방향 역방향 리스트를 생성하라
$r = 1;
for ($i = $seqlen- $Overlap - $OL ; $i > = 0; $i-=$OL)
{
print OUT"＼n" ;
print"＼n" ;
$oligo = substr ($revcomp, $i, $OL) ;
print OUT"$oligname R-$r $oligo" ;
print"$oligname R-$r $oligo" ;
$r = $r + 1;
}
#역방향 보완물의 개시 #로부터 1/2 로 구성된 마지막 역방향 올리고를 교정하고 출력하라
$oligo = substr ($revcomp, l, $Overlap) ;
print OUT "$oligo＼n" ;
print"$oligo＼n" ;
본 발명은 또한 프로세서, 입력 장치 및 출력 장치를 포함하는 프로그램된 컴퓨터를 이용하여, 입력 장치를 통해 표적 폴리펩티드를 암호화하는 표적 폴리뉴클레오티드 서열의 적어도 일부를 포함하는 데이터를 프로그램된 컴퓨터에 입력함으로써 모델 서열로부터 유래된 표적 폴리펩티드를 암호화하는 표적 폴리뉴클레오티드를 합성하는 컴퓨터 보조 방법을 제공한다. 후속적으로, 표적 폴리뉴클레오티드 서열에 존재하는 1 이상의 개시 폴리뉴클레오티드의 서열이 결정되고 표적 폴리뉴클레오티드 서열을 합성하는 모델이 유도된다. 모델은 생물학적 시스템에서 표적 폴리펩티드의 발현에 필요한 전체 서열 파라미터를 이용하여 표적 폴리뉴클레오티드 서열에서의 개시 서열의 위치를 근거로 한다. 정보는 표적 폴리뉴클레오티드로 합성 및 어셈블리하기 위한 수단을 제공하는 출력 장치로 출력된다.
폴리뉴클레오티드 합성에 적합한 임의의 장치가 본 발명에 사용될 수 있다는 것을 이해한다. 다양한 비제한적인 장치, 성분, 어셈블리 및 방법의 예들이 후술된다. 예를 들어, 한 태양에서, 최고 16개 밸브를 가지는 나노분배 헤드는 어셈블리 용기에서 합성 화학물질의 증착에 사용될 수 있다(도4). 화학물질은 시약 용기로부터 시린지 펌프를 이용하여 조절될 수 있다. 잉크젯 분배 시스템의 속도 및 성능 때문에, 합성은 매우 작고 매우 빠르게 이루어질 수 있다. 반응 챔버 하부에 미세유체역학에 의해 유체를 움직일 미세채널에 연결된 어셈블리 용기의 세트가 존재한 다. 채널의 형성은 예컨대, 로봇 장치를 이용하여 시스템적으로 풀 쌍들(pool pairs) 및 올리고뉴클레오티드의 트리플렉스일 것이다. 그러나, 풀링(pooling)은 유체역학을 이용하고 이동부 없이 이루어질 수 있다.
도5에 도시된 바와 같이, 풀링 및 어닐링에 의한 올리고뉴클레오티드 합성, 올리고뉴클레오티드 어셈블리 및 리게이션은 미세유체역학 혼합을 이용하여 행해질 수 있고, 어닐링, 리게이션 및 올리고뉴클레오티드 회합을 위한 기질로서 제공되는 동일한 세트의 임계적 트리플렉스 중간체를 생성한다. DNA 리가제 및 기타 성분은 장치 미세챔버를 통해 이동하는 완충액 유체에 위치할 수 있다. 따라서, 합성 및 어셈블리는 동일한 장치에서 매우 조절된 방식으로 수행될 수 있다.
도6에서 도시되는 바와 같이, 풀링 매니폴드는 비다공성 플라스틱으로부터 생성되며 어레이에서 합성되는 올리고뉴클레오티드의 순차적인 풀링을 조절하기 위해 디자인된다. 컴퓨터에서 디자인된 유전자 서열로부터 파싱된 올리고뉴클레오티드는 (+) 및 (-) 가닥이 어레이의 또 다른 웰에 놓여지는 경우에 합성을 위해 프로그램될 수 있다. 이러한 포맷에서 합성 후, 유전자의 12 열 서열은 스시템적으로 3개 웰을 임계적 트리플렉스 구조를 형성하는 반응 용기로 풀링하는 풀링 매니폴드로 니시된다. 어닐링 및 리게이션을 위한 온도 사이클링 후, 4개 세트의 트리플렉스는 2 세트의 6개의 올리고뉴클레오티드 생성물로 풀링된 후 1 세트의 12 올리고뉴클레오티드 생성물로 풀링된다. 각열의 합성 어레이는 유사한 매니폴드와 연관되어 각각 12개 올리고뉴클레오티드를 나타내느 어셈블된 올리고뉴클레오티드 8개 세트의 어셈블리의 제1 단계를 형성한다. 도7에 도시하는 바와 같이, 제2 매니폴드 풀링 단계는 7열 어셈블리를 단일 완전 어셈블리로 풀링하는 단일 매니폴드에 의해 조절된다. 2개 매니폴드 어셈블리(제1은 8개 제2는 단일)를 통한 올리고뉴클레오티드 성분의 통과는어레이로부터 모두 96개의 올리고뉴클레오티드의 완전 어셈블리를 생성한다. Genewriter(상표)의 어셈블리 모듈(도8)은 합성 용기 하부에 있는 단일 플라스틱 블록에서 미세제작을 이용하여 생성된 7개 풀링 매니폴드의 완전한 세트를 포함할 수 있다. 풀링 매니폴드의 다양한 형성은 파싱된 성분 올리고뉴클레오티드의 96,384 또는 1536 웰 어레이의 어셈블리를 가능하게 할 것이다.
처음 구성은 중첩 50mer의 48쌍으로 구성된 사전에 고안된 어레이에서 합성된 96 올리고뉴클레오티드의 어셈블리에 대해 디자인된다. DNA 리가제 및 다른 적절한 완충액 및 화학 성분의 존재하에 장치상에서 적절하게 온도 조절하여 어셈블리 장치를 통과시키면 이들을 단일 2400 염기 이중 가닥의 유전자 어셈블리로 어셈블리할 것이다(도9).
염기 풀링 장치 디자인은 표면에 에칭한 마이크로그루브 또는 미세유체역학 채널을 구비하고 채널의 접합부 하부에 Peltier 서킷과 같은 온도 조절 요소를 구비한 것으로, Plexiglas(상표) 또는 기타 형태의 공중합체로 제조될 수 있다. 이는 결과적으로 1) 2개 스트림을 혼합하고, 2) 조절된 온도를 유지하거나 접합부 부위를 사이클링하고, 3) 리게이션된 혼합물을 출구 채널로부터 다음 세트의 풀링 및 리게이션 챔버로 배제시키는 2개 채널의 접합부에서의 미세반응 용기가 된다.
도11에서 도시한 바와 같이, 어셈블리 플랫폼 디자인은 미세 분배의 16개 채널로 집중된 96 웰 구성에서 8개의 합성 미세웰 플레이트를 구성할 수 있다. 각각 96 웰 어레이로부터 성분 올리고뉴클레오티드를 어셈블리하기 위하여 도9에 도시한 것을 근거로, 각 플레이트 아래에 1) 합성 성분을 제거하기 위한 배출 매니폴드; 및 2) 어셈블리 매니폴드가 있다. 도12는 1536-웰 미세플레이트를 이용하며 플레이트 당 1536 성분 올리고뉴클레오티드의 합성을 가능하게 하는 고성능 어셈블리 포맷을 도시한다. 각각의 1536 웰 어레이로부터 1536 성분 올리고뉴클레오티드를 어셈블리하기 위하여 각 플레이트 아래에 1) 합성 성분을 제거하기 위한 배출 매니폴드 및 2) 어셈블리 매니폴드 어셈블리가 있다. 풀링 및 어셈블리 방법은 96 웰 플레이트에 사용된 개념을 근거로 할 수 있다.
또 다른 어셈블리 포맷은 CPG 유리비드상에서 가용성 합성이 아닌 표면 결합된 올리고뉴클레오티드 합성을 이용하는 것을 포함한다(도13). 이 구성에서, 올리고뉴클레오티드는 고체 지지체에 부착하도록 하는 탄화수소 링커를 이용하여 합성된다. 성분 서열의 파싱 및 합성 후, 합성된 올리고뉴클레오티드는 고체 지지체에 공유적으로 부착되므로 상부 용액에 첨가된 2개 리게이션 기질에 안정화제를 부착시킨다. 리게이션은 용액중의 DNA 리가제에 의해 매개되면서 일어나고 Tm 보다 높은 온도 상승은 열적 용융에 의해 링크된 올리고뉴클레오티드를 제거한다. 도14에서 도시된 바와 같이, 파싱된 성분 올리고뉴클레오티드 세트의 고체 지지체상의 시스템적 어셈블리는 부착된 안정화제 올리고뉴클레오티드 세트를 이용해 어레이에 배열될 수 있다. 리게이션 기질 올리고뉴클레오티드 세트를 용액에 넣은 후 후속적인 어닐링, 리게이션 및 용융에 의해 시스템적인 어셈블리를 고체상에서 수행하는데, 이는, 막 표면을 가로지르는 성장 DNA 분자를 이동시킨다.
도15는 성분 올리고뉴클레오티드를 미세전자 칩상에서 한 세트의 금속 전극에 결합시킴으로써 올리고뉴클레오티드 어셈블리의 추가 대안적 수단을 도시하며, 이때 각 전극은 전류 및 전압에 대해 독립적으로 조절될 수 있다. 상기 어레이는 마이너스 가닥 올리고뉴클레오티드 세트를 포함한다. 전극상에 양 전하를 놓으면 전기영동에 의해 성분 리가제 기질 올리고뉴클레오티드를 어닐링이 일어나는 표면상으로 이동시킬 것이다. DNA 리가제의 조재는 성분의 공유적 회합 또는 리게이션을 매개한다. 이후 전극을 차단하거나 음 전하를 적용해서 DNA 분자를 전극으로부터 배제시킨다. 파싱된 세트로부터 유래된 다음 안정화제 올리고뉴클레오티드를 포함하는 다음 어레이 요소를 양전하로 작동시켜 세트의 다음 올리고뉴클레오티드로 제2의 어닐링, 회합 및 리게이션을 수행시킨다. 전압 조절, 어닐링, 리게이션 및 변성의 시스템적이고 반복적인 적용은 완전한 DNA 분자로 성분을 어셈블리할 뿐 아니라 표면을 가로지르는 성장하는 쇄를 움직이게 할 것이다.
본 발명은 표적 폴리뉴클레오티드의 자동화된 합성 방법을 추가로 제공한다. 예를 들어, 원하는 서열은 상기 서열을 지시하고자 하는 사용자에게 유용한 임의의 접근 수단에 의해 지시될 수 있다. 본원의 "사용자"는 원하는 폴리뉴클레오티드 서열을 서버에게 접근시킬 수 있는 임의의 실체이다. 서열은 유저에게 유용한 임의의 접근 수단에 의해 전달될 수 있으며 서버에 의해 수용될 수 있다. 사용자가 합성 동안 폴리뉴클레오티드의 합성에 관한 정보를 얻을 수 있는 독특한 자격이 사용자에게 제공된다. 한번 얻으면, 전달된 표적 폴리뉴클레오티드 서열은 본 발명에 기재된 임의의 방법에 의해 합성될 수 있다.
본 발명은 사용자에게 모델 폴리뉴클레오티드 서열과 접근하기 위한 메카니즘을 제공함으로써 그리고 임의로 모델 서열에 원하는 1 이상의 변경과 접근하기 위한 기회를 제공함으로써 폴리뉴클레오티드의 자동화된 합성 방법을 더 제공한다. 본 발명은 사용자가 모델 서열 및 모델 서열을 변경시키는 서열에 대한 원하는 변경을 제공하는 것을 계획한다. 표적 폴리뉴클레오티드 또는 암호화된 표적 폴리펩티드의 발현, 기능 또는 활성을 변경시키는 임의의 변경은 변경된 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드가 본 발명의 방법에 따라 합성되거나 또는 발현되도록 사용자에 의해 접근될 수 있다. 예를 들어, 진핵생물계에서 통상 발현되는 폴리펩티드를 암호화하는 모델 폴리뉴클레오티드는 생성된 표적 폴리뉴클레오티드의 코돈이 원핵생물계에서의 폴리펩티드의 발현에 도움이 되도록 변경될 수 있다. 추가로, 사용자는 모델 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화된 폴리펩티드의 원하는 변경된 활성을 지시할 수 있다. 한번 제공되면, 본 발명의 알고리즘 및 방법은 원하는 변경된 활성을 가지도록 생각되는 표적 폴리펩티드를 암호화하는 표적 폴리뉴클레오티드를 합성하기위해 사용될 수 있다. 본 발명의 방법은 표적 폴리펩티드를 발현하기 위해 그리고 원하는 활성을 스크린하기 위해 더 사용될 수 있다. 본 발명의 방법은 폴리뉴클레오티드 발현 및/또는 활성의 임의의 파라미터를 원하는대로 변경시키는 합성적 진화 수단을 제공한다.
전달된 모델 서열 및 원하는 변경이 사용자에 의해 제공되면, 모델 폴리뉴클레오티드 서열의 적어도 일부를 포함하는 데이터가 프로그램된 컴퓨터로 입력 장치를 통해 입력된다. 일단 입력되면, 본 발명의 알고리즘은 원하는 변경을 포함하는 모델 폴리뉴클레오티드의 서열을 결정하고 변경을 포함하는 표적 폴리뉴클레오티드를 생성하는 데에 사용된다. 이어서, 본 발명의 프로세서 및 알고리즘은 폴리뉴클레오티드 서열에 존재하는 1 이상의 개시 폴리뉴클레오티드 서열을 동정하기 위해 사용된다. 표적 폴리뉴클레오티드(즉, 변경된 모델 폴리뉴클레오티드)가 동정되고 합성된다.
다양한 도면내의 참고 부호와 같은 것은 원소와 같은 것을 지시한다.
도1은 F(즉, "forward" 또는 "플러스 가닥") 올리고뉴클레오티드 합성을 위한, R(즉, "reverse" 또는 "마이너스 가닥") 올리고뉴클레오티드 합성을 위한 96 웰 플레이트, 및 F 및 T 올리고뉴클레오티드의 어닐링을 위한 T(즉, "온도") 플레이트를 도시한다.
도2는 F 올리고뉴클레오티드 및 R 올리고뉴클레오티드가 접촉성 폴리뉴클레오티드를 형성하기 위하여 어닐링되는 올리고뉴클레오티드 풀링(pooling) 계획을 도시한다.
도3은 유전자, 게놈, 유전자 또는 폴리펩티드 서열의 세트를 한정하기 위한 표적 폴리뉴클레오티드 서열의 어셈블리의 개략도이다. 이 서열은 표적 폴리펩티드를 암호화하는 표적 폴리뉴클레오티드 서열의 + 및 - 가닥을 포괄하는 분해된 올리고뉴클레오티드 단편의 세트를 제조하기 위해 컴퓨터에 의해 설계되고 사용된다.
도4는 폴리뉴클레오티드 합성 모듈의 개략도이다. 다수의 밸브를 가진 나노분배 헤드는 어셈블리 용기에서 합성 화학물질을 침착할 것이다. 시약 저장소로부 터의 화학적 분배는 시린지 펌프를 이용하여 조절될 수 있다. 반응 챔버 하부에 미세유체역학에 의해 유체를 움직일 수 있는 미세채널로 연결된 어셈블리 용기 세트가 있다.
도5는 올리고뉴클레오티드 합성, 풀링 및 어닐링에 의한 올리고뉴클레오티드 어셈블리를 도시하고 있으며, 리게이션은 미세유체역학 혼합을 이용하여 수행될 수 있다.
도6은 어레이에서 합성된 올리고뉴클레오티드의 순차적 풀링을 도시한다.
도7은 어레이에서 유래된 모든 올리고뉴클레오티드의 완전한 어셈블리리를 생성하는 매니폴드(manifold) 어셈블리를 통한 올리고뉴클레오티드 성분의 풀링 단계를 도시한다.
도8은 단일 유닛에서 미세구조제조법(microfabrication)을 이용하여 제조된 풀링 매니폴드의 완전한 세트를 포함하는 어셈블리 모듈의 예를 도시한다. 풀링 매니폴드의 다양한 구조는 분석된 성분 올리고뉴클레오티드의 웰 어레이 숫자가 증가된 어셈블리를 가능하게 할 것이다.
도9는 예비-한정된 어레이에서 합성된 올리고뉴클레오티드의 어셈블리의 구조를 도시한다. DAN 리가제 및기 타 적절한 완충액 및 화학적 성분들의 존재하에 어셈블리 장치 통과는 이중 가닥 폴리뉴클레오티드를 어셈블리하는 것을 촉진할 것이다.
도10은 풀링 장치 디자인의 실시예를 도시한다. 미세홈(microgroove) 또는 미세유체역학 채널은 풀링 장치 표면으로 에칭된다. 상기 장치는 1) 2개 스트림의 혼합, 2) 접합부의 조절된 온도 유지 또는 사이클링, 및 3) 출구 채널로부터 다음 풀링 및 리게이션 챔버 세트로의 리게이션된 혼합물의 구축을 위한 2개 채널의 접합부에 위치한 미세반응 용기를 제공한다.
도11은 미세분배를 위한 다수의 채널과 관련된 미세웰 플레이트를 포함하는 폴리뉴클레오티드 합성 플랫폼의 디자인을 도시한다.
도12는 플레이트 당 과량의 1536 성분을 합성할 수 있는 고밀도 미세웰 미세플레이트를 이용하는 고성능 폴리뉴클레오티드 합성 플랫폼의 실시예를 도시한다.
도13은 가용성 합성 보다는 표면-결합된 올리고뉴클레오티드 합성을 이용하는 폴리뉴클레오티드 어셈블리 포맷을 도시한다. 이 구조에서, 올리고뉴클레오티드는 고체 지지체에 부착하게 하는 링커로 합성된다.
도14는 고체 지지체상의 시스템적인 폴리뉴클레오티드 어셈블리이 다이어그램을 도시한다. 분석된 성분 올리고뉴클레오티드의 세트는 부착된 안정화제 올리고뉴클레오티드로 어레이에 배열된다. 리게이션 기질 올리고뉴클레오티드의 세트는 용액중에 놓여지고 시스템적인 어셈블리는 순서대로 어닐링, 결차 및 용융에 의해 고상에서 수행된다.
도15는 미세전기적 칩상의 금속 전극 세트에 결합된 성분 올리고뉴클레오티드를 이요한 폴리뉴클레오티드 어셈블리를 도시한다. 각 전각은 전류 및 전압과 관련하여 독립적으로 조절될 수 있다.
도16은 통상 본 발명의 프라이머 연장 어셈블리 방법을 도시한다.
도17은 본 발명의 시스템 다이어그램을 제공한다.
도18은 본 발명 장치의 사시도를 도시한다.
핵산 합성 디자인 프로토콜
표적 폴리펩티드를 암호화하는 합성 핵산 서열을 어셈블리하기 위한 목적에서, 모델 폴리펩티드 서열 또는 핵산 서열을 예를 들어, MacVector 또는 DNA Star와 같은 적절한 DNA 분석 패키지를 이용하여 수득하고 분석한다. 표적 단백질이 박테리아계에서 발현된다면, 예컨대, 모델 서열은 이 콜리 선호된 코돈(즉, 형태 I, 형태 II 또는 형태 III 코돈 선호)를 이용하여 폴리펩티드를 암호화하는 서열로 전환될 수 있다. 본 발명은 전환 프로그램 코돈 I, 코돈 II 또는 코돈 III을 제공한다. 본 발명의 핵산 서열은 임의의 원핵 또는 진핵 생물의 임의의 코돈 선호(preference)를 수용하도록 디자인될 수 있다.
상기 코돈 선호외에, 특정 프로모터, 인헨서, 복제 또는 약물 내성 서열이 본 발명의 합성 핵산 서열에 포함될 수 있다. 구성의 길이는 약 25 내지 100 bp 합성을 기준으로 다수의 염기를 부여하기 위하여 패딩(padding)에 의하여 조절할 수 있다. 약 25 내지 100 bp 길이의 서열 합성은 어레이 합성기 시스템을 이용하여 제조되고 어셈블링될 수 있고 추가의 정제 없이 사용될 수 있다. 예를 들어, 100-mer를 포함하는 2개의 96 웰 플레이트가 표적 서열의 9600 bp 구성을 부여할 수 있다.
표적 서열의 어셈블리에 필요한 올리고뉴클레오티드의 디자인에 후속하여, 올리고뉴클레오티드는 ParseOligo(상표), 핵산 서열 어셈블리를 최적화하는 적절한 컴퓨터 프로그램을 이용하여 파싱된다.서열 어셈블리 중의 추가 단계는 헤어핀, 반 복부 또는 기타 불리한 서열을 발생시킬 수 있는 서열을 동정하고 제거하는 것을 포함한다. 파싱된 올리고뉴클레오티드 리스트는 Synthesizer 드라이버 소프트웨어로 전달될 수 있다. 개별적인 올리고뉴클레오티드는 웰로 페이스트되서 올리고뉴클레오티드 합성이 완결된다.
2 단계 PCR 반응을 이용한 파싱된 올리고뉴클레오티드 어셈블리
약 25 염기쌍(bp)의 중첩부를 가진 파싱된 중첩 올리고뉴클레오티드, 각각 50 염기의 어레이된 세트를 수득한다. 올리고뉴클레오티드 농도는 250 nM(250 μM/ml). 50개 염기 올리고의 Tms는 75 내지 85 ℃, 6 내지 10 od260, 11 내지 15 나노몰, 150 내지 300 ㎍이다. 250 mM/ml로 만들기 위하여 H2O 50 내지 100 ㎕에서 재현탁한다. 최종농도 250 μM(250 nM/ml)이 되도록 동량의 각 올리고뉴클레오티드를 배합한다. 각각을 1㎕ 첨가하여 192 ㎕를 만든다. 8 ㎕ dH2O를 첨가하여 200 ㎕로 한다. 최종 농도는 250 μM 혼합된 올리고이다. 10 ㎕의 혼합된 올리고를 취하고 1 ml의 물을 첨가함으로써 250배로 희석한다(1/100; 2.5 μM) 이후 이것을 1 ㎕ 취하여 24 ㎕ 1X PCR 혼합물에 첨가한다. PCR 반응은 다음을 포함한다:
10 mM TRIS-HCl, pH 9.0
2.2 mM MgCl2
50 mM KCl
0.2 mM 각 dNTP
0.1 % 트리톤 X-100
하나의 U TapI 폴리머라제를 반응에 첨가한다. 본 반응은 다음 조건하에서 열순환(thermocycle)시킨다.
a.어셈블리
i. 55 사이클
1. 94도 30초
2. 52도 30초
3. 72도 30초
어셈블리 증폭 후, 이 어셈블리 혼합물 2.5 ㎕를 취하고 PCR 혼합물 100 ㎕에 첨가한다. (40 X 희석). 250 μM(250 nm/ml - .250 nmol/㎕)에서 F1 1 ㎕(순방향 프라이머) 및 R96 1 ㎕(역방향 프라이머)를 취함으로써 외부 프라이머를 제조하고 100 ㎕ PCR 반응에 첨가한다. 이는 2.5 uM 각 올리고의 최종 농도를 부여한다. 1 U TaqI 폴리머라제를 첨가하고 다음 조건하에서 열순환시킨다.
35 사이클(또는 오리지널 프로토콜 23 사이클)
94도 30초
50도 30초
72도 60초
페놀/클로로폼으로 추출한다. 에탄올로 침전시킨다. dH2O 10 ㎕에서 재현탁하고 아가로스겔상에서 분석한다.
Taq1 리게이션을 이용하는 파싱된 올리고뉴클레오티드 어셈블리
약 12 내지 75 염기쌍(bp)의 중첩부를 가진 각각 약 25 내지 150 염기 길이의 파싱된 중첩 올리고뉴클레오티드의 어레이된 세트를 얻는다. 올리고뉴클레오티드 농도는 250 nM(250 μM/ml) 부터이다. 예를 들어, 50 염기 올리고는 75 내지 85 ℃, 6 내지 10 od260, 11 내지 15 nm, 150 내지 300 ㎍이다. 250 nM/ml로 제조하기 위하여 50 내지 100 ml의 H2O에서 재현탁한다.
로봇 워크스테이션을 이용하여, 동일한 양의 순방향 및 역방향 올리고를 쌍으로 배합한다. 10 ㎕의 순방향 및 10㎕의 역방향 올리고를 취하여 새로운 96 웰 v-바닥 플레이트에서 혼합한다. 이는 표1의 풀링 반응 단계 1에 따라 250 μM에서 듀플렉스 올리고뉴클레오티드의 세트가 있는 한 어레이를 제공한다. 2 ㎕ 각 올리고머쌍을 취하고 각 웰에서 100 ㎕ 리게이션 혼합물을 포함하는 새로운 플레이트에 첨가한다. 이는 유효농도 2.5 μM 또는 2.5 nM/ml를 부여한다. 각 웰의 20 ㎕를 새로운 미세웰 플레이트로 전달하고 1 ㎕의 T4 폴리뉴클레오티드 키나제 및 1 ㎕ 1mM ATP를 각 웰에 첨가한다. 각 반응은 50pmol의 올리고뉴클레오티드 및 1 nmol의 ATP를 보유할 것이다. 37 ℃에서 30분 동안 항온처리한다.
표1의 단계 2-7에 따라 어셈블리를 개시한다. 각각의 연속적인 웰을 다음 것으로 혼합하여 풀링 단계 2를 수행한다. 각각의 혼합된 웰에 Taq1 리가제 1 ㎕를 첨가한다. 94 ℃에서 30초, 52 ℃에서 30초 이후 72 ℃에서 10분 동안 한 번 순환시킨다.
풀링 기전 3단계(표1)을 수행하고 상기 온도 개요에 따라 순환시킨다. 풀링 기전 6단계를 수행하고 각각의 혼합물 10 ㎕를 새로운 미세웰로 취한다. 남은 3개의 웰을 풀링시킴으로써 7 단계 풀링 기전을 수행한다. 반응 부피는 다음과 같을 것이다:
개시 플레이트는 웰 당 20 ㎕를 가진다.
2 단계 20 ㎕ + 20 ㎕ = 40 ㎕
3 단계 80 ㎕
4 단계 160 ㎕
5 단계 230 ㎕
6 단계 10 ㎕ + 10 ㎕ = 20 ㎕
7 단계 20 + 20 + 20 = 60 ㎕ 최종 반응 부피
이후 최종 PCR 증폭은 2 ㎕의 최종 리게이션 혼합물을 취하고 10 mM TRIS-HCl, pH 9.0, 2.2 mM MgCl2, 50 mM KCl, 0.2 mM 각 dNTP 및 0.1 % 트리톤 X-100을 포함하는 PCR 혼합물 20 ㎕에 첨가함을써 수행되었다.
250 μM(250 nm/ml - .250 nmol/㎕)에서 1 ㎕의 F1(순방향 프라이머) 및 1 ㎕의 R96(역방향 프라이머)를 취하고 최종 농도 2.5 μM 각각의 올리고를 부여하는 100 ㎕ PCR 반응에 첨가함으로써 외부 프라이머를 제조한다. 1 U Taq1 폴리머라제를 첨가하고 다음 조건하에서 35 회 순환시킨다: 94도에서 30초; 50도에서 30초; 및 72도 60초. 페놀/클로로포름으로 혼합물을 추출한다. 에탄올로 침전시킨다. dH2O 10 ㎕에서 재현탁하고 아가로스 겔상에서 분석한다.
리게이션 어셈블리의 풀링 기전. 리게이션 방법 - 웰 풀링 기전
단계 부터 까지 단계 부터 까지
1 All F All R 3 A2 A4
2 A6 A8
A1 A2 A10 A12
A3 A4 B2 B4
A5 A6 B6 B8
A7 A8 B10 B12
A9 A10 C2 C4
A11 A12 C6 C8
B1 B2 C10 C12
B3 B4 D2 D4
B5 B6 D6 D8
B7 B8 D10 D12
B9 B10 E2 E4
B11 B12 E6 E8
C1 C2 E10 E12
C3 C4 F2 F4
C5 C6 F6 F8
C7 C8 F10 F12
C9 C10 G2 G4
C11 C12 G6 G8
D1 D2 G10 G12
D3 D4 H2 H4
D5 D6 H6 H8
D7 D8 H10 H12
D9 D10
D11 D12 4 A4 A8
E1 E2 A12 B4
E3 E4 B8 B12
E5 E6 C4 C8
E7 E8 C12 D4
E9 E10 D8 D12
E11 E12 E4 E8
F1 F2 E12 F4
F3 F4 F8 F12
F5 F6 G4 G8
F7 F8 G12 H4
F9 F10 H8 H12
F11 F12
G1 G2 5 A8 B4
G3 G4 B12 C8
G5 G6 D4 D12
G7 G8 E8 F4
G9 G10 F12 G8
G11 G12 H4 H12
H1 H2
H3 H4 6 B4 C8
H5 H6 D12 F4
H7 H8 G8 H12
H9 H10
H11 H12 7 C8 F4
Taq I 합성 및 어셈블리를 이용한 파싱된 올리고뉴클레오티드의 어셈블리
약 12 내지 75 염기쌍(bp)의 중첩부를 가진 각각 약 25 내지 150 염기 길이의 파싱된 중첩 올리고뉴클레오티드의 어레이된 세트를 얻는다. 올리고뉴클레오티드 농도는 250 nM(250 μM/ml) 부터이다. 50 염기 올리고는 75 내지 85 ℃의 Tms, 6 내지 10 od260, 11 내지 15 nm, 150 내지 300 ㎍이다. 250 nM/ml로 제조하기 위하여 50 내지 100 ml의 H2O에서 재현탁한다.
본 발명은 핵산 어셈블리를 얻기 위하여 로봇 워크스테이션을 이용하는 것을 계획한다. 본 실시예에서, 2.5 mM의 PCR 혼합에서 순방향 및 역방향 올리고뉴클레오티드를 함유하는 2개의 워킹 플레이트를 제조하고 각 올리고이 1 ㎕를 어레이이 순방향 올리고의 하나의 플레이트 및 역방향 올리고의 하나의 플레이트를 제공하는 새로움 미세웰에서의 PCR 혼합물 100 ㎕에 첨가한다. 이후 순환 어셈블리는 표1에 설명된 풀링 기전에 따라 개시된다. 본 실시예에서, 어셈블리 96 사이클은 이 기전에 따라 수행될 수 있다.
2 ㎕의 웰 F-E1을 새로운 웰로 제거한다.; 2 ㎕의 R-E1을 새로운 웰로 제거한다; 18 ㎕의 1X PCR 혼합을 첨가한다; 1 U의 Taq1 폴리머라제를 첨가한다;
한번 순환시킨다:
94도 30초
52도 30초
72도 30초
이어서, 2 ㎕의 웰 F-E2를 반응 용기에 제거한다; 2 ㎕의 웰 R-D12를 반응 용기에 제거한다. 상기 온동 따라 한번 순환시킨다. 약 96회 사이클 동안 표1에 설명된 개략에 따라 풀링 및 순환을 반복한다.
이후 PCR 증폭은 2㎕의치종 반응 호합물을 취하여 이것을 다음을 포함하는 PCR 혼합물 20 ㎕에 첨가함으로써 수행된다"
10 mM TRIS-HCl, pH 9.0
2.2 mM MgCl2
50 mM KCl
0.2 mM 각 dNTP
0.1 % 트리톤 X-100
250 μM(250 nm/ml - .250 nmol/㎕)에서 1 ㎕의 F1 및 1 ㎕의 R96를 취하고 100 ㎕의 PCR반응에 첨가함으로써 외부 프라이머를 제조한다. 이는 최종 농도 2.5 μM 각 올리고를 부여한다. 이어서, 1 U Taq1 폴리머라제를 첨가하고 다음 조건하에서 약 23회 내지 35회 순환시킨다:
94도에서 30초
50도에서 30초
72도에서 60초
이어서, 반응을 페놀/클로로포름으로 추출하고, 에탄올로 침전시킨 후, 아가로스 겔상에서 분석하기 위하여 dH2O 10 ㎕에서 재현탁한다.
동일량의 10 ㎕의 순방향 및 10㎕의 역방향 올리고를 취하여 순방향 및 역방 향 올리고 쌍으로 첨가하고 새로운 96 웰 v-바닥 플레이트에서 혼합한다. 이는 표1의 풀링 반응 1단계에 따라 250 μM에서 듀플렉스 올리고뉴클레오티드의 세트가 있는 한 어레이를 제공한다. 2 ㎕ 각 올리고머쌍을 취하고 각 웰에서 100 ㎕ 리게이션 혼합물을 포함하는 플레이트에 첨가함으로써 어셈블리 플레이트를 제조한다. 이는 유효농도 2.5 μM 또는 2.5 nM/ml를 부여한다. 각 웰의 약 20 ㎕를 새로운 미세웰 플레이트로 전달하고 1 ㎕의 T4 폴리뉴클레오티드 키나제 및 1 ㎕ 1mM ATP를 각 웰에 첨가한다. 각 반응은 50pmol의 올리고뉴클레오티드 및 1 nmol의 ATP를 보유할 것이다. 37 ℃에서 30분 동안 항온처리한다.
표1의 단계 2-7에 따라 핵산 어셈블리를 개시한다. 연속적으로 각각의 웰을 다음 것으로 혼합하여 풀링 단계 2를 수행한다. 각각의 혼합된 웰에 Taq1 리가제 1 ㎕를 첨가하고 다음과 같이 한번 순환시킨다:
94 ℃에서 30초
52 ℃에서 30초
72 ℃에서 10분
풀링 기전 3단계를 수행하고 상기 온도 개요에 따라 순환시킨다. 풀링 기전 4 단계 및 5 단계를 수행하고 상기 온도 개요에 따라 순환시킨다. 풀링 기전 6 단계를 수행하고 각각의 혼합물 10 ㎕를 새로운 미세웰로 취한다. 남은 3개의 웰을 풀링시킴으로써 7 단계 풀링 기전을 수행한다. 반응 부피는 다음과 같을 것이다(개시 플레이트는 웰 당 20 ㎕를 가진다):
2 단계 20 ㎕ + 20 ㎕ = 40 ㎕
3 단계 80 ㎕
4 단계 160 ㎕
5 단계 230 ㎕
6 단계 10 ㎕ + 10 ㎕ = 20 ㎕
7 단계 20 + 20 + 20 = 60 ㎕ 최종 반응 부피
이후 최종 PCR 증폭은 2 ㎕의 최종 리게이션 혼합물을 취하고 다음을 포함하는 PCR 혼합물 20 ㎕에 첨가함으로써 수행되었다.
10 mM TRIS-HCl
pH 9.0, 2.2 mM MgCl2
50 mM KCl
0.2 mM 각 dNTP
0.1 % 트리톤 X-100
250 μM(250 nm/ml - .250 nmol/㎕)에서 1 ㎕의 F1 및 1 ㎕의 R96를 취하고 최종 농도 2.5 μM 각각의 올리고를 부여하는 100 ㎕ PCR 반응에 첨가함으로써 외부 프라이머를 제조한다. 이어서 1 U Taq1 폴리머라제를 첨가하고 다음 조건하에서 약 23 내지 35 회 순환시킨다:
94도에서 30초
50도에서 30초
72도에서 60초
페놀/클로로포름으로 생성물을 추출하고 에탄올로 침전시키며, dH2O 10 ㎕에서 재현탁하고 아가로스 겔상에서 분석한다.
Taq1 폴리머라제(토포이소머라제 II)를 이용하는 어셈블리의 풀링 기전
단계 순방향 올리고 역방향 올리고
1 F E 1 + R E 1
2 F E 2 + R D 12
3 F E 3 + R D 11
4 F E 4 + R D 10
5 F E 5 + R D 9
6 F E 6 + R D 8
7 F E 7 + R D 7
8 F E 8 + R D 6
9 F E 9 + R D 5
10 F E 10 + R D 4
11 F E 11 + R D 3
12 F E 12 + R D 2
13 F F 1 + R D 1
14 F F 2 + R C 12
15 F F 3 + R C 11
16 F F 4 + R C 10
17 F F 5 + R C 9
18 F F 6 + R C 8
19 F F 7 + R C 7
20 F F 8 + R C 6
21 F F 9 + R C 5
22 F F 10 + R C 4
23 F F 11 + R C 3
24 F F 12 + R C 2
25 F G 1 + R C 1
26 F G 2 + R B 12
27 F G 3 + R B 11
28 F G 4 + R B 10
29 F G 5 + R B 9
30 F G 6 + R B 8
31 F G 7 + R B 7
32 F G 8 + R B 6
33 F G 9 + R B 5
34 F G 10 + R B 4
35 F G 11 + R B 3
36 F G 12 + R B 2
37 F H 1 + R B 1
38 F H 2 + R A 12
39 F H 3 + R A 11
40 F H 4 + R A 10

41 F H 5 + R A 9
42 F H 6 + R A 8
43 F H 7 + R A 7
44 F H 8 + R A 6
45 F H 9 + R A 5
46 F H 10 + R A 4
47 F H 11 + R A 3
48 F H 12 + R A 2
대안적 풀링 기전(5' 또는 3' 말단으로부터의 어셈블리 개시)
1 F-A1 → R-A1 변성 어닐링 폴리머라제 연장
2 F-A2→ R-H12 변성 어닐링 폴리머라제 연장
3 F-A3→ R-H11 변성 어닐링 폴리머라제 연장
4 F-A4→ R-H10 변성 어닐링 폴리머라제 얀징
5 F-A5→ R-H9 변성 어닐링 폴리머라제 연장
6 F-A6→ R-H8 변성 어닐링 폴리머라제 연장
7 F-A7→ R-H7 변성 어닐링 폴리머라제 연장
8 F-A8→ R-H6 변성 어닐링 폴리머라제 연장
9 F-A9→ R-H5 변성 어닐링 폴리머라제 연장
10 F-A10→ R-H4 변성 어닐링 폴리머라제 연장
11 F-A11→ R-H3 변성 어닐링 폴리머라제 연장
12 F-A12→ R-H2 변성 어닐링 폴리머라제 연장
13 F-B1→ R-H1 변성 어닐링 폴리머라제 연장
14 F-B2→ R-G12 변성 어닐링 폴리머라제 연장
15 F-B3→ R-G11 변성 어닐링 폴리머라제 연장
16 F-B4→ R-G10 변성 어닐링 폴리머라제 연장
17 F-B5→ R-G9 변성 어닐링 폴리머라제 연장
18 F-B6→ R-G8 변성 어닐링 폴리머라제 연장
19 F-B7 → R-G7 변성 어닐링 폴리머라제 연장
20 F-B8 → R-G6 변성 어닐링 폴리머라제 연장
21 F-B9 → R-G5 변성 어닐링 폴리머라제 연장
22 F-B10 → R-G4 변성 어닐링 폴리머라제 연장
23 F-B11 → R-G3 변성 어닐링 폴리머라제 연장
24 F-B12 → R-G2 변성 어닐링 폴리머라제 연장
25 F-C1 → R-G1 변성 어닐링 폴리머라제 연장
26 F-C2 → R-F12 변성 어닐링 폴리머라제 연장
27 F-C3 → R-F11 변성 어닐링 폴리머라제 연장
28 F-C4 → R-F10 변성 어닐링 폴리머라제 연장
29 F-C5 → R-F9 변성 어닐링 폴리머라제 연장
30 F-C6 → R-F8 변성 어닐링 폴리머라제 연장
31 F-C7 → R-F7 변성 어닐링 폴리머라제 연장
32 F-C8 → R-F6 변성 어닐링 폴리머라제 연장
33 F-C9 → R-F5 변성 어닐링 폴리머라제 연장

34 F-C10→ R-F4 변성 어닐링 폴리머라제 연장
35 F-C11→ R-F3 변성 어닐링 폴리머라제 연장
36 F-C12→ R-F2 변성 어닐링 폴리머라제 연장
37 F-D1 → R-F1 변성 어닐링 폴리머라제 연장
38 F-D2 → R-E12 변성 어닐링 폴리머라제 연장
39 F-D3 → R-E11 변성 어닐링 폴리머라제 연장
40 F-D4 → R-E10 변성 어닐링 폴리머라제 연장
41 F-D5 → R-E9 변성 어닐링 폴리머라제 연장
42 F-D6 → R-E8 변성 어닐링 폴리머라제 연장
43 F-D7 → R-E7 변성 어닐링 폴리머라제 연장
44 F-D8 → R-E6 변성 어닐링 폴리머라제 연장
45 F-D9 → R-E5 변성 어닐링 폴리머라재 연장
46 F-D10→ R-E4 변성 어닐링 폴리머라제 연장
47 F-D11→ R-E3 변성 어닐링 폴리머라제 연장
48 F-D12→ R-E2 변성 어닐링 폴리머라제 연장
49 F-E1 → R-E1 변성 어닐링 폴리머라제 연장
50 F-E2 → R-D12 변성 어닐링 폴리머라제 연장
51 F-E3 → R-D11 변성 어닐링 폴리머라제 연장
52 F-E4 → R-D10 변성 어닐링 폴리머라제 연장
53 F-E5 → R-D9 변성 어닐링 폴리머라제 연장
54 F-E6 → R-D8 변성 어닐링 폴리머라제 연장
55 F-E7 → R-D7 변성 어닐링 폴리머라제 연장
56 F-E8 → R-D6 변성 어닐링 폴리머라제 연장
57 F-E9 → R-D5 변성 어닐링 폴리머라제 연장
58 F-E10→ R-D4 변성 어닐링 폴리머라제 연장
59 F-E11→ R-D3 변성 어닐링 폴리머라제 연장
60 F-E12→ R-D2 변성 어닐링 폴리머라제 연장
61 F-F1 → R-D1 변성 어닐링 폴리머라제 연장
62 F-F2 → R-C12 변성 어닐링 폴리머라제 연장
63 F-F3 → R-C11 변성 어닐링 폴리머라제 연장
64 F-F4 → R-C10 변성 어닐링 폴리머라제 얀징
65 F-F5 → R-C9 변성 어닐링 폴리머라제 연장
66 F-F6→ R-C8 변성 어닐링 폴리머라제 연장
67 F-F7→ R-C7 변성 어닐링 폴리머라제 연장
68 F-F8→ R-C6 변성 어닐링 폴리머라제 연장
69 F-F9→ R-C5 변성 어닐링 폴리머라제 연장
70 F-F10 R-C4 변성 어닐링 폴리머라제 연장
71 F-F11 R-C3 변성 어닐링 폴리머라제 연장
72 F-F12 R-C2 변성 어닐링 폴리머라제 연장
73 F-G1 → R-C1 변성 어닐링 폴리머라제 연장
74 F-G2 → R-B12 변성 어닐링 폴리머라제 연장
75 F-G3 → R-B11 변성 어닐링 폴리머라제 연장
76 F-G4 → R-B10 변성 어닐링 폴리머라제 연장
77 F-G5 → R-B9 변성 어닐링 폴리머라제 연장
78 F-G6 → R-B8 변성 어닐링 폴리머라제 연장
78 F-G7 → R-B7 변성 어닐링 폴리머라제 연장
80 F-G8 → R-B6 변성 어닐링 폴리머라제 연장
81 F-G9 → R-B5 변성 어닐링 폴리머라제 연장

82 F-G10→ R-B4 변성 어닐링 폴리머라제 연장
83 F-G11→ R-B3 변성 어닐링 폴리머라제 연장
84 F-G12→ R-B2 변성 어닐링 폴리머라제 연장
85 F-H1 → R-B1 변성 어닐링 폴리머라제 연장
86 F-H2 → R-A12 변성 어닐링 폴리머라제 연장
87 F-H3 → R-A11 변성 어닐링 폴리머라제 연장
88 F-H4 → R-A10 변성 어닐링 폴리머라제 연장
89 F-H5 → R-A9 변성 어닐링 폴리머라제 연장
90 F-H6 → R-A8 변성 어닐링 폴리머라제 연장
91 F-H7 → R-A7 변성 어닐링 폴리머라제 연장
92 F-H8 → R-A6 변성 어닐링 폴리머라제 연장
93 F-H9 → R-A5 변성 어닐링 폴리머라제 연장
94 F-H10→ R-A4 변성 어닐링 폴리머라제 연장
95 F-H11→ R-A3 변성 어닐링 폴리머라제 연장
96 F-H12→ R-A2 변성 어닐링 폴리머라제 연장
핵산 분자의 어셈블리
표4에 기재된 핵산 분자는 본원에 기재된 방법을 이용하여 제조되었다. 각 핵산 분자의 특징 및 특성은 또한 표4에 기재된다.
표4에 기재된 바와 같이, 길이가 4800 bp인 합성 플라스미드를 어셈블링하였다. 플라스미드는 192개의 올리고뉴클레오티드(96 중첩 50 mer의 2 세트; 25 bp 중첩). 플라스미드는 실질적으로 앰피실린 내성 대신 카나마이신 내성을 포함하는 pUC이다. 합성 플라스미드는 또한 비브리오 피셔리(Vibrio fisheri) 박테리아 루시퍼라제 유전자로부터 룩스 A 및 B 유전자를 포함할 수 있다. SynPuc19 플라스미드는 정확하게 2700 bp로 단지 짧아진 pUC19와 실질적으로 동일한 서열을 포함하여 길이가 2700 bp이다. 2 세트의 96 50 mer는 플라스미드를 어셈블하기 위해 사용되었다. Synlux4 pUC19 플라스미드는 짧아지고 lux A 유전자가 첨가되었다. 2 세트의 27 올리고뉴클레오티드를 포함하는 54 100mer 올리고뉴클레오티드는 플라스미드를 어셈블하기 위하여 사용되었다. 2400 bp를 포함하는 미니QE10 플라스미드는 48 50 mer 올리고뉴클레오티드를 이용하여 어셈블되었다. 미니QE10은 6X His xor 및 높은 수준 폴리펩티드 발현을 위한 박테리아 프로모터를 함유하는 발현 플라스미드이다. 미니QE는 본 발명의 Taq1 폴리머라제 증폭 방법을 이용하여 어셈블하고 합성하였다. 미크로 QE 플라스미드는 단지 앰피실린 유전자, 복제의 오리진 및 pQE 플라스미드의 링커를 포함하는 최소의 플라스미드이다. 미세 QE는 24 50 mer 또는 한 튜브 PCR 증폭의 조합적 리게이션을 이용하여 어셈블링되었다. SynFib1, SynFibB 및 SynFibG 핵산 서열은 원핵 생물 발현계에서 발현을 최적하 하기 위한 이 콜리 코돈을 이용하여 제조된 합성 인간 피브리노겐이다.
본 발명의 방법을 이용하여 제조된 합성 핵산 분자
합성 플라스미드 4800 192 50 원형 F1-F96
SynPUC/19 2700 192 50 원형 F01-F96
SynLux/4 2700 54 100 원형 F1-27
MiniQE10 2400 48 50 원형
MicroQE 1200 24 50 원형 MQEF-1, 24
Synfibl 1850 75 50 선형 SFAF1-37
pQE25 2400 96 25 원형 F1-F48
SynFibB 1500 60 59 50mers 선형 FibbF1-30
1 25mer
SynFibG 1350 54 53 50mers 선형 FibgF1-27
1 25mer
본 발명은 이의 상세한 설명으로 설명되며, 전술한 상세한 설명은 설명을 위한 것이며 본 발명을 제한하려는 것은 아니고, 첨부된 청구범위의 범위내에서 한정된다는 것을 이해하여야 한다. 기타 태양, 장점 및 변경은 다음 청구범위의 범위내에 속한다.

Claims (52)

  1. 다음의 단계를 포함하는 표적 폴리뉴클레오티드 합성 방법:
    a) 표적 폴리뉴클레오티드 서열을 제공하는 단계;
    b) a)의 표적 폴리뉴클레오티드 서열에 존재하는 1 이상의 개시 폴리뉴클레오티드를 동정하는 단계로서, 개시 폴리뉴클레오티드는 5' 오버행(overhang) 및 3' 오버행을 포함하는 부분적 이중 가닥 폴리뉴클레오티드를 생성하는 1 이상의 마이너스 가닥 올리고뉴클레오티드에 어닐링된 1 이상의 플러스 가닥 올리고뉴클레오티드를 포함하는 것인 단계;
    c) 5' 오버행, 3' 오버행 또는 5' 오버행과 3' 오버행을 포함하는 부분적 이중 가닥 폴리뉴클레오티드를 생성하는 1 이상의 마이너스 가닥 올리고뉴클레오티드에 어닐링된 1 이상의 플러스 가닥 올리고뉴클레오티드를 포함하고 개시 폴리뉴클레오티드와 접촉하는 a)의 표적 폴리뉴클레오티드에 존재하는 제2 폴리뉴클레오티드를 동정하는 단계로서, 제2 폴리뉴클레오티드의 1 이상의 오버행은 개시 폴리뉴클레오티드의 1 이상의 오버행에 상보적인 것인 단계;
    d) 5' 오버행, 3' 오버행 또는 5' 오버행과 3' 오버행을 포함하는 부분적 이중 가닥 폴리뉴클레오티드를 생성하는 1 이상의 마이너스 가닥 올리고뉴클레오티드에 어닐링된 1 이상의 플러스 가닥 올리고뉴클레오티드를 포함하고 개시 서열과 접촉하는 a)의 표적 폴리뉴클레오티드에 존재하는 제3 폴리뉴클레오티드를 동정하는 단계로서, 제3 폴리뉴클레오티드의 1 이상의 오버행이 제2 폴리뉴클레오티드의 오버행에 상보적이지 않은 개시 폴리뉴클레오티드의 1 이상의 오버행에 상보적인 것인 단계; 및
    e) 어닐링에 적합한 시간 동안 그리고 적합한 조건하에서 개시 폴리뉴클레오티드를 c)의 제2 폴리뉴클레오티드 및 d)의 제3 폴리뉴클레오티드와 접촉시키고, 이러한 접촉이 접촉성 이중 가닥 폴리뉴클레오티드를 생성하고, 개시 서열이 양방향 연장 되게 하는 것인 단계.
  2. 제1항에 있어서, 표적 폴리뉴클레오티드 서열이 표적 폴리펩티드를 암호화하는 것인 표적 폴리뉴클레오티드 합성 방법.
  3. 제2항에 있어서, 표적 폴리펩티드가 단백질인 것인 표적 폴리뉴클레오티드 합성 방법.
  4. 제3항에 있어서, 단백질이 효소인 것인 표적 폴리뉴클레오티드 합성 방법.
  5. 제1항에 있어서, 개시 폴리뉴클레오티드 서열이 알고리즘을 포함하는 컴퓨터 프로그램에 의해 동정되는 것으로서, 상기 알고리즘은 특정 코돈 표를 이용하여 DNA 서열을 생성하기 위한 폴리펩티드 서열을 이용하고, 이후 알고리즘은 하기의 방식으로 DNA 서열의 (+) 및 (-) 가닥에 상응하는 한 세트의 분석된 올리고뉴클레오티드를 생성하는 것인 표적 폴리뉴클레오티드 합성 방법:
    1. DNA 서열 GENE[], 염기들의 배열은 특정 코돈표를 이용하여 단백질 서열 AA[], 아미노산 어레이로부터 생성되고, 이 콜리 형태 II 코돈의 코돈표의 예는 하기와 같으며:
    a. 파라미터
    i. N 아미노산 잔기의 단백질 길이
    ii. L = DNA 염기의 유전자의 3N 길이
    iii. Q 각 성분 올리고뉴클레오티드의 길이
    iv. X = Q/2 올리고뉴클레오티드 간의 중첩 길이
    v. W = 3N/Q F 세트에서 올리고뉴클레오티드의 수
    vi. Z = 3N/Q + 1 R 세트에서 올리고뉴클레오티드의 수
    vii. F [1: W] (+) 가닥 올리고뉴클레오티드 세트
    viii. R [L: Z] (-) 가닥 올리고뉴클레오티드 세트
    ix. AA [1: N] 아미노산 잔기의 어레이
    x. GENE [1: L] 유전자를 포함하는 염기 어레이
    b. 아미노산 잔기 리스트로 구성된 단백질 서열 AA []의 수득 또는 디자인
    c. 단백질 서열, AA[]로부터 DNA 서열, GENE[]의 생성
    i. For I = 1 to N
    ii. Translate AA[J] from codon table generating GENE [I: I+2]
    iii. I = I + 3
    iv. J = J+ 1
    v. Go to ii
    2. 두 세트의 중첩 올리고뉴클레오티드는 GENE []로부터 생성됨; F [] 는 (+) 가닥을 포괄하고, R []는 (-) 가닥을 포괄하는 상보적이고 부분적으로 중첩하는 세트이며;
    a. 올리고의 F [] 세트를 생성
    i. For I = 1 to W
    ii. F [I] = GENE [I : I+Q-1]
    iii. I = I + Q
    iv. Go to ii
    b. 올리고의 R 세트를 생성
    i. J = W
    ii. For I = 1 to W
    iii. R [I] = GENE [W : W-Q]
    iv. J = J-Q
    v. Go to iii
    c. 결과는 Q 길이의 올리고 F [] 및 R [] 의 두 세트이고,
    d. 최종 2개의 마지막 올리고를 생성
    i. S [l] = GENE [Q/2 : 1]
    ii. S [2] = GENE [L-Q/2: L]
    이어서, 올리고뉴클레오티드 세트 어셈블리는 다음의 알고리즘에 의해 확립되며:
    올리고뉴클레오티드 2 세트 F [1: W] R [1: Z] S [1 : 2]
    3. 1 단계
    a. For I = 1 to W
    b. Ligate F [I], F [I+1], R [I]; place in T [I]
    c. Ligate F [I+2], R [I+1], R [I+2] T [I+1]
    d. I = I + 3
    e. Go to b
    4. 2 단계
    a. 단일 반응만 남을 때까지 다음을 실시
    i. For I = 1 to W/3
    ii. Ligate T [I], T [I+1]
    iii. I = I + 2
    iv. Go to ii
    코돈표(이 콜리 부류 II 선호된 이용)
    PHE TTC SER TCT TYR TAC CYS TGG TER TGA TRP TGG ILE ATC MET ATG THR ACC LEU CTG PRO CCG HIS CAC GLN CAG ARG CGT VAL GTT ALA GCG ASN AAC LYS AAA ASP GAC GLU GAA GLY GGT
  6. 삭제
  7. 제1항에 있어서, 개시, 제2 또는 제3 폴리뉴클레오티드의 플러스 가닥의 길이가 약 15 내지 1000 뉴클레오티드인 것인 표적 폴리뉴클레오티드 합성 방법.
  8. 제1항에 있어서, 개시, 제2 또는 제3 폴리뉴클레오티드의 플러스 가닥의 길이가 약 20 내지 500 뉴클레오티드인 것인 표적 폴리뉴클레오티드 합성 방법.
  9. 제1항에 있어서, 개시, 제2 또는 제3 폴리뉴클레오티드의 플러스 가닥의 길이가 약 25 내지 100 뉴클레오티드인 것인 표적 폴리뉴클레오티드 합성 방법.
  10. 제1항에 있어서, 개시, 제2 또는 제3 폴리뉴클레오티드의 마이너스 가닥의 길이가 약 15 내지 1000 뉴클레오티드인 것인 표적 폴리뉴클레오티드 합성 방법.
  11. 제1항에 있어서, 개시, 제2 또는 제3 폴리뉴클레오티드의 마이너스 가닥의 길이가 약 20 내지 500 뉴클레오티드인 것인 표적 폴리뉴클레오티드 합성 방법.
  12. 제1항에 있어서, 개시, 제2 또는 제3 폴리뉴클레오티드의 마이너스 가닥의 길이가 약 25 내지 100 뉴클레오티드인 것인 표적 폴리뉴클레오티드 합성 방법.
  13. 제1항에 있어서, 개시 폴리뉴클레오티드가 고체 지지체에 부착되는 것으로서, 상기 고체 지지체가 자성 라텍스 비드 또는 자성 조절 공극 유리 비드인 표적 폴리뉴클레오티드 합성 방법.
  14. 다음의 단계를 포함하는 표적 폴리뉴클레오티드 합성 방법:
    a) 모델 서열로부터 유래된 표적 폴리뉴클레오티드 서열을 제공하는 단계;
    b) a)의 표적 폴리뉴클레오티드 서열에 존재하는 1 이상의 개시 폴리뉴클레오티드 서열을 동정하는 단계로서, 이때 개시 폴리뉴클레오티드는 1) 제1 플러스 가닥 올리고뉴클레오티드; 2) 제1 플러스 가닥 올리고뉴클레오티드와 접촉하는 제2 플러스 가닥 올리고뉴클레오티드; 및 3) 제1 플러스 가닥 올리고뉴클레오티드에 적어도 부분적으로 상보적인 제1 접촉성 서열 및 제2 플러스 가닥 올리고뉴클레오티드에 적어도 부분적으로 상보적인 제2 접촉성 서열을 포함하는 마이너스 가닥 올리고뉴클레오티드;
    c) 5' 오버행 및 3' 오버행을 포함하는 부분적 이중 가닥 개시 폴리뉴클레오티드를 생성하는 b)의 마이너스 가닥 올리고뉴클레오티드에 제1 플러스 가닥 올리고뉴클레오티드 및 제1 플러스 가닥 올리고뉴클레오티드을 어닐링시키는 단계;
    d) a)의 표적 폴리뉴클레오티드 서열에 존재하는 제2 폴리뉴클레오티드 서열을 동정하는 단계로서, 이때 제2 폴리뉴클레오티드 서열은 개시 폴리뉴클레오티드 서열에 접촉하고 1) 제1 플러스 가닥 올리고뉴클레오티드; 2) 제1 플러스 가닥 올리고뉴클레오티드와 접촉하는 제2 플러스 가닥 올리고뉴클레오티드; 및 3) 제1 플러스 가닥 올리고뉴클레오티드에 적어도 부분적으로 상보적인 제1 접촉성 서열 및 제2 플러스 가닥 올리고뉴클레오티드에 적어도 부분적으로 상보적인 제2 접촉성 서열을 포함하는 마이너스 가닥 올리고뉴클레오티드를 포함하는 것인 단계;
    e) 부분적 이중 가닥 제2 폴리뉴클레오티드를 생성하는 d)의 마이너스 가닥 올리고뉴클레오티드에 제1 플러스 가닥 올리고뉴클레오티드 및 제2 플러스 가닥 올리고뉴클레오티드를 어닐링시키는 단계로서, 이때 제2 폴리뉴클레오티드의 1 이상의 오버행은 개시 폴리뉴클레오티드의 1 이상의 오버행에 상보적인 것인 단계;
    f) a)의 표적 폴리뉴클레오티드에 존재하는 제3 폴리뉴클레오티드를 동정하는 단계로서, 이때 제3 폴리뉴클레오티드는 개시 서열과 접촉하고, 1) 제1 플러스 가닥 올리고뉴클레오티드; 2) 제1 플러스 가닥 올리고뉴클레오티드과 접촉하는 제2 플러스 가닥 올리고뉴클레오티드; 및 3)제1 플러스 가닥 올리고뉴클레오티드에 적어도 부분적으로 상보적인 제1 접촉성 서열 및 제2 플러스 가닥 올리고뉴클레오티드에 적어도 부분적으로 상보적인 제2 접촉성 서열을 포함하는 마이너스 가닥 올리고뉴클레오티드를 포함하는 것인 단계;
    g) 부분적 이중 가닥의 제2 폴리뉴클레오티드를 생성하는 f)의 마이너스 가닥 올리고뉴클레오티드에 제1 플러스 가닥 올리고뉴클레오티드 및 제2 플러스 가닥 올리고뉴클레오티드를 어닐링시키는 단계로서, 제3 폴리뉴클레오티드의 1 이상의 오버행이 개시 폴리뉴클레오티드의 1 이상의 오버행에 상보적이고, 제2 폴리뉴클레오티드의 오버행에 상보적이지 않은 것인 단계; 및
    h) 어닐링에 적합한 시간 동안 그리고 적합한 조건하에서 e)의 제2 폴리뉴클레오티드 및 g)의 제3 폴리뉴클레오티드와 c)의 개시 폴리뉴클레오티드를 접촉시키는 단계로서, 상기 접촉은 접촉성 이중 가닥 폴리뉴클레오티드를 생성하고, 이때 개시 서열은 양방향으로 연장되는 것인 단계.
  15. 다음의 단계를 포함하는 표적 폴리뉴클레오티드 합성 방법:
    a) 표적 폴리뉴클레오티드 서열을 제공하는 단계;
    b) a)의 표적 폴리뉴클레오티드에 존재하는 1 이상의 개시 폴리뉴클레오티드를 동정하는 단계로서, 이때 개시 폴리뉴클레오티드는 1 이상의 마이너스 가닥 올리고뉴클레오티드에 어닐링된 1 이상의 플러스 가닥 올리고뉴클레오티드를 포함하는 것인 단계;
    c) 개시 폴리뉴클레오티드의 플러스 가닥의 3' 부분에 부분적 상보성을 가지는 제1 올리고뉴클레오티드 및 개시 폴리뉴클레오티드의 마이너스 가닥의 3'부분에 부분적 상보성을 가지는 제2 올리고뉴클레오티드와 프라이머 어닐링하기에 적합한 조건하에서 개시 폴리뉴클레오티드를 접촉시키는 단계;
    d) 프라이머 연장에 적합한 조건하에서 1) 개시 폴리뉴클레오티드의 플러스 가닥의 3'-히드록실로부터의 폴리뉴클레오티드 합성; 2) 어닐링된 제1 올리고뉴클레오티드의 3'-히드록실로부터의 폴리뉴클레오티드 합성; 3)개시 폴리뉴클레오티드의 마이너스 가닥의 3'-히드록실로부터의 폴리뉴클레오티드 합성; 및 4) 어닐링된 제2 올리고뉴클레오티드의 3'-히드록실로부터의 폴리뉴클레오티드 합성을 촉매하는 단계로서, 이때 개시 서열을 양방향 연장시킴으로써 초기의 연장된 개시 폴리뉴클레오티드를 형성하는 단계;
    e) 연장된 개시 폴리뉴클레오티드의 플러스 가닥의 3' 부분에 부분적 상보성을 가지는 제3 올리고뉴클레오티드 및 연장된 개시 폴리뉴클레오티드의 마이너스 가닥의 3' 부분에 부분적 상보성을 가지는 제4 올리고뉴클레오티드와 프라이머 어닐링에 적합한 조건하에서 d)의 연장된 개시 폴리뉴클레오티드를 접촉시키는 단계; 및
    f) 프라이머 연장에 적합한 조건하에서, 1) 연장된 개시 폴리뉴클레오티드의 플러스 가닥의 3'-히드록실로부터 폴리뉴클레오티드 합성; 2) 어닐링된 제3 올리고뉴클레오티드의 3'-히드록실로부터 폴리뉴클레오티드의 합성; 3) 연장된 개시 폴리뉴클레오티드의 마이너스 가닥의 3'-히드록실로부터 폴리뉴클레오티드 합성; 및 4) 어닐링된 제4 올리고뉴클레오티드의 3'-히드록실로부터 폴리뉴클레오티드 합성을 촉매하는 단계로서, 이때 연장된 개시 서열을 양방향 연장시킴으로써 초기 연장된 개시 폴리뉴클레오티드를 형성하는 단계.
  16. 제15항에 있어서, 표적 폴리뉴클레오티드 서열이 표적 폴리펩티드를 암호화하는 것인 표적 폴리뉴클레오티드 합성 방법.
  17. 제16항에 있어서, 표적 폴리펩티드가 단백질인 것인 표적 폴리뉴클레오티드 합성 방법.
  18. 제17항에 있어서, 단백질이 효소인 것인 표적 폴리뉴클레오티드 합성 방법.
  19. 제15항에 있어서, 개시 폴리펩티드가 알고리즘을 포함하는 컴퓨터 프로그램에 의해 동정되는 것으로서, 상기 알고리즘은 특정 코돈 표를 이용하여 DNA 서열을 생성하기 위한 폴리펩티드 서열을 이용하고, 이후 알고리즘은 하기의 방식으로 DNA 서열의 (+) 및 (-) 가닥에 상응하는 한 세트의 분석된 올리고뉴클레오티드를 생성하는 것인 표적 폴리뉴클레오티드 합성 방법:
    1. DNA 서열 GENE[], 염기들의 배열은 특정 코돈표를 이용하여 단백질 서열 AA[], 아미노산 어레이로부터 생성되고, 이 콜리 형태 II 코돈의 코돈표의 예는 하기와 같으며:
    a. 파라미터
    i. N 아미노산 잔기의 단백질 길이
    ii. L = DNA 염기의 유전자의 3N 길이
    iii. Q 각 성분 올리고뉴클레오티드의 길이
    iv. X = Q/2 올리고뉴클레오티드 간의 중첩 길이
    v. W = 3N/Q F 세트에서 올리고뉴클레오티드의 수
    vi. Z = 3N/Q + 1 R 세트에서 올리고뉴클레오티드의 수
    vii. F [1: W] (+) 가닥 올리고뉴클레오티드 세트
    viii. R [L: Z] (-) 가닥 올리고뉴클레오티드 세트
    ix. AA [1: N] 아미노산 잔기의 어레이
    x. GENE [1: L] 유전자를 포함하는 염기 어레이
    b. 아미노산 잔기 리스트로 구성된 단백질 서열 AA []의 수득 또는 디자인
    c. 단백질 서열, AA[]로부터 DNA 서열, GENE[]의 생성
    i. For I = 1 to N
    ii. Translate AA[J] from codon table generating GENE [I: I+2]
    iii. I = I + 3
    iv. J = J+ 1
    v. Go to ii
    2. 두 세트의 중첩 올리고뉴클레오티드는 GENE []로부터 생성됨; F [] 는 (+) 가닥을 포괄하고, R []는 (-) 가닥을 포괄하는 상보적이고 부분적으로 중첩하는 세트이며;
    a. 올리고의 F [] 세트를 생성
    i. For I = 1 to W
    ii. F [I] = GENE [I : I+Q-1]
    iii. I = I + Q
    iv. Go to ii
    b. 올리고의 R 세트를 생성
    i. J = W
    ii. For I = 1 to W
    iii. R [I] = GENE [W : W-Q]
    iv. J = J-Q
    v. Go to iii
    c. 결과는 Q 길이의 올리고 F [] 및 R [] 의 두 세트이고,
    d. 최종 2개의 마지막 올리고를 생성
    i. S [l] = GENE [Q/2 : 1]
    ii. S [2] = GENE [L-Q/2: L]
    이어서, 올리고뉴클레오티드 세트 어셈블리는 다음의 알고리즘에 의해 확립되며:
    올리고뉴클레오티드 2 세트 F [1: W] R [1: Z] S [1 : 2]
    3. 1 단계
    a. For I = 1 to W
    b. Ligate F [I], F [I+1], R [I]; place in T [I]
    c. Ligate F [I+2], R [I+1], R [I+2] T [I+1]
    d. I = I + 3
    e. Go to b
    4. 2 단계
    a. 단일 반응만 남을 때까지 다음을 실시
    i. For I = 1 to W/3
    ii. Ligate T [I], T [I+1]
    iii. I = I + 2
    iv. Go to ii
    코돈표(이 콜리 부류 II 선호된 이용)
    PHE TTC SER TCT TYR TAC CYS TGG TER TGA TRP TGG ILE ATC MET ATG THR ACC LEU CTG PRO CCG HIS CAC GLN CAG ARG CGT VAL GTT ALA GCG ASN AAC LYS AAA ASP GAC GLU GAA GLY GGT
  20. 다음의 단계를 포함하는 표적 폴리뉴클레오티드 합성 방법:
    a) 표적 폴리뉴클레오티드 서열을 제공하는 단계;
    b) a)의 표적 폴리뉴클레오티드 서열에 존재하는 1 이상의 개시 폴리뉴클레오티드를 동정하는 단계로서, 개시 폴리뉴클레오티드가 적어도 5' 오버행(overhang) 및 3' 오버행을 포함하는 부분적 이중 가닥 폴리뉴클레오티드를 생성하는 1 이상의 마이너스 가닥 올리고뉴클레오티드에 어닐링된 1 이상의 플러스 가닥 올리고뉴클레오티드를 포함하는 것인 단계;
    c) 5' 오버행, 3' 오버행 또는 5' 오버행과 3' 오버행을 포함하는 부분적 이중 가닥 폴리뉴클레오티드를 생성하는 1 이상의 마이너스 가닥 올리고뉴클레오티드로에 어닐링된 1 이상의 플러스 가닥 올리고뉴클레오티드를 포함하고 개시 서열과 접촉하는 표적 폴리뉴클레오티드에 존재하는 제2 폴리뉴클레오티드를 동정하는 단계로서, 제2 폴리뉴클레오티드의 1 이상의 오버행이 개시 폴리뉴클레오티드의 오버행에 상보적인 것인 단계; 및
    d) 어닐링에 적합한 시간 동안 그리고 적합한 조건하에서 개시 폴리뉴클레오티드를 c)의 제2 폴리뉴클레오티드와 접촉시키고, 이러한 접촉이 접촉성 이중 가닥 폴리뉴클레오티드를 생성하고, 개시 서열은 양방향으로 연장되게 하는 것인 단계.
  21. 제15항에 있어서, 개시, 제2 또는 제3 폴리뉴클레오티드의 플러스 가닥의 길이가 약 15 내지 1000 뉴클레오티드인 것인 표적 폴리뉴클레오티드 합성 방법.
  22. 제15항에 있어서, 개시, 제2 또는 제3 폴리뉴클레오티드의 플러스 가닥의 길 이가 약 20 내지 500 뉴클레오티드인 것인 표적 폴리뉴클레오티드 합성 방법.
  23. 제15항에 있어서, 개시, 제2 또는 제3 폴리뉴클레오티드의 플러스 가닥의 길이가 약 25 내지 100 뉴클레오티드인 것인 표적 폴리뉴클레오티드 합성 방법.
  24. 제15항에 있어서, 개시, 제2 또는 제3 폴리뉴클레오티드의 마이너스 가닥의 길이가 약 15 내지 1000 뉴클레오티드인 것인 표적 폴리뉴클레오티드 합성 방법.
  25. 제15항에 있어서, 개시, 제2 또는 제3 폴리뉴클레오티드의 마이너스 가닥의 길이가 약 20 내지 500 뉴클레오티드인 것인 표적 폴리뉴클레오티드 합성 방법.
  26. 제15항에 있어서, 개시, 제2 또는 제3 폴리뉴클레오티드의 마이너스 가닥의 길이가 약 25 내지 100 뉴클레오티드인 것인 표적 폴리뉴클레오티드 합성 방법.
  27. 제15항에 있어서, 개시 폴리뉴클레오티드가 고체 지지체에 부착되는 것으로서, 상기 고체 지지체가 자성 라텍스 비드 또는 자성 조절 공극 유리 비드인 표적 폴리뉴클레오티드 합성 방법.
  28. 다음을 포함하는 표적 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화된 표적 폴리펩티드의 분리 방법:
    a) 모델 서열로부터 유래된 표적 폴리뉴클레오티드 서열을 제공하는 단계;
    b) a)의 표적 폴리뉴클레오티드 서열에 존재하는 1 이상의 개시 폴리뉴클레오티드를 동정하는 단계로서, 개시 폴리뉴클레오티드는 5' 오버행 및 3' 오버행을 포함하는 부분적 이중 가닥 폴리뉴클레오티드를 생성하는 1 이상의 마이너스 가닥 올리고뉴클레오티드에 어닐링된 1 이상의 플러스 가닥 올리고뉴클레오티드를 포함하는 것인 단계;
    c) 5' 오버행, 3' 오버행 또는 5' 오버행과 3' 오버행을 포함하는 부분적 이중 가닥 폴리뉴클레오티드를 생성하는 1 이상의 마이너스 가닥 올리고뉴클레오티드에 어닐링된 1 이상의 플러스 가닥 올리고뉴클레오티드를 포함하고 개시 폴리뉴클레오티드와 접촉하는 a)의 표적 폴리뉴클레오티드에 존재하는 제2 폴리뉴클레오티드를 동정하는 단계로서, 제2 폴리뉴클레오티드의 1 이상의 오버행은 개시 폴리뉴클레오티드의 1 이상의 오버행에 상보적인 것인 단계;
    d) 5' 오버행, 3' 오버행 또는 5' 오버행과 3' 오버행을 포함하는 부분적 이중 가닥 폴리뉴클레오티드를 생성하는 1 이상의 마이너스 가닥 올리고뉴클레오티드에 어닐링된 1 이상의 플러스 가닥 올리고뉴클레오티드를 포함하고 개시 서열과 접촉하는 a)의 표적 폴리뉴클레오티드에 존재하는 제3 폴리뉴클레오티드를 동정하는 단계로서, 제3 폴리뉴클레오티드의 1 이상의 오버행이 제2 폴리뉴클레오티드 오버행에 상보적이지 않은 개시 폴리뉴클레오티드의 1 이상의 오버행에 상보적인 것인 단계;
    e) 어닐링에 적합한 시간 동안 그리고 적합한 조건하에서 b)의 개시 폴리뉴클레오티드를 c)의 제2 폴리뉴클레오티드 및 d)의 제3 폴리뉴클레오티드와 접촉시키고, 이러한 접촉이 접촉성 이중 가닥 폴리뉴클레오티드를 생성하고, 개시 서열이 양방향으로 연장되게 하는 것인 단계;
    h) 발현 벡터에 e)의 표적 폴리뉴클레오티드를 혼입하는 단계;
    i) 적절한 숙주 세포로 h)의 발현 벡터를 도입하는 단계;
    j) 표적 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화된 표적 폴리펩티드의 발현을 증진하는 시간 및 조건하에 i)의 세포를 배양하는 단계; 및
    k) 표적 폴리펩티드를 분리하는 단계.
  29. 제28항에 있어서, 표적 폴리펩티드가 키메라 단백질인 것인 표적 폴리뉴클레오티드 분리 방법.
  30. 제28항에 있어서, 표적 폴레펩티드가 융합 단백질인 것인 표적 폴리뉴클레오티드 분리 방법.
  31. 제28항에 있어서, 발현 벡터가 박테리아 발현 벡터인 것인 표적 폴리뉴클레 오티드 분리 방법.
  32. 제29항에 있어서, 발현 벡터가 동물 세포 발현 벡터인 것인 표적 폴리뉴클레오티드 분리 방법.
  33. 제28항에 있어서, 발현 벡터가 곤충 세포 발현 벡터인 것인 표적 폴리뉴클레오티드 분리 방법.
  34. 제28항에 있어서, 발현 벡터가 레트로바이러스 벡터인 것인 표적 폴리뉴클레오티드 분리 방법.
  35. 제29항에 있어서, 발현 벡터가 숙주 세포에 포함되는 것인 표적 폴리뉴클레오티드 분리 방법.
  36. 제35항에 있어서, 숙주 세포가 원핵 생물 세포인 것인 표적 폴리뉴클레오티드 분리 방법.
  37. 제35항에 있어서, 숙주 세포가 진핵 생물 세포인 것인 표적 폴리뉴클레오티드 분리 방법.
  38. 제1항, 제14항, 제15항 또는 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 올리고뉴클레오티드가 자동화된 DNA 합성기상에서 합성에 의해 생성되는 것인 표적 폴리뉴클레오티드 합성 방법.
  39. 다음을 포함하는 표적 폴리뉴클레오티드 합성 방법:
    a) 모델 서열로부터 유래된 표적 폴리뉴클레오티드 서열을 제공하는 단계;
    b) 각각의 다수로 존재하는 1 이상의 올리고뉴클레오티드에 부분적으로 상보적인 다수의 단일 가닥 올리고뉴클레오티드를 화학적으로 합성하는 단계로서, 이때 다수의 올리고뉴클레오티드 서열이 표적 폴리뉴클레오티드와 접촉하는 서열인 것인 단계;
    c) 어닐링하기 적합한 시간 동안 및 그러한 조건하에서 부분적으로 상보적인 올리고뉴클레오티드를 접촉시키는 단계로서 상기 접촉은 다수의 부분적 이중 가닥 폴리뉴클레오티드를 생성하며, 이때 각 이중 가닥 폴리뉴클레오티드는 5' 오버행 및 3' 오버행을 포함하는 것인 단계;
    d) c) 단계의 다수의 이중 가닥 폴리뉴클레오티드에 존재하는, 모델 서열로부터 유래된 1 이상의 개시 폴리뉴클레오티드를 동정하는 단계;
    e) 프라이머 연장 없이, 개시 폴리뉴클레오티드 및 1) 상기 개시 서열의 5' 부분에 어닐링될 이중 가닥 폴리뉴클레오티드; 2) 개시 폴리뉴클레오티드의 3' 부분에 어닐링될 이중 가닥 폴리뉴클레오티드 및 3) DNA 리가제를 포함하는 혼합물을 어닐링 및 리게이션에 적합한 조건하에서 투여하는 단계로서, 이때 개시 폴리뉴클 레오티드는 양방향으로 연장되는 것인 단계;
    f) 이중 가닥 폴리뉴클레오티드를 어닐링의 반복적 사이클을 통해 연장된 개시 폴리뉴클레오티드에 차례로 어닐링시킴으로써 표적 폴리뉴클레오티드를 생성하는 단계.
  40. 제39항에 있어서, 올리고뉴클레오티드는 자동화된 DNA 합성기상에서 합성에 의해 생성되는 것인 표적 폴리뉴클레오티드 합성 방법.
  41. 표적 폴리뉴클레오티드 서열을 제조하기 위한 컴퓨터 판독가능한 매체상에 저장된 컴퓨터 프로그램으로서, 컴퓨터 시스템이
    a) 표적 폴리뉴클레오티드 서열에 포함된 개시 폴리뉴클레오티드 서열을 동정;
    b) 표적 폴리뉴클레오티드 서열을 다수의 독특한 부분적으로 상보적인 올리고뉴클레오티드로 파싱(parsing);
    c) 부분적으로 상보적인 올리고뉴클레오티드의 순차적인 첨가에 의해 개시 폴리뉴클레오티드 서열의 양방향 연장을 조절함으로써 표적 폴리뉴클레오티드 서열의 어셈블리를 조절하여 접촉성 이중 가닥 폴리뉴클레오티드를 생성
    하도록 하는 지시를 포함하고,
    파싱은 알고리즘에 의해 수행되는 것으로서, 알고리즘은 다음을 포함하는 것인 컴퓨터 프로그램:
    $0verlap = <STDIN>;
    $seqlen = length ($sequence) ;
    }
    $revcomp = " ";
    for ($i = $seqlen-1 ; $i > = 0 ; $i--)
    { $base = substr ($sequence, $i, l) ;
    if ($base eq"a") {$comp ="T" ;}
    elsif ($base eq"t") {$comp ="A" ;}
    elsif ($base eq "g") {$comp = "C";}
    elsif ($base eq"c") {$comp ="G";}
    elsif ($base eq"A") {$comp ="T";}
    elsif ($base eq"T") {$comp ="A";}
    elsif ($base eq"G") {$comp = "C";}
    elsif ($base eq"C") {$comp = "G";}
    else {$comp ="X"} ;
    $revcomp = $revcomp. $comp;
    }
    print OUT "Forward oligos＼n" ;
    print "Forward oligos＼n" ;
    $r = 1 ;
    for ($i = 0; $i < = $seqlen-1 ; $i+=$OL)
    { $oligo = substr ($sequence, $i, $OL) ;
    print OUT "$oligname F-$r $oligo＼n" ;
    print "$oligname F-$r $oligo＼n" ;
    $r = $r + 1 ;
    }
    $r = 1;
    for ($i = $seqlen- $Overlap - $OL ; $i > = 0; $i-=$OL)
    {
    print OUT "＼n" ;
    print "＼n" ;
    $oligo = substr ($revcomp, $i, $OL) ;
    print OUT "$oligname R-$r $oligo" ;
    print "$oligname R-$r $oligo" ;
    $r = $r + 1;
    }
    $oligo = substr ($revcomp, l, $Overlap) ;
    print OUT "$oligo＼n" ;
    print "$oligo＼n" ;
    이때, $oligoname는 리스트 및 각 성분 #oligonucleotide의 동정자 이름이며,
    $OL은 각 성분 올리고뉴클레오티드의 길이이고,
    $Overlap 은 각 순방향 및 각 # 역방향 올리고뉴클레오티드 사이의 염기에서 중첩길이이며,
    $sequence는 염기의 DNA 서열이고,
    $seqlen는 염기의 DNA 서열의 길이이며,
    $bas는 서열의 개별 염기이고,
    $forseq는 순방향 올리고뉴클레오티드 서열이며,
    $revseq는 역방향 올리고뉴클레오티드 서열이고,
    $revcomp는 유전자의 역방향 상보된 서열이며,
    $oligonameF- []는 파싱된 순방향 올리고의 리스트이고,
    $oligonameR-[]는 파싱된 역방향 올리고의 리스트이다.
  42. 삭제
  43. 삭제
  44. 제41항에 있어서, 순방향 서열은 다음을 포함하는 알고리즘을 이용하여 어퍼케이스로 전환되는 것인 컴퓨터 프로그램:
    $forseq =" "
    for ($j = 0 ; $j < = seqlen-1; $j ++)
    { $bas = substr ($sequence, $j, l) ;
    if ($bas eq"a") {$cfor ="A";}
    elsif ($bas eq "t") {$cfor ="T";}
    elsif ($bas eq "c") {$cfor = "C";}
    elsif ($bas eq "g") {$cfor ="G";}
    elsif ($bas eq "A") {$cfor = "A";}
    elsif ($bas eq "T") {$cfor ="T";}
    elsif ($bas eq "C") {$cfor = "C";}
    elsif ($bas eq "G") {$cfor ="G";}
    else {$cfor = "X"};
    $forseq = $forseq. $cfor;
    print OUT "$j ＼n";
    이때, $seqlen는 염기의 DNA 서열의 길이이고,
    $bas는 서열의 개별 염기이며,
    $forseq는 순방향 올리고뉴클레오티드 서열이다.
  45. 다음의 단계를 포함하는, 프로세서, 입력 장치 및 출력 장치를 포함하는 프로그램된 컴퓨터를 이용하여, 모델 서열로부터 유래된 표적 폴리펩티드를 암호화하는 표적 폴리뉴클레오티드를 합성하는 컴퓨터 보조 방법:
    a) 입력 장치를 통해 표적 폴리펩티드를 암호화하는 표적 폴리뉴클레오티드 서열의 적어도 일부를 포함하는 데이터를 프로그램된 컴퓨터에 입력하는 단계;
    b) 프로세서를 이용하여, 표적 폴리뉴클레오티드 서열에 존재하는 1 이상의 개시 폴리뉴클레오티드의 서열 결정하는 단계;
    c) 프로세서를 이용하여, 생물학적 시스템에서 표적 폴리펩티드의 발현에 필요한 전체 서열 파라미터를 이용하여 표적 폴리뉴클레오티드 서열에서의 개시 서열의 위치를 근거로 표적 폴리펩티드 서열을 합성하기 위한 모델을 선택하는 단계; 및
    d) 출력 장치로 1 이상의 결정의 결과를 출력하는 단계.
  46. 제45항에 있어서, 프로세서를 이용하여, 표적 폴리뉴클레오티드에 대한 모델 서열의 변화가 모델 서열의 1 이상의 물리적, 구조적 또는 계통발생적인 특성을 근거로 표적 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화되는 표적 폴리펩티드에 효과를 가질 것인지 여부를 예측하는 것을 포함하는 것인 표적 폴리뉴클레오티드를 합성하는 컴퓨터 보조 방법.
  47. 다음을 포함하는, 표적 폴리뉴클레오티드 서열의 자동화된 합성 방법:
    a) 사용자에게 원하는 표적 폴리뉴클레오티드 서열에 접근(communicate)하기 위한 기회를 제공하는 단계;
    b) 사용자에게 원하는 표적 폴리뉴클레오티드 서열을 서버에 전달하게 하는 단계;
    c) 사용자에게 독특한 지시를 제공하는 단계;
    d) 사용자에 의해 제공된 전달된 표적 폴리뉴클레오티드 서열을 얻는 단계.
  48. 제47항에 있어서, 다음을 더 포함하는 것인 표적 폴리뉴클레오티드 서열의 자동화된 합성 방법:
    f) e)의 표적 폴리뉴클레오티드에 존재하는 1 이상의 개시 폴리뉴클레오티드를 동정하는 단계로서, 이때 개시 폴리뉴클레오티드는 5' 오버행 및 3' 오버행을 포함하는 부분적 이중 가닥 폴리뉴클레오티드을 생성하는 1 이상의 마이너스 가닥 올리고뉴클레오티드에 어닐링된 1 이상의 플러스 가닥 올리고뉴클레오티드를 포함하는 것인 단계;
    g) e)의 표적 폴리뉴클레오티드에 존재하는 제2 폴리뉴클레오티드를 동정하는 단계로서, 이때 제2 폴리뉴클레오티드는 5' 오버행, 3' 오버행 또는 5' 오버행과 3' 오버행으를 포함하는 부분적 이중 가닥 폴리뉴클레오티드을 생성하는 1 이상의 마이너스 가닥 올리고뉴클레오티드에 어닐링된 1 이상의 플러스 가닥 올리고뉴클레오티드를 포함하며 개시 폴리뉴클레오티드에 접촉하고, 제2 폴리뉴클레오티드의 1 이상의 오버행은 개시 폴리뉴클레오티드의 1 이상의 오버행에 상보적인 것인 단계;
    h) e)의 표적 폴리뉴클레오티드에 존재하는 제3 폴리뉴클레오티드를 동정하는 단계로서, 이때 제3 폴리뉴클레오티드는 개시 서열과 접촉하고, 5' 오버행, 3' 오버행 또는 5' 오버행과 3' 오버행를 포함하는 부분적 이중 가닥 폴리뉴클레오티드을 생성하는 1 이상의 마이너스 가닥 올리고뉴클레오티드에 어닐링된 1 이상의 플러스 가닥 올리고뉴클레오티드를 포함하며, 제3 폴리뉴클레오티드의 1 이상의 오버행은 제2 폴리뉴클레오티드의 오버행에 상보적이지 않은 개시 폴리뉴의 1 이상의 오버행에 상보적인 것인 단계; 및
    i) 어닐링에 적합한 시간 동안 그리고 적합한 조건하에서 g)의 제2 폴리뉴클레오티드 및 h)의 제3 폴리뉴클레오티드와 f)의 개시 폴리뉴클레오티드를 접촉시키는 단계로서, 상기 접촉은 접촉성 이중 가닥 폴리뉴클레오티드를 생성하고, 이때 개시 서열은 양방향으로 연장되는 것인 단계.
  49. 제47항에 있어서, 다음의 단계를 더 포함하는 것인 표적 폴리뉴클레오티드 서열의 자동화된 합성 방법:
    f) e)의 표적 폴리뉴클레오티드에 존재하는 1 이상의 개시 폴리뉴클레오티드를 동정하는 단계로서, 개시 폴리뉴클레오티드는 1 이상의 마이너스 가닥 올리고뉴클레오티드에 어닐링된 1 이상의 플러스 가닥 올리고뉴클레오티드를 포함하는 것인 단계;
    g) 개시 폴리뉴클레오티드의 플러스 가닥의 3' 부분에 부분적 상보성을 가지는 제1 올리고뉴클레오티드 및 개시 폴리뉴클레오티드의 마이너스 가닥의 3'부분에 부분적 상보성을 가지는 제2 올리고뉴클레오티드와 프라이머 어닐링하기에 적합한 조건하에서 개시 폴리뉴클레오티드를 접촉시키는 단계;
    h) 프라이머 연장에 적합한 조건하에서 1) 개시 폴리뉴클레오티드의 플러스 가닥의 3'-히드록실로부터 폴리뉴클레오티드 합성; 2) 어닐링된 제1 올리고뉴클레오티드의 3'-히드록실로부터 폴리뉴클레오티드 합성; 3)개시 폴리뉴클레오티드의 마이너스 가닥의 3'-히드록실로부터 폴리뉴클레오티드 합성; 및 4) 어닐링된 제2 올리고뉴클레오티드의 3'-히드록실로부터 폴리뉴클레오티드 합성을 촉매하는 단계로서, 이때 개시 서열을 양방향 연장시킴으로써 초기의 연장된 개시 폴리뉴클레오티드를 형성하는 단계;
    i) 연장된 개시 폴리뉴클레오티드의 플러스 가닥의 3' 부분에 부분적 상보성을 가지는 제3 올리고뉴클레오티드 및 연장된 개시 폴리뉴클레오티드의 마이너스 가닥의 3' 부분에 부분적 상보성을 가지는 제4 올리고뉴클레오티드와 프라이머 어닐링에 적합한 조건하에서 h)의 연장된 개시 폴리뉴클레오티드를 접촉시키는 단계; 및
    j) 프라이머 연장에 적합한 조건하에서, 1) 연장된 개시 폴리뉴클레오티드의 플러스 가닥의 3'-히드록실로부터 폴리뉴클레오티드 합성; 2) 어닐링된 제3 올리고뉴클레오티드의 3'-히드록실로부터 폴리뉴클레오티드의 합성; 3) 연장된 개시 폴리뉴클레오티드의 마이너스 가닥의 3'-히드록실로부터 폴리뉴클레오티드 합성; 및 4) 어닐링된 제4 올리고뉴클레오티드의 3'-히드록실로부터 폴리뉴클레오티드 합성을 촉매하여 연장된 개시 서열을 양방향 연장시킴으로써 초기 연장된 개시 폴리뉴클레오티드를 형성하는 단계.
  50. 다음을 포함하는, 폴리뉴클레오티드의 자동화된 합성 방법:
    a) 사용자에게 모델 폴리뉴클레오티드 서열에 접근하기 위한 메카니즘을 제공하는 단계;
    c) 사용자에게 모델 서열 및 원하는 변경을 서버에 전달하게 하는 단계;
    d) 사용자에게 독특한 지시를 제공하는 단계;
    e) 사용자에 의해 제공된 원하는 변경 및 전달된 모델 서열을 수득하는 단계;
    f)입력 장치를 통해 프로그램된 컴퓨터로 모델 폴리뉴클레오티드 서열의 적어도 일부를 포함하는 데이터를 입력하는 단계;
    g) 프로세서를 이용하여 원하는 변경을 포함하는 모델 폴리뉴클레오티드 서열의 서열을 결정하는 단계;
    h) 프로세서를 이용하여 모델 폴리뉴클레오티드 서열에 존재하는 1 이상의 개시 폴리뉴클레오티드 서열을 더 결정하는 단계;
    i) 프로세서를 이용하여, 모델 폴리뉴클레오티드 서열중의 개시 서열의 위치를 근거로 변경된 모델 폴리뉴클레오티드 서열을 합성하기 위한 모델을 선택하는 단계; 및
    j) 출력 장치로 1 이상의 결정 결과를 출력하는 단계.
  51. 삭제
  52. 삭제
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