KR100536917B1 - 유용 토착 사상균을 포함한 송이버섯으로부터하이드로포빈의 분리 및 정제, 이의 유전자 염기서열 및이를 포함하는 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 유용 토착 사상균을 포함한 송이버섯 (Tricholoma matsutake)으로부터 하이드로포빈의 분리 및 정제, 이의 유전자 염기서열 및 이를 포함하는 조성물에 관한 것으로, 본 발명은 유용 토착 사상균을 포함한 송이버섯 유래의 신규한 하이드로포빈 단백질의 분리 정제하는 방법을 제공하는 효과가 있다. 또한, 본 발명은 송이버섯에서 유래한 하이드로포빈 단백질을 코딩하는 유전자 염기서열을 제공하는 효과가 있으며 상기 염기서열은 종래에 알려진 균주들에서 유래한 하이드로포빈의 유전자 염기서열과 비교하여 매우 낮은 염기서열 상동성을 가진다.

Description

유용 토착 사상균을 포함한 송이버섯으로부터 하이드로포빈의 분리 및 정제, 이의 유전자 염기서열 및 이를 포함하는 조성물{Isolation and purification of hydrophobin protein from Tricholoma matsutake including useful tradition filamentous fungi, its gene sequence and a composition containing the same}

본 발명은 유용 토착 사상균을 포함한 송이버섯 (Tricholoma matsutake)으로부터 하이드로포빈의 분리 및 정제, 이의 유전자 염기서열 및 이를 포함하는 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 본 발명은 유용 토착 사상균을 포함한 송이버섯 (Tricholoma matsutake)으로부터 하이드로포빈을 분리 및 정제하고 특이 프라이머를 사용하여 유전자 증폭을 통해 하이드로포빈의 유전자 염기서열을 얻고 이를 포함하는 조성물을 제공하는 것에 관한 것이다.

하이드로포빈은 사상균 (filamentous fungi)에서 생산되는 저분자의 단백질로써 (de Vries 외, 1993; Wessels 1997), 곰팡이 쉬조필럼 코뮨(Schzophyllum commune)에서 4개의 하이드로포빈 유전자가 동정됨으로써 최초로 보고되었고 (Lugones 외, 1998; Schuren 외, 1990; van Wetter 외, 1998 & 2000), 여러 연구자들에 의해 여러 생물체에서 생산되는 다양한 종류의 하이드로포빈이 분리되었다.

하이드로포빈은 자낭균 및 담자균에서 세포와 세포 (cell-cell) 및 세포와 표면 (cell-surface)의 접촉에 관여하는 세포벽 단백질 중 하나이며 세포 표층에 소수성 층을 만들어 친수성 배지에서 공기 중으로 균사가 신장함에 있어 필수적인 역할을 하며, 포자형성, 균사생장 (growth of mycelium), 균사의 응집 (aggregation of hyphae), 숙주표면정착 (host-surface adhesion), 감염구조 형성 및 자실체 형성을 비롯하여 건조 내성 (desiccation tolerance) 등 곰팡이의 생물학적 현상에 중요한 역할을 담당하고 있다(Kershaw 와 Talbot, 1998; Wessels 1996, 1997, 1999; Wessels 외 1995; Wosten과 Wessels, 1997; Wosen 외 1994, 1999). 또한, 균근균에 있어서 이들 하이드로포빈은 공생 또는 기생하는 식물의 세근에 균사가 부착할 때 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다(Mankel 외 2002). 현재 외생 균근균에서 발견되는 하이드로포빈의 기능과 활용성에 대한 연구가 활발히 진행되고 있으며 식물의 뿌리표면에서 균사의 접촉과균사의 식물뿌리세포 침투와 같이 균근균의 균근 형성과정에서 중요한 역할을 하리라 예상되고 있다.

하이드로포빈은 class I과 class II로 크게 구분되며 현재까지 조사된 하이드로포빈 단백질의 아미노산 서열을 비교한 결과 서로 유사성이 낮아 하이드로포빈 단백질에 따라 다른 생·물리학적 특성을 나타낸다(Wessels 1994, 1997). 또한, 특징적인 자기융합성을 가지고 있어 액상과 기상의 계면에 얇은 단백질의 단층막을 형성해 소수성의 표면을 친수성으로, 친수성의 표면을 소수성으로 바꾸어 표면의 성질을 변화시킨다. 하이드로포빈의 이러한 물리화학적 특성은 의학 및 산업적으로 다양한 응용 가능성을 내포하고 있으며 사용 목적에 따라 가장 효과적인 물성을 나타내는 서로 다른 하이드로포빈 단백질을 자연계에서 분리할 필요가 있다.

최근에는 기존에 분리된 하이드로포빈류와 물리화학적 성질이 달라 다른 용도로 활용 가능한 새로운 하이드로포빈을 분리하고, 기존의 하이드로포빈 단백질의 발현율을 높임으로써 생산능을 높이고, 사용용도에 적합하도록 유전공학을 이용한 물성 개량 등 여러 가지 분야에서 하이드로포빈에 관한 연구가 활발히 진행되고 있다.

따라서, 본 발명의 발명자들은 상기의 내용에 착안하여 소나무뿌리와 상호작용하는 외생 균근균인 송이버섯 (Tricholoma matsutake)으로부터 기존의 하이드로포빈류와는 다른 신규한 하이드로포빈을 분리 정제하는 방법을 제공하고자 한다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 송이버섯에서 분리한 신규한 하이드로포빈 단백질을 코딩하는 유전자의 염기서열을 제공함에 있다.

본 발명의 상기 목적은 소나무 뿌리에서 외생균근을 형성하여 생육하는 송이버섯(Tricholoma matsutake)에서 신규한 하이드로포빈을 분리 및 정제하고, 상기 하이드로포빈을 코딩하는 유전자를 선택적으로 증폭할 수 있는 특이 프라이머를 개발하여 PCR 을 통하여 하이드로포빈을 코딩하는 유전자를 증폭하고 이를 클로닝하여 상기 하이드로포빈의 유전자 염기서열을 밝힘으로써 달성하였다.

이하, 본 발명의 구체적인 구성을 상세히 설명한다.

본 발명은 소나무 뿌리에서 외생균근을 형성하여 생육하는 송이버섯 (Tricholoma matsutake)에서 신규한 하이드로포빈을 분리·정제하는 단계; 상기 하이드로포빈을 코딩하는 유전자를 선택적으로 증폭할 수 있는 특이 PCR 프라이머의 제작단계; 상기 프라이머를 이용한 상기 하이드로포빈 코딩 유전자의 PCR 증폭단계; 상기 하이드로포빈 코딩 유전자의 염기서열 분석단계로 구성된다.

이하, 본 발명의 구체적인 방법을 실시예를 들어 상세히 설명하고자 하지만 본 발명의 권리범위는 이들 실시예에만 한정되는 것은 아니다.

실시예 1 : 송이버섯에서 신규한 하이드로포빈의 분리 및 정제

본 발명에 사용된 송이버섯의 자실체는 대구광역시 가창의 인근 야산에서 수확한 것을 사용하였다. 수확 후 즉시 송이버섯에 붙어 있는 오염원과 토양을 제거하기 위하여 증류수로 5회 수세하고 -70℃에 보관하였다. 냉동보관된 상기 송이버섯을 사용할 경우 이들을 2일간 동결 건조한 뒤 자실체 만을 사용하였다. 동결 건조한 자실체는 60% 에탄올을 넣은 뒤 고속 혼합기로 30초 동안 마쇄한 후, 10,000 x g로 30분 간 원심 분리한 다음, 상기에서 얻은 노란색의 상등액에 50배의 증류수를 넣고 하룻밤 투석하였다. 투석 후 남아 있는 용액을 4℃에서 12,000 x g로 1시간동안 원심 분리한 다음, 펠렛은 버리고 상등액을 동결 건조시켰다. 동결된 물질은 0.05 M 나트륨-인산 완충액 (pH 6.0)에 1 M 소금용액 25 mL에 녹이고 5분간 격렬하게 혼합시켰다. 상기 혼합액을 실온에서 10,000 x g로 1시간동안 원심분리하고 원심분리관 벽에 붙어 있는 투명한 띠를 포함한 상등액은 버리고 밑부분에 가라앉은 하이드로포빈을 포함한 부분만 1 M 소금완충액 3 mL로 한번 수세하고, 80% 에탄올 2 mL로 2번, 클로로포름/메탄올(2:1, v/v) 혼합액 2 mL로 2회 수세한 후 건조시켰다.

상기의 방법으로 분리 추출한 하이드로포빈 단백질을 확인하기 위하여, 상기에서 얻은 건조 시료를 SDS-시료 완충액 (SDS-sample buffer: 2% SDS, 0.05 M Tris/HCl, pH 6.8, 10% (v/v) 글리세롤)에 녹인 후, 12.5%의 폴리아크릴아마이드 젤에서 분석하였다. 전기영동 종료 후, 코마씨 블루를 사용하여 단백질을 염색하였다.

도 1에 나타난 바와 같이, 본 발명의 송이버섯 자실체로부터 분리·정제한 하이드로포빈 단백질은 25 kDa에서 단일 밴드를 나타났다.

도 2는 송이버섯의 자실체를 부분별로 구분하여 각 부분에 존재하는 하이드로포빈 단백질의 종류 및 발현 차이를 SDS-PAGE 를 실시하여 나타낸 것으로, 1은 자실체, 2는 갓, 3은 자루에서 추출 정제한 하이드로포빈을 나타낸다. 각각 25 kDa에서 단일 밴드를 나타냈으며, 발현 정도는 큰 차이를 보이지 않았다.

실시예 2 : 송이버섯에서 추출한 DNA에서 PCR을 이용한 하이드로포빈 유전자 증폭

송이버섯 자실체로부터 분리한 DNA에서 하이드로포빈 유전자를 증폭하기 위하여 7가지의 담자균류에서 보고된 18가지의 하이드로포빈 유전자를 정렬시켜 보았다. 하이드로포빈 유전자의 아미노산 배열을 배열시켜 본 결과 매우 잘 보존되어 있는 아미노산 서열은 발견할 수 있었으나, 하이드로포빈 유전자를 특이적으로 증폭할 수 있는 특이적 PCR 프라이머 제작에 이용할 영역을 찾을 수 없었다 (도 3).

따라서, 다양한 유전적 연구로 다량의 유전적 정보들이 보고되어 있는 곰팡이 아스퍼질러스(Aspergillus)속의 하이드로포빈 유전자의 아미노산 서열들을 선별한 후 다상정렬 (multiple-alignment)하여 특이적 프라이머를 제작 할 수 있는 보존된 영역을 찾고 이를 송이버섯 유래의 하이드로포빈 유전자의 증폭에 이용할 특이 프라이머 제작에 사용하였다(도 4).

도 4는 아스퍼질러스 니듈란스 균주의 하이드로포빈 아미노산 서열과 선별된 특이 프라이머의 제작 영역을 나타내며, 도 5는 이로부터 제작한 하이드로포빈 유전자의 특이 프라이머 염기서열을 나타낸 것으로 각각 hydAnA와 hydAnB로 명명하였고, HydAnA는 업스트림(upstream)의 증폭을 위한 프라이머로, hydAnB는 다운스트림(downstream)의 증폭을 위한 프라이머로 사용하였다.

송이버섯(Tricholoma matsutake) DNA의 PCR 증폭은 프로젠(PROGENE, 테크네 캠브리지사 제품(Techne Cambridge Ltd. Duxford))을 사용하여 실시하였다. PCR 반응에 있어서, 각 프라이머 농도는 100 pmol로 사용하였고, 0.2 M의 dNTP, 1.5 mM MgCl₂, 0.5 unit의 Taq DNA 폴리머라제를 사용하여, 증폭 완충액 (5 mM Tris-HCl, pH 8.0, 10 mM NaCl, 0.01 mM EDTA, 0.1 mM DTT, 5% 글리세롤 및 0.1% Triton X-100)을 혼합하고 멸균수로 전체를 200 ㎕로 보정한 후 실시하였다. PCR 프로그램은 95 ℃에서 30초, 55 ℃에서 1분, 72 ℃에서 30초로 하여 42 사이클을 반복하였다. 상기의 PCR 조건에서 하이드로포빈의 유전자 증폭을 실시하여 도 6과 같이 약 280 bp의 PCR 단편을 확인하였다. 생산된 약 280 bp의 PCR 단편을 pGEMT-easy vector와 연결하여 숙주에 클로닝하고 OmniBase DNA Cycle Sequencing System을 이용하여 하이드로포빈 유전자의 염기서열을 결정하였다.

도 7에 나타난 바와 같이, PCR 증폭으로부터 얻은 송이버섯의 하이드로포빈 유전자의 염기서열은 284개의 뉴클레오타이드로 구성되어 있다. 상기 염기서열을 NCBI (National Center for Biotechnology Information)의 유전자 데이터베이스에서 검색한 결과, 하이드로포빈 유전자로 확인되었으나 다른 균주에서 보고된 하이드로포빈 유전자와 비교하여 매우 낮은 염기서열 상동성 (sequence homology)을 나타내었다.

이상과 같이 본 발명은 실시예를 통하여 설명한 바와 같이, 유용 토착 사상균을 포함한 송이버섯에서 신규한 하이드로포빈 단백질을 분리 정제하는 방법을 제공하는 효과가 있다. 또한, 본 발명은 송이버섯에서 유래한 하이드로포빈 단백질을 코딩하는 유전자 염기서열을 제공하는 효과가 있으며 상기 염기서열은 종래에 알려진 균주들에서 유래한 하이드로포빈의 유전자 염기서열과 비교하여 매우 낮은 염기서열 상동성을 가지고 있어 본 발명의 하이드로포빈의 친수성과 소수성에서의 특이한 성질을 이용할 수 있으므로 향장산업, 맥주산업 및 의료산업상 매우 유용한 발명인 것이다.

도 1은 송이버섯 (Tricholoma matsutake) 자실체에서 분리·정제한 25 kDa의 하이드로포빈 단백질 전기영동 사진도를 나타낸 것이다.

도 2는 송이버섯의 자실체, 갓 및 자루에서 개별적으로 추출·정제한 하이드로포빈 단백질의 SDS-PAGE 결과를 나타낸 것으로, M은 전기영동확인용 표준물질, 1은 자실체, 2는 갓, 3은 자루에서 각각 추출 및 정제한 것이다.

도 3은 Clustal X 프로그램을 이용한 담자균류의 하이드로포빈 유전자의 아미노산 서열의 다상정렬 (multiple-alignment) 결과를 나타낸 것이다.

도 4는 아스퍼질러스 니둘란스(Aspergillus nidulans) 의 하이드로포빈 유전자의 아미노산 서열을 나타낸 것이다.

도 5는 하이드로포빈 유전자의 증폭을 위해 개발된 특이 프라이머 hydAnA 과 B의 염기서열을 나타낸 것이다.

도 6은 특이 프라이머 hydAnA 와 hydAnB를 사용하여 송이버섯 자실체의 DNA를 증폭한 후 전기영동한 결과를 나타낸 것이다.

도 7은 송이버섯에서 분리한 하이드로포빈의 유전자의 염기서열을 나타낸 것이다.

<110> KIM, Jong-Bok <120> hydrophobin sequence <160> 4 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 157 <212> PRT <213> Aspergillus nidulans <400> 1 Met Lys Phe Ser Ile Ala Ala Ala Val Val Ala Phe Ala Ala Ser Val 1 5 10 15 Ala Ala Leu Pro Pro Ala His Asp Ser Gln Phe Ala Gly Asn Gly Val 20 25 30 Gly Asn Lys Gly Asn Ser Asn Val Lys Phe Pro Val Pro Glu Asn Val 35 40 45 Thr Val Lys Gln Ala Ser Asp Lys Cys Gly Asp Gln Ala Gln Leu Ser 50 55 60 Cys Cys Asn Lys Ala Thr Tyr Ala Gly Asp Thr Thr Thr Val Asp Glu 65 70 75 80 Gly Leu Leu Ser Gly Ala Leu Ser Gly Leu Ile Gly Ala Gly Ser Gly 85 90 95 Ala Glu Gly Leu Gly Leu Phe Asp Gln Cys Ser Lys Leu Asp Val Ala 100 105 110 Val Leu Ile Gly Ile Gln Asp Leu Val Asn Gln Lys Cys Lys Gln Asn 115 120 125 Ile Ala Cys Cys Gln Asn Ser Pro Ser Ser Ala Asp Gly Asn Leu Ile 130 135 140 Gly Val Gly Leu Pro Cys Val Ala Leu Gly Ser Ile Leu 145 150 155 <210> 2 <211> 28 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hydAnA <400> 2 cggaacaggc cagcccgcgc aacaaggc 28 <210> 3 <211> 27 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hydAnB <400> 3 cggaaccggc agcaggcaag cgcgcac 27 <210> 4 <211> 284 <212> DNA <213> Tricholoma matsutake <400> 4 cggaattcag gctcagctct cttgctgcaa caagggcaac agtaagcgcc gtgtcatcgt 60 aaatcactct taaccaaaaa atagacactg tattgatctt gaagcttcct cattggaatc 120 gaccagcaga atcattatca accccacaaa aacctctatt aacacgatca tcgactctac 180 ggaatttcag tgtgcatggg gttctttctc taaatgttat ctcttagtgg ctgacacacc 240 tgagggagtg caagcagaac attgcctgct gccagagaat tccg 284

Claims (5)

1. 삭제
2. 삭제
3. 송이버섯 유래의 하이드로포빈을 코딩하는 유전자의 대량생산을 위한 서열목록 2와 3에 기재된 프라이머.
4. 서열목록 2와 3에 기재된 프라이머를 이용하여 증폭됨을 특징으로 하는 서열목록 4에 기재된 염기서열에 의해 코딩되는 송이버섯 유래의 하이드로포빈.
5. 삭제