CN101490258B - 应用dkk2刺激血管生成的方法以及含有dkk2的组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种通过使用DKK2来刺激血管生成的方法以及含有DKK2的组合物。本发明的DKK2蛋白表现出对HUVEC上血管形成的刺激活性，对动脉环组织出芽的促进活性以及对小鼠胚胎中血管发育的促进活性。因此，它可以用作用于治疗和预防缺血性疾病的治疗性或功能性保健食品。

Description

应用DKK2刺激血管生成的方法以及含有DKK2的组合物
技术领域
本发明涉及一种利用DKK2蛋白来刺激血管生成的方法以及含有DKK2蛋白的组合物。
背景技术
血管生成是新的毛细血管形成的过程。该过程在正常的生物学条件下很少发生，而总是伴随胚胎发生、黄体形成以及创伤愈合而发生。特别地，血管生成在肿瘤转移中发挥重要作用(Folkman J和Klagsburn M，Science，235(4787)，pp.442-447，1987)。
血管生成过程包括四个步骤，即，第一步是通过血管生成因子的刺激导致蛋白酶作用而使毛细血管基膜分离，第二步是血内皮细胞迁移和增殖，第三步是由于血内皮细胞的分化而形成毛细血管以及第四步是新毛细血管的重建。
已经报道了血管生成过程受各种刺激因子和抑制因子的调控，例如生长因子、细胞因子、脂类代谢物质、止血蛋白(haemostaticprotein)的隐原性片断等(Folkman J.Nat.Med.，1(1)，pp.27-31，1995)。血管生成刺激因子可以分成若干类，例如，主要是细胞生长诱导因子、具有免疫活性的细胞因子、激素和脂类产物等(Bussolino F等，Trends.Biochem.Sci.，22(7)，pp.251-256，1997)。
然而，由于刺激因子不仅作用于血管内皮细胞上而且还作用于其他的相邻细胞上，因此其在应用于临床使用时具有各种问题(Malecki M等，Gene Ther.，Supple 1，pp.S159-169，2005)。
因此，最近的研究集中在找到只作用于血内皮细胞的重要基因、尤其是在血管生成中涉及的基因，以及利用该基因治疗需要血管生成的各种疾病的新方法。但是，至今仍未得到令人满意的结果。
治疗性血管生成是通过给予血管生成因子，如血管内皮生长因子(VEGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、发育调节内皮基因座-1(developmentally regulated endothelial locus-1，Del-1)、肝细胞生长因子(HGF)、血小板源性内皮细胞生长因子(PD-EGF)、血管生成素、转化生长因子(TGF)和表皮生长因子(EGF)等或编码它们的基因以促进侧支血管形成从而治疗缺血性疾病的方法，该方法作为用于治疗不能实施经皮冠状动脉腔内血管成形术(PTCA)和冠状动脉旁路移植术(CABG)方法的严重缺血性疾病的一种新方法尤其突出(Kim D.K.和Kwon H.C.，Thejournal of endocrinology，16(3)，pp.328-3382001)。
DDK2是Wnt蛋白的抑制蛋白，据报道其作为Wnt信号通路的抑制因子或刺激因子起作用(Wu W等，Curr.Biol.，10(24)，pp.1611-1614，2000)。它具有两个特异性的富含半胱氨酸的结构域，并分成各种长度的连接区域。特别地，属于Dickkopf家族的该蛋白在家族成员之间具有高度保守的半胱氨酸-2区域(cystein-2)以及10个半胱氨酸(Krupnik VE等，Gene，238(2)，pp.301-313，1999)。据报道，DKK2与破骨细胞的分化密切相关(Li X等，Nat.Genet.，37(9)，pp.945-952，2005)。
然而，在上述引用的任何文献中都没有报道或披露关于DKK2对血管生成的刺激活性的作用，这些披露内容结合于此作为参考。
发明内容
技术问题
因此，本发明的发明人进行了深入研究以找到内皮细胞中的多个分化控制基因以及用于刺激血管生成的新的有效方法，最后，他们发现DKK2对于血管生成表现出潜在的刺激作用，因此该蛋白可用于治疗和预防缺血性疾病。
技术方案
根据本发明，本发明提供了一种用于刺激哺乳动物血管生成的方法，该方法包括向哺乳动物的未形成血管的组织给予有效量的DKK2蛋白或编码DKK2蛋白的DNA的步骤。
本文中所披露的术语“哺乳动物的未形成血管的组织”包括在哺乳动物中由缺血性疾病造成损伤后新形成的皮肤组织、肌肉组织和***。
本文中所披露的术语“缺血性疾病”包括烧伤、牛皮癣、溃疡、局部缺血、心肌梗塞、心绞痛、脑梗塞或脑出血。
本文中所披露的术语“编码DKK2蛋白的DNA”通过使用病毒载体或非病毒载体而给予哺乳动物。
本文中所披露的术语“非病毒载体”包括能够在动物细胞中表达的质粒。
本文中所披露的术语“病毒载体”包括腺病毒载体、腺伴随病毒载体、反转录病毒载体、慢病毒载体或单纯性疱疹病毒载体。
本发明的另一个目的是提供一种以有效量包含作为活性成分的DKK2蛋白或编码DKK2蛋白的DNA以治疗和预防缺血性疾病的药物组合物。
本发明的其他目的是提供DKK2蛋白或编码DKK2蛋白的DNA用于制造治疗或预防缺血性疾病所采用的药物的应用。
本发明的其他的目的是提供一种用于治疗或预防缺血性疾病的方法，其中所述方法包括向患有血管生成引起的疾病的哺乳动物中给予治疗有效量的DKK2蛋白或编码DKK2蛋白的DNA。
而且，本发明的另一个目的是提供一种以有效量包含作为活性成分的DKK2蛋白或编码DKK2蛋白的DNA以预防和缓解缺血性疾病的保健食品组合物。
本文中披露的术语“DKK2蛋白”包括由SEQ ID NO：1表示的氨基酸。
本文中披露的术语“编码DKK2蛋白的DNA”包括由SEQ IDNO：2表示的基因。
上述DKK2序列不限于一种哺乳动物的DKK2序列，而是包括所有的哺乳动物中的DKK2。
上述DKK2蛋白包括从哺乳动物的组织中分离的DKK2蛋白或重组DKK2蛋白。
本发明的DKK2蛋白或编码DKK2蛋白的DNA可以根据以下优选实施例来制备。
对本发明详述如下。
对于本发明，可以通过以下的步骤来制备上述DKK2蛋白和编码该蛋白的基因。对从HUVEC中纯化的总RNA进行反转录以得到互补DNA；用得到的互补DNA作为模板并使用DKK2引物，优选由SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6表示的DKK2引物，进行PCR以获得扩增的DKK2基因。
通过以下方法可以得到上述DKK2蛋白，例如，用限制性内切酶处理由上述步骤制备的DKK2基因，将其克隆到质粒中以获得可克隆并转化表达细胞系的质粒；筛选转化细胞并用柱纯化培养基中的分泌的DKK2蛋白；或将通过上述步骤制备的DKK2基因引入载体、优选慢病毒载体中，在培养基中培养，并用柱纯化培养基中的分泌的DKK2蛋白。
通过上述步骤制备的引入DKK2的细胞系(DKK2-induced celllines)以及DKK2基因表现出在HUVEC上对血管形成的刺激活性、对动脉环组织出芽的促进活性以及对小鼠胚胎血管发育的促进活性。另外，全长DKK2，以及DKK2的片段，都表现出彼此类似的对血管生成的刺激活性。
本发明的另一个目的是提供一种以有效量包含由上述方法制备的DKK2蛋白或编码DKK2蛋白的DNA作为活性成分以治疗和预防缺血性疾病的药物组合物。
本发明的其他目的是提供由上述方法制备的DKK2蛋白或编码DKK2蛋白的DNA用于制造治疗或预防缺血性疾病所采用的药物的应用。
本发明的其他目的是提供一种用于治疗或预防缺血性疾病的方法，其中所述方法包括向患有缺血性疾病的哺乳动物给予治疗有效量的由上述方法制备的DKK2蛋白或编码DKK2蛋白的DNA。
本发明的用于治疗缺血性疾病的组合物可以包括基于该组合物总重量的以重量计0.1-50％的上述DKK2蛋白或编码该蛋白的DNA。
本发明的组合物可以根据本领域公知的使用方法而另外含有常规的载体、佐剂或稀释剂。可优选的，所述载体根据其用途和使用方法作为适当物质而使用，但并不限于此。Remington’sPharmaceutical Science(Mack Publishing co，Easton PA)的著述中列出了适宜的稀释剂。
在下文中，以下的配制方法和赋形剂仅仅是例示性的而决不是限制本发明。
根据本发明的组合物可以作为含有药用载体、佐剂或稀释剂，例如，乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露糖醇、木糖醇、赤藻糖醇、麦芽糖醇、淀粉、***胶、藻酸盐、明胶、磷酸钙、硅酸钙、纤维素、甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、水、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石、硬脂酸镁和矿物油的药物组合物而提供。该配制物可以另外包括填料、抗凝剂、润滑剂、润湿剂、调味剂、乳化剂、防腐剂等。可以这样配制本发明的组合物，使得采用本领域公知的任何方法将其给予患者后，能够提供活性成分的快速、持续或延缓的释放。
例如，可以使本发明的组合物溶解在通常用于制造注射液的油、丙二醇或其他溶剂中。适宜的载体的实例包括生理盐水、聚乙二醇、乙醇、植物油、豆蔻酸异丙酯等，但不限于此。为了局部给予，本发明的组合物可以制成软膏和乳膏剂型。
含有本组合物的药物配制物可以以任何形式制备，例如口服剂型(粉剂、片剂、胶囊剂、软胶囊剂、水溶性药物、糖浆剂、酏剂、丸剂、粉剂、囊剂、颗粒剂)，或局部制剂(乳膏剂、软膏剂、洗剂、凝胶、膏剂(balm)、贴剂、糊剂、喷雾溶液、气雾剂等)，或可注射的制剂(溶液、混悬液、乳液)。
例如，可以将本发明的组合物溶解在通常用于制备注射液的油、丙二醇或其他溶剂中。注射液中适宜的基质或载体的实例包括各种盐混合物，例如生理盐水、无机盐或它们的混合物；糖溶液，例如甘露糖醇、乳糖、葡聚糖等；氨基酸，例如甘氨酸、精氨酸等；聚乙二醇、乙醇、植物油、豆蔻酸异丙酯、有机酸溶液、盐溶液、或它们的混合物等，但不限于此。本发明的可注射制剂可以通过在注射液中向上述基质加入常规的添加剂，如渗透调节剂、pH调节剂、植物油、卵磷脂、表面活性剂(如非离子表面活性剂)以制成适宜的配制物，如溶液、混悬液、胶体溶液等，来进行制备。在本发明的固体组合物的情况下，在遗传治疗原位使用之前，将该组合物溶解在已灭菌的基质中，而本发明的液体组合物可以直接使用而无需特别处理。
为了局部给予，可以将本发明的组合物制成软膏和乳膏剂型。
药物剂型的本发明的组合物可以以它们的药物学可接受的盐的形式使用，并且也可以单独使用或与其他药学活性成分适当联用及组合使用。
提供到受损部位的本文中披露的编码DKK2蛋白的DNA可以以***载体，如腺病毒载体、腺伴随病毒载体、反转录病毒载体、慢病毒载体、单纯性疱疹病毒载体或在哺乳动物细胞中表达的质粒的形式使用。
本发明组合物的所需剂量根据受治疗者的病况和体重、严重程度、药物形式、给予的途径和时期而不同，并可以由本领域技术人员来选择。然而，为了得到所需的效果，通常建议以0.001-100mg/kg体重/天，优选0.1-100mg/kg体重/天的用量范围给予本发明的蛋白或DNA。该剂量可以每天给药一次或分为几次给药。
本发明的另一个目的是提供一种含有DKK2蛋白或编码DKK2蛋白的DNA作为活性成分用于预防和改善缺血性疾病的保健食品。
可以将上述组合物加入食品、添加剂或饮料中，其中，对于保健食品组合物，食品或饮料中上述蛋白或DNA的量通常为食品总重量的约0.01-95w％，优选1-80w％。
本发明提供了一种含有DKK2蛋白或编码DKK2蛋白的DNA用于预防和缓解哺乳动物中缺血性疾病的保健饮料组合物。
为了开发保健食品，含有上述本发明的DKK2蛋白或编码DKK2蛋白的DNA的可添加食品的实例是各种食品、饮料、口香糖、复合维生素、健康改善食品等，并且可以作为粉剂、颗粒剂、片剂、咀嚼片、胶囊或饮料等使用。
本发明的组合物无毒性和副作用，因此它们可以安全使用。
可以将本文中上述的组合物加入食品、添加剂或饮料中，其中，在食品或饮料中的上述DKK2蛋白或编码DKK2蛋白的DNA的量，对于保健食品组合物通常为食品总重量的约0.01-80w/w％，优选0.01-15w/w％，而对于100ml保健饮料组合物的比例为0.02-5g，优选0.3-1g。
只要本发明的保健饮料组合物含有所示比例的上述DKK2蛋白或编码DKK2蛋白的DNA作为基本成分即可，对其他液体成分没有特别限制，其中其他成分可以是各种甜味剂(deodorant)或天然的碳水化合物等，就像传统的饮料一样。前述的天然碳水化合物的实例是单糖，如葡萄糖、果糖等；二糖，如麦芽糖、蔗糖等；常规的糖(conventional sugar)，如糊精、环糊精；以及糖醇，如木糖醇、和赤藻糖醇等。作为除前述甜味剂之外的其他甜味剂，天然甜味剂如奇异果甜蛋白(taumatin)、甜菊提取物(例如levaudioside A)、甘草甜素等，以及合成甜味剂如糖精、阿斯巴甜等可有利地应用。在100ml本饮料组合物中，上述天然碳水化合物的量的比例通常为约1-20g，优选5-12g。
除前述组合物之外的其他成分是各种营养素，维生素、矿物质或电解质、合成调味剂(或矫味剂)、在乳酪巧克力等情况中的染色剂和改良剂、果胶酸及其盐、海藻酸及其盐、有机酸、保护胶体粘合剂(protective colloidal adhesive)、pH调节剂、稳定剂、防腐剂、甘油、醇、用于碳酸饮料等中的碳酸化剂(carbonizing agent)等。除上述成分之外的其他成分可以是用于制备天然果汁、果汁饮料和蔬菜饮料的果汁，其中该成分可以单独使用或组合使用。该成分的比例不太重要，但一般范围是每100w/w％本组合物中约0-20w/w％。含有本文中前述提取物的可添加食品的实例是各种食品、饮料、口香糖、复合维生素、健康改善食品等。
本发明的组合物可以另外包括有机酸，如柠檬酸、富马酸、己二酸、乳酸、苹果酸；磷酸盐，如磷酸盐、磷酸钠、磷酸钾、酸式焦磷酸盐、多磷酸盐；天然抗氧化剂，如多酚、儿茶素、α-生育酚、迷迭香提取物、维生素C、绿茶提取物、甘草根提取物、壳聚糖、鞣酸、植酸等中的一种或多于一种。
上述本发明的DKK2蛋白或编码DKK2蛋白的DNA可以是20-90％的高浓缩液体、粉末或颗粒形式。
类似地，上述DKK2蛋白或编码DKK2蛋白的DNA可以另外含有乳糖、酪蛋白、右旋糖、葡萄糖、蔗糖和山梨糖醇中一种或多于一种。
因此，本发明的DKK2蛋白或编码DKK2蛋白的DNA无毒性和副作用；它们可以安全地使用。
对于本领域技术人员来说显而易见的是，在不背离本发明的精神或范围的前提下，可以对本发明的组合物、使用和制备进行各种修改和改变。
有利效果
如本发明中所述，该DKK2蛋白或编码DKK2蛋白的DNA表现出对在HUVEC上血管形成的刺激活性、对动脉环组织出芽的促进活性以及对小鼠胚胎中血管发育的促进活性。因此，它可以用作用于治疗和预防缺血性疾病的治疗性或功能性保健食品。
附图说明
将以下详细描述与附图结合，可以更清楚地理解本发明的上述和其他目的、特征以及其他优点，其中：
图1示出了在基质胶(Matrigel)上HUVEC(人脐静脉内皮细胞)的分化特征。
图2表示在HUVEC分化中DKK2基因的表达，
图3表示使用慢病毒的DKK2表达细胞系和DKK2抑制细胞系的产生结果，
图4示出了在DKK2表达和抑制细胞系上血管形成的比较结果，
图5表示通过不同于Wnt信号的DKK2处理使β-连环蛋白增加的结果，
图6表示用于产生DKK2转基因小鼠的载体图，
图7表示通过DNA扩增对DKK2转基因小鼠的验证，
图8表示诱导内皮细胞从DKK2转基因小鼠的主动脉出芽，
图9示出了使用血管特异性蛋白vWF的抗体在正常小鼠和DKK2转基因小鼠胚胎上的血管发育，
图10示出了在正常小鼠和DKK2转基因小鼠胚胎的头部区域上血管生成的比较结果，
图11表示正常小鼠和DKK2转基因小鼠的胚胎上的降主动脉和节段血管的生长。
具体实施方式
对于本领域的技术人员显而易见的是，在不背离本发明的精神或范围的前提下，在本发明的组合物、使用和制备中可以进行各种修改和改变。
将通过以下实施例，更加具体地解释本发明。然而，应该理解本发明并不限于这些实施例。
本发明的实施方式
以下的参考例和实验例旨在进一步阐述本发明而不是限制本发明的范围。
参考例1.HUVEC的培养
按照下面的方法从由延世大学医院(Yonsei UniversityHospital)妇科得到的脐带中分离HUVEC(人脐带静脉内皮细胞)。用脐带缓冲液(Cord buffer，0.2％葡萄糖磷酸缓冲盐水)清洗静脉后，向静脉加入5ml 0.2％的I型胶原酶(Sigma-Aldrich Co.，MO，USA)，并将该静脉在37℃下放置5分钟。在室温下向静脉加入20ml的脐带缓冲液后，收集从相对端分离的静脉细胞。再次向静脉加入脐带缓冲液以在37℃下反应。对收集的人脐带静脉内皮细胞(HUVEC)进行清洗并倒入包被有0.1％明胶的T75组织培养曲颈瓶中。细胞在5％C02培养箱中在37℃下培养在EGMTM-2完全培养基(Cambrex，MD，USA)中，且当细胞达到致密生长(confluent)阶段时，从胰蛋白酶-EDTA溶液中分离细胞。由上述过程得到的3-4次继代细胞用于本实验中。
参考例2.用慢病毒载体制备DKK2调节细胞系
DKK2重组病毒购自Macrogen Inc(韩国)，通过利用慢病毒将克隆质粒转化到病毒产生细胞系中以制备DKK2过表达和抑制细胞系从而获得DKK2重组病毒。在向参考例2中制备的HUVEC中加入DKK2病毒48小时后，如下对从细胞中分离的RNA进行反转录和聚合以验证DKK2mRNA的表达状态：用TRIzol试剂(Invitrogen，USA)分离总RNA，用寡聚(dT)引物实施反转录并随后用反转录酶(Stratagen，USA)重复PCR循环30次；使用聚合酶(Stratagen，USA)在94℃预变性5分钟，在94℃变性30秒，在50℃用引物退火30秒，以及在72℃延伸30秒。
如图3中所示，结果表明DKK2过表达细胞系和抑制细胞系产生良好。
参考例3.DKK2转基因小鼠的制备
使用仅在血管内皮细胞中激活的Tie2转录调控区来制备DKK2过表达小鼠，以确定DKK2基因在体内对血管生成的影响(SchlaegerTM等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，94(7)，pp.3058-3063，1997)。如图6中所示，用HindIII和NotI(NEB，英国)处理由SEQ ID NO：4表示的小鼠DKK2基因并将其克隆到Psp载体(Clontech，USA)中。用SalI(NEB，英国)处理克隆的质粒以制备DNA片段并将制得的DNA片段注入分离自小鼠(C57BL6，Orient Inc，韩国)的卵子中以诱导转导，其中该小鼠已通过***释放激素(Sigma，USA)刺激***，然后将该DKK2转基因卵子在受精后植入***母鼠中。将受精后21天出生的小鼠的尾部截去，用蛋白酶K(Sigma，USA)处理以分离DNA，并利用由SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8表示的DKK2引物，通过PCR对分离的DNA进行扩增[94℃预变性5分钟，(94℃变性30秒，55℃退火30秒以及72℃延伸30秒)×30次循环，并在72℃下后延伸10分钟](见图7)。
实验例1.人脐带静脉内皮细胞分化过程中DKK2的表达谱
将250μl基质胶(Collaborative Biomedical Products，USA；浓度：10mg蛋白/ml)加入到直径16mm的孔板中并在37℃聚合30分钟。将在参考例1中制备的HUVEC培养在含有20％(v/v)胎牛血清(FBS，Hyclone，USA)、100单位/ml青霉素(Invitrogen，USA)、10μg/ml链霉素(Invitrogen，USA)、3ng/ml bFGF(碱性成纤维细胞生长因子；Upstate Biotechnology，USA)和5单位/ml肝素(Sigma，USA)的M199生长培养基(Invitrogen，USA)中，并向其中加入胰蛋白酶以获得培养细胞。使细胞悬浮在生长培养基中并以2×105细胞/孔的浓度涂布在基质胶层上从而诱导细胞分化(见图1)。
如图1所示，分化由3个步骤组成；第一步是分化开始，用作对照组，第二步是由于细胞转移形成血管样结构以及第三步是完成血管样结构的形成。
用TRIZOL溶液(Invitrogen，USA)从每一步骤中的细胞中分离RNA后，用由SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6表示的引物对分离的RNA进行反转录，并按照参考例3中披露的方法进行扩增(见图2)。
如图2所示，该结果表明在血管形成过程中DKK2基因的表达增加。可以证实DKK2是血管形成的正调控因子。
实验例2.DKK2对人脐带静脉内皮细胞的血管形成的影响
将250μl基质胶(Collaborative Biomedical Products，USA；浓度：10mg蛋白/ml)加入到直径16mm的孔板中并在37℃下聚合30分钟。将在参考例1中制备的HUVEC培养在含有20％(v/v)胎牛血清(FBS，Hyclone，USA)、100单位/ml青霉素(Invitrogen，USA)，10μg/ml链霉素(Invitrogen，USA)、3ng/ml的bFGF(碱性成纤维细胞生长因子；Upstate Biotechnology，USA)和5单位/ml肝素(Sigma，USA)的M199生长培养基(Invitrogen，USA)中，并向其中加入胰蛋白酶以获得培养细胞。使细胞悬浮在生长培养基中并以2×105细胞/孔的浓度涂布在基质胶层上以诱导细胞分化(见图4)。将其用50ng/ml和100ng/ml的DKK2进行处理，然后将细胞培养20小时。用光学显微镜(ZEISS，德国)测量血管形成率并将没有用DKK2处理的组作为阴性对照组。
如图4中所示，该结果表明在DKK2的表达细胞系上诱导了血管形成，而在DKK2抑制细胞系上血管形成减少。
实验例3.β-连环蛋白上DKK2的稳定作用
将在参考例2中制备的使用慢病毒***的DKK2过表达细胞系培养24小时。培养基换成含有20％(v/v)胎牛血清(FBS，Hyclone，USA)、100单位/ml青霉素(Invitrogen，USA)、10μg/ml链霉素(Invitrogen，USA)、3ng/ml的bFGF(碱性成纤维细胞生长因子；Upstate Biotechnology，USA)和5单位/ml肝素(Sigma，USA)的M199生长培养基，并向其中加入200ng/ml sFrizzle(BD bioscience，USA)作为Wnt分泌抑制因子。培养24小时后，对其用胰蛋白酶处理以获得培养细胞。用含有100mM Tris/Cl、5mM EDTA、50mMβ-甘油磷酸盐、50mM NaF、100μM Na3VO4、1mM PMSF、0.5％NP-40和1％Triton X-100的裂解缓冲液从细胞中分离DNA。使用β-连环蛋白的抗体(Upstate Biotechnology，USA)通过蛋白印记实验证实分离的DNA的表达水平。
如图5中所示，与对照组(eGFP)相比，DKK2使β-连环蛋白的表达水平显著提高，并且尽管用Wnt抑制因子(sFz)进行处理，提高的表达水平也没有下降。因此，证实了DKK2通过控制不同于Wnt信号的β-连环蛋白的表达水平可刺激血管生成。
实验例4.DKK2对内皮细胞从转基因小鼠主动脉出芽的影响
将从参考例3中制备的DKK2转基因小鼠和6周龄正常小鼠的背部区域分离的主动脉切成1mm的大小，并将动脉环组织置于包被有110μl基质胶的48孔板上。再用40μl的基质胶将孔密封并向每个孔中加入HUVEC培养基(SFM，Invitrogen，USA)直至每个孔的终体积达到200μl。5天后，计数从每个环上出芽的数量并比较对照小鼠组和DKK2转基因小鼠组的出芽率(见图8)。根据以下标准将出芽分成5部分以评价出芽率；5分是指所有5个部分都出芽，0分是指没有出芽。
如图8中所示，结果表明，与正常小鼠相比，DKK2转基因小鼠中的动脉环组织的出芽显著增加。
实验例5.DKK2对DKK2转基因小鼠胚胎中血管发育的影响
用4％低聚甲醛将来源于妊娠第9-10天的正常小鼠和DKK2转基因小鼠的胚胎固定1天，并通过文献中披露的方法(Sadler J.E.，J.Thromb.Haemost.，3(8)，pp1702-1709，2005)，用仅在血管内皮细胞上特异性表达的血管假性血友病因子(von Willebrand Factor，Vwf)的抗体(Chemicon，USA)染色，以观察血管的发育。
如图9中所见，结果表明，与正常小鼠对照相比，DKK2转基因小鼠的胚胎中血管生成和血管发育普遍增加。
为了证实DKK2对胚胎血管生成的影响，通过高倍放大来确定由上述方法制备的胚胎中的头部毛细血管丛、降主动脉和节段血管的发育。
如图10和11所示，结果表明，在DKK2转基因小鼠的胚胎上促进了头部毛细血管丛和节段血管生长的显著增强以及降主动脉的扩大。
以下，将描述配制方法和各种赋形剂，但本发明不限于此。代表性的制备实例描述如下。
注射液的制备
DKK2蛋白100mg
焦亚硫酸钠3.0mg
对羟苯甲酸甲酯0.8mg
对羟苯甲酸丙酯0.1mg
用于注射液的蒸馏水最适量
通过常规的注射液制备方法，将活性成分溶解，将pH控制为约7.5然后将所有成分注入2ml安瓿瓶(ample)中并进行灭菌以制备注射液制剂。
粉剂的制备
DKK2蛋白500mg
玉米淀粉100mg
乳糖100mg
滑石10mg
通过将上述成分混合并填充进密封包装中以制备粉剂制剂。
片剂的制备
DKK2蛋白200mg
玉米淀粉100mg
乳糖100mg
硬脂酸镁最适量
通过混合上述成分并压制成片(entabletting)以制备片剂制剂。
胶囊的制备
DKK2蛋白  100mg
乳糖 50mg
玉米淀粉 50mg
滑石 2mg
硬脂酸镁 最适量
通过常规的明胶制备方法，混合上述成分并填充明胶胶囊以制备胶囊制剂。
液体的制备
DKK2蛋白1000mg
糖 20g
多糖 20g
柠檬香精 20g
通过常规的液体制备方法，将活性成分溶解，然后将所有成分注入1000ml安瓿瓶中并灭菌以制备液体制剂。
保健食品的制备
DKK2蛋白  1000mg
维生素混合物 最适量
维生素A 乙酸酯 70mg
维生素E  1.0mg
维生素B1 0.13mg
维生素B2 0.15mg
维生素B6 0.5mg
维生素B120.2mg
维生素C  10mg
生物素 10mg
烟酰胺 1.7mg
叶酸   50mg
泛酸钙   0.5mg
矿物质混合物 最适量
硫酸亚铁 1.75mg
氧化锌   0.82mg
碳酸镁   25.3mg
磷酸二氢钾 15mg
磷酸二钙 55mg
柠檬酸钾 90mg
碳酸钙   100mg
氯化镁   24.8mg
上述的维生素和矿物质混合物可以以多种方式改变。应当注意，这样的改变并不偏离本发明的精神和范围。
健康饮料的制备
DKK2蛋白1000mg
柠檬酸  1000mg
低聚糖  100g
杏浓缩物2g
牛磺酸  1g
蒸馏水  900ml
通过常规的健康饮料制备方法，将活性成分溶解、混合、在85℃搅拌1小时、过滤然后将所有成分注入1000ml安瓿瓶中并灭菌以制备健康饮料制剂。
显而易见的是，所描述的本发明可以以许多方式改变。应当注意，这样的改变并不偏离本发明的精神和范围，并且对于本领域普通技术人员来说，所有这些改变均应包括在所附权利要求的范围中。
工业适用性
如本发明所述，DKK2表现出对在HUVEC上血管形成的刺激活性、对动脉环组织出芽的促进活性以及对小鼠胚胎中血管发育的促进活性。因此，它可以用作用于治疗和预防缺血性疾病的治疗性或功能性保健食品。
序列表
SEQ ID NO：1是人DKK2的氨基酸序列，SEQ ID NO：2是人DKK2的DNA序列，SEQ ID NO：3是小鼠DKK2的氨基酸序列，SEQ ID NO：4是小鼠DKK2的DNA序列，SEQ ID NO：5是人DKK2的正向引物序列，SEQ ID NO：6是人DKK2的反向引物序列，SEQID NO：7是小鼠DKK2的正向引物序列，以及SEQ ID NO：8是小鼠DKK2的反向引物序列。
P23185JHKL-序列表.TXT
<110>延世大学工业学术合作社
<120>应用DKK2刺激血管生成的方法以及含有DKK2的组合物
<130>P23185JHKL
<140>PCT/KR2007/002493
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<150>KR 10-2006-0046442
<151>2006-05-24
<160>8
<170>KopatentIn 1.71
<210>1
<211>259
<212>PRT
<213>Human DKK2
<400>1
Met Ala Ala Leu Met Arg Ser Lys Asp Ser Ser Cys Cys Leu Leu Leu
  1               5                  10                  15
Leu Ala Ala Val Leu Met Val Glu Ser Ser Gln Ile Gly Ser Ser Arg
             20                  25                  30
Ala Lys Leu Asn Ser Ile Lys Ser Ser Leu Gly Gly Glu Thr Pro Gly
         35                  40                  45
Gln Ala Ala Asn Arg Ser Ala Gly Met Tyr Gln Gly Leu Ala Phe Gly
     50                  55                  60
Gly Ser Lys Lys Gly Lys Asn Leu Gly Gln Ala Tyr Pro Cys Ser Ser
 65                  70                  75                  80
Asp Lys Glu Cys Glu Val Gly Arg Tyr Cys His Ser Pro His Gln Gly
                 85                  90                  95
Ser Ser Ala Cys Met Val Cys Arg Arg Lys Lys Lys Arg Cys His Arg
            100                 105                 110
Asp Gly Met Cys Cys Pro Ser Thr Arg Cys Asn Asn Gly Ile Cys Ile
        115                 120                 125
Pro Val Thr Glu Ser Ile Leu Thr Pro His Ile Pro Ala Leu Asp Gly
    130                 135                 140
Thr Arg His Arg Asp Arg Asn His Gly His Tyr Ser Asn His Asp Leu
145                 150                 155                 160
Gly Trp Gln Asn Leu Gly Arg Pro His Thr Lys Met Ser His Ile Lys
                165                 170                 175
Gly His Glu Gly Asp Pro Cys Leu Arg Ser Ser Asp Cys Ile Glu Gly
            180                 185                 190
Phe Cys Cys Ala Arg His Phe Trp Thr Lys Ile Cys Lys Pro Val Leu
        195                 200                 205
His Gln Gly Glu Val Cys Thr Lys Gln Arg Lys Lys Gly Ser His Gly
    210                 215                 220
Leu Glu Ile Phe Gln Arg Cys Asp Cys Ala Lys Gly Leu Ser Cys Lys
225                 230                 235                 240
Val Trp Lys Asp Ala Thr Tyr Ser Ser Lys Ala Arg Leu His Val Cys
                245                 250                 255
Gln Lys Ile
<210>2
<211>780
<212>DNA
<213>Human DKK2
<400>2
atggccgcgt tgatgcggag caaggattcg tcctgctgcc tgctcctact ggccgcggtg    60
ctgatggtgg agagctcaca gatcggcagt tcgcgggcca aactcaactc catcaagtcc    120
tctctgggcg gggagacgcc tggtcaggcc gccaatcgat ctgcgggcat gtaccaagga    180
ctggcattcg gcggcagtaa gaagggcaaa aacctggggc aggcctaccc ttgtagcagt    240
gataaggagt gtgaagttgg gaggtattgc cacagtcccc accaaggatc atcggcctgc    300
atggtgtgtc ggagaaaaaa gaagcgctgc caccgagatg gcatgtgctg ccccagtacc    360
cgctgcaata atggcatctg tatcccagtt actgaaagca tcttaacccc tcacatcccg    420
gctctggatg gtactcggca cagagatcga aaccacggtc attactcaaa ccatgacttg    480
ggatggcaga atctaggaag accacacact aagatgtcac atataaaagg gcatgaagga    540
gacccctgcc tacgatcatc agactgcatt gaagggtttt gctgtgctcg tcatttctgg    600
accaaaatct gcaaaccagt gctccatcag ggggaagtct gtaccaaaca acgcaagaag    660
ggttctcatg ggctggaaat tttccagcgt tgcgactgtg cgaagggcct gtcttgcaaa    720
gtatggaaag atgccaccta ctcctccaaa gccagactcc atgtgtgtca gaaaatttga    780
                                                                     780
<210>3
<211>259
<212>PRT
<213>Mouse DKK2
<400>3
Met Ala Ala Leu Met Arg Val Lys Asp Ser Ser Arg Cys Leu Leu Leu
  1               5                  10                  15
Leu Ala Ala Val Leu Met Val Glu Ser Ser Gln Leu Gly Ser Ser Arg
             20                  25                  30
Ala Lys Leu Asn Ser Ile Lys Ser Ser Leu Gly Gly Glu Thr Pro Ala
         35                  40                  45
Gln Ser Ala Asn Arg Ser Ala Gly Met Asn Gln Gly Leu Ala Phe Gly
     50                  55                  60
Gly Ser Lys Lys Gly Lys Ser Leu Gly Gln Ala Tyr Pro Cys Ser Ser
 65                  70                  75                  80
Asp Lys Glu Cys Glu Val Gly Arg Tyr Cys His Ser Pro His Gln Gly
                 85                  90                  95
Ser Ser Ala Cys Met Leu Cys Arg Arg Lys Lys Lys Arg Cys His Arg
            100                 105                 110
Asp Gly Met Cys Cys Pro Gly Thr Arg Cys Asn Asn Gly Ile Cys Ile
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Pro Val Thr Glu Ser Ile Leu Thr Pro His Ile Pro Ala Leu Asp Gly
    130                 135                 140
Thr Arg His Arg Asp Arg Asn His Gly His Tyr Ser Asn His Asp Leu
145                 150                 155                 160
Gly Trp Gln Asn Leu Gly Arg Pro His Ser Lys Met Pro His Ile Lys
                165                 170                 175
Gly His Glu Gly Asp Pro Cys Leu Arg Ser Ser Asp Cys Ile Asp Gly
            180                 185                 190
Phe Cys Cys Ala Arg His Phe Trp Thr Lys Ile Cys Lys Pro Val Leu
        195                 200                 205
His Gln Gly Glu Val Cys Thr Lys Gln Arg Lys Lys Gly Ser His Gly
    210                 215                 220
Leu Glu Ile Phe Gln Arg Cys Asp Cys Ala Lys Gly Leu Ser Cys Lys
225                 230                 235                 240
Val Trp Lys Asp Ala Thr Tyr Ser Ser Lys Ala Arg Leu His Val Cys
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Gln Lys Ile
<210>4
<211>780
<212>DNA
<213>Mouse DKK2
<400>4
atggccgcgc tgatgcgggt caaggattca tcccgctgcc ttctcctact ggccgcggtg    60
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<210>5
<211>18
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Human DKK2 forward primer
<400>5
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<210>6
<211>18
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Human DKK2 reverse primer
<400>6
atggagtctg gctttgga                18
<210>7
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<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Mouse DKK2 forward primer
<400>7
atggccgcgc tgatgcgggt              20
<210>8
<211>19
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Mouse DKK2 reverse primer
<400>8
tcagatcttc tggcataca               19

Claims (15)

1.DKK2蛋白或编码DKK2蛋白的DNA在制备用于在哺乳动物中刺激血管生成的药物中的用途。
2.根据权利要求1所述的用途，其中，所述哺乳动物具有未形成血管的组织，所述未形成血管的组织是由缺血性疾病造成损伤后新形成的皮肤组织、肌肉组织和***。
3.根据权利要求2所述的用途，其中所述缺血性疾病是烧伤、牛皮癣、溃疡、局部缺血、心肌梗塞、心绞痛、脑梗塞或脑出血。
4.根据权利要求1所述的用途，其中，所述DNA为病毒载体或非病毒载体形式。
5.根据权利要求4所述的用途，其中，所述病毒载体是腺病毒载体、腺伴随病毒载体、反转录病毒载体、慢病毒载体或单纯性疱疹病毒载体。
6.根据权利要求4所述的用途，其中，所述非病毒载体是能够在动物细胞中表达的质粒。
7.根据权利要求1所述的用途，其中，所述DKK2蛋白由SEQ IDNO：1表示。
8.根据权利要求1所述的用途，其中，所述DNA由SEQ ID NO：2表示。
9.DKK2蛋白或编码DKK2蛋白的DNA用于制造治疗或预防缺血性疾病所采用的药物的应用。
10.一种用于治疗和预防缺血性疾病的药物组合物，含有DKK2蛋白或编码DKK2蛋白的DNA作为活性成分。
11.根据权利要求10所述的药物组合物，其中，所述DKK2蛋白由SEQ ID NO：1表示。
12.根据权利要求10所述的药物组合物，其中，所述DNA由SEQID NO：2表示。
13.根据权利要求10所述的药物组合物，其中，所述缺血性疾病是烧伤、牛皮癣、溃疡，局部缺血、心肌梗塞、心绞痛、脑梗塞或脑出血。
14.一种用于预防或改善缺血性疾病的保健食品，含有DKK2蛋白或编码DKK2蛋白的DNA作为活性成分。
15.根据权利要求14所述的保健食品，其中，所述保健食品以丸剂、粉剂、颗粒剂、片剂、咀嚼片剂、胶囊剂或饮料形式提供。
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