KR100781753B1

KR100781753B1 - Ｄｋｋ2를 포함하는 혈관신생을 촉진시키는 방법

Info

Publication number: KR100781753B1
Application number: KR1020060046442A
Authority: KR
Inventors: 영 근 권; 김영명; 민정기
Original assignee: 연세대학교 산학협력단
Priority date: 2006-05-24
Filing date: 2006-05-24
Publication date: 2007-12-04
Also published as: WO2007136226A1; US8067387B2; JP2009538295A; JP5133339B2; CN101490258B; ES2393125T3; CN101490258A; US20090275509A1; EP2021473A4; EP2021473A1; EP2021473B1; KR20070113500A

Abstract

본 발명은 Wnt 단백질의 보조수용체 억제단백질로서 알려진 DKK2 (Dickkopf-2)를 이용하여 혈관신생을 촉진하는 방법에 관한 것으로, 본 발명의 DKK2을 이용하여 혈관신생을 억제하는 방법은 포유동물의 조직에 DKK2 단백질을 암호화하는 DNA를 처리하는 단계를 포함한다. 또한, 본 발명의 DKK2 단백질을 암호화하는 DNA의 처리는 제대정맥내피세포, DKK2 과발현 세포주 및 DKK2 형질도입 마우스에서 혈관 형성을 효과적으로 촉진하므로 허혈성 질환의 치료를 위한 치료제 개발에 널리 활용될 수 있을 것이다.

DKK2, 혈관신생.

Description

ＤＫＫ2를 포함하는 혈관신생을 촉진시키는 방법 {A method for inducing angiogenesis using DKK2}

도 1a는 마트리젤 위에서 인간제대정맥내피세포 (HUVEC; Human umbelical vein endothelial cell)의 형태분화 과정을 3단계로 나누어 나타낸 도이고,

도 1b는 인간제대정맥내피세포의 형태분화 과정의 각 단계별 DKK2 유전자의 발현양상을 나타낸 도이며,

도 2a는 렌티바이러스를 이용한 DKK2 유전자 과발현 및 억제 세포주의 제작을 확인한 도이고,

도 2b는 DKK2 유전자 과발현 및 억제 세포주의 관 형성 정도를 비교한 도이고,

도 3은 DKK2가 Wnt 신호와는 독립적으로 베타-카테닌 (β-catenin) 단백질의 수준을 증가시킴을 나타낸 도이며,

도 4a는 DKK2 형질도입 마우스의 제작을 위한 벡터의 모식도이며,

도 4b는 DNA 증폭을 통해서 마우스의 DKK2 형질도입을 확인한 도이고,

도 4c는 정상 마우스와 DKK2 형질도입 마우스의 배 (embryo)에서 혈관발생정도를 비교한 도이며,

도 4d는 정상 마우스와 DKK2 형질도입 마우스의 배 (embryo)의 전반적인 혈관발생정도를 혈관특이적 발현 단백질인 vWF의 항체를 이용하여 나타낸 도이고,

도 4e는 정상 마우스와 DKK2 형질도입 마우스의 배 (embryo)에서 머리 부분의 대동맥의 발달 정도를 비교한 도이며,

도 4f는 정상 마우스와 DKK2 형질도입 마우스의 배 (embryo)에서 척추부분의 대동맥 및 곁사슬 동맥의 발달 정도를 비교한 도이다.

본 발명은 Wnt 단백질의 보조수용체 억제/촉진 단백질로서 알려진 DKK2 (Dickkopf-2)을 이용하여 혈관신생을 촉진시키는 방법에 관한 것이다.

혈관신생 (angiogenesis)이란 새로운 혈관이 생성되는 과정을 말하며, 정상적인 생체 조건에서는 드물게 일어나지만, 배발생, 황체 형성 또는 상처치료 과정에서는 반드시 수반되는 과정이다. 특히, 혈관신생은 종양이 다른 부위로 전이하는 경우 중요하게 작용함이 알려져 있다 (Folkman J and Klagsburn M, Science, 235(4787), pp442-447, 1987). 혈관신생이 일어나는 과정은 일반적으로 혈관신생 촉진인자의 자극에 의하여 프로테아제로 인한 혈관 기저막의 분해, 혈관 내피세포의 이동, 증식 및 혈관 내피세포 분화에 의한 관강의 형성으로 혈관이 재구성되어 새로운 모세혈관이 생성되는 것으로 이루어진다. 혈관생성 과정은 생장인자, 사이 토카인 (cytokine), 지질대사물질 및 지혈 단백질의 잠재성 단편 등 여러 종류의 촉진인자와 억제인자에 의해 엄격하게 통제되는 것으로 알려져 있다 (Folkman J, Nat. Med ., 1(1), pp27-31, 1995). 지금까지 보고된 혈관신생 촉진인자는 크게 몇 가지로 분리되는데, 세포성장을 유도하는 유도인자, 면역활성을 가지는 사이토카인, 호르몬 및 지질 산물 등이 대부분을 차지하고 있다 (Bussolino F et al., Trends. Biochem . Sci ., 22(7), pp251-256, 1997). 하지만 상기 촉진인자들은 혈관내피세포에만 특이적으로 작용하는 것이 아니라 다른 주변세포에도 영향을 주기 때문에 임상적으로 적용하기에는 많은 문제점을 드러내고 있다 (Malecki M et al., Gene Ther ., Supple 1, ppS159-169, 2005). 따라서 최근에는 혈관내피세포에 특이적으로 작용하는 즉 혈관형성과정에 관여하는 중요한 유전자를 발굴하여 이들 유전자를 이용하여 혈관신생이 요구되는 다양한 질환을 치료하는 방법에 적용하려고 연구가 활발히 이루어지고 있으나, 현재까지는 별다른 성과가 나타나지 않고 있는 실정이다.

혈관신생 치료법 (Therapeutic angiogenesis)은 혈관내피성장인자 (VEGF; vascular endothelial growth facotr), 섬유아세포성장인자 (FGF; fibroblast growth factor), Del-1 (developmentally regulated endothelial locus-1), HGF (hepathocyte growth factor), PD-EGF (platelet-derived endothelial cell growth factor), 안지오포이에틴 (angiopoietin), 변이성 성장인자 (TGF; transforming growth factor), 상피세포 성장인자 (EGF; epidermal growth factor) 등의 혈관생성인자 (angiogenic factor) 그 자체 또는 그를 제조하는 유전자를 허혈 부위에 투 여하여 측부혈관의 생성을 촉진시킴으로써, 허혈성 질환을 치료하는 방법으로, 경피적 동맥성형술 또는 동맥우회술을 시행할 수 없는 심한 허혈성 질환을 치료하기 위한 새로운 방법으로 대두되고 있다 (김덕경 및 권현철, 대한내분비학회지, 16(3), pp328-338, 2001).

DKK2는 Wnt의 억제 단백질인 Dickkopf류의 일종으로서, Wnt 신호전달경로의 저해 혹은 활성 인자로 작용하는 것으로 보고되고 있다 (Wu W et al., Curr . Biol., 10(24), pp1611-1614, 2000). DKK2는 두개의 특징적인 시스테인이 많은 부위 (cysteine-rich domain) 가지고 있으며 다양한 길이의 연결부위로 구분되어있다. 특이 시스테인-2 부분은 이들 Dickkopf류 간에 고도로 보존되어 있으며 10개의 보존된 시스테인 아미노산을 포함하고 있다 (Krupnik VE et al., Gene, 238(2), pp301-313, 1999). DKK2는 파골세포의 분화에 밀접하게 관계되어 있는 것으로 보고되었으나 (Li X et al., Nat . Genet ., 37(9), pp945-952, 2005), 지금까지 DKK2의 혈관 신생에 대한 촉진 효과에 대한 기술내용이 교시되거나 기재된 바 없다.

이에 본 발명자들은 혈관내피세포의 분화과정을 조절하는 유전자를 발굴하고 기능을 규명하여 안전하면서도 효과적으로 혈관신생을 촉진할 수 있는 방법을 개발하고자 예의 연구 노력한 결과, Wnt 단백질의 보조 수용체 억제/촉진 단백질로 알려진 DKK2 단백질을 암호화하는 DNA를 생체에 형질감염 또는 형질도입 시켰을 때, 혈관신생을 효과적으로 촉진하여 허혈성 질환의 치료에 활용될 수 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 DKK2 (Dickkopf-2) 단백질을 암호화하는 DNA를 이용하여 혈관신생을 촉진시키는 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 사람을 제외한 포유동물의 혈관이 형성되지 않은 조직에 DKK2 (Dickkopf-2) 단백질을 암호화하는 DNA를 처리하는 단계를 포함하는 혈관신생을 촉진시키는 방법을 제공한다.

본원 발명의 혈관이 형성되지 않은 조직은 허혈성 질환에 의하여 손상된 후, 새로이 형성된 진피조직, 근육조직 또는 결합조직인 것을 특징으로 한다.

본원 발명의 허혈성 질환은 화상, 건선, 궤양, 허혈, 심근경색, 협심증 또는 뇌혈관성 질환을 포함한다.

본원 발명의 DKK2 (Dickkopf-2) 단백질을 암호화하는 DNA는 비바이러스성 벡터 또는 바이러스성 벡터를 사용하여 조직 내로 전달됨을 특징으로 한다.

본원 발명의 비바이러스성 벡터는 동물 세포에서 발현될 수 있는 플라스미드를 포함함을 특징으로 한다.

본원 발명의 바이러스성 벡터는 아데노바이러스 벡터, 아데노관련 바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터 또는 단순포진 바이러스 벡터를 포함함을 특징으로 한다.

또한, 본원 발명은 DKK2 단백질을 암호화하는 DNA를 유효성분으로 포함하는 허혈성 질환의 예방 및 치료용 약학조성물을 제공한다.

이하, 본 발명은 상세히 설명한다.

본 발명은 서열번호: 1의 아미노산 서열을 갖는 DKK2 (Dickkopf-2) 단백질 또는 이를 암호화하는 서열번호 :2의 염기 서열인 DKK2 단백질을 암호화하는 DNA를 처리하는 단계를 포함하는 혈관신생을 억제시키는 방법을 제공하나, 본 발명의 DKK2은 상기 서열에 한정되는 것은 아니며, 모든 포유동물의 DKK2을 포함한다.

본 발명의 DKK2 단백질을 암호화하는 DKK2 유전자는 하기와 같이 수득될 수 있다.

혈관내피세포의 총 RNA를 분리하여 역전사하여 얻은 상보적 DNA를 주형으로 하여 DKK2 프라이머, 바람직하게는 서열번호 5 및 6의 프라이머를 사용한 중합반응으로 증폭된 DKK2 유전자를 수득할 수 있다.

상기 방법으로 수득한 DKK2 (Dickkopf-2) 단백질을 암호화하는 DNA를 형질감염시킨 DKK2 과발현 세포주는 관 형성이 촉진되었고, DKK2 (Dickkopf-2) 단백질을 암호화하는 DNA를 형질도입시킨 마우스의 배 (embryo)는 전체적으로 혈관발생이 촉진되어 본 발명의 DKK2는 탁월한 혈관생성 촉진 활성을 나타냄을 확인할 수 있었다.

또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 혈관신생을 촉진하는 DKK2 단백질을 암호화하는 DNA를 유효성분으로 함유하는 허혈성 질환의 예방 또는 치료용 약학조성물을 제공한다.

본 발명의 조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다.

본 발명의 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 본 발명의 추출물을 포함하는 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 추출액에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 조성물의 유효성분인 DKK2 (Dickkopf-2) 단백질을 암호화하는 DNA를 환부에 지속적으로 공급하기 위해 상기 DNA를 삽입할 수 있는 벡터로는 아데노바이러스 (adenovirus) 벡터, 아데노관련 바이러스 (adeno-associated virus) 벡터, 레트로바이러스 (retrovirus) 벡터, 렌티바이러스 (lentivirus) 벡터, 단순포진 바이러스 (herpes simplex virus) 벡터 또는 동물 세포에서 발현될 수 있는 플라스미드에 포함됨을 특징으로 한다.

본 발명의 조성물의 투여 형태는 주사제에서 통상적으로 사용되는 어떠한 기제라도 사용 가능하다. 예를 들어, 기재는 증류수, 염화나트륨 염 용액, 염화나트륨 및 무기물염의 혼합물 또는 그와 유사한 혼합물, 만니톨, 락토스, 덱스트란, 글루코스 등의 용액, 글리신, 아르기닌 같은 아미노산 용액, 유기산 용액 또는 염 용액 및 글루코스 용액의 혼합 및 이와 유사한 용액 등을 포함한다. 또한, 주사제는 통상의 방법으로 삼투압 조절제, pH 조절제, 참기름이나 콩기름과 같은 식물성 기름, 또는 레시틴, 비이온성 표면활성제와 같은 표면활성제를 상기한 기재에 첨가하여 용액, 현탁액 또는 콜로이드 용액 등으로 제조할 수 있다. 이러한 주사제는 분말형, 동결건조형 등으로 제조하여 사용하기 바로 전에 용해하여 쓸 수도 있다.

본 발명에 따른 조성물은 고체상인 경우 유전자 치료 바로 전에 필요하면 미리 멸 균한 기재에 용해하여 사용하거나, 액상인 경우 별도의 처리 없이 그대로 사용할 수 있다.

본 발명의 단백질을 암호화하는 DNA의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 달라질 수 있으며, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나 바람직한 효과를 위해서, 혈관신생에 의해 유발되는 질환 부위에 국부적으로 0.0001 내지 1000 mg/㎏의 양을 1주에 1회 내지 수회 투여하거나, 수술 이후에 카테터 (catherter)와 같은 것을 통해 일회 투여하여 목표 지점에서 흡수되도록 할 수 있다. 그 투여량은 투여경로, 질환의 정도, 성별, 체중, 나이 등에 따라서 증감될 수 있다. 따라서 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

본 발명의 단백질을 암호화하는 DNA는 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내(intracerebroventricular) 주사에 의해 투여될 수 있다.

이하, 본 발명을 하기의 참조예 및 실험예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 참조예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 참조예 및 실험예에 의해 한정되는 것은 아니다.

참조예 1. 인간 제대정맥내피세포 ( HUVEC )의 배양

연세대학병원 산부인과에서 분리 받은 산모의 탯줄 정맥으로부터 하기의 과정으로 혈관세포를 분리하였다. 코드 버퍼 (Cord buffer; 0.2% glucose phosphate buffered saline)로 혈관을 세척 후, 0.2 % 타입 I 콜라게나아제 (type Ⅰ collagenase, Sigma-Aldrich Co., MO, USA)를 정맥에 약 5 ㎖ 가량 넣은 후 37 ℃에서 5분간 방치했다. 실온에서 코드 버퍼 20 ㎖을 정맥에 넣고 반대편으로 분리되어 나온 혈관세포를 수집하고, 다시 한번 코드 버퍼만을 혈관에 주입하여 37 ℃에서 반응시킨 후 혈관세포인 사람 제대정맥 내피세포 (HUVEC; Human umbelical vein endothelial cell)를 수집하고 세척하여, 0.1 % 젤라틴 (gelatin)이 코팅된 조직배양용 T75 플라스크에 주입하였다. 배양배지는 EGM^TM-2 완전배지 (EGM^TM-2 complete medium, Cambrex, MD, USA)를 이용하여 37 ℃, 5% CO₂ 배양기에서 배양하고, confluent 상태가 되면 트립신-EDTA용액을 분리하여 세포를 분리하고, 3 내지 6 세대 (passage)의 세포를 실험에 사용하였다.

참조예 2. 렌티바이러스 벡터를 이용한 DKK2 과발현 및 억제 세포주 구축

인간 DKK2 유전자를 렌티바이러스 벡터에 클로닝 하여 제작한 플라스미드를 바이러스 생산 세포주에 형질 도입한 DKK2 과발현 및 억제 세포주로부터 수득한 DKK1 바이러스를 벡터코리아 (vectorcorea, 충청남도, 대한민국)로부터 제공 (최근 (주)마크로젠(Macrogen Inc., Korea)에 인수 합병되어, (주)마크로젠에서 바이러스 제작 관련 업무를 수행하고 있음)받아 상기 참조예 1에서 준비한 인간제대정맥내피세포에 첨가시킨 뒤 48시간 후 이들 세포로부터 RNA를 분리하여 하기의 역전사 및 중합반응을 실시하여 DKK2 유전자 발현 양상을 확인하였다. 트리졸 액 (TRIzol reagent, Invitrogen, 미국)을 이용하여 총 RNA를 분리한 후 oligo (dT) 프라이머 및 역전사효소 (Promega, 미국)를 사용하여 역전사한 후, 중합효소 (Stratagen, 미국)를 이용하여 하기의 조건, 상세하게는 94 ℃에서 5분간 전변성 (pre-denaturation)한 후, 94 ℃에서 30초간 변성 (denaturation), 50 ℃에서 30초간 프라이머를 결합 (annealing), 72 ℃에서 30초간 연장 (extension)함을 1회로 하여 중합반응은 총 30회 반복하였으며, 그 결과를 하기 도 2a에 나타내었다.

하기 도 2a에 나타난 바와 같이, 렌티바이러스 시스템을 이용한 DKK2의 과발현 또는 발현 억제 세포주가 잘 제작되었음을 확인할 수 있었다.

참조예 3. DKK2 형질도입 마우스 제작

생체 내 (in vivo)에서 DKK2 유전자가 혈관신생에 미치는 효과를 분석하기 위하여 혈관내피세포에서만 활성화되는 Tie2 전사조절부위를 이용하여 혈관에만 과잉 발현되는 마우스를 제작하였다 (Schlaeger TM et al., Proc . Natl. Acad . Sci . USA, 94(7), 3058-3063, 1997). 상기 마우스의 제작을 위하여 도 4a의 모식도에 나타난 바와 같이, 서열번호 4의 마우스 DKK2 유전자를 제한효소 HindⅢ 및 NotI (NEB, 영국)를 처리한 후 형질도입 벡터 (pSP vector, Clontech, 미국)에 삽입하여 클로닝하였다 (도 4a 참조). 상기 플라스미드를 제한효소 SalI (NEB, 영국)으로 처리하여 직선화시켜 DNA 절편을 만들었으며, 성선자극호르몬방출호르몬 (Gonadotropin, Sigma, 미국)으로 배란을 촉진시킨 마우스 (C57BL6, 오리엔트, 한국)로부터 분리한 난자들에 주입하여 형질도입시킨 후, 수정하여 대리모 마우스 (ICR, 오리엔트, 한국)에 넣어 착상시켰다. 21일 후 태어난 마우스의 꼬리를 잘라 단백질 분해효소 K (proteinase K, Sigma, 미국)를 처리하여 DNA를 분리한 후, 서열번호 7 및 8의 DKK2 프라이머를 이용하여 증폭 [94 ℃에서 5분간 전변성, (94 ℃에서 30초간 변성, 55 ℃에서 30초간 결합, 72 ℃에서 30초간 연장) x 30회, 72℃에서 10분간 후연장 하여 형질도입된 마우스를 확인하였다 (도 4b 참조).

실험예 1. 제대정맥내피세포의 분화과정동안 DKK2 의 발현 양상

10㎎단백질/㎖ 농도의 마트리젤 (Matrigel, Collaborative Biomedical Products, USA) 250㎕을 직경 16㎜의 세포배양 웰에 넣어 37℃에서 30분간 중합시켰다. 참조예 1의 인간제대정맥내피세포를 20 %(v/v) 우태아혈청 (FBS; fetal bovine serum, Hyclone, 미국), 100 units/㎖ 페니실린 (penicillin, Invitrogen, 미국), 10㎍/㎖ 스트렙토마이신 (streptomycin,Invitrogen, 미국), 3ng/㎖ 섬유아세포 성장인자 (bFGF; basic fibroblast growth factor, Upstate Biotechnology, USA), 5 units/㎖ 헤파린 (heparin, Sigma, 미국)을 포함한 M199 성장배지(Invitrogen, USA)에서 배양하고 트립신을 처리하여 수득한 후, 이를 상기 성장배지로 다시 부유시켜 준비된 마트리젤 층에 2 ×10⁵세포/웰의 농도로 깔아주고 분화를 유도하였다 (도 1a 참조). 분화과정은 세포분화정도에 따라 크게 세 단계로 구분하였으며, 상세하게는 대조군으로 쓰인 분화시작단계의 1단계, 세포가 이동하여 혈관을 만들기 시작하는 단계의 2단계, 완전히 혈관 형태로 분화한 단계의 3단계이다. 트리졸 용액 (TRIZOL reagent, Invitrogen, 미국)을 이용하여 각 단계의 세포로부터 RNA를 분리하여 서열번호 5 및 6의 프라이머를 사용하여 참조예 4의 중합반응 조건과 같이 역전사 및 증폭시킨 후 DKK2 유전자 발현 양상을 확인하였다 (도 1b 참조).

하기 도 1b에 나타난 바와 같이, DKK2 유전자는 관 형성 과정 동안 그 발현이 현저히 증가하다가 감소하는 양상을 보였으며 상기 실험 결과는 DKK2가 관 형성의 양성적 조절인자로 작용할 수 있음을 나타낸다.

실험예 2. DKK2 과발현 또는 발현억제 세포주에서 관 형성에 미치는 DKK2 의 효과

10㎎단백질/㎖ 농도의 마트리젤 (Matrigel, Collaborative Biomedical Products, USA) 250㎕을 직경 16㎜의 세포배양 웰에 넣어 37℃에서 30분간 중합시켰다. 참조예 2a의 DKK2 과발현 혹은 억제 세포주를 20 %(v/v) 우태아혈청 (FBS; fetal bovine serum, Hyclone, 미국), 100 units/㎖ 페니실린 (penicillin, Invitrogen, 미국), 10㎍/㎖ 스트렙토마이신 (streptomycin, Invitrogen, 미국), 3ng/㎖ 섬유아세포 성장인자 (bFGF; basic fibroblast growth factor, Upstate Biotechnology, USA), 5 units/㎖ 헤파린 (heparin, Sigma, 미국)을 포함한 M199 성장배지(Invitrogen, USA)에서 배양하고 트립신을 처리하여 수득한 후, 이를 상기 성장배지로 다시 부유시켜 준비된 마트리젤 층에 2 ×10⁵세포/웰의 농도로 깔아주고 20시간 동안 배양한 후, 형성된 관모양 형성도를 광학 이미지 기술로 촬영하였다 (도 2b 참조). 이때, 대조군으로는 렌티바이러스를 감염시킨 실험군을 사용하였다.

상기 도 2b에 나타난 바와 같이, DKK2가 과발현된 세포주에서는 관 형성이 촉진되었으며, DKK2의 발현을 억제시킨 세포주에서는 오히려 관형성이 억제되었다.

실험예 3. 베타- 카테닌 (β- catenin )의 안정화에 미치는 DKK2 의 효과

상기 참조예 2에서 언급한 DKK2를 과발현하는 렌티바이러스를 인간 제대정맥내피세포에 참조예 2와 동일한 방법으로 첨가하여 전염시키고 24시간 후 배지를 20 %(v/v) 우태아혈청 (FBS; fetal bovine serum, Hyclone, 미국), 100 units/㎖ 페니실린 (penicillin, Invitrogen, 미국), 10㎍/㎖ 스트렙토마이신 (streptomycin, Invitrogen, 미국), 3ng/㎖ 섬유아세포 성장인자 (bFGF; basic fibroblast growth factor, Upstate Biotechnology, USA), 5 units/㎖ 헤파린 (heparin, Sigma, 미국)을 포함한 M199 성장배지(Invitrogen, USA)로 교체함과 동시에 Wnt 분비 억제제인 sFrizzle (BD bioscience, 미국)를 200 ng/㎖처리한 뒤 24시간동안 배양하였다. 상기 배양된 세포를 트립신을 처리하여 수득한 후, 파쇄완충액 (lysis buffer; 100mM Tris/Cl, 5mM EDTA, 50mM Nacl, 50 mM beta-glycerophosphate, 50 mM NaF, 100uM Na₃VO₄, 1 mM PMSF, 0.5% NP-40, 1% Triton X-100)을 이용하여 세포 내 단백질을 채취하여 베타-카테닌 항체 (β-catenin Ab, Upstate Biotechnology, 미국)를 이용한 웨스턴-블롯 (western blot) 기법을 이용하여 베타-카테닌 단백질의 발현 수준을 확인하였다.

상기 실험 결과 도 3에 나타난 바와 같이, DKK2는 대조군 (eGFP)과 비교하여 베타-카테닌 단백질의 발현 수준을 증가시켰으며 이러한 효과는 Wnt 억제제 (sFz)를 처리하였을 때도 감소하지 않았다. 상기의 결과는 DKK2는 Wnt와는 독립적으로 베타-카테닌 단백질의 발현 수준을 조절함으로써 혈관 신생을 촉진시킨다는 것을 나타내는 것이다.

실험예 4. DKK2 형질도입 마우스의 배 ( embryo )에서 혈관발생에 미치는 DKK2 의 효과

임신한지 9-10일 지난 정상 마우스와 DKK2가 형질도입된 마우스의 배들을 꺼내어 4% 파라포름알데히드 (paraformaldehyde)에 담궈 하루 동안 고정시킨 후 배의 전반적인 혈관발생을 관찰하였으며 (도 4c 참조), 혈관내피세포에만 특이적으로 발현하는 단백질인 폰 빌레브란트 인자 (von Willebrand Factor (vWF)의 항체 (Chemicon, 미국)를 이용하여 염색한 후 혈관의 발생 정도를 관찰하여 하기 도 4d에 나타내었다 (Sadler JE, J. Thromb . Haemost ., 3(8),pp1702-1709, 2005). 도 4c 및 4d에 나타난 바와 같이, DKK2가 혈관에 과잉 발현된 배에서는 전반적인 혈관의 발생이 촉진되어있는 것을 확인할 수 있었다.

DKK2가 다른 부위의 혈관발생 억제에 미치는 효과를 확인하기 위하여, 상기와 같이 준비한 배의 척추부분 대동맥 및 곁사슬 동맥의 발달 정도를 하기와 같이 형광 염색하였다. 상기 배를 30 % 자당 (sucrose) 용액에서 하루 동안 탈수화 한 후 -70 ℃에서 동결하고, 동결된 조직을 10 ㎛ 두께로 잘라 슬라이드에 붙이고 염소 혈청으로 2시간 동안 블로킹 (blocking) 시킨 뒤 폰 빌레브란트 인자 [von Willebrand Factor (vWF)]의 항체를 1차 항체로 사용하여 4℃에서 하루 동안 처리하였다. 다음날 혈관세포 염색을 위한 녹색 형광물질 및 혈관주위의 평활근세포 염색을 위한 빨간색 형광물질이 붙어있는 2차 항체를 1시간 동안 처리하여 커버글라스를 덮은 뒤 형광 현미경하에서 관찰하여 하기 도 4e 및 도 4f에 나타내었다. 하기 도 4e 및 도 4f에 나타난 바와 같이, DKK2가 형질도입된 마우스에서는 척추부분의 대동맥 및 곁사슬 동맥의 발달이 촉진되어있음을 확인할 수 있었다.

상기에서 상세히 설명하고 입증하였듯이, 본 발명은 DKK2를 이용하여 혈관신생을 촉진하는 방법을 제공한다. 본 발명의 DKK2를 이용하여 혈관신생을 촉진시키는 방법은 포유동물의 조직에 DKK2 단백질을 암호화하는 DNA를 형질감염 또는 형질도입하여 발현시키는 단계를 포함한다. 본 발명의 DKK2는 혈관형성을 효과적으로 촉진하므로, 허혈성 질환의 예방 및 치료를 위한 치료제 개발에 널리 활용될 수 있을 것이다.

서열목록 전자파일 첨부

Claims

사람을 제외한 포유동물의 혈관이 형성되지 않은 조직에 서열번호 3으로 표기되는 DKK2 (Dickkopf-2) 단백질을 암호화하는 서열번호 4로 표기되는 DNA가 클로닝 된 렌티바이러스 벡터를 투여하는 단계를 포함하는 혈관신생을 촉진시키는 방법.
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