KR100977214B1

KR100977214B1 - 약물－함입 인산칼슘 복합박막

Info

Publication number: KR100977214B1
Application number: KR20070101242A
Authority: KR
Inventors: 이우걸; 정재영; 홍윤정
Original assignee: 단국대학교 산학협력단
Priority date: 2007-10-09
Filing date: 2007-10-09
Publication date: 2010-08-24
Also published as: WO2009048270A1; KR20090036201A

Abstract

본 발명은 다음의 단계를 포함하는 약물-함유 인산칼슘 복합 박막의 제조방법에 관한 것이다: (a) 약물 용액을 제조하는 단계; (b) 칼슘 이온 용액 및 인산 용액을 제조하는 단계; (c) 상기 약물 용액, 칼슘 이온 용액 및 인산 용액을 혼합하는 단계; 및 (d) 상기 단계 (c)의 혼합 용액을 고체 기질에 적용하여 약물이 함유된 인산칼슘 복합 박막을 제조하는 단계. 본 발명은 고체 표면에 저결정성 3차원 입체구조를 갖는 약물이 함입된 다공성 코팅층을 형성함으로써, 인체 삽입을 위한 인공대체물질 또는 의료용 이식물(implant)의 표면이 우수한 생체적합성, 세포적합성 및 골전도성(osteoconductivity)를 갖도록 개질하는데 유용하게 응용할 수 있다.

인산칼슘, 복합막, 약물, 골-형성 촉진제

Description

약물－함입 인산칼슘 복합박막{Drug－Incorporated Calcium Phosphate Hybrid Thin Film}

본 발명은 약물－함입 인산칼슘 복합박막에 관한 것이다.

현재 손상된 경조직을 대체하기 위한 다양한 인공합성 재료들에 관한 연구가 활발하게 진행되고 있으며, 특히 칼슘과 인이 주성분인 뼈의 화학적 구조와 유사한 수산화인회석과 같은 인산칼슘 계통의 물질들이 활용되고 있다(J.C. Elliott, Structure and chemistry of the apatites and other calcium orthophosphates, Elsvier, New York, 1994; H. Aoki, Medical Applications of hydroxyapatite, Ishiyaku EuroAmerica, Inc., Tokyo, 1994).

수산화인회석을 포함한 칼슘과 인이 주성분인 인산칼슘의 경우, 기계적 강도가 약하여, 하중을 받는 부위의 대체물질로는 적합하지 못하며, 이러한 단점을 보완하기 위해서 금속이나 세라믹과 같은 고체 지지체의 표면에 코팅층을 형성하여 활용함으로써 대체물질의 기계적인 특성은 물론 생물학적 기능성이 향상된 형태의 경조직 대체물질로 활용될 수 있다. 따라서 고체표면에 인산칼슘 코팅층을 형성하는 다양한 방법이 연구되어 왔다 (Ha et al, J. Mater . Sci .- Mater . M., 8:881(1997); Weng and Baptista, J. Mater . Sci .- Mater . M., 9:159(1998); Xu and Lu, J. Mater . Sci .- Mater . M., 10: 243(1999); 및 Pham et al, J. Mater . Sci .- Mater . M., 11:383(2000)).

이와 같이 인산칼슘 코팅층을 형성하기 위한 다양한 방법이 발표되어 있지만, 대부분의 방법이 생체의 조건과는 상당히 다른 조건, 예를 들면 고온, 진공 등에서 제조하는 방법이기 때문에 생체 경조직의 형성조건과는 매우 상이한 조건 하에서 진행되며, 결과적으로 합성된 코팅층의 물리화학적 성질도 상당히 다른 문제점이 있다. 또한 이러한 방법들은 재료의 외부표면에서만 코팅층을 형성할 수 있고, 다공성 재료의 내부표면에는 코팅을 형성하는 것이 매우 어렵거나 불가능한 경우도 있다. 또한 이와 같은 제조공정을 이용하는 경우, 합성 인산칼슘 박막내에 유기화합물 형태의 기능성 약물을 함입할 수 없다. 뿐만 아니라 이러한 코팅층을 형성하기 위해서는 상당히 고가의 장비들을 필요로 하기 때문에, 제조단가가 매우 높아질 수 있다. 따라서 기존의 방법들을 사용하는 경우, 활용도가 매우 제한적이고 경제적으로 비효율적이다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

본 발명자들은 약물이 함유된 생체적합성이 우수한 인산칼슘 매트릭스를 개발하고자 노력하였다. 특히, 본 발명자들은 인체 삽입을 위한 인공대체물 또는 이식물(implant)의 표면을 개질함에 있어서 생체 내 이식된 인공대체물이 생체 내에서 우수한 골 형성(osteogenesis)을 촉진하여 원하는 치료 효과를 발휘할 수 있는 방법을 개발하고자 노력하였다. 그 결과, 인산칼슘 박막에 약물, 특히 골-형성 촉진제를 함입시키는 경우에는 골-형성을 매우 효율적으로 촉진시킬 수 있음을 발견함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 약물-함유 인산칼슘 복합 박막의 제조방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 골-형성 촉진제를 함유하는 골-형성 촉진용 인산칼슘 복합 박막을 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 골-형성 촉진용 인산칼슘 복합 박막이 코팅된 인공대체물 또는 이식물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 약물-함유 인산칼슘 복합 박막의 제조방법을 제공한다:

(a) 약물 용액을 제조하는 단계;

(b) 칼슘 이온 용액 및 인산 용액을 제조하는 단계;

(c) 상기 약물 용액, 칼슘 이온 용액 및 인산 용액을 혼합하는 단계; 및

(d) 상기 단계 (c)의 혼합 용액을 고체 기질에 적용하여 약물이 함유된 인산칼슘 복합 박막을 제조하는 단계.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 본 발명의 방법에 따라 제조된 골-형성 촉진제를 함유하는 골-형성 촉진용 인산칼슘 복합 박막을 제공한다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 골-형성 촉진용 인산칼슘 복합 박막이 코팅된 인공대체물 또는 이식물을 제공한다.

본 발명자들은 약물이 함유된 생체적합성이 우수한 인산칼슘 매트릭스를 개발하고자 노력하였다. 특히, 본 발명자들은 인체 삽입을 위한 인공대체물 또는 이식물(implant)의 표면을 개질함에 있어서 생체 내 이식된 인공대체물이 생체 내에서 우수한 골 형성(osteogenesis)을 촉진하여 원하는 치료 효과를 발휘할 수 있는 방법을 개발하고자 노력하였다. 그 결과, 인산칼슘 박막에 약물, 특히 골-형성 촉진제를 함입시키는 경우에는 골-형성을 매우 효율적으로 촉진시킬 수 있음을 발견하였다.

본 발명은 약물-함유 인산칼슘 복합 박막의 제조방법에 관한 것이다.

본 발명의 방법을 각각의 단계에 따라 상세하게 설명하면 다음과 같다:

단계 (a): 약물 용액의 제조

본 발명에 따르면, 본 발명에서 인산칼슘 박막에 삽입되는 약물은 특별하게 제한되지 않으며, 바람직하게는 용액화 할 수 있는 약물이다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 인산칼슘 박막에 함입되는 약물은 단백질, 펩타이드, 핵산 분자 또는 화합물이다.

보다 바람직하게는, 이용되는 약물은 연골세포 증식제, 사이토카인, 항암제 또는 골-형성 촉진제이다. 보다 더 바람직하게는, 약물은 골-형성 촉진제이며, 이는 비타민 D, 비타민 D₃, 비타민 C, 란타늄(Ⅲ) 화합물[란타늄 염(란타늄 카보네이트, 란타늄 카보네이트 수화물, 란타늄 클로라이드 등), 란타늄 킬레이트, 란타늄 레진, 란타늄 흡수제 등), 칼시토닌, 타목시펜, 비스포스포네이트, 스타틴, 소듐 플루오라이드, 옥시스테롤(20S-하이드록시콜레스테롤, 22S-하이드록시콜레스테롤l, 22R-하이드록시콜레스테롤, 25-하이드록시콜레스테롤, 프레그나놀론 등), BMP(bone morphogenic protein: BMP2, BMP 7, BMP 14 등), 파라타이로이드 호르몬, IGF-1(insulin-like growth factor-1), TGF-β(transforming growth factor-beta), 칼슘 또는 이들의 조합을 포함한다. 보다 더욱 더 바람직하게는, 골-형성 촉진제 는 비타민 D 또는 비타민 D₃이며, 가장 바람직하게는 비타민 D₃이다.

본 발명자들은 본 발명자에 의해 개발된 인산칼슘 박막이 특히 비타민 D₃ 약물을 함유하는 데 적합하며, 이를 통하여 골-형성을 크게 촉진시킬 수 있음을 발견하였다. 예를 들어, 하기 실시예에 기재된 바와 같이, 비타민 D₃ 함유-인산칼슘 박막의 3차원적 구조는 인산칼슘 박막과 비교하여 크게 차이가 없으며, 비타민 D₃ 함유-인산칼슘 박막은 종래의 어떠한 인산칼슘 박막에 의해 달성된 효과보다 우수한 세포부착 촉진, 세포 분화 촉진 및 골 결절 형성능을 나타내었다.

본 발명에 사용되는 약물은 수용성 또는 알코올(바람직하게는, 에탄올) 용해성을 나타내는 것이 바람직하며, 그 이유는 본 발명에 의해 제조된 박막이 생체 내에 이식되기 때문이며 이러한 용해성은 생체적합성을 향상시킬 수 있다.

단계 (b): 칼슘 이온 용액 및 인산 용액의 제조

이온용액을 제조하는 과정은 본 발명자의 특허(특허등록 제10-0675573호)와 유사하다.

바람직하게는, 칼슘 이온 용액 및 인산 용액을 제조하는 경우에는 물, 보다 바람직하게는 증류수, 보다 바람직하게는 초순수(distilled deionized water)를 용매로 이용한다. 칼슘 이온 용액은 다양한 칼슘원(calcium source)를 물에 용해하여 제조할 수 있다. 이용될 수 있는 칼슘원은 바람직하게는, Ca(NO₃)₂ㆍ4H₂O, CaCl₂ 또는 CaHPO₄이다. 인산 이온 용액은 다양한 인산원(phosphate source)을 물에 용해하여 제조할 수 있다. 이용될 수 있는 인산원은 바람직하게는, (NH₄)₂HPO₄ 또는 NH₄H₂PO₄이다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 칼슘이온용액과 인산이온용액을 제조하기 위한 용매로 물을 사용하기 때문에 제조와 취급이 매우 용이할 뿐만 아니라, 기존에 완충용액의 사용시 완충용액중의 이온성분들이 칼슘이온 또는 인산이온들과 반응하여 칼슘포스페이트 박막 내에 포함될 수 있는 가능성을 최대한 억제할 수 있다는 장점을 갖는다.

단계 (c): 약물 용액, 칼슘 이온 용액 및 인산 용액의 혼합용액의 제조

약물 용액(예컨대, 골-형성 촉진제 용액), 칼슘 이온 용액 및 인산 용액의 혼합용액을 제조한다. 혼합 용액의 제조는 상기 3가지 용액을 단순하게 혼합하여 제조될 수 있다. 바람직하게는, 혼합용액은 수용액이다.

혼합용액을 제조함에 있어서, 약물, 칼슘 이온 및 인산 이온의 농도가 적합하게 되도록 하는 것이 바람직하다.

칼슘이온과 인산이온은 반응성이 매우 높아 용액 내에서 쉽게 침전물을 형성할 수 있기 때문에, 침전물을 형성하는 균일 침전반응(homogeneous precipitation reaction)은 억제하면서 용액 내에 존재하는 이온들이 고체 표면에 코팅층을 형성하는 불균일 침전반응(heterogeneous precipitation reaction)은 원활하게 되도록 칼슘이온과 인산이온의 농도를 적절히 조절하는 것이 바람직하다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 혼합용액에서 칼슘 이온의 농도는 0.1-10 mM, 보다 바람직하게는 1-10 mM, 보다 더 바람직하게는 1-5 mM, 가장 바람직하게는 2-4 mM이다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 혼합용액에서 인산 이온의 농도는 0.1-20 mM, 보다 바람직하게는 2-15 mM, 보다 더 바람직하게는 2-10 mM, 가장 바람직하게는 3-6 mM이다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 혼합용액에서 약물, 특히 골-형성 촉진제의 농도는 1 nM-10 mM, 보다 바람직하게는 100 nM-500 μM, 가장 바람직하게는 100 nM-50 μM이다.

바람직하게는, 단계 (c)에 의해 제조되는 혼합용액은 수용액이다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 단계 (d) 이전 및 단계 (c) 이후에 동공 크기 1 ㎛ 이하, 보다 바람직하게는 0.5 ㎛ 이하, 가장 바람직하게는 0.25 ㎛ 이하의 필터를 이용하여 상기 혼합용액을 여과하는 단계를 추가적으로 포함한다. 칼슘이온과 인산이온의 농도를 적절하게 조절하였다 하더라도 칼슘과 인산은 매우 반응성이 높은 물질들이기 때문에 균일 침전반응에 의한 침전물이 생성될 수 있다. 따라서 제조된 혼합용액을 박막 코팅에 사용하기 전에 적합한 동공 크기의 필터로 여과하여 침전된 결정을 제거하는 단계를 추가로 포함시키는 것이 바람직하다.

단계 (d): 약물이 함유된 인산칼슘 복합 박막의 제조

이어, 상기 혼합용액을 적합한 고체 기질에 적용하여 약물(예컨대, 골-형성 촉진제)가 함유된 인산칼슘 복합 박막을 제조한다. 즉, 약물이 함유된 인산칼슘 복합 박막으로 고체 기질의 표면을 개질한다.

이용될 수 있는 고체 기질은 당업계에서 이용되는 어떠한 기질도 가능하며, 예를 들어, 인체삽입용 인공대체물, 의료용 이식물과 치아 매식용 뼈 시멘트 등과 같은 금속, 세라믹, 유리, 또는 고분자를 포함한 유기물질, 인간, 식물과 동물 등에서 채취한 다양한 생체조직 등의 이용될 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 단계 (d)는 상기 혼합용액을 고체 기질에 적용하여 1-20℃에서 1분-24시간 동안 고체 기질 표면에 박막 형성을 위한 핵을 형성한 다음, 상기 고체 기질을 1-60℃에서 5분 이상 방치하여 인산칼슘 복합 박막을 제조한다.

상기 핵을 형성하는 단계는 보다 바람직하게는, 4-10℃, 가장 바람직하게는 4℃에서 실시된다. 상기 핵을 형성하는 단계는 보다 바람직하게는, 5분-24시간, 보다 바람직하게는 10분-10시간, 보다 더 바람직하게는 30분-3시간, 가장 바람직하게는 30분-2시간 동안 실시된다.

상기 박막을 형성하는 단계는 보다 바람직하게는, 10-50℃, 보다 더 바람직하게는 25-40℃, 가장 바람직하게는 30-40℃에서 실시된다. 상기 박막을 형성하는 단계는 보다 바람직하게는, 10분-24시간, 보다 더 바람직하게는 30분-10시간, 가장 바람직하게는 30분-2시간 동안 실시된다.

이온의 경우, 온도가 상승하면 용해도가 감소되는데, 특히 칼슘이온과 인산이온의 경우, 균일반응(homogeneous reaction)이 발생하여 침전물을 형성하려는 경 향이 매우 강하다. 따라서 코팅층을 형성하기 위해서는 제조과정의 온도를 가능한 한 낮은 상태로 유지하여 균일반응의 발생을 억제하는 것이 필요하다. 따라서 가능한 한 제조온도를 1 내지 20℃ 정도의 저온으로 유지하여 실시하는 것이 바람직하다. 그러나 본 발명의 제조공정은 이온용액의 농도가 적절하게 조절된 경우, 온도의 범위가 4-60℃ 정도의 넓은 온도범위에서도 제조가 가능하다. 가장 바람직하게는 온도조건이 인체의 온도와 동일한 조건인 37℃에서 인산칼슘 복합박막을 형성할 수 있기 때문에, 본 발명은 생체모방형 제조공정이라고 할 수 있다.

본 발명에서 인산칼슘 코팅층 형성은 용액의 pH와 온도 등의 조건들이 인체의 온도와 유사한 조건하에서 제조할 수 있다는 측면에서 생체모방적(biomimetic) 제조과정이라 할 수 있다. 본 발명의 또 다른 우수성은 인산칼슘 박막형성 시간에 있으며, 박막을 형성하는데 5분 내지 24시간 정도로 짧은 시간 내에 박막형성이 가능하다. 그러나 30분 내지 2시간 정도 처리하면 가장 바람직한 제조시간이 될 수 있다.

이와 같은 조건에 의해 형성된 인산칼슘 복합박막의 칼슘이온/인산이온 몰비는 바람직하게는 1.0-2.2이며, 보다 바람직하게는 1.5-2.0이며, 가장 바람직하게는 1.7-2.0이다.

하기의 실시예에서 입증한 바와 같이, 약물이 함입된 본 발명의 인산칼슘 박막은 약물이 함입되지 않은 인산칼슘에 비해 뼈와 유사한 유사뼈 결절(bone-like nodule) 형성능이 매우 우수하며, 이는 함입된 약물(특히, 비타민 D₃)에 의한 조골세포의 분화가 촉진되고, 이에 의해 신속하게 뼈와 유사한 결절을 형성하기 때문이다.

본 발명은 인체 삽입용 경조직 대체물질이나 장기 등의 표면의 성질을 생체적합성, 세포적합성 및 골전도성 등이 우수한 표면으로 개질하는 방법이다. 본 발명의 표면개질 방법은 금속, 세라믹, 유리, 유기물질, 무기물질, 뼈 시멘트(bone cement)들을 포함한 다양한 형태의 물질 그리고 인간이나 동물 그리고 식물의 생체 조직 등과 같은 다양한 재료에 적용할 수 있다. 또한 다공성 재료의 기공 내부표면에 대한 인산칼슘 복합박막을 형성도 가능하다. 그리고 조건에 따라 함입 약물의 농도를 적절하게 조절할 수 있으며, 용매는 DDW(distilled deionized water)를 활용할 수 있기 때문에 매우 편리하다. 본 발명은 기존에 사용되는 모든 치과, 정형외과 등의 분야에서 이용하고 있는 다양한 매식재(implant)에 활용될 수 있다.

본 발명은 고체 표면에 저결정성 3차원 입체구조를 갖는 약물이 함입된 다공성 코팅층을 형성함으로써, 인체 삽입을 위한 인공대체물질 또는 의료용 이식물(implant)의 표면이 우수한 생체적합성, 세포적합성 및 골전도성(osteoconductivity)를 갖도록 개질하는데 유용하게 응용할 수 있다.

본 발명에 따르면, 수용액 상태에서 인공장기의 표면에 인산칼슘 박막을 형성할 수 있으며, 동시에 기능성 약물을 박막 내에 용이하게 함입시켜 인산칼슘의 생물학적 기능성을 획기적으로 향상시킬 수 있는 신개념의 인산칼슘 유무기 복합박막 형성방법을 제공한다.

이러한 인산칼슘 복합박막 형성조건 또한 생리조건과 유사한 온도와 pH 조건하에서 진행될 수 있어, 생체모방형 인산칼슘을 제조한다는 장점을 가지고 있다. 본 발명의 또 다른 장점으로는 수용액 상에서 인산칼슘박막을 형성할 수 있기 때문에, 박막을 형성하고자 하는 재료의 표면의 형태에 상관없이 코팅층을 형성할 수 있으며, 더 나아가 다공성 기공이 존재하는 재료의 기공내부의 표면에도 코팅할 수 있다는 것이 매우 큰 장점이라고 할 수 있다.

본 발명에 의해 개발된 약물을 함입한 유기화합물과 무기재료가 복합된 형태의 신개념 인산칼슘 복합박막은, 현재까지 알려진 다른 형태의 박막과 비교하여 월등한 골-형성 촉진 효능을 나타낸다. 따라서 본 발명을 통해 개발된 방법을 활용한다면, 경조직 대체재료의 개발은 물론, 재료에 질병치유의 기능성을 부여함과 동시에 약물전달이 가능한 다양한 형태로 응용이 가능하다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통 상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예

실시예 1: 1α,25- 디하이드록시비타민 D ₃ 을 함유한 칼슘 및 인 과포화 이온 용액의 제조

125 mL의 DDW(distilled deionized water)에 8.85 g의 Ca(NO₃)₂₄ㆍH₂O를 주입하여 완전히 용해시켜 칼슘이온 농도가 299 mM인 칼슘이온용액을 제조하였다. 250 mL의 DDW에 20 g의 (NH₄)₂ㆍHPO₄을 넣어 용해시켜 인산이온의 농도가 605.6 mM이 되도록 인산이온용액을 제조하였다. 분말상태의 1α,25-디하이드록시비타민 D3(Sigma, D1530) 1 mg을 200 ㎕의 고순도 99.9% 에탄올(CARLO ERBA, 414577)에 용해시켰다. 4℃ 조건하에서 제조된 1α,25-디하이드록시비타민 D₃ 용액을 DDW에 용해시켜, 최종농도가 1 x 10^-12 M과 1 x 10^-6 M이 되도록 제조하였다. 이렇게 제조된 1α,25-디하이드록시비타민 D3 용액에 칼슘이인용액 및 인산이온용액을 최종농도가 각각 2.39 mM과 4.84 mM이 되도록 첨가 및 혼합하였다. 혼합용액의 pH는 7.2가 되도록 하였다.

기질표면에 인산칼슘 복합박막을 형성하기 위하여, 제조된 1α,25-디하이드록시비타민 D3과 이온혼합 용액을 충분히 혼합한 후, 불균일 침전 반응에 의해 발생할 수 있는 침전물을 기공크기가 0.2 ㎛인 필터로 여과하여 침전물을 제거하였 다. 이와 같은 방법으로 제조한 혼합용액을 재질이 폴리스틸렌으로 된 배양접시에 주입하여, 박막형성을 위한 핵이 형성되도록 4℃에서 1시간 동안 방치하였다. 그런 다음, 37℃에서 90분간 방치하여 인산칼슘 박막이 형성되도록 하였다.

실시예 2: 1α,25- 디하이드록시비타민 D3 를 함유한 인산칼슘 박막의 물리화학적 특성분석

<2-1> SEM ( scanning electron microscope ) 분석

1α,25-디하이드록시비타민 D3가 함입되지 않은 경우와 함입된 조건하에서 합성된 인산칼슘 박막들의 표면형태를 SEM(JSM-5800, Jeol, Japan)으로 관찰하였다. 얻어진 SEM 이미지는 도 1에 나타나 있다.

도 1에 나타낸 바와 같이, 대조군과 1α,25-디하이드록시비타민 D₃가 1 x 10^-12 M 및 1 x 10^-6 M인 경우에 관한 SEM 이미지를 분석하여 보면, 1α,25-디하이드록시비타민 D₃을 함유한 경우와 1α,25-디하이드록시비타민 D₃을 함유하지 않은 대조군 간의 차이가 크지 않음을 알 수 있다. 이는 1α,25-디하이드록시비타민 D₃의 농도가 매우 낮기 때문에 최종적으로 형성된 인산칼슘 박막의 물리적인 형태에는 큰 변화가 발생하지 않기 때문이다. 따라서 1α,25-디하이드록시비타민 D₃이 인산칼슘 박막의 3차원적 구조에는 크게 영향을 미치지 않는 것으로 나타났다.

<2-2> EDX Analysis ( energy dispersive X- ray analysis )

1α,25-디하이드록시비타민 D₃의 함입에 인산칼슘 박막의 화학적 상태를 EDX(FE-SEM; Inca program; Oxford Co.)를 활용하여 분석하여 Ca/P 비율의 값을 얻었다. EDX 스펙트럼은 도 2에 나타나 있다.

도 2에서 볼 수 있듯이, 대조군으로 사용된 1α,25-디하이드록시비타민 D₃가 함입되지 않은 인산칼슘 박막의 경우, Ca/P 값이 2.20이었으며, 1α,25-디하이드록시비타민 D₃의 농도가 1 x 10^-12 M인 경우에서도 Ca/P 값이 1.934로 대조군과 유사한 값을 나타내었다. 그러나 1α,25-디하이드록시비타민 D₃의 농도가 1 x 10^-6 M의 경우, Ca/P 값은 1.769로 감소하였다.

따라서 1α,25-디하이드록시비타민 D₃의 함입은 외형적 표면형태의 변화에는 큰 영향을 미치지는 않지만, 박막을 구성하는 화학적 상태는 상당한 영향을 미치는 것으로 나타났다. 즉 1α,25-디하이드록시비타민 D₃의 농도가 증가함에 따라 Ca/P 값이 감소하는 화학적 성분의 변화가 발생하였다. 탄소의 비율이 70% 이상으로 나타난 것은 X-선이 인산칼슘 박막을 충분히 투과하여 폴리스틸렌까지 투과되었기 때문인 것으로 판단된다.

실시예 3: 1α,25- 디하이드록시비타민 D ₃ 함입 인산칼슘박막의 세포부착, 분화 및 뼈와 유사한 결절형성 효과

<3-1> 세포배양 분석

1α,25-디하이드록시비타민 D3가 함입된 복합인산칼슘의 박막에 대한 세포반응을 분석하기 위해 조골세포와 유사한 성질을 나타내는 MG63 세포주(ATCC) 사용하였다. 세포에 대한 실험을 하기 위하여 MG63 세포의 배양은 10% FBS(fetal bovine serum)와 0.5% 페니실린/스트렙토마이신을 포함하는 DMEM(Dulbeco's modified eagle medium)에 접종하여 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 배양하였으며, 배양접시에 약 80% 정도 성장했을 때, 계대배양을 실시하였다. 배양액은 정기적으로 교환하였다.

<3-2> 세포부착 실험

실시예 1에서 제조한 1α,25-디하이드록시비타민 D₃-함유 인산칼슘 박막에 대한 세포부착실험을 수행하였다. 상기 <3-1>에서 배양된 MG63 세포주를 1 x 10³ cells/mL 농도로 준비하여 처리하지 않은 배양접시와 1α,25-디하이드록시비타민 D₃의 농도가 1 x 10^-12 M과 1 x 10^-6 M 하에서 합성된 인산칼슘에 분주하여, 37℃, 5% CO₂ 분위기 하에서 4시간 및 12시간 동안 각각 배양하였다. 원하는 배양시간이 경과한 후, 시료를 PBS(phosphate buffered saline)으로 충분히 세척하고, 저온의 70% 에탄올을 이용하여 상온에서 10분간 고정시켰다. 이를 다시 PBS로 세척한 후, 크리스탈 바이올렛 저장용액(crystal violet stock solution, Sigma C-6158)을 이용하여 상온에서 10분간 염색한 후, DDW로 세척하였다. 그런 후 표면시료에 1% SDS 용액을 가하여 10분간 교반하고, 마이크로플레이트 리더를 이용하여 750 nm에서 OD(optical density)를 측정하였다(도 3).

도 3에 나타낸 바와 같이, MG63 세포주를 4시간 및 12시간 동안 부착되도록 하였을 때, 박막을 형성하지 않은 일반 배양접시에 대한 MG63 세포주의 부착에 비해 1α,25-디하이드록시비타민 D₃가 함입된 인산칼슘 박막이 형성된 표면에서 훨씬 세포부착 정도가 높게 나타났다. 특히 일반 상업용 배양접시와 1α,25-디하이드록시비타민 D₃ 농도가 1 x 10^-6 M 조건에서 합성된 박막의 경우를 비교하면, 약 100% 정도 부착이 증가하는 것으로 나타났다. 따라서 1α,25-디하이드록시비타민 D₃이 함입된 표면의 특성이 세포의 부착을 향상시키는 것으로 나타났다.

<3-3> 세포분화실험

시료표면의 특성에 의한 MG63 세포주의 분화유도 현상을 ALP 키트(alkaline phosphatase activity kit, Sigma 104)를 이용하여 분석하였다. 분화실험은 표면시료에 MG63 세포주를 분주한 후, 2주, 3주 동안 연속배양을 한 후, 알칼라인 포스파타아제의 활성을 측정하였다. 예정된 배양시간이 경과한 후, 시료에 200 mL의 용혈 완충용액(lysis buffer)을 첨가한 후, 4℃에서 약 10분간 노출시켰다. 그런 후 15 mL 튜브에 알칼라인 완충액과 스톡기질용액(stock substrate solution)을 각 각 0.5 mL씩 첨가한 후, 37℃ 항온조에 1시간 동안 보관하였다. 그런 다음, 0.05 N NaOH 10 mL을 각 튜브에 첨가한 후, 400 nm에서 OD값을 측정하여 알칼라인 포스파타아제 활성을 측정하였다(도 4).

도 4에서 확인할 수 있듯이, 2주와 3주간의 배양결과, 1α,25-디하이드록시비타민 D3가 함입된 인산칼슘의 경우, 알칼라인 포스파타아제 활성이 대조군에 비해 증가됨을 알 수 있다. 알칼라인 포스파타아제 비활성(specific activity)의 증가는 본 발명자의 특허(특허 등록번호: 10-0675573)와 유사한 경향을 나타내었다. 즉 약물이 함입되지 않은 인산칼슘의 경우에도 대조군인 배양접시에 비해 알칼라인 포스파타아제 활성이 더 높게 나타난다. 그러나 1α,25-디하이드록시비타민 D₃를 함입한 경우, 알칼라인 포스파타아제 활성이 더 높게 나타나는 것을 관찰 할 수 있었다. 이러한 현상은, 알칼라인 포스파타아제가 조골세포의 분화초기에 발현되는 표적 단백질(marker protein)이라는 점을 감안한다면, 1α,25-디하이드록시비타민 D₃이 함입된 인산칼슘의 경우, MG63 세포주의 분화를 신속하게 유도하는 것으로 판단된다.

<3-4> 뼈와 유사한 결절형성

1α,25-디하이드록시비타민 D3가 함입된 인산칼슘 박막에 의한 골조직 재생능력과 관련하여 박막에서 MG63 세포가 뼈와 유사한 결절을 형성하는 현상을 분석하였다(도 5 및 도 6). 배양접시를 대조군으로 하여, 1α,25-디하이드록시비타민 D₃ 농도가 다른 조건 하에서 배양하여 뼈와 유사한 결절을 형성하는 지 여부를 분석하였다.

MG63 세포를 1α,25-디하이드록시비타민 D₃가 함입된 인산칼슘 박막에 1주일간 배양하여 뼈와 유사한 결절형성과 관련한 결과를 도 5 및 도 6에 나타내었다. 조골세포의 세포주인 MG63 세포를 상업용 세포배양접시와 1α,25-디하이드록시비타민 D₃의 농도가 1 x 10^-12M 및 1 x 10^-6 M 조건하에서 합성한 인산칼슘 복합박막에서 1주일 동안 배양하였을 때, 상업용 세포배양접시에서는 MG63 세포의 경우에는 유사뼈 결절이 전혀 형성되지 않았다. 그러나 1α,25-디하이드록시비타민 D₃가 함입된 인산칼슘 복합박막에서는 유사 뼈 결절이 신속하게 형성되었다. 1α,25-디하이드록시비타민 D₃의 농도가 극히 낮은 경우, 약물이 함입되지 않은 인산칼슘과 유사한 유사 뼈 결절 형성현상을 나타내었다. 그러나 1α,25-디하이드록시비타민 D₃의 농도가 1 x 10^-6 M으로 증가된 경우, 뼈 결절의 형성이 급격히 상승되었음을 알 수 있다. 이러한 결과를 도 5에 그래프로 나타내었다. 도 5에는 MG63 세포를 표면시료에서 1 주일간 배양했을 때, 형성된 유사뼈 결절의 수를 1α,25-디하이드록시비타민 D₃의 농도에 따라 측정한 결과를 나타내었다. 도 5에 나타낸 바와 같이, 상업용 배양접시에서는 뼈 결절이 전혀 발생하지 않은 것을 볼 수 있으며, 1α,25-디 하이드록시비타민 D₃의 농도가 1 x 10^-12 M일 때 합성된 복합박막에서는 약 10개 정도가 형성되었다. 그러나 1α,25-디하이드록시비타민 D₃의 농도가 1 x 10^-6 M에서 합성한 복합박막에서는 120개 이상의 유사뼈 결절이 형성되었음을 알 수 있다.

또한 1α,25-디하이드록시비타민 D₃의 농도가 1 x 10^-6 M의 경우에 형성된 뼈 결절을 광학현미경으로 관찰한 결과를 도 6에 나타내었다. 촬영된 사진을 보면, 1α,25-디하이드록시비타민 D₃가 함입된 인산칼슘 복합박막들에서는 상당한 수준의 뼈 결절이 형성된 것을 볼 수 있다. 상업용 배양접시에는 유사뼈 결절의 형성이 전혀 발생하지 않았다. 일반적으로 유사뼈 결절은 약물에 의한 자극과 함께 세포를 4 주간 정도 배양했을 경우에만 유사뼈 결절이 형성되는 것으로 보고되어 있으며, 본 발명에 의한 방법으로 제조된 인산칼슘 복합박막에서는 1주일 정도밖에 걸리지 않았으며, 이러한 결과는 매우 이례적이고 획기적이라고 할 수 있다.

따라서 본 발명에 의해 합성된 약물함입 인산칼슘 복합박막의 기능은 매우 우수하며, 1α,25-디하이드록시비타민 D₃의 함입을 통해 조골세포를 국지적인 부분에서 지속적으로 자극하여 유사뼈 결절 형성능력을 극대화 시킬 수 있다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이 며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

도 1은 본 발명의 따라 폴리스틸렌 재질의 세포 배양 접시 위에 조골세포의 활성을 촉진시키는 약물로 알려진 1α,25-디하이드록시비타민 D₃를 함입시킨 인산칼슘 복합 박막에 대한 FE-SEM 이미지이다. 1α,25-디하이드록시비타민 D₃의 농도는 (a) 0 M, (b) 1 x 10^-12 M, 그리고 (c) 1 x 10^{-6 M}이다. FE-SEM으로 촬영된 도 1을 보면, 폴리스틸렌 표면에 형성된 모든 인산칼슘 복합박막들이 3차원적의 다공성 구조를 형성하고 있는 것을 관찰할 수 있다. 이러한 다공성은 체내의 다양한 단백질이 흡착할 수 있는 표면적을 증가시키고, 이에 따라 세포의 부착 및 세포활성을 조절하는데 상당한 영향을 줄 수 있을 것으로 판단된다. 그러나 1α,25-디하이드록시비타민 D₃의 농도의 변화에 따른 표면의 형태(morphology)는 육안으로는 크게 차이가 나지 않았다.

도 2는 EDX(energy dispersive X-ray analysis)를 이용하여 본 발명의 약물-함유 인산칼슘 복합박막을 구성하는 원소들의 비율을 측정한 결과를 나타낸 것이다. 측정결과에 의하면, 칼슘과 인으로 이루어진 인산칼슘 박막이 형성된 것을 알 수 있다. 탄소와 산소 원소들은 박막과 약물, 그리고 배양접시로부터 유래된 것이다: 1α,25-디하이드록시비타민 D₃ 농도는 (a) 0 M, (b) 1 x 10^-12 M, 그리고 (c) 1 x 10^-6 M.

도 3은 본 발명에 따라 제조된 약물-함유 인산칼슘 복합박막에서 조골세포주 인 MG63 세포의 부착에 관한 실험을 수행한 결과이다. MG63 세포를 표면시료에 분주한 후, 4시간 및 12시간 동안 배양하였다. 모든 부착시간에서 세포부착은 1α,25-디하이드록시비타민 D₃이 함입된 인산칼슘 복합박막에서 대조군(CTL)보다 약 2배 정도 높게 나타났다. 따라서 인산칼슘 복합박막이 세포부착을 유도하는데 있어서 매우 우수한 특성을 가지고 있음을 알 수 있다. 채워진 막대그래프는 4시간 배양한 조건이며, 빗금 친 막대그래프는 12시간 배양하였을 때의 결과이다.

도 4는 대조군(CTRL)과 1α,25-디하이드록시비타민 D₃ 1 x 10^-12 및 1 x 10^-6 M 조건하에서 합성한 인산칼슘 복합박막에 MG63 세포주를 각각 2주 및 3주 동안 연속적으로 배양한 후, 알칼라린 포스파타이제 비활성(ALP specific activity)를 측정한 결과이다. 채워진 막대그래프는 2주간 배양, 빗금친 막대그래프는 3주간 배양한 결과이다.

도 5는 표면시료에 MG63 세포주를 1주일간 배양하였을 때, 대조군과 1α,25-디하이드록시비타민 D₃ 1 x 10^-12 및 1 x 10^-6 M 조건하에서 합성한 인산칼슘 복합박막들에서 형성된 유사뼈 결절(bone-like nodule)의 수를 측정한 결과이다.

도 6은 표면시료에 MG63 세포주를 1주일간 배양하였을 때, 1α,25-디하이드록시비타민 D₃ 1 x 10^-6 M 조건하에서 합성한 인산칼슘 복합박막에서 형성된 유사뼈 결절(bone-like nodule)을 광학현미경으로 촬영한 사진을 나타내었다: 배율은 (a) 40배, (b) 100배.

Claims

다음의 단계를 포함하는 약물-함유 인산칼슘 복합 박막의 제조방법:

(a) 1α,25-디하이드록시비타민 D₃를 포함하는 약물 용액을 제조하는 단계;

(b) 칼슘 이온 용액 및 인산 용액을 제조하는 단계;

(c) 상기 약물 용액, 칼슘 이온 용액 및 인산 용액을 혼합하는 단계; 및

(d) 상기 단계 (c)의 혼합 용액을 고체 기질에 적용하여 약물이 함유된 인산칼슘 복합 박막을 제조하는 단계.
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제 1 항에 있어서, 상기 단계 (c)의 혼합용액에서 1α,25-디하이드록시비타민 D₃의 농도는 1 nM-10 mM인 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 단계 (c)의 혼합용액에서 칼슘 이온의 농도는 1-10 mM인 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 단계 (c)의 혼합용액에서 인산 이온의 농도는 1-20 mM인 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 단계 (d)는 상기 혼합용액을 고체 기질에 적용하여 1-20℃에서 1분-24시간 동안 고체 기질에 박막 형성을 위한 핵을 형성한 다음, 상기 고체 기질을 1-60℃에서 5분 이상 방치하여 인산칼슘 복합 박막을 제조하여 실시되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 방법은 단계 (d) 이전에 동공 크기 0.5 ㎛ 이하의 필터를 이용하여 상기 혼합용액을 여과하는 단계를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 단계 (d)에 의해 제조된 인산칼슘 복합박막은 1.5-2.0의 칼슘이온 대 인산이온 몰비를 가지는 것을 특징으로 하는 방법.
상기 제 1 항 및 제 6 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항의 방법에 의해 제조되고, 약물로서 1α,25-디하이드록시비타민 D₃를 함유하는 골-형성 촉진용 인산칼슘 복합 박막.
제 12 항에 있어서, 상기 인산칼슘 복합박막은 1.5-2.0의 칼슘이온 대 인산이온 몰비를 가지는 것을 특징으로 하는 골-형성 촉진용 인산칼슘 복합 박막.
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상기 제 12 항의 골-형성 촉진용 인산칼슘 복합 박막이 코팅된 인공대체물 또는 이식물.