KR100765431B1 - 유용 토착 사상균을 포함한 상황버섯으로부터의하이드로포빈 유전자의 염기 서열 및 이를 발현하는 단백질또는 이의 유사물질을 포함하는 조성물 - Google Patents
유용 토착 사상균을 포함한 상황버섯으로부터의하이드로포빈 유전자의 염기 서열 및 이를 발현하는 단백질또는 이의 유사물질을 포함하는 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 유용 토착 사상균을 포함한 상황버섯(Phellinus linteus, Phellinus baumii)으로부터의 하이드로포빈 유전자의 염기 서열 및 이를 발현하는 단백질 또는 이의 유사물질을 포함하는 조성물에 관한 것으로, 국내 토착 유용 사상균으로써 항암활성이 뛰어난 여러 가지 생리활성물질을 생산하는 상황버섯(Phellinus linteus, Phellinus baumii)에서 total RNA의 cDNA 라이브러리를 구축하여 하이드로포빈 유전자를 클로닝하여 염기서열을 분석함을 그 특징으로 한다.
본 발명에 의하면, 식물조직에 침입하여 감염구조 형성, 균사형태 형성, 자실체 형성에 중요한 역할을 하며, 산업적으로는 하이드로포빈 분자의 물리화학적 성질에 기인한 특성을 화장품 공업을 비롯하여 의료용 제품 및, 주류를 포함하는 식품공업에의 응용이 가능하다.
유용 토착 사상균, 상황버섯, 하이드로포빈 유전자
Description
도 1은 상황버섯으로부터 분리한 하이드로포빈 유전자의 아미노산 서열과 다른 담자균류에서 분리된 하이드로포빈 유전자 아미노산 서열을 Clustal X 프로그램을 이용하여 다상정렬 (multiple-alignment)한 결과를 대비한 도면이다.
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도 2는 치마버섯의 하이드로포빈인 SC3와 상황버섯으로부터 새롭게 클론닝 한 하이드로포빈의 아미노산 서열의 일차구조를 비교, 분석한 결과 특정한 크기의 루프를 형성함을 보이는 도면이다.
도 3은 Kyte and Doolittle 알고리즘을 이용한 아미노산의 소수성 패턴 분석/비교도로서, (a)는 SC3, (b)는 ABH3, (c)는 Tmhyd1에 대한 실험이다.
본 발명은 유용 토착 사상균을 포함한 상황버섯(Phellinus linteus, Phellinus baumii)으로부터의 하이드로포빈 유전자의 염기 서열 및 이를 발현하는 단백질 또는 이의 유사물질을 포함하는 조성물에 관한 것이다.
하이드로포빈은 사상균 (filamentous fungi)에서 생산되는 저분자의 단백질들로써 (de Vries 외, 1993; Wessels 1997), 치마버섯 Schzophyllum commune에서 4개의 하이드로포빈 유전자가 동정되어 최초로 보고가 되었으며 (Lugones 외, 1998; Schuren 외, 1990; van Wetter 외, 1998 & 2000), 다수의 연구자들에 의해 여러 생물체에서 생산되는 다양한 종류의 하이드로포빈이 분리되었다.
하이드로포빈은 class I과 class II로 크게 구분되며 현재까지 조사된 하이드로포빈 단백질의 아미노산 서열을 비교해 보면 서로 유사성이 낮아 하이드로포빈 단백질에 따라 다른 생물리학적 특성을 나타내며 이러한 성질은 의학 및 산업적으로 하이드로포빈의 다양한 활용을 가능하게 한다 (Wessels 1994, 1997).
하이드로포빈은 자낭균 및 담자균에서 세포와 세포(cell-cell) 및 세포와 표면(cell-surface)의 접촉에서 역할을 하는 세포벽 단백질 중 하나이며 세포 표층에 소수성의 층을 만들어서 친수성 배지에서 공기 중으로 균사가 신장함에 있어 필수적인 역할을 하며, 포자 형성, 균사생장 (growth of mycelium), 균사의 응집 (aggregation of hyphae), 숙주표면정착 (host-surface adhesion), 감염구조 형성 및 자실체 형성을 비롯하여 건조 내성 (desiccation tolerance) 등 곰팡이의 생물학적 현상에서 중요한 역할을 담당하고 있다(Kershaw 와 Talbot, 1998; Wessels 1996, 1997, 1999; Wessels 외 1995; Wosten과 Wessels, 1997; Wosten 외 1994, 1999). 그리고, 균근균에 있어서 이들 하이드로포빈은 공생 또는 기생하는 식물의 세근(細根)에 균사가 부착할 때 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다 (Mankel 외 2002).
또한 하이드로포빈은 특징적인 자기융합성을 가지고 있어 액상과 기상의 계면에 얇은 단백질의 단층막을 형성해 소수성의 표면을 친수성으로, 친수성의 표면을 소수성으로 바꾸어서 표면의 성질을 변화시킨다. 하이드로포빈의 이러한 물리화학적 특성은 의학 및 산업적으로 다양한 응용 가능성을 내포하고 있으며 사용 목적에 따라 가장 효과적인 물성을 나타내는 서로 다른 하이드로포빈 단백질을 자연계에서 분리할 필요가 있다.
최근에 진행되고 있는 하이드로포빈에 관한 연구는 기존에 분리되어 연구되고 있는 종류와 물리화학적 성질이 달라 다른 용도로 활용 가능한 새로운 하이드로포빈의 분리와 더불어, 기존의 하이드로포빈 단백질의 고발현을 통한 고생산은 물론 사용용도에 적합하도록 유전적인 엔지니어링을 통한 물성개량 등 여러가지 분야에서 연구가 활발히 진행되고 있다.
대부분의 사상균에서 발견되는 하이드로포빈에 대한 기능 및 활용성 연구는 현재 매우 활발하게 진행되고 있으며, 이들 단백질들은 사상균이 식물의 표면에 균사가 침투할 시 균사의 접촉 및 식물세포로의 감염의 초기과정에 있어서 중요한 역할을 하리라 예상되고 있다. 현재까지 여러종류의 담자균류에서 각 개체당 복수의 하이드로포빈 유전자들이 클론닝 되었다.
이에 반해, 본 발명의 목적은 현재까지 하이드로포빈 유전자들이 발견되었던 주름버섯류가 아닌 민주름 버섯에 속하는 상황버섯(Phellinus linteus, Phellinus baumii)으로부터 최초로 하이드로포빈 유전자를 클론닝함으로써 식물체로의 침투 및 감염구조형성, 담자균의 형태형성 및 자실체 발생 기작에 관여하는 하이드로포빈의 기능 및 응용성을 밝히려는데 있다.
본 발명은 국내 토착 유용 사상균으로써 항암활성이 뛰어난 여러 가지 생리활성물질을 생산하는 상황버섯(Phellinus linteus, Phellinus baumii)에서 total RNA의 cDNA 라이브러리를 구축하여 하이드로포빈 유전자를 클로닝하여 염기서열을 분석함을 특징으로 한다.
이하, 본 발명에 대하여 상세하게 설명한다.
본 발명에서는 최근 특이한 물리화학적 성질을 나타내어 산업적으로 주목받고 있는 하이드로포빈을 코딩하는 유전자를 국내에서 채취한 상황버섯(Phellinus linteus, Phellinus baumii)에서 클로닝한다.
상황버섯 유래의 하이드로포빈 단백질과 관련된 유전자를 확보하기 위하여 상황버섯으로부터 총 RNA (total RNA)를 분리·정제하며, 이들의 double stranded cDNA를 합성하고 cDNA 라이브러리를 제작하여 상황버섯(Phellinus linteus, Phellinus baumii) 유전체에 코딩되어 있는 하이드로포빈 유전자를 cDNA library로부터 스크리닝 하여 하이드로포빈 유전자의 염기서열을 분석한다.
즉, 본 발명은 특이한 물리화학적 성질을 나타내어 의학 및 산업적으로 다양한 응용가치를 보유하여 최근 주목받고 있는 생계면활성제인 하이드로포빈 탐색에 있어 기존에 분리된 종류와 다른 하이드로포빈 단백질을 코딩하는 유전자를 분리하기 위하여 국내 토착 유용 사상균으로서 항암활성이 뛰어난 여러가지 생리활성물질을 생산하는 상황버섯(Phellinus linteus, Phellinus baumii)으로부터 cDNA library를 구축하고 하이드로포빈 유전자를 클로닝한다. 하이드로포빈 유전자의 클로닝을 위해 사용한 상황버섯(Phellinus linteus, Phellinus baumii)은 국내 안동에서 채취한 것을 사용하였다.
아래에 실시한 예를 통하여 국내에서 채취된 상황버섯(Phellinus linteus, Phellinus baumii)으로부터 하이드로포빈 유전자의 클로닝을 확인할 수 있었고, 상황버섯 염색체 상에 존재하는 하이드로포빈 유전자를 증폭하고 이를 클로닝하여 상황버섯 유래의 하이드로포빈을 산업적으로 활용할 수 있는 기초적인 시스템을 개발하였다.
본 발명의 핵심은 기존에 밝혀진 하이드로포빈과 다른 종류의 하이드로포빈 유전자를 분리하고, 특히 민주름버섯류에서는 최초로 상황버섯의 하이드로포빈 유전자를 클로닝하였으며, 본 연구에서 증폭한 상황버섯 유래의 하이드로포빈 유전자의 염기서열을 기존에 보고된 다양한 종류의 하이드로포빈 유전자와 비교할 때, 상황버섯 유래의 특이한 하이드로포빈임을 확인하였고 기존에 보고된 하이드로포빈과는 다른종류의 하이드로포빈임을 유전자의 염기서열과 아미노산의 배열로 확인할 수 있었다.
본 발명은 종래의 하이드로포빈 유전자와는 다른 하이드로포빈 유전자를 상황버섯으로부터 클로닝하여 확인하고, 하이드로포빈 유전자의 염기서열을 해명하였다. 또한 상황버섯의 하이드로포빈을 상업적 용도로 이용할 수 있는 기반을 마련하였다.
본 발명은 하이드로포빈의 유전자를 이용하여 생산된 하이드로포빈의 친수성과 소수성에서의 특이한 성질을 이용하여 화장품산업, 양조산업 및 의료용 산업의 소재로 직접 응용 가능하다.
본 발명은 하기의 실험 예에 의하여 보다 명확히 이해될 수 있으며, 하기의 실험 예는 본 발명의 예시 목적에 불과하며 발명의 영역을 제한하거나, 본 발명의 내용이 여기에 한정되는 것은 아니다.
이하 본 발명의 바람직한 실시예에 대하여 첨부된 도면에 따라서 보다 상세히 설명한다.
실시예 1: 상황버섯으로 제작한 cDNA library로부터 클론닝한 하이드로포빈 유전자의 염기배열과 아미노산의 배열
경상북도 안동에서 채취한 상황버섯으로부터 QIAGEN의 RNeasy kit를 이용하여 total RNA를 분리,정제하고 RT-PCR반응으로 1st cDNA를 합성하였다. 1st cDNA를 주형으로 다시 PCR하여 final cDNA를 만들고 벡터에 삽입하고 이를 electroporation 하여 cDNA library를 제작하였다. 그리고 Seq I sequencing primer를 이용하여 각각의 클론을 sequencing하고 그 결과를 NCBI에서 BLAST SEARCH를 해서 확인한 결과 하이드로포빈 유전자(서열번호 1)에 이어서 특이적으로 보존된 8개의 cystein을 확인할 수 있었고 유전자의 구조가 다른 곰팡이 유래의 하이드로포빈 유전자와 높은 상동성을 나타냄을 확인할 수 있었다. (도 1a, 도 1b 참조)
실시예 2 : Clustal X 프로그램을 이용한 담자균류의 하이드로포빈 유전자 아미노산 서열과 상황버섯으로부터 분리한 하이드로포빈 유전자의 아미노산 서열의 다상정렬 (multiple-alignment) 결과.
상황버섯으로부터 분리한 하이드로포빈 유전자의 아미노산 서열과 다른 담자균류에서 분리된 하이드로포빈 유전자 아미노산 서열(서열번호 2)을 Clustal X 프로그램을 이용하여 다상정렬 (multiple-alignment) 결과 하이드로포빈 유전자의 큰 특징중의 하나인 일정한 위치에서의 8개의 cysteine을 확인할 수 있었으며 2번째와 4번째 그리고 6번째와 7번째의 cysteine은 다른 하이드로포빈 유전자에서와 마찬가지로 인접하여 존재하고 있음을 확인할 수 있었다. (도 1 참조)
실시예 3 : SC3와 상황버섯으로부터 분리한 hydrophobin의 아미노산의 일차구조의 비교 분석: 4개의 disulfide 결합으로 4개의 특정한 크기의 loops를 형성
이미 많은 연구가 진행된 치마버섯의 하이드로포빈인 SC3와 상황버섯으로부터 새롭게 클론닝 한 하이드로포빈의 아미노산 서열의 일차구조를 비교, 분석한 결과 그림에서 보는바와 마찬가지로 그 구조가 매우 유사하며 disulfide 결합으로 4개의 특정한 크기의 loops를 형성하는 구조를 확인할 수 있었다.
또한 1번, 3번, 4번의 loop를 형성하고 있는 아미노산의 수도 각각 6개, 5개, 12개로 구성되어 있음을 확인할 수 있었다. 그리고 여러 종류의 하이드로포빈 유전자에서 보존되어있는 아미노산 잔기 역시 상황버섯으로부터 새롭게 클론닝 한 Pbhyd1의 아미노산 서열에서도 일정하게 보존되어 있음을 확인할 수 있었다.(도 2 참조)
실시예 4. Kyte and Doolittle 알고리즘을 이용한 SC3, ABH3, Tmhyd1의 아미노산의 소수성 패턴 분석/비교
여러 가지 담자균류에서 분리한 하이드로포빈 유전자는 아미노산 잔기는 다르지만 매우 유사한 소수성 패턴을 가지는 것이 큰 특징중의 하나로 밝혀져 있다. 이는 하이드로포빈이 자가결합시 강한 소수성을 나타내는 데 관련되어 있는 것으로 밝혀져 있다.
치마버섯의 하이드로포빈 유전자, 양송이버섯에서 분리한 하이드로포빈 유전자와 송이버섯에서 새롭게 클론닝 한 하이드로포빈 유전자의 아미노산의 소수성 패턴을 비교,분석 한 결과 아미노산의 배열은 다르지만 모두 일정한 패턴의 소수성을 나타낸다는 것을 확인하였다.(도 3 참조)
본 발명의 유용 토착 사상균을 포함한 상황버섯으로부터의 하이드로포빈 유전자의 염기 서열 및 이를 발현하는 단백질 또는 이의 유사물질을 포함하는 조성물은 식물조직에 침입하여 감염구조 형성, 균사형태 형성, 자실체 형성에 중요한 역할을 하며, 산업적으로는 이 분자의 물리화학적 성질에 기인한 특성을 화장품 공업을 비롯하여 의료용 제품 및, 주류를 포함하는 식품공업에의 응용이 가능한 효과를 제공한다.
본 발명은 특정한 실시예에 관련하여 도시하고 설명하였지만, 이하의 특허청구범위에 의해 마련되는 본 발명의 정신이나 분야를 벗어나지 않는 한도 내에서 본 발명이 다양하게 개조 및 변화될 수 있다는 것을 당업계에서 통상의 지식을 가진 자는 용이하게 알 수 있음을 밝혀두고자 한다.
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Claims (3)
- 상황버섯인 펠리누스린테우스(Phellinus lineteus) 또는 펠리누스바우미(Phellinus baumii)로부터 분리되고, 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 하이드로포빈 유전자.
- 상황버섯인 펠리누스린테우스(Phellinus lineteus) 또는 펠리누스바우미(Phellinus baumii)로부터 분리되고, 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 하이드로포빈 단백질.
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