KR101058820B1 - 유전자 서열 분석용 다중 중합효소 연쇄 반응 - Google Patents

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Abstract

PCR 방법은 병원체 핵산을 하나 이상의 포함하는 것으로 의심되는 생물학적 샘플을 제공하는 단계; 병원체 내에서 확인된 유전자에 상응하는 복수의 PCR 프라이머를 첨가하는 단계; 및 샘플 상에서 중합효소 연쇄 반응을 수행하여 상기 유전자에 상응하는 핵산의 서브세트를 증폭시키는 단계를 포함한다. 상기 프라이머는 각 병원체에 대한 하나 이상의 프라이머 쌍을 포함하고, 샘플 내 임의 병원체 DNA 또는 임의 백그라운드 DNA와 상동성이 없는 테일 서열을 포함한다. 상기 중합효소 연쇄 반응에서 하나 이상의 프라이머 농도는 약 100 nM보다 높지 않다.

Description

유전자 서열 분석용 다중 중합효소 연쇄 반응{MULTIPLEXED POLYMERASE CHAIN REACTION FOR GENETIC SEQUENCE ANALYSIS}
본 출원은 미국 가출원 60/691,768호(2005년 6월 16일 출원); 60/735,876호(2005년 11월 14일 출원); 60/735,824호(2005년 11월 14일 출원); 및 60/743,639호, (2006년 3월 22일 출원), 및 미국 특허 출원 11/422,425호(2006년 6월 6일 출원) 및 11/422,431호(2006년 6월 6일 출원)를 우선권으로 주장한다. 본 출원은 미국 특허 출원 11/177,647호(2005년 7월 2일 출원); 11/177,646호(2005년 7월 2일 출원); 및 11/268,373호(2005년 11월 7일 출원)의 일부계속출원이다. 상기 정규 출원은 미국 가출원 60/590,931호(2004년 7월 2일 출원); 60/609,918호(2004년 9월 15일 출원); 60/626,500호(2004년 11월 5일 출원); 60/631,437호(2004년 11월 29일 출원); 및 60/631,460호(2004년 11월 29일 출원)를 우선권으로 주장한다.
기술분야
본 발명은 일반적으로 복수의 유전자 표적의 증폭 방법 및 마이크로어레이를 사용한 증폭된 생성물의 분석법에 관한 것이다.
인간에 있어서 급성 호흡기 감염(ARI)을 유발하는 감염성 병원체의 정확하고 신속한 동정은 호흡기 질병의 성공적인 치료, 적절한 발발 조절 조치의 적용, 및 고가의 항생제 및 항바이러스제의 효율적 사용에 있어서 중요한 요인이 될 수 있다. 하지만, ARI의 임상적 감별 진단은 어려움이 있는데, 그 이유는 상이한 병원체에 의해 야기되는 증상의 유사성 및 상기 병원체의 수 및 생물학적 다양성 때문이다. 최근, 호흡기 병원체 동정을 위해 가장 광범위하게 사용되는 방법은 배양, 면역측정법, 및 RT-PCR/PCR 분석법이다. 배양 및 면역측정 기술은 통상 특정 병원체에 특이적이라서, 종 그리고 때때로 혈청형 수준에서 의심되는 하나의 병원체의 검출에만 국한된다. 대조적으로, 핵산을 기초로 하는 기술, 예컨대 RT-PCR/PCR은 다목적성으로써, 배양이 까다로운(fastidious) 또는 그렇지 않은 경우 배양이 어려운 유기체(organism)를 비롯한 모든 병원체의 검출에서 높은 감도를 제시한다. PCR의 다목적 성질로 인해, 이 기술은 복수의 병원체에 동시에 적용하여 특정 병인론(etiology)을 구축하는 기회를 증가시키고(McDonough et al., "A multiplex PCR for detection of Mycoplasma pneumoniae, Chlamydophila pneumoniae, Legionella pneumophila, and Bordetella pertussis in clinical specimens" Mol. Cell Probes, 19, 314-322 (2005)) 하나 이상의 병원체를 포함하는 동시감염을 정확하게 검출할 수 있다(Grondahl et al., "Rapid identification of nine microorganisms causing acute respiratory tract infections by single-tube multiplex reverse transcription-PCR: feasibility study" J. Clin. Microbiol., 37, 1-7 (1999)).
ARI 병원체가 징후학적으로 비특이적일 수 있기 때문에 복수의 방법으로 하나의 반응 내에서 여러개의 유기체를 검출하는 방법이 바람직하다. 따라서, 한번에 하나의 병원체를 분석하는 방법은 비효율적이며, 가능한 동시감염에 대한 정보를 제공하지도 않는다. 몇몇의 다중 RT-PCR/PCR 테스트들이 이를 해결하기 위해 개발되었으나(McDonough; Grondahl; Puppe et al., "Evaluation of a multiplex reverse transcriptase PCR ELISA for the detection of nine respiratory tract pathogens" J. Clin. Virol., 30, 165-174 (2004); Bellau-Pujol et al., "Development of three multiplex RT-PCR assays for the detection of 12 respiratory RNA viruses" J. Virol. Methods, 126, 53-63 (2005); Miyashita et al., "Multiplex PCR for the simultaneous detection of Chlamydia pneumoniae, Mycoplasma pneumoniae and Legionella pneumophila in community-acquired pneumonia" Respir. Med., 98, 542-550 (2004); Osiowy, "Direct detection of respiratory syncytial virus, parainfluenza virus, and adenovirus in clinical respiratory specimens by a multiplex reverse transcription-PCR assay" J. Clin. Microbiol., 36, 3149-3154 (1998); Verstrepen et al., "Rapid detection of enterovirus RNA in cerebrospinal fluid specimens with a novel single-tube real-time reverse transcription-PCR assay" J. Clin. Microbiol., 39, 4093-4096 (2001); Coiras et al., "Simultaneous detection of fourteen respiratory viruses in clinical specimens by two multiplex reverse transcription nested-PCR assays" J. Med. Virol., 72, 484-495 (2004); Coiras et al., "Oligonucleotide array for simultaneous detection of respiratory viruses using a reverse-line blot hybridization assay" J. Med. Virol., 76, 256-264 (2005); Gruteke et al., "Practical implementation of a multiplex PCR for acute respiratory tract infections in children" J. Clin. Microbiol., 42, 5596-5603 (2004)), 상기 방법은 최근 앰플리콘 검출 방법의 판별력에 의해 제한된다. 겔을 기초로 하는 분석 방법은 병원체의 생성물이 크기에 의해서만 판별되는 한정된 수의 병원체에 제한되는 경향이 있는 한편, 리얼 타임 PCR과 같은 형광 리포터 시스템은 명확하게 분리될 수 있는 형광 피크의 수(3개 또는 4개 이하)에 의해 제한된다. 따라서, 다수의 잠재적 원인이 있는 질병 증후군, 예컨대 ARI에 대한 원인이 되는 병원체의 신속한 구별 및 동정이 가능한 진단 분석법이 필요한 실정이다.
RT-PCR/PCR 방법에 의해 동시에 보다 많은 병원체들을 검출할 수 있는 소수의 기술들이 개발되었다. MASSCODETM 다중 RT-PCR 시스템에 의해 최대 22개의 호흡기 병원체의 다중 동정이 실현되었다(Briese et al., "Diagnostic system for rapid and sensitive differential detection of pathogens" Emerg. Infect. Dis., 11, 310-313 (2005)). 또한 스팟 (특히 긴-올리고뉴클레오티드) 마이크로어레이는 다중 PCR 분석 도구로서 다소 성공적으로 사용되었다(Roth et al., "Use of an oligonucleotide array for laboratory diagnosis of bacteria responsible for acute upper respiratory infections" J. Clin. Microbiol., 42, 4268-4274 (2004); Chizhikov et al., "Microarray analysis of microbial virulence factors" Appl. Environ. Microbiol., 67, 3258-3263 (2001); Chizhikov et al., "Detection and genotyping of human group A rotaviruses by oligonucleotide microarray hybridization" J. Clin. Microbiol., 40, 2398-2407 (2002); Wang et al., "Microarray-based detection and genotyping of viral pathogens" Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99, 15687-15692 (2002); Wang et al., "Viral discovery and sequence recovery using DNA microarrays" PLoS Biol., 1, E2 (2003); Wilson et al., "High-density microarray of small-subunit ribosomal DNA probes" Appl. Environ. Microbiol., 68, 2535-2541 (2002); Wilson et al., "Sequence-specific identification of 18 pathogenic microorganisms using microarray technology" Mol. Cell. Probes, 16, 119-127 (2002); Call et al., "Identifying antimicrobial resistance genes with DNA microarrays" Antimicrob. Agents Chemother., 47, 3290-3295 (2003); Call et al., "Mixed-genome microarrays reveal multiple serotype and lineage-specific differences among strains of Listeria monocytogenes" J. Clin. Microbiol., 41, 632-639 (2003)). 상기 시스템의 근본적인 한계는 검출된 혼성화 사건이 부분적 서열 차이에 영향을 받지 않을 수 있기 때문에 동일한 유기체와 밀접하게 관련된 균주를 식별하는데 무력하다는 것이다. 예를 들어, 스팟 마이크로어레이 프로브는 25 % 만큼 다른 서열과 비특이적으로 교차 혼성화될 수 있다 - 이렇게 보이지 않는 변화는 다형성이 특이적으로 규명될 수 있는 경우 고도의 균주 구별을 가능하게 하는 충분한 정보를 보유하고 있다는 사실을 감안하면 상기 사건은 불리하다.
균주 수준에서의 동정은 밀접하게 관련된 유기체가 매우 상이한 임상적 결과 및 유행병학적 패턴을 가질 수 있는 경우에 있어 중요할 수 있다. 그러한 경우, 균 주들은 적절한 처리 및 조절을 할 수 있도록 식별되어야 한다. 임상적으로 관련된 Bordetella pertussis 및 이의 자매종, 임상적으로 비관련된 B. parapertussis는 대표적 예를 제시한다. 또다른 예는 인플루엔자 바이러스인데, 이에 대해 백신 민감성 및 백신 불감성 균주와, 순환성 인간 분리물 및 가능한 동물원성 균주(예, 조류 H5N1)를 식별하는 것은 즉각적이면서 명백한 가치가 있다.
발명의 개시
본 발명은 사전규명된 병원체 세트 유래의 병원체 핵산을 하나 이상 포함하는 것으로 의심되는 생물학적 샘플을 제공하는 단계; 사전규명된 병원체 세트에서 확인된 유전자에 상응하는 복수의 PCR 프라이머를 상기 샘플에 첨가하는 단계; 및 샘플 상에서 중합효소 연쇄 반응을 수행하여 상기 유전자에 상응하는 핵산의 서브세트를 증폭시키는 단계를 포함하는 방법을 포함한다. 상기 프라이머는 각 병원체에 대한 하나 이상의 프라이머 쌍을 포함하고, 샘플 내 임의 병원체 DNA 또는 임의 백그라운드 DNA와 상동성이 없는 테일 서열을 포함한다. 상기 중합효소 연쇄 반응에서 하나 이상의 프라이머 농도는 약 100 nM보다 높지 않다.
발명의 수행 방법
하기 기술에서는, 설명 및 비제한적 목적을 위해, 특정 상세 자료를 제시하여 본 발명의 충분한 해석을 제공한다. 하지만, 본 발명은 이러한 특정 상세 자료와 다른 기타 구체예로 수행될 수 있음을 당업자는 알 것이다. 다른 예에 있어서, 기존 방법 및 장치의 상세한 기술은 불필요한 상세 설명으로 인해 본 발명의 기술이 모호하지 않도록 생략한다.
임상 증후군은 거의 단일 병원체에 특이적이지 않아서, 대량의 후보 병원체를 테스트하고 이를 식별하는 분석이 공중 위생 노력에 유리하다는 것은 의심할 여지가 없을 것이다. 본원에 제시된 실험은 다중 RT-PCR/PCR, RA와 자동화 서열 유사성 조사 및 병원체 동정-광범위한 조건 하에서의 6종 생물 위협 (biothreat) 병원체와 20개의 통상적인 호흡기 병원체에 대한 RPM v.1 시스템-을 조합한 재서열화 어레이(RA) 방법의 임상 진단 및 유행병학적 감시 잠재성을 입증하고 있다. 다중 PCR 증폭의 감도와 RA의 특이성을 조합함으로써, 진단 분석을 평가하는 경우에 종종 관찰되는 특이성과 감도 간의 상충작용을 피할 수 있다. 이것은, 추출 완충액 중에서 또는 건강한 환자의 임상 샘플에 첨가된 복합 혼합물로서 함께 대조 샘플을 사용하여 증명하였다. 상기 데이타는 또한, 이 시스템이 인플루엔자형 질병이 있는 환자로부터 얻은 101개의 인후 도찰 샘플을 사용하여 HAdV 및 인플루엔자 A 바이러스에 대해 허용된 RT-PCR/PCR을 기초로 하는 방법 및 배양을 기초로 하는 방법과 동일한 감도를 제공한다는 것을 제시한다.
짧은-올리고뉴클레오티드 재서열화 어레이(RA)는 ARI 병원체 유래의 PCR 앰플리콘의 종 수준과 균주 수준의 동정을 동시에 제공할 수 있다. 종래에 인식되지 않은 변이체로부터의 특정한 다형성을 포함하는 균주 특이적 정보는 어레이 상에 타일링된 원형(prototype) 서열(ProSeqs, Malanoski 등의 미국 특허 출원 번호 11/_, 명칭 "Computer-Implemented Biological Sequence Identifier System and Method"(본 출원과 동일한 일자에 출원함) 참조)과 혼성화된 표적을 구별하는 서열 차이를 밝히는 RA의 능력에 의해 제공된다. 종래 연구는 맞춤고안된 호흡기 병원체 마이크로어레이(RPM v.1)를 미생물 핵산 농축법, 무작위 핵산 증폭법 및 자동화 서열 유사성 조사법과 조합하여 명확한 통계적 해석으로 종 및 균주 수준에서 광범위한 스펙트럼의 호흡기 계통 병원체 동정을 실현하였다(Lin et al., "Broad-spectrum respiratory tract pathogen identification using resequencing DNA 마이크로어레이" Genome Res., 16(4), 527-535 (2006); Wang et al., "Rapid, Broad-spectrum Identification of Influenza Viruses by Resequencing Microarrays" Emerg. Infect. Dis., 12(4), 638-646 (2006)). 하지만, 일반적인 증폭법은 저역가의 병원체를 갖는 임상 샘플을 다룰 경우 성공률이 제한되었다. 무작위 표적 증폭에 대한 감도 문제를 완화하는 개선된 다중 PCR 증폭 전략이 개시되어 있다. ARI를 나타내는 환자로부터 얻어진 임상 샘플을 사용하는 성공적인 기술 검증 실험은 표준 기준 분석(예, 배양, 미국 병리학회[CAP] 인증 PCR)과 일치하는 높은 종 수준이 개선된 분석 시간(8.5 시간)에 직접 서열 판독을 통해 여전히 정확한 종 및 균주 수준 동정을 생성하면서 실현할 수 있다는 것을 증명하고 있다. 본 결과는 이러한 방법이 간단한 자동 조작 및 축소화된 방법을 수행할 수 있어서 진단 및 감시 목적용의 마이크로어레이를 기초로 하는 플랫폼을 유도할 수 있음을 시사한다.
중합효소 연쇄 반응(PCR)은 당분야에 잘 공지되어 있다. 본 발명의 방법은 병원체 핵산을 포함할 수 있는 생물학적 샘플을 사용한다. 상기 방법은 예를 들어 건강한 개체 유래의 견본 상에서 수행할 수 있는 방법이기 때문에 병원체 핵산의 존재를 필요로 하지 않는다. 사전 준비 단계로서, 병원체 핵산은 임상 샘플, 예컨대 비제한적인 예로서 비 세정물, 인후 도찰물, 객담, 혈액 또는 환경적 샘플로부터 추출할 수 있다. 임상 샘플은 비제한적인 예로서 인간을 비롯한 임의의 종의 유기체로부터 얻어질 수 있다. 임의 유형의 병원체는 비제한적인 예로서 호흡기 병원체, 장내 병원체, 및 생물 위협 병원체, 예컨대 탄저균 포자를 포함하여 테스트할 수 있다. 병원체 세트는 예를 들어 종 수준 또는 균주 수준에서 규명될 수 있다.
상기 방법은 병원체에서 확인될 수 있는 유전자에 상응하는 PCR 프라이머를 포함한다. PCR 프라이머는 당분야에 잘 공지되어 있다. 각 병원체에 대한 하나 이상의 프라이머 쌍이 있다. 상기 방법에 사용되는 프라이머는 샘플 내 임의 병원체 또는 임의 백그라운드 DNA와 상동성이 없는 테일 서열을 갖는다. 백그라운드 DNA는 임상 샘플이 얻어진 종의 DNA일 수 있다. 잠재적 테일 서열은 무작위적이거나 또는 그렇지 않은 경우 발생될 수 있고, 예를 들어 유전자 서열의 데이타베이스, 예컨대 GenBank를 비교함으로써 평가될 수 있다. 테일 서열은 통상 그 자체가 병원체 DNA에 결합하지 않으며 이 테일은 임의의 다른 프라이머와 상보적이지 않기 때문에 PCR시 프라이머 이량체의 형성을 감소시킬 수 있다. 인간 유래의 견본에 사용하기 적당한 테일은 비제한적인 예로서 CGATACGACGGGCGTACTAGCG (프라이머 L, 서열 번호 1) 및 CGATACGACGGGCGTACTAGCGNNNNNNNNN (프라이머 LN, 서열 번호 2)을 포함한다.
단일 PCR의 프라이머 세트는, 예를 들어 적어도 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 또는 100개의 상이한 프라이머를 포함할 수 있다. 길이가 다른 유전자에 상응하는 프라이머는 동일한 PCR에 사용될 수 있다. 예를 들어, 증폭된 핵산의 길이가 50, 100, 또는 200 이하 및 3000 또는 2000 이상인 뉴클레오티드는 단일 PCR로 제조될 수 있다.
이러한 프라이머를 사용하는 PCR은 다른 성분을 포함하거나 또는 PCR 분야에 통상 공지되어 있고 본원에 개시되어 있는 장비를 사용할 수 있다. 저농도의 프라이머는 반응에 사용될 수 있다. 1개 내지 모든 프라이머들은 약 100 nM보다 높지 않은 농도에서 존재할 수 있다. 더 낮은 농도, 예컨대 40∼50 nM도 사용될 수 있다.
생물학적 샘플을 복수의 분취물로 나누고 개별 PCR은 각 분취물 상에서 수행되는 상이한 프라이머를 사용할 수 있다. 그리고나서 PCR 후 상기 분취물을 재혼합할 수 있다. 대량의 프라이머를 사용하는 경우 이를 실시할 수 있다. 보다 많은 프라이머가 PCR에 사용될수록, 보다 많은 프라이머 이량체가 형성될 수 있다. PCR은 상이한 프라이머 혼합물을 사용하여 복수의 분취물로 보다 양호하게 최적화될 수 있다.
PCR 후, 병원체 동정을 수행할 수 있다. 증폭된 핵산의 적어도 일부분과 상보적인 복수의 핵산 서열을 포함하는 마이크로어레이와 샘플을 접촉시키는 단계, 및 상기 증폭된 핵산을 상보적인 핵산과 혼성화하는 단계에 의해 실시될 수 있다. 이러한 방법은 미국 특허 출원 11/177,646호에 기술되어 있다. 상보적인 핵산은 비제한적인 예로서 25량체 내지 29량체일 수 있다. 상기 짧은 상보적인 핵산을 사용하면 임의의 미스매치가 마이크로어레이와 혼성화될 가능성을 감소시킨다. 상보적인 핵산은 증폭된 핵산 중 하나 이상 내지 최대 전부와 완벽하게 대응하는 프로브와, 각각의 완벽하게 대응하는 프로브의 중심부의 3개의 상이한 단일 뉴클레오티드 다형성을 포함할 수 있다. 이러한 어레이는 결정될 유전자의 서열을 완전하게함으로써, 병원체의 균주를 동정할 수 있다.
혼성화 후, 종래 방법, 예컨대 형광법을 사용하여 어떤 상보성 핵산이 혼성화된 증폭 핵산을 가지는 지를 검출할 수 있다. 그리고나서 증폭된 핵산을 검출한 결과를 기준으로 병원체를 동정할 수 있다. 이것은 유전자가 어레이에 혼성화된 결과를 기준으로 병원체를 동정하는 패턴 인식 알고리즘에 의해 실시할 수 있다. 또한 상기 기술된 바와 같이 혼성화된 유전자의 염기 서열 분석을 기준으로 실시할 수 있다.
분자 진단 기법은 병인체(etiological agent)의 동정을 신속하고 민감하게 실시할 수 있다. 최근 방법, 예컨대 PCR, RT-PCR, 및 스팟 마이크로어레이 등은 허위 양성 및 허위 음성 테스트 결과로 인해 동정오류가 일어나기 쉽고, 감도 및 특이성 간의 직접적인 상충으로 곤란한 경향이 있다. 샘플은 또한 진단 PCR 증폭에 사용되는 표적 서열과 유사한 영역을 포함할 수 있는 백그라운드 유기체의 거대하고 다양한 군으로 이루어져 있다. 비표적 DNA (특히 인간 DNA)의 유전적 복잡성은 교차 반응성으로 인해 "허위 양성" 생성물의 증폭을 야기할 수 있다. 또한, 바이러스는 상당히 빠른 속도로 돌연변이 및 재조합 반응을 통해 진화하므로, 특히 민감한 테스트는 끊임없이 재고안되거나 또는 거의 즉시 구식이 된다. 유전적 변이는 또한 임상적으로 관련이 있는데, 그 이유는 감염 지속성 및 치료 및/또는 백신 접종 반응에 대해 잠재적으로 연루된 항원성 변이와 관련이 있을 수 있기 때문이다. 최근 PCR 방법을 통한 유전적 변이의 연구를 위해, 추가 서열 분석 단계가 항상 요구되고 있다. RPM v.1법은 종 및 균주 수준에서 감염성 병원체를 검출할 뿐 아니라 추가 실험없이 미세한 게놈 차이를 확인할 수 있다. 상기 방법은 또한 높은 감도 및 특이성을 가져서 동시에 최대 7개의 병원체를 검출하는 효과적인 수단이며, 마이크로어레이 상에서 적당하게 선택된 원형 서열(ProSeqs)을 가진 병원체에 대해 서열을 기초로 한 균주 동정을 명확하고 재현가능하게 하는 것으로 밝혀졌다. 이것은 정확한 각 병원체의 핑거프린팅, 내항생제성 프로파일링, 유전적 표류/이동 분석, 법의학 및 다수의 기타 변수들을 허용함으로써 임상 처리 및 전염병 발생 반응을 개선하는데 유용할 수 있다. 이러한 능력은 질병, 예컨대 조류 H5N1 인플루엔자 바이러스, 및 생물학적 테러리즘 사건이 일어나는 것을 신속하게 발견하기 위해 상당히 중요할 수 있다.
본 발명을 기술하였지만, 하기 실시예는 본 발명의 특정 적용을 예시하고 있다. 이러한 특정 실시예는 본 출원에 기술된 본 발명의 범위를 한정하는 것으로 의도되지 않는다.
실시예 1
RPM v.1 칩 고안 - RPM v.1 (호흡기 병원체 마이크로어레이) 칩 고안은 27개의 호흡기 병원체 및 세균전 병원체로부터 29.7 kb의 서열을 재서열화시킬 수 있는 57개의 타일 영역을 포함하고, 이전 연구에 상세하게 기술되었다(Lin et al., "Broad-spectrum respiratory tract pathogen identification using resequencing DNA microarrays" Genome Res., 16(4), 527-535 (2006)). 간단히 말해서, RPM 어레 이는 표적 유기체의 게놈으로부터 선택된 서열 중 각 염기를 표시하고 그 중심이 되는 연속 25량체가 완벽하게 대응하는 프로브로 이루어진다. 또한, 각각의 완벽하게 대응하는 프로브의 경우, 중심부 중 3개의 가능한 단일 뉴클레오티드 다형성(SNP)을 표시하는 3개의 미스매치 프로브를 또한 어레이 상에 타일링하였다. 따라서, 일련의 완벽한 대응물과 혼성화하는 것은 중복된 존재/부재 정보를 제공하는 반면, 미스매치된 프로브와 혼성화하는 것은 균주 특이적 SNP 데이타를 밝히게 된다. 이러한 칩 상에서, 2개의 병원체, HAdV 및 인플루엔자 A는 나머지들보다 더 많은 프로브 대표물을 제시하였다. 이들은 즉각적 관심 집단(훈련 중인 미국방부 신병)에서 임상적 관련성을 기준으로 선택되었다. HAdV의 경우, 혈청형 4, 5 및 7의 진단 영역을 포함하는 E1A, hexon, 및 fiber 유전자 유래의 부분적인 서열은 모든 ARI 관련 HAdV를 검출하기 위해 타일링되었다. 유사하게, 인플루엔자 A 바이러스 검출용 타일 영역은 hemagglutinin (아형 H1, H3, 및 H5), neuraminidase (아형 N1 및 N2), 및 matrix 유전자 유래의 부분적 서열을 포함하였다. 3개의 HAdV 및 3개의 인플루엔자 A 바이러스 이외에도, 최근 RPM 고안은 감염 초기 단계에서 ARI, 즉 "독감형" 증상을 야기하는 것으로 공지된 예방 카테고리 A 생물학적 테러리즘 병원체, 질병 조절을 위한 6개의 센터 및 15개의 다른 일반적인 호흡기 병원체를 식별할 수 있다. RPM v.1 및 이의 공급원의 감도 및 특이성을 테스트하는데 사용된 모든 조절 및 분야의 균주들은 하기 표 1에 열거되어 있다.
Figure 112008003610934-pct00001
노트: @: 정제된 플라크; *: 테스트된 최소 검출 한계; #: 표적 유전자를 제조하여 BlueHeron Biotechnology(워싱턴주 보델 소재)의 pUC119로 클로닝하였음.
실시예 2
임상 샘플 - 보관된 인후 도찰물은 1999∼2005에 배치된 해군 함 및 다양한 군대 신병 훈련 센터, 미국/멕시코 국경 지역에서 ARI가 있는 환자로부터 수집되었다. 이것은 바이러스 전이 배지(VTM) 1.5 ㎖를 포함하는 2 ㎖ 극저온병에 즉시 배치하고, 동결시키고, -80℃ 이하에서 보관하여 이송 동안 바이러스 입자를 유지하였다. 그리고나서 샘플들을 해군 위생 리서치 센터(NHRC, 캘리포니아 샌디에고 소재)로 운송하고 해동한 후 분주하고, CAP 인증 진단 RT-PCR/PCR 및 배양 테스트를 사용하여 HAdV 및 인플루엔자를 테스트하였다. 그리고나서 동결 분취물을 맹검 방식으로 마이크로어레이를 기초로 한 검출에 제시하였다.
실시예 3
핵산 추출 - 핵산은 RN아제 분해 단계를 생략한 MASTERPURETM DNA purification kit (Epicentre Technologies, 위스콘신주 매디슨 소재), 또는 제조자의 권장 프로토콜에 따른 MagNA Pure Compact Nucleic Acid Isolation Kit I (Roche Applied Science, 인디아나주 인디아나폴리스 소재)을 사용하여 임상 샘플로부터 추출하였다.
실시예 4
내부 대조군 - NAC1 및 트리오스포스페이트 이성화효소(TIM)와 상응한 2개의 애기장대 유전자를 역전사(RT), 및 PCR 반응에 대한 내부 대조군으로서 선택하였는데, 그 이유는 이들이 임상 샘플에 본래부터 발생되어 있지 않기 때문이다. 두개의 유전자의 ∼500 bp를 포함하는 2개의 플라스미드, 즉 pSP64poly(A)-NAC1 및 pSP64poly(A)-TIM는 게놈연구소(메릴랜드주 로크빌 소재)에서 Norman H. Lee 박사에 의해 적법하게 제공되었다. NAC1은 SP6 및 M13R 프라이머를 이용하여 PCR에 의해 증폭되었고, 이 PCR 생성물은 QIAquick PCR Purification Kit (Qiagen, 캘리포니아 발렌시아 소재)를 사용하여 정제되었다. pSP64poly(A)-TIM으로부터 RNA를 발생시키기 위해, 플라스미드를 EcoRI를 사용하여 선형화시키고 MEGASCRIPT® High Yield Transciption Kit (Ambion, 텍사스 오스틴 소재)를 사용하여 SP6 프로모터로부터 시험관내에서 전사하였다. 각각 60 fg의 NAC1 및 TDVI를 내부 대조군으로 사용하여 증폭 효율 및 견본 내 억제제의 존재를 조사하였다.
실시예 5
프라이머 고안 및 다중 RT - PCR 증폭 - 프라이머를 두개의 독립적인 반응물로 나누고 프라이머 디자인을 단순화하고 최적화한다. 둘다의 혼합물에 미세 조율 조절(신규한 것을 위해 불량하게 증폭된 프라이머를 교환함)을 수행하여 26개의 표적 병원체(West Nile Virus는 상기 증폭 반응이 아닌 어레이에 포함됨)로부터 모든 표적 유전자들을 충분하게 증폭시켜 혼성화한다. RPM v.1 칩 (표 2(a) 및 2(b)에 열거됨) 상의 모든 표적을 위한 유전자 특이적 프라이머 쌍을 고안하여 다중 PCR의 양호한 증폭 효율을 보장하였다. 모든 프라이머가 유사한 어닐링 온도를 갖도록 고안하고, BLAST 프로그램으로 GenBank 데이타베이스에서 기지 서열에 대해 완전한 조사를 이용하여 유일성을 보장하였다. AU 프라이머들은 다른 프라이머들과 잠재적인 혼성화를 이루는지 점검하여 잠재적 프라이머 이량체를 감소시켰다. 또한, 본 발명자들은 문헌[Shuber et al., "A simplified procedure for developing multiplex PCRs" Genome Res., 5, 488-493 (1995) 및 Brownie et al., "The elimination of primer-dimer accumulation in PCR" Nucleic Acids Res., 25, 3235-3241 (1997)]에 의해 개발된 방법을 개조하여 22 bp(프라이머 L)의 연결 서열을 본원에 사용된 프라이머의 5' 말단에 첨가함으로써 프라이머 이량체 형성을 추가로 억제하였다. 50 mM Tris-HCl (pH 8.3), 75 mM KC1, 3 mM MgCl2, 각각 500 μM의 dATP, dCTP, dGTP, dTTP, 40 U의 RNaseOUTTM, 10 mM DTT, 2 μM 프라이머 LN, 200 U의 Superscript III (Invitrogen Life Technologies, 캘리포니아주 카를스베드 소재), 60 fg 각 2개의 내부 대조군(NAC1 및 TIM), 및 5∼8 ㎕의 추출된 임상 견본 또는 실험 대조군을 포함하는 20 ㎕ 부피에서 역전사(RT) 반응을 수행하였다. 제조자의 권장 프로토콜을 사용하여 Peltier Thermal Cycler-PTC240 DNA Engine Tetrad 2 (MJ Research Inc., 네바다주 레노 소재)로 반응을 수행하였다.
Figure 112008003610934-pct00002
Figure 112008003610934-pct00003
Figure 112008003610934-pct00004
Figure 112008003610934-pct00005
Figure 112008003610934-pct00006
Figure 112008003610934-pct00007
RT 반응 생성물을 2개의 10 ㎕ 부피로 분할하여 2회의 상이한 다중 PCR 반응을 실시하였다. 프라이머 혼합물 A는 19개의 프라이머 쌍을 포함하였고 3개의 상이한 인플루엔자 A 바이러스, 1개의 인플루엔자 B 바이러스, 혈청형의 HAdV 3개, 및 1개의 내부 대조군(TIM)으로부터 18개의 유전자 표적을 증폭시킨다. 프라이머 혼합물 B는 38 프라이머 쌍을 포함하였고 잔여의 37개의 유전자 표적 및 나머지 내부 대조군(NAC1)을 증폭시킨다. 20 mM Tris-HCl (pH 8.4), 50 mM KCl, 2 mM MgCl2, 각각 400 μM의 dATP, dCTP, dGTP, dUTP, 1 U의 Uracil-DNA 글리코실라제, heat-labile (USB, 캘리포니아 카를스베드 소재), 2 μM의 프라이머 L, 각각 혼합물 A로부터의 40 nM의 프라이머 또는 각각 혼합물 B로부터의 50 nM 프라이머, 10 U의 Platinum Taq DNA polymerase (Invitrogen Life Technologies, 캘리포니아주 카를스베드 소재), 및 RT 생성물 10 ㎕를 포함하는 50 ㎕ 부피에서 PCR 반응을 수행하였다. 25℃에서 10분간 초기 항온처리 하고 94℃에서 3분간 예비 변성 후, 94℃ 30초, 5O℃ 90초, 72℃ 120초로 5회 순환시키고, 94℃ 30초, 64℃ 120초 35회 순환하고, 72℃에서 5분간 최종 신장하여 Peltier Thermal Cycler-PTC240 DNA Engine Tetrad 2(MJ Research Inc., 네바다주 레노 소재)로 증폭 반응을 수행하였다. 둘다의 PCR 반응으로부터 증폭된 생성물을 단일 부피로 배합하고 정제 및 처리를 실시한 후 RPM v.1 칩으로 혼성화하였다(하기 참조).
실시예 6
마이크로어레이 혼성화 및 처리 - 단편을 증폭시키고 마이크로어레이에 대해 혼성화한 후 2개의 PCR 생성 혼합물을 재배합하였다. 제조자의 권장 프로토콜(Affymetrix Inc., Santa 캘리포니아주 클라라 소재)에 따라 하기 변형예로 마이크로어레이 혼성화 및 처리를 수행하였다. 정제된 PCR 생성물을 37℃에서 5분간 단편화시킨 후, 37℃에서 30분간 Biotin-N6-ddATP로 표지하였다. 45℃ 및 60 rev/분에서 2시간 동안 로티서리 오븐에서 혼성화를 수행하였다. 스캐닝 후, GCOS 소프트웨어를 사용하여 각 상응한 프로브 위치로 양도된 강도의 간단화된 파일 포멧(.CEL 파일)으로 원료 이미지(.DAT) 파일을 감소시켰다. 최종적으로, GDAS 소프트웨어를 사용하여 ABACUS 알고리즘의 중간 버전을 적용하여(Cutler et al., "High-throughput variation detection and genotyping using microarrays" Genome Res., 11, 1913-1925 (2001)) 센스 및 안티센스 프로브 세트를 위한 각각의 강도를 비교함으로써, 올바른 염기 수요의 추정을 생성하였다. 염기 수요의 백분율을 증가시키기 위해, 변수들을 조정하여 허용 염기 수요를 가장 많이 할 수 있었다(하기 제시). 염기 수요 유래의 서열은 재서열화 어레이의 각 타일 영역을 제조한 후 FASTA-포멧 파일로서 GDAS로부터 이출하였다.
- 여과 조건
· 신호 임계값 없음 = 0.500 (디폴트값 = 1.000000)
· 약한 신호 폴드 임계값 = 20000.000 (디폴트값 = 20.000000)
· 강한 SNR 임계값 = 20.000000 (디폴트값 = 20.000000)
- 알고리즘 변수
· 표준 품질 임계값 = 0.000 (디폴트값 = 0.000000)
· 총 품질 임계값 = 25.0000 (디폴트값 = 75.000000)
· 이형 접합체 수요의 최대 비율 = 0.99000 (디폴트값 = 0.900000)
· 모델 유형(0 = 이형 접합체, 1 = 동형 접합체) = 0
· 완벽한 수요 품질 임계값 = 0.500 (디폴트값 = 2.000000)
- 최종 신뢰도 규칙
· 인접 프로브의 최소 비율 = 1.0000 (여과 손상)
· 샘플 수요의 최소 비율 = 1.0000 (여과 손상)
실시예 7
자동 병원체 동정 알고리즘 ( NA 서열을 기초로 한 병원체 동정) - 데이타베이스 기록에 대한 서열 유사성 비교를 이용하여 병원체를 동정하는 알고리즘을 사용하여 마이크로어레이 혼성화 및 스캐닝으로부터 발생한 원료 생산 서열을 처리하였다. 신규한 소프트웨어 프로그램인 Computer-Implemented Biological Sequence-based Identifier 시스템 버전 2 (CIBSI 2.0)를 개발하여 Resequencing Pathogen Identification(REPI) 프로그램에서 이전에 수행된 과제에 혼입시킴으로써 완전하게 결과를 분석하고(Lin et al., "Broad-spectrum respiratory tract pathogen identification using resequencing DNA microarrays" Genome Res ., 16(4), 527-535 (2006)), 또한 수동으로 미리 실시된 결정을 수행하였다. 개선된 REPI 알고리즘을 비롯한 상기 프로토콜의 광범위한 논의는 미국 특허 출원 11/422,431호(2006년 6월 6일 출원)에 상세하게 기술되어 있다.
실시예 8
병원체의 정량 - 상기 분석의 특이성은 다양한 원형 균주 및 임상 샘플을 사용하여 확인하였다. 결과는 표적 간의 식별 가능한 간섭을 제시하지 않았다. 그리고나서 RPM v.1의 분석적 감도는 원형 균주의 핵산 템플릿을 일련의 10배 희석믈을 사용하여 평가하였다. 표 1은 병원체가 검출 가능한 각 병원체를 위한 최저 희석물을 제시하고 있다. 표준 다중 RT-PCR/PCR 방법의 감도와 비교하였을 때 결과는 원형 균주에 대한 반응 당 10∼103의 게놈 사본의 감도 범위를 나타내었다. 호흡기 병원체에 대한 실용 계수보다 몇배 높은 규모가 아닐 경우 게놈 사본 수가 통상 하나 이상이기 때문에 게놈 사본 수가 실용 계수(플라크 형성 단위)와 동동하지 않음을 유의해야 한다. 보다 특정한 프로토콜에서 먼저 증명되었던 근접 유전자 인접물 사이의 RPM v.1의 동정 및 식별 능력은 상기 프로토콜을 이용하여 재현되었다. 인간 아데노바이러스(HAdV)의 17개의 상이한 혈청형으로부터 발생된 서열은 상기 분석이 다양한 ARI 관련 HAdV 균주를 구별할 수 있음을 밝히고 이 분석이 광범위한 변이체를 검출하는데 사용될 수 있음을 증명하였다(표 3). 상이한 혈청형 중 HAdV hexon 유전자에서만 표적의 교차 혼성화를 관찰하였으나, 이것은 올바르게 표적된 병원체의 양성 동정을 방해하지 않는다.
Figure 112008003610934-pct00008
감도 평가의 경우, 리얼 타임 PCR 분석을 iCycler 또는 MYIQTM 장치(Bio-Rad Laboratories, 캘리포니아 헤르큘레스 소재) 상에서 수행하여 각 샘플의 아데노바이러스 게놈 수를 측정하였다. 샘플 중에서의 발견물은 fiber 특이적 프라이머 Ad4F-F 및 Ad4F-R(표 4)을 사용하여 HAdV-4 원형 게놈 DNA 템플릿의 기지의 사본 수(101∼106 사본)의 일련의 10배 희석물로 비교하였다. HAdV-4 게놈 사본 수는 정제된 바이러스 DNA 유래의 DNA 농도를 측정하고 다음의 전환 인자를 사용하여 계산되었다: 0.384 fg = ∼35kb의 단일 아데노바이러스 게놈. 2.5 ㎕ FastStart Reaction Mix SYBR Green I (Roche Applied Science, 인디애나주 인디아나폴리스 소재), 20 mM Tris-HCl (pH 8.4), 50 mM KCl, 3 mM MgCl2, 각각 200 μM의 dATP, dTTP, dGTP, dCTP, 200 nM 프라이머, 및 아데노바이러스 게놈 DNA (1∼4 ㎕의 임상 견본 또는 DNA 추출물)를 포함하는 25 ㎕ 반응 부피로 리얼 타임 PCR 반응을 수행하였다. 94℃에서 10분간 예비 변성 후 94℃ 20초, 60℃ 30초를 40회 순환하여 증폭 반응을 수행하였다.
유사 분석을 수행하여 기존에 기술된 바와 같은 특이적 프라이머(표 4) 및 RT-PCR/PCR 조건을 사용하여 다른 병원체의 게놈 사본 수를 측정하였다(Stone et al., "Rapid detection and simultaneous subtype differentiation of influenza A viruses by real time PCR" J. Virol . Methods, 117, 103-112 (2004); Hardegger et al., "Rapid detection of Mycoplasma pneumoniae in clinical samples by real-time PCR" J. Microbiol.. Methods, 41, 45-51 (2000); Corless et al., "Simultaneous detection of Neisseria meningitidis, Haemophilus influenzae, and Streptococcus pneumoniae in suspected cases of meningitis and septicemia using realtime PCR" J. Clin. Microbiol., 39, 1553-1558 (2001); Molling et al., "Direct and rapid identification and genogrouping of meningococci andporA amplification by LightCycler PCR" J. Clin . Microbiol ., 40, 4531-4535 (2002); Vabret et al., "Direct diagnosis of human respiratory coronaviruses 229E and OC43 by the polymerase chain reaction" J. Virol . Methods, 91, 59-66 (2001)).
Figure 112008003610934-pct00009
* RSV : 호흡기 세포융합 바이러스, φ : 5' 말단에서 형광 리포터 염료, 및 3' 말단에서 Black Hole Quencher로서 이중 표지된 프로브가 6-카르복시-플루오레세인(FAM)을 포함함.
등록번호 참고문헌:
Stone et al., "Rapid detection and simultaneous subtype differentiation of influenza A viruses by real time PCR" J. Virol . Methods, 117, 103-112 (2004).
Vabret et al., "Direct diagnosis of human respiratory coronaviruses 229E and OC43 by the polymerase chain reaction" J. Virol . Methods, 97, 59-66 (2001).
Hardegger et al., "Rapid detection of Mycoplasma pneumoniae in clinical samples by real-time PCR" J. Microbiol. Methods, 41, 45-51 (2000).
Corless et al., "Simultaneous detection of Neisseria meningitidis, Haemophilus influenzae, and Streptococcus pneumoniae in suspected cases of meningitis and septicemia using real-time PCR" J. Clin . Microbiol ., 39, 1553- 1558 (2001).
Mentel et al., "Real-time PCR to improve the diagnosis of respiratory syncytial virus infection" J. Med . Microbiol ., 52, 893-896 (2003).
Moiling et al., "Direct and rapid identification and genogrouping of meningococci and porA amplification by LightCycler PCR" J. Clin . Microbiol ., 40, 4531-4535 (2002).
실시예 9
호흡기 병원체의 동시 검출 및 식별 - 종래 연구들은, 단일 병원체 종을 정확하게 동정하는 것 이외에, 병원체 검출을 위해 RPM v.1 분석을 사용하는 것의 현저한 이점 중 하나는 동시감염을 검출하는 능력을 제시한 것이었다. 상기 연구에 있어서, 동시에 복수의 병원체를 동정하는 RPM v.1 분석의 능력은 병원체 템플릿의 다양한 조합을 조제하여 추가로 평가되었다(표 5 및 6). 템플릿의 일련의 희석물을 사용하여 복수의 병원체의 검출 감도 및 특이성을 평가하였다. 각 병원체, HAdV-4, S. pyogenes, M. pneumoniae, 및 Y. pestis의 반응 당 106∼103 게놈 사본을 포함하는 핵산 템플릿을 함께 혼합하고 RPM v.1 분석을 사용하여 테스트하였다. 이러한 결과는 상기 분석이 반응물 당 표적 당 103 게놈 사본의 최저 농도에서도 모든 4개의 병원체의 재현가능한 서열을 기초로 한 동정을 할 수 있음을 증명하였다(표 5). 상기 복합 혼합물에서 식별 가능한 방해가 없다는 사실은 또한 복합 혼합물에서도 RA의 뉴클레오티드 염기 수요 능력의 견고함 및 부수적 동정 알고리즘을 지원하였다.
복합 혼합물 중 복수의 병원체 검출을 위한 상기 방법의 효과를 추가로 평가하기 위해서는, 3∼7개의 배양된 유기체를 상이한 역가(102∼105(cfu 또는 pfu)/㎖)에서 지원자로부터 회수하여 비 세정물 풀(pool)에 첨가하고, 제조된 샘플 150 ㎕를 테스트에 사용하였다. 초기 결과는 최하 역가 100 cfu(pfu)/㎖에서 동시에 7개의 병원체인 HAdV-4, HAdV-7, B. anthracis, 인플루엔자 A-H1N1, 파라인플루엔자 바이러스 1, RSV-A, M. pneumoniae, 및 S. pyogenes를 명확하게 검출할 수 있음으로써 밝혀졌다(표 6). 7개 병원체의 상이한 세트를 이용한 추가의 평가는 RPM v.1 분석이 이들 중 6개를 동시에 검출할 수 있음을 제시하였다. 이들 중에서, HAdV-4, B. anthracis, 인플루엔자 A-H1N1, RSV-A, 및 M. pneumoniae를 최하 역가 100 cfu (pfu)/㎖에서 검출하였고, S. pyogenes를 1000 cfu/㎖에서 검출하였다(표 6). Y. pestis는 최고 농도에서도 검출될 수 없었다. 이것은 불명의 Y. pestis 병원체에 대한 핵산 추출 프로토콜의 불명확성에서 기인한 것인데, 그 이유는 Y. pestis의 1000개의 게놈 사본이 정제된 핵산 템플릿을 사용하는 경우 검출될 수 있기 때문이다(표 1 및 5). 추가 확인을 하는 경우, RPM v.1은 정제된 핵산 템플릿을 사용하여 테스트되었던 동일한 4개의 병원체 세트 상에서 배양된 유기체를 이용하여 테스트되었다(표 5). 실패 없이, 상기 결과는 Y. pestis를 제외한 S. pyogenes (1000 cfu/㎖)의 감도가 떨어진 상태로 100 cfu(pfu)/㎖에서 HAdV-4 및 M. pneumoniae가 재현가능하게 검출될 수 있음을 제시하였다. 3개의 병원체, 즉 B. anthracis, 인플루엔자 A-H1N1, 및 HCoV-229E 또는 RSV-A의 경우를 테스트하는 경우, 상기 분석은 100 cfu (pfu)/㎖만큼 낮은 역가에서 3개의 병원체를 모두 검출하였다(표 6). 이러한 결과는 RA를 기초로 한 방법은 7개 이상의 병원체의 동시감염을 검출하는데 높은 감도 및 특이성의 이점을 가지고 비 세정물 샘플로부터 직접 다양한 병원체를 검출하고 분류하는 효과적인 수단이라는 점을 제시한다. 상기 방법은 복수의 병원체의 발생 상에서 신규한 정보를 제공함으로써 집단 내의 이러한 병원체의 일상적인 진단 및 전염성 조사에 유용할 것이다.
Figure 112008003610934-pct00010
노트: TE 완충액 중 정제된 핵산 템플릿을 혼합시킴으로써 샘플을 생성하여 106 게놈 사본/㎕ 스톡 용액을 제조하였음. 상기 농도로부터 출발하여 TE 완충액 중 10배 일련 희석물을 제조하였음.
Figure 112008003610934-pct00011
노트: 정상 지원자로부터 회수된 비 세정물 풀을 이용한 배양 샘플을 혼합함으로써 샘플을 생성시켜 105 cfu(pfu)/㎖를 생성하였음. 상기 농도로부터 출발하여, 정상 지원자로부터 회수된 수집 비 세정물을 이용하여 10 배 일련 희석물을 제조하였음. 각 희석물의 경우, 150 ㎕의 샘플을 RPM v.1법에 사용하였다. BA-B. anthracis (Sterne), H1N1-인플루엔자 A-H1N1, HCoV229E-인간 코로나바이러스 229E, HAdV-인간 아데노바이러스, GAS-S. pyogenes (group A Streptococcus), MP-M. pneumoniae, PIV1: 파라인플루엔자 바이러스 1, RSV-호흡기 세포융합 바이러스, YP-Y. pestis . +: 검출됨, -: 비검출됨.
실시예 10
임상 견본의 평가 - 병원체 검출을 위한 RPM v.1은 분석력을 성공적으로 증명한 후, ARI가 유발하는 감염의 예상적이며 회고적인 진단에 사용되었다. 주로 ARI가 제시된 군인 신병으로부터 회수된 임상 견본을 사용하여 보다 확립된 호흡기 병원체 검출 방법으로 마이크로어레이를 기초로 한 진단의 유용성을 비교하였다. 샘플(n = 101)은 임상적으로 증명된 호흡기 질병이 있는 바이러스 전이 매질에서 인후 도찰물로 이루어졌다. 샘플은 NHRC에서 CAP 인증 진단법(세포 배양 및/또는 PCR)을 사용하여 HAdV 또는 인플루엔자 바이러스에 대해 양성 테스트되었던 세트로부터 무작위적으로 선택되었다. 이들은 맹검시키고(무작위로 다시 번호를 매기고 관련 임상 기록으로부터 분리시킴) RPM v.1 테스트를 위해 Naval Research Laboratory (NRL)로 송부되었다. 비교된 실험은 2개의 독립적인 실험실에 의해 실시되었고 결과를 끝낸 후 동일한 일치를 밝혀내었다. 인플루엔자 A 바이러스의 경우, RPM v.1법은 초기 진단 결과에 대해 검출 감도 87 % 및 특이성 96 %, 및 전체적으로 92 %의 동일성을 제시하였다(표 7). 아데노바이러스의 경우, RPM v.1 검출 감도는 97 %, 특이성은 97 %, 전체적으로 97 %의 동일성을 제시하였다(표 7). 배양 및 PCR법을 이용한 RPM v.1 결과의 추가 비교에 있어서, 데이타는 배양 또는 PCR 분석의 유사한 검출 감도 및 특이성을 제시하였다(표 8). 데이타는 RPM v.1이 배양 대 PCR보다 감도 및 특이성이 양호한 것으로 나타났는데, 그 이유는 분자 방법이 통상 배양보다 더욱 민감하고, PCR보다 높은 특이성을 제공하는 RPM v.1법의 서열 분석력이 기대되기 때문임을 시사한다(표 9). 상기 데이타는 마이크로어레이를 기초로 한 진단력을 추가로 입증하여 미배양된 환자의 견본 중 임상적으로 관련된 인플루엔자 A 바이러스 균주를 올바르게 동정하였다.
Figure 112008003610934-pct00012
@CAP 인증 PCR; *CAP 인증 PCR 음성 샘플 중 하나에 인플루엔자 A 바이러스를 배양하고, RPM v.1는 HAdV-4 및 인플루엔자 A 동시감염을 제시하고, 나머지 음성 샘플을 확인하여 역가가 낮은 HAdV-4를 가졌음; φ3 인플루엔자 A 배양 양성 샘플은 정량 리얼 타임 PCR에 의해 검출되지 않는데, 이는 템플릿이 분해되었음을 제시함.
Figure 112008003610934-pct00013
Figure 112008003610934-pct00014
본 연구는 인플루엔자 바이러스의 아형을 동정하고 인플루엔자 균주 내 유전적 변화를 추적하여 상기 분석력을 입증하였다. 항원성 표류는 인플루엔자 바이러스가 이전의 자연적 노출 및 백신에 의해 유도된 면역 압박으로부터 벗어난 것에 의한 메카니즘이기 때문에 인플루엔자 유행병학에 특히 위험하다. RPM v.1로부터 발생된 hemagglutinin (HA) 및 neuramindase (NA) 서열 분석은 항원성 표류를 통해 1999∼2005에 발생한 기존의 계통 변화를 반복하였다(표 10). A/Panama/2007/99형 계통에 속하기 때문에 2003∼2004 인플루엔자 시즌 이전에 회수된 7개의 인플루엔자 A/H3N2 임상 견본을 동정하였고, 반면 2003∼2004 인플루엔자 시즌에 회수된 9개의 인플루엔자 A/H3N2 샘플은 HA 유전자 중 기호 A/Fujian/411/2002형 계통 뉴클레오티드 대체물을 명확하게 수행하였다. A/Fujian/411/2002형 균주에서 A/California/7/2004형 균주로의 표류는 2004∼2005 인플루엔자 시즌에 회수된 18개의 인플루엔자 A/H3N2 샘플에서 명백하였다. 3개의 샘플을 A/Fujian/411/2002형 균주로서 동정하는 한편 나머지는 HA 유전자 중 기호 캘리포니아형 핵산 대체물을 제시하였다. 동일한 기간 동안 회수된 2개의 샘플은 인플루엔자 A/H3N2로서만 동정될 수 있다. 이것은 표적의 불량한 증폭 및/또는 혼성화에 의해 균주 수준 동정에서 불충분한 서열 정보를 초래하였다. 2000∼2001에 회수된 2개의 인플루엔자 A/H1N1 샘플은 A/New Caledonia/20/99와 밀접하게 관련된 것으로서 동정되었다.
Figure 112008003610934-pct00015
Figure 112008003610934-pct00016
노트: *는 단일 균주만을 동정한 것을 나타냄.
임상 샘플에서 단일 병원체를 검출하는 단계 이외에, HAdV-4/인플루엔자 A 바이러스, HAdV-4/S. pyogenes, 및 인플루엔자 A 바이러스/M. pneumoniae 등의 다양한 동시감염은 임상 샘플에서 검출될 수 있다(데이타는 제시되지 않음). 이러한 동시감염은 공개된 유형의 특정 PCR 분석(Stone et al., "Rapid detection and simultaneous subtype differentiation of influenza A viruses by real time PCR" J. Virol . Methods, 117, 103-112 (2004); Hardegger et al., "Rapid detection of Mycoplasma pneumoniae in clinical samples by real-time PCR" J. Microbiol . Methods, 41, 45-5 (2000)) 및 사내 특정 PCR 프라이머(표 4)를 사용하여 추가로 입증되었다(데이타는 제시되지 않음). 또한, 상기 분석도 임상 샘플 중 S. pneumoniae 26 % 및 N. meningitidis 16 %를 검출하였다. S. pneumoniae, 및 N. meningitidis의 존재는 40개(샘플의 이용가능한 부피로 인한 제한)의 임상 샘플 서브세트 중 공개된 종 특이적 정량 리얼 타임 PCR 분석에 의해 입증되었다(데이타는 제시되지 않음). S. pneumoniae, 및 N. meningitidis는 구강 및 상부 호흡기계 내 공생 박테리아임이 잘 공지되어 있어서, 임상 샘플에서 통상적으로 밝견되었던 점은 놀라운 일이 아니다. 하지만, 정량 리얼 타임 PCR 데이타는 임상 샘플 중 존재하는 S. pneumoniaeN. meningitidis의 대부분이 저역가(≥103 게놈 사본/㎕)였고, 32 %의 인플루엔자 양성 샘플이 S. pneumoniae (7/25) 또는 N. meningitidis (1/25) (≥105 게놈 사본/㎕)의 고역가를 가지고 있었다(데이타는 제시되지 않음). 이러한 임상 샘플 중에 제시된 고역가의 세균들은 바이러스 유도의 세균성 중복감염으로 인한 것일 수 있다.
실시예 11
프라이머 L 및 LN 을 이용한 다중 PCR 프로토콜 - 하기는 실시예 절차의 상세한 프로토콜이다.
조제 실험
1. pSP64poly(A)-TIM으로부터 TIM RNA의 제조 - MEGASCRIPT® SP6 kit (Ambion, Cat # 1330)
a) EcoRI 효소를 이용하여 1 μg의 pSP64poly(A)-TIM을 선형화한다
x ㎕ pSP64poly(A)-TM
2 ㎕ 10x EcoRI 완충액
2 ㎕ EcoRI (NEB, Cat # R0101S)
(16-x) ㎕ H 2 O
20 μ 총 부피
37℃에서 5시간 동안 반응물을 항온처리한다.
b) 하기를 첨가하여 제한효소 분해를 종료한다:
· 0.5 M EDTA 1/20배 부피 (1 ㎕)
· 3 M Na acetate 1/1O배 부피 (2 ㎕)
· 에탄올 2배 부피 (40 ㎕)
c) 잘 혼합하고 20분간 -20분에서 냉각시킨다. 그리고나서 최고 속도의 미세원심분리기 중에서 15분간 DNA를 펠렛화시킨다.
d) 상청액을 제거하고, 수초간 튜브를 재회전시키고, 상당히 미세한 팁을 장착한 피펫을 이용하여 잔류 유동액을 제거한다. 뉴클레아제 무함유 물 20 ㎕에 재현탁시킨다.
e) 얼음 상에 RNA 중합효소 혼합물을 배치한다.
f) 1OX 반응 완충액 및 4 리보뉴클레오티드 용액을 볼텍싱한다.
g) 용액 중 이들이 완전해질 때까지 볼텍싱한다(ATP, CTP, GTP, 및 UTP).
h) 일단 용해되면, 얼음 상에 리보뉴클레오티드를 보관하나, 1OX 반응 완충액은 상온에서 반응물을 조합할 때까지 상온에서 보관한다.
i) 모든 시약을 개봉하기 전 간단하게 미세원심분리시켜 튜브의 테두리 주변에 존재할 수 있는 재료의 손실 및/또는 오염을 방지해야 한다.
j) 실온에서 하기 전사용 반응물을 조합한다.
16 ㎕ 선형화된 pSP64poly(A)-TIM
16 ㎕ NTP (ATP, GTP, CTP, UTP - 각 4㎕)
4 ㎕ 1OX 반응 완충액
4 ㎕ 효소 혼합물
40 ㎕ 총 부피
37℃에서 6시간 동안 반응물을 항온처리한다.
k) ProbeQuantTM G-50 Micro Column (Amersham, Cat #27533501)을 이용하여 RNA 생성물을 정제한다.
l) 회수된 RNA 및 희석물의 O.D값을 측정하여 60 fg/㎕ 스톡을 제작한다.
2. pSP64poly(A)-NAC1 유래의 NAC1 DNA 단편 제작 - 플라티늄 Taq DNA 중합효소(Invitrogen, Cat # 10966-034)를 이용한 PCR
1 ㎕ pSP64poly(A)-NAC1 (1 ng/㎕)
5 ㎕ 10x PCR 완충액
2 ㎕ 50 mM MgCl2
1 ㎕ 10 mM dNTP 혼합물
1 ㎕ SP6 (10 μM)
5' -ATT TAG GTG ACA CTA TAG AAT-3'
1 ㎕ SP6 (10 μM)
5 ' -CAG GAA ACA GCT ATG ACC ATG-3 '
0.5 ㎕ 플라티늄 Taq 중합효소
38.5 ㎕ H 2 O
50 ㎕ 총 부피
하기 PCR 프로그램을 작동시킨다:
94℃ - 3분
40회 순환:
94℃ - 30초
5O℃ - 30초
72℃ - 40초
72℃ - 5분
4℃ - 유지
PCR 생성물 정제 - QIAquick® PCR purification kit (Qiagen, Cat # 28106)
a) 완충액 PB 250 ㎕를 PCR 샘플 50 ㎕에 첨가한다.
b) 제공된 2 ㎖ 회수 튜브에 QIAquick 회전 컬럼을 배치한다.
c) DNA를 결합시키기 위해, QIAquick 컬럼에 샘플을 적용하고 30∼60초간 원심분리한다.
d) 용출액을 제거한다. 다시 QIAquick 컬럼을 동일한 튜브에 배치한다.
e) 세척을 위해, 0.75 ㎖ 완충액 PE를 QIAquick 컬럼에 첨가하고 30∼60초간 원심분리한다.
f) 용출액을 제거하고 동이한 튜브에 QIAquick 컬럼을 다시 배치한다.
g) 1분간 더 컬럼을 원심분리한다.
h) 청정한 1.5 ㎖ 미세원심분리 튜브에 QIAquick 컬럼을 배치한다.
i) DNA를 용리시키기 위해, 50 ㎕ 완충액 EB (10 mM Tris-Cl, pH 8.5) 또는 H2O를 QIAquick 막 중심에 첨가하고, 1분간 컬럼을 정치시킨 후, 1분간 컬럼을 원심분리한다.
j) PCR 생성물 및 희석물의 O.D값을 측정하여 60 fg/㎕ 스톡을 제조한다.
3. 100 μM 올리고 스톡 10 ㎕ (표 2(a))를 혼합하여 1 μM 프라이머 혼합물 A 스톡 1 ㎖를 제조하고 물을 1 ㎖로 첨가한다. 잘 혼합한 후 1OO ㎕ 분취물로 분할한다.
4. 100 μM 올리고 스톡 10 ㎕(표 2(b))를 혼합하여 1 μM 프라이머 혼합물 B 스톡 1 ㎖를 제조하고 물을 1 ㎖로 첨가한다. 잘 혼합한 후, 1OO ㎕ 분취물로 분할한다.
다중 PCR
1. 핵산 추출 - MASTERPURETM DNA purification kit (Epicentre, Cat #MC89010).
a) 1X PBS 100 ㎕를 비 세정물 50 ㎕에 첨가한다.
b) 프로테아제 K 1 ㎕가 있는 2X T & C 용해 용액 150 ㎕를 첨가한다.
c) 65℃에서 15분간 항온처리하고, 매 5분마다 볼텍싱한다.
d) 3∼5분간 얼음 상 또는 4℃에서 방치한다.
e) 상기 샘플에 MPC 용액 150 ㎕를 첨가하고, 10초간 볼텍싱한다.
f) 10분간 최고 속도에서 회전한다.
g) 새로운 1.5 ㎖ 튜브로 상청액을 이전한 후, 이소프로판올 500 ㎕를 첨가하고 잘 혼합한다.
h) 10분간 4℃에서 최고 속도로 회전한다. 상청액을 제거한 후 80 % 알콜로 2회 세척한다.
i) 펠렛을 건조하고 8 ㎕ 뉴클레아제 무함유 물에 재현탁한다.
2. 프라이머 LN을 이용한 역전사 - Invitrogen Superscript III (Invitrogen, Cat. #18080-093)
단계 1로부터의 NA 8 ㎕
프라이머 LN (40 μM) 1 ㎕
5 '-CGA TAC GAC GGG CGT ACT AGC GNN NNN NNN N-3 '
1O mM dNTP 1 ㎕
TIM (60 fg/㎕) 1 ㎕
NAC1 (60 fg/㎕) 1 ㎕
총 부피 12 ㎕
65℃에서 5분간 항온처리한 후 >1분간 얼음 상에 방치한다.
하기 반응 혼합물을 튜브에 첨가하고 천천히 피펫팅에 의해 혼합한다:
5X First-Strand 완충액 4 ㎕
0.1 M DTT 2 ㎕
RNaseOUT 1 ㎕
Superscript III 1 ㎕
총 부피 8 ㎕
PCR 장치 상에서 하기 프로그램을 작동시킨다:
25℃ - 10분
5O℃ - 50분
85℃ - 5분
3. 프라이머 L을 이용한 다중 PCR의 분할
a. 반응물 A:
1OX PCR buffer 5 ㎕
50 mM MgC12 4 ㎕
50X dNTP 2 ㎕
프라이머 L (100 μM) 1 ㎕
5'-CGA TAC GAC GGG CGT ACT AGC G-3'
프라이머 A 혼합물 (1 μM) 2 ㎕
5x Q-용액 5 ㎕
RT 템플릿 (단계 2) 10 ㎕
플라티늄 taq 2 ㎕
뉴클레아제 무함유 물 18 ㎕
UDG 1 ㎕
총 부피 50 ㎕
b. 반응물 B:
1OX PCR 완충액 5 ㎕
50 mM MgC12 4 ㎕
50X dNTP 2 ㎕
프라이머 L (100 μM) 1 ㎕
5'-CGA TAC GAC GGG CGT ACT AGC G-3'
프라이머 B 혼합물 (1 μM) 2.5 ㎕
5x Q-용액 5 ㎕
RT 템플릿 10 ㎕
플라티늄 taq 2 ㎕
뉴클레아제 무함유 물 17.5 ㎕
UDG 1 ㎕
총 부피 50 ㎕
하기 PCR 프로그램을 작동시킨다:
94℃ - 3분
5회 순환:
94℃ - 30초
50℃ - 90초
72℃ - 2분
35회 순환:
94℃ - 30초
64℃ - 2분
72℃ - 5분
4℃ - 유지
어레이 제조
Tag IQ-EXPCR - 1.0 kb Tag IQ-EX 또는 7.5 kb Tag IQ-EX
1.0 kb Tag IQ-EX PCR
정방향 프라이머 (1 kb) 3 ㎕
역방향 프라이머 3 ㎕
Tag IQ-EX 5 ㎕
MgCl2 (50 mM) 5 ㎕
dNTP (10 mM) 2 ㎕
1OX PCR 완충액 10 ㎕
플라티늄 Taq DNA 중합효소 1 ㎕
물 71 ㎕
총 부피 100 ㎕
· 94℃, 3'
· 30회 순환 94℃, 30"; 68℃, 30"; 72℃, 40"
· 72℃, 10'
7.5 kb Tag IQ-EX PCR
정방향 프라이머 (7.5 kb) 3 ㎕
역방향 프라이머 3 ㎕
Tag IQ-EX 5 ㎕
dNTP (LA PCR kit) 16 ㎕
1OX PCR 완충액 (LA PCR kit) 10 ㎕
TaKaRa Taq 1 ㎕
물 62 ㎕
총 부피 100 ㎕
· 94℃, 3'
· 30회 순환 94℃, 30"; 68℃, 7'30"
· 68℃, 10'
정제된 PCR 생성물 (Tag IQ-EX 및 다중 PCR) - QIAquick® PCR purification kit (Qiagen, Cat # 28106)
a) 완충액 PB 500 ㎕를 PCR 샘플 100 ㎕에 첨가한다(반응물 A 및 B를 배합함).
b) 제공된 2 ㎖ 회수 튜브 중에 QIAquick 회전 컬럼을 배치한다.
c) DNA를 결합시키기 위해, 샘플을 QIAquick 컬럼에 적용하고 30∼60초 동안 원심분리한다.
d) 용출액을 제거한다. 동일한 튜브에 다시 QIAquick 컬럼을 배치한다.
e) 세척을 위해, 완충액 PE 0.75 ㎖를 QIAquick 컬럼에 첨가하고 30∼60초 동안 원심분리한다.
f) 용출액을 제거하고 동일한 튜브에 다시 QIAquick 컬럼을 배치한다.
g) 추가 1분 동안 컬럼을 원심분리한다.
h) 청정한 1.5 ㎖ 미세원심분리 튜브 중에 QIAquick 컬럼을 배치한다.
i) DNA를 용리시키기 위해, add 완충액 EB 40 ㎕ (10 mM Tris-Cl, pH 8.5) 또는 H2O를 QIAquick 막 중심에 첨가하고, 컬럼을 1분간 정치시킨 후, 1분간 컬럼을 원심분리한다.
j) PCR 생성물의 O.D.값을 측정한다.
단편 및 표지
1. 단편용 샘플 당 1개의 튜브를 제작하고, 각 반응물에 대해 EB 완충액을 최종 부피 35 ㎕에 첨가한다. 한 샘플로서 Tag IQ-EX를 처리한다.
라인 1 어레이에 첨가하기 위한 생성물의 총 μg 1.4 μg
라인 2 단편 DNA에 요구되는 단편화 시약 수 U 라인 1 x 0.15 = 0.21 U
라인 3 단편화 시약의 활성 (U/㎕) 3 U/㎕
라인 4 각 반응물에 요구되는 단편화 시약의 부피
(㎕)
라인 2 ÷ 라인 3 = 0.07
라인 5 각 반응물에 요구되는 물 부피 (㎕) 3.3 - 라인 4 = 3.23
2. 얼음 상에서 단편화 칵테일을 제조한다.
1OX 단편화 완충액 4.3 ㎕
3.23
단편화 시약 0.07 ㎕
총 부피 7.6 ㎕
3. 얼음 상에서 단편화 칵테일을 냉각시킨 후, 7.6 ㎕를 단계 1 & 2에서 제조된 각 DNA에 첨가한다.
4. 하기 프로그램을 작동시킨다.
· 37℃, 5'
· 95℃, 10'
· 4℃, 유지
5. (반응 당) 표지 칵테일을 제조한다.
Tdt 완충액 (5X) 12 ㎕
GeneChip DNA 표지 시약 (5 mM) 2 ㎕
TdT (30U/㎕) 3.4 ㎕
총 17.4 ㎕
6. 표지 칵테일 17.4 ㎕를 하나의 각 반응물 및 단편화된 대조군 PCR 생성물에 첨가한다.
7. 하기 프로그램을 작동시킨다.
· 37℃, 30'
· 95℃, 5'
· 4℃, 유지
혼성화
1. 45℃로 설정된 혼성화 오븐을 작동하고, 실온에서 칩을 가온한다.
2. 예비 혼성화 용액을 제조한다.
1% Tween-20 2 ㎕
1 M Tris, pH 7.8 2 ㎕
물 196 ㎕
(칩 당) 총 부피 200 ㎕
3. 45℃에서 예비 혼성화 완충액으로 칩을 예비 혼성화시킨다.
4. 혼성화 마스터 혼합물을 조합한다.
Tag IQ-EX* (단편화된 0.26 μg) 1.9
5 M TMAC 132 ㎕
1 M Tris, pH 7.8 2.2 ㎕
1 % Tween-20 2.2 ㎕
Herring sperm DNA (10 mg/㎖) 2.2 ㎕
아세틸화된 BSA 2.2 ㎕
컨트롤 올리고 B2 3.4 ㎕
물 13.9 ㎕
(칩 당) 최종 부피 160 ㎕
* 하기 계산을 사용하여 혼성화 마스터 혼합물에 대해 Tag IQ-EX의 단편화 정도를 측정함.
· 정제된 PCR 생성물 농도. (예, 100 ng/㎕) x 35 ㎕ = 3500 ng
· 단편화 및 표지 후 최종 부피는 60 ㎕임.
· 단편화된 Tag IQ-EX의 최종 농도 = 58.3 ng/㎕
· 260 /58.3 = 4.4658.3 ㎕가 필요할 것.
5. 160 ㎕를 60 ㎕ 표지된 샘플에 첨가한다. 하기 프로그램을 작동시킨다.
· 95℃, 5'
· 45℃, 5'
6. 칩으로부터 예비 혼성화 완충액을 제거하고 혼성화 혼합물로 채운다.
7. 45℃, 60 rpm에서 밤새 혼성화한다.
세척 및 착색
1. 세척 완충액 A & B를 제조한다.
세척 A
2OX SSPE 300 ㎖
10 % Tween-20 1 ㎖
물 699 ㎖
0.2 μm 필터를 통해 여과시키고 실온에서 뚜껑을 덮어 보관한다.
세척 B
2OX SSPE 30 ㎖
10 % Tween-20 1 ㎖
물 969 ㎖
0.2 μm 필터를 통해 여과시키고 실온에서 뚜껑을 덮어 보관한다.
2. (각 칩) SAPE 착색 용액을 제조한다.
2OX SSPE 360 ㎕
1 % Tween-20 12 ㎕
50 mg/㎖ 아세틸화된 BSA 50 ㎕
SAPE 12 ㎕
DI 물 766 ㎕
잘 혼합하고 2개의 600 ㎕ 분취물로 나눈다(착색 1 & 착색 3).
3. (각 칩) 항체 용액을 제조한다.
2OX SSPE 180 ㎕
1 % Tween-20 6 ㎕
50 mg/㎖ 아세틸화된 BSA 25 ㎕
10 mg/㎖ 일반 goat IgG 6 ㎕
0.5 mg/㎖ 바이오티닐화된 항체 3.6 ㎕
DI 물 379.4 ㎕
최종 부피 600 ㎕
4. 세척 프로토콜 - DNAARRAY WS4를 작동시킨다.
기존 방법과는 달리, 최적화된 RPM v.1 분석은 병원체를 동정할 뿐 아니라, 대량의 병원체를 동일한 분석 내에서 검출되고 계통발생학적으로 카테고리화될 수 있다. 상기 서열 정보는 순환하며 나타나는 바이러스 (즉, 인플루엔자)의 유전적 변이 분석용으로 강력한 도구이며, 광범위한 변이체(예, HAdV)를 위한 RPM v.1의 능력을 입증하였다. 또한 기지의 변이체의 움직임을 추적하는데 유용하다. 이러한 유용성은 A/A/Panama/2007/99형 균주(2003년 인플루엔자 시즌 이전)에서 A/Fujian/411/2002형 균주(2003-2004 인플루엔자 시즌)로, 그리고나서 A/California/7/2004형 균주(2004-2005 인플루엔자 시즌)로의 계통 변화를 제시하는 인플루엔자 A 양성 임상 샘플에서 명백하게 입증되었다. 인플루엔자 A 바이러스 중 비교적 보존된 단 하나의 M 유전자(H1N1) 서열을 RPM v.1 상에 타일링하였다. 하지만, M 유전자 ProSeq는 여전히 이종 아형의 상동 영역을 검출할 수 있고, 올바르게 구별할 수 있다(표 10). 이러한 M 유전자 ProSeq는 어레이 상에 타일링되지 않은 항원성 HA 및 NA 서열에 대한 임의의 기타 유형의 인플루엔자 바이러스를 이론상 검출할 수 있어야 한다.
이러한 연구는 상기 시스템이 탁월한 임상 감도 및 특이성, 그 능력이 감도의 손실없이 복합적인 동시감염을 해결하기 위한 능력을 제시할 수 있고, 상기 감도는 26개의 모든 표적하는 병원체 및 잠재적 세균전 병원체와 유사하다는 것을 입증하고 있다. 배양 및 PCR 분석과는 대조적으로, 이러한 분석 플랫폼은 HAdV 및 인플루엔자 A 바이러스 둘다에 대해 유사한 검출 감도 및 특이성을 제시하였다(표 7). 상기 데이타는 진단 도구로서 RPM v.1 시스템을 사용한 실행가능성을 지원하여 직접 (미배양된) 임상 견본에서, 통상적인 검출 방법과 서로 관련된 방식으로 임상적으로 관련된 아데노바이러스 및 인플루엔자 A 바이러스 균주를 올바르게 동정하고 분류하고 있다.
명백하게, 본 발명의 다수의 변형 및 변이는 상기 내용 중에 가능하다. 따라서, 청구하고 있는 본 발명은 특정하게 기술된 내용보다 달리 실시될 수 있는 것으로 해석한다. 예를 들어 "a," "an," "the," 또는 "상기"를 본문에 사용하여 단수로서 물질을 청구하고 있는 임의의 기준물은 단수 물질로 제한되어 제조되지 않는다.
SEQUENCE LISTING <110> Lin, Bauchuan Blaney, Kate M Malanoski, Anthony P Schnur, Joel M Stenger, David A <120> MULTIPLEXED POLYMERASE CHAIN REACTION FOR GENETIC SEQUENCE ANALYSIS <130> 97439US2 <150> 60/691,768 <151> 2005-06-16 <150> 60/735,876 <151> 2005-11-14 <150> 60/735,824 <151> 2005-11-14 <150> 60/743,977 <151> 2006-03-30 <150> 11/177,647 <151> 2005-07-02 <150> 11/177,646 <151> 2005-07-02 <150> 11/268,373 <151> 2005-11-07 <150> 11/422,425 <151> 2006-06-06 <150> 11/422,431 <151> 2006-06-06 <160> 147 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer tail sequence <400> 1 cgatacgacg ggcgtactag cg 22 <210> 2 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer tail sequence <220> <221> misc_feature <222> (23)..(31) <223> n is a, t, c, or g <400> 2 cgatacgacg ggcgtactag cgnnnnnnnn n 31 <210> 3 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 3 cgatacgacg ggcgtactag cggccaacaa ctcaaccgac ac 42 <210> 4 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 4 cgatacgacg ggcgtactag cgacacttcg catcacattc atcc 44 <210> 5 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 5 cgatacgacg ggcgtactag cgacttcccg gaaatgacaa ca 42 <210> 6 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 6 cgatacgacg ggcgtactag cgggtttgtc attgggaatg ct 42 <210> 7 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 7 cgatacgacg ggcgtactag cggccattcc acaacataca cc 42 <210> 8 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 8 cgatacgacg ggcgtactag cgagctacca tgattgccag tg 42 <210> 9 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 9 cgatacgacg ggcgtactag cgacgttgtt gctggaaagg ac 42 <210> 10 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 10 cgatacgacg ggcgtactag cgaaacttcc gctgtaccct ga 42 <210> 11 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 11 cgatacgacg ggcgtactag cgggaaatat gccccaaact agc 43 <210> 12 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 12 cgatacgacg ggcgtactag cgatgcagct tttgccttca ac 42 <210> 13 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 13 cgatacgacg ggcgtactag cgttctaacc gaggtcgaaa cg 42 <210> 14 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 14 cgatacgacg ggcgtactag cgctctggca ctccttccgt ag 42 <210> 15 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 15 cgatacgacg ggcgtactag cggggaggtc aatgtgactg gt 42 <210> 16 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 16 cgatacgacg ggcgtactag cggggcaatt tcctatggct tt 42 <210> 17 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 17 cgatacgacg ggcgtactag cggtgaaccg ttctgcaaca aa 42 <210> 18 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 18 cgatacgacg ggcgtactag cgccaatctt ggatgccatt ct 42 <210> 19 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 19 cgatacgacg ggcgtactag cgcattgaca gaagatggag aagg 44 <210> 20 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 20 cgatacgacg ggcgtactag cgaagcacag agcgttccta g 41 <210> 21 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 21 cgatacgacg ggcgtactag cgctgtggac cgtgaggata ct 42 <210> 22 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 22 cgatacgacg ggcgtactag cgttggcggg tatagggtag agc 43 <210> 23 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 23 cgatacgacg ggcgtactag cgttattcag cagcacctcc ttg 43 <210> 24 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 24 cgatacgacg ggcgtactag cgggtggcag gttgaatact ag 42 <210> 25 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 25 cgatacgacg ggcgtactag cgggctgata atcttccacc tcc 43 <210> 26 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 26 cgatacgacg ggcgtactag cgctctcacg gcaactggtt taa 43 <210> 27 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 27 cgatacgacg ggcgtactag cggacaggac gcttcggagt ac 42 <210> 28 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 28 cgatacgacg ggcgtactag cgggcaacat tggcatagag gaag 44 <210> 29 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 29 cgatacgacg ggcgtactag cgggtggagt gatggcttcg 40 <210> 30 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 30 cgatacgacg ggcgtactag cgagtgccat ctatgctatc tcc 43 <210> 31 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 31 cgatacgacg ggcgtactag cggccgtgga gtaaatggct aa 42 <210> 32 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 32 cgatacgacg ggcgtactag cgagtcttcc aagaccgtcc aa 42 <210> 33 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 33 cgatacgacg ggcgtactag cgatgtgacc accgaccgta g 41 <210> 34 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 34 cgatacgacg ggcgtactag cggttgctgg agaacggtat g 41 <210> 35 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 35 cgatacgacg ggcgtactag cgtctacccc tatgaagatg aaagc 45 <210> 36 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 36 cgatacgacg ggcgtactag cgggataggc agttgtgctg ggcat 45 <210> 37 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 37 cgatacgacg ggcgtactag cgtgagtgcc agcgagaaga g 41 <210> 38 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 38 cgatacgacg ggcgtactag cgcaggaggt gaggtagttg aatc 44 <210> 39 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 39 cgatacgacg ggcgtactag cgtcaaatcc tcgttgacag ac 42 <210> 40 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 40 cgatacgacg ggcgtactag cgtgcactgt tgcctccatt ga 42 <210> 41 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 41 cgatacgacg ggcgtactag cgacaggaat tggctcagat atg 43 <210> 42 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 42 cgatacgacg ggcgtactag cgacatgatc tcctgttgtc gt 42 <210> 43 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 43 cgatacgacg ggcgtactag cgtcgaggtt gccaggatat agg 43 <210> 44 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 44 cgatacgacg ggcgtactag cgggactatg agatgcctga ttgc 44 <210> 45 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 45 cgatacgacg ggcgtactag cgcaactatt agcagtcaca ctcg 44 <210> 46 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 46 cgatacgacg ggcgtactag cgaagttggc attgtgttca gtg 43 <210> 47 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 47 cgatacgacg ggcgtactag cgtcatccag actgtcaaag g 41 <210> 48 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 48 cgatacgacg ggcgtactag cgaaacagga aacacggaca cc 42 <210> 49 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 49 cgatacgacg ggcgtactag cgctctatca tcacagatct cagc 44 <210> 50 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 50 cgatacgacg ggcgtactag cgcatgagtc tgactggttt gc 42 <210> 51 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 51 cgatacgacg ggcgtactag cgacaaagat ggctcttagc aaag 44 <210> 52 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 52 cgatacgacg ggcgtactag cgacccagtg aatttatgat tagc 44 <210> 53 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 53 cgatacgacg ggcgtactag cgaaaaccaa cccaaccaaa cc 42 <210> 54 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 54 cgatacgacg ggcgtactag cggcacatca taattgggag tgtc 44 <210> 55 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 55 cgatacgacg ggcgtactag cggctctctt ggcgttcttc ag 42 <210> 56 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 56 cgatacgacg ggcgtactag cgtcattacc agccgacagc ac 42 <210> 57 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 57 cgatacgacg ggcgtactag cgccgtcagc gatctctcca c 41 <210> 58 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 58 cgatacgacg ggcgtactag cgcctgtcca ccactccttg tc 42 <210> 59 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 59 cgatacgacg ggcgtactag cggcttgaaa gggcagttct gg 42 <210> 60 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 60 cgatacgacg ggcgtactag cgcaggtctc cgattgtgat tgc 43 <210> 61 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 61 cgatacgacg ggcgtactag cgctctggtg tgtggtgctt ata 43 <210> 62 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 62 cgatacgacg ggcgtactag cgctcggcac ggcaactgtc 40 <210> 63 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 63 cgatacgacg ggcgtactag cgatgtggat gacgtttagg ta 42 <210> 64 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 64 cgatacgacg ggcgtactag cgggttgatg gcagtcggta a 41 <210> 65 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 65 cgatacgacg ggcgtactag cgaagaagag ttcatgacgg ac 42 <210> 66 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 66 cgatacgacg ggcgtactag cgtggttgtt tggttggtta ttcg 44 <210> 67 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 67 cgatacgacg ggcgtactag cgccgatgac ttatagtatt ga 42 <210> 68 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 68 cgatacgacg ggcgtactag cgataatctt gatgccactt agc 43 <210> 69 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 69 cgatacgacg ggcgtactag cggttcttca ggctcaggtc aatc 44 <210> 70 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 70 cgatacgacg ggcgtactag cgacagcggt atgtactggt cata 44 <210> 71 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 71 cgatacgacg ggcgtactag cgtgggaata gtgtgcgtat gc 42 <210> 72 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 72 cgatacgacg ggcgtactag cgacatcacc gcgacgcagc aa 42 <210> 73 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 73 cgatacgacg ggcgtactag cggattccgc gatgccgatg 40 <210> 74 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 74 cgatacgacg ggcgtactag cgcgcccatg tatttagaga accg 44 <210> 75 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 75 cgatacgacg ggcgtactag cgccggcgtc gtgcgcgaaa 40 <210> 76 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 76 cgatacgacg ggcgtactag cgcagccacg tcagccagcc 40 <210> 77 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 77 cgatacgacg ggcgtactag cggagcgaat atctggcaca cc 42 <210> 78 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 78 cgatacgacg ggcgtactag cggggccagg tctagaacga at 42 <210> 79 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 79 cgatacgacg ggcgtactag cgtggagtac aatggtctcg agc 43 <210> 80 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 80 cgatacgacg ggcgtactag cgtttgcatg aagtctgaga acga 44 <210> 81 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 81 cgatacgacg ggcgtactag cgacggcatt acaacggcta g 41 <210> 82 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 82 cgatacgacg ggcgtactag cgcatcttct ggtaatccct gttc 44 <210> 83 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 83 cgatacgacg ggcgtactag cgacagcgtt caatctcgtt gg 42 <210> 84 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 84 cgatacgacg ggcgtactag cgagagaatt gcgatacgtt acag 44 <210> 85 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 85 cgatacgacg ggcgtactag cgccttacaa cctattgaca cctg 44 <210> 86 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 86 cgatacgacg ggcgtactag cgacacgaga gctacctgca ga 42 <210> 87 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 87 cgatacgacg ggcgtactag cgtttataca atatgggcag gg 42 <210> 88 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 88 cgatacgacg ggcgtactag cgtcgtaagc tgttcttctg gtac 44 <210> 89 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 89 cgatacgacg ggcgtactag cgtcattgct tgatgaaact gat 43 <210> 90 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 90 cgatacgacg ggcgtactag cgttggatat tcaccgaaca ctag 44 <210> 91 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 91 cgatacgacg ggcgtactag cgcttgtgga aatgagtcaa cgg 43 <210> 92 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 92 cgatacgacg ggcgtactag cgaggtagct atatttcgct tgac 44 <210> 93 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 93 cgatacgacg ggcgtactag cggagcgtct acgtcctggt ga 42 <210> 94 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 94 cgatacgacg ggcgtactag cgcattggtt tcgctgtttt ga 42 <210> 95 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 95 cgatacgacg ggcgtactag cgtggaagag tgagggtgga tac 43 <210> 96 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 96 cgatacgacg ggcgtactag cgaataatcc ctctgttgac gaa 43 <210> 97 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 97 cgatacgacg ggcgtactag cgaggagcaa tgagaattac acg 43 <210> 98 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 98 cgatacgacg ggcgtactag cgctaagttc caatactctt gc 42 <210> 99 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 99 cgatacgacg ggcgtactag cggccggtac ttatgtatgt gcatt 45 <210> 100 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 100 cgatacgacg ggcgtactag cgcatcattg gcggttgatt ta 42 <210> 101 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 101 cgatacgacg ggcgtactag cggggaacat acgcttccag at 42 <210> 102 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 102 cgatacgacg ggcgtactag cgttccacat tttgtttggg aaa 43 <210> 103 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 103 cgatacgacg ggcgtactag cgccttatcc gactcgcaat gt 42 <210> 104 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 104 cgatacgacg ggcgtactag cgcagtgtga ggttatgtgg tgga 44 <210> 105 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 105 cgatacgacg ggcgtactag cgttggttgc gcaattcaag t 41 <210> 106 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 106 cgatacgacg ggcgtactag cgtgttgttc tttgtgcagg aga 43 <210> 107 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 107 cgatacgacg ggcgtactag cgtcgtaatg ttagctgtat catc 44 <210> 108 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 108 cgatacgacg ggcgtactag cgtacattag ctgtccactt accg 44 <210> 109 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 109 cgatacgacg ggcgtactag cggtgggtgg tggtcttaag ttt 43 <210> 110 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 110 cgatacgacg ggcgtactag cgctggatat taccagtgtc att 43 <210> 111 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 111 cgatacgacg ggcgtactag cgactgataa aggggagtgg ata 43 <210> 112 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 112 cgatacgacg ggcgtactag cgctcgcctt gctctttgag c 41 <210> 113 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 113 cgatacgacg ggcgtactag cgggacacaa gccctctcta cg 42 <210> 114 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 114 cgatacgacg ggcgtactag cgtagatacg gttacggtta cag 43 <210> 115 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 115 cgatacgacg ggcgtactag cgcatgggaa gctgttttga tg 42 <210> 116 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 116 cgatacgacg ggcgtactag cgcccgaaga attgttccaa tc 42 <210> 117 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 117 gaccaatcct gtcacctctg a 21 <210> 118 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 118 gtatatgagk cccatrcaac t 21 <210> 119 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 119 tcggtgggaa agaatttgac 20 <210> 120 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 120 ttcctgatag gggctctgtg 20 <210> 121 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 121 acaagcaagg agatagcata gatg 24 <210> 122 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 122 gtaggagaag gtgtatgagt tagc 24 <210> 123 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 123 acctgggcta attgggattc 20 <210> 124 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 124 aatgcctgtt ggagcttgtt 20 <210> 125 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 125 ggcttatgtg gccccttact 20 <210> 126 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 126 aagatggccg cgtattattg 20 <210> 127 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 127 ggctcagata tgcgagaaca 20 <210> 128 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 128 ttggtccggg taataatgag a 21 <210> 129 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 129 ccatatgcgg cattataccc 20 <210> 130 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 130 gcagtctctc tgcgttttcc 20 <210> 131 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 131 tgctttaccc aaggcaaaaa 20 <210> 132 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 132 agcctcatct gccaggtcta 20 <210> 133 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 133 aagatggctc ttagcaaagt caa 23 <210> 134 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 134 tactatctcc tgtgctccgt tg 22 <210> 135 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 135 tggggcaaat acaaagatgg 20 <210> 136 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 136 cacatcataa ttgggagtgt caa 23 <210> 137 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 137 ccaaccaaac aacaacgttc a 21 <210> 138 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 138 accttgactg gaggccgtta 20 <210> 139 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 139 tcaactcgaa taacggtgac ttcttaccac tg 32 <210> 140 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 140 tgcagagcgt cctttggtct at 22 <210> 141 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 141 ctcttactcg tggtttccaa cttga 25 <210> 142 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 142 tggcgcccat aagcaacact cgaa 24 <210> 143 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 143 aacagatgta agcagctccg ttatc 25 <210> 144 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 144 cgatttttat tggatgctgt acattt 26 <210> 145 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 145 tgccatagca tgacacaatg gctcct 26 <210> 146 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 146 cggcagcgtc tcaattcgtt c 21 <210> 147 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 147 caagccgcct tcctcatagc 20

Claims (22)

  1. 유기체(organism)의 백그라운드 DNA를 포함하고 사전규명된 병원체 세트 유래의 병원체 핵산을 하나 이상 포함하는 것으로 의심되는 표적 샘플을 생산하기 위하여 유기체로부터 얻어진 임상 샘플로부터 핵산을 추출하는 단계;
    사전규명된 병원체 세트에서 확인된 유전자에 상응하는 복수의 PCR 프라이머를 상기 표적 샘플에 첨가하는 단계로서,
    여기서, 상기 PCR 프라이머는 30개 이상의 상이한 프라이머쌍을 포함하며, 상기 프라이머는 각 병원체에 대한 하나 이상의 프라이머 쌍을 포함하고, 샘플 내 사전규명된 임의 병원체 세트의 DNA 또는 임의 백그라운드 DNA와 상동성이 없는 테일 서열을 포함하는 것인 단계; 및
    배합된 표적 샘플과 PCR 프라이머 상에서 중합효소 연쇄 반응을 수행하여 상기 유전자에 상응하는 핵산의 서브세트를 증폭시켜 증폭된 샘플을 얻는 단계로서,
    상기 중합효소 연쇄 반응에서 하나 이상의 프라이머 농도는 100 nM이하인 단계
    를 포함하는 핵산 증폭 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 중합효소 연쇄 반응에서 각 프라이머의 농도는 100 nM이하인 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 테일 서열은 CGATACGACGGGCGTACTAGCG (서열 번호 1)인 방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 테일 서열은 CGATACGACGGGCGTACTAGCGNNNNNNNNN (서열 번호 2)인 방법.
  5. 삭제
  6. 제1항에 있어서, 상기 임상 샘플은 비 세정물, 인후 도찰물, 객담, 또는 혈액을 포함하는 방법.
  7. 삭제
  8. 제1항에 있어서, 상기 유기체는 인간인 방법.
  9. 제1항에 있어서, 상기 병원체는 호흡기 병원체인 방법.
  10. 제1항에 있어서, 상기 병원체는 장내 병원체 또는 생물 위협(biothreat) 병원체인 방법.
  11. 제1항에 있어서, 상기 증폭된 핵산은 200 개 미만의 뉴클레오티드 서열 및 2000 개 초과의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 방법.
  12. 제1항에 있어서, 상기 테일 서열은 프라이머 이량체의 형성을 감소시키는 것인 방법.
  13. 제1항에 있어서, 상기 PCR 프라이머는 50개 이상의 상이한 프라이머 쌍을 포함하는 것인 방법.
  14. 제1항에 있어서,
    복수의 PCR 프라이머들을 첨가하는 단계 및 중합효소 연쇄 반응을 수행하는 단계는 각각 표적 샘플의 복수의 분취물 상에서 수행하고;
    각 분취물에 대해 상이한 복수의 PCR 프라이머를 사용하고;
    PCR 반응 후 상기 분취물을 혼합하는 방법.
  15. 제1항에 있어서,
    상기 증폭된 핵산의 적어도 일부분과 상보적인 복수의 핵산 서열을 포함하는 마이크로어레이와 상기 증폭된 샘플을 접촉시키는 단계; 및
    상기 증폭된 핵산을 상보적인 핵산과 혼성화하는 단계
    를 더 포함하는 방법.
  16. 제15항에 있어서, 상기 상보적인 핵산은 25량체 내지 29량체인 방법.
  17. 제15항에 있어서, 상기 상보적인 핵산은 증폭된 핵산 중 하나 이상과 완벽하게 대응하는 프로브와, 각각의 완벽하게 대응하는 프로브의 중심부에 3개의 상이한 단일 뉴클레오티드 다형성을 포함하는 방법.
  18. 제15항에 있어서, 상보적인 핵산과 혼성화된 증폭된 핵산을 검출하는 단계를 더 포함하는 방법.
  19. 제18항에 있어서, 증폭된 핵산을 검출한 결과를 기준으로 병원체를 동정하는 단계를 더 포함하는 방법.
  20. 제19항에 있어서, 동정은 패턴 인식을 기준으로 하는 것인 방법.
  21. 제19항에 있어서, 동정은 증폭된 핵산의 염기 서열 분석 결과를 기준으로 하는 것인 방법.
  22. 제21항에 있어서, 동정은 병원체의 균주를 포함하는 것인 방법.
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