KR100771209B1

KR100771209B1 - 새로운 항산화 활성 락토바실러스 플랜타럼 ｎｃ

Info

Publication number: KR100771209B1
Application number: KR1020050124304A
Authority: KR
Inventors: 오세종; 임지영; 이승화; 김영민
Original assignee: 나드리화장품주식회사
Priority date: 2005-12-16
Filing date: 2005-12-16
Publication date: 2007-10-29
Also published as: KR20070063926A

Abstract

본 발명은 항산화 활성이 우수한 락토바실러스 스피시스 NC(유전자 은행 기탁번호 제 KCTC 10869 BP)에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는 내산성과 항산화 활성이 우수한 신규 유산균에 관한 것이다. 본 발명에 따른 락토바실러스 스피시스 NC는 생리적 기능이 뛰어나 화장품, 식품, 의약품, 생활용품에 광범위하게 사용될 수 있는 효과가 있다.

항산화, 내산성, 락토바실러스 스피시스 NC, 기탁번호 제 KCTC 10869 BP

Description

새로운 항산화 활성 락토바실러스 플랜타럼 ＮＣ {Antioxidant activity Lactobacillus plantarum ＮＣ}

도 1은 본 발명에 따른 락토바실러스 스피시스 NC를 포함한 유산균들의 전자공여능 평가결과를 나타낸 그래프.

도 2는 본 발명에 따른 락토바실러스 스피시스 NC를 포함한 유산균의 철환원능력 평가결과를 나타낸 그래프.

본 발명은 항산화 활성이 우수한 락토바실러스 스피시스 NC(유전자 은행 기탁번호 제 KCTC 10869 BP)에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는 내산성과 항산화 활성이 우수한 신규 유산균에 관한 것이다. 본 발명에 따른 락토바실러스 스피시스 NC는 생리적 기능이 뛰어나 화장품, 식품, 의약품, 생활용품에 광범위하게 사용될 수 있다.

일반적으로 유산균은 자연계에 널리 존재하며 유당과 같은 탄수화물을 이용하여 젖산을 생산하는 미생물이며, 오래전부터 유산균은 직접 혹은 간접적으로 식 품에 이용되어 왔다.

파스퇴르(Pasteur)가 1858년 처음으로 유산균을 분리하였지만 프로바이오틱스로서의 유산균이 아닌 포도주를 병들게 하는 나쁜 미생물로의 개념이었기 때문에 불가리아발효유(Bulgarian milk)에서 간균을 분리하고 Bulgarian bacillus가 명명한 것이 최초의 시도일 것이다. 유산균의 작용으로는 장내 균총의 정상화, 유당 불내증(lactose intolerance)의 완화, 혈중 콜레스테롤 수준의 저하, 항암 효과, 면역 체계 강화 및 식품의 영양적 가치 향상 등이 되고 있다.

김치를 포함한 유산균 이용 식품은 대사산물인 젖산에 의하여 식품의 저장성을 향상시키며, 식품의 향미와 조직을 개선하는 장점이 있다. 발효된 김치를 통하여 섭취된 젖산균은 장내로 유입된 후 장내 상피세포에 착생하게 되어 병원성 미생물의 저해 및 길항작용, 면역 활성의 증진, 암 발생률의 감소, 그리고 발암원인성 효소의 감소 등 숙주 동물에 많은 도움을 준다. 따라서 젖산균은 동서양을 막론하고 유제품, 육제품, 침채류 등에 사용되고 있다.

본 발명자들은 김치 유산균에 관해 연구해 오던 중 종래의 김치 유산균에 비하여 생리적 효능이 우수하고 항산화 활성이 높은 균주를 분리해내는데 성공하였다.

본 발명의 목적은 종래의 김치 유산균에 비하여 생리적 효능이 우수하고 항산화 활성이 높은 균주를 제공하고자 하는 것이다.

본 발명에 따른 유산균은 김치에서 채취하여 생리 식염수로 연속적으로 희석한 후 브로모크레졸 퍼플이 함유된 앰알에스 고체배지에 도말하여 37℃ 배양기에서 24시간 혐기적으로 배양한 후 노란색을 나타내는 집락을 얻었다. 락토바실러스 스피시스 NC는 내산성이 우수하였으며 항균활성이 매우 높은 것으로 밝혀졌다.

본 발명에 따른 락토바실러스 스피시스 NC 균주의 특성은 다음과 같으며 당 발효 특성은 표 1에 나타내었다.

1. 균의 형태 : 막대형

2. 집락 색갈 : 유백색

3. 생육 최적 온도 : 37℃

4. 운동성 : 없음

5. 그람 염색 : 양성

6. 카탈라제 : 음성

7. 산소 영향 : 편성 혐기성

[표 1] 당 발효성 테스트

-----------------------------

Glycerol +

Erythritol -

D-Arabinose -

L-Arabinose -

Ribose +

D-Xylose -

L-xylose -

Adonitol -

b-methyl-xyloside -

Galactose +

D-glucose +

D-fructose +

D-manose +

L-sorbose -

Rhamnose -

Dulcitol -

Inositol -

Mannitol +

Sorbitol +

a-Methyl-D-mannoside -

a-Methyl-D-glucoside -

N-Acethyl glucosamine +

Amygdaline +

Arbutine +

Esculine +

Salicine +

Cellobiose +

Maltose +

Lactose +

Melibiose +

Saccharose +

Trehalose +

Inuline -

Melezitose +

D-Raffinose +

Amidon -

Glycogene -

Xylitol -

b-Gentibiose +

D-Turanose +

D-Lyxose -

D-Tagatose +

D-fucose -

L-Fucose -

D-Arabitol -

L-Arabitol -

Gluconate +

2-ceto-gluconate -

5-ceto-gluconate -

---------------------------------

이상의 결과를 근거로 동정한 결과, 선발된 유산균 락토바실러스 스피시스 NC는 락토바실러스 플랜타럼(Lactobacillus plantarum)로 동정되었다.

(1) 내산성 평가

본 발명의 락토바실러스 스피시스 NC를 10ml 엠알에스 액체배지에 접종하여 37℃에서 18시간 배양한 후, 이 배양액의 일정량을 다시 pH 2.0의 완충 용액에 접종하여 60분 동안 배양하였다. 배양액의 일정량을 취하여 희석용 완충용액에 일정비율로 희석하였다. 엠알에스 한천배지에 상기의 희석액을 일정량 접종한 후 37℃에서 48 시간동안 배양하여 성장한 집락수를 계수하였다. 그 결과 50% 이상의 생존율을 보였다.

(2) 항산화 활성 평가

항산화 활성을 평가하는 방법에 많이 사용되는 전자공여능(DPPH) 평가법이나 철환원능(FRAP) 평가법은 모두 과일이나 채소 또는 이들의 추출물에서 간편하고 정확하게 항산화 능력을 측정할 수 있는 방법으로 알려져 있다(Takao T, Kitatani F, Watanabe N, Yagi A. Sakata KA. 1994. Simple screening method for antioxidants and isolation of several antioxidants produced by marine bacteria from fish and shellfish. Biosci. Biotech. Biochem. 58: 1780-1783; Benzie IFF, Strain JJ. 1996. The ferric reducing ability of plasma (FRAP) as measurement of "antioxidant power": The Frap assay. Anal. Biochem. 239: 70-76)).

김치에서 분리한 유산균들에 대한 전자공여능을 평가한 결과 NC 균주가 다른 유산균보다 유의적으로 우수한 전자공여능력을 나타내었다. 철환원에 의한 항산화력을 측정하는 방법에서 NC, L-55, L-67은 공통적으로 상대적으로 높은 항산화능력을 나타낸 반면 1213, LB-2는 상대적으로 낮은 항산화능력을 보였다. DPPH를 이용한 전자공여능 측정에서는 유의적 차이가 발견되지는 않았지만 FRAP assay의 경우 GP1B와 L-65의 항산화능력은 차이를 나타냈다.

이상과 같은 결과를 통해 락토바실러스 스피시스 NC는 내산성과 전자공여능력, 철환원능력을 가진 새로운 유산간균임을 알 수 있다.

본 발명을 실시예를 통해 상세히 설명하면 다음과 같다.

실시예 1(내산성 균주의 분리)

김치, 발효유제품, 신생아 분변, 및 성인분변 등 다양한 원천에서 시료를 채취하여 잘 혼합한 후 1g을 10ml의 pH 3.0 완충용액에 넣어 잘 혼합하고, HCl 원액으로 pH를 2.3으로 보정하였다. 37℃에서 2시간 동안 정치시킨 후 시료를 채취하여 희석용 완충용액으로 희석하여 pH를 5.4로 조정하여 제조한 엠알에스 한천평판배지에 도말하고 37℃에서 48 시간동안 배양하였다. 배양 후 나타난 집락이 그람양성, 카탈레이즈 음성, 포자를 형성하지 않는 막대기 모양의 간균임을 확인하여 내산성을 지닌 락토바실러스로 분리하였다. 분리된 락토바실러스를 버기스메뉴얼과 탄수 화물 분해실험 등에 의한 동정을 통해 락토바실러스 스피시스 NC로 명명하였다.

실시예 2(내산성 평가)

본 발명의 락토바실러스 스피시스 NC를 10ml 엠알에스 액체배지에 일정량 접종하여 37℃에서 하룻밤 동안 배양한 후, 배양액의 일정량을 pH 3.5, 3.0 및 2.5 완충용액에 각각 10⁶ cfu/ml 정도의 초기 접종농도로 접종하였다. 37℃에서 1시간 동안 정치시킨 후 1ml를 취해 각각 희석용 생리식염수에서 희석하였다. 일정량의 희석액을 엠알에스 한천평판배지에 도말하여 37℃에서 48 시간동안 배양하여 나타난 집락수를 계수, 비교하였다. 그 결과는 다음의 표 2와 같다.

[표 2] 락토바실러스 스피시스 NC의 내산성 평가 실험

pH	생 균 수(cfu/ml)
	초 기	pH 처리후
3.5 3.0 2.5	1.21 x 10⁶ 5.3 x 10⁶ 4.4 x 10⁶	3.6 x 10⁶ 2.1 x 10⁶ 2.8 x 10⁶

실시예 3(전자 공여능 평가)

DPPH에 대한 전자공여작용(electron donating ability, EDA)은 Takao 등의 방법(1)을 일부 변형하여 DPPH(2, 2-diphenyl-1-picrylhydrazyl) free radical 소거법에 의해 측정하였다. 조제된 DPPH 용액(0.04 mM) 0.8 mL에 에탄올 적당량(3-4mL)을 가하고 10초 동안 강하게 진탕하여 흡광도 값이 0.95∼0.99가 에탄올의 양을 조정한다. 조절한 적정량의 에탄올과 DPPH용액 0.8 mL와 시료 용액 0.2 mL을 혼합하여 실온에서 10분간 반응 후 525 nm에서 흡광도를 측정하였다. 대조구 실험은 시료 대신에 에탄올 0.2 mL를 취하여 동일한 방법으로 실시하였다. EDA는 시료 첨 가구와 무첨가구의 흡광도를 구하여 다음의 수학식 1에 의하여 계산하였다.

[수학식 1]

전자공여능(%) = {1 - (시료의 흡광도 / 대조구의 흡광도)} × 100

본 발명에 따른 락토바실러스 스피시스 NC를 포함한 유산균들의 전자공여능 평가결과를 도 1에 나타내었다.

실시예 4(철환원능 평가)

시료의 총체적 항산화 능력(total antioxidant potential)의 측정을 위하여 Benzie and strain(2)의 FRAP assay(ferric reducing ability of plasma)를 이용하였다. FRAP 시약은 acetate buffer 25 mL과 TPTZ 용액 2.5 mL과 FeCl₃·6H₂O 용액 2.5 mL(10:1:1)을 혼합하고 제조된 신선한 FRAP 시약 용액을 시험관에 3 mL씩 분주한 후 37℃로 유지하였다. 시료 100 ㎕와 H₂O 300㎕씩 첨가하여 4 분 동안 방치 후 철이 환원되어 생성되는 청색의 Fe(Ⅱ)-tripyridyltriazin compound의 양을 593 nm에서 측정하였으며 FeSO₄·7H₂O(0.1-1 mM/L)를 이용하여 표준곡선을 작성하고 생성된 Fe(Ⅱ)-tripyridyltriazin의 농도를 계산하였다.

FRAP 값은 4분의 흡광도에서 대조구의 흡광도를 뺀 값으로 산출하였다.

본 발명에 따른 락토바실러스 스피시스 NC를 포함한 유산균의 철환원능력 평가결과를 도 2에 나타내었다.

이상에서 살펴본 바와 같이, 본 발명에 따른 락토바실러스 스피시스 NC에 의 하면, 내산성과 항산화 활성이 우수하며 생리적 기능이 뛰어나 화장품, 식품, 의약품, 생활용품 등에 광범위하게 사용될 수 있는 효과가 있다.

Claims

김치, 발효유제품, 신생아 분변, 및 성인분변 중 적어도 하나를 포함하는 산성 시료로부터 분리하고, 내산성 및 항산화성을 가지며, 그람양성, 카탈레이즈 음성, 포자를 형성하지 않는 막대기 모양의 간균 형태로서 동정되는 락토바실러스 플랜타럼 NC (Lactobacillus plantarum NC, 수탁번호 : KCTC 10869 BP).
제 1 항에 기재된 락토바실러스 플랜타럼 NC(KCTC 10869 BP)를 이용하여 내산성 및 항산화 활성이 있는 화장료를 제조하는 방법.