KR100832860B1 - 호흡기 바이러스 검출용 올리고뉴클레오타이드 및 ｄｎａ칩 - Google Patents

호흡기 바이러스 검출용 올리고뉴클레오타이드 및 ｄｎａ칩 Download PDF

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Abstract

본 발명은 바이러스 감염을 진단하기 위한 DNA 칩에 관한 것이다. 상세하게는, 본 발명은 8종의 호흡기바이러스를 동시에 진단할 수 있는 다목적 DNA 칩에 관한 것이다. 본 발명의 DNA 칩은 바이러스 아형분석을 위한 후속적인 PCR 과정과 염기서열 분석 과정을 생략함으로써 보다 신속한 진단이 가능하며 감수성 및 특이성이 매우 뛰어나다.
DNA 칩, 호흡기바이러스, 진단

Description

호흡기 바이러스 검출용 올리고뉴클레오타이드 및 ＤＮＡ 칩 {Oligonucleotide and DNA chip for detecting respiratory viral pathogen}
도 1은 본 발명의 DNA 칩을 사용하여 호흡기바이러스를 검출한 결과를 도시한 것이다.
도 2는 본 발명의 DNA 칩을 사용하여 표준 호흡기바이러스를 진단한 결과를 도시한 것이다.
도 3은 본 발명의 DNA 칩을 사용하여 표준 호흡기바이러스를 진단한 결과를 도시한 것이다. 액틴 (actin)을 양성 대조군으로 사용하였다.
도 4는 본 발명의 DNA 칩의 재현성을 실험한 결과를 도시한 것이다.
1. 감염병실험실진단 질환별시험법 제 4부 바이러스질환 645-999. (2005)
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기술분야
본 발명은 바이러스 감염진단을 위한 DNA 칩에 관한 것이다. 상세하게는, 본 발명은 8종의 호흡기바이러스를 동시에 진단할 수 있는 다목적 DNA 칩에 관한 것이다.
종래기술
감염질환의 원인 병원체를 찾는 전통적인 방법은 예측 가능한 또는 관련성을 배제하기 위한 원인체를 진단하는 각각의 방법을 적용하는 것이다. 전통적으로 바이러스 진단을 위해서는 세포배양에 의한 바이러스 분리 또는 IFA (immunofluorescence assay)와 EIA (enzyme immunoassay) 등 면역반응에 의한 항원 항체 탐지를 적용해 왔다. 바이러스 진단에서의 중요한 요소는 감도와 특이도, 편리성과 신속성이라고 할 수 있다. 최근까지 이러한 중요한 요소를 충족하기 위한 새로운 진단방법과 진단제의 개발이 이루어져서 감도와 특이도 면에서 크게 개선되었고 또한 편리성과 신속성에 있어서도 많은 발전이 이루어졌다 (상기 문헌: 1). 그러나 다양한 바이러스 유형 (Type) 및 아형 (subtype), 새로운 유형확인, 및 같은 증상을 유발하는 다양한 바이러스의 구분 진단 등은 많은 제한점을 갖고 있다.
최근에 중합효소 연쇄반응 (polymerase chain reaction, PCR) 방법이 바이러스 진단에 도입되면서 바이러스 진단의 감도 향상과 더불어 멀티플렉스 (multiplex) PCR 방법과 혼합염기 프라이머(degenerate primer)를 이용한 동시진단의 적용범위가 확대되었다 (상기 문헌: 2). 그러나 바이러스의 타입과 서브타입을 구분하기 위해서는 PCR을 수행한 후 염기서열 분석, 혼성화 블로팅 (hybridization blotting) 등 많은 시간과 노력이 필요하다. 더구나 이러한 방법도 PCR에 사용되는 프라이머 (primer)에 의한 증폭 대상의 한계에 제한을 받게 된다 (상기 문헌: 3). 따라서 이러한 동시진단과 타입 구분 진단의 목적에 부합되는 진단제 개발로 DNA 칩 (chip)의 개발이 가장 유력한 방법 중 하나로 주목받고 있다 (상기 문헌: 4 및 5).
현재 개발되어 사용되는 바이러스 진단을 위한 DNA 칩은 HPV, HBV, 등과 같은 고위험 바이러스에 국한되어 개발되어있다. 이러한 DNA 칩 진단의 경우 환자의 검체로부터 유전자를 추출하고 그 유전자를 진단용 PCR로 증폭하며 표지 (labelling) 한 후 칩에서 혼성화 (hybridization) 하는 방법을 사용하고 있는데, 이 방법은 병원체 진단에 있어서 매우 중요한 요소인 신속함에 있어서 기존의 유전자 진단법인 PCR 후에 다시 혼성화 하는 방법을 적용함으로 기존의 유전자 진단법 보다 떨어진다. 또한 민감도 면에 있어서는 유전자 진단법을 그대로 적용하고 그것을 확인함으로 기존의 진단법에서 특이하게 달라진 것이 없다. 또한 현재 DNA 칩을 확인하는 방법으로는 형광 염료를 유전자 증폭과정에서 끼어 넣어 형광으로 확인하는 방법을 일반적으로 이용하는데 이러한 형광 염료의 경우 일반적인 진단법에서 요구되는 비용보다 매우 고가이기 때문에 비용 면에서도 많은 문제점을 가지고 있다.
그러나 위에서 언급한 여러 가지 문제점에도 불구하고 DNA 칩을 바이러스 진단에 적용하고자하는 가장 중요한 이유는 동시에 매우 다양한 바이러스를 확인할 수 있는 DNA 칩 특성을 이용하고자 하는 것이다. 그러나 종래에는 DNA 칩 분석을 통해서는 아형분석을 동시에 수행하는데 한계가 있으며, 아형분석을 위해서는 별도의 후속하는 PCR과 염기서열 분석을 진행해야만 했다. 따라서 이러한 기존의 DNA 칩의 한계를 극복하기 위해서는 PCR 방법을 생략하는 방법의 개발, 아형분석이 가능한 공동의 프라이머 개발, 공동 프라이머를 사용한 멀티플렉스 (multiplex) 적용 등이 이루어져야하며 이러한 제한점을 극복하려는 다양한 시도가 이루어지고 있다 (상기 문헌: 7). 또한 이러한 다양한 시도를 검증하기 위해서는 DNA 칩에 올리는 프로브의 특이도와 감도에 대한 사전 검색 시스템이 필요하다. 그 이유는 DNA 칩 제작은 고가이므로 모든 실험을 칩을 제작하여 실험한다면 비용효과 면에서 매우 효율적이지 못하며, 또한 이러한 검색 시스템 자체가 하나의 진단법으로 개발 될 수 있기 때문이다.
이에 본 발명자들은 인체에 다양한 질병을 유발하는 바이러스를 진단하기 위한 DNA 칩으로 유사한 임상증상을 나타내는 바이러스의 구분 진단, 유행하는 바이러스의 유전자형 또는 혈청형을 1회의 DNA 칩 분석에 의해 구분하기 위한 DNA 칩을 개발하려는 연구의 일환으로, 감별진단이 어려운 호흡기바이러스를 대상으로 이러한 용도의 칩 개발의 가능성과 효용성을 검증하고, 현재 시중에 보급되고 있는 PCR 단계를 포함하는 DNA 칩 방법의 제한점을 개선하기 위해 형광성 표지 (Fluorscent labelling) cDNA를 이용한 마이크로어레이 (microarray) (상기 문헌: 6) 결과를 보고한다.
본 발명은 호흡기 바이러스 감염진단을 위한 올리고뉴클레오타이드를 제공하 는 것을 목적으로 한다.
또한 본 발명의 목적은 호흡기 바이러스 감염진단을 위한 DNA 칩을 제공하는 것이다.
또한 본 발명의 목적은 호흡기 바이러스 검출용 진단 키트를 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 국내에서 발생하는 주요 바이러스성 질환의 원인 바이러스의 유형 및 아형을 1회의 DNA 칩 분석을 통해 결정하고 새로운 유형의 바이러스를 동시에 진단할 수 있는 다목적 DNA 칩 진단제를 개발하였다.
본 발명자들은 8종의 호흡기 바이러스 (PIV 1 (C-35), PIV 2 (Greer), PIV 3 (C-243), RSV A (Long), RSV B (CH-18537), HCoV (229E, OC43), SARS)를 연구 대상 바이러스로 사용하였다. 본 발명자들은 상기 8종의 호흡기 바이러스를 교차 반응 없이 검출하기 위해 특이적인 프로브 서열을 합성하였다. 바이러스의 RNA는 키트 (QIAmp Viral Mini Kit, Qiagen)를 사용하여 분리하고 정제하였다. 정제된 RNA로부터 RT-PCR을 통해 cDNA를 합성하는 과정에서 dTTP 대신에 Cy5-dUTP를 삽입하는 방법으로 형광 염료를 표지하였다.
이와 같이 본 발명은 종래의 DNA 칩의 최대 단점인 PCR 증폭 단계를 생략하고 cDNA를 적용하는 시스템을 개발하였다. 본 발명은 임상적 또는 역학적으로 연관이 있는 바이러스성 질환의 종합적인 진단체계 개발에 유용하며 원인병원체의 신속 정확한 진단을 위해 사용될 수 있다.
이하 실시예에 기초하여 본 발명을 기술한다. 하기 실시예들은 본 발명을 예시하고자 하는 것으로, 본 발명을 제한하고자 하는 것이 아니다. 본 발명에 개시된 모든 문헌은 참조로서 통합된다.
실시예
실시예 1: 표준주 및 임상분리주
호흡기 바이러스는 파라인플루엔자바이러스 (Parainfluenzavirus) 1(C-35),PIV1 (입수처: 미국종균협회 VR-94); 파라인플루엔자바이러스 2 (Greer), PIV2 (입수처: 미국종균협회 VR-92); 및 파라인플루엔자바이러스 3 (C-243), PIV3 (입수처: 미국종균협회 VR-93)를 LLC-MK2 세포 (입수처: 미국종균협회 CCL-7)에서 배양하여 사용하였고, RSV (Respiratory syncytial virus) A (Long) (입수처: 미국종균협회 VR-1540) 및 RSV B(CH-18537) (입수처: 미국종균협회 VR-1401)는 Hep-2 세포 (입수처: 미국종균협회 CCL-23)에, 그리고 코로나바이러스 (Coronavirus) 229E, HcoV (229E) (입수처: 미국종균협회 VR-740)와 OC43, HcoV (OC43) (입수처: 미국종균협회 VR-1558)은 MRC-5 (입수처: 미국종균협회 CCL-171)에, SARS-코로나바이러스 (Coronavirus), SARS (입수처: 미국CDC)는 Vero 세포 (입수처: 미국종균협회 CCL-81)에서 각각 37 ℃에서 7일간 배양하였다.
실시예 2: 유전자형 구분을 위한 프로브 (probe) 고안
유전자형을 구분하기 위한 프로브 선정 시 프로브의 길이, Tm (melting temperature) 값 (50-60 ℃), 혈청형 간에 미스매치 (mismatch) 염기수가 3개 이상 될 것, 헤어핀 (hairpin) 구조를 형성하지 말 것 등의 사항들을 고려하여 프로브를 제작하였다. 올리고 DNA는 DNA 합성기 (synthesizer) (제조사: Hokkaido System Science Co., Ltd)로 합성하였으며 HPLC (High Performance Liquid Chromatography) (제조사: Hokkaido System Science Co., Ltd)을 통해서 정제하였다. 각 바이러스의 분석대상 유전자 부위 및 고안된 프로브들을 표 1에 기재하였다.
표 1. 바이러스 특이 50bp 올리고뉴클레오타이드 프로브 서열
바이러스 서열 (5'-3') 표적 유전자
PIV1 CACACACTTAGTGTCGCCTTGGAGCGGAGTTGTTAAGCCACCGTACCCTA (서열번호: 1) HA
PIV2 TAGATCAGTTGTGGCATAATCTTCTTTCTCAGATCTTGTAGCTACATAGC (서열번호: 2) HA
PIV3 TCCATTTGGACATGAATGTCCCCATGGACATTCATCGTTTCCTGGTCTTG (서열번호: 3) HA
RSV A ATAATAATGATGCTTTTGGGTTGTTCAATATATGGTAGAATCCTGCTTCA (서열번호: 4) N
RSV B AAGATTCCTTCAACTCTACTACCCCCTCTTGTGGATGATTGTGCAATGCC (서열번호: 5) N
HcoV (229E) ATTGGGCCTTTGTTGCATTTAGCCTTCTTATGGCCGTATCAACACTCGTT (서열번호: 6) M
HcoV (OC43) TACTCTGACGGTCACAATAATACGCGGCCATCTTTACATTCAAGGTATAA (서열번호: 7) M
SARS ATGCTGCCACCGTGCTACAACTTCCTCAAGGAACAACATTGCCAAAAGGC (서열번호: 8) N
실시예 3: DNA 마이크로어레이 (microarray) 제작
DNA 마이크로어레이를 위한 슬라이드는 아민기가 코팅된 GAPSⅡ 슬라이드 (제조사: Corning co) 제품을 사용하여 HPLC 정제된 프로브를 50 pmol/㎕의 농도로 스포팅 하였다. 스포터 (Spotter)는 OmniGrid 100 (제조사: GenMachine)을 사용하였으며, 각 스폿 (Spot)의 크기는 약 200㎛ 정도로 서브어레이 (subarray)의 크기는 약 25,000um 이다. GenePix Scanarray 5000B (Axon사)를 이용하여 슬라이드의 스폿 상태를 확인한 후 80℃ 건식 오븐 (dry oven)에서 10분간 탈수 시킨 후 슬라이드 상에서 반응하지 않고 남아 있는 프로브를 제거하기 위해 0.1% SDS에서 3분간 세척 후 증류수로 3회 세척하였다. 준비된 슬라이드를 환원 용액 (PBS 중 25% 에탄올, 0.3% 수소화붕소나트륨) 에서 5분간 반응시킨 후 95℃ 증류수에서 3분간 반응시킨 후 차게한 에탄올로 세척 후 상온에서 500rpm으로 1분 30초간 원심을 이용하여 건조 하였다.
실시예 4: 바이러스 RNA 추출
바이러스의 RNA는 키트 (QIAmp Viral Mini Kit, Qiagen)를 사용하여 분리하고 정제하였다. 바이러스 배양액 200㎕에 세포용해 완충액 560㎕ 첨가 후 실온에서 10분간 용해 시켰다. 100% 에탄올을 첨가 후 정제 컬럼에 옮긴 후 8,000rpm으로 실온에서 1분간 원심분리하였다. 컬럼에 걸러진 바이러스 RNA에 첫 번째 세척액을 넣고 8,000rpm으로 실온에서 1분간 원심분리 후 두 번째 세척액을 넣고 13,000rpm으로 실온에서 3분간 원심분리 후 용리 완충액 40㎕을 넣고 8,000rpm으로 실온에서 1분간 원심분리 하여 정제 하였다.
실시예 5: cDNA 합성, 형광 표지 및 정제
바이러스 유전자로부터 cDNA를 합성과 형광 표지를 하기 위해서는 랜덤 헥사머 (random hexamer)와 올리고 dT (oligo dT) 어댑터를 이용하였다. 반응을 위해서는 바이러스 RNA 20㎕에 올리고(dT)20 프라이머 2㎕, 랜덤 헥사머 1㎕ 넣은 후 DEPC 처리 증류수로 25㎕ 맞춘 후 70℃ 변성 후 얼음에 정치시켰다. 5X 완충액 6㎕, 0.1M DTT 1.5㎕, low dT dNTP 믹스 (mix) (25mM dATP, dCTP, dGTP 및 10mM dTTP) 1.5㎕, AMV 역전사효소 (reverse transcriptase) (400U/㎕l) 1㎕, RNase 억제제 (inhibitor) (40U/㎕l) 0.5㎕, Cy5-dUTP 1㎕, DEPC 처리 증류수를 넣어 30㎕ 로 조정하여 46℃에서 2시간 동안 DNA를 합성과 형광 표지를 실시하였다. 남아 있는 RNA 가수분해는 0.5M EDTA 5㎕와 1N NaOH 10㎕를 가하여 65℃ 10분간 반응 시키고 1M Tri-HCl (pH7.5) 25㎕를 첨가 하여 중화 시켰다. cDNA의 정제는 Clonethech (USA)사는 CHROMA Spin TE100 컬럼을 사용하여 3,500rpm 으로 5분 동안 원심분리하여 정제 하였고 에탄올 침전법에 의해 정제 하였다. 1/10 부피의 아세트산나트륨 (sodium acetate) 10㎕과 2.5배 부피의 에탄올 250㎕을 첨가하여 혼합한 후 -80℃에서 15분 이상 반응 후 14,000rpm 으로 4℃에서 15분간 원심분리하고 상층액을 제거한 후 70% 에탄올 1ml를 넣고 14,000rpm 으로 4℃에서 15분간 원심분리하고 상층액을 제거한 후에 건조시켰다.
실시예 6: 마이크로어레이 혼성화
상기 실시예 5에서 침전 시킨 cDNA 침전물을 혼성화 (hybridization) 완충용액 (20X SSC 7.5㎕, 0.2% SDS 0.5㎕, 50X 덴하르트 용액 (Denhardt's solution) 2.5㎕, 10x 사람 c0t1 게놈 DNA 2.5㎕)에 넣고 잘 섞은 후 95℃에서 5분간 가열하여 선형으로 변성시키고 이를 슬라이드에 넣고 50℃에서 2시간 동안 혼성화 하였다. 반응이 끝난 후 마이크로어레이 슬라이드를 2X SSC/0.2% SDS로 15분간 2회 세척하였다. 린스는 0.05X SSC로 실온에서 5분간 세척하고 슬라이드를 원심분리 (500 rpm, 24℃, 2분)하여 건조하였다. 마이크로어레이의 스캔은 GenePix Scanarray 5000B scanner (Axon Instruments사)를 사용 하였고 분석은 GenePix pro 4.1 소프트웨어를 사용 하였다.
실시예 6: 진단키트
본 발명은 8종의 호흡기 바이러스의 HA, N 또는 M 유전자를 표적으로 하는 서열번호: 1 내지 서열번호: 8로 구성되는 군으로부터 선택되는 올리고 뉴클레오타이드로 구성되는 프로브가 슬라이드 상에 고정되어 있는 (스포팅된) DNA 칩 및 상기 DNA 칩의 상기 프로브와 검체로부터 수득된 시료 RNA로부터 합성된 cDNA의 혼성화를 탐지할 수 있는 수단으로 cy6-dUTP 를 포함하여, PIV1, PIV2, PIV3, RSV A, RSV B, HcoV (229E), HcoV (OC43) 및 SARS 바이러스를 동시에 진단할 수 있는 진단키트를 제공한다.
본 발명의 진단키트를 이용하여, 호흡기 바이러스 감염 의심 환자 (피검자)에 대해 바이러스 감염여부를 진단하는 방법은 다음과 같다. 피검자로부터 채취한 검체 (여기서, 검체는 피검자의 비강세척액, 인후도말액, 대변 또는 혈액이다)를 수거하여 감염 바이러스의 총 RNA를 추출하고, 역전사를 실시하는 과정에서 cy5-dUTP를 표지하고 cDNA를 정제한 다음, 혼성화 완충용액 (hybridization buffer)로 처리하여 슬라이드상의 프로브와 혼성화시키고 이 슬라이드를 세척 처리한 다음, 마이크로어레이의 스캔은 GenePix Scanarray 5000B scanner (Axon Instruments사)를 사용 하고 분석은 GenePix pro 4.1 소프트웨어를 사용하였다. 관찰결과, 배경신호 (background signal)에 비해 2배 이상인 경우에는 양성으로 판정하였다.
본 발명의 진단 키트는 8종의 호흡기 바이러스의 감별진단을 위한 표적 DNA 서열에 특이적인 올리고뉴클레오타이드 프로브 (서열번호: 1 내지 서열번호: 8)를 이용한다.
결과
바이러스 진단을 위한 칩으로 HcoV, SARS, RSV, PIV 등 호흡기 바이러스용 동시 진단 칩을 개발하였고, DNA 칩의 제한점으로 작용하는 후속적인 PCR 단계와 염기서열 분석을 생략하는 방법으로 개선하였다.
도 1에 도시한 바와 같이, 본 발명의 DNA 칩에 의해 호흡기 바이러스 중에서 PIV1, PIV2, PIV3, RSV A, RSV B, HcoV (229E), HcoV (OC43) 및 SARS를 동시에 감별진단할 수 있었다.
상기 실시예들에 기술된 방법으로 제작된 호흡기 바이러스 감별진단 DNA 칩의 특이도 평가를 위하여 각각의 표준 바이러스를 이용하여 DNA 칩 검사를 수행하였다. DNA 칩 결과는 도 2와 같다. 표준바이러스를 각각 적용한 결과 해당 프로브 위치에서 양성 결과를 나타내었고 다른 바이러스와의 교차반응을 나타내지 않았다 (도 2 참조).
본 발명의 방법은 후속적인 PCR 과정을 생략하고 RNA 바이러스의 역전사 과정시 표지하는 방법을 적용하여 기존의 진단용 DNA 칩의 단점을 해소하는 신속한 진단용 DNA 칩의 가능성을 확인하였다.
본 발명의 DNA 칩에 표준바이러스를 각각 적용한 결과 해당 프로브 위치에서 배경신호 (background signal)에 비해 2배이상 결과를 양성으로 판정한 결과 여덟 개의 표준 바이러스 시료 모두 정확하게 바이러스가 검출되었다. 또한 교차반응은 일어나지 않아 칩 상에 나타난 유전형 또한 표준바이러스 유전형과 일치하여 높은 특이도를 나타내었다. 표준바이러스를 이용하여 DNA 칩 검증실험은 여러번 반복실험을 통하여 재현성을 확인하였다 (도 3 참조).
DNA 칩의 민감도는 HcoV (OC43)으로 평가하였으며, 128 HA 유닛까지 검출이 되었다. 또한 DNA 칩의 재현성은 HcoV (229E), RSV A, PIV 2 샘플을 가지고 3번의 독립적인 칩을 사용하여 확인하였으며, 프로브들의 서열 또는 바이러스 농도의 차이에 따라 신호 (signal)의 정도가 차이가 있으나 표준편차의 오차의 범위는 25%이내를 나타냈다 (도 4 참조).
본 발명에 따른 DNA 칩은 8종의 호흡기 바이러스 감염을 진단함에 있어, 상기 8종의 호흡기 바이러스 간에 교차반응이 일어나지 않으며 따라서 감수성 및 특이성이 매우 뛰어나다.
이상 살펴본 바와 같이, 본 발명의 DNA 칩은 감수성 및 특이성이 우수하며, DNA 칩 실험시 에 후속적인 PCR 과정을 생략함으로써 신속하게 PIV1, PIV2, PIV3, RSV A, RSV B, HcoV (229E), HcoV (OC43) 및 SARS 바이러스 감염을 진단할 수 있다. 따라서, 본 발명의 DNA 칩은 상기 바이러스 감염에 대한 진단시약 또는 진단키트 제조 등에 매우 유용하게 이용될 수 있다.
서열목록 전자파일 첨부

Claims (5)

  1. 서열번호: 1 내지 서열번호: 8의 염기서열을 갖는 올리고 뉴클레오타이드 프로브가 슬라이드 상에 고정된, 호흡기바이러스 검출용 올리고 뉴클레오타이드 DNA 칩.
  2. 제 1항에 있어서, 서열번호: 1 내지 서열번호: 8의 올리고 뉴클레오타이드 프로브는 각각 PIV1의 HA 유전자, PIV2의 HA 유전자, PIV3의 HA 유전자, RSV A의 N 유전자, RSV B의 N 유전자, HcoV (229E)의 M 유전자, HcoV (OC43)의 M 유전자, 및 SARS의 N 유전자와 특이적으로 결합됨을 특징으로 하는 올리고 뉴클레오타이드 DNA 칩.
  3. 서열번호: 1 내지 서열번호: 8의 염기서열을 갖는 올리고 뉴클레오타이드 프로브가 슬라이드 상에 고정된, 호흡기바이러스 검출용 올리고 뉴클레오타이드 DNA 칩; 및 상기 DNA 칩의 상기 프로브와 검체로부터 수득된 시료 RNA로부터 합성된 cDNA의 혼성화 반응을 탐지할 수 있는 표지수단을 포함하는 호흡기바이러스 검출용 진단 키트.
  4. 제 3항에 있어서, 서열번호: 1 내지 서열번호: 8의 올리고 뉴클레오타이드 프로브는 각각 PIV1의 HA 유전자, PIV2의 HA 유전자, PIV3의 HA 유전자, RSV A의 N 유전자, RSV B의 N 유전자, HcoV (229E)의 M 유전자, HcoV (OC43)의 M 유전자, 및 SARS의 N 유전자와 특이적으로 결합됨을 특징으로 하는 진단 키트.
  5. 제 3항에 있어서, 표지수단은 cy5-dUTP를 포함하는 형광물질임을 특징으로 하는 진단 키트.
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