CN110256543B - PwNAC1基因及其编码蛋白在植物抗逆中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了PwNAC1基因及其编码蛋白在植物抗逆中的应用。本发明提供的蛋白是如下a)或b)或c)或d)的蛋白：a)氨基酸序列是序列2所示的蛋白；b)在序列2所示的蛋白的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白；c)将序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白；d)与序列2所示的氨基酸序列具有75％或75％以上的同源性且具有相同功能的蛋白。本发明发现新基因PwNAC1，将其导入拟南芥中得到转PwNAC1拟南芥植株。通过实验证明，转PwNAC1拟南芥植株的抗旱性和抗盐性显著提高，表明PwNAC1或其编码的蛋白具备抗逆性。

Description

PwNAC1基因及其编码蛋白在植物抗逆中的应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及PwNAC1基因及其编码蛋白在植物抗逆中的应用。

背景技术

盐害、干旱等非生物环境胁迫严重影响植物正常的生长发育，植物在漫长的进化过程中形成了一系列有效的抵御非生物胁迫的相应作用机制，而调控与胁迫响应相关基因的表达是植物应对外界不良环境的方法之一。逆境胁迫诱导表达基因可大致分为两大类：即功能蛋白编码基因和参与逆境胁迫信号转导过程的转录调控蛋白编码基因。

NAC转录因子是植物中特异的转录调控因子。迄今为止，NAC转录因子在模式植物如拟南芥和水稻中的研究取得了重要的进展，但在木本植物中NAC转录因子研究较少，其功能尚不清楚。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是如何提高植物对盐和干旱等非生物胁迫的耐受能力。

为解决上述技术问题，本发明首先提供了一种与植物抗逆性相关蛋白。

本发明所提供的与植物抗逆性相关蛋白的名称为PwNAC1，来源于青杄(Piceawilsonii Mast.)，为如下a)或b)或c)或d)所述的蛋白：

a)氨基酸序列是序列2所示的蛋白；

b)在序列2所示的蛋白的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白；

c)将序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白；

d)与序列2所示的氨基酸序列具有75％或75％以上的同源性且具有相同功能的蛋白。

其中，序列2由271个氨基酸残基组成。

为了使a)中的蛋白便于纯化，可在序列表中序列2所示的蛋白的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。

表1、标签的序列

上述c)中的蛋白PwNAC1，所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加为不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。

上述c)中的蛋白PwNAC1可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。

上述c)中的蛋白PwNAC1的编码基因可通过将序列1所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。

为解决上述技术问题，本发明又提供了与PwNAC1蛋白相关的生物材料。

本发明提供的与PwNAC1蛋白相关的生物材料为下述A1)至A12)中的任一种：

A1)编码PwNAC1蛋白的核酸分子；

A2)含有A1)所述核酸分子的表达盒；

A3)含有A1)所述核酸分子的重组载体；

A4)含有A2)所述表达盒的重组载体；

A5)含有A1)所述核酸分子的重组微生物；

A6)含有A2)所述表达盒的重组微生物；

A7)含有A3)所述重组载体的重组微生物；

A8)含有A4)所述重组载体的重组微生物；

A9)含有A1)所述核酸分子的转基因植物细胞系；

A10)含有A2)所述表达盒的转基因植物细胞系；

A11)含有A3)所述重组载体的转基因植物细胞系；

A12)含有A4)所述重组载体的转基因植物细胞系。

上述生物材料中，A1)所述核酸分子为如下1)或2)或3)所示的基因：

1)其编码序列是序列1所示的cDNA分子或基因组DNA分子；

2)与1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码PwNAC1蛋白的cDNA分子或基因组DNA分子；

3)在严格条件下与1)或2)限定的核苷酸序列杂交，且编码PwNAC1蛋白的cDNA分子或基因组DNA分子。

其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。

其中，序列1由816个核苷酸组成，编码序列2所示的氨基酸序列。

本领域普通生物技术人员可以采用已知的方法，如点突变等方法，对本发明的编码PwNAC1的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明分离得到的PwNAC1的核苷酸序列75％或者更高同一性的核苷酸，只要编码PwNAC1且具有相同功能，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。

这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的编码序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白的核苷酸序列具有75％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。

上述75％或75％以上同一性，可为80％、85％、90％或95％以上的同一性。

上述生物材料中，A2)所述的含有编码PwNAC1蛋白的核酸分子的表达盒(PwNAC1基因表达盒)，是指能够在宿主细胞中表达PwNAC1的DNA，该DNA不但可包括启动PwNAC1转录的启动子，还可包括终止PwNAC1转录的终止子。

进一步的，所述表达盒还可包括增强子序列。

更进一步的，可用于本发明的启动子包括但不限于：组成型启动子；组织、器官和发育特异的启动子及诱导型启动子。可用于本发明的终止子包括但不限于：农杆菌胭脂碱合成酶终止子(NOS终止子)、花椰菜花叶病毒CaMV 35S终止子、tml终止子、豌豆rbcS E9终止子和胭脂氨酸和章鱼氨酸合酶终止子。

在实际应用中，可用现有的表达载体构建含有所述PwNAC1基因表达盒的重组载体。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。如pAHC25、pBin438、pCAMBIA1302、pCAMBIA2300、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301、pCAMBIA1300、pBI121、pCAMBIA1391-Xa或pCAMBIA1391-Xb(CAMBIA公司)等。使用PwNAC1基因构建重组表达载体时，可在其转录起始核苷酸前加上任何一种增强型、组成型、组织特异型或诱导型启动子，如花椰菜花叶病毒(CAMV)35S启动子、泛素(Ubiquitin)基因启动子(pUbi)等，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。

为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入在植物中表达可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、GFP基因、荧光素酶基因等)、具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素标记物、卡那霉素、氯霉素标记物等)或是抗化学试剂标记基因(如抗除莠剂基因)等。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。

上述生物材料中，所述载体可为质粒、黏粒、噬菌体或病毒载体。在本发明的一个实施例中，所述重组载体具体可为在pCAMBIA1205载体上***上述PwNAC1基因(序列1)得到的重组表达载体。

上述生物材料中，所述微生物可为酵母、细菌、藻或真菌，如农杆菌。在本发明的一个实施例中，采用的农杆菌为GV3101。

上述生物材料中，所述转基因植物细胞系均不包括繁殖材料。

扩增上述PwNAC1基因全长或其任一片段的引物对也属于本发明的保护范围。

为解决上述技术问题，本发明还提供了PwNAC1蛋白或上述生物材料的新用途。

本发明提供了PwNAC1蛋白或上述生物材料在调控植物抗逆性中的应用。

本发明还提供了PwNAC1蛋白或上述生物材料在培育抗逆性提高的转基因植物中的应用。

本发明还提供了PwNAC1蛋白或上述生物材料在植物育种中的应用。

上述应用中，所述抗逆性为抗盐性和/或抗旱性。

上述应用中，所述植物为单子叶植物或双子叶植物。进一步的，所述双子叶植物具体可为豆科植物和/或十字花科植物和/或菊科植物。更进一步的，所述豆科植物可为大豆、百脉根、苜蓿或水黄皮；所述十字花科植物可为拟南芥或油菜；所述菊科植物可为向日葵。在本发明的一个实施例中，所述拟南芥为哥伦比亚生态型拟南芥(col-0)。

为解决上述技术问题，本发明最后提供了一种培育抗逆性提高的转基因植物的方法。

本发明提供的培育抗逆性提高的转基因植物的方法包括提高受体植物中PwNAC1蛋白的表达量和/或活性，得到转基因植物的步骤；所述转基因植物的抗逆性高于所述受体植物。

上述方法中，所述抗逆性为抗盐性和/或抗旱性。

进一步的，所述转基因植物的抗逆性高于所述受体植物体现在如下(1)-(3)中任一种：

(1)转基因植物的种子萌发率高于受体植物；

(2)转基因植物的根长长于受体植物；

(3)转基因植物的存活率高于受体植物。

更进一步的，所述转基因植物的抗逆性高于所述受体植物的具体表现为在逆境胁迫下产生如下方式：所述转基因植物在高浓度盐或高浓度甘露醇的胁迫下种子萌发率和/或幼苗根长和/或存活率大于所述受体植物。上述高盐环境具体可以是100mM、200mM的NaCl水溶液引起的环境；上述干旱环境具体可以是200mM、300mM的甘露醇水溶液模拟得到的干旱环境，也可以是停止浇水11天的干旱处理环境。

上述方法中，所述提高受体植物中PwNAC1蛋白的表达量和/或活性的方法为在受体植物中过表达PwNAC1蛋白。即将编码PwNAC1蛋白的基因导入到受体植物；所述PwNAC1蛋白的编码基因的核苷酸序列是序列1所示的DNA分子。

在本发明的一个实施例中，所述PwNAC1蛋白的编码基因(即序列1所示的核苷酸)通过含有PwNAC1蛋白的编码基因的表达盒的重组载体pCAMBIA1205-PwNAC1导入农杆菌中。所述重组载体pCAMBIA1205-PwNAC1为将序列表中序列1所示的PwNAC1***表达载体pCAMBIA1205中，且保持pCAMBIA1205载体的其他序列不变后得到的载体。所述重组载体pCAMBIA1205-PwNAC1表达PwNAC1蛋白。

上述方法中，所述转基因植物理解为不仅包含将所述PwNAC1基因转化受体植物得到的第一代转基因植物，也包括其子代。对于转基因植物，可以在该物种中繁殖该基因，也可用常规育种技术将该基因转移进入相同物种的其它品种，特别包括商业品种中。所述转基因植物包括种子、愈伤组织、完整植株和细胞。

上述方法中，所述植物为单子叶植物或双子叶植物。进一步的，所述双子叶植物具体可为豆科植物和/或十字花科植物和/或菊科植物。更进一步的，所述豆科植物可为大豆、百脉根、苜蓿或水黄皮；所述十字花科植物可为拟南芥或油菜；所述菊科植物可为向日葵。在本发明的一个实施例中，所述拟南芥为哥伦比亚生态型拟南芥(col-0)。

本发明首先发现了一个新基因PwNAC1，然后通过农杆菌转化法在拟南芥中过表达该基因以获得过表达PwNAC1拟南芥植株，研究发现在拟南芥中过表达PwNAC1能够显著提高转基因拟南芥在盐和干旱胁迫下的耐受能力。具体表现如下：在100mM的NaCl培养基中过表达PwNAC1拟南芥种子的萌发率及萌发势均显著高于野生型对照，其幼苗根长相对于野生型对照提高了50.90％；使用200mM NaCl溶液浇灌处理11天后，过表达PwNAC1拟南芥幼苗存活率比野生型对照的存活率提高49.33％。此外，本发明获得的过表达PwNAC1拟南芥种子在甘露醇浓度为200mM的培养基中的萌发率显著高于野生型对照，其幼苗根长相对于野生型对照提高了30.50％；在培养基质中的幼苗停止浇水11天，复水3天后的存活率比野生型对照的存活率高1.43倍。上述结果表明，PwNAC1或其编码的蛋白具有提高植物抗旱性和抗盐性的功能。

附图说明

图1为PwNAC1基因在青杄各组织中的表达情况。

图2为转PwNAC1拟南芥的分子检测结果。

图3为转PwNAC1拟南芥和野生型拟南芥种子在100mM的NaCl处理下萌发8天的观察结果。

图4为转PwNAC1拟南芥和野生型拟南芥种子在100mM的NaCl处理下的萌发率测定结果。

图5为转PwNAC1拟南芥和野生型拟南芥种子在200mM的甘露醇处理下萌发8天的观察结果。

图6为转PwNAC1拟南芥和野生型拟南芥种子在200mM的甘露醇处理下的萌发率测定结果。

图7为转PwNAC1拟南芥和野生型拟南芥种子萌发后转入含不同浓度NaCl和甘露醇的平板生长8天的根长观察结果。

图8为转PwNAC1拟南芥和野生型拟南芥种子萌发后转入含不同浓度NaCl和甘露醇的平板生长8天的根长统计结果。

图9为转PwNAC1拟南芥和野生型拟南芥幼苗在200mM的NaCl处理11天后的观察结果。

图10为转PwNAC1拟南芥和野生型拟南芥幼苗在干旱处理11天，复水3天后的观察结果。

图11为转PwNAC1拟南芥和野生型拟南芥幼苗在盐处理和干旱处理后的存活率统计结果。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

下述实施例中的pCAMBIA1205载体记载于文献“ZhangTong，LiYanfang，ZhouYanni，ZhangLingyun，Cloning and Expression Analysis of a HomologousExpansin Gene EXP2in Picea wilsonii.Journal of Forestry Research.2016,27(2):247–255.”中，公众可从申请人(北京林业大学)处获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。

实施例1、转录因子PwNAC1及其编码基因的获得

一、转录因子PwNAC1及其编码基因的获得

提取青杄的RNA，并以RNA为模板通过试剂盒法反转录成cDNA。然后将cDNA作为扩增目的基因序列的反应模板，以5’-TGAGCAAAGACCCCAACGAGA-3’和5’-CTTTATGCTTCCGGCTCGT-3’为引物进行PCR扩增，得到PwNAC1基因的CDS序列。再以由英潍捷基(上海)公司完成的采用Gateway方法构建的青杄cDNA文库为模板，以5’-CTGTTCGTTGCAACAAATTGA-3’和5’-GGGATATTTCCGGTCCCTCGG-3’为引物进行PCR扩增，得到5’RACE-PCR；以5’-CCCAGCAGTTAAATTCCTCC-3’和5’-CAGGAAACAGCTATGACCA-3’为引物进行PCR扩增，得到3’RACE-PCR，将RACE-PCR产物与CDS序列拼接，得到cDNA全长序列，并对其进行测序。

测序结果表明：cDNA全长序列为序列表中序列1，由816个核苷酸组成，与Genbank中的序列进行比较，确定它属于青杄NAC类转录因子，并将其所示的基因命名为PwNAC1，PwNAC1编码的蛋白命名为PwNAC1，其氨基酸序列为序列表中序列2，由271个氨基酸组成。上述cDNA序列也可以通过人工合成获得。

二、通过荧光定量PCR分析PwNAC1基因的组织表达情况

分别提取青杄花粉、根、茎、针叶、种子组织的RNA，反转录合成cDNA；然后分别以上述各组织的cDNA为模板，以5’-CGTTGTCATGTCGGGAACCAC-3’和5’-TTGCTTTTCGTTGGCATGGTT-3’为引物进行PCR扩增，检测PwNAC1基因在青杄不同组织中的表达情况。同时以EF1-α基因作为内参，扩增EF1-α基因的5’引物为：5’-AACTGGAGAAGGAACCCAAG-3’，3’引物为：5’-AACGACCCAATGGAGGATAC-3’。RT-qPCR反应条件：先95℃预变性15min；然后95℃20sec，56℃28sec，72℃50sec，共33个循环；再72℃延伸5min。

PwNAC1基因在各组织中的表达情况如图1所示。结果表明，PwNAC1在所有组织中均有表达，种子中表达量最高，花粉中表达量较低。

实施例2、PwNAC1基因在提高植物抗逆性中的应用

一、转PwNAC1拟南芥的构建

1、PwNAC1基因的获得

制备下述引物对：

引物1：5’-TGAGCAAAGACCCCAACGAGA-3’；

引物2：5’-CTTTATGCTTCCGGCTCGT-3’。

以青杄的cDNA为模板，采用上述引物1和引物2进行PCR扩增，得到大小为816bp的PCR产物，并对其进行测序。

测序结果表明：PCR产物的核苷酸序列为序列表中序列1，可编码序列表中序列2所示的蛋白PwNAC1。

2、重组表达载体的获得

将上述步骤1获得的PCR产物和pCAMBIA1205载体经限制性内切酶酶切后进行连接，得到连接产物。然后将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，并涂布在含有35μg/ml氯霉素的LB平板上培养过夜。挑取白色单菌落于含有35μg/ml氯霉素的LB液体培养基中培养过夜并进行菌落PCR鉴定；同时碱法提取质粒DNA进行序列测定。

测序结果表明，重组表达载体为将序列表中序列1所示的PwNAC1***表达载体pCAMBIA1205后得到的载体，将其命名为pCAMBIA1205-PwNAC1。

3、转PwNAC1拟南芥的获得及分子检测

1)转PwNAC1拟南芥的获得

将上述步骤2制备的重组表达载体pCAMBIA1205-PwNAC1转化农杆菌GV3101的感受态细胞(购自上海唯地生物技术公司)，得到重组菌株GV3101/pCAMBIA1205-PwNAC1(提取质粒送去测序，为重组载体pCAMBIA1205-PwNAC1)。

将重组菌GV3101/pCAMBIA1205-PwNAC1单克隆接种于含35mg/L氯霉素的YEB液体培养基中，28℃振荡培养两天。将培养液4000rpm/min离心5分钟，所得农杆菌沉淀用含5％蔗糖和0.03％SilwetL-77的侵染液重悬菌体。

采用花絮浸染法转化哥伦比亚生态型野生型拟南芥(Col-0)(购自ABRC)，收获当代转基因拟南芥植株所接的种子(T1代)，在含有40μg/ml潮霉素(Hygromycin B)和50μg/ml羧苄青霉素(Carbenicllin)的MS培养基筛选萌发的种子。将在上述培养基上萌发的T1代幼苗移到培养土中，收获种子(T2代)，然后经相同的筛选过程得到纯合的转PwNAC1拟南芥植株(T4代)种子。最后将转PwNAC1拟南芥植株(T4代)种子直接播种到培养土中，长出的转PwNAC1拟南芥植株(T4代)在长日照条件下生长两周左右开花。

2)转PwNAC1拟南芥的分子检测

提取转PwNAC1拟南芥植株(T4代)的总蛋白，以其为模板，经SDS-PAGE跑胶、转膜、封闭后以GFP标签为抗体进行检测，并以野生型拟南芥为对照，检测结果如图2所示，转PwNAC1拟南芥植株(T4代)经GFP抗体结合后有明显条带，而野生型拟南芥则没有检测到条带，证明该T4代转PwNAC1拟南芥株系中PwNAC1的表达量明显提高。

采用同样的方法，将空载体pCAMBIA1205转入野生型拟南芥中，得到转空载体拟南芥，播种、传代，得到转空载体拟南芥植株(T4代)。

二、转PwNAC1拟南芥的功能研究

1、种子萌发试验

1)抗盐性研究

取野生型拟南芥(WT)、转PwNAC1拟南芥植株(T4代)和转空载体拟南芥植株(T4代)的种子，在含有100mM的NaCl的MS培养基上进行种子萌发实验，实验条件是光周期为16小时光照，8小时黑暗；光照强度为300-400μmol m^-2s^-1；光照条件下的培养温度为22-24℃，相对湿度为70-90％；黑暗条件下的培养温度为18-20℃，相对湿度大于90％。在萌发第8天时统计各个株系的种子萌发率。每个株系100粒种子，实验重复3次，结果取平均值。

结果如图3和图4所示(WT表示野生型拟南芥，T表示转PwNAC1拟南芥植株(T4代)，图3为萌发8天的表型图，图4为种子萌发率的统计图)。在100mM的NaCl处理下，转PwNAC1拟南芥株系的种子在第1、2、3、4天的萌发率均比野生型高。虽然野生型对照和转PwNAC1拟南芥株系的种子均能在第4天萌发，但转PwNAC1拟南芥株系的种子在第1天的萌发率为36.99％，而野生型拟南芥的种子在第1天的萌发率仅为24.45％，远低于转PwNAC1拟南芥植株。该结果表明转PwNAC1拟南芥植株(T4代)的种子在NaCl浓度为100mM时的种子萌发率显著高于野生型拟南芥。

野生型拟南芥(WT)和转空载体拟南芥植株(T4代)的结果无显著差异。

2)抗旱性研究

取野生型拟南芥(WT)、转PwNAC1拟南芥植株(T4代)和转空载体拟南芥植株(T4代)的种子在MS培养基上进行种子萌发实验，其中培养基中含200mM的甘露醇，实验条件是光周期为16小时光照，8小时黑暗；光照强度为300-400μmol m^-2s^-1；光照条件下的培养温度为22-24℃，相对湿度为70-90％；黑暗条件下的培养温度为18-20℃，相对湿度大于90％。在萌发第8天时统计各个株系的种子萌发率。每个株系100粒种子，实验重复3次，结果取平均值。

结果如图5和图6所示(WT表示野生型拟南芥，T表示转PwNAC1拟南芥植株(T4代)，图5为萌发8天的表型图，图6为种子萌发率的统计图)。在200mM的甘露醇胁迫处理下，野生型拟南芥和转PwNAC1拟南芥株系的种子在胁迫处理第1天时均未萌发，但均能在第5天时萌发，且转PwNAC1拟南芥株系的种子在第2天的萌发率为47.74％，而野生型拟南芥的种子在第2天的萌发率仅为21.94％，远低于转PwNAC1拟南芥植株。该结果表明转PwNAC1拟南芥植株(T4代)的种子在甘露醇浓度为200mM时的种子萌发率显著高于野生型拟南芥。

野生型拟南芥(WT)和转空载体拟南芥植株(T4代)的结果无显著差异。

2、根长测量抗盐性和抗旱性试验

取野生型拟南芥(WT)、转PwNAC1拟南芥植株(T4代)和转空载体拟南芥植株(T4代)的种子在MS培养基上进行种子萌发实验，萌发后的拟南芥幼苗，用镊子移在MS培养基上生长，其中MS培养基中分别含100mM的NaCl和200mM的甘露醇。实验条件是光周期为16小时光照，8小时黑暗；光照强度为300-400μmol m^-2s^-1；光照条件下的培养温度为22-24℃，相对湿度为70-90％；黑暗条件下的培养温度为18-20℃，相对湿度大于90％。在生长第8天时测量统计各个株系的根长。每个株系100株，实验重复3次，结果取平均值。

结果如图7和图8所示(WT表示野生型拟南芥，T表示转PwNAC1拟南芥植株(T4代)，图7为生长8天的表型图，图8为根长的统计图)。与野生型对照组相比，转PwNAC1拟南芥植株(T4代)的种子在NaCl浓度为100mM胁迫处理下的幼苗根长为5.02cm，而野生型拟南芥的幼苗根长仅为3.33cm，提高了50.80％；在200mM甘露醇胁迫处理下的幼苗根长为4.87cm，而野生型拟南芥的幼苗根长仅为3.66cm，提高了33.06％。该结果表明转PwNAC1拟南芥植株(T4代)种子在NaCl浓度为100mM或甘露醇浓度为200mM时的幼苗根长显著长于野生型拟南芥。

野生型拟南芥(WT)和转空载体拟南芥植株(T4代)结果无显著差异。

3、幼苗抗逆实验

1)抗盐性研究

取野生型拟南芥(WT)、转PwNAC1拟南芥植株(T4代)和转空载体拟南芥植株(T4代)的种子播种在MS培养基上，7天后，将幼苗移至培养基质(营养土：蛭石为1:1)中，实验条件是光周期为16小时光照，8小时黑暗；光照强度为300-400μmol m^-2s^-1；光照条件下的培养温度为22-24℃，相对湿度为70-90％；黑暗条件下的培养温度为18-20℃，相对湿度大于90％。在培养基质中生长12天后，浇以200mM的NaCl溶液，每两天浇一次，在NaCl处理第11天后统计各个株系的存活率。每个株系100粒种子，实验重复3次，结果取平均值。

结果如图9和图11所示(WT表示野生型拟南芥，T表示转PwNAC1拟南芥植株(T4代)，图9为200mM的NaCl处理6天和11天后的表型图，图11为存活率的统计图)，转PwNAC1拟南芥植株(T4代)的幼苗在200mM NaCl处理11天后的存活率为83.67％，而对照组野生型存活率仅为56.04％，转PwNAC1拟南芥幼苗的存活率显著高于野生型拟南芥的幼苗。该结果表明转PwNAC1拟南芥植株(T4代)的幼苗在NaCl浓度为200mM时的存活率显著高于野生型拟南芥。

野生型拟南芥(WT)和转空载体拟南芥植株(T4代)的结果无显著差异。

2)抗旱性研究

取野生型拟南芥(WT)、转PwNAC1拟南芥植株(T4代)和转空载体拟南芥植株(T4代)的种子播种在MS培养基上，7天后将幼苗移至培养基质(营养土：蛭石为1:1)中，实验条件是光周期为16小时光照，8小时黑暗；光照强度为300-400μmol m^-2s^-1；光照条件下的培养温度为22-24℃，相对湿度为70-90％；黑暗条件下的培养温度为18-20℃，相对湿度大于90％。在培养基质中生长12天后，停止浇水11天，复水3天后统计各个株系的存活率。每个株系100粒种子，实验重复3次，结果取平均值。

结果如图10和图11所示(WT表示野生型拟南芥，T表示转PwNAC1拟南芥植株(T4代)，图10为干旱处理11天，复水3天后的表型图，图11为存活率的统计图)，转PwNAC1拟南芥植株(T4代)的幼苗在干旱处理11天，复水3天后的存活率(74.12％)显著高于野生型拟南芥的幼苗的存活率(30.54％)。该结果表明转PwNAC1拟南芥植株(T4代)的幼苗在干旱胁迫下的存活率显著高于野生型拟南芥。

野生型拟南芥(WT)和转空载体拟南芥植株(T4代)的结果无显著差异。

上述结果表明，PwNAC1及其编码的蛋白具有提高植物抗旱性和抗盐性的功能。

序列表

<110>北京林业大学

<120>PwNAC1基因及其编码蛋白在植物抗逆中的应用

<160>2

<170>PatentIn version 3.5

<210>1

<211>816

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<400>1

atggagggat cggaattcca cccgcaggtc ctgcctccag gtttcagatt tcatcccaca 60

gatgaggagc tgctcatcca ttacctgaag aagaaggttt ctgcctctgc tctcccggcg 120

tcaattatcg cagagattga cctgtacaag catgacccct gggatttgcc cgcgaaggca 180

tgttacgggg agcgagaatg gtatttcttc agcccgaggg accggaaata tcccaacgga 240

gcgcggccaa acagatccgc cggctccggc tactggaaag ccactggagc agaaaagccc 300

atcgttgtca tgtcgggaac cacttcgtca cagaaagtgg gcgtgaagaa atccctggtg 360

ttttataaag gaatgccgct taagggcctc aagaccaact ggatcatgca cgaatactgc 420

ctcgctgaaa ccatgccaac gaaaagcaac cgatctctgc gcttggacga ttgggtactg 480

tgccggatat acaagaaagt gagtcattct gccacggcgg tctcgaaccc agaactggag 540

gcaccgtcac ctgctgacgt gcaacaagaa tccgtgatgc ccaaattcag ttccttctct 600

gggctgcttc agagcgacgg tccgtttatg gagagctttc taagccatga tttgtcagat 660

gcctacaaag ctgccctgtc cgatgcggag ccgtcatcca cggtagtccc ccagcagtta 720

aattcctccg agaccagagg ccacctgtca atgtccatgg ctctcaactg cgatgaatta 780

tcctccgtct accctgccga gtggcaaaca gtctga 816

<210>2

<211>271

<212>PRT

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<400>2

Met Glu Gly Ser Glu Phe His Pro Gln Val Leu Pro Pro Gly Phe Arg

1 5 10 15

Phe His Pro Thr Asp Glu Glu Leu Leu Ile His Tyr Leu Lys Lys Lys

20 25 30

Val Ser Ala Ser Ala Leu Pro Ala Ser Ile Ile Ala Glu Ile Asp Leu

35 40 45

Tyr Lys His Asp Pro Trp Asp Leu Pro Ala Lys Ala Cys Tyr Gly Glu

50 55 60

Arg Glu Trp Tyr Phe Phe Ser Pro Arg Asp Arg Lys Tyr Pro Asn Gly

65 70 75 80

Ala Arg Pro Asn Arg Ser Ala Gly Ser Gly Tyr Trp Lys Ala Thr Gly

85 90 95

Ala Glu Lys Pro Ile Val Val Met Ser Gly Thr Thr Ser Ser Gln Lys

100 105 110

Val Gly Val Lys Lys Ser Leu Val Phe Tyr Lys Gly Met Pro Leu Lys

115 120 125

Gly Leu Lys Thr Asn Trp Ile Met His Glu Tyr Cys Leu Ala Glu Thr

130 135 140

Met Pro Thr Lys Ser Asn Arg Ser Leu Arg Leu Asp Asp Trp Val Leu

145 150 155 160

Cys Arg Ile Tyr Lys Lys Val Ser His Ser Ala Thr Ala Val Ser Asn

165 170 175

Pro Glu Leu Glu Ala Pro Ser Pro Ala Asp Val Gln Gln Glu Ser Val

180 185 190

Met Pro Lys Phe Ser Ser Phe Ser Gly Leu Leu Gln Ser Asp Gly Pro

195 200 205

Phe Met Glu Ser Phe Leu Ser His Asp Leu Ser Asp Ala Tyr Lys Ala

210 215 220

Ala Leu Ser Asp Ala Glu Pro Ser Ser Thr Val Val Pro Gln Gln Leu

225 230 235 240

Asn Ser Ser Glu Thr Arg Gly His Leu Ser Met Ser Met Ala Leu Asn

245 250 255

Cys Asp Glu Leu Ser Ser Val Tyr Pro Ala Glu Trp Gln Thr Val

260 265 270

Claims (9)

1.蛋白，是如下a）或b）所示的蛋白：

a）氨基酸序列是序列2所示的蛋白；

b）在序列2所示的蛋白的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白。

2.与权利要求1所述蛋白相关的生物材料，为下述A1）至A8）中的任一种：

A1）编码权利要求1所述蛋白的核酸分子；

A2）含有A1）所述核酸分子的表达盒；

A3）含有A1）所述核酸分子的重组载体；

A4）含有A2）所述表达盒的重组载体；

A5）含有A1）所述核酸分子的重组微生物；

A6）含有A2）所述表达盒的重组微生物；

A7）含有A3）所述重组载体的重组微生物；

A8）含有A4）所述重组载体的重组微生物。

3.根据权利要求2所述的生物材料，其特征在于：A1）所述核酸分子为如下1）或2）或3）所示的基因：

1）其编码序列是序列1所示的DNA分子；

2）与1）限定的核苷酸序列具有75%或75%以上同一性，且编码权利要求1所述蛋白的DNA分子；

3）在严格条件下与1）或2）限定的核苷酸序列杂交，且编码权利要求1所述蛋白的DNA分子。

4.权利要求1所述的蛋白或权利要求2或3所述的生物材料在提高植物抗逆性中的应用；

或，权利要求1所述的蛋白或权利要求2或3所述的生物材料在培育抗逆性提高的转基因植物中的应用；

或，权利要求1所述的蛋白或权利要求2或3所述的生物材料在抗逆植物育种中的应用；

所述抗逆性为抗盐性和/或抗旱性；

所述植物为单子叶植物或双子叶植物。

5.一种培育抗逆性提高的转基因植物的方法，包括提高受体植物中权利要求1所述蛋白的表达量和/或活性，得到转基因植物的步骤；所述转基因植物的抗逆性高于所述受体植物；所述抗逆性为抗盐性和/或抗旱性；所述植物为单子叶植物或双子叶植物。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述转基因植物的抗逆性高于所述受体植物体现在如下（1）-（3）中任一种：

（1）转基因植物的种子萌发率高于受体植物；

（2）转基因植物的根长长于受体植物；

（3）转基因植物的存活率高于受体植物。

7.根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于：所述提高受体植物中权利要求1所述蛋白的表达量和/或活性的方法为在受体植物中过表达权利要求1所述的蛋白。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述过表达的方法为将权利要求1所述蛋白的编码基因导入受体植物。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：所述蛋白的编码基因的核苷酸序列是序列1所示的DNA分子。

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