KR100821128B1

KR100821128B1 - 지방 조직으로부터 줄기세포를 생성하는 방법 및 시스템

Info

Publication number: KR100821128B1
Application number: KR1020067005817A
Authority: KR
Inventors: 코타로 요시무라; 다이스케 마츠모토
Original assignee: 가부시키가이샤 바이오마스타
Priority date: 2003-11-04
Filing date: 2004-11-04
Publication date: 2008-04-14
Also published as: KR20060037469A; EP1692275A2; WO2005042730A2; US20070148766A1; DE602004030823D1; CN1871343B; ATE493492T1; WO2005042730A3; JP2007509601A; US9631176B2; JP4217262B2; EP1692275B1; JP2008188021A; CN1871343A

Abstract

본 발명은 대상이 되는 사람으로부터 간단하고 효율적인 방식으로 대량의 동질한 줄기세포 및/또는 전구세포를 생성하는 방법을 제공한다. 본 발명은 본 발명의 줄기세포 및/또는 전구세포를 이용하여 대량의 이식조직 또는 이식절편을 생성하는 방법을 더욱 제공한다. 본 발명의 고안자는 지방흡입에 의한 흡인물(aspirate)이 대량의 줄기세포를 포함하고 있음을 우연히 발견하였으며 그러한 지방흡입에 의한 흡인물(aspirate)로부터 줄기세포를 생성하는 방법을 수립하였고 따라서 상기 목적을 달성하였다.

줄기세포, 전구세포, 이식, 지방, 흡입

Description

지방 조직으로부터 줄기세포를 생성하는 방법 및 시스템{Method and system for preparing stem cells from fat tissue}

본 발명은 지방 흡입에 의한 흡인물(aspirate)로부터 줄기세포를 만드는 방법 및 시스템과 줄기세포의 이용 그리고 그러한 방법 및 시스템을 이용하여 생성된 줄기세포에 관한 것이다.

줄기세포를 주로 이용하는 재생 의학이 최근 몇 년 동안 상당한 진보를 보였다. 존재하지 않는다고 간주된 다양한 종류의 줄기세포가 발견되었고 다양한 조직으로부터 이것이 확인되었다. 따라서 많은 관심이 재생 기술을 이용하여 질병을 치료하는 것에 집중되었다.

그러나 재생 기술은 조직 및 기관의 기능부전으로 고통받는 수많은 환자들에게 일반적으로 적용될 수 있는 지점에까지는 아직 도달하지 못하였다. 현재까지 극히 한정된 수의 환자들만이 장기이식 및 보조 의학 시스템 또는 보조 장치를 이용하여 치료되었다. 이러한 치료방법은 기증자의 부족, 거부반응, 감염, 내구성 등과 같은 문제점이 있다. 특히 기증자의 부족은 심각한 문제를 일으킨다. 골수 이식의 경우, 골수와 탯줄 혈액 은행은 필요로 하는 환자들에게 한정된 양의 샘플을 제공하기가 어려운데도 불구하고 점차적으로 국내외에서 더 널리 사용되고 있다. 그러므로 상기 문제를 극복하기 위하여 줄기세포를 이용하는 치료기술과 같은 기술을 이용하는 재생의학의 수요가 증가하고 있다. 장기이식을(예를 들어 심장, 혈관 등) 위하여 외부 조직을 이용하는 것은 주로 면역 거부 반응에 의해 저지된다. 동종이식 및 이종이식에서 발생하는 변화는 잘 알려져 있다.

장배형성(gastrulation) 후, 수정란은 내배엽, 중배엽, 외배엽의 세 개의 배엽으로 분할된다. 외배엽으로부터 생성된 세포는 신경 줄기세포 등을 포함하는 뇌에 주로 존재한다. 중배엽으로부터 생성된 세포는 혈관 줄기세포, 조혈 줄기세포, 간엽(mesenchymal) 줄기세포 등을 포함하는 골수에 주로 존재한다. 내배엽으로부터 생성된 세포는 간 줄기세포, 췌장 줄기세포 등을 포함하는 장기에 주로 존재한다.

지방세포, 골세포, 인대세포, 심근세포 등과 같은 간엽세포는 신체의 모양 혹은 골격을 형성하는 데 있어 중요한 기능을 한다. 그러므로 그러한 세포 덩어리 및 그러한 세포 조직을 재생의학 및 이식의학에 적용하려는 기대가 증가하고 있 다. 특히 골수 간엽 줄기세포가 중배엽 기관으로 분화할 수 있음이 보고되었으며 그러한 줄기세포는 주로 재생의학 분야에 관심을 모으고 있다. 그러나 그러한 세포의 분화에는 덱사메타손(dexamethasone) 등과 같은 분화 유도제를 포함하는 특수한 배지가 요구되는 특별한 조건이 필요하다.(Nakatsuji, ed., "Kansaibo·Kuron Kenkyu Purotokoru [Stem cell/Clone Research Protocol]", Yodosha (2001))

간엽 줄기세포는 일종의 조직 줄기세포이다. 간엽 줄기세포는 본래 신생아의 골수 내의 모든 세포 중 만 분의 일의 비율로 생성되며 성인이 된 후에는 모든 세포 중 이백만 분의 일의 비율로 감소되어 작은 양으로만 존재하는 것이다. 그러므로 간엽 줄기세포를 분리해내는 것은 어려운 일이다. 간엽 줄기세포가 중배엽과는 다른 배엽으로 분화된다고 보고되어 그것의 응용 범위가 확대되고 있다. 그러나 그러한 분화를 위한 조건은 앞서 기술한 것보다 더 특이하다. 간엽 줄기세포의 알려진 외부 항체는 CD105(+), CD73(+), CD29(+), CD44(+), CD14(-), CD34(-), CD45(-)이다.

간엽 줄기세포를 분리하기 위해서는 많은 비용이 든다. 또한 골수세포를 채취하는 것은 일반적으로 기증자에게 고통을 준다. 더욱이 그러한 세포를 특별히 선택된 영역에서 기인한 필수적인 분화유도 혈청(serum) 없이 배양하는 것은 어려우며 따라서 그러한 줄기세포를 이용하기 위해 추가적인 비용과 노동을 들여야한다.

한편 지방이 줄기세포를 포함하고 있다는 것이 발견되었다.(WO00/53795; WO03/022988; WO01/62901; Zuk, P.A., et al., Tissue Engineering, Vol. 7, 211∼228; Zuk, P.A., et al., Molecular Biology of the cell, Vol. 13, 4279∼4295, 2002) 골수 등과 같은 다른 조직에서보다 많은 양의 줄기세포를 지방에서 얻을 수 있으며 줄기세포의 밀도는 더 높은 것으로 보여진다. 따라서 지방으로 관심이 집중되고 있다. 지방조직으로부터 줄기세포를 생성하는 본 기술은(일본 PCT 국내 공개 공보 제 2003-523267호와 일본 PCT 국내 공개 공보 제 2002-537849호) 골수에서 세포를 추출하는 방법보다 더 많은 양을 도출할 수 있다는 점에서 유익하다. 그러나 세포의 원천인 지방 조직을 콜라게네이즈(collagenase)와 같은 효소로 처리하는 것이 필요하며 따라서 줄기세포를 대량으로 간단히 생성하는 것은 불가능하다. 그럼에도 줄기세포와 전구(precursor)세포를 재생의학에 적용하기 위해서는 대량으로 간단히 동질의 줄기세포와 전구세포를 생성하는 방법이 요구된다.

발명의 요약

본 발명의 목적은 특히 본질적 대상인 사람으로부터 동질의 줄기세포 및/혹은 전구세포를 대량으로 간단히 효율적으로 생성하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 본 발명의 줄기세포 및/혹은 전구세포를 이용하여 대량으로 이식조직이나 이식절편을 생성하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 고안자는 지방흡입에 의한 흡인물(aspirate)이 대량의 줄기세포를 포함하고 있음을 우연히 발견하였으며 그러한 지방흡입에 의한 흡인물(aspirate)로부터 줄기세포를 생성하는 방법을 수립하였고 따라서 상기 목적을 달성하였다.

따라서 본 발명은 다음과 같은 사항을 제공하는 것이다.:

1. A) 지방흡입에 의해 흡인물을 수득하는 단계; B) 지방흡입물의 세포 분획을 얻기 위해 원심분리기로 이송하는 단계; C) 비중에 따른 원심분리로 세포 분획을 수득하는 단계; D) 적혈구 층보다 낮은 비중을 지닌 세포층을 수집하는 단계로 구성된 줄기세포의 제조방법

2. 제 1항에 있어서, 상기 지방흡입에 의한 흡인물은 생리식염수 및 링거 솔루션(Ringer's solution)을 사용하여 제조함을 특징으로 하는 방법

3. 제 1항에 있어서, 상기 원심분리는 800×ｇ과 같거나 작은 범위의 속도로 수행됨을 특징으로 하는 방법

4. 제 1항에 있어서, 상기 원심분리는 400×ｇ과 같거나 작은 범위의 속도로 수행됨을 특징으로 하는 방법

5. 제 1항에 있어서, 상기 비중에 따른 원심분리는 370×ｇ 내지 1,100×ｇ의 범위의 속도로 수행됨을 특징으로 하는 방법

6. 제 1항에 있어서, 상기 비중에 따른 원심분리는 20℃의 1.076에서 1.078 ｇ/㎖에 이르는 비중을 가지는 매질을 사용하여 수행됨을 특징으로 하는 방법

7. 제 1항에 있어서, 상기 비중에 따른 원심분리의 매질은 Ficoll, Percoll 및 설탕으로 구성된 그룹에서 선택되어짐을 특징으로 하는 방법

8. 제 7항에 있어서, 상기 비중에 따른 원심분리의 매질은 Ficoll임을 특징으로 하는 방법

9. 제 1항에 있어서, 상기 수득된 세포층의 비중은 1.050 내지 1.075의 범위에 존재함을 특징으로 하는 방법

10. 제 1항에 있어서, 상기 세포층의 채취는 피펫(pipette)을 사용하여 수행됨을 특징으로 하는 방법

11. 제 1항에 있어서, 세포층을 DMEM, M199, MEM, HBSS, Ham's F12, BME, RPMI1640, MCDB104, MCDB153(KGM) 및 그것의 혼합물로 구성된 그룹에서 선택된 성분을 포함하는 배지에서 배양되는 단계를 더욱 포함함을 특징으로 하는 방법

12. 제 1항에 있어서, 상기 비중에 따른 원심분리는 밀도 구배 원심분리를 포함함을 특징으로 하는 방법

13. 제 1항에 있어서, 적혈구를 제거하는 단계를 더욱 포함함을 특징으로 하는 방법

14. A) 지방흡입으로부터 물질을 수득하는 단계; 및 B) 지방조직을 분리하지 않고 세포 분획을 얻기 위해 지방흡입으로부터 수득된 물질을 원심분리시키는 단계로 구성된 줄기세포의 제조방법

15. 제 14항에 있어서, 최소한 하나의 세포 분획이 물질로부터 분리되는 조건 하에 물질을 적용시키는 단계를 더욱 포함함을 특징으로 하는 방법

삭제

18. 제 14항에 있어서, 단계 B)에서 상등액(supernatant)을 제거하는 단계를 더욱 포함함을 특징으로 하는 방법

19. 제 14항에 있어서, 단계 B)로부터의 물질을 여과하는 단계를 더욱 포함함을 특징으로 하는 방법

20. 제 14항에 있어서, 적혈구를 제거하는 단계를 더욱 포함함을 특징으로 하는 방법

21. 제 14항에 있어서, 상기 적혈구를 제거하는 단계는 적혈구를 분해시키는 성분을 첨가하는 것을 포함함을 특징으로 하는 방법

22. ⅰ) 지방흡입으로부터 물질을 수득하는 단계; ⅱ) 지방조직을 분리하지 않고 최소한 하나의 세포 분획이 물질로부터 분리되는 조건 하에 물질을 적용시키는 단계; ⅲ) 물질을 원심분리시키는 단계; ⅳ) 물질에 적혈구를 분해시키는 성분을 첨가하여 교반하는 단계; ⅴ) 펠렛(pellet)을 얻기 위해 물질을 원심분리시키는 단계; 및 ⅵ) 펠렛으로부터 물질의 상등액(supernatant)을 흡인하는 단계로 구성된 줄기세포의 제조방법

23. 제 22항에 있어서, 상기 분리되는 조건 하에 물질을 적용시키는 단계는 지방흡입에 의한 흡인물을 유지하는 것을 포함함을 특징으로 하는 방법

24. 제 22항에 있어서, 상기 지방흡입에 의한 물질은 지방흡입에 의한 흡인물과 지방을 포함함을 특징으로 하는 방법

삭제

26. 제 22항에 있어서, 상기 단계 ⅲ)에서 상기 원심분리는 400×ｇ 내지 1200×ｇ에서 수행됨을 특징으로 하는 방법

27. 제 22항에 있어서, 상기 적혈구를 분해시키는 성분은 염화암모늄(ammonium chloride)과 중탄산칼륨(potassium bicarbonate)을 포함함을 특징으로 하는 방법

28. 제 27항에 있어서, 상기 염화암모늄은 155mM의 농도임을 특징으로 하는 방법

29. 제 27항에 있어서, 상기 중탄산칼륨은 10mM의 농도임을 특징으로 하는 방법

30. 제 22항에 있어서, 상기 단계 ⅴ)에서 상기 원심분리는 400×ｇ 내지 1200×ｇ에서 수행됨을 특징으로 하는 방법

31. 제 22항에 있어서, 상기 펠렛은 줄기세포를 포함함을 특징으로 하는 방법

32. 1∼31항의 방법 중 어느 한 방법에 따라 제조된 줄기세포

33. 제 32항에 있어서, CD13, CD29, CD34, CD36, CD44, CD49d, CD54, CD58, CD71, CD73, CD90, CD105, CD106, CD151 및 SH3으로 구성된 그룹에서 선택된 최소한 하나의 단백질을 발현함을 특징으로 하는 줄기세포

34. 제 33항에 있어서, CD13, CD29, CD34, CD36, CD44, CD49d, CD54, CD58, CD71, CD73, CD90, CD105, CD106, CD151 및 SH3을 발현함을 특징으로 하는 줄기세포

35. 제 33항에 있어서, CD31, CD45, CD117 및 CD146으로 구성된 그룹에서 선택된 최소한 하나의 단백질을 더욱 발현함을 특징으로 하는 줄기세포

36. 제 32항에 있어서, CD56을 발현하지 않음을 특징으로 하는 줄기세포

37. 제 32항에 있어서, CD3, CD4, CD14, CD15, CD16, CD19, CD33, CD38, CD56, CD61, CD62e, CD62p, CD69, CD104, CD135 및 CD144로 구성된 그룹에서 선택된 최소한 하나의 단백질을 발현하지 않음을 특징으로 하는 줄기세포

38. 제 37항에 있어서, CD3, CD4, CD14, CD15, CD16, CD19, CD33, CD38, CD56, CD61, CD62e, CD62p, CD69, CD104, CD135 및 CD144을 발현하지 않음을 특징으로 하는 줄기세포

39. 제 32항에 있어서, CD49d를 발현하고 CD56은 발현하지 않음을 특징으로 하는 줄기세포

40. A) 지방흡입에 의한 흡인물을 수득하기 위한 수단; B) 세포 분획을 얻기 위해 지방흡입에 의한 흡인물을 원심분리시키기 위한 수단; 및 C) 세포 분획을 비중에 따라 원심분리시키기 위한 수단으로 구성된 줄기세포의 제조 시스템

41. 제 40항에 있어서, 상기 시스템은 D) 적혈구 층보다 낮은 비중을 지닌 세포층을 수집하기 위한 수단을 더욱 포함함을 특징으로 하는 시스템

42. A) 지방흡입에 의한 물질을 수득하기 위한 수단; 및 B) 지방조직의 분리 없이 세포 분획을 얻기 위해 지방흡입에 의한 물질을 원심분리시키기 위한 수단으로 구성된 줄기세포의 제조 시스템

43. ⅰ) 지방흡입으로부터 물질을 수득하기 위한 수단; ⅱ) 지방조직을 분리하지 않고 최소한 하나의 세포 분획이 물질로부터 분리되는 조건에 물질을 적용시키기 위한 수단; ⅲ) 물질을 원심분리시키기 위한 수단; ⅳ) 물질에 적혈구를 분해시키는 성분을 첨가하여 교반하기 위한 수단; ⅴ) 펠렛(pellet)을 얻기 위해 물질을 원심분리시키기 위한 수단; 및 ⅵ) 펠렛으로부터 물질의 상등액(supernatant)을 흡인하기 위한 방법으로 구성된 줄기세포의 제조 시스템

44. A) 지방흡입에 의한 흡인물을 수득하는 단계; B) 세포 분획을 얻기 위해 지방흡입에 의한 흡인물을 원심분리시키는 단계; C) 세포 분획을 비중에 따라 원심분리시키는 단계; D) 적혈구 층보다 낮은 비중을 지닌 세포층을 수집하는 단계; 및 E) 외식편(explant)을 얻기 위해 수집된 세포층을 배양하는 단계로 구성된 외식편의 수득 방법

45. A) 지방흡입에 의한 흡인물을 수득하는 단계; B) 세포 분획을 얻기 위해 지방흡입에 의한 흡인물을 원심분리시키는 단계; 및 C) 이식 조직(tissue transplant)을 얻기 위해 수집된 세포층을 배양하는 단계로 구성된 이식 조직의 제조방법

46. A) 지방흡입에 의한 흡인물을 수득하는 단계; B) 세포 분획을 얻기 위해 지방흡입에 의한 흡인물을 원심분리시키는 단계; C) 세포 분획을 비중에 따라 원심분리시키는 단계; D) 적혈구 층보다 낮은 비중을 지닌 세포층을 수집하는 단계; 및 E) 이식 조직(tissue transplant)을 얻기 위해 수집된 세포층을 배양하는 단계로 구성된 이식 조직의 제조방법

47. A) 지방흡입에 의한 흡인물을 수득하는 단계; B) 세포 분획을 얻기 위해 지방흡입에 의한 흡인물을 원심분리시키는 단계; C) 세포 분획을 비중에 따라 원심분리시키는 단계; D) 적혈구 층보다 낮은 비중을 지닌 세포층을 수집하는 단계; 및 E) 이식 조직(tissue transplant)을 얻기 위해 수집된 세포층을 배양하는 단계; 및 F) 이식 조직을 이식하는 단계로 구성된 이식 조직의 이식 방법

48. 줄기세포의 제조에 있어서 지방흡입에 의한 흡인물의 사용

49. 1∼31항 중 어느 하나에 따른 방법에 의해 수득된 줄기세포를 배양하는 단계를 포함하는 혈관내피 전구세포, 지방세포, 연골세포, 골세포 및 근세포로 구성된 그룹에서 선택된 세포의 제조방법

50. A) a) 1∼31항 중 어느 하나에 따라 수득된 줄기세포와 b) 목적 분화 부위에 상응하는 분화된 세포를 혼합하여 혼합물을 수득하는 단계; 및 B) 지방-유래 전구세포를 분화시키기에 충분한 조건 하에서 혼합물을 배양하는 단계로 구성된 분화된 세포의 제조방법

51. 제 50항에 있어서, 상기 분화된 세포는 간엽(mesenchymal) 세포임을 특징으로 하는 방법

52. 제 50항에 있어서, 상기 분화된 세포는 지방세포, 골수세포, 골아세포, 연골세포, 섬유아세포, 근섬유아세포, 신경세포, 골격 근원세포, 심근세포, 혈관내피세포, 평활근세포, 간세포, 신장세포 및 췌장세포로 구성된 그룹에서 선택되어짐을 특징으로 하는 방법

53. 제 50항에 있어서, 상기 분화된 세포로 분화를 유도하기 위하여 분화 유도제를 공급하는 단계를 더욱 포함함을 특징으로 하는 방법

54. 제 50항에 있어서, 상기 혼합물은 아드레노코티컬(adrenocortical) 스테로이드, 인슐린, 포도당, 인도메타신, 이소부틸-메틸크산틴(IBMX), 아스코르빈산 및 그 유도체, 글리세로포스페이트, 에스트로겐 및 그 유도체, 프로게르테론 및 그 유도체, 안드로겐 및 그 유도체, 성장인자(growth factor), 뇌하수체 분비물 추출물(pituitary gland extracts), 송과선 추출물(pineal body extracts), 레티논산, 비타민 D, 타이로이드 흐르몬, 우태아 혈청, 말 혈청, 인간 혈청, 헤파린, 중탄산소다, HEPES, 알부민, 트랜스페린(transferrin), 셀레네이트(selenates), 리놀레인산, 3-이소부틸-1-메틸크산틴, 탈메틸화제, 히스톤 탈아세틸레이트제(histone deacetylating agents), 악티빈(activin), 사이토카인, 헥사메틸렌비스아세트아마이드(HMBA), 다이메틸아세트아마이드(DMA), 디부틸 cAMP(dbcAMP), 디메틸술폭사이드(DMSO), 요도데옥시유리딘(IdU), 하이록시우레아(hyroxyurea(HU)), 사이토신 아라비노사이드(cytosine arabinoside(AraC)), 마이토마이신 C(mitomycin C(MMC)), 부티르산 나트륨(sodium butyrate(NaBu)), 폴리브렌(polybrene) 및 셀레늄으로 구성된 그룹에서 선택된 하나 이상의 성분을 포함하는 배지에서 배양됨을 특징으로 하는 방법

55. 1∼31항 중 어느 하나에 따라 수득된 줄기세포와 목적 분화 부위에 상응하는 분화된 세포를 포함하는 세포 혼합물

56. 제 55항에 있어서, 상기 세포 혼합물을 줄기세포의 분화를 유도하기에 충분한 조건 하에 적용시킴을 특징으로 하는 세포 혼합물

57. a) 1∼31항 중 어느 하나에 따라 수득된 줄기세포와 b) 목적 분화 부위에 상응하는 분화된 세포를 포함하는 세포 이식을 위한 혼합물

58. 제 57항에 있어서, 상기 이식은 목적 분화 부위에 수행됨을 특징으로 하는 혼합물

59. 제 57항에 있어서, 상기 줄기세포와 분화된 세포의 비율이 약 1:10에서 10:1임을 특징으로 하는 혼합물

60. 제 57항에 있어서, 상기 줄기세포와 분화된 세포의 비율이 약 1:2에서 2:1임을 특징으로 하는 혼합물

61. 제 57항에 있어서, 상기 줄기세포와 분화된 세포의 비율이 실질적으로 같음을 특징으로 하는 혼합물

62. 제 57항에 있어서, 상기 분화된 세포는 간엽 세포를 포함함을 특징으로 하는 혼합물

63. 제 57항에 있어서, 상기 분화된 세포는 지방세포, 골수세포, 골아세포, 연골세포, 섬유아세포, 근섬유아세포, 신경세포, 골격 근원세포, 심근세포, 혈관내피세포, 평활근세포, 간세포, 신장세포 및 췌장세포로 구성된 그룹에서 선택되어짐을 특징으로 하는 혼합물

64. 제 57항에 있어서, 아드레코티컬(adrenocortical) 스테로이드, 인슐린, 포도당, 인도메타신, 이소부틸-메틸크산틴(IBMX), 아스코르빈산 및 그 유도체, 글리세로포스페이트, 에스트로겐 및 그 유도체, 프로게르테론 및 그 유도체, 안드로겐 및 그 유도체, 성장인자(growth factor), 뇌하수체 분비물 추출물(pituitary gland extracts), 송과선 추출물(pineal body extracts), 레티논산, 비타민 D, 타이로이드 흐르몬, 우태아 혈청, 말 혈청, 인간 혈청, 헤파린, 중탄산소다, HEPES, 알부민, 트랜스페린(transferrin), 셀레네이트(selenates), 리놀레인산, 3-이소부틸-1-메틸크산틴, 탈메틸화제, 히스톤 탈아세틸레이트제(histone deacetylating agents), 악티빈(activin), 사이토카인, 헥사메틸렌비스아세트아마이드(HMBA), 다이메틸아세트아마이드(DMA), 디부틸 cAMP(dbcAMP), 디메틸술폭사이드(DMSO), 요도데옥시유리딘(IdU), 하이록시우레아(hyroxyurea(HU)), 사이토신 아라비노사이드(cytosine arabinoside(AraC)), 마이토마이신 C(mitomycin C(MMC)), 부티르산 나트륨(sodium butyrate(NaBu)), 폴리브렌(polybrene) 및 셀레늄으로 구성된 그룹에서 적어도 하나의 성분을 더욱 포함함을 특징으로 하는 혼합물

65. 제 57항에 있어서, 상기 줄기세포와 분화된 세포는 서로가 동종이계(allogeneic)임을 특징으로 하는 혼합물

66. 제 57항에 있어서, 상기 줄기세포와 분화된 세포는 서로가 동계(syngeneic)임을 특징으로 하는 혼합물

67. A) a) 1∼31항 중 어느 하나에 따라 수득된 줄기세포와 b) 목적 분화 부위에 상응하는 분화된 세포를 포함하는 혼합물을 제공하는 단계; 및 B) 혼합물을 개체에 투여하는 단계로 구성됨을 특징으로 하는 분화된 세포의 기능부전과 관련한 병, 장애 혹은 비정상적 상태의 치료 및 예방 방법

68. a) 1∼31항 중 어느 하나에 따라 수득된 줄기세포; b) 목적 분화 부위에 상응하는 분화된 세포; 및 c) 약학적으로 수용 가능한 담체를 포함함을 특징으로 하는 분화된 세포의 결핍으로 인한 병, 장애, 혹은 비정상적 상태의 치료 및 예방 약제

69. 분화된 세포의 결핍으로 인한 병, 장애, 혹은 비정상적 상태의 치료 및 예방 약제의 제조를 위한 a) 1∼31항 중 어느 하나에 따라 수득된 줄기세포와 b) 목적 분화 부위에 상응하는 분화된 세포를 포함함을 특징으로 하는 혼합물의 이용

70. A) a) 1∼26항 중 어느 하나에 따라 수득된 줄기세포와 b) 목적 분화 부위에 상응하는 분화된 세포를 포함하는 혼합물을 제공하는 단계; B) 그 혼합물을 개체에 투여하는 단계를 포함함을 특징으로 하는 성형성 질환의 치료 및 개선 방법

71. a) 1∼31항 중 어느 하나에 따라 수득된 줄기세포; b) 목적 분화 부위에 상응하는 분화된 세포; 및 c) 약학적으로 수용 가능한 담체를 포함함을 특징으로 하는 성형성 질환의 치료 및 개선 약제

72. 성형성 질환의 치료 및 개선 약제의 제조를 위한 a) 1∼31항 중 어느 하나에 따라 수득된 줄기세포; b) 목적 분화 부위에 상응하는 분화된 세포를 포함함을 특징으로 하는 혼합물의 이용

발명의 효과

본 발명은 특히 본질적 대상인 사람으로부터 동질의(homogeneous) 줄기세포 및/혹은 전구세포를 대량으로 간단히 효율적으로 생성하는 방법을 제공하는 것이다.

또한 본 발명은 본 발명의 줄기세포 및/혹은 전구세포를 이용하여 대량으로 이식조직이나 이식절편을 생성하는 방법을 제공하는 것이다.

더욱이 본 발명은 줄기세포, 전구세포, 조직 및 이러한 세포들을 이용하여 생성된 기관을 제공하는 것이다.

본 발명은 종래의 방법보다 간단하고 효율적으로 지방조직으로부터 줄기세포를 생성하는 새로운 방법을 제공한다. 본 발명은 지방조직으로부터의 흡인물(aspirate)을 이용함으로써 대량의 줄기세포를 제공하는 큰 효과를 이룬다.

이하 본 발명은 선택적인 예의 형태로 설명될 것이다. 본 기술분야에 전문적인 사람은 본 발명이 본 명세서의 설명과 본 기술분야에서 잘 알려진 통상적으로 사용되는 기술에 근거하여 적절히 수행되었음을 이해할 것이다. 본 기술분야에 전문적인 사람은 본 발명의 기능과 영향을 쉽게 인지할 수 있을 것이다.

용어의 정의

본 발명에서 사용된 용어는 다음으로 정의된다.

본 발명에서 "세포"라는 용어는 본 기술분야에서 광범위한 의미로 사용되는 것과 같으며 자기복제가 가능하고 유전정보를 가지며 그것을 발현하기 위한 기작(mechanism)을 가지고 있고 세포와 같은 생명체를 외부와 구분하는 세포벽 구조로 둘러싸인 다세포 기관을 이루는 조직의 구조적 단위를 말한다. 본 발명에 따라 모든 세포가 대상으로 사용될 수 있다. 본 발명에서 사용된 세포의 수는 광학 현미경을 통해 셀 수 있다. 광학 현미경을 통해 그 수를 셀 때 핵의 수가 세어진다. 조직은 조직 절편(section)으로 잘라내어진 뒤 엘라스틴(elastin) 혹은 콜라겐과 같은 세포외부의 세포간질(matrices)과 세포들로부터 유래된 핵을 구별하기 위해 헤마톡실린-에오신(hematoxylin eosin (HE))으로 염색되어진다. 이러한 조직 절편은 광학 현미경을 통해 관찰이 되며 특정한 영역(예를 들어 200㎛×200㎛)안의 핵의 수는 세포의 수로 평가된다. 본 원에 사용된 세포는 자연적으로 발생하는 세포이거나 인공적으로 변형된 세포(예를 들어 퓨전(fusion) 세포 및 유전적으로 변형된 세포 등)일 수 있다. 세포 소스(source)의 예로는 여기에 한정되는 것은 아니며 단일 세포(single-cell) 배양; 정상적으로 성장한 유전자 도입 동물의 태아(embryo), 혈액 및 체조직(예를 들어 아디포스(adipose) 혹은 팻 조직); 정상적으로 성장한 세포 라인에 기인한 세포들의 혼합 등을 포함한다. 그러한 공급 소스 자체가 세포로 사용될 수 있다.

본 발명에서 사용되는 지방세포(adipocytes)와 그에 상응하는 물질은 그러한 기관이 지방세포 및 그에 상응하는 세포를 가지고 있는 한 모든 기관(예를 들어 먹장어목, 페트로나조니포메스(Petronyzoniformes), 연골어류, 경골어류, 양서류, 파충류, 조류, 포유류 등)으로부터 유래하며 포유동물(예를 들어 단공류, 유대류, 빈치류, 피익목, 익수목, 식육류, 식충류, 장비류, 기제류, 우제류, 관치목, 유린류, 해우류, 고래류, 영장류, 설치류, 토끼목 등)이 더욱 바람직하다. 하나의 실시태양에서 영장류(예를 들어 침팬지, 일본 원숭이, 인간)에서 기인한 세포가 사용되었다. 사람으로부터 유래한 세포가 가장 바람직하나 본 발명은 그것에 한정되지는 것은 아니다.

본 발명에서 사용되는 "줄기세포"라는 용어는 모노포텐시(monopotency), 멀티포텐시(multipotency) 및 토티포텐시(totipotency)를 가지는 분화된 세포의 전구체(혹은 progenitor)를 언급한다. 줄기세포는 특정한 자극에 상응하여 분화된다. 전형적으로 줄기세포는 파괴된 조직을 재생할 수 있다. 본 명세서에서 사용된 줄기세포는 조직 줄기세포(tissue stem cell, tissular stem cell, tissue-specific stem cell 혹은 somatic stem cell이라고 불리는) 및 다른 전구세포가 될 수 있으나 그것에 한정되는 것은 아니다. 줄기세포는 앞서 기술한 특징을 갖는 한 인공적으로 생산된 세포(예를 들어 퓨전 세포, 재프로그램된 세포 및 본 명세서에서 사용된 것과 같은)일 수 있다. 태아(embryonic) 줄기세포는 초기 태아(embryo)에서 유래된 플루리포텐트(pluripotent) 줄기세포이다. 태아 줄기세포는 1981년에 처음으로 수립된 후 1989년부터 녹아웃(Knockout) 마이스의 생산에 적용되었다. 1998년에는 인간 태아 줄기세포가 수립되었고 현재 재생의학에 적용 가능하게 되었다. 조직 줄기세포는 태아 줄기세포와 달리 비교적 제한된 수준의 분화를 보인다. 조직 줄기세포는 조직에 존재하며 미분화된 세포내부 구조를 가진다. 조직 줄기세포는 핵/세포질 비율이 더 높으며 세포내부의 세포기관을 거의 가지고 있지 않다. 대부분의 조직 줄기세포는 플루리포텐시, 긴 세포 주기, 개인의 생명을 넘어서는 증식력을 가진다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이 줄기세포는 상황에 따라 채용된 조직 줄기세포일 수 있다.

조직 줄기세포는 피부조직, 골수조직, 신경조직 등과 같이 세포가 유래된 곳에 근거하여 구분되어진다. 피부조직에 속하는 조직 줄기세포는 상피 줄기세포, 모낭 줄기세포 등을 포함한다. 소화조직에 속하는 조직 줄기세포는 췌장 줄기세포, 간 줄기세포 등을 포함한다. 골수조직에 속하는 조직 줄기세포는 조혈(hamatopoietic) 줄기세포, 간엽(mesenchymal) 줄기세포 등을 포함한다. 신경조직에 속하는 조직 줄기세포는 신경 줄기세포, 레티날(retinal) 줄기세포 등을 포함한다.

본 발명에서 사용된 "전구세포"는 분화 특성이 없는 미분화된 모세포에 해당하는 세포를 말하며 그것의 자세포(progeny cell)는 특정한 분화 특성을 가지는 것으로 알려져 있고 멀티포텐트 미분화 세포뿐만이 아니라 모노포텐트 미분화 세포 또한 포함한다. 예를 들어 자세포가 혈관내피 세포인 경우 그것의 전구세포는 혈관내피 전구세포가 된다. 본 발명에서 사용된 "줄기세포"는 전구세포를 포함한다. 그러나 줄기세포의 분화에 의해 얻어진 전구세포는 줄기세포에 의하여 "분화된 세포"에 해당하는 것이다. "PLA(processed lipoaspirate cell)"라는 용어는 지방흡입에 의한 흡인물의 지방 부분으로부터 얻어진 전구세포를 의미한다. 지방흡입에 의한 흡인물의 액상으로부터 기인한 전구세포는 "체액-흡인물 세포(liquid-aspirate cells)" 혹은 "LAF"로 언급되기도 한다. 지방-유래 전구세포는 PLA 세포와 체액-흡인물 세포를 포함한다.

본 발명에 사용된 "지방-유래 전구세포"라는 용어는 말초 혈액(peripheral blood) 혹은 혈관-지질(vascular-stromal) 세포(preadipocytes)로부터 기인한 줄기세포와 같이 지방흡입으로 얻어진 줄기세포 및 다른 전구세포를 의미한다. 지방-유래 전구세포는 지방흡입과정에서 얻어지거나 지방 조직으로부터 유래한 모든 멀티포텐트 혹은 모노포텐트 전구세포를 의미한다. 세포는 지방-유래 혈관-지질 세포(=preadipocytes, adipose-derived interstitial cells), 지방-유래 줄기세포, 지방 줄기세포, 내피 모세포(endothelial progenitor cells),조혈(hematopoietic) 줄기세포 등을 포함한다. 그러한 줄기세포를 분리하기 위한 기술이 예를 들어 Nakatsuji, ed., "Kansaibo·Kuron Kenkyu Purotokoru [Stem cell/Clone Research Protocol]", Yodosha (2001); WO00/53795; WO03/022988; 및 WO01/62901에 기술된 바와 같이 알려져 있다. 이 문서는 관련된 부분에서 참조에 의해 구체화되었다. 본 원에 사용된 "지방-유래 전구세포"는 여기 알려진 분리 방법에 의해 얻어진 지방 조직-유래 줄기세포를 포함하는 모든 지방 조직-유래 줄기세포를 의미한다. 본 원에 사용된 "전구세포"라는 용어는 멀티포텐트 미분화 세포뿐만이 아니라 모노포텐트 미분화 세포 또한 포함한다. 본 원에 사용된 "줄기세포"라는 용어는 전구세포를 포함한다. "PLA(processed lipoaspirate cell)"라는 용어는 지방흡입에 의한 흡인물의 지방 부분으로부터 얻어진 전구세포를 의미한다. 지방흡입에 의한 흡인물의 체액으로부터 기인한 전구세포는 "체액-흡인물 세포(liquid-aspirate cells)"로 언급되기도 한다. 지방-유래 전구세포는 PLA 세포와 체액-흡인물 세포를 포함한다.

본 명세서에서 사용된 "체세포"라는 용어는 난자, 정자 등과 같은 생식세포를 제외한 DNA를 다음세대에 전달하지 않는 모든 세포를 의미한다. 전형적으로 체세포는 제한된 플루리포텐시를 가지거나 혹은 플루리포텐시가 없다. 본 발명에 사용된 체세포는 세포가 의도하는 처리에 도달할 수 있는 한 자연적으로 발생하거나 혹은 유전적으로 변형될 수 있다.

본 원에 사용된 "분화된 세포"라는 용어는 예를 들어 근육세포, 신경세포 등과 같이 특정한 기능과 형태를 가지는 세포를 의미한다. 줄기세포와는 달리 분화된 세포는 플루리포텐시가 없거나 거의 없다. 분화된 세포의 예로는 상피세포, 췌장 실질 세포(pancreatic parenchymal cell), 췌관세포, 간세포, 혈액세포, 심근세포, 골격근세포, 골아세포(osteoblast), 골격 근원세포, 신경세포, 혈관내피세포, 색소세포, 평활근세포, 지방세포, 골세포, 연골세포 등을 포함한다. 본 발명에 사용된 분화된 세포는 덩어리 및 조직의 형태에 속한다.

세포의 기원은 외배엽, 내배엽 및 중배엽으로 분류된다. 신경 줄기세포를 포함하는 외배엽 기원의 줄기세포는 대부분 뇌에 존재한다. 혈관 줄기세포와 그것의 분화된 세포, 조혈 줄기세포와 그것의 분화된 세포, 간엽 줄기세포와 그것의 분화된 세포 등을 포함하는 내배엽 기원의 줄기세포는 대부분 골수에 존재한다. 간 줄기세포와 그것의 분화된 세포, 췌장 줄기세포와 그것의 분화된 세포 등을 포함하는 중배엽 기원의 줄기세포는 대부분 기관에 존재한다. 본 원의 체세포는 모든 배엽으로부터 유래할 수 있으나 간엽 체세포가 바람직하다.

본 발명에 사용된 "간엽(mesenchymal) 줄기세포"는 간엽(mesenchyme)에서 발견되는 줄기세포를 의미한다. 본 원의 "간엽 줄기세포"라는 용어는 "MSC"로 축약되어 쓰이기도 한다. 간엽은 불가사리 모양을 하거나 불규칙적인 돌기를 가지고 외피 조직 사이에 브리지(bridge) 갭이 있는 프리(free) 세포 집합을 의미하며 다세포 동물의 각 발달 단계에서 확인되어진다. 간엽은 또한 세포들과 결합된 세포내부 접합체로 구성된 조직을 의미한다. 간엽 줄기세포는 증식력과 골세포, 연골세포, 근세포, 간질세포(stroma cell), 힘줄세포 및 지방세포로 분화할 수 있는 능력을 가지고 있다. 간엽 줄기세포는 환자로부터 수득된 골수세포 등을 성장시키거나 배양하고 혹은 연골세포 또는 골아세포로 분화시키기 위하여 사용된다. 간엽 줄기세포는 또한 폐포 뼈(alveolar bones); 관절증(arthropathy) 등의 경우 뼈, 연골 및 관절 등의 재구성 물질로도 사용된다. 따라서 간엽 줄기세포의 수요가 많다. 또한 간엽 줄기세포는 혈액세포와 임파세포(lymphoid cell)로 분화될 수 있다. 그러므로 간엽 줄기세포의 수요가 증가하고 있다.

"지방흡입 물질"이라는 어구는 지방흡입 시 발생하는 모든 물질을 의미한다. 전형적으로 그러한 지방흡입 물질은 지방조직 및 지방흡입에 의한 흡인물을 포함한다.

"지방흡입에 의한 흡인물"이라는 어구는 지방흡입 시 발생하는 체액을 의미한다. 지방흡입에 의한 흡인물은 (1) 지방흡입 시 발생하는 체액 흡인물(예를 들어 튜메센트(tumecent) 솔루션 및 혈액을 포함하는) 및 (2) 식염수(saline)와 같은 용액으로 흡인된 지방을 세척할 때 발생하는 액체이나 여기에 한정되는 것은 아니다.

본 명세서에서 사용된 "체세포"라는 용어는 난자, 정자 등과 같은 생식세포를 제외한 DNA를 다음 세대에 전달하지 않는 모든 세포를 의미한다. 전형적으로 체세포는 제한된 플루리포텐시를 가지거나 혹은 플루리포텐시가 없다. 본 발명에 사용된 체세포는 세포가 의도하는 처리에 도달할 수 있는 한 자연적으로 발생하거나 혹은 유전적으로 변형될 수 있다.

본 원에 사용된 "지방세포"라는 용어는 조직사이에 위치하는 세포 및 소성(areolar) 조직으로서 지방조직 또는 모세혈관 사이에 그룹을 형성하는 세포를 의미한다. 지방세포는 황색 및 갈색의 지방세포를 포함하며 본 명세서에서 동등하게 사용된다. 세포내부의 지방은 Sudan Ⅲ 및 osmium tetroxide로 쉽게 검출할 수 있다.

본 원에 사용된 "목적 분화 부위"라는 용어는 처리가 요구되는 개체의 특정한 부분을 의미한다. 본 발명에서 그러한 목적 분화 부위는 개체의 모든 기관 및 조직에서 선택될 수 있다.

본 명세서에서 사용된 "조직"이라는 용어는 다세포 기관 내에 실질적으로 같은 기능 및/혹은 형태를 가지는 세포의 집합을 의미한다. "조직"은 전형적으로 기원(origine)이 같은 세포의 집합체이나 같은 기능 및/혹은 형태를 가지는 한 기원이 다른 세포들의 집합체도 될 수 있다. 그러므로 본 발명의 줄기세포가 조직을 재생하기 위하여 사용될 경우 그 조직은 기원이 두 개 혹은 그 이상으로 다른 세포들의 집합체로 구성될 수 있다. 전형적으로 조직은 기관의 한 부분을 구성한다. 동물 조직은 형태학적, 기능적 또는 발생학적 근거로 상피조직, 결합조직, 근육조직, 신경조직 등으로 나뉜다. 또는 조직은 조직을 구성하는 세포 형태에 따라 단일 조직과 구성 조직으로 나뉜다. 이와 같이 조직은 다양한 범주로 분류된다. 본 발명에서 모든 조직은 처리하고자 하는 대상을 의미한다.

본 발명은 모든 기관을 대상으로 한다. 본 발명에서 대상이 되는 조직 및 세포는 모든 기관에서 유래한다. 본 명세서에서 사용된 "기관"이라는 용어는 특정한 기능이 수행되는 개별적인 유기체의 특정한 부분에 위치하는 형태학적으로 독립된 구조를 의미한다. 예를 들어 동물 및 식물과 같은 다세포 생물에서 기관은 특정한 방식으로 배열된 몇몇의 조직으로 구성되며 각 조직은 많은 수의 세포들로 이루어져있다. 그러한 예로 혈관계와 연관된 기관이 있다. 한 실시태양에서 본 발명의 대상이 되는 기관은 피부, 혈관, 각막, 신장, 심장, 간, 탯줄, 장, 신경, 폐, 태반, 췌장, 뇌, 페리퍼럴(peripheral) 림(limb), 망막 등을 포함하나 여기에 한정되는 것은 아니다. 본 명세서에서 모든 기관이 대상으로 사용될 수 있다. 그러나 예를 들어 지방, 뼈, 인대 등과 같은 간엽 조직이 대상으로 바람직하며 여기에 한정되는 것은 아니다.

본 명세서에서 사용된 "분화에 충분한 조건"이라는 용어는 분화를 일으키는 시간, 배지, 온도, 습도 등을 의미한다. 지방흡입에 의한 흡인물에서 유도된 줄기세포로부터 분화된 세포를 생성하기 위한 방법은 (1) 배지에 분화 유도제를 첨가하기 위한 방법; 및 (2) 본 발명의 세포를 목적 분화 부위에 상응하는 분화된 세포로써 배양하기 위한 방법을 포함한다. 덱사메타손(dexamethasone)과 같은 분화 유도제를 첨가하기 위한 방법은 줄기세포의 배지에 덱사메타손과 같은 아드레노코르티콜 스테로이드(adrenocortical steroid), 인슐린, 포도당, 인도메타신, 이소부틸-메틸크산틴(IBMX), 아르코르베이트-2-포스페이트(ascorbate-2-phosphate), 아스코르빈산 및 그 유도체, 글리세로포스페이트, 에스트로겐 및 그 유도체, 프로게르테론 및 그 유도체, 안드로겐 및 그 유도체, αFGF, βFGF, EGF, IGF, TGF-beta, ECGF, BMF, PDGF와 같은 성장인자(growth factor), 뇌하수체 분비물 추출물(pituitary gland extracts), 송과선 추출물(pineal body extracts), 레티논산, 비타민 D, 타이로이드 흐르몬, 우태아 혈청, 말 혈청, 인간 혈청, 헤파린, 중탄산소다, HEPES, 알부민, 트랜스페린(transferrin), 아셀레산나트륨과 같은 셀레네이트(selenates), 리놀레인산, 3-이소부틸-1-메틸크산틴, 5-아자사이티딘(5-azacytidine)과 같은 탈메틸화제, 트리코스타틴(trichostatin)과 같은 히스톤 탈아세틸레이트제(histone deacetylating agents), 악티빈(activin), LIF, IL-2, IL-6와 같은 사이토카인, 헥사메틸렌비스아세트아마이드(HMBA), 다이메틸아세트아마이드(DMA), 디부틸 cAMP(dbcAMP), 디메틸술폭사이드(DMSO), 요도데옥시유리딘(IdU), 하이록시우레아(hyroxyurea(HU)), 사이토신 아라비노사이드(cytosine arabinoside(AraC)), 마이토마이신 C(mitomycin C(MMC)), 부티르산 나트륨(sodium butyrate(NaBu)), 폴리브렌(polybrene) 및 셀레늄과 같이 전형적으로 알려진 분화 유도제를 첨가하기 위한 방법을 포함한다.

본 발명의 개시에 따라 줄기세포를 목적 분화 부위에 상응하는 분화된 세포로써 배양하기 위한 방법 (2)에서 지방-유래 전구세포는 분화된 세포로 지방-유래 전구세포를 혼합함으로써 분화된 세포가 된다. 본 발명의 구체화에 따라 그러한 조건은 지방-유래 전구세포 및 분화된 세포 자체를 유지하기 위한 조건과 일부분 일치하는 점이 있다. 그러므로 조건은 알맞게 변화되어야 한다. 조건은 본 발명의 지방-유래 전구세포와 함께 혼합될 분화된 세포 및 그것의 혼합물에 따라 변화되는 것이 바람직하다. 일단 어떤 조건이 적용된 후에는 그 조건은 이어서 비슷한 혼합물의 처리에도 사용될 수 있다. 본 발명에서 분화를 위한 그러한 조건은 생체 안에서 혹은 생체 밖에서 사용될 수 있다. 생체 안에서 사용할 경우 신체에 이식된 부분 내에서 공급되는 조건이 그대로 사용된다. 본 발명에서 줄기세포와 분화된 세포는 혼합된 후 즉시 생체 내부의 환경으로 이식되거나 혹은 생체 외부에서 같이 배양된다. 자가 조직(autologous) 이식은 생체 밖 이식이라고 한다.

본 명세서에서 사용된 "생체 안에서"라는 용어는 유기체 내부를 의미한다. 특정 문맥에서 "생체 안에서"는 본 명세서에서 사용된 '목적 분화 부위'와 같이 대상 조직 혹은 기관이 위치한 곳을 의미한다.

본 명세서에서 사용된 "생체 밖에서"라는 용어는 유전인자가 도입되는 목적 세포가 대상으로부터 채취되는 일련의 오퍼레이션(operation); 치료상의 유전인자가 시험관 내에서 세포 안으로 도입되는 것; 및 세포가 동일한 개체 안으로 되돌아가는 것을 의미한다.

분화를 위한 조건의 예는 다음에서 독립적으로 선택될 수 있다: pH 5∼10, 20℃∼45℃(예를 들어 37℃), 80% 혹은 그 이상의 습도(예를 들어 100%), M199 배지 사용, 5㎎/500㎖의 헤파린 보충, 2㎍/500㎖의 산성 FGF의 보충, FBS(15%)의 보충, NaHCO₃의 보충, 10∼30%의 산소 농도(예를 들어 20%), 2∼10%의 이산화탄소 농도(예를 들어 5%), 젤라틴으로 코팅된 세균배양용 접시, 사육용(feeder) 세포의 존재 등에서 5시간 혹은 그 이상 동안 배양. 예를 들어 분화 조건은 2.2ｇ의 NaHCO₃, FBS(15%), 2㎍의 산성 FGF, 5㎎의 헤파린이 보충된 500㎖의 M199 배지에서, 37℃, 20% 농도의 산소, 5% 농도의 이산화탄소, 100%의 습도에서 5시간 배양되고 젤라틴으로 코팅된 세균배양용 접시에서 배양되는 것이 있으나 본 발명은 여기에 한정되는 것은 아니다.

상기 조건은 지방세포와 같은 분화된 세포와 지방-유래 전구세포를 유지하기 위해 사용되나 본 발명은 여기에 한정되는 것은 아니다.

지방-유래 전구세포를 분화시키기 위해 세포의 분화를 유도하는 분화 유도제를 포함하는 배지가 배양하는 동안 사용된다. 예를 들어 그러한 배지는 10% FBS, 0.5 mM 이소부틸메틸크산틴(IBMX), 1μM 덱사메타손, 10 μM 인슐린, 200μM 인도메타신으로 보충된 DMEM이며 여기에 한정되는 것은 아니다. 그리고 그 배지는 37℃, 20% 농도의 산소, 5% 농도의 이산화탄소, 100%의 습도에서 사용된다.

본 명세서에서 사용된 "분화된 세포로 분화를 유도하는 분화 유도제" 혹은 "분화 유도 분화 유도제"라는 용어는 화학물질과 온도 등과 같이 분화된 세포로 분화를 유도하는 것으로 알려진 모든 분화 유도제를 의미한다. 그러한 분화 유도제의 예로 온도, 습도 ,pH, 염분 농도, 영양분, 메탈, 가스, 유기 용매, 압력, 스테로이드와 항체 등과 같은 화학물질 등 혹은 그것의 조합과 같은 다양한 환경 분화 유도제가 있으나 여기에 한정되는 것은 아니다. 그러한 분화 유도제의 대표적인 예로 5-아자사이티딘(5-azacytidine) 등과 같은 DNA 탈메틸화제, 트리코스타틴(trichostatin) 등과 같은 히스톤 탈아세틸레이트제(histone deacetylating agents), 레티논산(ATRA), 비타민 D3, T3 등과 같은 핵 내부의 수용체 리간드, 악티빈(activin), IGF-1, FGF, PDGF, TGF-β, BMF2/4 등과 같은 성장인자(growth factor), LIF, IL-2, IL-6와 같은 사이토카인, 헥사메틸렌비스아세트아마이드(HMBA), 다이메틸아세트아마이드(DMA), 디부틸 cAMP(dbcAMP), 디메틸술폭사이드(DMSO), 요도데옥시유리딘(IdU), 하이록시우레아(hyroxyurea(HU)), 사이토신 아라비노사이드(cytosine arabinoside(AraC)), 마이토마이신 C(mitomycin C(MMC)), 부티르산 나트륨(sodium butyrate(NaBu)), 아피디콜린(aphidicholine), 플루오로데옥시유리딘(fluorodeoxyuridine), 폴리브렌(polybrene) 및 셀레늄 등이 있으나 여기에 한정되는 것은 아니다. 그러나 분화된 세포는 전형적으로 분화를 유도하는 분화 유도제로 사용되지 않았다. 이것은 분화된 세포가 분화를 억제하는 물질을 방출하기 때문이다.

본 발명에 따라 이식 혹은 재생을 위해 사용되는 세포, 조직, 기관 등과 관련하여 본 명세서에서 사용된 "목적 분화 부위에 상응하여"라는 용어는 예를 들어 심장-유래 세포 등과 같이 세포 등이 목적 분화 부위에서 채취되는 것 및 세포 등이 예를 들어 심장 세포 등으로 분화하는 세포와 같이 목적 분화 부위에 존재하는 세포와 실질적으로 같은 특성을 가지는 것을 가리킨다. 그러므로 세포 표면 마커(marker)와 같이 세포가 목적 분화 부위의 세포와 실질적으로 같은 특성을 가지는 한 세포는 목적 분화 부위에 상응하는 것으로 확고히 된다.

그러한 목적 분화 부위에 상응하는 세포인지를 결정하기 위한 유용한 마커의 예로 (1) 지방: 세포질 내에 트리글리세라이드(triglycerides)의 존재, OilRedO 염색, 글리세로포르페이트디하이드로지네이즈(Glycerophosphate dehydrogenase = GPDH)의 활성, 세포질 내의 GLUT4, Ap2(fatty acid binding 단백질), LPL(lipoprotein lipase), PPARγ1,2(peroxisome growth activating receptor γ1,2), 렙틴(leptin)의 발현; (2) 골세포, 뼈 조직: 알칼리포스파테이즈(alkaliphosphatase), 뼈의 석회화 정도 확인(precipitation of calcium), 오스테오칼신(osteocalcin), 오스테오판틴(osteopontin) 및 오스테오넥틴(osteonectin)의 발현; (3) 연골세포, 연골 조직: 무코폴리사카라이드(mucopolysaccharides)의 존재, type Ⅱ 콜라겐의 발현/존재, 콘드로이틴-4-설페이트(chondroitin-4-sulfate); (4) 골격근세포: 세포질 내에 많은 미오신의 존재 등이 있으나 여기에 한정되는 것은 아니다.

본 명세서에서 사용된 "이식"이라는 용어는 본 발명의 세포, 혼합물, 약제 등을 단일하게 혹은 다른 치료 약물과 조합하여 신체 내부로 투입하는 것을 의미한다. 본 발명에서 다음의 방법, 형태 및 양이 뼈 등과 같은 치료 부분으로 도입되기 위하여 사용된다: 본 발명의 약제는 손상된 부분으로 직접적으로 주사되고 부착되고 꿰매지고 끼워 넣어진다. 본 발명의 지방-유래 전구세포와 분화된 세포는 예를 들어 혼합물로서 단독적으로 그러나 동시에 혼합되거나 혹은 순차적으로 혼합될 수 있다. 이것은 분화를 유도하는 분화 유도제 등과 같은 조합된 분화 유도제가 치료 혼합물로서 함께 투입되는 것과 같은 프리젠테이션과 조합된 분화 유도제가 단독적으로 그러나 동시에 투입되는 과정을 포함한다. 또한 "조합하여" 투여하는 것은 성분 중하나를 단독적으로 투입하는 것 혹은 처음으로 주어진 분화 유도제를 먼저 투입한 후 두 번째 분화 유도제를 투입하는 것을 포함한다.

본 명세서에서 사용된 본체와 관련하는 "자가조직" 혹은 "자기"라는 용어는 동일한 본체의 세포, 조직, 기관 등과 같은 한 부분 혹은 전체를 의미한다. 본 명세서에서 사용된 "자가조직" 혹은 "자기"라는 용어는 넓은 의미에서 일란성 쌍생아와 같이 유전적으로 동일한 개체로부터의 조직을 포함한다.

본 명세서에서 사용된 "동종이계의(allogenic)"라는 용어는 같은 종이나 유전적으로 다른 개체로부터 조직 이식되어지는 개체의 세포, 조직, 기관 등과 같은 한 부분 혹은 전체를 의미한다. 동종이계의 개체는 유전적으로 상이하기 때문에 동종이계의 개체는 다른 개체가 이식된 수령인에서 면역 반응을 일으킬 수 있다. 예를 들어 그러한 세포에는 부모로부터 유래한 세포를 포함하며 여기에 한정되는 것은 아니다.

본 명세서에서 사용된 "이종 조직의(heterologous)"라는 용어는 다른 종의 개체에서 이식된 조직 혹은 세포와 같은 물질을 의미한다. 그러므로 예를 들어 사람이 수령인인 경우 돼지에서 유래된 조직을 이종 조직이라고 한다.

본 명세서에서 사용된 "수령인"은 이식 세포 등을 공급받는 개체를 의미하고 또한 "호스트"라고도 한다. 반대로 이식 세포 등을 공급해주는 개체를 "제공자(donor)"라고 한다. 제공자는 수령인과 같거나 다를 수 있다.

본 발명에서 사용된 세포는 자가조직에서 유래한 것이거나(syngeneic origin) 동종이계에서 유래한 것(non-self origin) 혹은 이종 조직에서 유래한 것일 수 있다. 거부 반응을 고려하면 자가조직이 바람직하다. 만약 거부 반응이 문제를 일으키지 않을 경우 동종이계의 세포도 사용될 수 있다.

본 명세서에서 사용된 " 분화된 세포의 기능부전과 관련한 병, 장애 혹은 비정상적 상태"라는 용어는 분화된 세포와 관련하는 모든 병, 장애 혹은 비정상적 상태를 의미한다. 그러한 분화된 세포에는 간엽 세포가 있으나 여기에 한정되는 것은 아니다.

하나의 실시태양에서 본 발명의 대상이 되는 병과 장애로는 적혈구 등과 같은 순환기계 장애이다. 질병과 장애의 예로 재생불량성 빈혈(특히 중증 재생불량성 빈혈), 신장부(renal) 빈혈, 암성(cancerous) 빈혈, 이차적 빈혈, 불응성(refractory) 빈혈 등과 같은 빈혈증, 백혈병과 같은 암 혹은 종양 그리고 이후 그것을 위한 화학요법, 조혈의 기능부전, 혈소판 감소증, 급성 골수 백혈병(특히 1차 경감(first remission)(고도의 위험 그룹),2차 경감 그리고 그 후), 급성 림프구 백혈병(특히 1차 경감, 2차 경감 그리고 그 후), 만성 골수 백혈병(특히 만성 기간, 전이 기간), 악성 임파종(lymphoma)(특히 1차 경감(고도의 위험 그룹), 2차 경감 그리고 그 후), 다발성 골수종(특히 발병 후 초기) 등, 심장 기능부전, 협심증, 심근경색증, 부정맥, 판막염, 심근/심막 질환, 심방중격결손증, 동맥관 개방(arterial canal patency), 팔로사징증 등과 같은 선천적 심장병, 동맥경화증, 동맥류와 같은 동맥 질환, 정맥류와 같은 정맥 질환, 림프수종과 같은 임파관 질환 등을 포함하나 여기에 한정되는 것은 아니다.

또다른 실시태양에서 본 발명의 대상이 되는 병과 장애로는 신경계 장애이다. 그러한 질병과 장애의 예로는 치매, 뇌졸중 그리고 그것의 후유증, 뇌종양, 척수 손상 등을 포함하나 여기에 한정되는 것은 아니다.

또다른 실시태양에서 본 발명의 대상이 되는 병과 장애로는 면역기계 장애이다. 그러한 질병과 장애의 예로는 T-세포 결핍증, 백혈병 등을 포함하나 여기에 한정되는 것은 아니다.

또다른 실시태양에서 본 발명의 대상이 되는 병과 장애로는 운동기관 및 골격계 장애이다. 그러한 질병과 장애의 예로는 골절, 골다공증, 관절의 탈구, 염좌, 삠, 인대 손상, 골관절염, 골육종, 유윙종양, 근위축, 골형성부전증, 골연골이형성증 등을 포함하나 여기에 한정되는 것은 아니다.

또다른 실시태양에서 본 발명의 대상이 되는 병과 장애로는 피부계 장애이다. 그러한 질병과 장애의 예로는 무모증, 흑색종, 진피 악성 임파종, 혈관육종, 조직구증식증, 수포증, 농포증, 피부염, 습진 등을 포함하나 여기에 한정되는 것은 아니다.

또다른 실시태양에서 본 발명의 대상이 되는 병과 장애로는 내분비계 장애이다. 그러한 질병과 장애의 예로는 시상하부/뇌하수체 질환, 갑상선 질환, 부갑상선 질환, 부신 피질/수질 질환, 당대사이상증, 지질대사이상증, 단백질대사이상증, 핵산대사이상증, 선천적대사이상증(페닐케톤뇨증, 갈락토오스 혈증, 호모시스틴요증, 단풍당뇨증), 무알부민혈증, 아스코르빈산 합성력의 결핍, 고빌리루빈혈증, 고빌리루빈요증, 칼리크레인 결핍증, 비만세포 결핍증, 요붕증, 바소프레신 분비이상증, 왜소 발육증, Wolman's 질환(산성 리파아제 결핍증), 무코다당 Ⅵ 등을 포함하나 여기에 한정되는 것은 아니다.

또다른 실시태양에서 본 발명의 대상이 되는 병과 장애로는 호흡기계 장애이다. 그러한 질병과 장애의 예로는 폐렴, 폐암 등과 같은 폐질환, 기관지 질환 등을 포함하나 여기에 한정되는 것은 아니다.

또다른 실시태양에서 본 발명의 대상이 되는 병과 장애로는 소화기계 장애이다. 그러한 질병과 장애의 예로는 식도암 등과 같은 식도 질환, 위암, 십이지장암과 같은 위/십이지장 질환, 결장용종, 결장암, 직장암 등과 같은 소장/대장 질환, 담관 질환, 간경변, 간염(A, B, C, D, E 등), 급성 간염, 만성 간염, 제 1기 간암, 알콜성 간장애, 약제유발성 간장애 등과 같은 간 질환, 급성 췌장염, 만성 췌장염, 췌장암, 낭포성췌장 질환 등과 같은 췌장 질환, 탈장 등과 같은 복막/복근 내벽/횡경막 질환, 히르시프룽병 등을 포함하나 여기에 한정되는 것은 아니다.

또다른 실시태양에서 본 발명의 대상이 되는 병과 장애로는 비뇨기계 장애이다. 그러한 질병과 장애의 예로는 신장 기능부전, 제 1기의 사구체 질환, 신혈관이상증, 세뇨관 기능부전, 간질성 신장질환, 전신성 질환으로 인한 신장이상증, 신장암 등과 같은 신장 질환, 방광염, 방광암 등과 같은 방광질환 등을 포함하나 여기에 한정되는 것은 아니다.

또다른 실시태양에서 본 발명의 대상이 되는 병과 장애로는 생식기계 장애이다. 그러한 질병과 장애의 예로는 남성 불임증, 전립선비대증, 전립선암, 고환암등과 같은 남성 생식기관 질환, 여성 불임증, 난소 기능부전, 자궁근종, 자궁선근증, 자궁암, 자궁내막증, 난소암, 융모 질환 등과 같은 여성 생식기관 질환 등을 포함하나 여기에 한정되는 것은 아니다.

본 명세서에서 사용된 "진단, 예방, 치료 혹은 예후를 위해 효과적인 양"이라는 용어는 진단, 예방, 치료 혹은 예후를 위해 치료학적으로 유효하다고 인정되는 양을 의미한다. 그러한 양은 다양한 변수를 고려하고 잘 알려진 기술을 사용하여 본 기술분야에 전문적인 사람에 의해 결정되어진다.

또다른 실시태양에서 본 발명은 성형 목적으로 치료 혹은 개선에 사용된다. 그러한 성형 목적은 건강한 상태를 위한 순수한 성형 목적 뿐 아니라 수술 후 혹은 외상 후의 변형 및 선천성 변형을 위한 성형 치료를 포함한다. 예를 들어 본 발명은 가슴 조직의 증가를 위한 기술(가슴확대), 움푹 팬 것을 메우기 위하여 볼 혹은 위와 아래 눈꺼풀의 증가를 위한 기술, 안면반측위축증 혹은 안면마비 후 조직의 퇴화 혹은 오목가슴을 보완하기 위한 조직의 증가 기술에 적용될 수 있으나 여기에 한정되는 것은 아니다. 더욱이 본 발명은 예를 들어 융비술, 축비술, 앞턱성형술(조직 증대), 메토페성형(조직 증대), 소이증과 같은 외이의 변형/기형을 위한 외이 연골정복술 등에 적용될 수 있으나 여기에 한정되는 것은 아니다.

본 발명이 약제로 사용될 경우 약제는 약학적으로 수용 가능한 담체를 더욱 포함한다. 본 기술분야에서 알려진 약학적으로 수용 가능한 모든 담체는 본 발명의 약제에 사용될 수 있다.

약학적으로 수용 가능한 담체 혹은 적합한 공식 물질에는 항산화제, 방부제, 착색제, 향료, 희석제, 유화제, 부유제, 용매, 충전제, bulky agent, 완충제, 부형제 및 보조제를 포함하나 여기에 한정되는 것은 아니다. 대표적으로 본 발명의 약제는 적어도 하나의 생리학적으로 수용 가능한 담체, 첨가제, 희석제와 함께 본 발명의 세포와 다른 활성 성분으로 구성된 혼합물의 형태로 투여된다. 예를 들어 적합한 부형제는 주사용액, 생리학적 용해제 혹은 인공 수액이 될 수 있으며 또한 비경구 투여를 위한 혼합물에 통상적으로 사용되는 다른 물질이 보충될 수 있다.

본 명세서에서 사용된 수용 가능한 담체, 첨가제 및 안정제는 수령인에게 무독성이고 사용된 농도와 투약량에서 비활성이며 인산, 구연산 및 다른 유기산; 아스코르빈산, α-토코페롤; 작은 분자량의 폴리펩타이드; 알부민 세럼, 젤라틴 및 면역 글로불린 항체와 같은 단백질; 폴리비닐파이롤리돈(polyvinylpyrrolidone)과 같은 친수성 폴리머; 글라이신, 글루타민, 아스파라긴, 아르기닌 및 라이신과 같은 아미노산; 단당류, 이당류 및 포도당, 만노오스, 덱스트린과 같은 다른 탄수화물; EDTA와 같은 킬레이트 시약; 만니톨 혹은 소르비톨과 같은 당알코올; 나트륨과 같은 염을 형성하는 반대이온; 및/혹은 Tween, 플루로닉스(pluronics) 혹은 폴리에틸렌 글리콜(PEG)과 같은 비이온계면활성제를 포함하는 것이 바람직하다.

적합한 담체의 예로는 중성으로 완충된 생리식염수 및 알부민 세럼으로 혼합된 생리식염수를 포함한다. 약제는 자당과 같은 적합한 첨가제를 사용하여 친액성화제로 형성되는 것이 바람직하다. 다른 공식 담체, 희석제 및 첨가제는 필요에 따라 포함된다. 다른 혼합물의 예는 약 pH 7.0∼8.5의 Tris 버퍼 혹은 약 pH 4.0∼5.5의 아세테이트 버퍼를 포함하며 여기에 소르비톨 혹은 적합한 그것의 치환제가 더욱 포함될 수 있다.

본 발명의 약제 혼합물의 제조를 위한 일반적인 기술이 아래에 설명된다. 동물성 약 혼합물, 준-약(quasi-drug) 혼합물, 해상 약 혼합물, 식품 혼합물, 미용 혼합물 등이 알려진 기술에 의해 생산될 수 있다.

본 발명의 세포 등은 약학적으로 수용 가능한 담체와 선택적으로 혼합될 수 있으며 주사, 현탁액, 용액, 스프레이액 등과 같은 액체 조성물질로서 비경구로 투여될 수 있다. 약학적으로 수용 가능한 담체의 예로 첨가제, 윤활제, 바인더, 분해제, 분해 저해제, 흡수 촉진제, 흡착제, 보습제, 용매, 용해제, 부형제, 등장화제, 버퍼, 진정제 등을 포함한다. 방부제, 항산화제, 착색제, 감미료와 같은 조성을 위한 첨가제는 선택적으로 사용될 수 있다. 본 발명의 혼합물은 본 발명의 폴리뉴클레오타이드, 폴리펩타이드 등과는 다른 물질과 함께 혼합될 수 있다. 비경구 투여의 예로는 정맥주사, 근육주사, 피하주사, 피내주사, 점막내주사, 직장내주사, 질내주사, 일반적으로 경피적인 주사 경로 등을 포함하나 여기에 한정되는 것은 아니다. 전신으로 투여되었을 경우 본 발명의 실용적 약제는 발열물질이 없고 약학적으로 수용 가능한 수성 용액의 형태를 가진다. 그러한 약학적으로 수용 가능한 혼합물의 제조는 마땅히 pH, 등장성, 안정성 등을 고려하여 본 기술분야의 기술에 의해 수행된다.

액체 조성물의 용매로 바람직한 예는 주사용액, 알코올, 프로필렌글리콜, 마크로골(macrogol), 참깨(sesame) 오일, 옥수수 기름 등을 포함한다.

액체 조성물의 안정화제로 바람직한 예는 폴리에틸렌글리콜, 프로필렌글리콜, D-만니톨, 벤질 벤조에이트, 에탄올, 트리스아미노메탄, 콜레스테롤, 트리에탄올아민, 탄산나트륨, 시트르산나트륨 등을 포함하나 여기에 한정되는 것은 아니다.

액체 조성물의 부유제로 바람직한 예는 스테아릴트리에탄올아민(stearyltriethanolamine), 라우릴인산나트륨, 라우릴 아미노 프로피온산, 레시틴, 염화벤잘코늄, 염화벤즈토늄(benzethonuim chloride), 글리세린 모노스테아르산 등과 같은 계면활성제, 폴리비닐 알코올, 폴리비닐파이롤리돈, 카르복시메틸셀룰로즈 나트륨, 메틸셀룰로즈, 하이드록시메틸셀룰로즈, 하이드록시에틸셀룰로즈, 하이드록시프로필셀룰로즈 등과 같은 친수성 고분자 등을 포함한다.

액체 조성물의 등장화제로 바람직한 예는 염화나트륨, 글리세린, D-만니톨 등을 포함하나 여기에 한정되는 것은 아니다.

액체 조성물의 완충제로 바람직한 예는 인산, 아세트산, 탄산, 시트르산 등을 포함하나 여기에 한정되는 것은 아니다.

액체 조성물의 진정제로 바람직한 예는 벤질알콜, 염화벤잘코늄, 염산프로카인 등을 포함하나 여기에 한정되는 것은 아니다.

액체 조성물의 방부제로 바람직한 예는 파라하이드록시벤조 에스테르, 클로로부탄올, 벤질알코올, 2-페닐에틸알코올, 디하이드로아세트산, 소르브산 등을 포함하나 여기에 한정되는 것은 아니다.

액체 조성물의 항산화제로 바람직한 예는 아황산, 아스코르빈산, α-토코페롤, 시스테인 등을 포함하나 여기에 한정되는 것은 아니다.

액체 물질과 부유물은 주사제로 제조될 경우 멸균되고 혈액 혹은 다른 목적에서 주사하는 부위의 배지와 등장액이 된다. 전형적으로 이러한 작용제는 박테리아-보유 필터 등을 이용하여 여과, 살균제와 혼합 혹은 광선(irradiation) 등에 의해 무균으로 생성된다. 이러한 처리를 거친 후 이러한 작용제는 동결건조 등에 의해 고형화 된다. 사용하기 직전에 정제수 혹은 수성 리도카인염화수소, 생리식염수, 수성 포도당 용액, 에탄올 혹은 그것의 혼합물 등과 같은 멸균된 주사 희석액이 첨가된다.

본 발명의 약제 혼합물은 착색제, 보존제, 방향물질, 향미료, 감미료, 혹은 다른 약물을 더욱 포함한다.

본 발명의 치료 방법에서 사용된 혼합물의 양은 사용목적, 대상질환(유형, 심각성 등), 환자의 나이, 몸무게, 성별, 병력, 세포의 형태와 종류 등을 참고하여 본 기술분야에 전문적인 사람에 의해 쉽게 결정될 수 있다. 개체(혹은 환자)에 적용되는 본 발명의 치료 방법에 있어 투여횟수 또한 사용목적, 대상질환(유형, 심각성 등), 환자의 나이, 몸무게, 성별, 병력, 치료 경과 등을 고려하여 본 기술분야에 전문적인 사람에 의해 결정될 수 있다. 투여횟수의 예로 하루 한 번에서 예를 들어 일주일에 한 번에서 한 달에 한 번과 같이 달에 몇 번이 될 수 있다. 경과에 따라 일주일에 한 번 내지는 한 달에 한 번 투여되는 것이 바람직하다. 복용양은 치료하고자 하는 부위에 필요한 양을 추정하여 결정된다.

본 명세서에서 사용된 "사용설명서"라는 용어는 투여하거나 투여 받는 사람을 위한 본 발명의 약물을 투여하는 방법, 진단 방법 등과 진단하거나 진단 받는 사람(예를 들어 의사, 환자 등)을 위한 약물 등을 설명하는 것이다. 사용설명서는 본 발명의 진단법, 약물 등을 적절하게 적용하는 방법을 기술한다. 사용설명서는 본 발명이 실행되는 나라의 당국(일본의 후생노동성, 미국의 식약청(FDA) 등)에 의해 정의된 체제에 따라서 제작되며 사용설명서가 당국에 의해 승인되었음을 명백히 기술한다. 사용설명서는 소위 포장지에 삽입될 수 있고 전형적으로 지면으로 제공될 수 있다. 사용설명서는 제한적이지 않고 예를 들어 인터넷 상으로 공급되는 웹사이트, 전자 메일 등과 같이 전자 매체의 형태로 제공될 수 있다.

본 발명의 방법에 따라 치료의 종료 판단은 통상적으로 이용 가능한 분석검사 및 기구를 이용한 표준 임상 실험 테스트의 결과, 질병(예를 들어 뼈 질환, 심장 질환, 신경 질환 등)에 따른 의도된 치료에 상응하는 임상적 증상의 소멸 혹은 외관의 회복 등과 같은 미용상의 회복에 의해 결정된다. 치료는 신경 질환 등과 같은 분화된 세포 등의 부족 혹은 미용상의 손상과 관련한 질병의 재발로 인해 재개될 수 있다.

본 발명은 또한 하나 이상의 약학적 혼합물로 채워진 용기를 하나 이상 포함하는 약학적 포장 혹은 키트(kit)를 제공한다. 제품을 단속하는 정부기관에 의해 정의된 형태의 고지, 약학적 제품 및 생물학적 제품의 이용 및 판매는 그러한 용기에 독단적으로 붙여질 수 있으며 사람에게 투여하는 것과 연관하여 제품, 이용 및 판매에 관련한 정부기관의 승인을 기술한다. 키트는 주사기구를 포함할 수 있다.

독성 연구는 쥐, 토끼, 비설치류와 같은 다양한 동물 모델을 이용하여 수행된다. 이러한 동물 모델에서 혈액검사, 혈액의 생화학적 검사, 요검사, 안과 검사 등과 같은 정밀검사 뿐 아니라 체중, 먹이 양, 마시는 물의 양과 같은 일반적인 상태의 관찰도 수행된다. 다양한 검사가 본 기술분야에서 잘 알려져 있으며 다음을 포함하나 여기에 한정되는 것은 아니다:

혈액 검사: 적혈구 수, 백혈구 수, 혈소판 수, 헤모글로빈, 적혈구용적비(hematocrit), 혈액상(백혈구 종류별 비율), 다른 망상적혈구 수, 프로트롬빈 시간, 활성화된 부분 트롬보플라스틴 시간 등이 검사된다. 예를 들어 혈구 조성은 다음으로 측정된다:

(1) 작용제가 쥐에 투여된다(처리되지 않은 대조 쥐 또한 측정되어야 한다); (2) 혈액 샘플이 각 처리된 쥐 중 하나로부터 꼬리쪽 정맥을 통해 주기적으로 채취된다; (3) 상기 샘플은 적혈구 수와 백혈구 수, 혈구 조성, 다형핵 세포에 대한 임파계 세포의 비율을 측정하기 위해 분석된다. 각 투약 양생법(regimen)과 대조구의 결과는 독성의 존재 여부를 알려준다.

혈액의 생화학적 검사: 세럼(plasma) 단백질, 알부민, A/C 비율, 단백질 분류, 포도당, 콜레스테롤, 트리글리세라이드, 빌리루빈, 유레아 나이트로젠, 크레아티닌, 트랜스아미네이즈(ASAT(GOT), ALAT(GPT)), 알칼리 포스페이트, 전해질(나트륨, 칼륨, 염화물, 칼슘, 무기 인 등)을 측정.

요검사: 오줌 양, pH, 단백질, 탄수화물, 케톤체(ketone body), 빌리루빈, 숨은(occult) 혁액, 침사(sediment), 비중 혹은 삼투압, 전해질(나트륨, 칼륨 등)의 측정.

안과 검사: 그로스(Gross)와 검안경이 눈의 정면, 시각 매체(optic media) 및 안저(fundus oculi)를 분석하기 위해 사용된다.

각 독성 검사를 마친 후 동물을 희생시켜 다른 검사가 더욱 실행된다.(American Veterinary Medical Association guidelines Report of the American Veterinary Medical Assoc. Panel on Euthanasia, (1993) J. Am. Vet. Med. Assoc. 202: 229∼249에 따라서) 그러므로 각 치료 그룹으로부터 대표하는 동물은 변화, 비정상적 질환 혹은 독성의 직접적인 증거를 위해 전체적인 몸체의 관점에서 검사된다. 조직의 전체적인 이상이 기술되고 조직은 조직학적으로 검사된다. 체중과 혈액 조성에 있어 감소를 유발하는 합성물은 목적 기관에 반대 작용을 가지는 약제이므로 부적합하다. 일반적으로 반대 작용이 클수록 그 약제는 덜 바람직하다.

본 발명에 따라 생성된 세포는 밀도 1.8×107 cells/dish의 60㎜-dish에 종배양되었다. 유도는 두 그룹으로 행해졌다. 한 그룹은 10일간의 배양 후 "배양"이라고 언급된 본래의 배양액을 각각의 분화 유도 배양액(지방세포 분화, 연골세포 분화 및 골세포 분화 배양액)으로 대치되었다. 다른 한 그룹은 "시드"라고 언급된 유도를 시작하기 전에 배양을 하지 않은 것이다. 유도 후 지방세포는 Oil-RedO로, 연골세포는 Alcian blue로, 골세포는 von Kossa로 염색하여 평가하였다.

본 발명의 이러한 이점과 다른 이점은 그것의 세부적인 설명과 도면으로 분명해질 것이다.

발명을 실행하기 위한 최선의 방식

이하 본 발명은 상세히 설명된다. 본 명세서에서 단수 형태의 관사(예를 들어 "a", "an", "the" 등 in English)는 문맥에서 분명히 다르게 지시하지 않는 한 복수의 인용문도 포함한다. 본 명세서에서 사용된 용어는 다르게 언급하지 않는 한 본 기술분야에서 전형적으로 사용되는 정의와 같다. "하나", "하나 혹은 그 이상", "적어도 하나"는 본 명세서에서 교대로 사용될 수 있다. "구성하는", "포함하는" 및 "가지는"이라는 용어 또한 교대로 사용될 수 있다. 게다가 "로 구성된 그룹에서 선택되어진" 물질은 뒤를 잇는 목록 중 한가지 혹은 그 이상의 물질 혹은 두 개 이상의 물질의 혼합물(혼합물)을 포함함을 의미한다. 본 명세서에서 사용된 용어는 다르게 언급하지 않는 한 본 기술분야에서 통상적으로 사용되는 정의와 같다. 그러므로 본 명세서에서 사용된 모든 기술적이고 과학적인 용어는 본 기술분야에 전문적인 사람에 의해 통상적으로 이해될 수 있는 의미와 같다. 다른 경우 정의를 포함한 본 신청서가 우선된다.

(바람직한 실시태양의 설명)

이후 바람직한 본 발명의 실시태양이 설명된다. 다음의 실시태양은 본 발명의 이해를 돕기 위해 제공되며 본 발명의 범위는 다음의 설명에 제한되는 것은 아니다. 변화와 변형은 본 명세서와 관련하여 본 발명의 범위로부터 벗어나지 않고 이루어짐을 본 기술분야에 전문적인 사람에 의해 명확히 고려되어 진다.

(지방흡입에 의한 흡인물(aspirate)로부터 줄기세포를 생성하는 방법)

본 발명은 지방흡입에 의한 흡인물(aspirate)로부터 줄기세포를 생성하는 방법을 제공하며 이는 A) 지방흡입에 의한 흡인물(aspirate)을 획득하는 단계; B) 세포 단편을 얻기 위해 지방흡입에 의한 흡인물(aspirate)을 원심분리에 적용시키는 단계; C) 밀도 구배 원심분리와 같이 세포 단편을 비중에 따른 세포 분리에 적용시키는 단계 및 D) 적혈구보다 낮은 비중을 가지는 세포층을 수집하는 단계로 구성된다. 본 발명의 지방흡입에 의한 흡인물(aspirate)은 지방흡입동안 지방과 함께 흡인된 체액과(예를 들어 튜메센트(Tumescent) 체액과 혈액을 포함하나 이것에 한정되는 것은 아니다) 흡인된 지방을 유액으로 워싱하면서 생성된 웨이스트 리퀴드(waste liquid)를 포함하나 이 것에 한정되는 것은 아니다.

지방-유래 전구세포는 다음(WO00/53795; WO03/022988; WO01/62901; Zuk, P.A., et al., Tissue Engineering, Vol. 7, 211-228, 2001; Zuk, P.A., et al., Molecular Biology of the Cell Vol. 13, 4279∼4295, 2002)과 같이 혹은 그것을 변형하여 지방흡입에 의한 흡인물(aspirate)의 지방 부분으로부터 분리된다. 특히 예를 들어 (1) 흡입된 지방은 1ℓ 분별 깔때기를 사용하여 생리식염수로 잘 세척한다; (2) 아래층의 생리식염수로부터 위층의 흡입된 지방이 충분히 분리되도록 하고 그 후 아래층은 버린다. 이 과정은 생리식염수가 육안으로 보았을 때 충분히 투명해질 때까지 반복된다; (3) 0.075% 콜라게네이즈/PBS를 흡입된 지방과 같은 양으로 첨가하고 잘 휘저으면서 37℃에서 30분 동안 배양한다; (4) 상기 설명한 샘플에 같은 양의 10% 세럼이 보충된 DMEM을 첨가한다; (5) 샘플을 1200×ｇ으로 10분 동안 원심분리시킨다; (6) 결과 펠렛을 0.16 M NH₄Cl/PBS로 부유시키고 실내온도에서 10분 동안 배양시킨다; (7) 샘플을 100㎛-diameter 망(mesh)을 사용하여 흡입 여과시킨다(suction filtration); 및 (8) 결과 여과액을 1200×ｇ으로 5분 동안 원심분리시킨다. 상기 설명한 프로토콜은 조성물의 양에 따라 본 기술분야에 전문적인 사람에 의해 규모가 확대되거나 축소될 수 있다.

반면 지방-유래 전구세포는 예를 들어 다음과 같이 지방흡입에 의한 흡인물의 액상으로부터 분리된다: (1) 지방흡입에 의한 흡인물의 액상을 준비한다; (2) 세포 분획을 얻기 위해 액상을 원심분리시킨다; (3) 세포 분획을 밀도 구배 원심분리시키고 세포를 비중에 따라 분리한다; 및 (4) 적혈구 층보다 낮은 비중을 지닌 세포층으로부터 세포를 수집한다. 흡인물의 액상은 생리식염수나 Ringer's 주사용액을 이용하여 생성된다. 원심분리는 약 800×ｇ 이하의 속도로 또는 약 400×ｇ 이상의 속도로 수행된다. 밀도 구배 원심분리는 약 370×ｇ에서 1,100×ｇ에 이르는 속도에서 수행된다. 밀도 구배 원심분리는 20℃에서 약 1.076에서 1.078ｇ/㎖의 비중을 가지는 배지를 사용하여 수행된다. 밀도 구배 원심분리에 사용되는 배지는 Ficoll^TM, Percoll^TM 혹은 자당이다. 수득된 세포층의 비중은 약 1.050에서 1.075에 이르는 범위에 속한다. 세포층은 피펫을 사용하여 수득된다.

지방을 흡입하는 방법은 본 기술분야에 전문적인 사람들에게 잘 알려진 기술을 사용하여 수행된다. 지방을 흡입하는 방법에 사용된 장치는 Keisei SAL PUMP(SAL 76-A, Keisei Ika-Kogyo, Hongo 3-19-6, Bunkyo, Tokyo, Japan)을 포함하나 여기에 한정되는 것은 아니다. 사람의 경우 0.0001% 아드레날린을 포함하는 생리식염수와 같은 액체는 흡입을 위해 지방 부피의 두 배에 해당하는 부피로 지방 조직으로 주입된다. 그러므로 내부 직경이 2∼3㎜인 캐뉼러(cannulae: 금속으로된 흡입관)가 약 -250∼-900㎜Hg의 음압으로 흡입을 위해 사용된다.

흡입된 지방세포를 세척하기 위해 사용되는 액체는 보통 생리식염수이다. 그러나 생리식염수가 아닌 액체도 줄기세포를 분리하는데 반대 작용이 없는 한 사용될 수 있다. 특히 예를 들어 Ringer's 용액, 포유동물 세포 배양액(예를 들어 DMEM, MEM, M199, MCDB153 등)과 같은 등장액이 본 발명에서 사용된다.

지방흡입에 의한 흡인물로부터 줄기세포를 제조할 때 선택적으로 지방흡입에 의한 흡인물을 콜라게네이즈와 같은 효소로 처리할 수 있다. 그러나 지방흡입에 의한 흡인물에 포함되는 콜라겐의 양은 지방조직에 비해 비교적 적다. 그리고 지방흡입에 의한 흡인물로부터 줄기세포를 제조할 때 요구되는 콜라게네이즈 처리 시간 및/혹은 처리 양은 지방조직에 비해 비교적 적다.

지방흡입에 의한 흡인물을 원심분리하여 세포 분획을 수득하는 단계에서 세포 분획과 다른 혼합물(예를 들어 수술, 마취, 지혈, 터진 지방세포로부터 지방을 삼출하는(exudate) 과정에서 들어온 플라즈마, 생리식염수)을 분리시키는 조건은 모두 사용될 수 있다. 예를 들어 400∼800×ｇ으로 약 5∼15분 동안 원심분리한다.

비중에 따라 세포를 분리하는 단계에서 예를 들어 분리된 세포 분획을 밀도 구배 원심분리시킨다. 밀도 구배 원심분리에 사용 가능한 배지는 모두 사용될 수 있다. 1.076∼1.078ｇ/㎖의 비중을 가지는 배지가 바람직하다. 또한 pH가 4.5에서 7.5인 배지가 바람직하다. 내독소(endotoxin)의 수치가 0.12EU/㎖ 이하인 배지가 바람직하다. 전형적인 배지는 자당, Ficoll(자당과 에피클로로하이드린(epichlorohydrin)의 혼성중합체(copolymer)), Percoll(폴리비닐 파이롤리돈의 필름을 가지는 아교질의(colloidal) 이산화규소(silica) 제품)을 포함한다. Ficoll은 예를 들어 Ficoll-Paque PLUS(Pharmacia Biotech Japan, Tokyo, Japan), Histopaque-1077(SIGMA-Aldrich Japan, Tokyo, Japan) 등과 같이 통상적으로 이용 가능하다. Percoll은 Percoll(SIGMA-Aldrich Japan, Tokyo, Japan)과 같이 통상적으로 이용 가능하다.

비중에 따라 원심분리하는 조건은 다음과 같다: 배지로 Ficoll-Paque PLUS를 사용하는 경우 400×ｇ으로 30∼40분 동안 원심분리하며, Histopaque-1077을 사용하는 경우 370cg로 약 30분 동안 원심분리한다. 배지로 Lymphoprep을 사용하는 경우 800×ｇ으로 약 20분 동안 및 1,100×ｇ으로 약 10분 동안 원심분리하나 여기에 한정되는 것은 아니다.

비중에 따라 원심분리하는 경우 대부분의 세포는 보통 적혈구이며 적혈구 층을 관찰함으로써 확인할 수 있다. 줄기세포는 적혈구 보다 낮은 비중을 가지며 따라서 줄기세포를 분리할 때 적혈구 보다 낮은 비중을 가지는 세포층이 채취된다. 1.050∼1.075 범위의 비중을 가지는 세포층이 바람직하다.

근사치의 비중을 가지는 세포들은 염화나트륨 용액 및 자당 용액에 Percoll, Readygrad과 같은 밀도 구배 원심분리 배지를 제조하고 덴시타이머 마커 비드(densitimer marker bead)와 함께 수득된 세포를 원심분리시키고 5개 내지 10개로 분리된 층 사이에서 세포를 포함한 층이 어느 것인지를 확인하여 분석된다.

또한 여러 층으로 분리된 세포는 예를 들어 피펫을 이용하여 채취할 수 있다.

비중에 따라 원심분리할 때 혈액 조성물 분리 장치 ASTEC204, Amco와 같은 세포 분리기가 사용될 수 있다.

본 발명의 다른 관점에서 본 발명의 줄기세포를 제조하는 방법은 A) 지방흡입에 의한 물질을 수득하는 방법; 및 B) 지방조직을 분리하지 않고 세포 분획을 얻기 위해 지방흡입에 의한 물질을 원심분리시키는 방법을 포함한다. 방법은 줄기세포를 얻기 위해 세포 분획을 여과시키는 단계를 더욱 포함한다. 본 방법은 물질을 적어도 하나의 세포 분획이 물질로부터 분리되는 조건에 적용시키는 단계를 더욱 포함한다.

지방흡입에 의한 물질은 지방흡입을 수행하는 동안 얻어지는 모든 물질을 의미한다. 그러한 물질은 지방, 지방세포, 체액, 콜라겐과 같은 세포외부 간질 등을 포함한다. 본 발명에서 일반적으로 지방흡입에 의한 물질은 지방흡입에 의한 흡인물 뿐 아니라 많은 줄기세포 혹은 전구세포를 포함하고 있음이 밝혀졌다. 그러므로 일반적으로 지방흡입에 의한 물질은 줄기세포의 제조에 있어 좋은 지급원이 된다. 그러한 영향은 본 기술분야에서 예상하지 못했던 것이다.

지방 조직을 세포로부터 분리할 때 지방 조직이 세포로부터 분리되고 세포의 분리를 촉진하는 하는 조건은 모두 사용될 수 있다. 그러한 조건은 Wako(세포 분산을 위한 콜라게네이즈, 032-10534)로부터 이용 가능한 콜라게네이즈와 같은 콜라게네이즈를 첨가하여 세포외부 간질을 분해시키는 것을 포함하나 여기에 한정되는 것은 아니다. 그러한 콜라게네이즈는 PBS에 0.075%의 농도로 용해되고 37℃까지 용액을 데워 지방과 같은 부피로 첨가된다. 샘플을 37℃에서 80rpm으로 30분 동안 교반하기 위해 교반기가 사용된다.

본 발명에서 사용된 원심분리하는 단계에서 본 발명은 세포층을 채취하기 위해 상등액을 제거하는 단계를 더욱 포함한다.

본 방법은 남아있는 지방 덩어리를 제거하기 위해 B)단계에서 상등액을 제거하는 단계 혹은 B)단계로부터 물질을 여과하는 단계를 더욱 포함하는 것이 바람직하다. 이러한 목적을 위해 막힘을 유발하지 않는 한 모든 여과기가 사용될 수 있다.

본 방법은 줄기세포의 순도를 높이기 위해 적혈구를 제거하는 단계를 더욱 포함한다. 그러나 배양 접시에서 충분히 배양하고 세포 덩어리를 관에 통과시킴으로서 적혈구는 제거될 수 있으며 따라서 80% 이상의 줄기세포 혹은 90%의 줄기세포를 가지는 세포가 생성된다. 이것은 또한 놀라운 결과이며 종전의 본 기술분야에서 예상하지 못했던 것이다. 또한 적혈구를 분해하는 혼합물을 첨가하는 것을 포함하는 적혈구를 제거하는 단계에 의해 적혈구는 제거될 수 있다.

본 발명의 실시태양에서 본 발명은 ⅰ) 지방흡입으로부터 물질을 수득하는 방법; ⅱ) 가능한 지방조직을 분리하지 않고 지방 조직이 세포로부터 분리되는 조건에 물질을 적용시키는 방법; ⅲ) 물질을 원심분리시키는 방법; ⅳ) 물질에 적혈구를 분해시키는 성분을 첨가하여 교반하는 방법; ⅴ) 펠렛(pellet)을 얻기 위해 물질을 원심분리시키는 방법; 및 ⅵ) 펠렛으로부터 물질의 상등액(supernatant)을 흡인하는 방법으로 구성된 줄기세포를 제조하는 방법을 제공한다.

본 발명에서 사용된 지방흡입에 의한 물질은 보통 지방흡입에 의한 흡인물과 지방을 포함한다. 그리고 본 발명에 따라 처리되었을 때 물질은 흡인물에서 발견되는 양보다 훨씬 많은 줄기세포를 포함하는 것이 밝혀졌다.

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본 방법은 지방흡입에 의한 흡인물을 유지하는 것을 포함하는 조건에 물질을 적용시키는 단계를 더욱 포함하는 것이 바람직하다.

본 발명에서 사용된 지방흡입에 의한 물질은 지방흡입에 의한 흡인물과 지방을 더욱 포함하는 것이 바람직하다.

또다른 실시태양에서 상기 ⅲ) 단계의 원심분리는 400∼1200×ｇ으로 수행된다. 보통 400×ｇ 혹은 800×ｇ이 사용된다.

또다른 실시태양에서 상기 적혈구를 분해시키는 혼합물은 염화암모늄과 탄산칼륨을 포함한다.

또다른 실시태양에서 상기 염화암모늄은 100mM에서 200mM의 혼합물에 포함되나 약 155mM이 바람직하다. 또다른 실시태양에서 상기 탄산칼륨은 5mM에서 20mM의 혼합물에 포함되나 약 10mM이 바람직하다. 염화암모늄과 탄산칼륨 두 개를 유익하게 화합하여 사용되는 것이 바람직하다.

또다른 실시태양에서 상기 ⅴ) 단계의 원심분리는 400∼1200×ｇ으로 수행된다.

본 발명에 의해 수득된 펠렛은 많은 줄기세포 혹은 전구세포를 포함한다. 이러한 세포는 뼈, 연골, 지방 등과 같은 많은 분화된 세포로 분화할 수 있는 능력을 가진 것으로 알려져 있다.

본 발명에서 적혈구가 제거되는 것이 바람직하나 적혈구를 제거하지 않고 생성된 본 발명의 줄기세포가 충분한 분화를 보이고 분열능력을 가지는 이상 반드시 필요한 것은 아니다.

수득된 세포를 배양하기 위해 사용되는 배지는 예를 들어 DMEM, M199, MEM, HBSS, Ham's F12, BME, RPMI1640, MCDB104, MCDB153(KGM) 등을 포함할 수 있으나 여기에 한정되는 것은 아니다. DMEM과 M199 배지가 바람직하다.

수득된 세포는 외래(heterogenous)세포이며 CD13,CD29, CD44, CD49d, CD71, CD73, CD90, CD105, CD151을 발현하는 줄기세포를 포함하며 CD31과 CD34 둘 중 하나 혹은 둘 다를 발현하는 줄기세포를 더욱 포함한다.

본 발명의 한 면에서, 수득된 세포는 혈관내피세포, 신경세포, 평활근세포, 심근세포, 골격 근원세포, 연골세포, 골세포, 지방세포, 인대세포, 간질세포 등과 같은 다양한 세포를 얻기 위해 많은 조건 하에서 배양된다.

그러한 분화 조건은 본 기술분야에서 알려져 있고 수득된 세포를 DMEM배지에서 1.8×106의 세포 농도로 60㎜-배양접시에 종배양하는 것, 일 주에서 이 주 동안 배양하여 세포가 반융합(subconfluent)) 상태가 되도록 하고 이후 세포를 지방 분화를 유도하는 배지, 연골 분화를 유도하는 배지 혹은 뼈 분화를 유도하는 배지에 적용시켜 약 2∼4주 동안 계속해서 배양하는 것을 포함한다.

예시적인 지방형성 배지는 10% FBS이 첨가되고 0.5mM IBMX, 1μM 덱사메타손, 10μM 인슐린, 200μM 인도메타신, 1% ABAM을 포함한다.

예시적인 골형성 배지는 10% FBS와 5% 말 세럼이 첨가되고 1μM 덱사메타손, 50μM 아스코르베이트-2-포스페이트, 10mM β-글리세로포스페이트, 1% ABAM을 포함한다.

예시적인 연골형성 배지는 1% FBS이 첨가되고 6.25㎍/㎖ 인슐린, 6.25㎍/㎖ 트랜스페린, 10ng/㎖ TGF β1, 50nM 아스코르베이트-2-포스페이트, 1% ABAM을 포함한다. ABAM 항생-항진균성 용액은 Gibco(ABAM; cat. no. 600-5240)로부터 이용 가능하다.

분화 유도 후 지방조직은 Oil-RedO로, 연골조직은 Alcian blue로, 골조직은 von Kossa로 염색하여 평가한다.

또한 본 발명에서 다음의 방법이 혈관내피 전구세포를 수득된 세포 덩어리로부터 분리하여 얻기 위해 사용된다.

예를 들어 수득된 세포 덩어리는 혈관내피 세포를 배양하기 위한 배지를 사용하여 1% 젤라틴으로 코팅된 배양접시에서 약 4∼5일 동안 배양된다. 배양 후 세포 덩어리는 0.25% 트립신을 이용하여 분리되고 MACS(자기(magnetic) 세포 분리 시스템) 또는 FACS(유출 혈구계산(flow cytometry))를 이용하여 항체에 오직 반응하는 세포들을 분리시키는 anti-PECAM-1 비드(bead)에 반응시킨다. 분리된 세포는 혈관내피 세포를 배양하기 위한 배지를 사용하여 1% 젤라틴으로 코팅된 배양접시에서 배양된다. 섬유아세포 등으로 오염된 것을 제거하기 위하여 다른 세포보다 더 잘 분리되는 혈관내피 세포의 특성을 이용하여 0.25% 트립신을 약 30∼40 초 동안 세포에 반응시키고 오직 분리된 세포만 수득하여 다른 배양 접시에서 배양한다. 그리고 이것은 분화된 혈관 내피 전구세포의 분리를 가능하게 한다(예를 들어 다음을 참조하라. Hutley LJ, et al: Human adipose tissue endothelial cells promote preadipocyte proliferation. Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 2001 Nov;. 281(5):.E1037-44).

본 발명의 다른 면에서 본 발명은 A) 지방흡입으로부터 물질을 수득하기 위한 수단; B) 세포 분획을 얻기 위해 지방흡입에 의한 흡인물을 분리시키기 위한 수단; 및 C) 세포를 분리하기 위해 세포 분획을 밀도 구배 원심분리와 같이 비중에 따라 원심분리시키기 위한 수단으로 구성된 줄기세포 제조 시스템을 제공한다. 본 시스템은 줄기세포를 대량으로 자동화된 방식으로 간단히 제조할 수 있다.

다른 면에서 본 발명은 A) 지방흡입으로부터 물질을 수득하기 위한 수단; 및 B)지방조직을 분리하지 않고 세포 분획을 얻기 위해 지방흡입에 의한 흡인물을 원심분리시키기 위한 수단으로 구성된 줄기세포 제조 시스템을 제공한다.

또 다른 면에서 본 발명은 A) 지방흡입으로부터 물질을 수득하기 위한 수단; B) 지방조직을 분리하지 않고 최소한 하나의 세포 분획이 물질로부터 분리되는 조건에 물질을 적용시키기 위한 수단; C) 물질을 원심분리시키기 위한 수단; D) 물질에 적혈구를 분해시키는 성분을 첨가하여 교반하기 위한 수단; E) 펠렛(pellet)을 얻기 위해 물질을 원심분리시키기 위한 수단; 및 F) 펠렛으로부터 물질의 상등액(supernatant)을 흡인하기 위한 방법으로 구성된 줄기세포 제조 시스템을 제공한다.

지방흡입에 의한 흡인물을 수득하기 위한 수단은 신체에 진공을 이용하여 지방을 흡인하기 위한 수단을 포함한다. 예를 들어 그러한 수단은 지방 흡입술(수동 진공 주사기를 이용하는 지방 흡입술과 진공 흡인기 등)과 피부 절개에 의한 지방질 제거술을 포함하나 여기에 한정되는 것은 아니다.

세포 분획을 얻기 위한 지방흡입에 의한 흡인물을 분리하기 위한 수단과 세포 분리를 위한 세포 분획을 밀도 구배 원심분리와 같이 비중에 따라 분리시키기 위한 수단은 원심분리를 포함하나 여기에 한정되는 것은 아니다. 지방흡입에 의한 흡인물을 원심분리시켜 세포 분획을 수득하는 경우 조건은 200∼1200×ｇ로 30∼60분 동안 원심분리하는 것이 있고, 260∼900×ｇ로 3∼30분 동안 원심분리하는 것이 바람직하고, 400∼800×ｇ로 3∼15분 동안 원심분리하는 것이 더욱 바람직하며, 400×ｇ로 5∼10분 동안 원심분리하는 것이 가장 바람직하다. 밀도 구배에 따른 원심분리를 이용하여 비중에 따라 세포를 분리하기 위해 Ficoll을 사용하는 경우 조건은 200∼1200×ｇ로 10∼60분 동안 원심분리하는 것이 있고, 260∼900×ｇ로 10∼60분 동안 원심분리하는 것이 바람직하고, 400∼800×ｇ로 10∼40분 동안 원심분리하는 것이 더욱 바람직하며, 400×ｇ로 30∼40분 동안 원심분리하는 것이 가장 바람직하다. 또한 본 시스템은 선택적으로 관심 있는 특정 비중의 세포층을 수득하기 위한 수단을 포함한다. 수득된 세포층은 적혈구 보다 낮은 비중을 가지는 층이다. 그러한 수단은 수동 피펫, 수동 흡인기, 자동 피펫, 자동 흡인기 등을 포함하나 여기에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 줄기세포는 다양한 분화된 세포 및/혹은 전구세포를 수득하기 위해 사용된다. 특별한 처리 과정이 아래 설명된다.

(분화된 세포의 제조 방법)

한 면에서 본 발명은 줄기세포로부터 분화된 세포를 생성하기 위한 방법을 제공한다. 상기 줄기세포로부터 얻을 수 있는 분화된 세포는 최종 분화된 세포가 될 수 있을 뿐 아니라 전구세포 또한 될 수 있다.

지방흡입에 의한 흡인물에 기인한 줄기세포로부터 분화된 세포를 생성하기 위한 방법은 (1) 덱사메타손과 같은 분화 유도제를 배양액에 첨가하기 위한 방법; 및 (2) 줄기세포를 목적 분화 부위에 상응하는 분화된 세포와 함께 배양하기 위한 법을 포함한다.

(줄기세포를 분화시키기 위한 배양액으로의 분화 유도제 첨가 방법)

본 발명의 세포 혼합물은 목적 분화 부위에 상응하는 분화된 세포로 분화를 촉진하기 위한 작용제를 더욱 포함한다. 상기 작용제는 목적 분화 부위에 상응하는 분화된 세포로 분화를 촉진하는 것으로 알려지거나 확인된 것은 모두 가능하다. 바람직한 분화 촉진제의 예로 덱사메타손 등과 같은 아드레노코티콜 스테로이드, 인슐린, 포도당, 인도메타신, 이소부틸-메틸크산틴(IBMX), 아르코르베이트-2-포스페이트, 아스코르빈산과 그 유도체, 글리세로포스페이트, 에스트로겐과 그 유도체, 프로게르테론과 그 유도체, 안드로겐과 그 유도체, αFGF, βFGF, EGF, IGF, TGF-β, ECGF, BMP, PDGF 등과 같은 성장인자(growth factor), 뇌하수체 분비물 추출물(pituitary gland extracts), 송과선 추출물(pineal body extracts), 레티논산, 비타민 D, 타이로이드 흐르몬, 우태아 혈청, 말 혈청, 인간 혈청, 헤파린, 중탄산소다, HEPES, 알부민, 트랜스페린(transferrin), 아셀레산나트륨 등과 같은 셀레네이트(selenates), 리놀레인산, 3-이소부틸-1-메틸크산틴, 5-아자사이티딘(5-azacytidine) 등과 같은 탈메틸화제, 트리코스타틴(trichostatin) 등과 같은 히스톤 탈아세틸레이트제(histone deacetylating agents), 악티빈(activin), LIF, IL-2, IL-6 등과 같은 사이토카인, 헥사메틸렌비스아세트아마이드(HMBA), 다이메틸아세트아마이드(DMA), 디부틸 cAMP(dbcAMP), 디메틸술폭사이드(DMSO), 요도데옥시유리딘(IdU), 하이록시우레아(hyroxyurea(HU)), 사이토신 아라비노사이드(cytosine arabinoside(AraC)), 마이토마이신 C(mitomycin C(MMC)), 부티르산 나트륨(sodium butyrate(NaBu)), 폴리브렌(polybrene) 및 셀레늄 등이 있으나 여기에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 세포 혼합물에 있어서 배양액은 혼합된 세포가 목적 분화 부위에 상응하는 분화된 세포로 분화되고 유지되도록 하는 배양액은 모두 사용될 수 있다. 그러한 배양액의 예로 DMEM, M199, MEM, HBSS(Hanks' Balanced salt solution), Ham's F12, BME, RPMI1640, MCDB104, MCDB153(KGM) 등이 있으나 여기에 한정되는 것은 아니다. 상기 배양액에 덱사메타손 등과 같은 아드레노코티콜 스테로이드, 인슐린, 포도당, 인도메타신, 이소부틸-메틸크산틴(IBMX), 아르코르베이트-2-포스페이트, 아스코르빈산과 그 유도체, 글리세로포스페이트, 에스트로겐과 그 유도체, 프로게르테론과 그 유도체, 안드로겐과 그 유도체, αFGF, βFGF, EGF, IGF, TGF-β, ECGF, BMP, PDGF 등과 같은 성장인자(growth factor), 뇌하수체 분비물 추출물(pituitary gland extracts), 송과선 추출물(pineal body extracts), 레티논산, 비타민 D, 타이로이드 흐르몬, 우태아 혈청, 말 혈청, 인간 혈청, 헤파린, 중탄산소다, HEPES, 알부민, 트랜스페린(transferrin), 아셀레산나트륨 등과 같은 셀레네이트(selenates), 리놀레인산, 3-이소부틸-1-메틸크산틴, 5-아자사이티딘(5-azacytidine) 등과 같은 탈메틸화제, 트리코스타틴(trichostatin) 등과 같은 히스톤 탈아세틸레이트제(histone deacetylating agents), 악티빈(activin), LIF, IL-2, IL-6 등과 같은 사이토카인, 헥사메틸렌비스아세트아마이드(HMBA), 다이메틸아세트아마이드(DMA), 디부틸 cAMP(dbcAMP), 디메틸술폭사이드(DMSO), 요도데옥시유리딘(IdU), 하이록시우레아(hyroxyurea(HU)), 사이토신 아라비노사이드(cytosine arabinoside(AraC)), 마이토마이신 C(mitomycin C(MMC)), 부티르산 나트륨(sodium butyrate(NaBu)), 폴리브렌(polybrene) 및 셀레늄 등이 단독으로 혹은 혼합되어 첨가될 수 있다.

지방흡입에 의한 흡인물로부터 유래한 줄기세포로부터 지방세포로의 분화 유도를 위한 조건에는 예를 들어 이소부틸-메틸 크산틴, 덱사메타손, 인슐린 및 인도메타신이 첨가된 DMEM배지에서 줄기세포를 배양하는 것이 있으나 여기에 한정되는 것은 아니다.

지방흡입에 의한 흡인물로부터 유래한 줄기세포로부터 연골세포로의 분화 유도를 위한 조건에는 예를 들어 인슐린, 아르코르베이트-2-포스페이트 및 TGF-β가 첨가된 DMEM배지에서 줄기세포를 배양하는 것이 있으나 여기에 한정되는 것은 아니다.

지방흡입에 의한 흡인물로부터 유래한 줄기세포로부터 골세포로의 분화 유도를 위한 조건에는 예를 들어 덱사메타손, 아스코르베이트-2-포스페이트 및 β-글리세로프스페이트가 첨가된 DMEM배지에서 줄기세포를 배양하는 것이 있으나 여기에 한정되는 것은 아니다.

지방흡입에 의한 흡인물로부터 유래한 줄기세포로부터 근세포로의 분화 유도를 위한 조건에는 예를 들어 덱사메타손과 하이드로코티손이 첨가된 10% 우태아 혈청(FBS) 및 5% 말 혈청(HS)이 첨가된 DMEM배지에서 줄기세포를 배양하는 것이 있으나 여기에 한정되는 것은 아니다.

(목적 분화 부위에 상응하는 분화된 세포와 줄기세포의 공동 배양에 의한 분화 유도)

목적 분화 부위에 상응하는 분화된 세포와 줄기세포를 공동으로 배양하는 것은 목적 특성을 가지는 특정한 양의 분화된 세포가 동질하게 생성되도록 한다. 본 방법은 A) a) 지방-유래 전구세포와 b) 목적 분화 부위에 상응하는 분화된 세포를 혼합하여 혼합물을 수득하는 방법; 및 B) 지방-유래 전구세포를 분화시키기에 충분한 조건 하에서 혼합물을 배양하는 방법으로 구성된다.

목적 분화 부위에 상응하는 분화된 세포는 본 기술분야에서 잘 알려진 기술을 이용하여 생성할 수 있다. 또는 예를 들어 ATCC 등으로부터 얻을 수 있는 세포 라인과 같이 통상적으로 이용 가능한 세포 라인으로부터 분화된 세포를 얻을 수 있다. 또한 예를 들어 간세포, 신장세포, 지방세포, 골세포, 연골세포 등과 같이 이식이 필요한 개체로부터 초기(primary) 배양된 세포로부터 분화된 세포를 얻을 수 있다. 초기 배양을 위한 혹은 세포 라인 배양을 위한 기술은 예를 들어 본 명세서에 참조로 붙여진 Hirochi Hatanaka & Akira Asano, eds., "AMBO Manuaru Saibo Kenkyuho [AMBO Manual of Cell Study Methods]", Takara; Toshio Watanabe, ed., "Baio Jikken Irasutoreiteddo (6) Sukusuku Sodate Saibo Baiyo [Illustrated Culture Experiments-Cells grow quickly]", Shujun sha (1996); 등에 설명된 바와 같이 본 기술분야에서 잘 알려져 있다.

본 발명에서 분화된 세포로 목적 분화 부위에 상응하는 세포는 모두 사용될 수 있으나 간엽세포가 바람직하며 지방세포, 골수세포, 골아세포, 연골세포, 섬유아세포, 근섬유아세포, 신경세포, 골격 근원세포, 심근세포, 혈관내피세포, 평활근세포, 간세포, 신장세포 및 췌장세포 등을 포함하나 여기에 한정되는 것은 아니다. 상기 분화된 세포는 확인된 세포이나 그러한 세포의 특성이 알려지지 않았더라도 그러한 세포들은 FACS와 같은 분리 기술을 이용하여 목적 분화 부위에 상응하는 세포를 생성하기 위해 사용될 수 있다.

목적 분화 부위에 상응하는 세포인지를 결정하기 위한 유용한 마커의 예로 (1) 지방: 세포질 내에 트리글리세라이드(triglycerides)의 존재, OilRedO 염색, 글리세로포르페이트디하이드로지네이즈(Glycerophosphate dehydrogenase = GPDH)의 활성, 세포질 내의 GLUT4, Ap2(fatty acid binding 단백질), LPL(lipoprotein lipase), PPARγ1,2(peroxisome growth activating receptor γ1,2), 렙틴(leptin)의 발현; (2) 골세포, 뼈 조직: 알칼리포스파테이즈(alkaliphosphatase), 뼈의 석회화 정도 확인(precipitation of calcium), 오스테오칼신(osteocalcin), 오스테오판틴(osteopontin) 및 오스테오넥틴(osteonectin)의 발현; (3) 연골세포, 연골 조직: 무코폴리사카라이드(mucopolysaccharides)의 존재, type Ⅱ 콜라겐의 발현/존재, 콘드로이틴-4-설페이트(chondroitin-4-sulfate); (4) 골격근세포: 세포질 내에 많은 미오신의 존재 등이 있으나 여기에 한정되는 것은 아니다.

따라서 다른 면에서 본 발명은 목적 분화 부위에 상응하는 분화된 세포와 지방흡입에 의한 흡인물에 기인한 줄기세포로 구성된 세포 혼합물을 제공한다. 상기 혼합물은 세포 이식에 유용하며 종전의 본 기술분야에서 사용된 단일 형태의 세포를 사용하는 것보다 요구되는 각 성분의 양이 적다는 점에서 더욱 유리하다. 또한 종전의 본 기술분야보다 우수한 추가적인 이점에는 예를 들어 (1) 반드시 생체 외부에서 조직을 재생할 필요 없다; (2) 보다 명확한 방식으로 더 큰 조직을 재생할 수 있다: (3) 방법을 간단한 방식으로 더 짧은 기간 내에 수행할 수 있다; (4) 반드시 피부와 같은 기관을 절개하고 수술할 필요는 없으며 오직 바늘을 사용해 이식 세포 및/혹은 조직을 투여할 수 있다는 점이 있다.

본 발명의 세포 혼합물은 줄기세포가 지방으로 분화되도록 유도하기에 충분한 조건의 혼합물이 바람직하나 본 발명은 여기에 한정되는 것은 아니다. 분화 유도 조건에 적용시킨 후 세포 혼합물은 직접으로 이식하기 위해 사용되거나 혹은 조직 또는 기관으로 분화된다.

(세포 이식 조성)

또 다른 면에서 본 발명은 예를 들어 조직 외식, 외식과 같은 것을 포함하는 화합물과 같은 세포 이식을 위한 조성을 제공한다. 이러한 이식은 목적 분화 부위에 상응하는 분화된 세포의 결핍이나 기능부전과 관련한 병, 장애 혹은 비정상적 상태의 치료 및 예방을 위해 사용되거나 또는 외관 상태를 치료하거나 개선하기 위해 사용되는 한 어떤 목적으로도 이용될 수 있다. 상기 이식은 목적 분화 부위로 이식하는 것을 의미하나 여기에 한정되는 것은 아니다. 또한 본 발명의 혼합물을 포함하는 세포는 상기 목적 분화 부위의 치료 및 예방이 결과적으로 가능한 경우 모든 목적 분화 부위에 투여되거나 이식될 수 있다.

지방흡입에 의한 흡인물에 기인한 줄기세포와 분화된 세포의 혼합비율은 목적 분화를 발생시키는 한 모든 비율이 가능하며 보통 약 1:10에서 10:1이 쓰이며, 약 1:5에서 5:1이 바람직하고, 약 1:2에서 2:1이 더욱 바람직하며, 각 세포의 부피가 대략 동일하게 존재하는 것이 가장 바람직하다. 본 발명의 세포 혼합물에서 이식을 위해 사용되는 지방흡입에 의한 흡인물에 기인한 줄기세포와 분화된 세포는 본 발명에서 앞서 설명된 "분화된 세포의 제조 방법" 부분에서 설명된 형태와 실시태양에 따른다.

분화된 세포와 지방-유래 전구세포 각각은 이식 받을 개체에 이종(heterologous), 동종이계(allogeneic) 혹은 동급체(isologous)이다. 동종이계이거나 동급체인 것이 바람직하며, 동급체인 것이 가장 바람직하나 본 발명은 여기에 한정되는 것은 아니다. 이는 이론에 속박되길 바라는 것은 아니나 면역 거부 반응을 억제할 수 있기 때문이다. 거부 반응이 예상된다면 본 발명은 거부 반응을 피할 수 있는 것을 더욱 포함한다. 거부 반응을 피할 수 있는 처리과정은 본 기술분야에서 알려져 있다(예를 들어 다음을 참조하시오. "Shin Gekagaku Taikei, Dai 12 Han, Zoki Ishoku (Shinzo Ishoku·Hai Ishoku Gijutsuteki, Rinriteki Seibi kara Jisshi ni Mukete [New Whole Surgery, Vol. 12, Organ Transplantation (Heart Transplantation·Lung Transplantation From Technical and Ethical Improvements th Practice)" (Revised 3rd ed.), Nakayama Shoten]). 상기 방법의 예로 면역억제제 혹은 스테로이드성 약물 등이 있으나 여기에 한정되는 것은 아니다. 예를 들어 현재 거부 반응을 방지하기 위한 면역억제제로 "사이클로스포린(cyclosporine)"(SANDIMMUNE/NEORAL); "타크로리무스(tacrolimus)"(PROGRAF); "아자치오프린(azathioprine)"(IMURAN); "스테로이드 호르몬"(prednine, methylprednine); 및 "T-세포 항체"(OKT3, ATG 등)가 있다. 많은 시설에서 방지적인 면역억제 치료술로 전 세계적으로 사용되는 방법은 세 종류의 약물(사이클로스포린, 아자치오프린 및 스테로이드 호르몬)을 동시에 사용하는 것이다. 면역억제제는 가능한 본 발명의 약학적 물질과 동시에 투여되나 본 발명이 여기에 한정되는 것은 아니다. 면역억제제는 면역억제 효과가 달성되는 한 본 발명의 재생/치료상의 방법 전에 또는 후에 투여될 수 있다.

분화된 세포와 지방-유래 전구세포 각각은 이종(heterologous), 동종이계(allogeneic) 혹은 동급체(isologous)이며, 동종이계이거나 동급체인 것이 바람직하고, 동급체인 것이 가장 바람직하다. 이는 이론에 속박되길 바라는 것은 아니나 분화된 세포와 지방-유래 전구세포가 동종이계이거나 동급체(autologous)인 경우(동급체인경우는 더욱) 동질한 세포덩어리를 형성하기 쉽기 때문이다.

지방-유래 세포 혼합물 혹은 합성물이 약제로 제공될 수 있다. 상기 약제는 목적 분화 부위에 상응하는 분화된 세포의 결핍이나 기능부전과 관련한 병, 장애 혹은 비정상적 상태의 치료 및 예방을 위해 사용되거나 또는 외관 상태를 치료하거나 개선하기 위해 사용된다. 본 발명의 약제는 세포 혼합물에 약학적으로 수용 가능한 담체를 포함하거나 같은 것을 포함하는 합성물을 포함한다. 그러한 담체로서 본 명세서에서 설명된 모든 담체는 목적에 따라 본 기술분야에 전문적인 사람에 의해 선택되고 사용될 수 있다. 본 기술분야에 전문적인 사람은 본 발명에 함유된 성분을 조정할 수 있다.

(세포 혼합물을 이용하는 치료 및 예방)

또 다른 면에서 본 발명은 목적 분화 부위에 상응하는 분화된 세포의 결핍이나 기능부전과 관련한 병, 장애 혹은 비정상적 상태의 치료 및 예방을 위한 방법 또는 외관 상태를 치료하거나 개선하기 위한 방법을 제공한다. 이러한 방법은 A) a) 지방-유래 전구세포와 b) 목적 분화 부위에 상응하는 분화된 세포를 포함하는 혼합물을 제공하는 단계; 및 B) 개체에 혼합물을 투여하는 단계로 구성된다. 본 방법에서 이식을 위해 사용되는 분화된 세포와 지방흡입에 의한 흡인물에 기인한 줄기세포는 본 발명에서 앞서 설명된 "분화된 세포의 제조 방법" 부분에서 설명된 형태와 실시태양에 따른다.

투여 방법은 본 발명에서 본 기술분야에서 알려진 방법을 포함한다. 예를 들어 혼합물은 주사기, 카테너(catheter), 관(tube) 등을 이용하여 주입되나 여기에 한정되는 것은 아니다. 투여 경로의 예로 국부 주사(피하주사, 기관내주사(예를 들어 근육, 지방 등)), 정맥주사, 동맥주사, 조직으로의 투여 등이 바람직하나 여기에 한정되는 것은 아니다. 이식에 의한 본 발명의 치료 및 예방 방법은 종래의 기술에 비해 다음의 이점 등을 가지나 여기에 한정되는 것은 아니다: (1) 반드시 생체 외부에서 조직을 재생할 필요 없다; (2) 보다 명확한 방식으로 더 큰 조직을 재생할 수 있다: (3) 더 간단히 빨리 재생될 수 있다; (4) 반드시 피부와 같은 기관을 절개하고 수술할 필요는 없으며 오직 바늘을 사용해 이식 세포 및/혹은 조직을 투여할 수 있다.

(이용)

또 다른 면에서 본 발명은 세포 이식을 위하여 목적 분화 부위에 상응하는 분화된 세포의 결핍이나 기능부전과 관련한 병, 장애 혹은 비정상적 상태의 치료 및 예방을 위한 또는 외관 상태의 치료 및 개선을 위한 a) 지방-유래 전구세포와 b) 목적 분화 부위에 상응하는 분화된 세포 혼합물의 이용을 제공한다. 이식을 위하여 세포 혼합물에서 사용된 분화된 세포와 지방-유래 전구세포는 본 명세서에서 "분화된 세포의 제조 방법" 부분에서 설명된 형태를 따른다.

도 1은 본 발명의 구체화에 따른 지방 흡입에 의한 흡인물(aspirate)의 액상으로부터 유래된 줄기세포의 예시도 이다.

도 2는 본 발명의 구체화에 따른 지방형성(adipogenic) DMEM 배지에서 줄기세포를 배양하여 생성된 분화된 세포의 예시도 이다.

도 3은 본 발명의 구체화에 따른 지방형성(adipogenic) DMEM 배지에서 줄기세포를 배양하여 OliRed-O로 염색한 분화된 세포의 예시도 이다.

도 4는 본 발명의 구체화에 따른 연골형성(chondrogenic) DMEM 배지에서 줄기세포를 배양하여 생성된 분화된 세포의 예시도 이다.

도 5는 본 발명의 구체화에 따른 연골형성(chondrogenic) DMEM 배지에서 줄기세포를 배양하여 Alcian blue로 염색한 분화된 세포의 예시도 이다.

도 6은 적혈구의 제거 없이 지방 흡입에 의한 물질로부터 생성된 줄기세포의 성장곡선이다.

도 7∼10은 적혈구의 제거 없이 지방흡입에 의한 물질로부터 DMEM 배지(도 7 = Round 1; Days 6, 8, 10, 12와 도 8 = Round 2; Days 3, 5, 7, 9) 및 M199 배지(도 9 = Round 1; Days 6, 8, 10, 12와 도 10 = Round 2; Days 3, 5, 7, 9)에서 생성된 줄기세포의 성장곡선의 예시도 이다.

도 11∼26은 다양한 배양조건에서의 예시도 이다. 다음의 표는 배양조건, 배양일, 규모, 유도(induction)/제어(control) 및 배양(culture)/시드(seed)가 나열되어있다. 오른쪽 마지막 열에서 "유도"는 세포들을 분화를 유도하기 위한 조건에 적용시키는 것을 의미하며 "제어"는 세포들을 분화를 유도시키지 않는 조건에 적용시키는 것을 의미한다. 다섯 번째 열에서 "배양"은 종배양 후 유도를 시작하기 전에 10일간 배양하는 조건을 의미하며 "시드"는 유도 전에 배양을 하지 않는 조건을 의미한다.

표: 도면 범례

도면번호	배양 일(인덕션)	배양 액	크기	배양/시드	제어/유도
11	12일	지방세포 분화	×10	배양	유도
12	12일	지방세포 분화	×20	배양	유도
13	12일	지방세포 분화	×10	배양	제어
14	12일	지방세포 분화	×20	배양	제어
15	33일	연골세포 분화	×10	배양	유도
16	35일	연골세포 분화	×10	배양	유도
17	33일	연골세포 분화	×10	배양	제어
18	35일	연골세포 분화	×10	배양	제어
19	22일	골세포 분화	×10	배양	유도
20	22일	골세포 분화	×10	배양	제어
21	25일	지방세포 분화	×20	시드	유도
22	25일	지방세포 분화	×10	시드	유도
23	25일	지방세포 분화	×20	시드	제어
24	25일	지방세포 분화	×10	시드	제어
25	22일	골세포 분화	×10	시드	유도
26	22일	골세포 분화	×10	시드	제어

이후 본 발명은 실시예를 통해 설명된다. 하기 실시예는 오직 예증의 목적으로 제공된다. 따라서 본 발명의 범위는 상기 설명된 실시태양이 또는 하기 실시예에 한정되는 것은 아니며 첨부된 청구항은 제외된다.

하기 실시예에 사용된 시약은 달리 기술되지 않는 한 Wako Pure Chemical Industries 혹은 Sigma에서 제조된 것이다. 동물들은 의학 연구를 위한 국제 협회에 의해 생성된 "실험 동물 보호 원칙(Principles of Laboratory Animal Care)"과 실험 동물 자원 협회와 국제 보건 협회에 의해 발행된 "실험 동물의 이용과 보호 가이드(Guide for the Care and Use of Laboratory Animals)"(NIH Publication No. 86∼23, 1985 revised)에 따르는 동물 보호 정신에 입각하여 보호된다. 실험 을 하기 전에 대상인 사람으로부터 고지에 입각한 동의를 얻는다.

(실시예 1 : 지방흡입에 의한 흡인물의 제조)

0.0001%의 아드레날린을 함유한 생리식염수인 튜메센트 용액의 초과량은 지방흡입술을 시행하기 전에 흡인될 양을 초과하여 피하 지방층으로 주입되었고(tumescent method) 그 후 내부 직경이 2∼3㎜인 캐뉼러(금속으로된 흡입관)가 지방흡입을 위해 사용되었다. 지방흡입술은 본 기술분야에서 잘 알려져 있으며 예를 들어 Biyo Seikei Shujutsu Practice 2(Cosmetic Operation Practice 2), ed. Masanari ICHIDA, Ryusaburo TANINO, and Yoshiaki HOSAKA, published by BUNKODO, pp. 429∼469에 언급되어 있고 본 원에 참조로 그대로 통합되어있다.

흡인된 지방은 생시식염수로 세척하였다. 세척된 흡인물은 약 5ℓ에서 10ℓ로 생성이 되며 풍부한 세포 물질을 함유하는 처음 1ℓ에서 2ℓ가 다음 과정을 위해 사용되었다.

(실시예 2 : 지방흡입에 의한 흡인물로부터 줄기세포 현탁액의 제조)

수득된 흡인물은 줄기세포 현탁액을 제조하기 위한 두 가지 방법 중 하나를 이용하여 다음과 같이 제조되었다. 다음의 두 방법은 콜라게네이즈와 같은 효소 를 처리하는 과정이 필요하지 않으며, 본 방법은 종래의 방법과 구별되고, 본 방법으로 제조된 지방조직으로부터의 줄기세포는 콜라게네이즈와 같은 효소의 오염이 없다.

(Ⅰ) 제조 방법 1

1) 지방흡입에 의한 흡인물의 액상(보통 약 2ℓ에서 4ℓ)을 400×ｇ로 10분 동안 원심분리시켰다.

2) 상등액은 버렸다. 침전된 세포는 떠오르기 쉬우므로 세포를 손상시키지 않도록 조심스럽게 흡인기를 사용하여 흡인하였다.

3) 모인 세포(대부분 적혈구)는 몇 개의 50-㎖ 폴리프로필렌 튜브로 옮기고 400×ｇ로 5분 동안 원심분리시켰다.

4) 상등액을 흡인하였다. 전체 부피가 15㎖에서 20㎖인 세포가 수득되었다. 여기에 대량의 세포간질이 함유되어 있다면 100㎛ 필터를 사용하여 여과시켰다. 그 후 필요한 경우 원심분리시켰다.

5) 50-㎖의 튜브에 Ficoll(registered trademark) 15㎖을 첨가했다. 그 후 15㎖에서 20㎖의 세포 용액을 그 위에 층을 형성하도록 아주 천천히 첨가했다.

6) 튜브를 18에서 20℃에서 400×ｇ로 30분 동안 원심분리시켰다.

7) 원심분리 후 세포 용액은 4개의 층으로 분리되었다: 위에서부터 A 층(세포가 없는 층, 투명); B 층(단핵 세포 층, 연한 빨간색); C 층(Ficoll 층, 투명); 및 D 층(적혈구 층, 짙은 빨간색). 줄기세포를 포함하는 유착(adhesion) 세포는 B 층과 C층에 함유되어있다. A 층은 흡입하여 버렸다. B 층과 C 층은(약 3㎖) 세포 현탁액이므로 수득하여 50-㎖ 튜브에 옮겼다.

8) 세럼이 보충된 PBS(10% FBS 또는 10% 인간 세럼이 보충된 PBS)를 수득된 세포 현탁액에 첨가하여 50㎖이 되게 했다. 혼합물을 피펫팅하여(pipetting) 섞은 후 400×ｇ로 5분 동안 원심분리시켰다.

9) 상등액은 흡인하여 버렸다. 세럼이 보충된 PBS를 다시 첨가하여 50㎖이 되도록 했다. 혼합물을 피펫팅하여 섞은 후 400×ｇ로 5분 동안 원심분리시켰다.

10) 상등액은 흡인하여 버렸다. 줄기세포를 포함하는 세포를 수득했다.

(Ⅱ) 제조 방법 2

1) 지방흡입에 의한 흡인물의 액상을 무균 작업대에서 흡입 튜브로 흡입하여 필터(pore size: 120㎛)가 있는 저장기로 보냈다. 결과 여과액은 차단된 분리 백(bag)에 넣었다.

2) 작은 비중의 혈소판과 큰 비중의 적혈구와 과립성 백혈구를 가능한 많이 제거시키기 위해 세포 분리기(혈액성분 분리 장치: AMCO, Inc., Tokyo, Japan의 ASTEC204)를 사용하여 세 번 원심분리시켰다.

3) 고농도의 줄기세포를 함유하는 분획을(약 30㎖에서 40㎖) 수득했다. 분리된 세포의 비중은 1.050에서 1.075의 범위 내에 있다.

세포의 비중은 다음과 같이 대략 결정될 수 있다. Percoll^TM, RediGrad^TM 등과 같은 밀도 구배 원심분리 배지는 염화나트륨 용액 또는 자당 용액에 형성된다. 수득된 세포와 밀도 표시 비드(bead)를 혼합물에 첨가하고 원심분리시킨다. 혼합물은 비드에 따라 5개에서 10개의 층으로 분리된다. 세포를 포함하는 층은 세포의 비중을 보인다.

도 1은 분리된 세포의 예시도이다.

(실시예 3: 수득된 줄기세포의 특성)

실시예 2에서 수득된 줄기세포는 FACS를 사용하는 다음의 과정에 의해 특징지어졌다.

약 5㎖의 세포 현탁액을 염색 배지(SM; 0.5% 우태아 혈청 알부민과 0.05% NaN₃가 보충된 PBS)로 두 번 세척했다. 필요한 경우 세포의 수를 계산했다.

라벨이 붙은 항체(라벨(label(s)): 피코에리트린(phycoerythrin(PE)), 알로피코사이아닌(allophycocyannin(APC)) 및/혹은 플루오레세인 이소치오사이아네이트(fluorescein isothiocyanate(FITC)))를 약 1에서 10×10⁶ cells/㎖의 세포 현탁액에 첨가하여 최종 농도가 0.001에서 0.1 ㎍/㎖이 되도록 했다.

혼합물을 얼음 위에서 30분 동안 배양하고 세포를 세척했다. 세포가 떠있는 용액의 농도는 SM을 이용하여 약 5×10⁵ cells/㎖로 조정했다.

FACS Vantage(Becton Dickinson)를 사용하였다. 항체의 라벨은 분리된 줄기세포의 각 CD 단백질의 발현을 분석하기 위한 마커로 사용되었다. 결과 지방흡 입에 의한 흡인물의 액상에서 기인한 줄기세포가 표 1에서 보여지는 바와 같이 CD90과 CD49d를 발현한다는 것이 밝혀졌다.

분리된 줄기세포는 DMEM에서 두 번 2차 배양하였다. 2차 배양은 80%의 컨플루언스(confluence)에서 수행하였다. 두 번째 2차 배양 후 세포를 상기 FACS를 이용하여 분석하였다. 결과는 표 1에 제시되어있다.

두 번의 2차 배양 후 줄기세포의 다양한 CDs 발현

CD	발현 정도
3	-
4	-
11c	-
13	++
14	-
15	-
16	-
19	-
29	++
31	+
33	-
34	+
36	++
38	-
44	+
45	+
49d	++
54	+
56	-
58	+
61	-
62E	-
62P	-
69	-
71	++
73	++
90	++
104	-
105	++
106	-
117	+
135	-
144	-
146	+
151	++
235a	-
SH3	+
STRO-1	+

"-" = 발현이 감지되지 않았음을,

+ 및 ++은 20%를 의미한다.

"+" = 20% 또는 그 이하의 세포에서 감지됨 및

"++" = 20% 또는 그 이상의 세포에서 감지됨.

상기 결과에 따라서, 지방흡입에 의한 흡인물의 액상에 기인하여 제조된 본 줄기세포는 간엽 줄기세포에 상응하는 세포 덩어리를 포함하나 본 줄기세포는 종래의 기술에 의해 제조된 지방-유래 줄기세포에서는 포함되지 않았던 CD31과 CD34를 발현하는 세포를 포함한다. 그러므로 본 발명에 의해 제조된 줄기세포는 쉽고 효과적으로 혈관내피로 분화될 수 있다(vascularization). 또한 본 명세서에서 마커로 사용된 CD 발현은 두 번의 2차 배양 후에 결정되었다. 그러므로 본 발명의 줄기세포는 약 2번의 배양 과정 후에 실질적으로 표현형을 바꾸지 않는다고 해석된다.

(실시예 4 : 다수의 개체로부터 수득된 지방흡입에 의한 흡인물의 액상으로부터 수득된 줄기세포의 특성)

또한 줄기세포는 다수의 개체로부터 수득된 지방흡입에 의한 흡인물의 액상으로부터 수득되었으며 이후 특징지어졌다. 결과는 아래와 같다.

다수의 개체로부터 수득된 지방흡입에 의한 흡인물의 액상으로부터 수득된 줄기세포의 특성 결과

개체	A	B	C
Passage	7	1	1
세포 수	10,000	10,000	30,000
배지	DMEM	M199	M199
CD4	-	5.1	N.T.
CD13	+	100.0	99.6
CD16	N.T.	1.9	1.1
CD29	+	99.9	98.9
CD31	-	8.0	1.7
CD34	-	80.3	80.6
CD36	+	27.6	15.6
CD44	+	100.0	99.4
CD45	-	8.1	0.9
CD49d	+	78.0	79.4
CD54	N.T.	N.T.	95.6
CD56	N.T.	2.1	9.0
CD57	N.T.	N.T.	0.1
CD69	-	0.0	0.0
CD71	+	95.4	53.5
CD73	N.T.	89.5	98.5
CD90	+	100.0	N.T.
CD105	+	99.8	92.4
CD106	-	0.6	1.2
CD117	-	10.4	7.1
CD135	-	0.5	0.0
CD151	+	98.7	99.4
CD235a	-	4.5	N.T.
STRO-1	N.T.	4.1	5.7

수치는 줄기세포의 세포그룹에서 각 단백질을 발현하는 비율(%)을 나타내고 "-" = 발현이 감지되지 않았음, "+" = 발현이 감지되었음, 그리고 N.T. = 실험하지 않았음을 의미한다.

대부분의 수득된 줄기세포는 CD13, CD29, CD34, CD36, CD44, CD49d, CD54, CD58, CD71, CD73, CD90, CD105, CD106, CD151 및 SH3에 양성이었다. 그러므로 본 발명의 지방-유래 전구세포는 CD13, CD29, CD34, CD36, CD44, CD49d, CD54, CD58, CD71, CD73, CD90, CD105, CD106, CD151 및 SH3으로 구성된 그룹에서 선택된 적어도 하나의 단백질을 발현하는 세포이다. CD106을 발현하는 줄기세포는 본 발명에서 사용된 지방-유래 전구세포의 특징이다. 다른 한 부분은 음성이었으나 줄기세포 덩어리의 한 부분은 CD31, CD45, CD117 및 CD146에 양성이었다.

줄기세포 덩어리는 CD3, CD4, CD14, CD15, CD16, CD19, CD33, CD38, CD56, CD61, CD62e, CD62p, CD69, CD104, CD135 및 CD144에 음성이었다. 그러므로 본 발명의 지방-유래 전구세포는 CD3, CD4, CD14, CD15, CD16, CD19, CD33, CD38, CD56, CD61, CD62e, CD62p, CD69, CD104, CD135 및 CD144 중 적어도 하나를 발현하지 않는 세포이다.

줄기세포 덩어리를 분화를 유도하는 배지에서 배양하는 동안 뼈, 연골, 지방 등과 같은 기관에 따라 특유한 단백질의 발현이 2에서 3주 후에 확인되었다. 대부분의 섬유아세포가 발현하는 CD56을 줄기세포 덩어리는 발현하지 않았으며 이는 사람 피부-유래 배양된 섬유아세포와 다른 점이다. 반대로 줄기세포 덩어리가 발현하는 CD105는 섬유아세포에서는 보통 관찰되지 않았다. 줄기세포 덩어리가 발현하는 CD49d는 보통 뼈 골수-유래 간엽 줄기세포에서는 관찰되지 않았다.

또한 배양기간이 길어진 경우 CD31, CD34, CD36, CD45, CD106 및 CD117의 발현이 점점 사라졌다. 그러므로 2차 배양이 지속되는 경우 2차 배양 전에 관찰되었던 CD106의 발현은 더 이상 관찰되지 않았다.

(실시예 5 : 지방흡입에 의한 흡인물에 기인한 줄기세포의 지방세포로의 분화 유도)

지방흡입에 의한 흡인물에 기인한 줄기세포를 다음과 같은 지방형성 DMEM 배지에서 배양함으로써 지방세포로 분화 유도하였다:

사용된 지방형성 DMEM은 다음의 조성을 가진다:

DMEM(10% FBS가 첨가된) 100 ㎖

이소부틸-메틸 크산틴(0.5M) 100 ㎕ (최종 농도 0.5 mM)

덱사메타손(10^-4M) 1 ㎖ (최종 농도 1μM)

인슐린(10^-3M) 1 ㎖ (최종 농도 10μM)

인도메타신 100 ㎕ (최종 농도 200μM)

실시예 2에서 생성된 약 30만 개의 줄기세포가 약 4주 동안 passage 없이 배양되었다. 결과 도 2에 제시된 바와 같이 줄기세포는 안에 저장된 지방과 같은 물질을 함유하는 세포로 분화되었다.

저장된 지방과 같은 물질이 지방인지를 확인하기 위해 분화된 세포를 Oil-Red로 염색하였으며 분화된 세포는 실제로 지방세포였다.

Oil-Red O 염색은 다음과 같이 수행된다:

1) 배지를 버리고 PBS로 세척한다;

2) 10% 포르말린으로 약 10분 동안 세포를 고정한다;

3) 증류수로 세척한다;

4) 60% 이소프로필 알코올을 약 1분 동안 첨가한다;

5) 세포를 Oil-Red O 염색 용액^*에 15분 동안 옮겨놓는다;

6) 60% 이소프로필 알코올을 1분 동안 첨가한다;

7) 증류수로 세척한다;

8) 핵을 염색시키기 위해 헤마톡실린(hematoxylin)을 2분 동안 첨가한다;

9) 증류수로 세척한다;

10) 착색을 위해 탄산리튬^**을 몇 초 동안 첨가한다;

11) 증류수로 세척한다.

* Oil-Red 염색 용액은 다음과 같이 제조되었다:

Oil Red O 0.3g(SIGMA O-0625)을 99% 이소프로필 알코올 100㎖에 용해시켰다. 사용 시, 이 용액과 증류수를 6:4의 비율로 혼합하고 충분히 섞었다. 그 후 30분 뒤, 결과 용액을 여과시켰다.

** 탄산리튬은 다음과 같이 제조되었다:

3㎎의 탄산리튬 용액(100㎖의 증류수에 1.54g; Sigma-Aldrich)을 100㎖의 증류수에 첨가하였다.

염색된 세포의 예시도가 도 3에 제시되어있다. 도 3에 제시된 바와 같이 실시예 2에서 생성된 줄기세포는 세포 내에 저장된 물질이 지방인지를 확인하기 위해 상기 지방형성 DMEM에서 배양되었고 결과 줄기세포로부터 분화된 세포는 실제로 지방세포임이 확인되었다.

(실시예 6 : 지방흡입에 의한 흡인물에 기인한 줄기세포의 연골세포로의 분화 유도)

지방흡입에 의한 흡인물에 기인한 줄기세포를 다음과 같은 연골형성 DMEM 배지에서 배양함으로써 연골세포로 분화 유도하였다:

사용된 연골형성 DMEM 배지는 다음과 같이 제조되었다:

1) DMEM(세럼은 첨가하지 않고 적합한 항체는 첨가하였다) 100㎖; 인슐린(6.25 ㎎/㎖) 100㎕(첨가된 총양: 625㎕); 아스코르베이트-2-포스페이트(5μM) 1㎖ (최종 농도 50nM); 및 우태아 혈청 1㎖ (최종 농도 1%)을 혼합하였다.

2) 결과 혼합물을 0.22㎛ 필터를 사용하여 여과하였고 1㎖의 TGF-β1(1 ㎍/㎖)을 혼합물에 첨가하여 피펫팅한 후 4℃에 보관하였다.

실시예 2에서 생성된 약 30만 개의 줄기세포가 약 4주 동안 passage 없이 배양되었다. 결과 도 4에 제시된 바와 같이 줄기세포는 거대 세포 덩어리를 형성하는 연골과 같은 세포로 분화되었다.

분화된 세포가 연골세포인지를 확인하기 위해 분화된 세포를 Alcian blue로 염색하였다.

Alcian blue 염색 용액은 다음과 같이 제조되었다:

1) 배지를 버리고 PBS로 세척한다;

2) 10% 포르말린으로 약 10분 동안 세포를 고정한다;

3) 3% 아세테이트 용액을 3분 동안 첨가한다;

4) Alcian blue 염색 용액^*을 약 1시간 동안 첨가한다;

5) 3% 아세테이트 용액을 3분 동안 첨가한다;

6) 2분 동안 증류수로 세척한다;

7) Nuclear Fast Red(Kernechtrot)^**을 2분 동안 첨가한다;

8) 증류수로 세척한다.

* Alcian Blue 8 GX 1g을 3% 아세테이트 수용액 100㎖에 용해시키고 이후 사용을 위해 여과시켰다.

** Nuclear Fast Red 용액은 다음과 같이 제조되었다:

Nuclear Fast Red(nuclease fast red) 0.1g을 100㎖의 증류수에 첨가하였고 5g의 황산알루미늄을 끓어오르는 용액을 위해 첨가하였다. 결과용액을 이후 사용을 위해 여과시켰다.

Alcian blue로 염색된 세포의 예시도가 도 5에 제시되어있다. 도 5에 제시된 바와 같이 상기 연골형성 DMEM에서 배양된 줄기세포가 실제 연골세포임이 확인되었다.

(실시예 7 : 지방조직의 생성)

다음 분화된 세포로서 지방조직은 개체로부터 고지에 입각한 동의를 받아 생성되었다. 분리는 본 기술분야에서 잘 알려진 기술에 의해 수행되었다. 즉 인간 지방조직은 고지에 입각한 동의를 받아 개체로부터 흡입한 지방조직으로부터 무균으로 분리되었다. 조직 덩어리는 지방세포를 위한 배지((500㎖) 화합물 = Eagle's 배지 4.75g; 10% NaHCO₃ 10㎖; 글루타민 0.3g; 카나마이신(20㎎/㎖) 1.5㎖; 페니실린 스트렙토마이신 5㎖; FBS(10%))에 보존되었다. 조직 덩어리는 그대로 사용할 수 있고 또는 지방세포로 분리한 후 사용할 수도 있다.

Eagle's 배지의 조성(9.5g 당)

염화나트륨 6400 ㎎

염화칼륨 400 ㎎

염화칼슘(무수물) 200 ㎎

황산마그네슘(무수물) 97.7 ㎎

인산이수소나트륨(무수물) 108 ㎎

질화수은(노나수화물) 0.1 ㎎

포도당 1000 ㎎

피루브산나트륨 110 ㎎

숙신산 106 ㎎

숙신산나트륨(6수화물) 27 ㎎

L-아르기닌 하이드로클로라이드 84 ㎎

L-시스테인 하이드로클로라이드(1수화물) 70.3 ㎎

글라이신 30 ㎎

L-히스티딘 하이드로클로라이드(1수화물) 42 ㎎

L-이소루신 104.8 ㎎

L-루신 104.8 ㎎

L-라이신 하이드로클로라이드 146.2 ㎎

L-메치오닌 30 ㎎

L-페닐알라닌 66 ㎎

L-세린 42 ㎎

L-트레오닌 95.2 ㎎

L-트립토판 16 ㎎

L-다이소디움 타이로신 89.5 ㎎

L-발린 93.6 ㎎

산성주석산콜린 7.2 ㎎

엽산 4 ㎎

니코틴산아미드 4 ㎎

비타민 B5 4 ㎎

염산피리독살 4 ㎎

리보플라빈 0.4 ㎎

염산티아민 4 ㎎

I-이노시톨 7.2 ㎎

페놀 레드 5 ㎎

(실시예 8 : 지방세포 혼합물)

다음 실시예 2에서 생성된 지방-유래 전구세포(PLA)는 더 이상 화학처리하지 않고 실시예 6에서 생성된 분화된 세포인 지방조직(지방세포 덩어리)과 함께 혼합하였다. 분화가 재생을 일으켰는지 아닌지 결정된다.

실시예 6에서 생성된 1㎖(900㎎)의 지방조직 덩어리 (A) 또는 1㎖(900㎎)의 지방조직 덩어리와 실시예 2에서 생성된 흡입된 지방-유래 줄기세포 10㎖의 혼합물 (B)을 SCID 쥐(Charles River, Japan)의 등부위에 피하로 주사하였다. 주입은 주사기(syringe)를 사용하였다. 이식된 지방조직의 무게를 결정하고 조직을 분석하였다.

지방흡입에 의한 흡인물에 기인한 줄기세포 혼합물의 조직 무게 유지에 관한 영향이 확인되었다.

(지방세포 혼합물에 의한 지방조직의 재생)

지방-유래 줄기세포와 지방조직이 혼합되었을 때 재생된 지방의 평균 무게는 지방조직 단독 무게보다 무겁다. 그러므로 PLA의 영향은 확실히 증명될 수 있다. SCID 쥐를 정밀검사를 위해 해부하면 재생에 의한 효과를 확인할 수 있다. 제시된 바와 같이 지방-유래 줄기세포를 함유하는 혼합물을 투여하였을 때 조직은 확실히 더 커졌다.

지방조직을 단독으로 주입하였을 때 지방조직의 무게는 4주 후 die 반으로 감소되었다. 이것은 지방조직이 괴사되었기 때문이다. 지방-유래 줄기세포를 함유하는 혼합물을 투여하였을 때 조직의 무게가 유지되었던 이유는 지방-유래 줄기세포가 지방조직으로 분화되도록 유도되었거나 또는 지방-유래 줄기세포가 조직의 괴사를 방지하는 기능을 가졌거나 혹은 둘 다이기 때문이다.

(실시예 9 : DMEM에서 배양되고 유지된 PLA의 효과)

실시예 2에서 생성된 지방흡입에 의한 흡인물에 기인한 줄기세포는 DMEM(실시예 7에서 사용된 것과 같은)에서 유지된다. 결과 지방-유래 줄기세포는 비슷한 효과를 확인하기 위해 사용된다. 특히 이러한 생성방법은 실시예 2에서 생성되고 실시예 7에서 사용된 지방-유래 줄기세포 또는 지방-유래 전구세포(PLA) 대신 사용된다. 결과 2억 5천만 개의 지방-유래 줄기세포를 900㎎의 지방에 첨가하였을 때 약 40에서 50%의 지방조직이 성공적으로 성장하였다. 그러므로 성장 배양액에서 수득되고 유지된 줄기세포가 이용될 수 있음이 밝혀졌다.

(실시예 10 : M199에서 배양된 지방-유래 줄기세포의 효과)

M-199에서 배양된 지방-유래 전구세포는 실시예 2에서 생성되고 실시예 7에서 사용된 지방-유래 줄기세포 또는 지방-유래 전구세포(PLA) 대신 사용된다. M-199는 다음의 성분을 포함한다.

M-199의 성분(혈관내피세포 배지) (ℓ 당):

배지 199 9.5 g

NaHCO₃ 2.2 g

FBS (15%)

산성-FGF 2 ㎍

헤파린 5 ㎎

항생-항진균(antibiotic-antimycotic) 10 ㎖

(주의) 아래 성분의 단위는 ㎎/㎖이다.

L-알라닌 50

L-아르기닌· 하이드로클로라이드 70

L-아스파르트산 60

L-시스테인 0.1

L-시스틴 20

L-글루타민산 150 (H2O)

L-글루타민 100

글라이신 50

L-히스티딘 하이드로클로라이드(1수화물) 20

하이드록시-L-프롤린 10

L-이소루신 40

L-루신 120

L-라이신 하이드로클로라이드 70

L-메치오닌 30

L-페닐알라닌 50

L-프롤린 40

L-세린 50

L-트레오닌 60

L-트립토판 20

L-타이로신 40

L-발린 50

글루타치온(환원된 형) 0.05

염화칼슘(2수화물) 264.9

염화칼륨 400

황산마그네슘(7수화물) 97.7 (무수물 형)

염화나트륨 6800

탄산수소나트륨 2200

인산이수소나트륨 140 (2H₂O)

질산철(9수화물) 0.72

아세트산나트륨(3수화물) 83

페놀 레드 15

D-비오틴 0.01

엽산 0.01

니코틴산아미드 0.025

비타민 B5 0.01

염산피리독살 0.025

염산피리독신 0.025

리보플라빈 0.01

염산티아민 0.01

아데닌 10(SO₄)

염산콜린 0.5

하이포크산틴 0.3

I-이노시톨 0.05

p-아미노벤조산 0.05

염산구아닌 0.3

크산틴 0.3

티아민 0.3

우라실 0.3

니코틴산 0.025

비타민 A 0.1

칼시페롤 0.1

메나디온 0.01

α-토코페롤 0.05

아스코르빈산 20

Tween 80 20

콜레스테롤 0.2

ATP·2Na 1

아데닐산 0.2

리보오스 0.5

데옥시리보오스 0.5

결과 M-199배지에서 배양된 지방-유래 전구세포를 지방에 첨가하였을 때 지방조직이 성장하는 것이 밝혀졌다. 그러므로 수득 후 배지에서 배양된 줄기세포를 이용할 수 있음이 밝혀졌다.

(실시예 11 : 골세포의 적용)

다음 본 발명의 세포 혼합물을 이식하는 것과 유사한 실험을 수행하기 위해 골세포가 사용된다. 골세포의 경우 뼈(뼈 조직)는 본 기술분야에서 잘 알려진 기술을 이용하여 쥐로부터 수득된다. 뼈 조직은 실시예 2에서 생성된 PLA와 혼합되고 그 혼합물은 뼈로 이식된다. 이 경우 뼈의 재생이 본 발명의 혼합물의 이식에 의해 지속된다는 것이 관찰되었다.

(실시예 12 : 혈관신생에 적용)

다음 본 발명의 세포 혼합물을 이식하는 것과 유사한 실험을 수행하기 위해 혈관세포가 사용된다. 혈관세포의 경우 혈관은 본 기술분야에서 잘 알려진 기술을 이용하여 쥐로부터 수득된다. 혈관조직은 실시예 1에서 생성된 PLA와 혼합되고 그 혼합물은 혈관에 이식된다. 이 경우 혈관의 재생이 본 발명의 혼합물의 이식에 의해 지속된다는 것이 관찰되었다.

(실시예 13 : 줄기세포의 생성 조건 분석)

(Ⅰ) 제조 방법 1(실시예 2: 지방흡입에 의한 흡인물에 기인한 줄기세포 현탁액의 제조)에서 사용된 세포층의 밀도 구배 원심분리의 조건은 Ficoll을 사용하여 400×ｇ로 30분 동안 원심분리하는 것이었다. 다음 상기 밀도 구배 원심분리 조건은 더욱 상세히 분석되었다.

(1) 사용된 배지의 연구

Ficoll을 제외하고 사용 가능한 밀도 구배 원심분리에 사용되는 배지는 Percoll (R), Histopaque (R), Lymphoprep 등이 있다. 이러한 배지는 세포층의 밀도 구배 원심분리를 위해 그리고 Ficoll과 결과를 비교하기 위해 사용되었다. 분리된 세포는 FACS를 이용하여 측정되었다. 최상의 순도를 보이는 배지는 Ficoll이다.

(2) 원심분리 조건의 연구

실시예 2에서 원심분리는 400×ｇ로 30분 동안 수행되었다. 다음, 다음의 원심분리 조건이 연구되었다.

200×ｇ로 60분 동안, 400×ｇ로 20분 동안, 400×ｇ로 30분 동안, 400×ｇ로 40분 동안, 600×ｇ로 30분 동안 및 800×ｇ로 20분 동안이 줄기세포를 분리하기 위한 배지로써 Ficoll을 사용해 분석되었다. 세포의 순도는 FACS을 이용해 분석되었다. 400×ｇ로 30분 동안 원심분리한 것이 가장 깨끗하고 많은 양의 분리된 줄기세포를 생성하는 것으로 나타났다.

(실시예 14 : 지방흡입에 의한 물질에 기인한 줄기세포의 생성)

다음, 지방흡입에 의한 물질을 흡인물과 조직으로(이후 또한 "지방조직 + 흡인물"로 일컫는다) 나누기 전에 분석을 위하여 분리 전에 지방흡입에 의한 물질로 비슷한 분리 실험을 하였다.

상기 분리 방법은 다음과 같았다:

1. "지방조직 + 흡인물"("흡인물"에 의해 덮인 지방조직)을 함유하는 커버가 있는 혈관에 콜라게네이즈(7.5% 콜라게네이즈, Sigma, 전체 샘플 부피의 1/100이 첨가되었다)를 첨가하였고 적절한 속도로 혼합하였다. 37℃에서 30분 동안 혼합한 후, 지방세포사이의 세포간질의 주요한 성분인 콜라게네이즈는 지방세포의 분리를 촉진하기 위해 분해되었다. 여기에 8개의 500㎖-튜브 또는 1000㎖-튜브가 사용되었다.

2. 결과 샘플을 800×ｇ로 원심분리시켜 지방성분과 세포가 분리되었으며 분리된 지방성분은 세포보다 낮은 비중을 가진다. 원심분리 후 물질은 기름(oil) 층, 기질(substrate) 층, 액상(liquid layer) 및 세포층의 4개의 층으로 분리되었다.

3. 기름 층, 기질 층 및 액상은 세포층만을 수득하기 위해 흡인하여 버려졌다. 세포층은 500㎛ 및 250㎛의 필터를 이용하여 선택적으로 여과하였다. 500㎛-필터는 필요하지 않는 것으로 나타났다.

4. 적혈구를 용해시키기 위해 10㎖ 세포용해(lysis) 버퍼(예를 들어 염화암모늄과 탄산칼륨 수용액)를 첨가하고 2∼5분 동안 교반하였다. 선택적으로 이러한 세포용해 단계는 생략될 수 있다.

5. 결과 펠렛에 생리식염수로 완충된 인산염을 첨가하였다. 세포용해 버퍼 반응이 종료되었다. 용해된 샘플은 100㎛-필터를 사용하여 여과하였다. 175㎖-코니컬(conical) 튜브를 원심분리를 위해 사용하였다.

6. 결과 샘플을 800×ｇ로 또는 400×ｇ로 5분 동안 더욱 원심분리시켰다. 모아진 세포는 목적 세포이다.

7. 불필요한 용액을 제거하기 위해 상등액을 흡인하여 버렸으며 농축된 세포가 수득되었다.

수득된 세포를 분석하였다.

(실시예 15 : "지방조직 + 흡인물"에 의한 줄기세포)

실시예 14에 따라 생성된 줄기세포가 실시예 4에서와 같이 분석되었다.

"지방조직 + 흡인물"로부터 수득된 대부분의 줄기세포는 CD13, CD29, CD34, CD36, CD44, CD49d, CD54, CD58, CD71, CD73, CD90, CD105, CD106, CD151 및 SH3에 양성이었다. 그러므로 본 발명의 지방-유래 전구세포는 CD13, CD29, CD34, CD36, CD44, CD49d, CD54, CD58, CD71, CD73, CD90, CD105, CD106, CD151 및 SH3으로 구성된 그룹에서 선택된 적어도 하나의 단백질을 발현하는 세포이다. CD106을 발현하는 줄기세포는 본 발명에서 사용된 지방-유래 전구세포의 특징이다. 다른 한 부분은 음성이었으나 줄기세포 덩어리의 한 부분은 CD31, CD45, CD117 및 CD146에 양성이었다.

"지방조직 + 흡인물"에 의한 줄기세포 덩어리는 CD3, CD4, CD14, CD15, CD16, CD19, CD33, CD38, CD56, CD61, CD62e, CD62p, CD69, CD104, CD135 및 CD144에 음성이었다. 그러므로 본 발명의 지방-유래 전구세포는 CD3, CD4, CD14, CD15, CD16, CD19, CD33, CD38, CD56, CD61, CD62e, CD62p, CD69, CD104, CD135 및 CD144 중 적어도 하나를 발현하지 않는 세포이다.

"지방조직 + 흡인물"에 의한 줄기세포 덩어리를 분화를 유도하는 배지에서 배양하는 동안 뼈, 연골, 지방 등과 같은 기관에 따라 특유한 단백질의 발현이 2에서 3주 후에 확인되었다. 대부분의 섬유아세포가 발현하는 CD56을 줄기세포 덩어리는 발현하지 않았으며 이는 사람 피부-유래 배양된 섬유아세포와 다른 점이다. 반대로 줄기세포 덩어리가 발현하는 CD105는 섬유아세포에서는 보통 관찰되지 않았다. 줄기세포 덩어리가 발현하는 CD49d는 보통 뼈 골수-유래 간엽 줄기세포에서는 관찰되지 않았다.

또한 배양기간이 길어진 경우 CD31, CD34, CD36, CD45, CD106 및 CD117의 발현이 점점 사라졌다. 그러므로 2차 배양이 지속되는 경우 2차 배양 전에 관찰되었던 CD106의 발현은 더 이상 관찰되지 않을 수 있다.

줄기세포의 근원으로 "지방조직 + 흡인물"을 사용하더라도 양질의 줄기세포를 얻을 수 있다. 따라서 지방흡입에 의한 흡인물로부터 줄기세포를 수득하기 위해 지방조직의 분리가 반드시 필요한 것은 아니다. 또한 물질로부터 많은 양의 줄기세포를 얻을 수 있다.

(실시예 16 : 본 발명의 줄기세포의 성장)

다음 지방흡입에 의한 흡인물은 줄기세포를 수득하기 위해 적혈구를 제거하는 과정을 생략하는 것을 제외하고 실시예 2와 같은 과정(제조 방법 1)을 거쳤다.

생성된 줄기세포 중 1.8×10⁷개의 세포를 M199 배양액이 있는 60㎜ 배양접시(젤라틴으로 코팅된)와 DMEM 배양액이 있는 60㎜ 배양접시(젤라틴으로 코팅되지 않은)에서 배양하였다. 세포 수의 측정은 6일(혹은 2회 3일)부터 격일로 시작되었다.

결과는 다음과 같다:

1 회

일	6	8	10	12	14
M199 배양액	1.90E+04	7.80E+04	4.15E+05	4.65E+05	3.85E+05
DMEM 배양액	8.50E+03	2.60E+04	7.20E+04	1.19E+05	1.26E+05

2 회

일	3	5	7	9	11
M199 배양액	3.90E+04	1.75E+05	3.17E+05	3.40E+05	4.50E+05
DMEM 배양액	8.50E+04	9.30E+04	1.90E+05	2.09E+05	2.80E+05

상기 표에서 알 수 있듯이, 지방흡입에 의한 흡인물로부터 생성된 줄기세포와 유사한 성장곡선을 가지므로 효과적인 방식으로 줄기세포를 얻기 위해 적혈구를 반드시 제거할 필요는 없음을 알 수 있다. 성장곡선이 도 6에 제시되어있다. 도 7∼10은 적혈구를 제거하지 않고 지방흡입에 의한 흡인물로부터 DMEM 배지(도 7 = 1 회; 6, 8, 10, 12일; 및 도 8 = 2 회; 3, 5, 7, 9일)와 M199 배지(도 9 = 1 회; 6, 8, 10, 12일; 및 도 10 = 2 회; 3, 5, 7, 9일)에서 생성된 줄기세포의 성장을 보여주는 예시도이다.

(실시예 17 : 반융합(sub-confluence) 조건에서의 성장 분석)

본 실시예에서 반융합 조건 하의 배양은 다양하게 분화된 세포로 분화를 유도할 수 있다는 것이 증명되었다.

사용된 프로토콜은 다음과 같다:

1) 뼈로 분화

수득된 세포는 DMEM 배양액이 있는 60㎜ 배양접시에서 1.8×10⁷cells/dish의 농도로 배양되었다. 10일 간의 배양 후 세포는 반융합 상태가 되었고 기존의 배지를 분화 유도 배양액(조성: 예시적인 골형성 배지는 10% FBS와 5% 말 세럼이 첨가되고 1μM 덱사메타손, 50μM 아스코르베이트-2-포스페이트, 10mM β-글리세로포스페이트, 1% ABAM을 포함하는 DMEM이다)으로 교체하여 22일 동안 배양하였다. 세포는 von Kossa 염색을 이용하여 관찰되었다.

von Kossa 염색:

배양액을 버리고 목적 샘플을 생리식염수로 완충된 인산염으로(PBS) 세척한다. 세척된 샘플을 4% 파라포름알데히드로 10분 동안 고정한다. 샘플을 milliQ water로 세척한다. 샘플을 암실에서 20분 동안 2.5% 질산은과 반응시킨다. 샘플을 milliQ water로 세척한다. 샘플을 15분 동안 형광등 아래 놓는다. 샘플을 0.5% 히드로퀴논에 2분 동안 배양하고 이어 5% 티오황산나트륨에 2분 동안 배양하였다. 샘플을 milliQ water로 세척한다. 샘플을 Nuclear Fast Red로 2분 동안 염색한다. 샘플을 MountQuick(Daido Sangyo, Japan)으로 슬라이드에 고정시키고 현미경을 통해 관찰한다.

2) 연골로 분화

수득된 세포는 DMEM 배양액이 있는 60㎜ 배양접시에서 1.8×10⁷cells/dish의 농도로 배양되었다. 10일 간의 배양 후 세포는 반융합 상태가 되었고 기존의 배지를 분화 유도 배양액(조성: 예시적인 연골형성 배지는 1% FBS이 첨가되고 6.25㎍/㎖ 인슐린, 6.25㎍/㎖ 트랜스페린, 10ng/㎖ TGF β1, 50nM 아스코르베이트-2-포스페이트, 1% ABAM을 포함하는 DMEM이다)으로 교체하여 22일 동안 배양하였다. 세포는 Alcian blue 염색을 이용하여 관찰되었다.

Alcian blue 염색:

목적 샘플에서 배양액은 버린다. 샘플을 4% 파라포름알데히드로 10분 동안 고정한다. 샘플을 milliQ water로 세척한다. 샘플을 3% 아세테이트로 3분 동안 세척한다. 샘플을 Alcian blue 염색 용액에 30분 동안 흡수시킨다. 샘플을 3% 아세테이트로 3분 동안 세척한다. 샘플을 milliQ water로 세척한다. 샘플을 Nuclear Fast Red로 2분 동안 염색한다. 샘플을 milliQ water로 세척한다. 샘플을 MountQuick(Daido Sangyo, Japan)으로 슬라이드에 고정시키고 현미경을 통해 관찰한다.

3) 지방으로 분화

수득된 세포는 DMEM 배양액이 있는 60㎜ 배양접시에서 1.8×10⁷cells/dish의 농도로 배양되었다. 10일 간의 배양 후 세포는 반융합 상태가 되었고 기존의 배지를 분화 유도 배양액(조성: 예시적인 지방형성 배지는 10% FBS이 첨가되고 0.5mM IBMX, 1μM 덱사메타손, 10μM 인슐린, 200μM 인도메타신, 1% ABAM을 포함하는 DMEM이다)으로 교체하여 22일 동안 배양하였다. 세포는 Oil-Red O 염색을 이용하여 관찰되었다.

Oil-Red O 염색:

배양액을 버리고 목적 샘플을 생리식염수로 완충된 인산염으로(PBS) 세척한다. 세척된 샘플을 4% 파라포름알데히드(PFA)로 10분 동안 고정한다. 샘플을 milliQ water로 세척한다. 샘플을 60% 이소프로필 알코올에 1분 동안 흡수시킨다. 샘플을 milliQ water로 세척한다. 샘플을 헤마톡실린에 1분 동안 흡수시킨다. 샘플을 milliQ water로 세척한다. 샘플을 탄산리튬에 몇 초 동안 흡수시킨다. 샘플을 milliQ water로 세척한다. 샘플을 MountQuick(Daido Sangyo, Japan)으로 슬라이드에 고정시키고 현미경을 통해 관찰한다.

1) Oil-Red O 염색 용액은 다음과 같이 제조된다:

Oil-Red O 0.3g을 99% 100㎖의 이소프로필 알코올에 용해시킨다. 사용 시 이 용액을 milliQ water와 6:4의 비율로 혼합하였고 30분 동안 교반하였다. 혼합된 용액은 사용 전에 여과하였다.

2) 탄산리튬 용액:

3㎖의 포화된 탄산리튬 용액(100㎖ 당 탄산리튬 1.54g)을 100㎖의 milliQ water에 첨가하였다.

결과가 도 11∼20에 제시되어있다. 제시된 바와 같이, 실시예 3 또는 15에서 생성된 줄기세포가 양질의 플루리포텐시(pluripotency)를 보였다.

(실시예 18 : 적혈구의 제거 단계 없이 반융합 조건에서의 성장 분석)

본 실시예에서 적혈구의 제거 단계를 거치지 않고도 반융합 조건 하의 배양은 다양하게 분화된 세포로 분화를 유도할 수 있다는 것이 증명되었다.

사용된 분화 단계는 실시예 17과 같다.

결과는 실시예 17에서 얻어진 것과 유사하다. 결과 적혈구의 제거 단계를 거치지 않고 생성된 줄기세포도 양질의 플루리포텐시(pluripotency)를 보였다.

(실시예 19 : 분화 유도 배지에서의 분화)

본 실시예에서 분화 유도 배지를 이용한 배양은 다양하게 분화된 세포로 분화를 유도할 수 있다는 것이 증명되었다.

사용된 프로토콜은 다음과 같다:

1) 뼈로 분화

수득된 세포는 분화 유도 배양액(조성: 예시적인 골형성 배지는 10% FBS와 5% 말 세럼이 첨가되고 1μM 덱사메타손, 50μM 아스코르베이트-2-포스페이트, 10mM β-글리세로포스페이트, 1% ABAM을 포함하는 DMEM이다)이 있는 60㎜ 배양접시에서 1.8×10⁷cells/dish의 농도로 종배양 되었다. 22일 동안 배양한 후, 샘플은 von Kossa 염색을 이용하여 분석되었다. Von Kossa 염색은 상기 실시예 17에서 설명된 것과 같이 수행되었다.

3) 지방으로 분화

수득된 세포는 분화 유도 배양액(조성: 예시적인 지방형성 배지는 10% FBS이 첨가되고 0.5mM IBMX, 1μM 덱사메타손, 10μM 인슐린, 200μM 인도메타신, 1% ABAM을 포함하는 DMEM이다)이 있는 60㎜ 배양접시에서 1.8×10⁷cells/dish의 농도로 종배양 되었다. 22일 동안 배양한 후, 샘플은 Oil-Red O 염색을 이용하여 관찰되었다. Oil-Red O 염색은 상기 실시예 17에서 설명된 것과 같이 수행되었다.

결과가 도 21∼26에 제시되어있다. 제시된 바와 같이, 반융합 상태로의 배양 없이 분화 유도 배지를 사용한 실시예 3 또는 15에서 생성된 줄기세포가 양질의 플루리포텐시(pluripotency)를 보였다.

(실시예 20 : 적혈구의 제거 단계 없이 분화 유도 배지에서의 성장 분석)

본 실시예에서 적혈구의 제거 단계를 거치지 않고도 분화 유도 배지를 이용한 배양은 다양하게 분화된 세포로 분화를 유도할 수 있다는 것이 증명되었다.

사용된 분화 단계는 실시예 19와 같다.

결과는 실시예 19에서 얻어진 것과 유사하다. 결과 적혈구의 제거 단계를 거치지 않고 생성된 줄기세포도 양질의 플루리포텐시(pluripotency)를 보였다.

(실시예 21 : 수량화(quantification))

본 실시예에서 지방흡입에 의한 물질로부터 수득된 줄기세포의 수를 설명한다. 수량화는 세포 샘플의 특정 부피 당 세포수를 단순히 세어 측정된다.

결과는 다음의 표에 제시되어있다. 표는 줄기세포 생성 직후의 세포 수와 7일 동안 배양한 후 7일 후의 세포 수를 나타낸다. 줄기세포 샘플을 배양함으로써 혈액세포는 제거되고 따라서 줄기세포의 농도는 증가하는 것으로 관찰되었다.

앞서 제시된 바와 같이, 지방흡입에 의한 흡인물(LFA)은 고형의 지방조직 단독에 필적하는 양의 줄기세포를 포함한다. 그러므로 줄기세포의 제조를 위한 재료로 지방흡입에 의한 흡인물 및/또는 지방흡입에 의한 흡인물과 지방조직과 같은 것을 포함하는 물질을 사용하는 것이 유익하다.

본 명세서에서 특정 바람직한 실시태양이 설명되어있지만, 첨부된 청구사항에 진술된 것은 제외하고 본 발명의 범위가 그러한 실시태양에 한정되도록 의도한 것은 아니다. 모든 특허권, 즉 본 명세서에서 열거된 신청서와 발행된 특허권신청서는 본 명세서에서 전체 기술된 대로 참조에 의해 통합되어있다.

다양한 다른 변형이 본 발명의 범위와 정신을 벗어나지 않고 본 기술분야에 전문적인 사람에게 분명할 것이고 쉽게 만들어질 수 있다. 따라서 여기 첨부된 청구사항의 범위가 본 명세서에서 진술된 설명에 제한되지 않도록 의도하였으며 청구사항은 다소 광범위하게 해석된다.

본 발명은 간단한 방식으로 수득 가능한 지방흡입에 의한 흡인물에 기인한 줄기세포가 재생의학에 적용될 수 있음을 확증한다. 따라서 본 기술분야에 전문적인 사람은 제약 산업 등에서 본 발명의 산업적 적용을 쉽게 발견할 수 있을 것이다.

Claims

A) 지방흡입에 의해 흡인물을 수득하는 단계; B) 지방흡입물의 세포 분획을 얻기 위해 원심분리기로 이송하는 단계; C) 비중에 따른 원심분리로 세포 분획을 수득하는 단계; D) 적혈구 층보다 낮은 비중을 지닌 세포층을 수집하는 단계로 구성된 콜라게나아제 처리를 하지 않은 줄기세포의 제조방법
제 1항에 있어서, 상기 지방흡입에 의한 흡인물은 생리식염수 및 링거 솔루션(Ringer's solution)을 사용하여 제조함을 특징으로 하는 방법
제 1항에 있어서, 상기 원심분리는 800xｇ과 같거나 작은 범위의 속도로 수행됨을 특징으로 하는 방법
제 1항에 있어서, 상기 원심분리는 400xｇ과 같거나 작은 범위의 속도로 수행됨을 특징으로 하는 방법
제 1항에 있어서, 상기 비중에 따른 원심분리는 370xｇ 내지 1,100xｇ의 범위의 속도로 수행됨을 특징으로 하는 방법
제 1항에 있어서, 상기 비중에 따른 원심분리는 20℃의 1.076에서 1.078 ｇ/㎖에 이르는 비중을 가지는 매질을 사용하여 수행됨을 특징으로 하는 방법
제 1항에 있어서, 상기 비중에 따른 원심분리의 매질은 Ficoll, Percoll 및 설탕으로 구성된 그룹에서 선택되어짐을 특징으로 하는 방법
제 7항에 있어서, 상기 비중에 따른 원심분리의 매질은 Ficoll임을 특징으로 하는 방법
제 1항에 있어서, 상기 수득된 세포층의 비중은 1.050 내지 1.075의 범위에 존재함을 특징으로 하는 방법
제 1항에 있어서, 상기 세포층의 채취는 피펫(pipette)을 사용하여 수행됨을 특징으로 하는 방법
제 1항에 있어서, 세포층을 DMEM, M199, MEM, HBSS, Ham's F12, BME, RPMI1640, MCDB104, MCDB153(KGM) 및 그것의 혼합물로 구성된 그룹에서 선택된 성분을 포함하는 배지에서 배양되는 단계를 더욱 포함함을 특징으로 하는 방법
제 1항에 있어서, 상기 비중에 따른 원심분리는 밀도 구배 원심분리를 포함함을 특징으로 하는 방법
제 1항에 있어서, 적혈구를 제거하는 단계를 더욱 포함함을 특징으로 하는 방법
A) 지방흡입으로부터 물질을 수득하는 단계; 및 B) 지방조직을 분리하지 않고 세포 분획을 얻기 위해 지방흡입으로부터 수득된 물질을 원심분리시키는 단계로 구성된 콜라게나아제 처리를 하지 않은 줄기세포의 제조방법
제 14항에 있어서, 하나 이상의 세포 분획이 물질로부터 분리되는 조건 하에 물질을 적용시키는 단계를 더욱 포함함을 특징으로 하는 방법
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제 14항에 있어서, 단계 B)에서 상등액(supernatant)을 제거하는 단계를 더욱 포함함을 특징으로 하는 방법
제 14항에 있어서, 단계 B)로부터의 물질을 여과하는 단계를 더욱 포함함을 특징으로 하는 방법
제 14항에 있어서, 적혈구를 제거하는 단계를 더욱 포함함을 특징으로 하는 방법
제 14항에 있어서, 상기 적혈구를 제거하는 단계는 적혈구를 분해시키는 성분을 첨가하는 것을 포함함을 특징으로 하는 방법
ⅰ) 지방흡입으로부터 흡인 물질을 수득하는 단계; ⅱ) 지방조직을 분리하지 않고 하나 이상의 세포 분획을 분리시키기 위해 흡인 물질을 분리 여과 조건 하에 적용시키는 단계; ⅲ) 수득된 물질을 원심분리시키는 단계; ⅳ) 수득된 세포 분획 물질에 적혈구를 분해시키는 성분을 첨가하여 교반하는 단계; ⅴ) 펠렛(pellet)을 얻기 위해 수득된 물질을 원심분리시키는 단계; 및 ⅵ) 펠렛으로부터 상등액(supernatant)을 흡인하는 단계로 구성된 콜라게나아제 처리를 하지 않은 줄기세포의 제조방법
제 22항에 있어서, 상기 분리 여과 조건 하에 적용시키는 단계는 지방흡입에 의한 흡인물을 유지하는 단계를 포함함을 특징으로 하는 방법
제 22항에 있어서, 상기 지방흡입에 의한 물질은 지방흡입에 의한 흡인물과 지방을 포함함을 특징으로 하는 방법
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제 22항에 있어서, 상기 단계 ⅲ)에서 상기 원심분리는 400xｇ 내지 1200xｇ에서 수행됨을 특징으로 하는 방법
제 22항에 있어서, 상기 적혈구를 분해시키는 성분은 염화암모늄(ammonium chloride)과 중탄산칼륨(potassium bicarbonate)을 포함함을 특징으로 하는 방법
제 27항에 있어서, 상기 염화암모늄은 155mM의 농도임을 특징으로 하는 방법
제 27항에 있어서, 상기 중탄산칼륨은 10mM의 농도임을 특징으로 하는 방법
제 22항에 있어서, 상기 단계 ⅴ)에서 상기 원심분리는 400xｇ 내지 1200xｇ에서 수행됨을 특징으로 하는 방법
제 22항에 있어서, 상기 펠렛은 줄기세포를 포함함을 특징으로 하는 방법
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A) 지방흡입에 의한 흡인물을 수득하는 단계; B) 세포 분획을 얻기 위해 지방흡입에 의한 흡인물을 원심분리시키는 단계; C) 세포 분획을 비중에 따라 원심분리시키는 단계; D) 적혈구 층보다 낮은 비중을 지닌 세포층을 수집하는 단계; 및 E) 외식편(explant)을 얻기 위해 수집된 세포층을 배양하는 단계로 구성된 콜라게나아제 처리를 하지 않은 외식편의 수득 방법
A) 지방흡입에 의한 흡인물을 수득하는 단계; B) 세포 분획을 얻기 위해 지방흡입에 의한 흡인물을 원심분리시키는 단계; 및 C) 이식 조직(tissue transplant)을 얻기 위해 수집된 세포층을 배양하는 단계로 구성된 콜라게나아제 처리를 하지 않은 이식 조직의 제조방법
A) 지방흡입에 의한 흡인물을 수득하는 단계; B) 세포 분획을 얻기 위해 지방흡입에 의한 흡인물을 원심분리시키는 단계; C) 세포 분획을 비중에 따라 원심분리시키는 단계; D) 적혈구 층보다 낮은 비중을 지닌 세포층을 수집하는 단계; 및 E) 이식 조직(tissue transplant)을 얻기 위해 수집된 세포층을 배양하는 단계로 구성된 콜라게나아제 처리를 하지 않은 이식 조직의 제조방법
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제1항 내지 제15항, 제18항 내지 제24항 및 제26항 내지 제31항 중 어느 하나에 따른 방법에 의해 수득된 줄기세포를 배양하는 단계를 포함하는 혈관내피 전구세포, 지방세포, 연골세포, 골세포 및 근세포로 구성된 그룹에서 선택된 세포의 제조방법
A) a) 제1항 내지 제15항, 제18항 내지 제24항 및 제26항 내지 제31항 중 어느 하나에 따라 수득된 줄기세포와 b) 목적 분화 부위에 상응하는 분화된 세포를 혼합하여 혼합물을 수득하는 단계; 및 B) 지방-유래 전구세포를 분화시키기에 충분한 조건 하에서 혼합물을 배양하는 단계로 구성된 분화된 세포의 제조방법
제 50항에 있어서, 상기 분화된 세포는 간엽(mesenchymal) 세포임을 특징으로 하는 방법
제 50항에 있어서, 상기 분화된 세포는 지방세포, 골수세포, 골아세포, 연골세포, 섬유아세포, 근섬유아세포, 신경세포, 골격 근원세포, 심근세포, 혈관내피세포, 평활근세포, 간세포, 신장세포 및 췌장세포로 구성된 그룹에서 선택되어짐을 특징으로 하는 방법
제 50항에 있어서, 상기 분화된 세포로 분화를 유도하기 위하여 분화 유도제를 공급하는 단계를 더욱 포함함을 특징으로 하는 방법
제 50항에 있어서, 상기 혼합물은 아드레코티컬(adrenocortical) 스테로이드, 인슐린, 포도당, 인도메타신, 이소부틸-메틸크산틴(IBMX), 아스코르빈산 및 그 유도체, 글리세로포스페이트, 에스트로겐 및 그 유도체, 프로게르테론 및 그 유도체, 안드로겐 및 그 유도체, 성장인자(growth factor), 뇌하수체 분비물 추출물(pituitary gland extracts), 송과선 추출물(pineal body extracts), 레티논산, 비타민 D, 타이로이드 흐르몬, 우태아 혈청, 말 혈청, 인간 혈청, 헤파린, 중탄산소다, HEPES, 알부민, 트랜스페린(transferrin), 셀레네이트(selenates), 리놀레인산, 3-이소부틸-1-메틸크산틴, 탈메틸화제, 히스톤 탈아세틸레이트제(histone deacetylating agents), 악티빈(activin), 사이토카인, 헥사메틸렌비스아세트아마이드(HMBA), 다이메틸아세트아마이드(DMA), 디부틸 cAMP(dbcAMP), 디메틸술폭사이드(DMSO), 요도데옥시유리딘(IdU), 하이록시우레아(hyroxyurea(HU)), 사이토신 아라비노사이드(cytosine arabinoside(AraC)), 마이토마이신 C(mitomycin C(MMC)), 부티르산 나트륨(sodium butyrate(NaBu)), 폴리브렌(polybrene) 및 셀레늄으로 구성된 그룹에서 선택된 하나 이상의 성분을 포함하는 배지에서 배양됨을 특징으로 하는 방법
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