KR100773323B1 - 지-씨에스에프 접합체 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 G-CSF 활성을 나타내며, 비폴리펩티드 부분 대한 부착기를 포함하는 적어도 하나의 특정된 도입 및/또는 제거된 아미노산 잔기에서 인간 G-CSF 아미노산 서열과 상이한 아미노산 서열을 가지며, 폴리펩티드에 부착기에 부착된 적어도 하나의 비폴리펩티드부분을 가지는 폴리펩티드를 포함하는 폴리펩티드 접합체에 관한 것이다. 부착기는 예를 들면, 라이신, 시스테인, 아스파라틱산, 또는 글루탐산 잔기 또는 글리코실화 부위일 수 있으며, 비폴리펩티드 부분은 예를 들면, 에틸렌 글리콜과 같은 폴리머 또는 올리고당일 수 있다. 접합체는 증가된 생물학적 반감기, 감소된 부작용과 같은 하나 이상의 향상된 특성을 가진다.

Description

지-씨에스에프 접합체{G-CSF CONJUGATES}
본 발명은 폴리펩티드와 과립성백혈구 클로니 자극 인자(G-CSF)활성을 나타내는 새로운 폴리펩티드, G-CSF 활성을 나타내는 폴리펩티드와 비폴리펩티드 사이에서의 접합체, 그러한 폴리펩티드 또는 접합체의 제조, 및 치료, 상세하게는 백혈구 감소증의 치료에 있어서의 그러한 폴리펩티드 또는 접합체의 이용 방법에 관한 것이다.
골수에서 백혈구 세포가 성장, 분열하고 분화하는 과정은 조혈작용이라 한다(Dexter and Spooncer, Ann.Rev.Cell.Biol., 3:423, 1987). 각각의 백혈구 세포형은 플루리포텐트(pluripotent) 줄기세포로부터 발생한다. 일반적으로 in vivo 생성되는 백혈구는 세 종류가 있다: 적혈구 세포(erythrocyte), 혈소판 및 백혈구 세포(leukocytes)로 후자의 대부분은 숙주 면역 방어에 관련된다. 조혈 전구세포의 증식과 분화는 G-CSF 와 인터루킨(interleukin)과 같은 클로니-자극 인자(CSF's)포함하는 사이토키닌 군에 의해서 제어된다(Arai 등, Ann. Rev. Biochem.,59:783-836,1990). G-CSF 의 주요한 in vivo 생물학적 효과는 호중구성 과립성 백혈구 또는 호중구(neutrophils)로 알려진 어떤 백혈구의 성장과 발달을 자극하는 것이다(Welte 등, PNAS-USA 82:1526-1530, 1985, Souza 등, Science, 232:61-65, 1986). 혈류로 방출되었을 때, 호중구 과립성 백혈구는 박테리아 감열과 싸우도록 작용한다.
인간 G-CSF(hG-CSF) 의 아미노산 서열은 Nagata 등, Nature 319:415-418 에 의해서 보고되었다. hG-CSF는 G-CSF 수용체를 2 G-CSF 분자와 2 수용체의 2:2 복합체의 형성에 의해서 2 량화한 단위체 단백질이다(Horan 등(1996), Biochemistry 35(15):4886-96). Aritomi 등, Nature 401:713-717,1999 는 hG-CSF 와 G-CSF 수용체의 BN-BC 영역사이에서 복합체의 X-레이 구조를 기술하고 있다. 이들은 하기 hG-CSF 잔기를 수용체 결합 계면의 부분으로 확인하고 있다: G4,P5,A6,S7,S8,L9,P10, Q11,S12,L15,K16,E19,Q20,L108,D109,D112,T115,T116,Q119,E122,E123 및 L124. rhG-CSF의 Escherichia coil, Saccharomyces cerevisiae 및 포유세포에서의 발현은 보고되었다(Souza 등, Science 232;61-65, 1986, Nagata 등, Nature 319:415-418, 1986, Robison and Wittrup, Biotechnol. Prog. 11: 171-177,1985).
재조합 인간 G-CSF(rhG-CSF)는 일반적으로 다양한 형태의 백혈구 감소증의 치료에 사용된다. 그래서 rhG-CSF 의 상업적인 제조는 필그라스팀(Gran? and Neupogen?), 레노그라스팀(Neutrogin? and Granocyte?) 및 나르토그라스팀(Neu-up?)의 명칭하에서 이용할 수 있다. Gran? 및 Neupogen? 은 비글리코실화된 것이며, 재조합 E.coli 세포에서 생산된다. Neutrogin?및 Granocyte? 는 글리코실화된 것이며, 재조합 CHO 세포에서 생성되며, Neu-up? 은 재조합 E.coil 세포에서 생산된 그 대로의 rhG-CSF 의 N-말단 부위에서 치환된 5 아미노산으로 비글리코실화된 것이다.
hG-CSF 의 몇몇 단백질-조작된 변이체가 보고되었다(US 5,581,476, US 5,214,132, US 5,362,853, US 4,904,584 및 Riedhaar-Olson 등 Biochemistry 35: 9034-9041, 1996). hG-CSF 및 다른 폴리펩티드의 변형이 원 폴리펩티드와 비교했을 때 적어도 하나의 추가적인 탄수화물 사슬을 도입하기 위해서 제안되었다(US 5,218,092). 폴리펩티드의 아미노산 서열이 아미노산 치환, 아미노산 제거 또는 추가적인 탄수화물 사슬의 추가에 영향을 주기 위한 아미노산 삽입에 의해서 변형될 수 있음이 기술되어 있다. 추가적으로, PEG 기의 부착을 포함하는 원hG-CSF의 폴리머 변형은 보고되었다(Satake-Ishikawa 등, 셀구조 및 기능 17:157-160, 1992, US 5,824,778, US 5,824,784, WO 96/11953, WO 95/21629, WO 94/20069).
Bowen 등, Experimental Hematology 27(1999), 425-432 는 분자량과 PEG 접합된 G-CSF의 활성 지속과의 관계에 대한 연구를 공개한다. in vivo 분자량의 증가에 따라서 활성이 증가한 반면, 단백질에 접합된 PEG 일부의 분자량과 in vitro 활성사이에서 명백한 역상관이 제시되었다. 수용체-매개성 엔도시토시스는 조혈 성장 인자의 수준을 조절하는 중요한 기구이므로 접합체의 낮은 친화성이 반감기를 증가시키는 역할을 한다는 것이 추측된다.
상업적으로 이용가능한 rhG-CSF 는 짧은-기간 약물학적 효과를 가지며, 백혈구 감소 상태의 기간동안 하루에 한번이상 투약되어야 한다. 보다 긴 순환 반감기를 가지는 분자는 백혈구 감소증을 경감시키고 결과적인 감염을 막는데 필요한 투 약의 수를 감소시킬 것이다. 현재 이용가능한 rG-CSF 생산물의 또 다른 문제는 복용량-의존성 골통(bone pain)의 발생이다. 골통은 rG-CSF 치료의 중요한 부작용으로 환자에게 경험되기 때문에, 원래 이러한 효과를 나타내지 않거나 또는 어떤 골통도 유발되지 않는 충분히 작은 복용량에서도 효과적인 생산품을 이용하여, 골통을 유발하지 않는 rG-CSF를 제공하는 것이 바람직하다.
반감기의 관점에서, 단백질의 순환 반감기를 증가시키는 한 방안은 단백질의 단백질의 클리어런스(clearance), 상세하게는 신장 클리어런스 및 수용체-매개성 클리어런스를 통한 것이 감소되게 하는 것이다. 이것은 겉보기 크기를 증가시킬수 있는 화학 부분에 단백질을 접합시키고, 이에의해 신장 클리어런스를 감소시키고 in vivo 반감기를 증가시키는 것이 성취될 수 있다. 게다가, 화학부분의 단백질에의 부착은 효과적으로 단백질 가수분해 효소의 단백질과의 물리적 접촉을 방해하고, 그래서 비특이성 단백질 가수분해에 의한 분해를 막는다. 폴리에틸렌 글리콜(PEG)는 치료적인 단백질 생산품의 제조에 있어서 사용되는 그러한 한 화학 부분이다. 단일, N-말단 연결된 PEG 기로 변형된 G-CSF 분자는, SD/01 로 칭해지고, 현재 임상 시험을 거치고 있다. 비록 이러한 PEG 화된 G-CSF 분자가 비-PEG 화된 G-CSF에 비해서 증가된 반감기를 가지는 것을 보인다하더라도, 이것을 낮은 활성을 가지며, 그러므로 높은 복용량으로 투약되어야 한다. 결과적으로, 위에서 논의된 골통의 문제는 이러한 분자에 의해서는 해결되지 않았다. 더구나, 반감기의 관점에서 알려진 G-CSF 분자의 실질적인 개선의 여지도 여전히 존재한다.
그러므로 백혈구 감소증의 치료에 유용하고 G-CSF 활성을 보여주는 신규한 분자를 제공하기 위한 필요가 여전히 존재하고, 이것은 증가된 반감기와 부작용의 감소의 관점에서 향상되어야 한다. 본 발명은 그러한 분자에 관한 것이다.
발명의 간단한 설명
보다 상세하게는, 본 발명은 G-CSF 활성을 나타내는 폴리펩티드와 비-폴리펩티드 부분을 포함하는 특이성 접합체에 관한 것이며, 이들의 제조 및 의료적 치료 및 약물제조에서의 이용 방법에 관한 것이다. 따라서, 첫번째 측면에서, 본 발명은 G-CSF 활성을 나타내고, SEQ ID NO:1 에서 보여지는 인간 G-CSF의 알려진 아미노산 서열과, 비폴리펩티드 부분에 대한 부착기를 포함하며 그리고 폴리펩티드의 부착기에 부착된 적어도 하나의 비폴리펩티드 부분을 가지는 특이적으로 개선된 아미노산 서열에 있어서, 상이한 아미노산 서열을 가지는 폴리펩티드를 포함하는 다양한 특이성 접합체에 관한 것이다. 본 발명의 접합체는 상업적으로 이용가능한 rhG-CSF와 비교할 때, 증가된 in vivo 기능성 반감기, 증가된 혈청 반감기, 감소된 부작용, 감소된 면역원성(immunogenicity) 및/또는 증가된 생체이용율를 포함하는 하나 이상의 개선된 특성을 가진다. 결국, 발명의 접합체를 이용한 의료적 치료는 현재 이용가능한 G-CSF 화합물에 비해 많은 잇점들을 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 G-CSF 활성을 나타내고, 본 발명의 접합체의 부분을 형성하는 폴리펩티드에 관한 것이다. 본 발명의 폴리펩티드는 치료 또는 진단 또는 다른 목적과 같은 것에 유용한 것으로 고려되나, 그러나 본 발명의 접합체의 제조를 위한 중간 생성물로서 특별한 잇점이 발견된다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 G-CSF 활성을 나타내는 폴리펩티드, 이것은 hG-CSF(SEQ ID NO:1 에서 나타난 아미노산 서열로)의 아미노산 서열과 비폴리펩티드 부분에 대한 부착기를 포함하는 도입 또는 제거된 아미노산 잔기로부터 선택되는 적어도 하나의 아미노산 잔기에서 상이한 아미노산 서열을 포함하며, 알려진 재조합 G-CSF 생산품에 비해서 증가된 반감기를 가지는 접합체를 제공하는 충분한 수 또는 타입의 비폴리펩티드 부분을 포함하는 폴리펩티드 접합체에 관한 것이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의 폴리펩티드를 코드화하는 뉴클레오타이드 서열, 그러한 뉴클레오사이드 서열을 포함하는 표현 벡타, 그러한 뉴클레오사이드 서열 또는 표현 벡타를 포함하는 숙주세포를 포함하여, 본 발명의 접합체의 제조 방법에 관한 것이다.
마지막으로, 본 발명은 접합체 또는 본 발명의 폴리펩티드를 포함하는 조성물, 약리학적 조성물의 제조 방법, 본 발명의 접합체 또는 조성물의 약품으로서의 이용, 및 그러한 조성물로 포유류를 치료하는 방법에 관한 것이다. 상세하게는, 폴리펩티드, 접합체, 또는 본 발명의 조성물은 어떤 종류의 방사선 치료, 화학치료, 및 골수 이식를 받는 암환자에 있어서 감염을 막는 것, 말초성 혈액 프로제니터 세포이식에서 모집을 위한 프로제니터 세포의 유동화 하는 것, 원인과 관계없이 심각한 만성 또는 상대적인 백혈구 감소증의 치료, 그리고 심한 골수성 백혈병 환자의 치료를 돕기 위해서 사용될 수 있다. 추가적으로, 본 발명의 폴리펩티드, 접합체 또는 조성물은 AIDS 의 치료나 또는 박테리아 감염뿐 아니라 다른 면역결핍질병을 위해서 사용될 수 있다.
발명의 상세한 설명
정의
본 출원 및 발명의 문맥에서, 다음의 정의가 적용된다:
접합체("conjugate") 는 이형성 분자로써, 폴리머 분자, 친유성 화합물, 탄수화물 부분 또는 유기 유도화(derivatizing)제와 같은 한 개이상의 비-폴리펩티드 부분에 한 가지 이상의 폴리펩티드, 전형적으로는 하나의 폴리펩티드를 공유적으로 부착시켜 만들 수 있다. 공유적으로 부착시킨다는 의미는 폴리펩티드 및 비-폴리펩티드 부분을 직접적으로 서로 공유결합시키거나 연결 다리, 스페이스, 연결 부분, 또는 부분과 같은 중개부분 또는 부분등을 통하여 서로 간접적으로 공유결합적으로 연결된다는 것을 의미한다. 바람직하게는 접합체는 관련 농도 및 조건하에서 가용성을 띠는데, 예를 들면, 혈액과 같은 생리적인 유체에서 가용성이다. "비-접합된 폴리펩티드"란 접합체의 폴리펩티드 부분을 말하는 것이다.
"폴리펩티드"란 여기서 "단백질"과 교환적으로 사용될 수 있다.
"폴리머 분자"는 두 개 이상의 단량체가 공유 결합되어 형성된 분자를 말하는 것으로, 여기서 폴리머가 사람의 알부민 또는 다른 풍부한 혈장 단백질인 경우를 제외하고는, 단량체는 어떤 아미노산 잔기가 아니다. "폴리머"는 "폴리머 분자"와 서로 혼용될 수 있다. 비록 통상적으로 이 용어가 in vivo N- 또는 O- 글리코실화(하기에 더 기술되는 것처럼)에 의해서 폴리펩티드에 부착된 탄수화물 분자의 형태를, 그러한 분자들이 여기서 "올리고당 부분"으로 언급되기 때문에, 포함하지 않는 것으로 의도된다 하더라도, 탄수화물을 포함하는 것으로 의도된다. 폴 리머 분자(들)의 숫자가 분명히 명시된 경우를 제외하고는, 본 발명에서 사용되는 본 발명의 폴리펩티드에 함유된 "한 폴리머", "한 폴리머 분자", "폴리머" 또는 "폴리머 분자" 에 대한 언급이건 아니건 하나이상의 폴리머 분자(들)에 대한 언급이다.
"부착기"는 관련된 비-폴리펩티드 부분에 결합할 수 있는 폴리펩티드의 아미노산 잔기를 나타내는 것이다. 예를 들면, 폴리머 접합에 대해서, 상세하게는 PEG에서, 자주 사용되는 부착기는 라이신의 ε-아미노기 또는 N-말단 아미노기이다. 다른 폴리머 부착기는 자유 카르복실산기(예를 들면, C-말단 아미노 산 잔기 또는 아스파르트산 또는 글루탐산잔기의 그것), 적절하게 활성화된 카르보닐기, 산화된 탄수화물 부분, 머켑토기를 포함한다. 유용한 부착기 및 이와 짝을 이루는 비-폴리펩티드 부분은 다음의 표에서 분명하게 파악할 수 있을 것이다.
부착기 아미노산 비-폴리펩티드부분의 예시 접합 방법/ dPEG 활성화 참고문헌
-NH2 N-말단, Lys, His,Arg 폴리머,예를 들면 PEG, 아미드 또는 이민기를 가진 mPEG-SPA Tresylated mPEG Shearwater Inc Delgado et al., Critical reviews in Therapeutic Durg Carrier Systems 9(3,4):249-304 (1992)
-CHOOH C-말단, Asp,Glu 폴리머,예를 들면PEG, 에스테르 또는 아미드기르 가진 올리고당 부분 mPEG-Hz In vitro 결합 Shearwater Inc
-SH Cys 폴리머, 예를 들면PEG, 디설파이드,말레이미드 또는 비닐설폰기를 가진 올리고당 부분 PEG vinylsulphone PEG-maleimide in vitro 결합 Shearwater Inc Delgado et al, critical reviews in Therapeutic Durg Carrier System 9(3,4):249-304 (1992)
-OH Ser,Thr, OH- Lys 올리고당 부분 에스테르, 에테르, 카바메이트, 카르보네이트를 가진PEG in vivo O-연결된 글리코실화반응
-CONH2 N-글리코실화반응의 일부분으로 Asn 올리고당 부분 폴리머 예를들면 PEG in vivo 글리코실화 반응
방향족 기 Phe, Tyr, Trp 올리고당 부분 in vitro 결합
-CONH2 Gln 올리고당 부분 in vitro 결합 Yan and Wold, Biochemistry, 1984,Jul 31; 23(16):3759-65
알데히드(Aldehyde) 케톤(Ketone) 산화된 카르보하이드레이트 폴리머- PEG. PEG-하이드라지드 PEG화반응 Andresz et al., 1978, Makromol. Chem.179:302; WO 92/16555 WO 00/23114


구아니디노 (Guanidino) Arg 올리고당 부분 in vitro 결합 Lundblad and Noyes, Chimical Reagents for Protein Modification, CRE Press Inc. Boca Raton, FI
Imidazole ring His 올리고당 부분 in vitro 결합 구아딘에 관하여

in vivo N-글리코실화 경우에, "부착기"는 N-글르코실화된 부위를 구성하는 아미노산 잔기를 나타내기 위해 자유로운 방식으로 이용된다(서열 N-X'-S/T/C-X"의 경우에, X'는 프롤린을 제외한 어떤 아미노산 잔기를 나타내고, X"는 X'와 동일하거나 다른 임의 아미노산 잔기를 나타내는데, 바람직하게는 프롤린과는 다르며, N은 아스파라진, S/T/C는 세린, 트레오닌 또는 시스테인을 나타내고, 바람직하게는 세린 또는 트레오닌을, 가장 바람직하게는 트레오닌이 된다). N-글리코실화 부분의 아스파라진 잔기는 글리코실화 동안 올리고당 부분에 부착되는 것일지라도, N-글리코실화 부분의 다른 아미노산 잔기가 존재해야만 이와 같은 부착이 이루어질 수 있다. 따라서, 비-펩티드 부분이 올리고당 부분이고, 접합이 N-글리코실화에 의해 성취되는 경우에, 관심사의 폴리펩티드의 아미노산 서열 변형과 관련하여 이용된 경우에 "비-펩티드 부분 부착용기를 포함하는 아미노산 잔기"는 기능성 N-글리코실화 부위가 아미노산 서열내로 도입되거나 제거되는 방식으로 N-글리코실화 부분을 구성하는 하나 이상의 아미노산 잔기가 변경된다는 의미로 이해되어야 한다.
본 발명에서, 아미노산 명칭 및 원자 명칭(가령, CA, CB, NZ, N, O, C 등등) 는 Protein DataBank(PDB)(www.pdb.org)에서 정의한 것을 이용하고 있는데, 이는 IUPAC 명명법(IUPAC Nomenclature and Symbolism for Amino Acids and Peptides(residue names, atom narnes etc.) 및 Eur. J. Biochem. 138, 9-37(1984)과 이의 교정본(Eur. J. Biochem. 152, 1(1985))을 기초로 한 것이다. "아미노산 잔기"는 첫째로 20 개의 자연적으로 발생하는 아미노산으로 이루어진 그룹에서 함유된 아미노산 잔기를 언급하는 것으로 의도된다. 알라닌(Ala 또는 A), 시스테인(Cys 또는 C), 아스파라틱산(Asp 또는 D), 글루타민산(Glu 또는 E), 페닐알라닌(Phe 또는 F), 글리신(Gly 또는 G), 시스티딘(His 또는 H), 이소루이신(Ile 또는 I), 리신(Lys 또는 K), 루이신(Leu 또는 L), 메티오닌(Met 또는 M), 아스파라진(Asn 또는 N), 프롤린(Pro 또는 P), 글루타민(Glu 또는 Q), 아르기닌(Arg 또는 R), 세린(Ser 또는 S), 트레오닌(Thr 또는 T), 발린(Vla 또 는 V), 트립토판(Trp 또는 W), 티로신(Tyr 또는 Y) 잔기.
아미노산 위치/치환을 가르키기 위해 사용되는 용어는 다음과 같다: F13 은아미노산 서열언급에서 페닐알라닌 잔기로 차지된 위치 번호 13 을 가르킨다. F13K 는 13 위치의 페닐알라닌 잔기가 리신 잔기로 치환되었다는 것을 가르킨다. 달리 지시되지 않는다면, 여기서 만들어진 아미노산잔기의 번호화는 SEQ ID NO: 1에서 나타난 hG-CSF 의 아미노산 서열에 관련되어 만들어진다. 선택적 치환은 "/"로 표시되는데, 예를 들면 Q67D/E 는 67 위치에 있는 글루타민이 다른 아스파라틱 산 또는 글루탐산으로 치환된 아미노산 서열임을 나타낸다. 다중치환은 "+"로 나타내는데, 예를 들면 S53N+G55ST 는 위치 53 의 세린잔기를 아스파라진 잔기로 치환, 및 55 위치의 글리신의 세린 또는 트레오닌 잔기로 치환을 포함하는 아미노산 서열을 의미한다.
"뉴클레오티드 서열"은 두 개 이상의 뉴클레오티드 분자의 연속적인 확장을 나타내는 것이다. 뉴클레오티드 서열은 게놈, cDNA, RNA, 반합성 또는 합성 오리진 또는 이들의 어떤 조합일 수 있다.
"폴리머라제 사슬 반응" 또는 "PCR"은 일반적으로 in vitro에서 원하는 뉴클레오티드 서열을 증폭시키는데 이용되는 방법을 말하는 것으로써, US 4,683,195에서도 설명하고 있다. 일반적으로, PCR 방법은 주형 핵산에 선호적으로 하이브리드할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프라이머를 이용하여, 프라이머 연장 합성의 반복된 사이클을 포함한다.
"세포", "숙주세포", "세포주", "세포 배양물"은 서로 상호 혼용할 수 있으며, 이들 용어는 세포의 생장 또는 배양으로 인하여 생성된 후손이 포함되는 것으로 이해해야 한다. "형질변환" 또는 "트렌스펙션"은 세포안으로 DNA를 도입하는 공정을 말하는 것으로 혼용하여 사용한다.
"작용할 수 있도록 연결된" 이란 두 개 또는 그이상의 뉴클레오티드 서열이 효소적 봉합에 의해서, 서로에 대해서 구성내에서 공유적으로 결합되어, 서열의 정상 기능이 작용할 수 있게 되는 것을 의미한다. 예를 들면, 폴리펩티드의 분비에 참여하는 프리프로테인으로 발현된다면, 프리-서열 (presequence) 또는 분비-리더(secretory leader)를 인코드하는 뉴클레오티드 서열이 폴리펩티드에 대한 뉴클레오티드 서열에 작용할 수 있도록 연결되었다: 서열의 전사에 영향을 줄 수 있다면 프로모터 또는 인헨서가 코딩 서열에 작용할 수 있도록 연결된 것이다: 리보솜 결합 부위에 코딩 서열이 작용할 수 있도록 연결되었다는 것은 해독을 실행할 수 있도록 위치하였다는 것을 의미한다. 일반적으로 "작용할 수 있도록 연결된"이란 연결된 뉴클레오티드 서열이 접촉성이라는 것을 말하고, 분비 리더의 경우에는 리딩상에서 접촉성이라는 것을 말한다. 통상의 제한효소 부위에서는 결찰에 의해 연결이 이루어진다. 이와 같은 부위가 존재하지 않는 경우에는 표준 재조합 DNA 방법과 병행하여, 합성된 올리고뉴클레오티드 어뎁터 또는 링커가 이용될 수 있다.
"도입하다"란 비-폴리펩티드 부분에 대한 부착기를 포함하는 아미노산 잔기를 도입하는 것을 의미하며, 상세하게는 기존의 아미노산 잔기의 치환에 의한다는 것을 의미하며, 선택적으로 추가 아미노산 잔기의 삽입을 의미할 수 있다. "제거하다"는 비-폴리펩티드 부분에 대한 부착기를 포함하는 아미노산 잔기의 제거를 의미하며, 상세하게는 또다른 아미노산 잔기에 의해 제거되는 아미노산 잔기의 치환에 의한다는 것을 의미하며, 선택적으로는 제거되기 위해 아미노산 잔기의 결손(치환없이)에 의한 것임을 의미 할 수 있다.
치환이 모체 폴리펩티드와 관련되어 수행될 때, 이들은 바람직하게 " 보존적 치환"이며, 다시 말해 유사한 특성을 가지는, 예를 들면 작은 아미노산, 산성 아미노산, 극성 아미노산, 염기성 아미노산, 소수성 아미노산, 및 방향족 아미노산과 같은 아미노산의 그룹내에서 수행된 치환이다.
본 발명에서 바람직한 치환은 상세하게는 하기 표에서 기재된 보존적 치환기 들로부터 선택되는 것을 의미한다.
보존적 치환기:
1 알라닌(A) 글리신(G) 세린(S) 트레오닌(T)
2 아스파라틱산(D) 글루탐산(E)
3 아스파라긴 (N) 글루타민(G)
4 아르기닌(R) 시스티딘(H) 리신(K)
5 이소루이신(I) 루이신(L) 메티오닌(M) 발린(V)
6 페닐알라닌(F) 티로신(Y) 트립토판(W)

"비-폴리펩티드 부분 부착용으로 구성된 아미노산 잔기"는 아미노산 잔기가 비-폴리펩티드 부분에 결합하거나(도입된 아미노산 잔기의 경우) 또는 결합된(제거된 아미노산 잔기의 경우) 경우를 말한다.
주어진 기질과 관련하여 사용된 "면역원성(immunogenicity)" 은 면역계로부터 반응을 유도하는 기질의 능력을 가르키는 것으로 의도된다. 면역 반응은 세포 또는 항체 매개된 반응일 수 있다(예를 들면, Roitt: Essential Immunology(8th Edition, Blackwell) 면역원성의 더 추가된 정의에 대한). 통상적으로, 감소된 항체 반응성은 감소된 면역원성을 가르키는 것이다. 감소된 면역원성은 본 기술분야에서 공지된 어떤 적절한 방법의 이용에 의해서, 예를 들면 in vivo 또는 in vitro 로 결정될 수 있다.
"in vivo 기능성 반감기"는 통상적인 의미로는 폴리펩티드 또는 접합체 분자의 생물학적 활성의 50%가 몸체/목표 기관에서 아직 존재하는 시간이나 또는 폴리펩티드 또는 접합체의 활성이 초기 값의 50 % 인 시간이다. 기능성 in vivo 반감기를 측정하는 대안으로서, "혈청 반감기" 가 결정될 수 있는데 즉 폴리펩티드 또는 접합체 분자의 50 % 가 제거되기 전에 혈청 또는 혈류에서 순환하는 시간이다. 혈청 반감기에 대한 선택적인 용어는 "혈장 반감기", "순환반감기", 혈청 클리어런스", "혈장클리어런스" 및 "클리어런스 반감기"를 포함한다. 폴리펩티드 또는 접합체는 정상적으로는 망상내피세포시스템(RES), 신장, 비장 또는 간중 한가지 이상의 작용에 의해, 수용체-매개 분해 또는 특이성 또는 비특이성 단백질분해, 상세하게는 수용체-매개 클리어런스 및 신장 클리어런스에 의해 제거된다. 통상적으로, 클리어런스는 크기(사구체 여과에 의한 걸러지는 범위에 따라), 전하, 부착된 탄수화물 사슬 및 단백질에 대한 세포 수용체 존재여부에 따라 달라진다. 보유되는 기능성이란 증식성 또는 수용체 결합 활성중에서 선택될 수 있다. in vivo 기능상 반감기및 혈청 반감기는 기술분야에서 공지된 적절한 방법에 의해서 하기 물질과 방법 부분에서 더 논의되는 것처럼 측정될 수 있다.
in vivo 기능성 반감기 또는 혈청 반감기에 대해서 사용되는 "증가"는 예를 들면, 접합체 또는 폴리펩티드의 관련 반감기가 통계적으로, 필적하는 조건하에서 측정되었을 때 비-접합된 hG-CSF(예를 들면 Neupogen?)와 같은 기준 분자의 증가에 대해서 상대적으로 유의성이 있는 수준에서 증가된 것을 가르킨다. 예를 들면, 관련 반감기는 적어도 약 25 %, 가령 적어도 약 50 %, 예를 들면 적어도 약 100 %, 200 %, 500 % 또는 1000 % 증가할 수 있다.
"신장 클리어런스"는 그 통상의 의미에 있어서, 신장에서 일어나는 어떤 클리어런스, 예를 들면 사구체 여과, 관상 배설, 관상 제거를 가르키기 위해서 사용 된다. 신장 클리어런스는 크기(직경), 대칭, 형상/강성 및 전하를 포함하는 접합체의 물리적 특성에 의존한다. 감소된 신장클리어런스는 어떤 적절한 측정, 예를 들면, 확립된 in vivo 측정에 의해서 확립될 수 있다. 전형적으로, 신장 클리어런스는 표지된(예를 들면, 방사선 또는 형광 표지된)폴리펩티드 접합체를 환자에게 투여하고 그리고 환자로부터의 소변으로부터 표지활성을 측정하는 것에 의해서 결정된다. 감소된 신장 클리어런스는 상응하는 기준 폴리펩티드, 예를 들면 상응하는 비-접합된 폴리펩티드, 비-접합된 상응하는 야생형 폴리펩티드 또는 다른 접합된 폴리펩티드(발명에 따르지 않는 접합된 폴리펩티드와 같은)에 대해서 필적하는 조건하에서 상대적으로 결정된다. 바람직하게는, 접합체의 신장 클리어런스 속도는 관련 기준 폴리펩티드와 비교할 경우 적어도 50 % 감소하고 바람직하게는 적어도 75 %, 가장 바람직하게는 적어도 90 % 감소된다.
일반적으로, 수용체의 활성은 수용체-매개 클리어런스(RMC)와 결합되고, 수용체의 활성화가 RMC 에 이르는 반면, 활성화가 없는 그 수용체에 대한 폴리펩티드의 결합은 RMC 에 이르지 못한다. 클리어런스는 수용체-결합된 폴리펩티드와 이어지는 리소솜적 분해의 내재화에 기인한다. 감소된 RMC 는 접합체를 최적의 in vivo 생물학적 반응을 얻고, 그러한 반응을 얻기 위해 요구되는 것보다 더 많은 수용체의 활성을 피하기 위해, 충분한 수의 수용체를 결합하고 활성화 할 수 있도록 하기 위해서 설계하는 것에 의해서 성취될 수 있다. 이것은 감소된 in vitro 생활성 및/또는 증가된 오프-속도에서 반영될 수 있다.
전형적으로, 감소된 in vitro 생활성은 감소된 유용성/효율 및/또는 감소된 효능을 반영하고, 이러한 특성들을 측정하는 어떤 적절한 방법에 의해서 측정될 수 있다. 예를 들면, in vitro 생활성은 루시페라아제계 분석(물질과 방법을 참조)에서 결정될 수 있다. 접합체의 in vitro 생활성은 적어도 30 %, 예를 들면, 적어도 50 %, 60 % 또는 75 %, 예를 들면 적어도 90 % 가, 필적하는 조건하에서 측정된 상응하는 기준 폴리펩티드의 in vitro 생활성에 비교할 때, 감소될 수 있다. 다르게 표현하면, 접합체는 상응하는 비-접합된 폴리펩티드 또는 상응하는 야생형 폴리펩티드의 생활성의 약 1 % 만큼, 전형적으로는 적어도 약 2 % 정도, 예를 들면 적어도 약 5 %정도만큼 적은 in vitro 생활성을 가질수 있다. 예를 들면, in vitro 생활성은 기준 폴리펩티드의 생활성의 약 1 - 50 %의 범위내일 수 있으며, 예를 들면 약 2 - 40 %, 예를 들면 약 5 - 25 % 이다. 수용체-매개 클리어런스를 감소시키기 위해서, 감소된 in vitro 생활성이 필요한 경우에, 소정의 수용체 활성을 얻기 위해서 충분한 생활성이 그럼에도 불구하고 유지되어야 한다는 것이 명백할 것이다.
바람직하게, 폴리펩티드 접합체와 그 수용체사이에서 증가된 오프레이트는, 어떤 수용체-리간드 복합체의 실질적인 내재화(intenalisation)가 일어나기 전에 수용체로부터 방출된 폴리펩티드 접합체의 결과로 나타나는 등급이다. 수용체-폴리펩티드 결합 친화도(오프레이트를 포함하는)는 여기서 물질과 방법 부분에서 기술되는 것과 같이 결정될 수 있다. in vitro RMC 는 폴리펩티드 접합체를 표지(예를 들면, 방사선 또는 인광 표지)하고, 폴리펩티드 수용체를 포함하는 세포를 자극하고, 세포를 세척하고, 그리고 표지 활성을 측정하는 것에 의해서 결정될 수 있다. 적절한 배양시간 후, 상층액이 제거되고, 유사한 세포를 함유하는 웰(well)에 옮겨진다. 상층액에 대한 이러한 세포들의 생물학적 반응은 상대적으로 비-접합 폴리펩티드 또는 다른 기준 폴리펩티드에 대해서 상대적으로 결정되며, 이것은 감소된 RMC 의 정도의 측정이다.
통상적으로, 접합체의 감소된 in vitro 생활성은 비-폴리펩티드 부분에 의한 그것의 변형의 결과로서 얻어진다. 그러나, in vitro 생활성을 더 감소시키거나 또는 다른 이를 때문에, 접합체의 폴리펩티드 부분을 더 변형시키는 것이 이로울 수 있다. 예를 들면, 한 실시예에서, 폴리펩티드의 수용체 결합부위 또는 근방에 위치된 적어도 하나의 아미노산 잔기는, 상응하는 야생 폴리펩티드와 비교시에 감소된 in vitro 활성을 얻기 위해서, 다른 아미노산 잔기로 치환될 수 있다. 치환에 의해서 도입된 아미노산 잔기는 접합체의 in vitro 생활성을 감소시킬 수 있는 어떤 아미노산 잔기일 수 있다. 편의적으로, 도입된 아미노산 잔기는 여기서 정의된 비-폴리펩티드 부분에 대한 부착기를 포함할 수 있다. 상세하게는, 비-폴리펩티드 부분이 PEG 와 같은 폴리머 분자일 때, 도입된 아미노산 잔기는 라이신 잔기일 수 있다.
"G-CSF 활성을 나타내는"이란 용어는 폴리펩티드 또는 접합체가 내생 G-CSF, 상세하게는 SEQ ID :1 에서 나타난 아미노산 서열을 가지는 hG-CSF 의 기능을 하나이상 가지며, G-CSF 수용체(Fukunaga 등, J. Bio. Chem, 265:14008, 1990)에 결합하는 능력을 포함하는 것을 가르키는 것으로 의도된다. G-CSF 활성은 편리하게 다음의 물질 및 방법 부분에서 기술된 제 1 의 측정을 이용하여 측정된다. G-CSF 활 성을 "나타내는" 폴리펩디트는 그것이 측정할 수 있는 기능, 예를 들면 측정할 수 있는 증식 활성 또는 수용체 결합 활성(예를 들면, 물질과 방법 부분에서 기술된 제 1 측정에 의해서 결정된)을 나타낼 때, 그러한 활성을 가지는 것으로 고려된다. G-CSF 를 활성을 나타내는 폴리펩티드는 "G-CSF 분자"로 여기서 또한 명명된다.
"모체 G-CSF" 또는 "모체 폴리펩티드"라는 용어는 본 발명에 따라서 변형된 분자를 가르키는 것으로 의도된다. 모체 G-CSF 는 통상적으로 hG-CSF 또는 그 변형이다. "변형" 은 모체 폴리펩티드와 하나이상의 아미노산 잔기, 통상적으로 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 및 15 아미노산 잔기가 다른 폴리펩티드이다. rhG-CSF 의 예는 필그라스팀(Gran?및 Neupogen?), 레노그라스팀(Neutrogin? 및 Granocyte? ) 및 나르토그라스팀( Neu-up? )을 포함한다.
본 발명의 접합체
상기에서 언급한 바와 같이, 제 1 측면에서 본 발명은 G-CSF 활성을 나타내는 폴리펩티드, 이것은 비폴리펩티드 부분에 대한 부착기를 포함하는 특정의 도입 또는 제거된 아미노산 잔기에서 선택된 아미노산 잔기에 있어서, SEQ ID NO:1 의 아미노산 서열과 상이한 아미노산 서열을 포함하며, 폴리펩티드의 부착기에 부착된 적어도 하나의 비폴리펩티드를 포함하는 접합체에 관한 것이다. 도입된 및/또는 제거된 아미노산 잔기는 다음의 부분에서 더 자세히 기술된다. 접합체 자체는 또한 G-CSF 활성을 나타내는 것으로 이해된다.
비폴리펩티드 부분에 대한 부착기를 포함하는 아미노산 잔기를 제거 및/또는 도입하는 것에 의해, 분자를 비폴리펩티드 선택 부분에 대한 접합에 보다 민감하게 하여, 접합 패턴을 최적화하고(예를 들면, G-CSF 분자의 표면상에서 비폴리펩티드 부분의 최적의 분산을 확실하게 하기 위해서, 그리고 접합되도록 의도된 부착기가 단지 분자내에서 존재한다는 것을 확실하게 하기 위해서)그리고 그에 의해서 오늘날 이용가능한 G-CSF분자와 비교할 경우에 하나이상의 보다 향상된 특성을 가질 뿐아니라 G-CSF 활성을 가지는 새로운 접합 분자를 얻도록 하기 위해서 폴리펩티드를 특정적으로 변형시키는 것이 가능하다.
폴리펩티드는 어떤 기원(origin), 상세하게는 포유류 기원일 수 있으며, 그것은 현재로서는 인간기원인 것이 바람직하다.
본 발명의 바람직한 실시예에서, G-CSF 활성을 가지는 폴리펩티드의 하나 이상의 아미노산 잔기가 변형되며, 예를 들면 변형은 비폴리펩티드 선택부분에 대한 부착기를 포함하는 아미노산 잔기를 도입하는 것 뿐만아니라 제거를 포함한다.
비폴리펩티드 부분에 대한 부착 부위의 제거 및/또는 도입을 목적으로한 여기서 공개된 아미노산 변형 뿐만아니라, 본 발명의 폴리펩티드의 아미노산 서열은 원할 경우 부착기의 도입 또는 제거와 연관될 필요가 없는 다른 변형 즉 다른 치환, 삽입 또는 제거를 포함할 수 있다. 예를 들면, 이들은 하나이상의 아미노산 잔기에 의한 N-말단 및/또는 C-말단의 절단 또는 N-말단 및/또는 C-말단에서 하나이상의 추가적인 잔기의 삽입, 예를 들면 N-말단에서 메티오닌 잔기의 삽입을 포함한다.
본 발명의 접합체는, hG-CSF 에 비해서, 상세하게는 rhG-CSF(예를 들면, 필그라스팀, 레노그라스팀 또는 나르토그라스팀) 또는 공지된 hG-CSF 변형에 비교할 경우 하나이상의 다음의 향상된 특성을 가진다: 증가된 기능성 in vitro 반감기, 증가된 혈청 반감기, 감소된 신장 클리어런스, 감소된 수용체-매개 클리어런스, 감소된 골통과 같은 부작용, 및 감소된 면역원성.
비폴리펩티드 부분에 대한 부착기를 포함하는 아미노산 잔기는, 그것이 제거되든 도입되든간에, 비폴리펩티드 선택부분의 특성에 기초하고 그리고, 대부분의 예에서, 폴리펩티드와 비폴리펩티드 부분사이에서 접합이 성취되는 방법에 기초하여 선택되는 것으로 이해될 것이다. 예를 들면, 비폴리펩티드 부분이 폴리에틸렌 글리콜 또는 폴리알킬렌 옥사이드와 같은 폴리머 분자일 경우, 부착기를 포함하는 유도된 분자 아미노산 잔기는 라이신, 시스테인, 아스파라틱 산, 글루탐산, 히스티딘 및 아르기닌으로 이루어진 그룹에서 선택될 수 있다. 라이신 잔기에 대한 접합이 성취될 때, 적절한 활성 분자는 예를들면, Shearwater Polymer, Inc. 의 mPEG-SAP, 옥시카르보닐-옥시-N-디키르복시이미드-PEG(US 5,122,614),또는 PolyMASC Phaemaceuticals plc.로부터 이용가능한 PEG 이다. 이들 중 제일 처음은 하기에서 더 기술될 것이다.
모체 hG-CSF 분자의 구조와 기능의 너무 많은 분열을 피하기 위해서, 본 발명에 따라 변형된 아미노산 잔기의 총수는, 예를 들면 여기서 다음 부분에서 기술된 것과 같이,(SEQ ID NO:1 에서 나타난 아미노산 서열과 비교시) 전형적으로 15 를 초과하지 않을 것이다. 도입되거나 또는 제거되는 아미노산 잔기의 추가적인 수 와 아미노산 잔기의 타입은 상세하게는 소정의 특성과 접합도(예를 들면, 비폴리펩티드부분의 동일성, 얼마나 많은 비폴리펩티드 부분들이 폴리펩티드에 접합하는 것이 바람직한가 또는 가능한가, 어디에서 접합이 바람직하고 또는 피해져야하는가 등등)에 의존한다. 바람직하게, 발명의 접합의 폴리펩티드 부분 또는 발명의 폴리펩티드는 1 - 15 아미노산 잔기가 SEQ ID NO:1에서 나타난 아미노산 서열과 다른 아미노산 서열, 전형적으로는 2 - 10 아미노산 잔기, 예를 들면 4 -6 아미노산 잔기와 같은 3 -8 아미노산 잔기가 SEQ ID NO:1에서 나타난 아미노산 서열과 다른 아미노산 서열을 포함한다. 그래서, 통상적으로, 본발명의 접합체의 폴릴펩티드 부분 또는 폴리펩티드는 SEQ ID NO:1에서 보여지는 아미노산 서열과는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 및 15 아미노산 잔기에서 다른 아미노산 서열을 포함한다.
접합체의 폴리펩티드 부분은 전형적으로 SEQ ID NO:1과 적어도 80 % 이상, 바람직하게는 적어도 90 %, 예를 들면 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 가진다. 아미노산 서열 상동성/동일성 은 편의적으로, 예를 들면 the ClustalW program, version 1.8, June 1999를 이용하며, 결점 인자(Thompson et al., 1994, ClustalW: Improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, position-specific gap penalties and weight matrix choice, Nucleic Acids Research, 22:4373 - 4680)를 이용하는 정열된 서열로부터, 또는 GENEDOC 버젼 2.5(Nicholas, K. B., Nicholas H.B. Jr., and Deerfield,D.W.II. 1997 GeneDoc: Analysis and Visualization of Genetic Variation, EMBNEW.NEWS 4:14: Nicholas, K.B. and Nicholas H.B. Jr. 1997 GeneDoc: Analysis and Visualization of Genetic Version) 이용에 의한 PFAM 군 데이타베이스 버젼 4.0(http://pfam.wustl.edu/)로부터 결정된다.
바람직한 실시예에서, 폴리펩티드의 아미노산 서열과 SEQ ID NO:1에서 보여지는 아미노산 서열사이의 한 차이는 비폴리펩티드 부분에 대한 부착기를 포함하는 적어도 하나 또는 자주 그이상 예를 들면 1 - 15 아미노산 잔기가 아미노산 서열에 도입된, 바람직하게는 치환에 의해서 것이다. 그에 의해서, 폴리펩티드 부분은 비폴리펩티드 선택부분이 결합하는 특정 아미노산 잔기의 내용에서 변형되고, 그에 의해 보다 효율적이고, 특이적 및/또는 광범위한 접하이 성취된다. 예를 들면, 선택의 비폴리펩티드에 대한 부착기를 포함하는 아미노산 잔기의 총수는 최적화된 수준까지 변형되고, 접합체의 클리어런스는 전형적으로 충분히 감소되며, 접합에 의해서 이루어진 변형된 형태, 크기 및/또는 전하에 기인한다. 게다가ㅏ. 선택의 비폴리펩티드에 대한 부착기를 포함하는 아미노산 잔기의 총수가 증가될 때, 폴리펩티드 분자의 더 많은 비율이 선택의 비폴리펩티드부분에 의해서 가려지고, 적은 면역 반응에 이르게 된다.
"한 차이"는 본 발명 출원에서 현존하는 추가적인 차이를 허용하는 것으로 의도된다. 따라서, 특정 아미노산 차이 뿐만아니라 여기서 특정된 것보다 다른 아미노산 잔기가 변화될수 있다.
발명의 다른 실시예에서, 폴리펩티드의 아미노산 서역과 SEQ ID NO:1에서 보여지는 아미노산 서열에서의 한 차이는 비폴리펩티디 부분에 대한 부착기를 포함하 는 부착기를 포함하는 적어도 하나 바람직하게는 예를 들면 1 - 15 와 같이 더 많은 아니노산 잔기가 아미노산 서열에서 제거, 바람직하게는 치환되는 것이다. 선택의 비폴리펩티드 부분에 대한 부착기를 포함하는 하나 이상의 아미노산 잔기를 제거함으로서, 그러한 접합이 불이익한, 예를 들면 폴피펩티드의 기능성 부위 또는 근방에 위치한 아미노산잔기(그러한 사이트에서 접합이 손상된 수용체 인식에 기인한 결과적인 접합의 비활성화 또는 감소된 G-CSF 활성에 이를수 있기 때문이다), 폴리펩티드 부분에서 비폴리펩티드 부분에 대한 접합을 피하는 것이 가능하다. 본 발명의 문맥에서 "기능성 부분"은 hG-CSF 의 기능 또는 역할에 필수적인 또는 그렇지 않으면 관련된 하나이상의 아미노산 잔기를 가르키는 것으로 의도된다. 그러한 아미노산 잔기는 기능성 부분의 일부이다. 기능성 부분은 본 분야에서 공지된 방법에 의해서 결정될 수 있으며, hG-CSF 수용체(Aritomi 등. Nature 401:713-717,1999)와 같은 관련된 수용체에 복합되는 폴리펩티드 구조의 분석에 의해서 바람직하게 확인될 수 있다.
다른 실시예에서, 폴리펩티드의 아미노산 서열은 SEQ ID NO:1에서 보여진 아미노산 서열과 다음과 같이 다르다: a)비폴리펩티드부분에 대한 부착기를 포함하며, SEQ ID NO:1에서 보여진 아미노산 서열에 존재하는 적어도 하나의 특정 아미노산 잔기가 제거되고, 바람직하게는 치환에 의해서, b) 비폴리펩티드 부분에 대한 부착기를 포함하는 적어도 하나의 특정 아미노산 잔기가 아미노산 서열에 도입되고, 바람직하게는 치환되고, 특정 아미노산 잔기는 여기의 하기에서 기술된 것들중의 하나이다. 이 실시예는 선택의 비폴리펩티드부분에 대한 최적의 접합을 얻기위 해서 폴리펩티드를 특이적으로 설계하는 것이 가능하다는 점에서 특별히 잇점이 있는 것으로 고려된다. 예를들면, 하기에서 공개된 것과 같이 선택된 아미노산의 도입 또는 제거에 의해서, 선택의 비폴리펩티드 부분에 대한 부착기의 최적의 분산을 보증하는 것이 가능하며, 이것은 과도한 구조적 파열과 그로인한 폴리펩티드 기능의 손상을 일으킴이 없이 a) 에피토프 및 다른 폴리펩티드의 표면부분을 효과적으로 막기 위해서, 및 b) 접합의 최적의 스트로크 반경을 보증하기 위해서 비폴리페펩티드 부분이 위치된 접합체를 야기시킨다.
본 발명의 접합체는 일반적으로 충분한 수 및 타입의 비폴리펩티드 부분을 포함하며, hG-CSF, 예를 들면, 필그라스팀, 레노그라스팀, 또는 나르토그라스팀과 비하여, 바람직하게는 단일 N-말단에 부착된 20 kDa PEO 부분을 포함하는 rhG-CSF 에 비하여 증가된 기능성 in vivo 반감기 및/또는 혈청 반감기를 가지는 접하자를 제공한다. 증가된 기능성 in vivo 반감기는 편의적으로 여기서 물질 및 방법에서 기술된 것처럼 측정된다.
발명의 접합체는 적어도 하나의 비-접합된, 비폴리펩티드 부분에 접합가능한 부착기를 포함할 수 있다. 본 문맥에서, "접합가능한 부착기" 는 접합을 위한 접근 가능한 폴리펩티드 위치에 위치된 부착기를 가르키며, 특별한 경고가 없으면 접합을 겪을 때 관련된 비폴리펩티드 부분에 접합되는 것으로 의도된다. 예를 들면, 그러한 부착기는 폴리펩티드가 그 활성을 나타내기 위해서 관련되거나 또는 그렇지 않으면 필수적인 아미노산 잔기의 부분일수 있다. 다른 접합가능한 부착기의 부착을 피하기 위한 편리한 방법은 헬퍼(helper) 분자를 이용하여 부착기를 차단하는 것으로 예를들면 "기능성 부위의 차단(blocking)" 부분에 기술된 것과 같다. 비접합된, 접합가능한 부착기의 수는 특이적 G-SCF폴리펩티드와 접합가능한 부착기의 위치에 달려있다. 예를 들면, 폴리펩티드 접합체는 하나 이상의 비접합된, 접합가능한 부착기, 적어도 하나 바람직하게는 두개 이상의 접합된 부착기를 포함한다.
발명의 접합체, 여기에서 비-폴리펩티드 부분은 라이신 또는 N-말단 아미노산 잔기에 부착된다
한편으로는 본 발명은 다음을 포함하는 폴리펩티드 접합체에 관련된다.
i) SEQ ID NO:1에서 보여진 아미노산 서열과 하기로 이루어진 그룹에서 선택된 적어도 하나의 치환에 있어서 상이한 아미노산 서열을 포함하는 G-CSF 활성을 나타내는 폴리펩티드:
Figure 112002022035895-pct00001
ii) 폴리펩티드의 라이신 잔기에 부착된 비폴리펩티드부분.
hG-CSF 는 4 개의 라이신 잔기를 포함하며, K16 은 수용체-결합 부위에 위치 하고 그리고 다른 것들은 23, 34 및 40 위치에 각각 위치되며, 모두 상대적으로 수용체-결합 부분에 가깝다. 이들 라이신 잔기의 하나 이상에 대한 접합을 피하기 위해서(이것이 비활성화되거나 또는 결과적인 접합체의 활성이 심히 감소되기 때문에) 적어도 하나의 라이신 잔기, 예를 들면, 두개, 세개 또는 이들 잔기 전부를 제거하는 것이 바람직할 수 있다. 따라서, 본 발명의 다른, 보다 바람직한 측면에서, 본 발명은 상기에서 정의된 폴리펩티드 접합체에 관련되며, 여기서 K16, K23, K34 및 K40 으로 구성된 그룹으로부터 선택된 아니모산 잔기의 적어도 하나가 삭제되거나 또는 다른 아미노산 잔기로 치환된다. 바람직하게는, 적어도 K16 이 다른 아미노산 잔기로 치환되는 것이 바람직하다.
바람직한 아미노산 치환의 예는 Q70K, Q90K, T105K, Q120K 및 T133K의 하나 또는 이상, 예를 들면 이들 치환의 두개, 세개 또는 4 개를 포함한다. 예를들면
Figure 112002022035895-pct00002
이다.
본 부분에서 기술된 제 2 측면에 따른 접합체 폴리펩티드(즉 적어도 하나가 도입되고 그리고 하나가 제거된 라이신)는 K16R, K16Q, K23R, K23Q, K34R, K40R 및 K40Q 로 이루어진 그룹에서 선택된 바람직하게는 적어도 하나 예를 들면 하나, 둘, 셋 또는 네개의 치환을 포함하며,보다 바람직하게는 K16R 및 K23R 치환의 적어도 하나를 포함하며, 그에 의해서 이러한 잔기들의 접합은 피해질 수 있다. 바람직하게는, 폴리펩티드는 K16R+K23R, K16R+K34R, K16R+K40R, K23R+K34R, K23R+K40R, K34R+K40R, K16R+K23R+K34R, K16R+K23R+K40R, K23R+K34R+K40R, K16R+K34R+K40R, 및 K16R+K23R+K34R+K40R 로 이루어진 그룹으로부터 선택된 적어도 하나의 치환이다. 이러한 치환들은 내생 또는 모체 폴리펩티드와 비교시 최소 구조적 차이를 일으키는 경향이 있다.
상기에 나열된 치환외에도, 본발명의 폴리펩티드 접합은 R22K, R146K, R147K, R166K 및 R19K 로부터 선택된 하나이상의 치환을 또한 포함한다.
발명의 이러한 측면에 따른 접합체의 비폴리펩티드 부분이, 주어진 접합을 이용할 때, 방법이 탄수화물 부분과 같은 부착기로서 라이신을 가지는 어떤 분자일 수 있는 반면, 비폴리펩티드 부분은 폴리머 분자인것이 바람직하다. 폴리머분자는 "폴리머 분자에 대한 접합"의 부분에서 언급된 분자중 하나일 수 있으며, 그러나 직쇄, 또는 가지쇄 폴리에틸렌 글리콜 또는 다른 폴리알킬렌 옥사이드로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것이 바람직하다. 바람직한 폴리머 분자는 예를 들면, Shearwater Polymers, Inc 로부터의 mPEG-SAP, 또는 옥시카르보닐-옥시-N-디카르보시이미드 PEG(US 5,122,614)이다.
이 부분에서 특정된 어떤 아미노 산의 변화, 상세하게는 치환은 글리코실화 부위의 도입 및/또는 제거를 포함하면서, 특정한 아미노산 변형을 공개하는 다른 부분에서 특정된 어떤 아미노산 변화, 바람직하게는 치환과 결합될 수 있다.
본 발명의 접합체, 여기서 비폴리펩티드 부분은 시스테인을 부착기로 가진 다.
다른 측면에서 본 발명은 다음을 포함하는 접합체에 관련된다.
i) SEQ ID NO:1에서 보여진 hG-CSF 의 아미노산 서열과, 하기로 이루어진 그룹에서 선택된 적어도 하나의 치환에 있어서, 상이한 아미노산 서열을 포함하는 G-CSF 활성을 나타내는 폴리펩티드:
Figure 112002022035895-pct00003
ii) 폴리펩티드의 시스테인 잔기에 부착된 비폴리펩티드부분.
hG-CSF 의 수용체 결합 영역은 시스테인에 참가하지 않고, 그리고 시스테인에 대한 비폴리펩티드 부분의 접합을 피하기 위해서 유리하게 제거될 수 있는 17 위치의 시스테인 잔기를 함유한다. 따라서 다른, 더 바람직한 측면에서, 본 발명은 다음을 포함하는 접합체에 관련된다.
i) SEQ ID NO:1에서 보여진 아미노산 서열과 하기로 이루어진 그룹에서 선택된 적어도 하나의 치환에 있어서 상이한 아미노산 서열을 포함하며, 다른 어떤 아미노산 잔기, 예를 들면, 세린 잔기로 C17 의 제거, 바람직하게는 C-17 의 치환과 조합되는, G-CSF 활성을 나타내는 폴리펩티드
:
Figure 112002022035895-pct00004
및
ii) 부착기로서 시스테인 잔기를 가지는 비폴리펩티드부분.
본 발명의 이러한 측면에 따른 바람직한 치환은 시스테인으로 아르기닌의 치환이며, 예를 들면, R146C, R147C, R166C 및 R169C 중에서 하나 이상이다.
이 부분에서 특정된 어떤 아미노 산의 변화, 상세하게는 치환은 글리코실화 부위의 도입 및/또는 제거를 포함하면서, 특정한 아미노산 변형을 공개하는 다른 부분에서 특정된 어떤 아미노산 변화, 바람직하게는 치환과 결합될 수 있다.
비폴리펩티드 부분이 산기 또는 C-말단 아미노산 잔기와 결합하는 본 발명의 접합체
또 다른 측면에서 본 발명은 하기를 포함하는 접합체에 관련된다.
i) SEQ ID NO:1에서 보여진 아미노산 서열과 하기로 이루어진 그룹에서 선택된 적어도 하나의 치환에서 상이한 아미노산 서열을 포함하는 G-CSF 활성을 나타내 는 폴리펩티드
Figure 112002022035895-pct00005
Figure 112002022035895-pct00006
및
ii) 아스파라틱산 또는 글루탐산잔기를 부착기로 가지는 비폴리펩티드부분.
본 발명의 이러한 측면에 따라서, 바람직한 실시예는 Q67D/E, Q70D/E, Q77D/E, Q86D/E, Q90D/E, Q120D/E, Q131D/E, Q134D/E, Q145D/E, 및 Q173D/E를 포함한다.
상기 열거된 치환이외에도, 상기 한 측면에 따른 접합체의 폴리펩티드는 D27, D104, D109, D112, E19, E33, E45, E46, E93, E98, E122, E123, 및 E163 으로 이루어진 그룹에서 선택된 아미노산 잔기중 적어도 하나의 제거, 바람직하게는 치환을 포함한다. 치환은 어떤 다른 아미노산 잔기, 상세하게는 아스파라긴 또는 글루탐산에 대한 것일 수 있으며, 그에 의해서 이러한 잔기들의 접합은 피해질 수 있다. 상세하게는 폴리펩티드는 하기의 치환 중 적어도 하나를 포함할 수 있다: D27N, D104N, D109N, D112N, E19Q, E33Q, E45Q, E46Q, E93Q, E98Q, E122Q, E123Q 및 E163Q. 바람직하게는 상기 위치의 하나 이상에서 아미노산 치환은 하기 치환 중 적어도 하나와 추가적으로 결합될 수 있다: D109N, D112N, E19Q, E122Q, 및 E123Q. 이들 아미노산 잔기중 하나로의 치환은 최소 구조적 차이를 발생시키는 경향이 있다.
본 발명의 이러한 측면에 따른 접합체의 비폴리펩티드 부분은, 이것은 부착기로서 산기를 가지고 있으며, 그러한 특성을 가지는 어떤 비폴리펩티드일 수 있을지라도, 현재로서는 비폴리펩티드 부분이 폴리머 분자 또는 유기유도화제, 상세하게는 폴리머 분자인 것이 바람직하며, 접합체는 예를 들면, Sakane and Pardridge, Pharmaceutical Research, Vol. 14, No. 8, 1997, pp 1085 - 1091 에 기술된 것처럼 제조될 수 있다.
이 부분에서 특정된 어떤 아미노 산의 변화, 상세하게는 치환은 글리코실화 부위의 도입 및/또는 제거를 포함하면서, 특정한 아미노산 변형을 공개하는 다른 부분에서 특정된 어떤 아미노산 변화, 바람직하게는 치환과 결합될 수 있다.
발명의 다른 접합체
상기에서 특정된 비-폴리펩티드 부분, 예를 들면, "발명의 접합체...." 제하 의 부분 이외에도, 발명의 접합체는 글리코실화 숙주 세포 및 글리코실화 부위 또는 도입된 글리코실화 부위에서 성취된 글리코실화에서 발현된 폴리펩티드의 결과로서 탄화수소 부분을 더 함유할 수 있다.
비폴리펩티드 부분이 탄화수소 부분인 발명의 접합체
다른 측면에서, 발명은 G-CSF 활성을 나타내는 글리코실화된 폴리펩티드에 관한 것이며, 이것은 SEQ ID NO:1 에서 보여지는 것과는 적어도 하나의 비자연적으로 발생한 글리코실화 부위가 아미노산 서열에 하기로 구성된 그룹에서 선택되는 적어도 하나의 치환을 통해서 도입된다는 점에서 차이가 있는 아미노산 서열을 포함한다.
Figure 112002022035895-pct00007
여기서 S/T 는 S 또는 T 잔기, 바람직하게는 T 잔기를 가르킨다.
이러한 측면에 따른 접합체를 제조하기 위해서, 폴리펩티드는 글리코실화 부위에서 올리고당 부분을 부착할 수 있는 글리코실화 숙주세포에 발현되거나 또는 선택적으로 in vitro 글리코실화를 겪어야 한다. 글리코실화 숙주세포의 예는 "당부분의 커플링" 제하의 더 아래 섹션에서 주어진다.
선택적으로 이러한 측면에 따른 접합체는 G-CSF 활성을 나타내는 폴리펩티드를 포함하며, 이것은 SEQ ID NO:1에서 보여지는 것과는 P5N, A6N, P10N, P60N, L61N, L78N, F113N, 및 E162N 으로 이루어진 그룹, 상세하게는 P5N, A6N, P10N, P60N, L61N, F113N 및 E162N 으로 구성된 그룹, 예를 들면, P60N, L61N, F113N, 및 E162N 으로 구성된 그룹에서 선택된 하나이상의 치환에서 차이가 있는 아미노산 서열을 포함한다.
선택적으로 이러한 측면에 따른 접합체는 G-CSF 활성을 나타내는 폴리펩티드를 포함하며, 이것은 SEQ ID NO:1에서 보여지는 것과는 D27N+A29S, D27N+A29T, D104N+L106S, D104N+L106T, D109N+A111S, D109N+A11T, D112N+A114S, 및 D112N+A114T 으로 이루어진 그룹, 상세하게는 D27N+A29S, D27N+A29T, D104N+L106S, D104N+L106T, D112N+A114S, 및 D112N+A114T 으로 구성된 그룹, 예를 들면, D27N+A29S, D27N+A29T, D104N+L106S, 및 D104N+L106T으로 구성된 그룹에서 선택된 하나이상의 치환에서 차이가 있는 아미노산 서열을 포함한다.
탄화수소 분자이외에도, 이 섹션에서 기술된 본 발명의 이러한 측면에 따른 접합체는 본 출원에서 기술된 것처럼, 접합체의 폴리펩티드 부분에서 존재하는 하 나이상의 부착기에 접합된 추가적인 비폴리펩티드부분, 상세하게는 폴리머 분자를 함유할 수 있다 .
이 섹션에서 특정된 어떤 아미노산의 변화, 상세하게는 치환은 어떤 아미노산 변화, 상세하게는 특정한 아미노산 변화를 여기서 공개하는 다른 섹션에서 특정된 것과 결합할 수 있는 것으로 이해될 것이다.
원형 치환 변이체
다른 실시예에서, 본 발명의 폴리펩티드 접합체의 폴리펩티드 부분은 여기서 다른 상태로 공개되는 폴리펩티드의 원형 치환 변이체의 형태일 수 있다. 그러한 원형 치환 변이된 폴리펩티드에서, 새로운 N- 및 C-말단들이 원래 펩티드 결합에 의해서 연결되어 있던 두 인접 아미노산 잔기 사이에 형성되는 반면, 원래 N-말단 및 C-말단은 함께 직접적으로 펩티드 결합 또는 간접적으로 펩티드 링커를 통해서 결합된다. 원N - 및 C- 말단들이 통상적으로 서로 약간의 거리에서 위치되기 때문에, 전형적으로 이들은 적절한 길이와 조성을 가지는 펩티드 링거를 이용해서 연결되어, 접합체의 활성과 구조는 불리하게 영향을 받지 않는다. 새로운 N-말단 및 C-말단은 이것이 폴리펩티드의 활성에 간섭하는 아미노산 잔기쌍 사이에서 형성되어서는 안된다는 것이 명백할 것이다. 원형 변이된 C-CSF 수용체 작용제는 US 6,100,070 에 공개되었으며, 이들을 각변이체로서 생산하는 방법이외에도 펩티드 링커와 새로운 N-말단, 및 C-말단의 위치에 대한 더 많은 정보가 참조문헌으로 기재되어 있다.
본 발명 접합체의 백혈구 세포 및 호중구 형성
다른 실시예에서, 본 발명의 폴리펩티드 접합체는 G-CSF 활성을 나타내며, SEQ ID NO:1 에서 보여지는 아미노산 서열과 적어도 하나의 아미노산 잔기에서 차이가 있는 아미노산 서열을 가지는 폴리펩티드를 포함하며, 폴리펩티드의 부착기에 부착된 적어도 하나의 비폴리펩티드 부분을 가지며, 폴리펩티드 접합체는 하기의 기준 (A)-(D) 중 적어도 하나를 더 만족하는 것으로 특징되어 질 수 있다:
(A) 쥐에게 kg 체중당 100 마이크로그램(접합체의 폴리펩티드 부분의 무게를 기준)의 한 피하 투약 후, 그것이:
i) 투약 후 12 시간동안 kg 체중당 비접합된 hG-CSF 의 100 마이크로그램의 투약과 적어도 대략 동일한 수준(혈액 리터당 세포의 숫자로 측정)에까지 적어도 대략 동일한 속도로 백혈구 세포의 형성이 증가시키고, 및
ii) 적어도 96 시간, 바람직하게는 적어도 120 시간동안 투약전 백혈구 세포의 수준이상으로 백혈구 세포의 수준(혈액 리터당 세포의 숫자로 측정)을 증가시키며;
(B) 쥐에게 kg 체중당 25 마이크로그램(접합체의 폴리펩티드 부분의 무게를 기준)의 한 피하 투약 후, 그것이:
i) 투약 후 12 시간동안 kg 체중당 비접합된 hG-CSF 의 100 마이크로그램의 투약과 적어도 대략 동일한 수준(혈액 리터당 세포의 숫자로 측정)에까지 적어도 대략 동일한 속도로 백혈구 세포의 형성을 증가시키고, 및
ii) 적어도 72 시간, 바람직하게는 적어도 96 시간, 가장 바람직하게는 적 어도 120 시간동안 투약전 백혈구 세포의 수준이상으로 백혈구 세포의 수준(혈액 리터당 세포의 숫자로 측정)을 증가시키며;
(C) 쥐에게 kg 체중당 100 마이크로그램(접합체의 폴리펩티드 부분의 무게를 기준)의 한 피하 투약 후, 그것이:
i) 투약 후 12 시간동안 kg 체중당 비접합된 hG-CSF 의 100 마이크로그램의 투약과 적어도 대략 동일한 수준(혈액 리터당 세포의 숫자로 측정)에까지 적어도 대략 동일한 속도로 호중구의 형성을 증가시키고, 및
ii) 적어도 96 시간, 바람직하게는 적어도 120 시간 동안 투약전 호중구의 수준이상으로 백혈구 세포의 수준(혈액 리터당 세포의 숫자로 측정)을 증가시키며;
(D) 쥐에게 kg 체중당 25 마이크로그램(접합체의 폴리펩티드 부분의 무게를 기준)의 한 피하 투약 후, 그것이:
i) 투약 후 12 시간동안 kg 체중당 비접합된 hG-CSF 의 100 마이크로그램의 투약과 적어도 대략 동일한 수준(혈액 리터당 세포의 숫자로 측정)에까지 적어도 대략 동일한 속도로 호중구의 형성을 증가시키고, 및
ii) 적어도 72 시간, 바람직하게는 96 시간, 가장 바람직하게는 120 시간동안 투약전 호중구의 수준이상으로 백혈구 세포의 수준(혈액 리터당 세포의 숫자로 측정)을 증가시킨다.
본 발명 접합체의 비-폴리펩티드 부분
상기에서 설명한 것과 같이, 본 발명 접합체의 비-폴리펩티드 부분은 적절하게는 폴리머, 친지성 화합물, 탄수화물 부분(in vivo 글리코실화반응을 통하여), 유기 유도된 물질에서 선택된다. 이와 같은 모든 물질은 접합체의 폴리펩티드 부분에 바람직한 성질을 부여하는데, 특히 in vivo 기능성 반감기의 증가 및/또는 혈청반감기 감소등의 성질을 부여한다. 접합체의 폴리펩티드 부분은 통상적으로는 비폴리펩티드 부분의 단지 한 타입에 접합될 수 있지만 또한 두가지 또는 그 이상의 상이한 형태의 비-폴리펩티드 부분 예를 들면, 폴리머 및 당 부분; 친지성 기와 당 부분; 유기 유도제 및 당 부분; 친지성 부분 및 폴리머 등에 접합될 수 있다. 두가지 또는 그 이상의 비-폴리펩티드 부분에 대한 접합은 동시에 또는 연속적으로 일어날 수 있다.
본 발명 접합체를 준비하는 방법
다음의 "친지성 화합물에 접합" , "폴리머에 접합", "당 부분에 접합", 및 "유기 유도제에 접합" 단락에서 특정 형태의 비-폴리펩티드 부분들에 접합이 기술된다. 일반적으로, 본 발명에 따른 폴리펩티드 접합체는 폴리펩티드의 발현에 도움을 주는 조건하에서 적절한 숙주세포를 배양하고, 폴리펩티드를 회수하는 것에 의해서 생산될 수 있으며, 여기서 a)폴리펩티드는 적어도 하나의 N- 또는 O-글리코실화 부위를 포함하며, 숙주세포는 in vivo 글리코실화 할 수 있는 eukaryotic 숙주세포이며, 및/또는 b)폴리펩티드는 in vitro 비폴리펩티드 부분에 접합을 겪는다.
친지성 화합물에 접합
폴리펩티드와 친지성 화합물은 직접 또는 링커를 통하여 서로 접합될 수 있다. 친지성 화합물은 포화된 또는 불포화된 지방산, 지방산 디케톤, 테르펜, 프로스타글란딘, 비타민, 카로테노이드, 또는 스테로이드와 같은 천연 화합물, 한 개 또는 그 이상의 알킬, 아릴, 알케닐, 또는 다른 다중 불포화 화합물을 가지는 탄산, 알코올, 아민, 설폰산과 같은 합성화합물이 될 수도 있다. 폴리펩티드 및 친지성 화합물간의 접합은, 선택적으로 링커를 통하며, 당분야에 공지의 방법 예를 들면, Bodanszky in Peptide Synthesis, John Wiley, New York, 1976 및 WO 96/12505에서 설명하는 방법으로 실시할 수 있다.
폴리머에 접합
폴리펩티드에 결합할 수 있는 폴리머는 어떤 적절한 폴리머 예를 들면, 천연 또는 합성 동종폴리머 또는 이종폴리머일 수 있으며, 전형적으로 분자량의 범위가 300-100,000 Da, 예를 들면 500-20,000 Da, 좀더 적절하게는 1000-15,000 Da 범위, 보다 더 적절하게는 2000-12,000Da범위, 예를 들면 3000 - 10,000의 이다. 여기서 폴리머 분자에 대해서 사용될 때, "약" 이란 말은 대략적인 평균 분자량을 가르키며, 통상적으로 주어진 폴리머 제조에서 어떤 분자량 평균 분포가 있다는 사실을 반영한다.
동종폴리머로의 예는, 폴리올(즉 poly-OH), 폴리아민(즉 폴리-NH2), 및 폴리카르복실산(즉 poly-COOH)를 포함한다. 이종폴리머는 상이한 결합기 예를 들면 하 이드록실 기 및 아민기를 포함하는 폴리머이다.
적절한 폴리머의 예는 폴리알킬렌 옥사이드(PAO)로 이루어진 그룹에서 선택되는 폴리머 분자를 포함하며, 폴리알킬렌 글리콜(PAG) 예를 들면, 직쇄 또는 가지쇄 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 및 폴리프로필렌 글리콜(PPG), 폴리-비닐 알코올(PVA), 폴리-카르복실레이트, 폴리(비닐피롤리돈), 폴리에틸렌-co-말레산 무수물, 폴리스트렌-co-말레산 무수물, 카르복실메틸-덱스트란을 포함하는 덱스트란, 또는 면역원성을 감소시키거나 및/또는 in vivo 기능적 반감기를 증가시키거나 및/또는 혈청 반감기를 증가시키는데 적절한 다른 바이오폴리머를 포함한다. 폴리머의 또 다른 예는 사람의 알부민 또는 다른 풍부한 혈장 단백질이 될 수 있다. 일반적으로, 폴리알킬렌 글리콜-유도된 폴리머는 생체 적합성이고, 비-독성이며, 항원을 일으키지 않으면서, 비-면역원성이고, 다양한 수용성 성질을 가지고, 살아있는 유기체로부터 용이하게 분비되는 성질을 가진다.
PEG가 이용할 수 있는 적절한 폴리머가 되는데, 그 이유는 덱스트란과 같은 폴리사카라이드등과 비교하였을 때, 가교가 가능한 반응기가 상당이 적기 때문이다. 특히, 단가기능성 PEG, 예를 들면 메톡시폴리에틸렌 글리콜(mPEG)이 적절한데, 그 이유는 이의 결합 화학이 상대적으로 간단하기 때문이다(폴리펩티드상에 부착기와 접합하는데 이용할 수 있는 것은 한 개 반응기 뿐이다). 결과적으로, 가교의 위험이 없어지고, 결과적인 폴리펩티드 접합은 보다 동질이며, 폴리머와 폴리펩티드의 반응을 조절하기가 더 용이하다.
폴리펩티드에 폴리머를 공유적으로 결합시키기 위해서는, 폴리머 분자의 하 이드록시 말단기가 활성을 가진 상태로 제공되어야 하는데, 즉, 반응성 기능기를 가진다. 적절하게 활성화된 폴리머는 시판되는 것을 이용할 수 있는데, 예를 들면, Shearwater Polymers, Inc., Huntsville, AL, USA 또는 PolyMASC Pharmaceuticals plc, UK 에서 공급하는 것을 이용할 수 있다. 선택적으로, 폴리머는 당분야에 공지된 방법으로 활성화시킬 수 있는데, 예를 들면, WO 90/13540에서 공개된 방법을 이용한다. 본 발명에서 이용할 수 있는 활성화된 선형 또는 기지형 폴리머의 특정 예는 Sharwater Polymers, Inc. 1997 and 2000 Catalogs (Functionalized Biocompatible Polymers for Research and pharmaceuticals, Polyethylene Glycol and Derivatives, incorporated herein by reference)에서 기술된다. 활성화된 PEG 폴리머의 특정예는 다음의 선형 PEG: NHS-PEG(예를 들면, SPA-PEG, SSPA-PEG, SBA-PEG, SS-PEG, SSA-PEG, SC-PEG, SG-PEG 및 SCM-PEG), 및 NOR-PEG, BTC-PEG, EPOX-PEG, NCO-PEG, NPC-PEG, CDI-PEG, ALD-PEG, TRES-PEG, VS-PEG, IODO-PEG, 및 MAL-PEG:와 PEG2-NHS와 같은 분지형 PEG, 및 US 5,932,462 및 US 5,643,575에서 공개된 것과 여기서 참고문헌으로 양자에 도입된 것을 포함한다. 게다가, 여기서 참고 문헌으로 도입된 다음의 공개문헌에서는 유용한 폴리머 또는 PEG화반응 화학에 대해서 설명하고 있다: US5,824,778, US5,476,653, WO97/32607, EP229108, EP402378, US4,902,502, US5,281,698, US5,122,614, US5,219,564, WO92/16555, WO94/04193, WO94/14758, WO94/17039, WO94/18247, WO94/2804, WO95/00162, WO95/11924, WO95/13090, WO95/33490, WO96/00080, WO97/18832, WO98/41562, WO98/48837, WO99/32134, WO99/32139, WO99/32140, WO96/40791, WO98/32466, WO95/06058, EP439508, WO97/03106, WO96/21469, WO95/13312, EP921131, US5,736,625, WO98/05363, EP809996, US5,629,384, WO96/41813, WO96/07670, US5,473,034, US5,516,673, EP605963, US5,382,657, EP510356, EP400472, EP183503, 및 EP154316.
폴리펩티드와 활성화된 폴리머 분자 접합시에는 통상적인 방법, 예를들면 다음의 문헌에서 설명하는 방법들이 이용된다(또한 폴리머 분자의 활성화를 위한 적절한 방법도 설명하고 있다); R.F. Taylor(1991), "Protein immobilisation. Fundamental and applications", Marcel Dekker, N.Y.; S.S.Wong(1992), "Chemistry of Protein Conjugation and Crosslinking", CRC Press, Boca Raton; G.T. Hermanson et al., (1993), "Immobilized Affinity Ligand Techniques", Academic Press, N.Y.). 당업자는 사용되는 폴리머의 기능기(예를 들면, 아미노, 하이드록실, 카르복실, 알데히드 또는 설파하이드릴) 및 폴리펩티드의 부착기(상기에서 주어진 예들)에 따라서 활성화 방법 및 접합 화학이 달라질 수 있다는 것을 인지할 수 있을 것이다. 폴리펩티드 상에 모든 이용가능한 부착기(예를 들면 폴리펩티드의 표면에 노출된 부착기 등)에 접합시키는데 이용되거나 특정 부착기 예를 들면 N-말단 아미노 기(US 5,985,265)에 접합시키는데 PEG화 반응을 이용할 수 있다. 또한, 접합은 한단계 또는 단계별 반응으로 이루어질 수 있다(WO99/55377에서 설명).
PEG화 반응은 부착된 PEG 분자의 수, 분자의 크기 및 형태(예를 들면 이들이 선형인지 가지형인지) 그리고, 폴리펩티드에서 이와 같은 분자가 어디에 부착되는 지등에 대해 최적의 분자를 생산할 수 있도록 고안된 것이다. 이용될 폴리머의 분자량은 성취될 소정의 고려하여 선택될 것이다. 예를 들면, 접합의 1차 목적이 높은 분자량과, 보다 큰 크기의 접합체를 얻는 것이라면(신장 클리어런스를 줄이기 위해), 원하는 효과를 얻기 위해 고분자량 폴리머 분자 하나 또는 약간 또는 저분자량을 가지는 많은 폴리머 분자를 접합하는 것을 선택할 수 있다. 바람직하게는, 그러나, 적은 분자량을 가지는 몇몇 폴리머 분자가 이용될 것이다. 에피토프 차단 정도를 높이고자 할 경우에는, 폴리펩티드의 모든 또는 대부분의 에피토프를 효과적으로 차단시키기 위해서 저분자량 폴리머 분자(예를 들면, 약5,000Da의 분자량)를 충분히 많이 이용하여 얻을 수 있다. 예를 들면, 2~8개 가령, 3~6개의 그러한 폴리머를 이용할 수 있다. 하기 실시예들이 나타내는 것과 같이, 더 적은 분자량을 가지는 보다 많은 수의 폴리머 분자를(예를 들면, MW 5000 의 4 - 6) 가지는 것이 보다 고분자량의 보다 적은 수의 폴리머 분자(예를 들면, MW 12,000 - 20,000 의 1-3)와 비교시 폴리펩티드 접합체의 in vivo 기능성 반감기를 증가시킴에 있어서 , 비록 부착된 폴리머 분자의 총분자량이 두경우에서 동일하다 할지라도, 보다 효과적이다. 보다 적은 폴리머 분자의 보다 많은 수의 존재는, 적어도 폴리머 분자가 상대적으로 균일하게 폴리펩티드 표면에 분산된 경우에 예를 들면, 단일의 보다 큰 고분자보다 큰 직경 또는 외관크기의 폴리펩티드를 제공한다.
단지 하나의 폴리머 분자의 하나의 부착기에 대한 단백질 상에서의 접합은 바람직하지 않을지라도, 단지 한 폴리머 분자가 부착되는 경우에, 폴리머 분자가, 그것이 선형 또는 가지형이든, 상대적으로 고분자량, 예를 들면, 약 20 kDa 을 가지는 것이 통상적으로 유리하다.
통상적으로, 폴리머 접합은 가능한한 많은 이용가능한 폴리머 부착기를 폴리머 분자와 반응시키는 것을 목적으로 하는 조건하에서 수행된다. 이것은 폴리펩티드에 관련된 적절한 폴리머의 몰량 과다를 통해서 이루어질 수 있다. 활성화된 폴리머 분자의 폴리펩티드에 대한 전형적인 몰비는 약 1000 - 1 까지이며, 예를 들면, 200-1, 또는 100 -1 까지이다. 그러나 어떤 경우에는 그 비가 예를 들면 50 -1, 10-1, 또는 5-1 까지 낮을 수 있다.
본 발명에 따르면, 링커를 통하여 폴리펩티드에 폴리머를 결합시키는 것도 고려할 수 있는데, 적절한 링커는 당업자에 공지되어 있다. 적절한 예로는 염화 시아누르가 된다(Abuchowski et al.,(1997), J. Biol. Chem., 252, 3578-3581; US 4,179,337; Shafer et al.,(1986), J.Polym. Sci. Polym. Chem. Ed., 24, 375-378).
당분야에 공지된 방법에 따라, 접합에 어어서 잔류 활성화된 폴리머를 차단시킬 수 있는데, 예를 들면, 반응 혼합물에 1차 아민을 첨가하여 블락킹시키고, 생성된 비활성화된 분자는 적절한 방법을 이용하여 제거하면 된다(물질과 방법을 참조).
바람직한 실시예에서, 본발명의 폴리펩티드 접합은 PEG화에 이용가능한 폴리펩티드에서 라이신 잔기의 일부, 대부분, 바람직하게는 전부에 부착된 PEG 분자, 상세하게는 선형 또는 가지형 PEG 분자로서 예를 들면, 약 1 -15 kDa 분자량, 전형적으로 2 - 12 kDa, 가령 약 3 -10 kDa, 예를 들면 약 5 또는 6 kDa 의 분자량을 가지는 PEG 를 포함한다.
상황, 예를 들면, 폴리펩티드의 아미노산 서열, 사용되는 활성화된 PEG 화합물의 특성, PEG 의 폴리펩티드에 대한 몰비를 포함하는 특정 PEG화 조건에 따라서, PEG화 변화도가, PEG 의 폴리펩티드에 대한 보다 높은 비로 일반적으로 얻어지는 더 높은 PEG화도로 얻어질 수 있다. 어떤 주어진 PEG 화 공정에서 유래된 PEG 화된 폴리펩티드는, 그러나, 통상적으로 약간 다른 정도의 PEG화를 가지는 폴리펩티드 접합체의 확률적인 분산을 포함한다.
다른 실시예에서, 본 발명의 폴리펩티드 접합체는 폴리펩티드의 N-말단 아미노산 잔기 이외에도, PEG 화 에 이용가능한 폴리펩티드에 있어서 라이신 잔기에 부착된 PEG 분자를 포함한다.
당 부분에 결합
in vivo 또는 in vitro에서 당 부분에 결합이 일어날 수 있다. 하나 이상의 in vivo 글리코실화반응 부위를 포함하는 G-CSF 분자의 in vivo 글리코실화를 얻기 위해서, 폴리펩티드를 인코드하는 뉴클레오티드 서열을 글리코실화하는 진핵 발현 숙주에 삽입해야 한다. 발현 숙주세포는 곰팡이(필라멘트성 곰팡이 또는 이스트), 곤충, 동물 세포, 또는 유전자변이 식물 세포에서 선택될 수 있다. 한 구체예에서, 숙주 세포는 CHO 세포, BHK 또는 HEK 세포,예를 들면, HEK293와 같은 포유류 세포 또는 SF9 세포와 같은 곤충 세포 또는 Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris 와 같은 효모 세포 또는 여기서부터 언급된 어떤 숙주세포로부터 선택될 수 있다. 글리코사이드(덱스트란과 같은)의 폴리펩티드의 아미노산 잔기에 대한 in vitro 공유결합이 또한 사용될 수 있으며, 예를 들면 WO 87/05330 및 Aplin et al., CRC Crit Rev. Biochem., pp 259-306, 1981에서 설명하고 있다.
당부분 또는 PEG의 단백질- 및 펩티드-바운드 Gln-잔기의 in vitro 결합은 트랜스글루타미나아제 (TG'아제)에 의해서 수행될 수 있다. 트랜스글루타미나아제는 소위 가교 반응에서 아민기의 단백질- 및 펩티드-바운드 Gln-잔기로의 이전을 촉매화한다. 도너-아민기는, 예를 들면, Lys-잔기에서 ε-아미노기와 같은 단백질- 또는 펩티드-바운드가 될 수 있으며, 또는 적거나 또는 큰 유기 분자의 일부 일 수있다. TG'아제-촉매화된 가교에서 아미노-도너로서 기능하는 적은 유기분자의 예는 푸트래신(1,4-디아미노부탄)이다. TG'아제-촉매화된 가교에서 아미노-도너로서 기능하는 큰 유기분자의 예는 아민-함유 PEG(Sato et al., 1996 Biochemistry 35, 13072-13080; EP 725145)이다.
Tg'아제는 일반적으로 매우 특이성이 있는 효소이며, 단백질의 표면에 노출된 모든 Gln-잔기가 아미노함유 물질에 대한 TG'아제-촉매화된 가교에 접근가능한 것은 아니다. 반대로, 단지 약간의 Gln-잔기가 자연적으로 TG'아제 기질로 기능하나, 그러나 Gln-잔기가 좋은 TG'아제 기질이 되는 것을 지배하는 추가적인 인자는 미지의 상태로 남아 있다. 그래서, TG'아제-촉매화된 가교반응에 민감한 단백질이 되도록 하기 위하여, 편리한 위치에 TG'아제 기질로서 매우 잘 기능하는 것으로 알려진 아미노산 서열의 스트레치(Stretch)를 첨가하는 것이 선행조건이다. 몇몇 아미노산 서열이 뛰어난 자연 TG'아제 기질이거나 또는 함유하는 것으로 알려져 있 으며, 예를 들면, 재질 P, 엘라핀, 피브리노겐, 피브로네스틴, α2-플라스민 억제제, α-카세인 및 β-카세인이다.
유기 유도화제에 결합
유기 유도화제와 하나 이상의 폴리펩티드의 부착기를 반응시켜, G-CSF활성을 나타내는 폴리펩티드를 공유적으로 변형시킬 수 있다. 적절한 유도화제 및 방법은 당분야에 공지되어 있다. 예를 들면, 가장 흔히 이용되는 시스테닐 잔기는 α-할로아세테이트(및 이에 상응하는 아민) 예를 들면, 클로로아세트산 또는 클로로아세타아미드와 반응하여, 카르복실메틸 또는 카르복실아미도메틸 유도체를 제공한다. 브로모트리를로로아세톤, α-브로모-β-(4-이미도조일)프로피오닌산, 클로로아세틸 포스페이트, N-알킬멜레이미드, 3-니트로-2-피리딜 디설파이드, 메틸 2-피리딜 디설파이드, p-클로로머큐리벤조에이트, 2-클로로머큐리-4-니트로페놀, 또는 클로로-7-니트로벤조-2-옥사-1,3-디아졸과 반응시켜, 시스테닐 잔기를 유도할 수 있다. 히스티딜 잔기는 디에틸피로카르보네이트 pH 5.5-7.0와 반응시켜 유도할 수 있는데, 그 이유는 이 물질이 히스티딜 측쇄에 대해 상대적으로 특이성을 가지기 때문이다. 파라-브로모펜아실 브로마이드도 유용하다; 이 반응은 0.1M 카코딜레이트 나트륨에서 pH 6.0에서 실행된다. 리시닐 및 아미노 말단 잔기는 숙신 또는 다른 카르복실산 무수물과 반응하였다. 이들 물질을 이용한 유도화 반응은 리신 잔기의 전하를 역전시키는 효과를 가지고 있다. α-아미노를 포함하는 잔기를 유도하기 위한 다른 적절한 시약에는 메틸 피코리니이미데이트와 같은 이미도에스테르; 피리 독살 포스페이트; 피리독살; 클로로보로하이드라이드; 트리니트로벤젠설폰산; O-메틸리소우레아; 2,4-펜다네디온; 글리옥실레이트와 트렌스아미나제-촉매된 반응을 포함한다. 아르기닌 잔기는 한 개 또는 몇 개의 통상적인 시약으로 반응시켜 변형시키는데, 그중에서, 페닐글리옥살, 2,3-부타네디온, 1,2-사이클로헥사네디온, 닌하이드릴등과 반응시킨다. 아르기닌 잔기의 유도화 반응은 알카리 조건하에서 실행해야하는데, 그 이유는 구아니딘 기능기의 pKa가 높기 때문이다.
또한, 이와 같은 시약들은 라이신기뿐만 아니라 아르기닌 구아니디노기와도 반응을 할 수 있다. 카르복실 측기(아스파르틸 또는 글루타밀)는 카르보이미드 (R-N=C=N-R')와 반응시켜 선택적으로 변형시킬 수 있다; 이때, R 및 R'는 서로 다른 알킬기 가령, 1-사이클로헥실-3-(2-몰포리닐-4-에틸)카르보디이미드 또는 1-에틸-3-(4-아조니아-4,4-디메틸페닐)카르보디이미드가 된다. 또한, 아스파르틸 및 글루타밀 잔기는 암모니움 이온과 반응시켜 아스파라기닐 및 글루타미닐 잔기로 전환시킨다.
기능성 부위의 차단(블럭킹)
과도하게 폴리머를 접합시키는 경우에 폴리머가 접합되는 폴리펩티드의 활성을 상실할 수도 있다고 보고된 바 있다. 기능을 하는 부분에 위치한 부착기를 제거하거나 접합전에 기능기를 차단시키면, 그래서 기능성 부위가 접합중 블럭화되어 이와 같은 문제를 해결할 수 있다. 이와 같은 전략이 본 발명의 구체예에 포함된다(제 1 전략의 한 가지 예로써 기능성 부위에 근접 위치한 리신 잔기를 제거하는 것이다). 좀더 구체적으로는, 두 번째 전략에 따르면, 폴리펩티드와 비-폴리펩티 드 부분사이에 접합은 폴리펩티드의 기능성 부위에 결합할 수 있는 헬퍼 분자로 폴리펩티드의 기능성 부위를 차단시킬 수 있는 조건하에서 실시되도록 한다는 것이다.
적절하게는, 헬퍼 분자가 수용체, 특히 G-CSF 수용체 또는 G-CSF 수용체의 일부와 같은 폴리펩티드의 기능부위를 특이적으로 인지하는 것이다.
선택적으로, 헬퍼 분자가 항체가 될 수도 있는데, 특히, G-CSF 활성을 나타내는 폴리펩티드를 인지하는 단클론항체가 될 수도 있다. 특히, 헬퍼 분자는 중화 단클론 항체가 될 수 있다.
접합을 하기 전에 헬퍼 분자와 폴리펩티드는 상호작용하게 된다. 이는 폴리펩티드의 기능 부위가 차단되거나 보호되어, 결과적으로 폴리머와 같은 비-폴리펩티드 부분에 의한 유도화에 이용될 수 없게 된다. 헬퍼 분자로부터 용출된 후에, 비-폴리펩티드 부분과 폴리펩티드사이에 접합이 회복될 수 있는데, 적어도 부분적으로 보존된 기능기를 가진다
차단된 기능 부위를 가지는 폴리펩티드를 폴리머, 친지성 화합물, 당 부분, 유기 유도화된 물질 또는 다른 임의 화합물에 연속하여 통상적인 방법을 이용하여 예를 들면, 상기 "접합...." 제하의 단락에서 기술된 것과 같이, 접합을 시킬 수 있다.
접합으로부터 폴리펩티드의 기능부위를 차단하기 위해서 사용된 헬퍼 분자의 특성에 관계없이, 헬퍼 분자는 그러한 기에 대한 접합이 헬퍼 분자로부터 접합된 폴리펩티드의 탈착을 방해하는 분자의 부분에서, 선택의 비폴리펩티드 부분에 대한 단지 약간의 부착기를 포함하기거 없는 것이 바람직하다. 이에 의해, 폴리펩티드의 비-차단된 부분에 존재하는 부착기에 대한 선택적인 접합은 얻어질 수 있으며, 헬퍼 분자를 접합의 반복된 사이클에 재사용하는 것이 가능하다. 예를 들면, 비폴리펩티드 부분이 PEG 와 같은 폴리머 분자이며, 이것이 부착기로서 라이신의 에피시론 아미노기 또는 N-말단 아미노산 잔기를 가지면, 헬퍼 분자는 실질적으로 접합가능한 에피시론 아미노기가 없는 것으며, 바람직하게는 어떤 에피시론 아미노기도 없는 것이 바람직하다. 따라서, 바람직한 실시예에서, 헬퍼 분자는 폴리펩티드의 기능부위에 결합할 수 있는 단백질 또는 펩티드이며, 단백질 또는 펩티드는 선택의 비폴리펩티드 부분에 대한 어떤 접합가능한 부착기가 없다.
본 발명의 실시예와 연관된 특별한 잇점은, 여기서 폴리펩티드 접합체는 관심있는 폴리펩티드를 엔코딩하는 뉴클레오티드 서열의 변화된 집단으로부터 제조되며, 기능기의 차단이 접합전의 마이크로적정판에서 이루어지고, 예를 들면, 가령 수용체, 항체 등등과 같은 비유동화된 차단기를 함유하는 마이크로적정판에서 발현된 폴리펩티드 변이체를 도포하는 것에 의해서 이루어진다.
추가 구체예에서, 헬퍼 분자는 컬럼 패킹 물질 예를 들면, Sephadex 또는 아가로즈 비드와 같은 고형상에 또는 반응 용기와 같은 표면에 우선 공유 결합시킨다. 연속하여, 폴리펩티드를 헬퍼 분자가 있는 컬럼 물질위에 적하시키고, 당분야에 공지된 방법, 예를 들면, "접합..." 제하의 단락에서 공지된 방법을 이용하여 접합을 실행하였다. 이와 같은 과정에서 용출을 이용하여, 헬퍼 분자로부터 폴리펩티드 접합체를 유리시킬 수 있다. 폴리펩티드 접합체를 물리화학적인 조건하에 서 통상의 기술을 이용하여 용출시키는데, 이때 조건은 폴리펩티드 접합체가 연속하여 분해가 일으나지 않도록 하는 조건이어야 한다. 폴리펩티드 접합체를 포함하는 유동상을 고형상으로부터 분리하는데, 이때 고형상에는 헬퍼 분자가 공유적으로 결합되어 남아 있다. 다른 방법으로도 분리할 수도 있다; 예를 들면, 헬퍼 분자를 특정 결합체(스트렙타아비딘)가 인지할 수 있는 제 2 분자(바이오틴)로 유도시킬 수 있다. 특정 결합제를 고형상에 연결시켜, 그에 의해 제 2 헬퍼-고형상 컬럼을 통과시켜, 용출시에, 헬퍼 분자-제2 분자 복합체가 컬럼상에 보유되면서, 폴리펩티드 접합체는 용출시키도록 하여, 헬퍼분자-제2분자 복합체로부터 폴리펩티드 접합체를 분리할 수 있다. 임의 적절한 방식으로 헬퍼 분자로부터 폴리펩티드 접합체를 방출시킬 수 있다. 구속되어 있는 G-CSF의 기능을 가진 부위로부터 헬퍼 분자가 해리될 수 있도록 만든 조건하에서 탈-보호 반응을 얻을 수 있다. 예를 들면, pH를 산성 또는 알카리성 pH로 조절하여 폴리머가 접합된 항체와 항-이디오타입 항체간의 복합체를 해리시킬 수도 있다.
태그된 폴리펩티드 접합체
또 다른 구체예에서, 폴리펩티드는 태그, 즉 전형적으로 1-30개 예를 들면 1-20개의 아미노산 잔기로 구성된 아미노산 서열 또는 펩티드 스트레치를 가지는 융합 단백질로 발현될 수 있다. 신속하고 용이한 정제를 위해서, 태그된 폴리펩티드와 비-폴리펩티드 부분사이를 접합시키는 편리한 도구로 태그가 이용된다. 특히, 태그를 이용하여 마이크로 적정판 또는 다른 운반체 예를 들면, 파라마그네틱 막대에 접합시키는데 태그가 이용될 수 있으며, 여기에 태그를 통하여 태그된 폴리 펩티드가 표면에 고정된다. 예를 들면 마이크로적정판내에 태그된 폴리펩티드에 접합시키는 경우에는 태그된 폴리펩티드는 배양액으로부터 직접 미량적정판에 고정될 수 있어( 주로 추가 정제가 필요없음), 접합시키면 된다는 잇점이 있다. 따라서, 전체 공정 단계 수(발현부터 접합까지)를 줄일 수 있다. 또한, 태그는 접합될 고정된 폴리펩티드에 접근성을 개선시키는 스페이스 분자로도 기능을 할 수 있다. 여기에서 설명하는 비-폴리펩티드 부분 예를 들면 PEG와 같은 폴리머 분자에 태그된 폴리펩티드를 이용하여 접합을 실행할 수 있다.
이용될 수 있는 특정 태그의 본질은 폴리펩티드와 함께 발현되고, 적절한 표면 또는 운반체 물질상에서 고정될 수 있다면 그리 중요한 것이 아니다. 많은 적절한 태그는 시판되는 것을, 예를 들면 Unizyme Laboratories, Denmark, 이용할 수 있다. 예를 들면, 태그는 다음의 서열로 이루어질 수 있다;
His-His-His-His-His
Met-Lys-His-His-His-His-His
Met-Lys-His-His-Ala-His-His-Gln-His-His
Met-Lys-His-Gln-His-Gln-His-Gln-His-Gln-His-Gln-His-Gln
Met-Lys-His-Gln-His-Gln-His-Gln-His-Gln-His-Gln-His-Gln-Gln
또는 다음중의 하나
EQKLI SEEDL(Mol. Cell. Biol. 5:3610-16, 1985에서 설명하는 C-말단 태그)
DYKDDDDK(C- 또는 N-말단 태그)
YPYDVPDYA
ADI, Aves Lab, Research Diagnostics에서 구할 수 있는 상기 태그에 대한 항체.
PEG화 반응에 태그된 폴리펩티드를 이용하는 통상의 방법은 다음의 물질 및 방법 단락에서 제공한다. 시판되는 효소를 이용하여 폴리펩티드에서 태그를 연속하여 절단할 수 있다.
본 발명의 폴리펩티드를 준비하는 방법 또는 본 발명의 접합체의 폴리펩티드 부분
본 발명의 폴리펩티드 또는 본 발명의 접합체의 폴리펩티드 부분은, 선택적으로는 글리코실화된 형으로 당분야에 공지된 임의 적절한 방법으로 만들 수 있다. 이와 같은 방법에는 폴리펩티드를 인코드하는 뉴클레오티드 서열을 건제하고, 적절하게 변화된 또는 트랜스펙션된 숙주내에서 서열을 발현시키는 것을 포함한다. 그러나, 본 발명의 폴리펩티드는 화학적인 합성 또는 화학적인 합성의 조합 또는 화학적인 합성과 재조합 DNA 기술의 조합에 의해서 다소효율이 낮더라도 생산될 수 있다.
폴리펩티드를 인코드하는 본 발명의 뉴클레오티드 서열 또는 본 발명의 접합체의 폴리펩티드 부분은 SEQ ID NO:1의 아미노산 서열을 가지는 hG-CSF와 같은 모체 G-CSF를 인코드하는 뉴클레오티드 서열을 분리 또는 합성시키고, 합성된 뉴클레오티드 서열을 변형시켜, 관련 아미노산 잔기의 도입(삽입 또는 치환) 또는 제거(삭제 또는 치환)시켜 만들수 있다.
당분야에 공지된 방법에 따라, 부위-직접적인 돌연변이 형성을 통하여 뉴클 레오티드 서열을 변형시킬 수 있다. 선택적으로, 뉴클레오티드 서열은 화학적인 합성 방법에 의해 만들 수 있는데, 예를 들면 올리고뉴클레오티드 합성기를 이용하는데, 이때 올리고뉴클레오티드는 원하는 폴리펩티드의 아미노산 서열에 기초하여 고안되고, 적절하게는 재조합된 폴리펩티드가 만들어지는 숙주세포에서 선호하는 코드를 선별하여 작제한다. 예를 들면, 원하는 폴리펩티드의 일부를 코드화하는 몇 가지 작은 올리고뉴클레오티드를 합성하고, PCR, 결찰 또는 결찰 사슬 반응(LCR)을 이용하여 어셈블리한다(Barany, PNAS 88:189-193, 1991). 개별 올리고뉴클레오티드는 일반적으로 상보적인 어셈블리를 위해서는 5' 또는 3' 오버행(overhang)을 포함하고 있다.
대체 뉴클레오티드 서열 변형 방법을 높은 처리량 스크린을 위한 폴리펩티드 변이체에 이용할 수 있는데, 예를 들면, US 5,093,257 에 공개된 것과 같은 동형-크로스오버를 포함하는 방법, 및 유전자 셔플링(shuffling)을 포함하는 방법, 즉 두개이상의 동형 뉴클레오티드 서열사이에서 재조합하여 출발의 뉴클레오티드 서열과 비교시 많은 뉴클레오티드 변형을 가지는 새로운 뉴클레오티드 서열이 되는 방법이다. 유전자 셔플링(또한 DNA 셔플링으로도 알려짐)은 뉴클레오티드 서열의 무작위의 분절과 재조립의 하나이상의 사이클을 포함하고, 소정의 특성을 가지는 폴리펩티드를 엔코딩하는 뉴클레오티드 서열을 선택하기 위한 스크린링한다. 호모로지계 핵산 셔플링이 발생하도록 하기 위해서, 뉴클레오티드 서열의 관련부분이 적어도 50 % 동일한 것이 바람직하며, 가령 60 % 동일, 보다 바람직하게는 적어도 70 % 동일, 가령 80 % 동일이다. 재조합은 in vitro 또는 in vivo 에서 가능하다.
적절한 in vitro 유전자 셔플링 방법의 예는 다음에 기술되어 있다. Stemmer et al.(1994), Proc. Natl. Sci.USA; Vol. 91, pp. 10747 - 10751; Stemmer(1994), Nature, vol. 370, p.389 - 391; Smith(1994), Nature vol. 370, pp.324 - 325; Zhao et al., Nat. Biotechnol. 1998, Mar; 16(3):258 -61; Zhao H. and Arnold, FB, Neucleic Acids Research, 1997, Vol. 25. No. 6 pp. 1307-1308; Shao et al., Neucleic Acids Research 1998, Jan 15;26(2):pp. 681 - 83; 및 WO 95/17413. 적절한 in vivo 셔플링 방법의 예는 WO 95/ 07205 에서 공개된 방법이다. in vitro 및 in vivo 재조합에서 핵산 서열의 돌연변이에 대한 다른 기술들은 예를 들면 WO 97/20078 및 US 5,837,458 에 공개되어 있다. 특정한 셔플링 기법의 예는 "페밀리 셔플링","합성셔플링", 및 "in silico 셔플링"을 포함한다. 페밀리 셔플링은 다른 종으로부터의 상동유전자의 페밀리를 1 회이상의 셔플링과 연속적인 스크린링 또는 선택을 겪게하는 것을 포함한다. 페밀리 셔플링 기법은 예를 들면, Crameri et al. (1998), Nature, Vol. 391, pp. 288-291; Christian et al. (1999), Nature Biotechnology, vol. 17, pp. 259- 264; Chang et al.(1999), Nature Biotechnology, vol. 17, pp. 793 - 797; and Ness et al.(1999), Nature Biotechnology, vol. 17, 893 - 896 에 공개되어 있다. 합성 셔플링은 예를 들면 관심사의 상동 유전자의 배열 정열에 기초한 합성 올리고뉴클레오티드 중복의 라이브러리를 제공하는 것을 포함한다. 합성적으로 생성된 올리고뉴클레오티드은 재조합되고, 그리고 결과적인 재조합 핵산 서열이 스크린되고, 그리고 원할 경우 셔플링 사이클에 더 사용된다. 합성 셔플링 기법은 WO 00/42561 에 공개된다. in silico 셔플링은 컴퓨터 시스템을 이용하여 수행되거나 또는 설계되고, 그에 의해서 전체적으로 또는 부분적으로 물리적으로 핵산을 조작할 필요를 피하는 DNA 셔플링 절차를 언급한다. 이러한 in silico 셔플링에 대한 기법은 WO 00/42560 에 기재되어 있다.
일단, 어셈블리되면(합성, 부위-지정된 돌연변이 형성 또는 다른 방법), 폴리펩티드를 인코드하는 뉴클레오티드 서열을 재조합 벡터에 삽입시키고, 원하는 형질변환된 숙주 세포내에서 G-CSF를 발현시키는데 필수적인 조절 서열에 작용가능하도록 연결한다.
물론, 인지해야 할 것은 모든 벡터 및 발현 조절 서열이 여기에서 설명하고 있는 폴리펩티드를 인코드하는 뉴클레오티드 서열을 발현시키는데 동일하게 작용을 하지는 않는다는 것이다. 모든 숙주가 동일한 백터 시스템에 대해 균등하게 기능을 하는 것도 아니다. 그러나, 당업자는 과도한 실험없이도 이와 같은 벡터, 발현 조절 서열 및 숙주를 선택할 수 있을 것이다. 예를 들면, 벡터를 선택하는데 있어서, 벡터가 숙주내에서 복제하거나 염색체안으로 삽입되어야 하기 때문에 숙주를 반드시 고려해야 한다. 벡터의 복제 수, 복제수를 조절하는 능력, 벡터에 의해 인코드된 임의 다른 단백질의 발현, 예를 들면, 항생제 표식의 발현 등도 고려해야 할 부분이다. 발현 조절 서열을 선택하는데 있어서, 다양한 인자들을 고려해야 한다. 여기에는 서열의 상대적인 강도, 조절능력, 폴리펩티드를 인코드하는 뉴클레오티드 서열과의 적합성, 특히, 잠재적인 2 차 구조등이 포함된다. 선택된 벡터와의 적합성, 뉴클레오티드 서열에 의해 코드화된 생성물의 독성, 이들 분비상 특징, 정확하게 폴리펩티드를 폴드하는 능력, 이들의 발효 또는 배양 요건, 뉴클레오티드 서열에 의해 코드화되는 생성물의 정제 난이도등을 고려하여, 숙주를 선택해야 한다.
재조합 백터는 자생 복제 백터가 될 수도 있는데, 즉 이 벡터는 플라스미드와 같이 엑스트라크로모좀의 실체로서 존재할 수 있는데, 이의 복제는 염색체 복제 예를 들면 플라스미드와는 별개이다. 또는 벡터가 숙주 세포내로 도입되었을 때, 숙주 세포 게놈안으로 통합되어, 통합된 염색체와 함께 복제될 수도 있다.
벡터는 뉴클레오티드 서열 전사를 위해 필요한 추가 단편에 작동가능하도록 연결된 본 발명의 폴리펩티드를 인코드하는 뉴클레오티드 서열인 발현 벡터가 바람직하다. 이와 같은 벡터는 일반적으로 플라스미드 또는 바이러스성 DNA로부터 유도된다. 여기에서 언급하는 숙주 세포내에서 발현시키는데 적절한 발현 벡터는 시판하는 것을 이용하는 것이거나 또는 문헌에 기재된 것이다. 진핵 숙주에 유용한 발현 벡터는 SV40, 소과 파필로마 바이러스, 아데노바이러스, 사이토메갈로바이러스의 발현 조절 서열을 포함하는 벡터등을 포함한다. 특정 벡터로는 예를 들면 pCDNA3.1(+)＼Hyg(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) 및 pCI-neo(Stratagene, LA Jola, CA, USA)등이 있다. 이스트 세포용 유용한 벡터에는 2μ플라스미드 및 이의 유도체, POT1 벡터(US 4,931,373), pJSO37 벡터(Okkels, Ann. New York Acad. Sci. 782, 202-207, 1996),및 pPICZ A, B , 또는 C(Invitrogen)등이 포함된다. 곤충 세포에 유용한 벡터에는 pVL941, pBG31l(Cate et al., "Isolation of the Bovine and Human Genes for Mullerian Inhibiting Substance And Expression of the Human Gene In Animal Cells", Cell, 45, pp. 685-98 (1986), pBluebac 4.5, pMelbac(Invitrogen)등이 포함된다. 박테리아 숙주에 적합한 유용한 발현 벡터에는 공지의 박테리아 플라스미드 예를 들면, E. Coli의 플라스미드 즉, pBR322, pET3a, pET12a(Novagen Inc., WI, USA) 및 RP4와 같은 다양한 범위의 숙주 플라스미드, phage DNAs(다양한 파아지 람다 유도체) 즉, NM989 및 다른 DNA 파아지 예를 들면, M13 및 필라멘트성 단일 가닥 DNA 파아지등이 포함된다.
본 발명에서 이용할 수 있는 다른 벡터에는 폴리펩티드를 인코드하는 뉴클레오티드 서열이 증폭 복제될 수 있도록 하는 벡터도 포함된다. 이와 같은 증폭을 가능하게 하는 벡터도 당분야에 공지되어 있다. 예를 들면, DHFR 증폭을 이용한 증폭 벡터(Kaufman, U.S. Pat. No. 4,470,461, Kaufman and Sharp, "Construction OF A Modular Dihydrafolate Reductaso cDNA Gene: Analysis Of Signals Utilized For Efficient Expression", Mol. Cell. Biol., 2, pp. 1304-19 (1982))와 글루타민 합성효소("GS") 증폭을 이용한 증폭 벡터(US 5,122,464 and EP 388,841)가 포함된다.
재조합 벡터에는 문제의 숙주 세포내에서 벡터가 복제할 수 있도록 하는 DNA 서열이 추가 포함된다. 이와 같은 서열(이때, 숙주 세포는 포유류 세포이다)의 예로는 SV40 복제 오리진이 될 수 있다. 숙주 세포가 이스트 세포인 경우에, 벡터를 복제시킬 수 있는 적절한 서열은 이스트 플라스미드 2μ복제 유전자 REP 1-3 및 복제 오리진이 된다.
벡터는 선택성 표식으로 유전자 예를 들면, 특정 유전자의 생성물이 숙주 세 포에 결함을 보완할 수 있는 유전자, 즉 디하이드로폴레이트 환원효소(DHFR)를 코드하는 유전자 또는 Schizosaccaromyces pombe TPI 유전자(described by P.R. Russell, Gene 40, 1985, pp. 125-130) 또는 약물 가령, 암피실린, 카나마이신, 테트라사이클린, 클로람페니콜, 네오마이신, 하이그로마이신, 메토트렉세이트에 대한 저항성을 부여하는 유전자을 가질 수 있다. Saccharomyces cerevisia 에 대해서는 선택성 표식은 ura3, 및 leu2 를 포함한다. 필라멘트성 곰팡이의 경우에, 선택성 표식에는 amdS, pyrG, arcB, niaD, sC등이 포함된다.
여기에서 "조절 서열"이란 본 발명의 폴리펩티드의 발현에 필요한 또는 이를 도와주는 모든 성분을 포함하는 것으로 정의된다. 각 조절 서열은 폴리펩티드를 인코드하는 핵산 서열에 고유한 서열 또는 외래에서 도입된 서열이 될 수 있다. 이와 같은 조절 서열에는 리더서열, 폴리아데닐화 서열, 프로펩티드 서열, 프로모터, 인헨서 또는 상류 활성화 서열, 시그날 펩티드 서열 및 전사 종료물질 등이 포함되나 이에 국한시키지는 않는다. 최소한, 조절 서열에는 프로모터가 포함된다.
본 발명에서 다양한 범위의 발현 조절 서열이 이용될 수 있다. 전술한 발현 벡터의 구조 유전자와 연합한 발현 조절 서열뿐만 아니라 원핵 또는 진핵세포, 또는 이들의 바이러스 유전자 발현을 조절하는 것으로 알려진 임의 서열 또는 이의 다양한 복합체가 유용한 발현 조절 서열에 포함된다.
포유류 세포에서 전사를 지시하는 적절한 조절 서열을 예로 들면, SV40와 아데노바이러스의 초기 및 후기 프로모터, 즉, 아데노바이러스 2개 주요 후기 프로모터, MT-1(메탈로티오닌 유전자) 프로모터, 사람의 사이토메갈로바이러스 초 전기 유전자 프로모터(CMV), 사람의 연장 인자 1α(EF-1α) 프로모터, Drosophila 최소 열 쇼크 단백질 70 프로모터, 라우스 살코마 바이러스(RSV) 프로모터, 사람의 유비퀴틴 C(UbC) 프로모터, 사람의 생장 호르몬 종료인자, SV40 또는 아데노바이러스 Elb 부분 폴리아데닐화 반응 시그날 및 Kozak 콘센선스 서열(Kozak, M. J. Mol. Biol. 1987 Aug 20; 196(4):947-50)등이 있다.
포유류 세포내에서 발현을 개선시키기 위해서, 폴리펩티드를 인코드하는 뉴클레오티드 서열의 5' 해독안된 부분에 합성 인트론을 삽입시킬 수 있다. 합성 인트론을 예를 들면, 플라스미드 pCI-Neo(Promega Corporation, WI, USA)에서 얻은 합성 인트론 등이 있다.
곤충 세포에서 전사를 지시하는데 이용되는 적절한 조절 서열에는 폴리헤드린 프로모터, P10 프로모터, Autographa californica 폴리헤드로시스 바이러스 기초 단백질 프로모터, 베큘로바이러스 초 전기 유전자 1 프로모터, 베큘로바이러스 39K 지연된-초기 유전가 프로모터, SV40 폴리아데닐화반응 서열등이 포함된다.
이스트 숙주 세포에서 이용할 수 있는 적절한 조절 서열을 예를 들면, 이스트 α-메이팅 시스템의 프로모터, 이스트 트리오즈 포스페이트 이소메라제(TP1) 프로모터, 이스트 글로코리틱 유전자 또는 알코올 디하이드로게나제 유전자의 프로모터, ADH2-4c 프로모터 및 유도성 GAL 프로모터등이 포함된다. 필라멘트성 곰팡이 숙주 세포에 이용할 수 있는 적절한 조절 서열을 예로 들면 ADH3 프로모터 및 종료물질, Aspergillus oryzae TAKA 아밀라제 트리오즈 포스페이트 이소메라제 또는 알칼린 프로테아제, A. niger α-아밀라제, A. niger 또는 A. nidulans 글리코아밀 라제, A. nidulans 아세타미다제, Rhizomucor miehei 아스파르틱 프로데나제 또는 리파제, TPI1 종료물질, ADH3 종료물질을 인코드하는 유전자에서 유도된 프로모터등이 포함된다. 세균성 숙주 세포에 이용할 수 있는 적절한 조절 서열을 예로 들면, lac 시스템, trp 시스템, TAC 또는 TRC 시스템의 프로모터 및 파아지 람다의 주요 프로모터 부분 등이 포함된다.
발현될 폴리펩티드를 생산하는데 이용되는 발현 숙주 세포,(세포내 폴리펩티드인지 또는 세포간 폴리펩티드인지), 분비를 하는 것이 바람직한 것인지에 따라, 시그날 펩티드의 유무가 달라질 수 있다. 필라멘트성 곰팡이에 이용되는 경우에, Asperhillus sp. 아밀라제 또는 글루코아밀라제를 인코드하는 유전자 또는 Rhizomucor miehei 리파제 또는 프로테아제 또는 Humicola lanuginosa 리파제를 인코드하는 유전자로부터 시그날 펩티드는 통상적으로 유도된다. 시그날 펩티드는 A. oryzae TAKA 아밀라제, A. niger 중성 α-아밀라제, A. niger 산-안정 아밀라제, A. niger 글루코아밀라제를 인코드하는 유전자로부터 유도되는 것이 바람직하다. 곤충 세포에 사용하기 위해서는, 곤충 유전자(WO90/05783)로부터 유도하는 것이 편리한데, 예를 들면 lepidopteran Manduca sexta 아디포카이네틱 호르몬 전구물질(US 5,023,328), 꿀벌 멜리틴(Invitrogen), 엑티스테로이드 UDP 글루로실트란스퍼라제(egt)(Murphy et. al. Protein Expression and Purification 4,349-357(1993) 또는 사람의 췌장 리파제(hpl)(Methods in Enzymology 284, pp. 262-272, 1997)에서 시그날 펩티드를 유도할 수 있다.
포유류 세포에 이용할 수 있는 적절한 시그날 펩티드는 hG-csf 또는 뮤린 Ig 카파 경쇄 시그날 펩티드(Coloma, M(1992) J. Imm. Methods 152:89-104)이다. 이스트 세포에 이용하기 위해서는 적절한 S. cereviciae의 α-인자 시그날 펩티드(US 4,870,008), 변형된 카르복시펩티다아제 시그날 펩티드( L.A. Valla et al., Cell 48, 1987, pp 887 - 897), 이스트 BARl 시그날 펩티드(WO 87/02670), 이스트 아스파르트 프로테아제 3(YAP3) 시그날 펩티드(M. Egel-Mitani et al., Yeast, 6, 1990, pp. 127-137) 및 합성 리더 서열 TA57(WO 98/ 32867)에서 적절한 시그날 펩티드가 발견하였다. E. coli 세포에서는 적절한 시그널 펩티드가 시그널 펩티드 ompA 인것이 발견되었다.
G-CSF 활성을 나타내는 폴리펩티드를 엔코드하는 본 발명의 뉴클레오티드 서열은, 부위-지정된 돌연 변이, 합성, PCR 또는 다른 방법에 의해서 제조되든지 간에, 임의적으로 또한 시그널 펩티드를 엔코드하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 이 시그널 펩티드는 폴리펩티드가 그것이 발현되는 세포에서 분비될 때 존재한다. 시그널 펩티드는 폴리펩티드에 대해서 상동(통상적으로는 예를 들면 hG-CSF 에 관련)이거나 또는 이종(즉, hG-CSF 보다는 다른 근원에서 유래된)일 수 있으며, 숙주세포에 대해서 동종 또는 이종일수 있다. 즉 숙주세포로부터 통상적으로 발현된 시그널펩티드 또는 숙주세포로부터 통상적으로 발현되지 않는 시그널 펩티드이다. 따라서, 시그널 펩티드는 E. coil 과 같은 박테리아로부터 유도된 원핵 또는 포유류 또는 곤충 또는 이스트로부터 유래된 진핵일 수 있다.
폴리펩티드 또는 본 발명에 따른 접합체의 폴리펩티드 부분을 생산하는데 이용되는 임의 적절한 숙주에는 박테리아, 곰팡이(이스트 포함), 식물, 곤충, 포유류 또는 다른 적절한 동물 세포 또는 세포주뿐만 아니라 유전자전이 동물 또는 식물이 포함된다. 박테리아성 숙주 세포를 예를 들면, Bacillus 균주 즉, B. brevls, B. subtilis, Pseudomonas 또는 Streptomyces와 같은 그램 양성 박테리아; E. Coli와 같은 그램 음성 박테리아등이 있다. 원형질 형질변환(Chang and Cohen, 1979, Molecular General Genetics 168: 111-115), 컴피턴트 세포를 이용(Young and Spizizen, 1961, Journal of Bacteriology 81:823-829, or Dubnau and Davidoff-Abelson, 1971, Journal of Molecular Biology 56:209-221); 전기천공(Shigekawa and Dower, 1988, Biotechniques 6:742-751); 컨쥬게이션(Koehler and Thome, 1987, Journal of Bacteriology 169:5771-5278)등이 박테리아 세포내로 벡터를 도입시키는데 이용되는 방법이다.
필라멘트성 곰팡이 세포로는 예를 들면, Aspergillus 균주, 예를 들면 A. oryzae, A. niger, A. nidulane, Fusarium 또는 Trichoderma등이 포함된다. 곰팡이 세포는 공지의 방법으로 원형질 형성, 원형질의 형질변환, 세포벽의 재생등 일련의 공정에 의해 형질변환될 수 있다. Aspergillus 숙주 세포의 적절한 형질변환 과정은 EP 238 023 및 US 5,679,543에서 설명하고 있다. Fusarium 종을 형질변환시키는 방법은 Malardier et al., 1989, Gene 78: 147-156 및 WO 96/0787에서 설명하고 있다. 적절한 이스트 숙주 세포에는 Saccharomyces종 (S. cerevisiae, Schizosaccharomyces), Kluyvsromyces, Plchia(P. pastoris, P. methanolica), Hansenula(H. Polymorpha) 또는 Yarrowia 종이 포함된다.
이스트는 Becker and Guarentinte, In Abelson, J. N. and Simon, M. I., editors, Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology, Methods in Enzymology, Volumn 194, pp 182- 187, Academic Press, Inc., Newyork:Ito et al., 1983, Journal of Bacteriology 153: 163; Hinnen et al., 1978, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 75:1920: 및 Clontech Laboratories, Inc, Palo Alto, CA, USA(YeastmakerTM Yeast Transforamtion System Kit에 대한 생산물 프로토콜에서) 에 공개되어 있다. 적절한 곤충 숙주 세포를 예를 들면, Lepidoptora 세포 주 가령, Spodoptera frugiperda(Sf9 또는 Sf21), Trichoplusioa ni 세포(High Five)(US 5,077,214)등이 포함된다. 곤충 세포의 형질변환 및 여기에서 이종 폴리펩티드를 생산하는 것은 Invitrogen에서 설명하는 것과 같이 시행하면 된다. 적절한 포유류 숙주 세포의 예를 들면 차이니즈 햄스트 오바리(CHO) 세포주(예를들면 CHOㆍK1; ATCC CCL-61), 녹색 원숭이 세포주(COS)(예를 들면 COS 1(ATCC CRL-1650), COS 7(ATCC CRL-1651)); 생쥐 세포(예를 들면NS/O), Baby Hamster Kindney (BHK) 세포주(ATCC CRL-1632 또는 ATCC CCL-10), 사람 세포(HEK 293(ATCC CRL-1573)) 및 조직 배양물에 있는 식물 세포등이 있다. 또 다른 적절한 세포주는 당분야에 공지되어 있고, 이는 American Type Culture Collection, Rockville, Maryland와 같은 공공 기탁기관으로부터 분양받을 수 있다.
인산 칼슘-중개된 트랜스펙션, 전기천공, DEAE-덱스트란 중개된 트랜스펙션, 리포좀-중개된 트랜스펙션, 바이러스성 벡터, Life Technologies Ltd, Paisley, UK using Lipofectamin 2000에서 설명하는 방법등이 외생 DNA를 포유류 숙주 세포로 도입시키는데 이용되는 방법이다. 이와 같은 방법들은 당분야에 이미 공지된 것이 고, Ausber et. al.(eds.), 1996, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, USA에서도 설명하고 있다. 포유류 세포의 배양은 정립된 방법 예를 들면, Animal Cell Biotechnology, Methods and Protocols, Edited by Nigel Jenkins, 1999, Human Press Inc, Totowa, New Jorsey, USA and Harrison MA and Rae IF, General Techniques of Cell Culture, Cambridge University Press 1997에서 설명하는 방법에 따라 실행하였다.
본 발명의 생산 방법에서, 당분야에 공지된 방법을 이용하여 폴리펩티드를 생산하는데 적절한 영양 배지에서 세포를 배양하였다. 예를 들면, 플라스크 진탕배양, 소규모 또는 대규모 발효(연속 발효, 배치, 피드-배취, 고형상 발효등 포함)을 이용하여, 폴리펩티드가 발현 및/또는 분리될 수 있는 조건하에, 적절한 배지에서 실험실 규모 또는 산업 규모로 세포를 배양할 수 있다. 당분야에 공지된 방법을 이용하여, 탄소, 질소원, 무기염을 포함하는 적절한 영양 배지에서 배양한다. 적절한 배지는 공급업자로부터 얻거나 공지된 조성에 따라 조제할 수 있다(American Typer Culture Collection 카타로그 참고). 폴리펩티드가 영양 배지로 분비되면, 배지로부터 폴리펩티드를 바로 회수할 수 있다. 폴리펩티드가 분비되지 않으면, 세포 용해물질로부터 회수할 수 있다.
생성된 폴리펩티드를 당분야에 공지된 방법을 이용하여 회수할 수 있다. 예를 들면 폴리펩티드를 원심분리, 여과, 추출, 스프레이 건조, 증발, 침전등을 포함하나 이에 국한되지 않는 통상의 과정을 이용하여 영양 배지로부터 회수할 수 있다.
폴리펩티드는 당분야에 공지된 여러 가지 방법을 이용하여 정제할 수 있는데, 예를 들면, 크로마토그래피(예를 들면, 이온 교환 크로마토그래피, 친화력, 소수성, 크로마토포커싱, 및 크기 배제), 전기적인 공정(예비 등전점 포커스), 용해도차(가령, 암모니움 설페이트 침전), SDS-PAGE 또는 추출(Protein Purification, J.C. Janson and Lars Ryden, editors, VCH Publishers, New York, 1989)등이 포함되나 이에 국한되지 않는 방법을 이용하여 정제할 수 있다. G-CSF 활성을 나타내는 폴리펩티드를 정제하는 특정 방법은 D. Metcalf and N.A. Nicola in The hemopoietic colony-stimulating factors, p. 50 -51, Cambridge University Press(1995), by C.S. Bae et al., Appl. Microbiol. Biotechnol, 52:338 - 344(1999) 및 US 4,810,643 에서 설명하고 있다.
본 발명의 약리학적 조성물과 이의 이용
다른 측면에서, 본 발명은 여기서 기술된 폴리펩티드 또는 접합체와 적어도 하나의 약리학적으로 수용가능한 운반체 또는 부형제를 포함한다.
본 발명에 따른 폴리펩티드, 접합체 또는 약리학적 조성물은 질변의 치료를 위한 의약의 제조에 사용될 수 있다. 상세하게는 화학치료, 방사선 치료, 및 골수 이식, 심각한 만성 또는 상대적인 백혈구 감소증, 말초성 혈액 프로제니터 세포이식에서 모집을 위한 프로제니터 세포의 유동화 따위를 겪는 암환자의 감염의 예방, 심한 골수성 백혈병 환자의 치료, AIDS 의 치료나 또는 다른 면역결핍질병, 상세하게는 전신 또는 침입성 캔디다증의 치료이다.
다른 측면에서, 본 발명에 따른 폴리펩티드, 접합체 또는 약리학적 조성물은 일반적인 헤마토포이에틱(heamatopoietic) 질병과 화학요법 특히 백혈구 감소증, AIDS 또는 다른 면역결핍성 질병으로부터 또는 방사선 요법으로부터 유발되는 것들을 가지는 포유류 치료 방법에 사용될 수 있으며, 이방법은 포유류에게 폴리펩티드, 접합체, 또는 약리학적 조성물 같은 것을 그것에 관해 필요만큼 투여하는 것을 포함한다.
본 발명의 폴리펩티드 및 접합체는 "치료적으로 효과적인" 복용량에서 환자에게 투여될 것이다. 즉, 투여되는 조건에 관해서 소정의 효과를 생산하기에 충분한 복용양이다. 정확한 복용양은 치료되는 질병에 달려있으며, 본 분야에서 당업자에게 확신될 수 있을 것이다. 본 발명의 폴리펩티드 또는 접합체는 예를 들면, Neupogen?과 같은 rhG-CSF 를 이용한 치료에서 이용되는 것과 유사한 복용량이 투여될 수 있다. 본 발명 접합체의 적절한 복용량은 5 -300 마이크로그램/kg 체중(접합체의 단백질 부분의 무게를 기준)의 범위에서 고려되며, 예를 들면 10 - 200 마이크로그램/kg, 가령 25 - 100 마이크로그램/kg 이다. 당업자에게 본 발명의 폴리펩티드, 접합체, 또는 조성물의 효과적인 양은 그중에서도 특히 질병, 복용량, 투약 스케쥴, 폴리펩티드 또는 접합체 또는 조성물이 단독으로 투여되는가 아니면 다른 치료제와 함께 투여되는가, 조성물의 혈청 반감기, 환자의 전체적인 건강, 투약 주기에 달려있다. 바람직하게, 본 발명의 폴리펩티드, 접합체, 제조 또는 조성물은 효과적인 복용양으로 투약되며, 특히, 문제가 있는 환자에게서 백혈구의 숫자, 특히 호중성을 정상화하기에 충분한 복용양으로 투약된다. 백혈구 숫자의 정상화는 단순히 정해진 절차에 따라서 일정한 간격으로 백혈구의 숫자를 세는 것으로 결정된다.
본 발명의 폴리펩티드 또는 접합체는 하나이상의 약리학적으로 수용가능한 운반체 또는 부형제를 포함하는 조성물로 투입되는 것이 바람직하다. 폴리펩티드 또는 접합체는 당해 분야에서 공지된 방법으로 약리학적 조성물로 만들어지고, 충분하게 보관가능하며 인간과 동물에게 투약하는데 적절한 폴리펩티드 약물에 이르게 된다. 약리학적 조성물은 다양한 형태로 만들어질수 있으며, 액체, 겔 또는 동결건조, 또는 다른 적절한 형태를 포함한다. 바라직한 형태는 처치되는 특별한 지시에 달려있으며, 당업자에게 명백할 것이다.
따라서, 본 발명은 다양한 형태의 백혈구 감소증의 치료에 대한 방법과 조성물을 제공한다. 특히,본 발명의 폴리펩티드, 접합체, 또는 조성물은 어떤 종류의 방사선 치료, 화학치료, 및 골수 이식를 받는 암환자에 있어서 감염을 막기 위해서, 말초성 혈액 프로제니터 세포이식에서 모집을 위한 프로제니터 세포의 유동화를 위해서, 심각한 만성 또는 상대적인 백혈구 감소증의 치료를 위해서, 그리고 심한 골수성 백혈병 환자의 치료를 돕기 위해서 사용될 수 있다. 추가적으로, 본 발명의 폴리펩티드, 접합체 또는 조성물은 AIDS 의 치료나 다른 면역결핍질병 및 항균성 치료를 위해, 특히 전신 또는 침투적인 칸디다증 및 또는 박테리아 감염의 치료를 위해 사용될 수 있다.
약 형태
본 발명의 접합체 또는 폴리펩티드는 "원래형" 및/또는 염의 형으로 이용될 수 있다. 적절한 염에는 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속 예를 들면, 나트륨, 칼륨, 칼슘, 마그네슘 및 아연 염등이 포함되나 이에 국한시키지는 않는다. 이와 같은 염 또는 복합체는 결정 및/또는 무정형 구조로 존재한다.
부형제
"제약학적으로 수용가능한"이란 조성물을 투여 받는 환자에서 사용된 복용량 및 농도에서 부작용을 일으키지 않는 운반체 또는 부형제를 의미한다. 이와 같은 제약학적으로 수용가능한 운반체 및 부형제는 당분야에 공지되어 있다(Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th edition, A.R. Gennaro, Ed., Mack Publishing Company [1990]; Pharmaceutical Formulation Development of Peptides and Proteins, s. Frokjaer and K. Hovgaard, Eds., Taylor % Francis [2000]; and Handbook of Pharmaceutical Excipients, 3rd edition, A. Kibbe, Ed., Pharmaceutical Press [2000]).
약물의 혼합
본 발명의 약리학적 조성물은 단독으로 또는 다른 치료제와 함께 투여될 수 있다. 이들 제제들은 몇몇 약리학적 조성물의 부분으로서 도입될 수 있거나, 또는 다른 치료 계획에 따라서 또는 함께 본 발명의 폴리펩티드 또는 접합체와 별도로 투약될 수 있다. 또한 본 발명의 폴리펩티드, 접합체, 또는 약리학적 조성물은 다른 치료들의 보조제로 사용될 수 있다.
환자
본 발명의 목적에 대한 "환자"란 인간과 다른 동물을 포함한다. 그래서, 방 법들은 인간 치료와 수의사의 응용에 적용할 수 있다.
투약경로
제약학적 조제물의 투약은 구강, 피하, 정맥, 뇌, 비강, 경피, 복막, 근육, 폐, 질, 직장, 안구 등을 포함하나 제한되는 것은 아닌 다양한 방법과 또는 다른 임의 적절한 방법을 이용하여 수행될 수 있다. 조제물은 본 분야에서 공지된 환약 투입이 가능할지라도 주입을 통하여 연속적으로 투여될 수 있다.
비경구
제약학적 조성물로 예를 들면, 장관외 투여를 목적으로 하는 용액이 될 수 있다. 대부분의 경우에, 제약학적 용액상 조성물은 바로 이용할 수 있는 적절하게는 액상형이 될 수 있으며, 이와 같은 장관외 조성물은 냉동 또는 동결건조된 형으로 제공될 수 있다. 전자의 경우에, 조성물은 사용하기 전에 해동시킨다. 후자 경우는 다양한 저장 조건에서 조성물에 포함된 활성 화합물의 안정성을 강화시키고자 하는 경우에 이용되는데, 동결건조된 조제물은 일반적으로 액상보다는 더 안정적이라는 것을 당업자는 인지할 것이다. 이와 같은 동결건조된 조제물은 한가지 또는 그이상의 적절한 제약학적 수용가능한 희석제 예를 들면, 주사용 멸균 수 또는 멸균된 생리적인 염 용액을 사용전에 첨가하여 재구성시킨다.
장관외 투여의 경우에, 저장용으로 동결건조된 조성물 또는 수용성 용액으로 조제하는데 있어서, 원하는 순도를 가지는 폴리펩티드를 한 가지 이상의 제약학적 수용가능한 담체, 부형제 또는 안정화제(당분야에서 이용되는 모든 것을 통칭하여 "부형제"라고 함)와 혼합하여 만드는데, 부형제로는 완충제, 안정화제, 보존제, 등 장액, 비-이온성 계면활성제, 항산화제 또는 다른 기타 첨가제등이 포함된다.
생리학적 조건에 근접하는 범위내로 pH를 조절하는데 도움을 주는 것이 완충제이다. 이는 일반적으로 2mM 내지 50mM 농도 범위를 가지며, 본 발명에서 이용할 수 있는 적절한 완충액에는 유기 및 무기산 및 이의 염이 있는데, 예를 들면, 시트레이트 완충액(가령, 구연산 일나트륨, 구연산 이나트륨 혼합물, 구연산-구연산 삼나트륨혼합물, 구연산-구연산 일나트륨 혼합물), 숙신산 완충액(가령, 숙신산-구연산 일나트륨 혼합물, 숙신산-수산화나트륨 혼합물, 숙신산-숙신산 이나트륨 혼합물등), 주석산염 완충액(가령, 주석산-주석산 나트륨 혼합물, 주석산-주석산 칼륨 주석산염 혼합물, 주석산염-수산화나트륨 혼합물등), 푸마르산 완충액(가령, 푸마르산-푸마르산 일나트륨 푸마르산염 혼합물, 푸마르산-푸마르산 이나트륨 혼합물, 푸마르산 일나트륨-푸마르산 이나트륨 혼합물등), 글루코네이트 완충액(글루코닌산-글리코네이트 혼합물, 글루코닌산-수산화나트륨 혼합물, 글루코닌산-글루코네이트 혼합물등), 옥살레이트 완충액(가령, 옥살산-옥살산 나트륨염 혼합물, 옥살산-수산화나트륨 혼합물, 옥살산-옥살산 칼륨 혼합물등), 락테이트 완충액(가령, 젖산-젖산 나트륨염 혼합물, 젖산-수산화나트륨 혼합물, 젖산-젖산 칼륨 혼합물등), 아세테이트 완충액(가령, 아세트산-아세트산 나트륨 혼합물, 아세트산-수산화 나트륨 혼합물등)등이 있다. 인산염 완충액, 히스티딘 완충액, Tris와 같은 트리메틸아민 염등도 가능하다.
보존제는 미생물의 생장을 지연시키기 위해 첨가되는데, 일반적으로 0.2%~1%(w/v)정도로 첨가된다. 본 발명에서 이용되는 적절한 보존제에는 페놀, 벤 질 알코올, 메타-크레졸, 메틸 파라벤, 프로필 파라벤, 옥테데실디메틸벤질 염화 암모니움, 할로겐화 벤잘코니움(가령, 염화 벤잘코니움, 브롬화 벤잘코니움, 요오드화 벤잘코니움), 염화헥사메토니움, 알킬 파라벤 예를 들면, 메틸 또는 프로필 파라벤, 카테콜, 레조르시놀, 사이클로핵사놀 및 3-펜타놀등이 포함된다.
등장화액은 액상 조성물의 등장성을 위해 첨가되는데, 폴리히드릭 슈가 알코올 적절하게는 트리히드릭 또는 고차 슈가 알코올 예를 들면, 글리세린, 에리트리톨, 아라비톨, 자이레톨, 솔비톨, 만니톨등이 포함된다. 폴리히드릭 알코올은 0.1% 내지 25wt%, 일반적으로 다른 성분들의 상대적인 양을 고려하여 1% 내지 5%정도가 포함된다.
안정화제는 팽창제에서부터 주로 치료제를 용해시키거나, 변성 방지를 도와주거나 용기벽에 부착되지 않도록 도와주는 등의 기능을 하는 첨가제에 이르기까지의 광범위한 부형제를 말하는 것이다. 일반적으로 안정화제는 폴리히드릭 슈카 알코올(상기에서 언급); 아르기닌, 리신, 글리신, 글루타민, 아스파라진, 히스티딘, 알라닌, 오미틴, L-루이신, 2-페닐알라닌, 글루타민산, 트레오닌등의 아미노산;과이노시톨과 같은 사이클리톨을 포함하는 락토즈, 트레할로즈, 스타키오즈, 만디톨, 솔비톨, 자이레톨, 미오이노시톨, 갈락티톨, 글리세롤 같은 유기 슈가 또는 슈가 알코올; 폴리에틸렌 글리콜; 아미노산 폴리머; 황을 포함하는 환원 물질 예를 들면 요소, 글루타티온, 트오틱산, 티오글리콜레이트 나트륨, 티오글리세롤, α-모노티오글리세롤 및 티오설페이트 나트륨; 저분자량 폴리펩티드(가령 10개 미만의 아미노산 잔기); 사람의 혈청 알부민, 소의 혈청 알부민, 젤라틴 또는 이뮤노글로블린 과 같은 단백질; 폴리비닐피롤리돈과 같은 친수성 폴리머; 자이로즈, 만노즈, 프락토즈, 글루코즈와 같은 모노사카라이드; 락토즈, 말토즈, 슈크로즈와 같은 디사카라이드; 라피노즈와 같은 트리사카라이드; 덱스트란과 같은 폴리사카라이드등이 된다. 일반적으로 안정화제는 활성 단백질 중량을 기초하여 0.1 내지 10,000중량부 범위로 존재한다.
비-이온성 계면활성제 또는 계면활성제(습윤제로도 알려짐)는 치료제의 용해를 돕고, 교반-유도된 응집에 대하여 치료적인 폴리펩티드를 보호하기 위하여 첨가될 수 있으며, 이로써 조성물은 폴리펩티드의 변형을 유발하지 않으면서 전단 표면 스트레스에 노출된다. 적절한 비-이온성 계면활성제는 폴리오르베이트(20, 80 등), 폴리옥사머(184, 188), Pluronic? 폴리올, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노에테르 (Tween?-20, Tween?-80 등)이 있다.
기타 추가 부형제에는 팽창제 또는 충진제(가령, 전분), 킬레이트제(EDTA), 항산화제(아스코르브산, 메티오닌, 비타민 E), 공용매등이 포함된다.
활성 성분은 또한, 코아세르베이션 기술 또는 계면 중합반응을 이용하여 만든 마이크로캡슐(예를 들면 하이드록시메틸셀룰로즈, 젤라틴, 폴리-(메틸메타아크릴레이트)마이크로캡슐); 콜로이드성 약물 운반 시스템(리포좀, 알부민 소포, 마이크로에멸젼, 나노입자, 나노캡슐) 및 마크로에멸젼 내에 포집시킬 수도 있다. 이와 같은 기술은 Remingtons' Pharmaceutical Science를 참고하면 된다.
in vivo로 투여하기 위해 이용되는 장관외 조성물은 멸균을 해야 한다. 이 는 멸균용 여과 막을 통한 여과를 통하여 멸균을 할 수 있다.
지연 방출 조제물
지연 방출 조제물의 적절한 예로는 폴리펩티드 또는 접합체를 포함하는 고형 소수성 폴리머로된 반투성 매트릭스, 필름 또는 마이크로캡슐형과 같은 적절한 형을 가지는 매트릭스등이 포함된다. 지연 방출 매트릭스의 예로는 폴리에스테르, 하이드로겔(가령, 폴리(2-하이드록시에틸-메타아크릴레이트) 또는 폴리(비닐알코올)), 폴리락티드, L-글루타민산 및 에틸-L-글루타메이트 공중합체, 비-분해성 에틸렌-비닐 아세테이트, 분해성 젖산-글리콜산 공중합체 가령, Prolease? technology 또는 Lupron Depot?(젖산-글리콜산 공중합체 및 로이프롤리드 아세테이트로 구성된 주사용 미소구), 폴리-D-(-)-3-하이드록시부틸산 등이 포함된다. 에틸렌-비닐 아세테이트 및 젖산-글리콜산과 같은 폴리머는 최고 100일 또는 그 이상의 긴 시간동안 분자를 방출시킬 수 있으나, 특정 하이드로겔은 이보다 짧은 기간동안 단백질을 방출한다. 포집된 폴리펩티드는 신체에 오랜 시간동안 남아있는데, 이들은 37℃ 수분에 노출되어 변성되거나 응집되어 생물학적 활성을 상실하게 되고, 면역원성이 변화되기도 한다. 관련 기작에 따라 안정화를 위해 합리적인 전략을 고안해야 한다. 예를 들면, 티오-디설파이드 상호작용을 통하여 분자간 S-S 결합이 형성되는 응집 기작이 발견된 경우에 설파하이드릴 잔기를 변형시키고, 산성 용액으로 동결건조시키고, 적절한 첨가제를 이용하여 수분 함량을 조절하고, 특정 폴리머 매트릭스 조성물을 개발하여, 안정화를 이룰 수 있다.
폐로 수송
제트 또는 초음파를 이용한 네블라이져를 사용하는데 적절한 조성물은 물에 용액 ㎖당 약 0.01 내지 25㎎/㎖ 농도로 용해된 폴리펩티드 또는 접합체로 구성된다. 이때, 적절한 농도는 약 0.1 내지 10㎎/㎖이 된다. 조성물에는 완충액, 단순한 당(예를 들면, 단백질을 안정화시키고, 삼투압을 조절하기 위한 당), 0.1 내지 10㎎/㎖의 사람 혈청 알부민이 포함될 수도 있다. 이용될 수 있는 완충액으로는 아세테이트 나트륨, 구연산염 및 글리신들이 있다. 적절하게는 완충액도 조성물로써 용액의 pH를 3 내지 9 범위 조절하는데 적합한 몰농도를 가진다. 일반적으로 1mM 내지 50mM 몰범위의 완충액이 이와 같은 목적에 적합하다. 안정화에 이용될 수 있는 당으로는 말토즈, 락토즈, 만니톨, 솔비톨, 트레할로즈, 자이로즈등이 있고, 조성물 중량당 1% 내지 10% 범위의 양이 된다.
네블라이져 조성물에는 에어로졸을 형성하는데 용액의 원자화에 따른 단백질이 표면 응집되는 것을 감소시키거나 이를 예방하기 위한 계면활성제도 포함될 수 있다. 통상 다양한 계면활성제가 이용될 수도 있는데, 예를 들면 폴리옥시에틸렌 지방산 에스테르, 알코올 그리고 폴리옥시에틸렌 소르비탄 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다. 그 양은 일반적으로 조성물 중량의 0.001% 내지 4% 범위가 된다. 본 발명의 목적에 특히 적합한 계면활성제는 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노올레이트이다.
본 발명의 적절한 액체 입자 분산액을 만드는 방법과 특정 조성물은 WO94/20069, US5,915,378, US5,960,792, US5,957,124, US5,934,272, US 5,915,378, US 5,855,564, US 5,826,570, US 5,522,385에서 설명하고 있다.
정해진 약량의 흡입 장치에 사용할 수 있는 조성물은 일반적으로 미세하게 분리된 분말로 구성된다. 이와 같은 분말은 동결건조시킨 후, 액상 접합체 조성물을 분쇄하여 만들 수 있는데, 사람의 혈청 알부민(HSA)과 같은 안정화제를 포함할 수도 있다. 일반적으로 0.5%(w/w)이상의 HSA를 첨가한다. 또한, 한 가지 이상의 당 또는 당 알코올이 필요에 따라 조제물에 첨가된다. 당 또는 당 알코올로는 락토즈, 말토즈, 만니톨, 솔비톨, 솔비토즈, 트레할로즈, 자이리톨, 자일로즈등이 포함된다. 조성물에 첨가되는 양은 0.01 내지 200%(w/w), 적절하게는 존재하는 접합체의 약 1 내지 50% 범위가 된다. 이와 같은 조제물을 동결건조시키고, 원하는 입자 크기로 분쇄한다.
그 다음 적절한 크기 입자를 계면활성제의 도움을 받아, 추진제에 현탁시킨다. 추진제는 이와 같은 목적을 위해 이용되는 임의 통상적인 물질이 되는데, 예를 들면, 클로로플로오르카본, 하이드로클로로플로오로카본, 하이드로플로오로카본 또는 트리클로로플로오로메탄, 디클로로디플로오르메탄, 디클로로테트라플로오르에탄올, 1,1,1,2-테트라플로오르에탄 또는 이의 복합물을 포함하는 하이드로카본등이 있다. 적절한 계면활성제에는 소르비탄 트레올레이트, 콩 레시틴등이 포함된다. 올레산이 계면활성제로 유용할 수도 있다. 그 다음, 이와 같은 혼합물을 운반장치에 적하한다. 본 발명의 목적에 이용할 수 있는 상업적으로 이용할 수 있는 적절한 일정 약량을 제공하는 흡입기로는 Glaxo Inc., Research Triangle Park, N.C.가 공급하는 Ventolin있다.
분말 흡입기용 조제물에는 접합체를 포함하는 미세하게 분쇄된 건분말이 포함되는데, 팽창제 가령, 락토즈, 솔비톨, 슈크로즈 또는 만니톨이 장치로부터 분말을 분산시킬 수 있을 정도의 양 가령, 중량의 50% 내지 90%가 포함된다. 분말 입자들은 평균 직경이 약 10㎛ 이하, 적절하게는 0.5 내지 5㎛, 가장 적절하게는 1.5 내지 3.5㎛를 가지고, 밀도가 1g/㎠인 입자에 상응하는 공기역학적 특성을 폐에서 가질 수가 있다. 여기에서 설명하는 기술에 따라 이용할 수 있는 분말 흡입기로는 Fisons Corp., Bedford, Mass.가 제공하는 Spinhaler가 있다.
이와 같은 장치용 분말은 US5,997,848, US5,993,783, US5,985,248, US5,976,574, US5,922,354, US5,785,049, US 5,654,007에서 설명하는 방법으로 만들고, 운반할 수 있다.
치료요법적 산물을 폐로 운반하도록 고안된 기계적인 장치에는 네블라이져, 정해진 약량 흡입기, 분말 흡입기등이 포함되나 이에 국한시키지 않고, 이들 모두는 당업자가 잘 알고 있는 것들이다. 본 발명을 실행하는데 적절한 시판되는 장치로는 Mallinckrodt, Inc., St. Louis, Missouri.가 공급하는 Ultravent 네블라이져; Marquest Medical Procucts, Englewood, Colorado가 공급하는 Acorn Ⅱ 네블라이져; Glaxo Inc., Research Triangle Park, North Carolina가 공급하는 Ventolin 정량 흡입기; Fision Corp., Bedfor, Massachusetts가 공급하는 Spinhaler 분말 흡입기; Inhale Therapeutic Systems, Inc., San Carlos, California가 공급하는 "standing cloud"; Alkermes, Cambridge, Massachusetts기 공급하는 AIR 흡입기; Aradigm Corporation, Hayward, California가 공급하는 AERx 폐로 약물을 운반하는 시스템등이 있다
또한 유전자 요법에 이용시에, 본 발명의 폴리펩티드를 인코드하는 뉴클레오티드를 이용하는 것도 고려해볼 수 있다. 특히, 관심을 끄는 것은 "발명의 접합체 여기서 비폴리펩티드 부분이 탄수화물 부분" 단락에서 설명하고 있는 폴리펩티드를 인코드하는 뉴클레오티드를 이용하는 것이다. 따라서, 폴리펩티드의 글리코실화반응은 유전자 치료과정동안에 얻을 수 있는데, 즉, 사람의 신체내에서 뉴클레오티드 서열이 발현된 뒤에 얻을 수 있다는 것이다.
고려되는 유전자 치료법에는 폴리펩티드가 효과적인 치료를 제공할 것으로 기대되는 질병의 치료에 포함된다. 이것은
는 것이 기대되는 상기 질병을 치료하는 것이 포함되는데, 이때 폴리펩티드가 효과적인 치료법을 제공할 것으로 기대된다. 이들은 다양한 형태의 백혈구 감소증의 치료, 상세하게는 어떤 형태의 화학요법, 골수 이식을 겪는 암환자에 있어서 감염을 예방하는 것, 말초성 혈액 프로제니터 세포이식에서 모집을 위한 프로제니터 세포의 유동화, 심각한 만성 또는 상대적인 백혈구 감소증, 심한 골수성 백혈병 환자의 치료, AIDS 의 치료나 또는 다른 면역결핍질병의 치료를 포함한다.
유전자 치료법을 이용하여 국소로 G-CSF 를 운반함으로써 표적부위에 치료요법제를 제공하고, 불-특정 투여와 연관하여 나타나는 잠재적인 독성 문제를 피할 수 있다.
in vitro 및 in vivo 유전자 치료용으로 고려하였다.
한정된 세포군에 잠재적 치료요법적 유전자를 운반하는 몇가지 방법이 공지 되어 있다. 참고문헌으로는 Mulligan, "The Basic Science Of Gene Therapy", Science, 260, pp. 926-31(1993)이 있고, 이들 방법에는 다음이 포함된다:
직접 유전자를 전달하는 방법-Wolff et al., "Direct Gene transfer Into Mouse Muscle In vivo", Science 247, pp. 1465-68(1990)에서 설명하는 것과 같은 방법;
리포좀-중개된 DNA를 전달하는 방법-Caplen et al., "Liposomemediated CFTR Gene Transfer to the Nasal Epithelium Of Patients With Cystic Fibrosis" Nature Med., 3, pp. 39-46(1995); Crystal, "The Gene As A Drug", Nature Med., 1, pp. 15-17(1995); Gao and Huang, "A Novel Cationic Liposome Reagent For Efficient Transfection of Mammalian Cells" Biochem. Biophys Res. Comm., 179, pp. 280-85(1991)에서 설명하는 방법;
레트로바이러스-중개된 DNA 전달방법-Kay et al., "In vivo Gene Therapy of Hemophills B: Sustained Partial Correction In Factor Ⅸ-Deficient Dogs", Science, 262, pp. 117-19(1993); Anderson, "Human Gene Therapy", Science, 256, pp.808-13(1992)에서 설명하는 방법; 그리고
DNA 바이러스-중개된 DNA를 전달하는 방법. 이와 같은 DNA 바이러스에는 아데노바이러스(적절하게는 Ad-2 또는 Ad-5계 벡터), 허피스 바이러스(적절하게는 하피스 심플렉스계 벡터), 파르보바이러스(적절하게는 "결손" 또는 비-자발성 파르보바이러스계 벡터, 좀더 적절하게는 아데노-연합된 바이러스계 벡터, 가장 적절하게는 AAV-2계 벡터)(Ali et al., "The Use Of DNA Viruses as Vectors for Gene Therapy", Gene Therapy, 1, pp. 367-84(1994); US 4,797,368, and US 5,139,941)등이 포함된다.
본 발명은 다음의 실시예에서 추가 설명된다.
도 1 : rhG-CSF(Neupogen?) 및 SPA-PEG 5000-접합된 hG-CSF K16R K34R K40R Q70K Q90K Q120K의 in vivo 반감기
도 2 : rhG-CSF(Neupogen?), SPA-PEG 5000-접합된 hG-CSF K16R K34R K40R Q70K Q120 및 SPA-PEG 5000-접합된 hG-CSF K16R K34R K40R Q70K Q90K Q120 의 in vivo 생물학적 활성
도 3 : rhG-CSF(Neupogen?), SPA-PEG 12000-접합된 hG-CSF K16R K34R K40R 및 다른 복용량의 SPA-PEG 5000-접합된 hG-CSF K16R K34R K40R Q70K Q90K Q120 의 in vivo 생물학적 활성
서열 리스트
첨부된 서열 리스트는 다음의 서열을 함유한다:
SEQ ID NO:1: 인간 G-CSF 의 아미노산 서열.
SEQ ID NO:2: E. coli 에서의 발현에 최적화된 코돈 사용법과 인간 G-CSF 을 엔코드하는 합성 DNA 서열.
SEQ ID NO:3: OmpA 시그널의 아미노산 서열.
SEQ ID NO:4: OmpA 시그널 서열을 엔코드하는 합성 DNA 서열.
SEQ ID NO:5: 합성 히스티딘 태그.
SEQ ID NO:6: SEQ ID NO:5 의 히스티딘 태그를 엔코드하는 합성 DNA 서열.
SEQ ID NO:7: 인간 G-CSF 시그널 펩티드의 아미노산 서열.
SEQ ID NO:8: CHO 세포에서의 발현에 최적화된 코돈 사용법과 SEQ ID NO:7 의 시그널 펩티드를 포함하는 인간 G-CSF 을 엔코드하는 합성 DNA 서열.
재료 및 방법
변형된 아미노산을 결정하기 위해서 사용된 방법
접근가능한 표면 지역(ASA)
NMR 분광학에 의해서 결정된 10 구조의 A 3D 앙상블(Zink et al.(1994) Biochemistry 33: 8453 - 8463) 이 단백질 데이타 은행(PDB)(www.rcsb.org/pdb/)에서 이용가능하다. 이 정보는 컴퓨터 프로그램 Access(B. Lee and F.M.Richards, J. Mol. Biol. 55:379-400 (1971)) 버전 2(Copyright(c) 1983 Yale University)에 입력되고 구조에서 개별 원자의 접근가능한 표면 지역(ASA)을 계산하는데 이용될 수 있다. 이 방법은 일반적으로 1.4Å크기의 프로브를 이용하고, 프로브 중심에 의해 지역이 형성되어, 접근가능한 표면 지역을 규정짓는다. 이와 같은 계산을 실행하기 전에, 단백질에 직접 관련이 안된 모든 물 분자, 수소 원자 및 다른 원자를 좌표로부터 제거한다.
측쇄의 단편 ASA
측쇄원자의 단편 ASA는 측쇄에 있는 원자들의 ASA 합을 연장된 ALA-x-ALA 삼 가펩티드에서 잔기형의 측쇄 원자의 ASA를 나타내는 값으로 나누어 계산할 수 있다. Hubbard, Campbell & Thornton (1991) J. Mol. Biol.: 220,507-530 를 참조. 예를 들면, CA 원자는 글리신 잔기의 측쇄의 일부분이나 나머지 잔기의 일부분이 아닌 것으로 간주한다. 다음의 표는 측쇄에 대해 100% ASA 기준으로 이용한다;
Ala 69.23Å2
Arg 200.35Å2
Asn 106.25Å2
Asp 102.06Å2
Cys 96.69Å2
Gln 104.58Å2
Glu 134.61Å
Gly 32.28Å
His 147.00Å
Ile 137.91Å
Leu 140.76Å
Lys 162.50Å
Met 156.08Å
Phe 163.90Å
Pro 119.65Å
Ser 78.16Å
Thr 101.67Å
Trp 210.89Å
Tyr 176.61Å
Val 114.14Å
구조에서 감지되지 않은 잔기는 유연성 있는 부분에 거주하기 때문에 100% 노출되는 것으로 규정짓는다.
원자간에 거리 측정
InsightⅡ v. 98.0, MSI INC.의 분자 그래픽 소프트웨어를 이용하여, 원자간의 거리를 계산한다.
변화된 아미노산 잔기에 관한 일반적인 고려사항
상기에 설명된 바와 같이, 본 발명에 따라서 변화된 아미노산 잔기은 바람직하게는 측쇄가 표면에 노출된 것으로서, 특히 측쇄의 25 % 이상이 분자의 표면에 노출되고, 더 바람직하게는 50 % 이상의 측쇄노출을 가지는 것이다. 다른 고려는 수용체 표면에 위치한 잔기들이 바람직하게는 수용체 결합 또는 활성화와의 가능한 간섭을 피하거나 또는 최소한 최소화하기 위해서 제외된다는 것이다. 더 다른 고려사항은 가장 가까운 Lys(Glu,Asp)CB-CB(CA for Gly)로부터 10 Å 이하에 존재하는 잔기들은 또한 제외되어야 한다는 것이다. 마지막으로, 변형에 대한 바람직한 위치 는 특히, 친수성 및/또는 하전된 잔기, 예를 들면 Asp, Asn, Glu, Gln, Arg, His, Tys. Ser 및 Thr 를 가지는 것이며, 특히 아르기닌 잔기를 가지는 것이 바람직하다.
변형을 위한 G-CSF 아미노산 잔기를 확인
다음의 정보는 본 발명에 따라서 변화된 아미노산 잔기를 확인할 때 일반적으로 고려되어야 할 인자를 예시한다.
인간 G-CSF 에 대한 X-결정학에 의한 삼차원 구조(Hill et al.(1993) Proc. Natl. Acad.Sci.USA 90:5167 - 5171)와 NMR 분광학(Zink et al.(1994) Biochemistry 33: 8458-8463)에 의해 보고되었다. 상기에서 언급한 바와 같이, Aritomi et al.(Nature 401:713 - 717, 1999)는 다음의 hG-CSF 잔기를 수용체 결합 계면의 일부로서 확인하였다:G4, P5, A6, S7, S8, L9, P10, Q11, S12, L15, K16, E19, Q20, L108, D109, D112, T115, T116, Q119, E122, E123 및 L124. 그래서, 이러한 잔기를 개선하는 것이 가능할지라도, 이러한 잔기는 변형으로부터 배제되는 것이 바람직하다.
Zink et al.(1994)에 의해서 확인된 G-CSF 의 10 NMR 구조를 입력구조와 이에 이은 측쇄의 평균 ASA 의 계산으로서 이용하여, 다음의 잔기가 25 % 이상의 ASA 를 가지는 것으로 확인되었다. :
Figure 112002022035895-pct00008
Figure 112002022035895-pct00009

분자 그래픽 프로그램 InsightⅡ? v. 98.0 이 가장 가까운 아민기에서 15 Å 이상의 거리에서 그들의 CB 원자(글리신의 경우 CA)를 가지는 잔기를 결정하기 위해서 사용되었으며, 라이신의 NZ 원자와 N-말단 잔기 T1 의 N 원자로서 정의된다. 다음의 목록은 적어도 10 NMR 구조중 하나에서 이러한 기준이 충족되는 잔기를 포 함한다.
Figure 112002022035895-pct00010
InsightⅡ? v. 98.0 프로그램은 유사하게 가장 가까운 산기로부터 10 Å 이상의 거리에서 그들의 CB 원자(글리신의 경우 CA)를 가지는 잔기를 결정하기 위해서 사용되었으며, 아스파라틱산의 CG원자, 글루탐산의 CD 원자 및 C-말단 잔기 P174 의 C 원자로 정의된다. 다음의 목록은 10 NMR 구조중 하나에서 이러한 기준이 충족되는 잔기를 포함한다. M0, T1, P2, L3, G4, P5, A6, S7, S8, L9, P10,
Figure 112002022035895-pct00011
상기 목록을 비교하고 조합하는 것에 의해서, 주어진 G-CSF 폴리펩티드에서의 변형이 바라는 특성의 결과에 이르게 되는 아미노산잔기의 제한된 수를 함유하는 목록에 이르는 변형을 위해서 개별적인 아미노산 잔기를 선택하는 것이 가능하 다.
hG-CSF 및 이의 변이체의 PEG화 방법
hG-CSF 및 이의 변이체의 용액에서의 PEG화
인간 G-CSF 및 이의 변이체는 50 mM 쏘듐 포스페이트, 100 mM NaCl, pH 8.5 에서 250 ㎍/ml 농도에서 PEG화된다. PEG 의 몰잉여는 단백질상에서 PEG 화 부위에 대해 100 배이다. 반응 혼합물은 열 혼합기에 30 분동안 37 ℃에서 1200 rpm 에 놓여진다. 30 분 후 과량몰의 글리신을 첨가하는 것에 의해 반응종결이 이루어진다.
음이온 교환 크로마토그래피가 과량의 PEG, 글리신, 및 다른 부산물을 반응혼합물로부터 제거하기 위해서 적용되었다. PEG 화 반응 혼합물은 이온 강도가 7mS/cm이하가 될때까지 pH 2.5 의 쏘듐사이드레이트 20 mM으로 희석되었다. pH 는 5 N NaCl 을 이용하여 2.5 에 맞춰졌다. 혼합물은 pH 2.5 쏘듐 사이트레이트 20 mM로 평행화된 SP-sepharose FF 컬럼에 적용되었다. 고정되지 않은 물질들이 평형 완충액의 4 컬럼부피를 이용하여 컬럼으로부터 세척되었다. PEG화된 단백질은 20 mM 쏘듐사이드레이트, 750 mM 쏘듐클로라이드를 투입하여 3 컬럼부피에서 용출되었다.순수한 PEG화된 G-CSF 는 농축되고, 완충액 교환이 분자량 컷오프(mwco): 10 kDa VivaSpin 농축장치를 이용해서 수행되었다.
G-CSF 활성을 가지는 태그된 폴리펩티드의 마이크로적정판에서 PEG 화
G-CSF 활성을 나타내는 폴리펩티드는 적절한 태그, 예를 들면, 상기의 일반적 기술에서의 예증된 어떤 태그로 발현되고, 배양 브로스가 태그된 폴리펩티드를 고정시킬수 있는 하나이상의 마이크로적정판으로 옮겨진다. 태그가 Met-Lys-His-Gln-His-Gln-His-Gln-His-Gln-His-Gln-His-Gln-Gln 일때, QIAGEN 에서 구입할 수 있는 니켈-니트릴로트리아세틱산(Ni-NTA)HisSorb 마이크로적정판이 이용될 수 있다.
태그된 폴리펩티드의 마이크로적정판에의 고정화이후, 웰은 결합과 순차적인 PEG 화에 적절한 완충액에서 세척되고, 선택의 활성화된 PEG 로 웰을 배양하는 것이 이어졌다. 예를 들면, Shearwater Polymers 로부터 M-SPA-5000이 이용된다. 활성화된 PEG 의 폴리펩티드에 대한 몰비는 최적화되어야 하며, 그러나 전형적으로는 10 : 1 보다는 크며, 예를 들면100 :1 까지 또는 더높다. 주위온도에서 적절한 반응시간 후, 전형적으로는 1 시간정도, 반응이 활성화된 PEG 용액을 제거함으로서 중단된다. 접합된 단백질은 적절한 완충액에 의한 배양에 의해서 판으로부터 용출된다. 적절한 용출 완충액은 이미다졸을 함유하고, 과량의 NTA 또는 다른 킬레이팅 화합물을 포함한다. 접합된 단백질은 생물학적 활성에 대해서 측정되고, 적절하게 면역원성이 측정된다. 태그는 임의적으로 공지의 방법을 이용해서 분열될 수 있으며, 예를들면, 디아미노펩티다아제를 이용하여, pos-1 에서 Gln이 GCT(글루타밀사이클로트랜스퍼라아제)와 함께 피로글루타밀로 변화되고, 종국적으로 태그되지 않은 단백질로 되면서, PGAP(피로-글루타밀-아미노펩티다아제)로 분해될 수 있다. 공정은 금속 킬레이트 친화성 크로마토그래피의 몇단계를 포함한다. 선택적으로, 태그된 폴리펩티드는 접합될 수 있다.
hG-CSF 활성을 나타내는 폴리펩티드와 차단된 수용체 결합부위를 가지는 PEG 화
라이신의 PEG 화를 배제하는 방법에 있어서 hG-CSF 의 최적의 PEG 화를 위해서, 다음의 방법이 개발되었다:
정제된 hG-CSF 가 실시예 3 에서 얻어지다. G-CSF 수용체의 용해성 부분 hG-CSF 폴리펩티드의 호모다이머(homodimer)의 2:2 양론적 복합체와가 포스페이트-완충 살린 용액(PBS)완충액내에서 pH 7.0 에서 형성된다. hG-CSF 폴리펩티드의 농도는 약 20 ㎍/mL 이거나 또는 1 μM 이며, 수용체는 동몰농도로 존재한다.
Shearwater Polymers, Inc. 으로부터의 M-SPA-5000은 hG-CSF 폴리펩티드의 5, 20 및 100 몰과량에 상응하는 3 가지 다른 농도 레벨로 첨가된다. 반응 시간은 실온에서 30 분이다. 30 분 반응시간 후, 반응 혼합물의 pH 는 pH 2.0 에 맞춰지고, 반응 혼합물은 Vydac C18 컬럼에 적용되고, 필연적으로(Utsumi et al., J. Biochem., Vol. 101, 1199 - 1208,(1987)에서 기술된 것처럼 아세토니트릴 기울기로 용리된다. 선택적으로 이소프로판올 기울기가 사용될 수 있다.
단편들은 여기서 기술된 1 차 스크린링 측정을 이용하여 분석되고, 이방법에 의해서 얻어진 활성 PEG화된 hG-CSF 폴리펩티드는 - 80 ℃로 PBS 내에, 1 mg/ml 인간 혈청 알부민(HSA)을 함유하며 pH 7 로 저장된다.
접합된 그리고 비접합된 hG-CSF 및 이의 변이체를 특징지우는데 사용되는 방법
hG-CSF와 이의 변이체의 분자크기를 결정
접합된 그리고 비접합된 hG-CSF 또는 이의 변이체의 분자량은 SDS-PAGE, 겔 여과, 레이져 탈착 질량 분석기에 보조되는 매트릭스, 또는 평형 원심분리기로 결정된다.
폴리펩티드의 농도 결정
폴리펩티드의 농도는 280 nm 에서 광학 밀도 측정, 효소-연결된 면역흡착 측정(ELISA), 방사-면역측정(RIA), 또는 본 분야에서 공지된 면역감지와 같은 다른것을 이용하여 측정될 수 있다. 또한, 시료에서 폴리펩티드의 농도는 폴리펩티드에 대한 특정 항체로 코팅된 Biacore? 칩을 이용하는 Biacore? 장치를 이용하여 측정할 수 있다.
그러한 항체는 공유적으로 Biacore?칩에 다양한 화학으로 결합될 수 있다. 선택적으로, 항체는 비공유적으로 예를 들면, 항-폴리펩티드 항체의 Fc 부분에 대한 특이성 항체를 이용하여, 고정될 수 있다. Fc 특이성 항체는 먼저 칩에 공유적으로 결합된다. 항-폴리펩티드항체는 이후 칩위로 넘쳐흘러서 지정된 형식으로 청 항체에 의해서 고정된다. 더구나 비오틴화된 항체는 스트렙타비딘 코팅된 표면을 이용하여 고정될 수 있다.(예를 들면, Biacore Sensor Chip SA?)(Real-Time Analysis of Biomolecular Interactions, Nagata and Handa(Eds.), 2000, Springer Verlag, Tokyo: Biacore 2000 Instrument Handbook, 1999, Biacore AB).
시료가 침을 흘러넘칠 때, 폴리펩티드는 코팅된 항체에 고정되고, 무게의 증가는 측정될 수 있다. 공지의 농도에서 폴리펩티드의 제조를 이용하는 것으로서, 표준 커브가 확립될 수 있으며, 순차적으로 시료에 있어서, 폴리펩티드의 농도가 결정될 수 있다. 시료의 각각의 주입 후 센서칩은 바운드 에널레이트(bound analyte)를 제거하는 적절한 용리액(예를 들면, 낮은 pH 완충제)에 의해서 재생된다. 야생형 폴리펩티드에 돌연변이 또는 다른 조작을 도입하는 것은 (추가적인 글리코실화 또는 폴리머 접합) 그러한 항체에 의한 인식을 변형시킬 수 있다. 더구나, 그러한 폴리펩티드의 증가된 분자량을 야기시킬수 있는 그러한 조작은 증가된 플라스몬 공명 신호에 이르게 된다. 결과적으로, 테스트되는 모든 분자에 대한 표준곡선을 확립하는 것이 필수적이다.
접합된 또는 비접합된 hG-CSF 및 그 변이체의 in vivo 및 in vitro 활성을 결정함에 있어 사용하는 방법
1 차 측정 1- in vitro G-CSF 활성 측정
쥐세포주 NFS -60(Dr. J. Ihle, St. Jude Childern's Research Hospital, Tennessee, USA)의 증식은 성장배지에서 활성 G-CSF의 존재에 따라 달라진다. 그래서, hG-CSF 및 그 변이체의 in vitro 생물학적 활성은 성장 배지에 어떤 G-CSF 시료를 투입하고, 고정된 기간동안의 배양 후 NFS-60 세포의 분열수를 측정하는 것에 의해서 결정될 수 있다.
NFS-60 세포는 10 % w/w FBS(태아 소 혈청), 1 % w/w Pen/Strep, 10 ㎍/리터 hG-CSF, 및 2 mM 글루타막스를 함유하는 Iscoves DME 배지에서 유지된다. 시료첨가전, 세포들은 hG-CSF 가 없는 성장 배지에서 두번 세척되고, ml 당 2.2 x 105셀의 농도까지 희석된다. 세포 현탁액 100 ㎕ 이 각각의 96 웰 마이크로적정판(코닝)에 투입된다.
접합된 또는 비접합된 G-CSF 또는 이의 변이체를 함유하는 시료들은 성장배지에서 1.1x10 -6 M - 1.1x10-13 M 까지 희석된다. 각각의 시료 10 ㎕가 NSF-60 세포를 함유하고 있는 3 웰에 투입된다. 포유류 성장 배지의 10 ㎕ 로 이루어진 컨트롤이 각 마이크로적정판에 8 웰에 투입된다. 세포들은 48 시간동안(37 ℃, 5 % CO2) 배양되고, 세포의 분열 수 는 각 웰에서 WST-1 세포 증식제(Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany)를 이용하여 계량화된다. WST-1 0.01 ml가 웰에 투입되고, 150 분간 37 ℃에서 5 % CO2 대기에서 배양된다. 테트라졸리윰 염 WST-1 의 생존가능한 세포에서의 미토콘드라아성 디하이드로나아제에 의한 분열은 450 nm 에서의 흡수를 측정하는 것에 의해서 계량화되는 포르마잔의 형성에 이르게된다. 이것에 의해서 생존할 수 있는 세포의수가 각 웰에서 계량화된다.
이러한 측정에 기초하여, 각 접합되거나 비접합된 G-CSF 분자 또는 이의 변이체에 대한 복용량-반응 곡선이 계산되고, 이후 각 분자에 대한 EC50 수치가 결정될 수 있다. 이러한 수치는 비접합된 인가 G-CSF 의 최대 증식활성의 50 % 를 얻기 위해서 필수적인 활성 G-CSF 단백질의 양과 동일하다. 그래서, EC 50 수치는 주어진 단백질의 in vitro 활성의 직접적인 측정이다.
1 차 측정 2- in vitro G-CSF 활성 측정
뮤린 조혈세포주 BaF3 가 ,fos, 루시페라제 리포터 염색체 앞에, 인간 G-CSF 수용체 및 전사 조절제 프로모터를 가지는 플라스미드로 감염된다. G-CSF 시료를 가지는 그러한 세포주를 자극할 때, 많은 세포내 반응이 fos 발현의 자극에 이르로, 결과적으로 루시페라제의 발현에 이른다. 이러한 자극은 Steady-GloTM 루세페라제 측정 장비(Promega, Cat. No. E2510)으로 관측되며, 이에 의해서 G-CSF in vitro 활성이 계량화될 수 있다.
BaF3/hGCSF-R/pfos-lux 세포가 37℃ 에서 가습된 5 % CO2 대기, 완전 배양 배지(RPMI-1640/HEPES(Gibco/BRL, Cat. No.22400), 10 % FBS(HyClone, characterized), 1x 페니실린/스트렙토미신(Gibco/BRL, Cat. No.15140-122), 1x L-글루타민(Gibco/BRL, Cat. No.25030-081), 10 % WEHI-3 conditioned media(muiL-3 의 근원)에서 유지되어, 5 x 105 세포/mL(융합성의) 밀도까지 자란다. 세포는 약 2 x 104 세포/mL 에서 매 2 - 3 일마다 리시드(reseed)되었다.
측정 하루전, 로그-상 세포가 스타빙 배지(DMEM/F12(Gibco/BRL, Cat. No. 11039), 1 % BSA (Sigma, Cat. No. A3675), 1x 페니실린/스트렙토미신(Gibco/BRL, Cat. No.15140-122), 1xL-글루타민(Gibco/BRL, Cat. No.25030-081), 0.1 % WEHI-3 conditioned media)에서 2x105 세포/mL에서 리서스펜션되고, 20 시간동안 굶주렸다. 세포는 PBS 로 두번 세척되고, Trypan Blue 생존성 착색을 이용하여 생존성에 대해서 시험된다. 세포들은 측정 배지(RPMI-1640(페놀-레드 없는,Gibco/BRL, Cat. No. 11835), 25 mM HEPES, 1 % BSA(Sigma, Cat. No. A3675), 1x 페니실린/스트렙토미신(Gibco/BRL, Cat. No.15140-122), 1xL-글루타민(Gibco/BRL, Cat. No.25030-081)에서 4 X 106 세포/mL 에서 리서스펜션되고, 96-웰 마이크로적정판(코닝)의 각 웰에 50 μL 씩 나누어서 투입되었다. 접합된 또는 비접합된 G-CSF 또는 이들의 변이체를 함유하는 시료들은 측정 배지상에서 1.1 x 10-7 - 1.1 x 10-12 M 의 농도까지 희석된다. 각 시료의 50 ㎕가 BaF3/hGCSF-R/pfos-lux 세포를 함유하는 3 웰에 투입된다. 50㎕ 매개를 포함하는 네가티브 컨트롤이 각 마이크로적정판상에서 8 웰에 투입된다. 판들은 부드럽게 혼합되고, 2 시간동안 37℃ 에서 배양된다. 루시페라제 활성은 다음의 Promega Steady-GloTM protocol(Promega Steady-GloTM 루시페라제 측정 시스템, Cat. No. E2510)을 이용하여 측정된다. 100 μL 의 기질이 각 웰에 투입되고, 부드러운 혼합이 이어진다. 루미네센스가 TopCount 루미노미터(Packard)에서 SPC(single photon counting) 모드에서 측정된다.
이러한 측정에 기인하여, 각 접합되거나 비접합된 G-CSF 분자 또는 이들의 변이체의 복용량-반응 곡선이 계산되고, 이 후 각 분자에 대한 EC 50 수치가 결정될 수 있다.
2 차측정- G-CSF 또는 이들의 변이체의 hG-CSF 수용체에 대한 결합 친화도
hG-CSF 수용체에 대한 rhG-CSF 또는 이의 변이체의 결합이 표준 결합측정을 이용하여 연구된다. 수용체는 정제된 세포외 수용체 영역, 정제된 세포 플라즈마 막 또는 모든 세포- 고유적으로 G-CSF 수용체(예를 들면 NSF-60) 를 발현하는 세포주 또는 수용체를 엔코드하는 cDNA 로 감염된 세포인 세포의 출처- 에 고정된 수용 체일 수 있다. rhG-CSF 또는 이들의 변이체의 결합부위에 대한 자연의 G-CSF 와의 경쟁 능력은 표지된 G-CSF-아날로그, 예를 들면 비오틴화된 hG-CSF 또는 방사요드화(radioiodinated)된 hG-CSF 와 배양하는 것에 의해서 분석된다. 그러한 분석의 예는 Yamasaki et al.(Druga. Exptl.Clin. Res. 24:191-196(1998))에 기술되어 있다.
hG-CSF 의 세포외 영역은 임의적으로 Fc 에 결합되고, 96 웰판에 고정될 수 있다. RhG-CSF 또는 이의 변이체는 연속적으로 첨가되고, 이들의 결합은 특정한 항-hG-CSF 항체 또는 비오틴화된 또는 방사요드화된 hG-CSF 를 이용하여 감지된다.
in vivo 상에서 접합되거나 비접합된 rhG-CSF 및 이들의 변이체의 반감기 측정
본 발명의 중요한 면은 폴리머 부분에 폴리펩티드의 접합이 있거나 혹은 없는 hG-CSF 의 건설로 얻어지는 연장된 생물학적 반감기이다. hG-CSF 혈청 농도의 급격한 감소는 접합 또는 비접합된 hG-CSF 및 이의 변이체로의 처리에 대한 생물학적 반응을 수치화하는 것을 중요하게 만든다. 바람직하게, 본 발명의 접합 또는 비접합된 hG-CSF 및 이의 변이체는 또한 i.v. 투약 후 혈청 반감기를 연장시키며, 예를 들면 ELISA 방법 또는 1 차 스크린링 측정에 의한 측정이 가능하게 한다. in vivo 생물학적 반감기의 측정은 하기와 같이 이루어진다.
수컷 Sprague Dawley rat(7 weeks old)가 사용되었다. 투약 일에, 동물의 체중이 측정되었다(동물당 280 - 310 g). 비접합된 hG-CSF 시료와 접합된 hG-CSF 시 료의 체중당 100 ㎍ 이 각각 세쥐의 꼬리 정맥에 정맥주사로 투입되었다. 주사후 1 분, 30 분, 1, 2, 4, 6 및 24 시간에서, 500 ㎕ 혈액이 각 쥐의 눈으로부터 CO2 마취하에서 채취되었다. 혈액 시료들은 실온에서 11/2 시간동안 저장되고, 이후 원심분리에 의한 혈청의 분리(4 ℃, 5 분간 18000xg) 가 이어졌다. 혈청 시료는 분석일까지 -80℃ 에서 보관되었다. 혈청에서 활성 G-CSF 의 양은 얼음에서 시료를 해동시킨 후 G-CSF in vitro 활성 측정(제 1 측정 및 제 2 측정을 참조)에 의해서 계량화되었다.
G-CSF 또는 이들의 변이체의 in vitro 반감기의 측정을 위한 다른 측정예는 US 5,824,778 에 기술되어 있으며, 이것은 내용은 여기서 참고문헌으로 도입되었다.
접합 및 비접합된 hG-CSF 및 이의 변이체의 in vivo 생물학적 활성의 측정
SPF Sprague Dawley 쥐(M&B A/S, Denmark 로부터 구입)에서 hG-CSF 의 in vivo 생물학적 효과의 측정은 접합 및 비접합된 G-CSF 및 이의 변이체의 생물학적 효율을 측정하는데 사용된다.
도착일에, 쥐들은 무작위적으로 6 그룹으로 배당된다. 동물들은 7 일동안 순응되며, 여기서 조건이 나쁘거나 혹은 극단적 체중의 개체들은 배제되었다. 순응화 기간의 출발시 쥐의 체중 범위는 250 - 270 g 이다.
투약일에 쥐들은 16 시간 동안 단식되고, 체중당 100 ㎍ 의 hG-CSF 또는 이의 변이체 피하 주사가 이어졌다. 각 hG-CSF 시료는 6 무작위화된 쥐 그룹에 주사 되었다. 300 ㎕ EDTA 안정된 혈액의 혈액 시료가 쥐의 꼬리 정맥으로부터 투약전, 복용후 6, 12, 24, 36, 48, 72, 96, 120, 및 140 시간에 채취되었다. 혈액 시료는 하기의 혈액학적 인자에 대해서 분석된다: 헤모글로빈, 적혈구 수, 헤마토크리트, 평균 세포부피, 세포헤모글로빈 평균 농도, 평균 세포 헤모글로빈, 백혈구 수, 백혈구 백분율수,(호중성, 림프구, 호산성, 호염기성, 단핵백혈구). 이러한 측정의 기초하에서 접합 및 비접합된 hG-CSF 및 이의 변이체의 생물학적 효율이 수치화된다.
hG-CSF 및 이의 변이체에 대한 in vivo 생물학적 활성의 측정의 측정예는 US 5,681,720, US5,795,968, US5,824,778, US5,985,265 및 Bowen et al., Experimental Hematology 27: 425 - 432(1999) 에 더 기술되어 있다.
폴리펩티드 수용체-결합 친화성(온- 및 오프-레이트)의 결정
수용체와 리간드사이의 결합의 세기는 효소-연결된 면역흡착 측정(ELISA), 방사-면역측정 (RIA) 또는 이분야에서 공지된 다른 면역감지 기법을 이용하여 측정될 수 있다. 리간드-수용체 결합 상호작용은 Biacore 장치를 이용하여 또한 측정될 수 있으며, 이것은 플라스몬 공명 감지(Zhou et al., Biochemistry, 1993, 32, 8193 - 98: Faegerstram and O'Shannessy, 1993, In Handbook of Affinity Chromatography, 229 - 52, Marcel Dekker, Inc., NY)를 이용한다.
BiocoreR 기술은 수용체를 금 표면에 고정시키고, 그 위로 리간드를 흘러가게 한다. 플라스몬 공명 감지는 실시간에서 표면에 고정된 무게의 양의 직접계량화 를 제공한다. 이러한 기법은 온- 및 오프-레이트 상수를 산출하고, 그래서 리간드-수용체 분해 상수 및 친화 상수가 직접 결정될 수 있다.
hG-CSF 접합체의 in vitro 면역원성 시험
본 발명 접합체의 감소된 면역원성은 기준 분자 또는 제조물에 대한 접합체의 상대적인 면역원성을 측정하는 ELISA 방법을 이용하여 결정될 수 있따. 기준 분자 또는 제조물은 통상적으로 Neupogen? 과 같은 재조합 인간 G-CSF, 또는 예를 들면 US 5,824,784 에서 기술된 것과 같은 N-말단 PEG화된 rhG-CSF 분자와 같은 G-CSF 제조물이다. ELISA 방법은 이들 제조합 G-CSF 제조물의 하나로 처리된 환자로부터의 항체에 기초한다. 발명의 접합체가 통계적으로 유의한 적은 반응을 측정에서 기준 분자 또는 제조물보다 가질 때, 면역원성이 감소된 것으로 고려된다.
G-CSF 생측정에 있어서 활성의 중화
항 G-CSF 혈청에 의한 hG-CSF 접합체의 중화는 상기의 G-CSF 생측정에 의해서 분석된다.
G-CSF 표준 분자로 처리된 환자 또는 면역화된 동물로부터의 혈청이 이용된다. 혈청이 고정된 농도(희석 1:20 - 1:500(혈청부(pt)) 또는 20 - 1000 ng/ml(동물 혈청)) 또는 1: 20(혈청부) 또는 1000 ng/ml(동물혈청)에서 시작하는 혈청의 5 - 배 일련의 희석에 투입된다. HG-CSF 접합체는 10 nM 에서 시작하는 7배- 희석 또는 80 ㎕ DMEM 매개 + 10 % FCS 의 총 부피에서 고정된 농도(1 - 100 pM)에 투입된다. 혈청은 hG-CSF 접합체와 함께 37 ℃ 에서 1 시간동안 배양된다.
시료(0.01 ml)는 이후 0.1 ml DMEM 매개에서 NFS-60 을 함유한 96 웰 조직 배양판에 옮겨진다. 배지는 5 % 이산화탄소 대기, 37 ℃에서 48 시간동안 배양된다. 0.01 ml WST-1(WST-1 세포 증식제, Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany) 가 배지에 투입되고 5 % 이산화탄소 대기, 37 ℃에서 150 분간 배양되었다. 생존할 수 있는 세포에서 미토콘드라아 디하이드로겐나아제에 의한 테트라졸리움 염 WST-1 의 분해는 450 nm 에서 흡광도를 측정하는 것에 의해서 계량화되는 포르마잔의 형성에 이르게 된다.
hG-CSF 접합체 시료가 고정된 양의 혈청의 존재하에서 적정될 때, 중화의 효과는 EC50(혈청존재)/EC50(혈청 부존재)로서 계량화된 폴드(fold) 억제(FI)로 정의된다. G-CSF 변이체 단백질의 항체 중화의 감소는 다음과 같이 정의된다.
(FI 변이체 -1)
(1- --------------- ) X 100 %
(FI wt -1 )
실시예 1
hG-CSF 를 엔코딩하는 합성 유전자의 축조와 클로닝
하기의 DNA 단편들이 Stemmer et al.(1995), Gene 164, pp. 49 - 53: 에 기재된 하기의 일반적인 절차에 의해서 합성되었다.
단편 1, Bam HI 소화부위, YAP3 시그널 펩티드(WO 98/32867)을 엔코딩하는 서열, TA57 리더서열(WO 98/32867)을 엔코딩하는 서열, (AAAAGA)부위를 인식하는 KEX2 프로티아제를 엔코드하는 서열, E. coli (SEQ ID NO:2)에서의 발현에 최적화된 코돈 이용을 가지는 hG-CSF 를 엔코딩하는 서열 및 Xba I 소화부위로 구성됨.
단편 2, Bam HI 소화부위, YAP3 시그널 펩티드(WO 98/32867)을 엔코딩하는 서열, TA57 리더서열(WO 98/32867)을 엔코딩하는 서열, 히스티딘 태그 (SEQ ID NO:5)를 엔코딩하는 서열, (AAAAGA)부위를 인식하는 KEX2 프로티아제를 엔코드하는 서열, E. coli (SEQ ID NO:2)에서의 발현에 최적화된 코돈 이용을 가지는 hG-CSF 를 엔코딩하는 서열 및 Xba I 소화부위로 구성됨.
단편 3, Nde I 소화부위, OmpA 시그널 펩티드(SEQ ID NO:3)를 엔코딩하는 서열, E. coli (SEQ ID NO:2)에서의 발현에 최적화된 코돈 이용을 가지는 hG-CSF 를 엔코딩하는 서열 및 Bam HI 소화부위로 구성됨.
단편 4, Bam HI 소화부위, Kozak 일치 서열(Kozak, M.J Mol Biol 1987 Aug 20:196(4):947-50), 시그널 펩티드(SEQ ID NO:7)를 엔코딩하는 서열, CHO 세포(SEQ ID NO:8) 에서의 발현에 최적화된 코돈 이용을 가지는 hG-CSF 를 엔코딩하는 서열 및 Xba I 소화부위로 구성됨.
DNA 단편 1, 2 가 플라스미드 pJSO37(Okkels, Ann. New York Acad. Sci. 782:202 -207, 1996)에서 Bam HI 및 Xba I 소화부위사이에 표준 DNA 기법을 이용하여 삽입되었다. 이것은 플라스미드 pG-CSF cerevisiae 및 pHISG-CSF cerevisiae 가 되었다.
DNA 단편 3 이 플라스미드 pET12a(인비트로겐)에서 Nde I 및 Bam HI 소화부위사이에 표준 DNA 기법을 이용하여 삽입되었다. 이것은 플라스미드 pG-CSF coli 가 되었다.
DNA 단편 4 이 플라스미드 pcDNA3.1(+)(인비트로겐)에서 Nde I 및 Bam HI 소화부위 사이에 표준 DNA 기법을 이용하여 삽입되었다. 이것은 플라스미드 pG-CSF CHO 가 되었다.
실시예 2
S.cerevisiae 및 E.coli 에서 hG-CSF 의 발현
플라스미드 pG-CSF cerevisiae 또는 pHISG-CSF cerevisiae로 Saccharomyces cerevisiae YNG318( ATCC 208973 으로 American Type Curture Collection, VA, USA 로부터 이용가능한)의 형질변환, 두 플라스미드의 어느 하나를 함유한 형질변환체의 분리, 및 이어지는 HIS 태그가 존재 및 부존재하는 hG-CSF 의 각각의 세포외 발현이 문헌에 기술된 표준화된 기법을 이용하여 수행되었다. pG-CSF 로 E.coli BL21(DE3) (Novagen, Cat. No,69387-3) 의 형질변경, 플라스미드를 함유한 형질변환체의 분리, 및 이어지는 부유물과 주변세포질에서의 hG-CSF의 발현이 Novagen의 pET 시스템 메뉴얼(8 판)에 기술된 대로 수행되었다.
S. cerevisiae 및 E. coli 에 의한 hG-CSF 의 발현은 ImmunoPure Ultra-Sensitive ABC Rabbit IgG Staining kit(Pierce) 및 hG-CSF에 대한 폴리클로날 항체(Pepro Tech EC Ltd.)에 의한 Western Bolt 분석에 의해서 확인되었다. 단백질이 적정 크기를 가지는 것이 관측되었다.
S. cerevisiae 및 E. coli 에서 N-말단 히스티딘 태그를 가지는 hG-CSF의 발현 수준은 상업적으로 이용가능한 G-CSF 특이 ELISA 키트(Quantikine Human G- CSF Immunoassay, R&D system Cat. No. DCS50)를 이용하여 계량화되었다. 측정된 수치는 다음과 같다.
발현 시스템 발현 수준(리터당 mg G-CSF)
S.cerevisiae 에서 hG-CSF 30
S.cerevisiae 에서 히스티딘 태그를 가지는 hG-CSF 25
E.coli 에서 hG-CSF 0.05
실시예 3
S.cerevisiae 배양 부유물로부터 hG-CSF 및 그의 변이체의 정제
hG-CSF 의 정제가 다음과 같이 이루어졌다.
세포들이 원심분리에 의해서 제거된다. 세포가 빠진 부유물이 0.22 ㎛ 필터를 통해서 필터 무균화된다. 필터 무균화된 부유물이 10 mM 쏘듐 아세테이트 pH4.5 에서 5 배 희석된다. pH 는 5 리터의 희석된 부유물에 10 ml 농축된 아세트산를 투입하여 조절된다. 이온세기는 음이온 교환 컬럼에 적용되기 전에 8 mS/cm 미만이어야 한다.
희석된 부율물은 컬럼으로부터의 유출물이 안정한 UV 및 전도도 기준에 도달할 때까지, 90 cm/h 의 선속도로 pH 4.5, 50 mM 쏘듐 아세테이트로 평형화된 SP-sepharose FF(Pharmacia)컬럼에 적하된다. 어떤 비고정된 물질을 제거하기 위해서, 컬럼으로부터의 유출물이 UV 흡광도와 전도도에 대해서 안정한 수준에 도달할 때까지, 컬럼은 평형 완충제를 이용하여 세척된다. 고정된 G-CSF 단백질은 선형 변화(gradient): 30 컬럼부피; 45 cm/h 의 유속에서 0 - 80 완충제 B(50 NaAc, pH 4.5, 750 mM NaCl)를 이용하여 컬럼으로부터 용출된다. SDS-폴리아크릴 아미드 겔 전기영동에 기초하여, G-CSF 를 함유한 단편들이 고여진다. 쏘듐 클로라이드가 용 액의 이온 세기가 80 mS/cm 이상이 될 때까지, 첨가된다.
50 mM NaAc, pH 4.5, 750 mM NaCl 로 평형화된Phenyl Toyo Pearl 650S 컬럼상에 단백질용액이 적용된다. 어떤 비고정된 물질들은 평형 완충제를 이용하여 컬럼으로부터 세척된다. G-CSF 의 용출은 MilliQ water 의 단계 그래디언트(gradeient)를 적용하여 수행된다. G-CSF 를 함유한 단편들은 고여진다. 이러한 2 단계 하류 공정 전략을 이용하여, 90 이상의 순수한 G-CSF 가 얻어질 수 있다. 정제된 단백질은 다음 280 nm 에서 분광광도계 측정 또는 아미노산 분석을 통해서 계량화된다.
G-CSF 를 함유한 단편들이 고여진다. 완충제 교환 및 농축화가 VivaSpin 농축기(mwco: 5 kDa ) 를 이용하여 수행된다.
실시예 4
접합 및 비접합된 hG-CSF 와 이의 변이체 들의 확인과 계량화
SDS-폴리아크릴 아미드 겔 전기영동
정제되고, 농축된 G-CSF가 SDS-PAGE 에 의해서 분석되었다. 대략 17 kDa 의 외관 분자량을 가지는 단일 밴드가 주류였다.
흡광도
G-CSF 농도의 산정치가 분광광도계 방법에 의해서 얻어진다. 280 nm 에서의 흡광도를 측정하고, 0.83 의 이론적인 흡광 계수를 이용하여 단백질 농도가 측정될 수 있다.
아미노산 분석
보다 정확한 단백질 농도가 아미노산 분석에 의해서 얻어질 수 있다. 실험적으로 결정된 아미노산 조성이 DNA 서열에 기초한 기대되는 아미노산 조성과 일치한다는 것이 밝혀진 정제된 G-CSF 상에서 수행된다.
실시예 5
PEG 화된 wt G-CSF 및 G-CSF 변이체의 MALDI-TOF 질량 분석법.
MALDI-TOF 질량분석법이 PEG화된 wt G-CSF 및 PEG 화된 G-CSF 변이체에 부착된 PEG 기의 숫자를 수치화하기 위해서 사용되었다.
Wt G-CSF 는 SPA-PEG 에 대한 기대되는 부착 부위인 5 개 1 차아민을 함유한다(N-말단 아미노산 및 K16, K23, K34, 및 K40 상의 ε-아미노산기). SPA5000 으로 wt G-CSF의 PEG화 후, MALDI-TOF 질량 분석법은 주로 4, 5 및 6 PEG 기가 부착된 wt G-CSF 종의 존재를 보여준다. 또한, 부착된 7 PEG 기를 가지는 wt G-CSF 는 소량일지라도 분명히 보여진다.
치환체 K16R, K34R, K40R, Q70K, Q90K 및 Q120K 를 가지는 G-CSF 변이체는 또한 5 개의 1 차아민( N-말단 아미노산 및 K23, K70, K90, 및 K120 상의 ε-아미노산기)를 함유한다. 이러한 SPA-PEG5000를 가지는 G-CSF변이체의 PEG 화후, MALDI-TOF 질량 분석법은 주로 4, 5 및 6 PEG 기가 부착된 G-CSF 종의 존재를 보여준다. 또한, 부착된 7 PEG 기를 가지는 G-CSF 변이체는 소량일지라도 분명히 보여진다.
치환체 K16R, K34R, 및 K40R 를 가지는 G-CSF 변이체는 또한 2 개의 1 차아민( N-말단 아미노산 및 K23 상의 ε-아미노산기)를 함유한다. 이러한 SPA- PEG12000를 가지는 G-CSF 변이체의 PEG 화후, MALDI-TOF 질량 분석법은 주로 2, 3 PEG 기가 부착된 G-CSF 변이체 종의 존재를 보여준다. 또한, 부착된 4 PEG 기를 가지는 G-CSF 변이체는 소량일지라도 분명히 보여진다.
이러한 관찰은 아민기를 함유한 아미노산 뿐만아니라, 다른 아미노산 잔기도 종종 사용되는 PEG 화 조건하에서 PEG 화 된다는 것을 명백하게 보여준다. 아민기가 도입된 PEG 화가 중요하다는 것이 보여진다. 이것은 또한 wt 치환체 K16R, K34R, K40R, Q70K, Q90K 및 Q120K 를 가지는 G-CSF 변이체는 또한 5 개의 1 차아민( N-말단 아미노산 및 K23, K70, K90, 및 K120 상의 ε-아미노산기)를 함유한다. 이러한 SPA-PEG5000를 가지는 G-CSF의 PEG 화후, MALDI-TOF 질량 분석법은 주로 4, 5 및 6 PEG 기가 부착된 G-CSF 종의 존재를 보여준다. 또한, 이것은 wt G-CSF 및 G-CSF 변이체의 SDS-PAGE 분석을 이용하여 보여진다.
실시예 11에서 기술된 바와 같이,SPA-PEG 화학이 사용될 때, 히스티딘 170 은 완전히 PEG 화된다는 것이 보여진다. 또한 K23 및 S159 는 부분적으로 PEG 화된다. 이것은 hG-CSF 및 만들어진 변이체에서 1 차 아민 이외에도 1 -2 여분의 PEG 화 부위가 존재한다는 것을 설명한다.
실시예 6
PEG 화 및 비 PEG 화된 G-CSF 변이체의 펩티드 지도
G-CSF 및 G-CSF 변이체상에 SPA-PEG 의 추가적인 부착부위를 지도화하기 위해서, 다음의 절차가 사용되었다.
적은 수의 아미노산기를 가지는 G-CSF 변이체가 PEG 화가 기대되는 부위의 수를 최소한으로 감소시키기 위해서 선택된다. 선택된 G-CSF 변이체는 K16R, K34R, K40R 및 H170Q 변이체를 가진다. 전의 자료가 상당한 정도로 PEG 화되었다는 것을 보여주기 않은 K23 상의 ε-아미노산기로부터 떨어졌기 때문에, 이 변이체는 단지 하나의 1 차 아미노산을 말단에 함유한다. 그래서, 아미노기상에 바탕 PEG 화는 이러한 G-CSF 변이체에서 충분히 감소된다. G-CSF 변이체는 SPA-PEG 5000 을이용하여 PEG 화되었다. PEG 화후, G-CSF 변이체가 변성되고, 디설파이드 결합이 감소하고, 결과적인 시올기가 알킬화되고, 및 알킬화 및 PEG 화된 단백질이 글루탐산-특이 프로티아제에 의해서 분해된다. 마지막으로, 결과적인 펩티드들은 역상 HPLC 로 분리되었다.
이와 더불어, 기준 HPLC 크로마토그램을 만들기 위해서 G-CSF 변이체의 비-PEG 화된 버젼이 K16R, K34R, K40R로 처리되었다.
PEG 화된 G-CSF 변이체 및 비 PEG 화된 G-CSF 변이체의 변성의 HPLC 크로마토그램의 비교는 펩티드가 PEG화시 사라졌다는 것을 보여준다. 비 PEG 화된 G-CSF 변이체로부터 펩티드의 N-말단 아미노산 서열화에 의한 펩티드의 확인은 PEG 화된 위치를 간접적으로 가르킨다.
주로, 모든 치환체 K16R, K34R, K40R 및 H170Q 를 가지는 G-CSF 변이체의 비 PEG 화된 버젼을 사용하는 것이 바람직할 것이나, 모든 실행적인 목적에 대해서 이것은 문제가 아니다.
보다 상세하게는, 치환체 K16R, K34R, K40R 및 H170Q 를 가지는 대략 1 mg 의 PEG 화된 G-CSF 변이체 및 K16R, K34R, K40R 치환체를 가지는 500 ㎍ 의 비 PEG 화된 G-CSF 변이체가 SpeedVac 농축기에서 건조되었다. 두개의 시료가 각각 400 ㎕ 6 M 구아니디늄, 0.3 M 트리스 HCl 에 용해되고, pH 8.3, 37 ℃에서 밤새 변성되었다. 변성후, 단백질에서 디설파이드 결합이 50 ㎕ 의 0.1 M DTT 가 6 M 구아니디늄, 0.3 M 트리스 HCl 에 투입됨으로서 감소되었다. 주위온도에서 2 시간의 배양후, 존재하는 시올기들은 50 ㎕ 0.6 M 요오드아세트아미드를 6 M 구아니디늄, 0.3 M 트리스 HCl, pH 8.3 의 투입에 의해서 알킬화된다. 감소 및 알킬화된 단백질들이 NAP5 컬럼을 이용하여 50 mM NH4HCO3 로 완충 변화되기 전에 30 분간 주위온도에서 알킬화가 일어났다. 20 ㎕ 및 10 ㎕ 글루탐산-특이 프로티아제가 각각 투입되기 전에, SpeedVac 농축기에서 시료의 부피는 약 200 ㎕로 감소되었다. 결과적인 펩티드들은 Phenomenex Jupiter C18 컬럼(0.2 *5 cm)과 0. 1 수용성 TFA 에서 아세토니트릴의 선형 그래디언트로 용출되는 역상 HPLC 에 의해서 분리되었다. 모여진 단편들은 MALDI-TOF 질량분석으로 분석되고, 차후 선택된 펩티드는 N-말단 아미노산 서열분석을 겪는다.
PEG 화된 G-CSF 변이체 및 비 PEG 화된 G-CSF 변이체의 변성의 HPLC 크로마토그램의 비교는 단지 두개의 단편이 PEG화시 사라졌다는 것을 보여준다. 비 PEG 화된 G-CSF 변이체로부터 두 단편의 G-CSF 의 N-말단으로부터 유도된 것을 보여준다. 한 펩티드는 Gln 11 을 따르는 기대하지 않은 분열에 의해서 생성된 아미노산 잔기 1 - 11 로 이루어진다. 다른 펩티드는 Glu 9 를 따르는 기대한 분열에 의해서 생성된 아미노산 잔기 1 - 19 로 이루어진다.
N-말단 아미노기가 쉽게 PEG화 되기 때문에, G-CSF 의 N-말단이 이러한 접근을 이용하여 확인될 수 있다는 것이 기대되었다.그러나, SPA-PEG 5000 에 대한 추거적인 부착부위가 전혀 이러한 접근을 이용하여 확인되지 않았다.
PEG 5000 부착 부위의 간접적인 확인에 대한 대안은 PEG 화 펩티드에서 부착부위의 직접적 확인이다. 그러나, 분해된 PEG 화된 G-CSF 변이체의 HPLC 분석에서 PEG 화된 펩티드를 함유하는 단편들은 서로로부터 및 비PEG 화된 펩티드를 함유하는 몇몇 단편으로부터 거의 분리되지 않는다. 그래서, 이러한 단편의 N-말단 아미노산 서열분석은 K23 이 부분적으로 PEG 화되었다는 것을 가르키는 것을 제외하고는 어떤 유용한 자료자료에 이르지 않는다.
이러한 문제를 극복하기 위해서, PEG화된 펩티드의 두 풀(pool)이 제 1 HPLC 분리로부터의 단편들로부터 만들어졌다. 이러한 두 풀은 SpeedVac 농축기에서 건조되고, 200 ㎕의 새로 제조된 50 mM NH4HCO3에 녹여지고, 1 ㎍ 의 크로모트립신으로 더 분해된다. 결과적인 페티드들은 Phenomenex Jupiter C18 컬럼(0.2 *5 cm)과 0. 1 수용성 TFA 에서 아세토니트릴의 선형 그래디언트로 용출되는 역상 HPLC 에 의해서 분리되었다. 모여진 단편들은 MALDI-TOF 질량분석으로 분석되고, 차후 선택된 펩티드는 N-말단 아미노산 서열분석을 겪는다.
N-말단 아미노산 서열 결정으로부터, K23 및 S159가 부분적으로 PEG 화되었다는 것이 결정될 수 있다. 이들 두 위치에서 정확한 PEG화의 정도를 결정하는 것은 불가능하나, 그러나 K23 및 S159 가 변형되지 않은 펩티드들이 초기 HPLC 분리 로부터 확인되고, 그리고 서열화 되었기 때문에 PEG 화는 단지 부분적이다.
실시예 7
wt G-CSF 및 G-CSF 변이체의 글리코실화 반응
MALDI-TOF 질량 분석에 의해 정제된 wt G-CSF 및 G-CSF 변이체를 분석할 때, 일관된 관측은 분석된 G-CSF 분자의 무게 보다 더 큰 약 324 Da 무게를 가지는 추가적인 성분의 존재이다. 가장 낮은 불변적인 질량의 성분은 G-CSF 분자의 질량을 가지며, G-CSF 분자는 정확한 N-말단 아미노산 서열을 가지므로, 추가적인 성분은 두개의 육탄당을 가지는 변형된 G-CSF로 결론지어진다. 많은 경우에, 비변형된 G-CSF 분자는 많은 강한 시그널을 발생시키나, 몇몇 경우에 변형된 G-CSF 분자의 신호의 강도는 가장 강하다.
추가적인 PEG화 부위를 확인할 목적으로 생겨난 펩티드의 분석동안, 글리코실화 부위를 확인에 중요한 두 펩티드가 각각의 분해에서 확인되었다.
양자의 HPLC 분리에서, 두 펩티드들은 서로 이웃하여 용출되며, MALDI-TOF 질량분석은 약 324 Da 의 두 폴리펩티드 사이에서 질량 차이를 보여준다. 질량 분석 데이타는 펩티드가 아미노산 잔기 124 - 162 에 이른다는 것을 가르킨다. 모든 4 개의 펩티드의 N-말단 아미노산 서열 분석은 이러한 할당이 바르고, Thr 133 이 변형된 유일한 부위라는 것을 보여준다. 비변형된 펩티드의 질량을 가지는 펩티드에서, Thr 133 은 서열에서 명백하게 보여지며, 반면 어떤 아미노산 잔기도 133 위치에 324 Da 의 추가적인 무게를 가지는 펩티드로 할당될 수 없다. 모든 다른 아미노산 잔기가 서열에서 할당될 수 있으므로,Thr 이 변형의 유일한 부위로 결론지 어졌다. 글리칸이 효소에 의해서 부착된 것과 다르다 할지라도, 글리코실화 부위는 CHO 세포에서 발현된 재조합 G-CSF에서 사용되는 것으로 전에 보고되었다.
비글리코실화된 wt G-CSF는 글리코실화된 wt G-CSF 로부터, Vydac C18 컬럼(0.21 *5 cm)과 0. 1 % TFA 에서 51 % 아세토니트릴로 이소크래티컬 (isocratically)하게 용출되는 역상 HPLC 를 이용하여, 단지 wt G-CSF 의 비글리코실화된 형태를 함유하는, MALDI-TOF 질량분석으로 보여지는 단편으로 분리된다.
실시예 8
다른 수의 공유적으로 부착된 PEG 분자들을 가지는 G-CSF 분자의 분리
4, 5, 또는 6 PEG기 에 공유적으로 부착된 G-CSF 분자의 분리는 다음과 같이 얻어진다. 20 mM 쏘듐사이드레이트, pH 2.5 에서 PEG 화된 단백질이 20 mM 쏘듐사이트레이트로 평형화된 SP-sepharose FF 컬럼에 적용되었다. PEG 화된 G-CSF 는 약 pH 3.8 의 컬럼으로부터 용출되기 시작하고, 3.8 - 4.5 pH 범위에 미치는 단편들에서 용출을 지속하였다.
단편들은 SDS-PAGE 및 질량 분석적 분석을 겪는다. 이러한 분석들은 가장 높은 정도의 PEG 화를 가지는 G-CSF가 "낮은 pH 단편"에 위치하는 것을 가르킨다. 낮은 정도의 PEG 화를 가지는 PEG 화된 G-CSF 는 "높은 pH 단편"에서 용출된다.
PEG 화된 G-CSF상에서 수행된 아미노산 분석은 이론 및 실험적으로 결정된 흡광계수 사이에서 좋은 일치성을 보여주었다.
실시예 9
hG-CSF 변이체의 축조
다른 아미노산 잔기에 대한 hG-CSF에서 존재하는 아미노산의 특정 치환들, 예를 들면, 상기 일반적인 기술에서 논의된 특정 치환들이 본 분야에서 공지된 표분 DNA 기법을 이용하여 도입되었다. PCR 반응에서 DNA 주형으로서, 염색체를 함유하는, HIS 태그 없이 hG-CSF를 엔코딩하는 플라스미드 pG-CSF cerevisiae 를 이용하여 새로운 G-CSF 변이체가 만들어졌다.
변이체는 S.cerevisiae 에서 발현되고, 실시예 3 에서와 같이 정제되었다. 축조된 G-CSF 변이체의 일부는 하기(실시예 9 및 10 을 참조)에서 목록으로 되어있다.
실시예 10
hG-CSF 또는 이의 변이체에 대한 SPA-PEG 의 공유적 부착
인간 G-CSF 및 이의 변이체는 상기("용액에서의 hG-CSF 및 이의 변이체의 PEG 화")와 같이 SPA-PAGE 5000, SPA-PAGE 12000 및 SPA-PAGE 20000(Shearwater)에 공유적으로 연결되었다. 접합체의 in vitro 활성은 실시예 12 에 목록화되었다.
실시예 11
부위-지정된 돌연변이에 의한 G-CSF에서 SPA-PEG 부착부위의 확인과 이에 이은 정제된 변이체들의 PEG 화
SPA-PEG 는 G-CSF 에서 라이신 보다는 다른 아미노산 잔기에 부착될 수 있다. SPA-PEG 가 히스티딘, 세린, 시레오닌, 및 아르기닌에 부착되었는지를 결정하기 위해서, 이들 아미노산이 라이신, 알라닌 또는 글루타민으로 치환된 변이체들이 만들어졌다. 변이체들은 S.cerevisiae 에서 발현되고, 정제되고, 그리고 PEG 화된 후 이어서,SDS-PAGE 상에 부착된 SPA-PEG 분자의 수 분석이 이어졌다. 주어진 아미노산을 글루탐산 또는 알라닌으로 치환한 후 부착된 SPA-PEG 분자의 수에 있어서 감소는 이러한 아미노산이 SPA-PEG 에 의해서 PEG 화되었다는 것을 강력하게 가르키며, 이러한 관측은 아미노산의 라이신으로의 치환후 변하지 않는 PEG 화도에 의해서 지지된다. 분석된 변이체는 아래에 목록화되어있다.
Figure 112002022035895-pct00012

N-말단, K16, K34, 및 K40 이외에도 SPA-PEG 가 또한 공유적으로 H170 에 결합되었다는 것을 보여준다. 더구나, 이용가능한 K23 아미노산잔기의 10 % 가 PEG 화되고, S159 의 10 % 가 PEG 화된다는 것을 보여준다.
실시예 12
비접합 및 접합된 hG-CSF 및 이의 변이체의 in vitro 생물학적 활성
비접합 및 접합된 hG-CSF 및 이의 변이체의 in vitro 생물학적 활성은 상기 "1 차 측정 2- in vitro hG-CSF 활성 측정" 과 같이 측정된다. 이용가능한 PEG 화 부위에 대한 SPA-PEG 5000 의 접합체가 있는 및 없는 각 변이체에 대한 측정된 EC50 수치가 하기에 목록화되어 있다. 수치들은 비접합된 hG-CSF(Neupogen?)의 EC 수치에 관해서 표준화되었다. 이 수치는 동시에 동일한 측정 조건하에서 각 시간의 변이체에 대해서 측정되었다. 하기 측정에서 hG-CSF 의 EC50 의 값은 30 pM 이다.
Figure 112002022035895-pct00013
Figure 112002022035895-pct00014
자료는 K23 의 아르기닌에 대한 치환이 접합된 단백질의 활성을 증가시키지 못한다는 것을 보여준다. 이것은 단지 K23 의 10 % 만이 PEG 화되었고, 이에 의해서 접합된 K23R 변이체가 그것에 부착된 PEG 기와 필연적으로 동일한 수를 가지며, hG-CSF와 PEG 화 부위의 동일한 위치를 가지게 되는 사실에 기인한다. 위치 K16, K34, K40 에서의 잔존하는 라이신의 제거는 PEG 화 이후 충분한 활성을 가지는 G-CSF 변이체 결과에 이르게 된다. SPA-PEG 5000 의 접합은 비 접합된 변이체와 비교시 충분히 활성을 저하시키지 않는다. 그래서 N-말단 및 H170 의 SPA-PEG 5000 으 로의 변이는 hG-CSF 의 활성을 저하시키지 않는다. hG-CSF K16R, K34R, K40R 을 새로운 PEG 화 부위에 대한 주쇄로 이용하는 것이 결정되었다. 잔기 E45 와 H159 사이의 21 새로운 PEG 화 부위가 이러한 주쇄에 도입되었다. 이러한 잔기들은 G-CSF 수용체와 상호작용을 하지 않는 hG-CSF 부분에 분산된다. Q70, Q90, T105, Q120, T133 및 S142 위치에서 새로운 PEG 화 부위의 도입은 SPA-PEG 5000로의 PEG 화후 충분한 량의 활성을 보존하는 hG-CSF 결과에 이르게 된다. 그래서, 이러한 새로운 PEG 화 부위는 2 또는 3 새로운 PEG 화 부위를 가지는 hG-CSF 변이체에서 결합된다. SPA-PEG 5000 로 PEG 화 후 이러한 변이체의 대부분의 활성은 hG-CSF K16R K34R K40R Q70R Q120R 및 hG-CSF K16R K34R K40R Q70R Q90K Q120K 이다.
또한, SPA-PEG 5000, SPA-PEG 12000, 및 SPA-PEG 20000 들이 hG-CSF K16R K34R K40R 에 부착되었다. in vitro 수치는 각각 비접합된 hG-CSF(Neupogen?)의 35 %, 10 %, 및 1 % 이었다.
실시예 13
비접합 및 접합된 hG-CSF 및 이의 변이체들의 in vivo 반감기
비접합(Neupogen?) 및 접합된 hG-CSF 및 SPA-PEG 5000 접합된 hG-CSF K164 K34R K40R Q70K Q90K Q120K 의 in vivo 반감기가 상기와 같이 측정되었다("비접합 및 접합된 rhG-CSF 및 이의 변이체들의 in vivo 반감기"). 결과는 도 1 에 도시되어 있다. Neupogen? 및 SPA-PEG 5000 접합된 hG-CSF K16R K34R K40R Q70K Q90K Q120K 의 in vivo 반감기는 각각 2.01 시간 및 12.15 시간으로 결정되었다. 그래 서 새로운 hG-CSF에 새로운 PEG 부위를 도입하는 것과 SPA-PEG 5000 을 그들에 도입하는 것은 in vivo 반감기에서 의미있는 증가라는 결과에 이르게 된다. 앞선 시험에서 Neupogen?의 in vivo 반감기는 더 큰 N-말단 접합된 PEG 분자(10 kDa)를 가지는 hG-CSF 와 비교되었다. 여기서, in vivo 반감기는 각각1.75 시간 및 7.01 시간으로 결정되었다. 그래서 SPA-PEG 5000 접합된 hG-CSF K16R K34R K40R Q70K Q90K Q120K 는 Neupogen? 및 10 kDa N-말단 접합된 PEG 분자를 가지는 hG-CSF 보다 충분히 더 긴 반감기를 가진다.
실시예 14
비접합 및 접합된 hG-CSF 및 이의 변이체들의 in vivo 생물학적 활성
비접합(Neupogen?)된 hG-CSF, SPA-PEG 5000 접합된 hG-CSF K16R K34R K40R Q70K Q120K 및 SPA-PEG 5000 접합된 hG-CSF K16R K34R K40R Q70K Q90K Q120K 의 in vivo 생물학적 활성이 상기와 같이 측정되었다("비접합 및 접합된 rhG-CSF 및 이의 변이체들의 in vivo 생물학적 활성"). 결과는 도 2 에 도시되어 있다. Neupogen? 의 어떤 활성도 t = 0 에서 kg 체중당 100 ㎍ 의 주사후 48 시간에서 검출되지 않았다. SPA-PEG 5000 접합된 hG-CSF K16R K34R K40R Q70K Q120K 의 활성은 초기 주사후 72 시간까지 검출될 수 있었으며, SPA-PEG 5000 접합된 hG-CSF K16R K34R K40R Q70K Q90K Q120K 는 초기 주사 후 96 시간까지 in vivo 활성이 남아 있었다. 그래서, 접합된 변이체 양자가 Neupogen? 보다 더 긴 in vivo 생물 학적 활성을 가지며, SPA-PEG 5000 접합된 hG-CSF K16R K34R K40R Q70K Q90K Q120K는 Neupogen? 보다 두배나 오랫동안 in vivo 활성을 가지는 것이 보여졌다.
또한, Neupogen?, SPA-PEG 12000 접합된 hG-CSF K16R K34R K40R 및 SPA-PEG 5000 접합된 hG-CSF K16R K34R K40R Q70K Q90K Q120K 의 다른 복용량의 in vivo 생물학적 활성이 측정되었다. 그 결과는 표 3 에 보여진다. 앞서 살펴본바와 같이 Neupogen? 의 어떤 활성도 t = 0 에서 kg 체중당 100 ㎍ 의 주사후 48 시간에서 검출되지 않았다. SPA-PEG 5000 접합된 hG-CSF K16R K34R K40R Q70K Q120K 의 체중 kg 당 5 ㎍ 의 투약은 Neupogen? 보다 약간 더 긴 in vivo 생물학적 활성을 가지는 결과에 이르며, 반면 체중 kg 당 이 화합물의 25 ㎍ 및 100 ㎍의 투약은 초기 주사 후 각각 72 시간 및 96 시간까지의 hG-CSF 활성의 결과에 이른다. SPA-PEG 12000 접합된 hG-CSF K16R K34R K40R 는 kg 체중당 100 ㎍ 의 투약후 72 시간까지 in vivo 활성이 남아 있었다. 실시예 5 에서 기술된 바와 같이, SPA-PEG 12000 접합된 hG-CSF K16R K34R K40R 는 부착된 2 또는 3 SPA-PEG 12000 기를 가지며, 반면 SPA-PEG 5000 접합된 hG-CSF K16R K34R K40R Q70K Q90K Q120K는 부착된 5 또는 6 SPA-PEG 5000 기를 가진다. 그래서, 두 화합물의 분자량은 42- 54 kDa 및 43 -48 kDa 이다. 실질적으로 동일한 분자량을 가지는 SPA-PEG 12000 접합된 hG-CSF K16R K34R K40R 와 비교시 SPA-PEG 5000 접합된 hG-CSF K16R K34R K40R Q70K Q90K Q120K 의 더 긴 in vivo 생물학적 활성은 부착된 PEO 기의 분산이 in vivo 생물학적 활성의 지속에 있어서 중요하다는 것을 보여준다.
SEQUENCE LISTING <110> Maxygen ApS <120> G-CSF conjugates <130> 208wo100 <140> PCT/DK 01/00011 <141> 2001-01-09 <150> DK PA 2000 00024 <151> 2000-01-10 <150> DK PA 2000 00341 <151> 2000-03-02 <150> DK PA 2000 00943 <151> 2000-06-16 <160> 8 <170> PatentIn version 3.0 <210> 1 <211> 174 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Thr Pro Leu Gly Pro Ala Ser Ser Leu Pro Gln Ser Phe Leu Leu Lys 1 5 10 15 Cys Leu Glu Gln Val Arg Lys Ile Gln Gly Asp Gly Ala Ala Leu Gln 20 25 30 Glu Lys Leu Cys Ala Thr Tyr Lys Leu Cys His Pro Glu Glu Leu Val 35 40 45 Leu Leu Gly His Ser Leu Gly Ile Pro Trp Ala Pro Leu Ser Ser Cys 50 55 60 Pro Ser Gln Ala Leu Gln Leu Ala Gly Cys Leu Ser Gln Leu His Ser 65 70 75 80 Gly Leu Phe Leu Tyr Gln Gly Leu Leu Gln Ala Leu Glu Gly Ile Ser 85 90 95 Pro Glu Leu Gly Pro Thr Leu Asp Thr Leu Gln Leu Asp Val Ala Asp 100 105 110 Phe Ala Thr Thr Ile Trp Gln Gln Met Glu Glu Leu Gly Met Ala Pro 115 120 125 Ala Leu Gln Pro Thr Gln Gly Ala Met Pro Ala Phe Ala Ser Ala Phe 130 135 140 Gln Arg Arg Ala Gly Gly Val Leu Val Ala Ser His Leu Gln Ser Phe 145 150 155 160 Leu Glu Val Ser Tyr Arg Val Leu Arg His Leu Ala Gln Pro 165 170 <210> 2 <211> 525 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <221> misc_feature <222> ()..() <223> DNA sequence encoding hG-CSF, with codon usage for E. coli <400> 2 acccctctgg gcccggccag cagtctgcct cagagttttt tactgaaatg cttagaacag 60 gtgcgtaaaa tccagggcga tggcgcggcc ctgcaggaaa aactgtgcgc gacctataaa 120 ctgtgccatc ctgaagaact ggtcctgtta ggccatagct taggcatccc gtgggcgcct 180 ctgagtagct gcccgagtca ggccctgcag ctggccggct gcctgagtca gttacatagt 240 ggcttatttt tatatcaggg cttactgcag gcgttagaag gcattagtcc ggaactgggc 300 ccgaccctgg ataccttaca gttagatgtc gcggattttg ccaccaccat ttggcagcag 360 atggaagaat taggcatggc gcctgcgtta cagcctaccc agggcgccat gcctgcgttt 420 gcgagtgcgt ttcagcgtcg cgccggcggc gtgttagtgg ccagccatct gcagagcttt 480 ctggaagtga gttatcgtgt gttacgccat ctggcccagc cttaa 525 <210> 3 <211> 21 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 3 Met Lys Lys Thr Ala Ile Ala Ile Ala Val Ala Leu Ala Gly Phe Ala 1 5 10 15 Thr Val Ala Gln Ala 20 <210> 4 <211> 63 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <221> misc_feature <222> ()..() <223> DNA sequence encoding the OmpA signal sequence <400> 4 atgaaaaaga cagctatcgc gattgcagtg gcactggctg gtttcgctac cgtagcgcag 60 gcc 63 <210> 5 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(15) <223> Synthetic histidine tag <400> 5 Met Lys His Gln His Gln His Gln His Gln His Gln His Gln Gln 1 5 10 15 <210> 6 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <221> misc_feature <222> ()..() <223> DNA sequence encoding the histidine tag of SEQ ID NO:5 <400> 6 atgaaacacc aacaccaaca tcaacatcaa catcaacatc aacag 45 <210> 7 <211> 30 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 7 Met Ala Gly Pro Ala Thr Gln Ser Pro Met Lys Leu Met Ala Leu Gln 1 5 10 15 Leu Leu Leu Trp His Ser Ala Leu Trp Thr Val Gln Glu Ala 20 25 30 <210> 8 <211> 615 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <221> misc_feature <222> ()..() <223> Sequence encoding hG-CSF with signal peptide of SEQ ID NO:7 <400> 8 atggccggcc ctgccacaca gtcccccatg aagctgatgg ccctgcagct gctgctgtgg 60 cactccgccc tgtggacagt gcaggaggcc acccctctgg gccccgccag ctccctgcct 120 cagtccttcc tgctgaagtg cctggagcag gtgagaaaga tccagggcga cggcgccgcc 180 ctgcaggaga agctgtgcgc cacatacaag ctgtgccacc ctgaggagct ggtgctgctg 240 ggccacagcc tgggcatccc ctgggcccct ctgtccagct gcccctccca ggccctgcag 300 ctggccggct gcctgtccca gctgcactcc ggcctgttcc tgtaccaggg cctgctgcag 360 gccctggagg gcatctcccc cgagctgggc cccacactgg ataccctgca gctggacgtg 420 gccgatttcg ccaccacaat ctggcagcag atggaggagc tgggcatggc ccctgccctg 480 cagcctaccc agggcgccat gcctgccttt gcctccgcct ttcagagacg ggccggcggc 540 gtgctggtgg ccagccacct gcagagcttt ctggaggtgt cctacagagt gctgcggcac 600 ctggcccagc cttga 615

Claims (35)

  1. ⅰ) G-CSF 활성을 나타내는 폴리펩티드로서, 상기 폴레펩티드의 아미노산 서열이 1-15 아미노산 잔기에 있어서 SEG ID NO:1에 나타난 아미노산 서열과 상이하고, T1K, P2K, L3K, G4K, P5K, A6K, S7K, S8K, L9K, PI0K, Q11K, S12K, F13K, L14K, L15K, E19K, Q20K, V21K, Q25K, G26K, D27K, A29K, A30K, E33K, A37K, T38K, Y39K, L41K, H43K, P44K, E45K, E46K, V48K, L49K, L50K, H52K, S53K, L54K,I56K, P57K, P60K, L61K, S62K, S63K, P65K, S66K, Q67K, A68K, L69K, Q70K, L71K, A72K, G73K, S76K, Q77K, L78K, S80K, F83K, Q86K, G87K, Q90K, E93K, G94K, S96K, P97K, E98K, L99K, G100K, P101K, T102K, D104K, T105K, Q107K, L108K, D109K,A111K, D112K, F113K, T115K, T116K, W118K, Q119K, Q120K, M121K, E122K, E123K, L124K, M126K, A127K, P128K, A129K, L130K, Q131K, P132K, T133K, Q134K, G135K, A136K, M137K, P138K, A139K, A141K, S142K, A143K, F144K, Q145K, S155K, H156K, Q158K,S159K, L161K, E162K, V163K, S164K, Y165K, V167K, L168K, H170K, L171K, A172K, Q173K 및 P174K로 이루어진 그룹에서 선택되는 하나 이상의 치환을 포함하는 폴리펩티드; 및
    ⅱ) 상기 폴리펩티드의 라이신 잔기에 부착된 하나 이상의 비폴리펩티드 모이어티;
    를 포함하는 폴리펩티드 접합체.
  2. 제1항에 있어서, SEQ ID NO:1의 아미노산 잔기 K16, K23, K34 및 K40 중 하나 이상이 결손되거나 다른 아미노산 잔기로 치환된 것을 특징으로 하는 폴리펩티드 접합체.
  3. 제2항에 있어서, K16, K23, K34 및 K40 중 하나 이상이 R 또는 Q 잔기로 치환된 것을 특징으로 하는 폴리펩티드 접합체.
  4. 제3항에 있어서, 치환 K16R+K34R+K40R을 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드 접합체.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩티드가 P5K, A6K, S7K, S8K, L9K, P44K, E45K, E46K, V48K, L49K, L50K, H52K, S53K, L54K, I56K, P57K, P60K, L61K, S62K, S63K, P65K, S66K, Q67K, A68K, L69K, Q70K, L71K, A72K, G73K, S76K, Q77K, L78K, S80K, F83K, Q86K, G87K, Q90K, E93K, G94K, S96K, P97K, E98K, L99K, P101K, D104K, T105K, Q107K, L108K, D109K, A111K, D112K, F113K, T115K, T116K, W118K, Q119K, Q120K, M121K, E122K, E123K, L124K, M126K, A127K, P128K, A129K, L130K, Q131K, P132K, T133K, Q134K, G135K, A136K, M137K, P138K, A139K, A141K, S142K, A143K, F144K, Q145K, S155K, H156K, Q158K, S159K, L161K, E162K, V163K, S164K, Y165K, V167K, L168K, H170K, L171K, A172K, Q173K 및 P174K로 이루어진 그룹에서 선택되는 하나 이상의 치환을 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드 접합체.
  6. 제5항에 있어서, 상기 폴리펩티드가 Q70K, Q90K, T105K, Q120K, T133K 및 S159K로 이루어진 그룹에서 선택되는 하나 이상의 치환을 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드 접합체.
  7. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 비폴리펩티드 모이어티가 천연 및 합성 동질중합체 및 이질중합체로 이루어진 그룹에서 선택되는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드 접합체.
  8. 제7항에 있어서, 상기 중합체가 선형 또는 분지형 폴리에틸렌 글리콜, 폴리비닐알코올(PVA), 폴리-카르복실산 및 폴리-(비닐피롤리돈)으로 이루어진 그룹에서 선택되는 합성 동질중합체 또는 이질중합체인 것을 특징으로 하는 폴리펩티드 접합체.
  9. 제8항에 있어서, 상기 중합체가 선형 또는 분지형 폴리에틸렌 글리콜인 것을 특징으로 하는 폴리펩티드 접합체.
  10. 제9항에 있어서, 상기 폴리에틸렌 글리콜이 1,000-15,000Da의 분자량을 가지는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드 접합체.
  11. 제9항에 있어서, 2-8 폴리에틸렌 글리콜 모이어티를 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드 접합체.
  12. 제11항에 있어서, 3-6 폴리에틸렌 글리콜 모이어티를 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드 접합체.
  13. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩티드가 2-10 아미노산 잔기에 있어서 SEQ ID NO:1에 나타난 아미노산 서열과 상이한 것을 특징으로 하는 폴리펩티드 접합체.
  14. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩티드가 글리코실화된 것을 특징으로 하는 폴리펩티드 접합체.
  15. 제14항에 있어서, 상기 폴리펩티드가 하나 이상의 비천연적으로 발생하는 글리코실화 자리를 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드 접합체.
  16. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 단일 N-말단 부착된 20 kDa PEG 모이어티를 포함하는 rhG-CSF와 비교할 때, 증가한 기능성 in vivo 반감기 또는 증가한 혈청 반감기를 가지는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드 접합체.
  17. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 하기 기준 (A)-(D) 중 하나 이상을 만족시키는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드 접합체:
    (A) 래트에게 ㎏체중당 100㎍(접합체의 폴리펩티드 부분의 중량 기준)을 피하 투여 후:
    ⅰ) 투여 후 12시간 동안 ㎏체중당 비접합된 hG-CSF의 100㎍의 투여와 적어도 동일한 속도로 적어도 동일한 수준(혈액 리터당 세포 수로서 측정)까지 백혈구 세포의 형성을 증가시키고, 및
    ⅱ) 적어도 96시간 동안 투여 전 백혈구 세포의 수준 이상으로 백혈구 세포의 수준(혈액 리터당 세포 수로서 측정)을 증가시키며;
    (B) 래트에게 ㎏체중당 25㎍(접합체의 폴리펩티드 부분의 중량 기준)을 피하 투여 후:
    ⅰ) 투여 후 12시간 동안 ㎏체중당 비접합된 hG-CSF의 100㎍의 투여와 적어도 동일한 속도로 적어도 동일한 수준(혈액 리터당 세포 수로서 측정)까지 백혈구 세포의 형성을 증가시키고, 및
    ⅱ) 적어도 72시간 동안 투여 전 백혈구 세포의 수준 이상으로 백혈구 세포의 수준(혈액 리터당 세포 수로서 측정)을 증가시키며;
    (C) 래트에게 ㎏체중당 100㎍(접합체의 폴리펩티드 부분의 중량 기준)의 피하 투여 후:
    ⅰ) 투여 후 12시간 동안 ㎏체중당 비접합된 hG-CSF의 100㎍의 투여와 적어도 동일한 속도로 적어도 동일한 수준(혈액 리터당 세포 수로서 측정)까지 호중구의 형성을 증가시키고, 및
    ⅱ) 적어도 96시간 동안 투여 전 호중구의 수준 이상으로 백혈구 세포의 수준(혈액 리터당 세포 수로서 측정)을 증가시키며; 및
    (D) 래트에게 ㎏체중당 25㎍(접합체의 폴리펩티드 부분의 중량 기준)의 피하 투여 후:
    ⅰ) 투여 후 12시간 동안 ㎏체중당 비접합된 hG-CSF의 100㎍의 투여와 적어도 동일한 속도로 적어도 동일한 수준(혈액 리터당 세포 수로서 측정)까지 호중구의 형성을 증가시키고, 및
    ⅱ) 적어도 72시간 동안 투여 전 호중구의 수준 이상으로 백혈구 세포의 수준(혈액 리터당 세포 수로서 측정)을 증가시킨다.
  18. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩티드 접합체를 생산하는 방법에 있어서,
    폴리펩티드의 발현에 도움이 되는 조건 하에서 폴리펩티드를 엔코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 숙주세포를 배양하는 단계 및 폴리펩티드를 회수하는 단계를 포함하고, 여기서 상기 폴리펩티드는 비폴리펩티드 모이어티에 in vitro 접합을 겪는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드 접합체 생산 방법.
  19. 제18항에 있어서, 상기 비폴리펩티드 모이어티가 선형 또는 분지형 폴리에틸렌 글리콜인 것을 특징으로 하는 폴리펩티드 접합체 생산 방법.
  20. 제19항에 있어서, 상기 폴리에틸렌 글리콜이 1,000-15,000Da의 분자량을 가지는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드 접합체 생산 방법.
  21. 제19항에 있어서, 상기 폴리펩티드가 2-8 폴리에틸렌 글리콜 모이어티에 접합되는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드 접합체 생산 방법.
  22. 제21항에 있어서, 상기 폴리펩티드가 3-6 폴리에틸렌 글리콜 모이어티에 접합되는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드 접합체 생산 방법.
  23. 제1항 내지 제4항 중 어느 항에 따른 접합체 및 약학적 허용 운반체 또는 부형제를 포함하는, 방사요법 또는 화학요법으로부터 야기되는 장애를 포함한 조혈장애, 백혈구 감소증, AIDS 또는 다른 면역결핍질병, 및 박테리아성 또는 다른 감염증 치료용 약학 조성물.
  24. 제23항에 있어서, 상기 조성물이 백혈구 감소증 치료용인 약학 조성물.
  25. 제24항에 있어서, 상기 조성물이 화학요법에 의해 유발되는 백혈구 감소증 치료용인 약학 조성물.
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