KR100554672B1 - 송이버섯으로부터 분리된 신규 하이드로포빈 유전자Ｔｍｈｙｄ2 - Google Patents

송이버섯으로부터 분리된 신규 하이드로포빈 유전자Ｔｍｈｙｄ2 Download PDF

Info

Publication number
KR100554672B1
KR100554672B1 KR1020040052417A KR20040052417A KR100554672B1 KR 100554672 B1 KR100554672 B1 KR 100554672B1 KR 1020040052417 A KR1020040052417 A KR 1020040052417A KR 20040052417 A KR20040052417 A KR 20040052417A KR 100554672 B1 KR100554672 B1 KR 100554672B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
hydrophobin
gene
tmhyd2
hydrophobin gene
amino acid
Prior art date
Application number
KR1020040052417A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20060003510A (ko
Inventor
김종국
이진형
김정민
이상한
신기선
김남순
Original Assignee
경북대학교 산학협력단
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 경북대학교 산학협력단 filed Critical 경북대학교 산학협력단
Priority to KR1020040052417A priority Critical patent/KR100554672B1/ko
Publication of KR20060003510A publication Critical patent/KR20060003510A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR100554672B1 publication Critical patent/KR100554672B1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8216—Methods for controlling, regulating or enhancing expression of transgenes in plant cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/14—Fungi; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

본 발명은 소나무 뿌리와 상호작용하는 외생균근균인 송이버섯(Tricholoma matsutake)의 하이드로포빈으로부터 식물 RNA를 추출하여 cDNA 라이브러리를 구축하고 신규의 하이드로포빈 유전자(Tmhyd2)를 클로닝하여 염기서열을 분석한 결과 상기 하이드로포빈 유전자는 균근 형성, 곰팡이 형태형성 및 자실체 발생에 관여할 뿐만 아니라, 친수성과 소수성에서의 특이한 성질을 이용한 상업적 용도로 활용함과 동시에 식물 형질전환 벡터의 제조합과 형질전환을 통한 버섯의 대량생산을 가능하게 하는 효과가 있으므로 화장품 공업을 비롯하여 의료용 제품 및 주류를 포함하는 식품공업 산업상 뛰어난 효과가 있다.
송이버섯(Tricholoma matsutake), 하이드로포빈, RNA, cDNA 라이브러리, 클로닝, 균근 형성, 자실체

Description

송이버섯으로부터 분리된 신규 하이드로포빈 유전자 Ｔｍｈｙｄ2{Novel hydrophobin gene Tmhyd2 from Tricholoma matsutake}
도 1은 Clustal X 프로그램을 이용한 송이버섯의 하이드로포빈 유전자 Tmhyd1과 Tmhyd2의 씨퀀스 얼라인먼트(sequence alignment)을 나타낸다.
도 2은 Clustal X 프로그램을 이용한 담자균류의 하이드로포빈 유전자의 아미노산 서열과 송이버섯으로부터 분리한 하이드로포빈 유전자의 아미노산 서열의 다상정렬 (multiple-alignment)을 나타낸다.
도 3는 SC3 와 Tmhyd2의 아미노산의 일차구조를 비교하여 4개의 특정한 크기의 loops를 형성하는 구조를 나타낸다.
도 4은 SC3, ABH3, Tmhyd2의 아미노산의 소수성 패턴 분석/비교를 나타낸다.
도 5는 담자균류의 하이드로포빈 유전자 아미노산 서열과 송이버섯으로부터 분리한 하이드로포빈 유전자의 아미노산 서열의 계통분류(phylogenetic relationship)를 나타낸다.
본 발명은 송이버섯(Tricholoma matsutake)으로부터 분리한 신규한 하이드로 포빈 유전자(Tmhyd2)에 관한 것이다.
하이드로포빈은 사상균 (filamentous fungi)에서 생산되는 저분자의 단백질로써 (de Vries 외, 1993; Wessels 1997), 곰팡이 Schzophyllum commune에서 4개의 하이드로포빈 유전자가 동정되어 최초로 보고된 바 있으며 (Lugones 외, 1998; Schuren 외, 1990; van Wetter 외, 1998 & 2000), 그 후 다수의 연구자들에 의해 여러 생물체에서 생산되는 다양한 종류의 하이드로포빈이 분리되었다.
하이드로포빈은 class I과 class II로 크게 구분되며 현재까지 조사된 하이드로포빈 단백질의 아미노산 서열을 비교해 보면 서로 유사성이 낮아 하이드로포빈 단백질에 따라 다른 생물리학적 특성을 나타내며 이러한 성질은 의학 및 산업적으로 하이드로포빈의 다양한 활용을 가능하게 한다 (Wessels 1994, 1997).
하이드로포빈은 자낭균 및 담자균에서 세포와 세포 (cell-cell) 및 세포와 표면 (cell-surface)의 접촉에서 역할을 하는 세포벽 단백질 중 하나이며 세포 표층에 소수성의 층을 만들어서 친수성 배지에서 공기 중으로 균사가 신장함에 있어 필수적인 역할을 하며, 포자 형성, 균사생장 (growth of mycelium), 균사의 응집 (aggregation of hyphae), 숙주표면정착 (host-surface adhesion), 감염구조 형성 및 자실체 형성을 비롯하여 건조 내성 (desiccation tolerance) 등 곰팡이의 생물학적 현상에서 중요한 역할을 담당하고 있다 (Kershaw 와 Talbot, 1998; Wessels 1996, 1997, 1999; Wessels 외 1995; Wosten과 Wessels, 1997; Wosten 외 1994, 1999). 또한 균근균에 있어서 이들 하이드로포빈은 공생 또는 기생하는 식물의 세근 (細根)에 균사가 부착할 때 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다 (Mankel 외 2002).
또한 하이드로포빈은 특징적인 자기융합성을 가지고 있어 액상과 기상의 계면에 얇은 단백질의 단층막을 형성해 소수성의 표면을 친수성으로, 친수성의 표면을 소수성으로 바꾸어서 표면의 성질을 변화시킨다. 하이드로포빈의 이러한 물리화학적 특성은 의학 및 산업적으로 다양한 응용 가능성을 내포하고 있으며 사용 목적에 따라 가장 효과적인 물성을 나타내는 서로 다른 하이드로포빈 단백질을 자연계에서 분리할 필요가 있다.
최근에 진행되고 있는 하이드로포빈에 관한 연구는 기존에 분리되어 연구되고 있는 종류와 물리화학적 성질이 달라 다른 용도로 활용 가능한 새로운 하이드로포빈의 분리와 더불어, 기존의 하이드로포빈 단백질의 고발현을 통한 고생산은 물론 사용용도에 적합하도록 유전적인 엔지니어링을 통한 물성 개량 등 여러 가지 분야에서 연구가 활발히 진행되고 있다.
본 발명자들은 기존의 송이버섯의 하이드로포빈 유전자(Tmhyd1) 외에 새로운 유전자(Tmhyd2)를 밝힌 바 있어(대한민국 특허출원 제10-20020050910 호) 이 유전자들은 서로 염기배열에 있어서 60%, 아미노산 배열에 있어서는 40%의 상동성을 지님을 확인하였고 (도 1 참조) 이러한 하이드로포빈 유전자는 하나의 개체에서 복수의 유전자를 가지고 있고 이들은 버섯의 생육과 분화단계에 따라 각각 다른 역할을 하는 것으로 확인하였다.
본 발명은 상기와 같은 점들을 감안하여 안출한 것으로 기존에 밝혀진 하이드로포빈과 다른 종류의 하이드로포빈 유전자(Tmhyd2)를 분리함으로써 앞으로 식물 형질전환 벡터의 재조합과 형질전환을 통한 대량생산을 가능하게 하여 산업적으로 활용할 수 있는 기초적인 시스템을 개발하고 제공하고자 하는데 그 목적이 있다.
본 발명의 상기 목적은 기존에 공지된 하이드로포빈과 다른 종류의 국내 자생의 최고품질의 송이버섯으로부터 하이드로포빈 유전자를 분리하고 클로닝하여 기존의 다양한 종류의 하이드로포빈 유전자와 비교할 때, 염기서열과 아미노산의 배열이 송이버섯 유래의 특이한 하이드로포빈임을 확인함으로써 달성하였다.
본 발명은 종래의 하이드로포빈 유전자와는 다른 하이드로포빈 유전자(Tmhyd2)를 송이버섯으로부터 클로닝하여 확인하고, 하이드로포빈 유전자의 염기서열을 규명함으로써 친수성과 소수성에서의 특이한 성질을 이용한 상업적 용도로 활용할 수 있는 기초적인 시스템에 관한 것이다.
본 발명은, 송이버섯으로 제작한 cDNA library로부터 클로닝한 하이드로포빈유전자의 염기와 아미노산 배열을 확인하는 단계; 담자균류의 하이드로포빈 유전자의 아미노산과 송이버섯의 하이드로포빈 유전자의 아미노산 서열의 다상정렬을 확인하는 단계; SC3와 Tmhyd2의 아미노산 일차구조를 비교분석하는 단계; SC3,ABH3,Tmhyd2의 아미노산의 소수성 패턴을 분석하는 단계; 담자균류의 하이드로포빈 유전자 아미노산 서열과 송이버섯의 하이드로포빈 유전자의 아미노산 서열을 계통분류하는 단계로 구성된다.
본 발명의 하이드로포빈 유전자의 클로닝을 위해 사용한 송이버섯은 국내 대구 근교의 가창 송림에서 채취하였다.
이하, 본 발명의 구체적인 구성과 작용효과를 실시예 및 실험예를 통하여 더욱 자세히 설명한다.
실시예 1: 송이버섯으로 제작한 cDNA 라이브러리(library) 로부터 클로닝한 하이드로포빈 유전자(Tmhyd2)의 염기배열과 아미노산의 배열
국내 대구 근교의 가창 송림에서 채취한 송이버섯으로부터 QIAGEN의 RNeasy kit를 이용하여 토탈(total) RNA를 분리,정제하고 RT-PCR반응으로 1차 cDNA를 합성하였다. 1차 cDNA를 주형으로 다시 PCR하여 최종 cDNA를 만들고 벡터에 삽입하여 이를 일렉트로포레이션(electroporation) 하여 cDNA library를 제작하였다. 그리고 Seq I 씨퀀싱 프라이머(sequencing primer)를 이용하여 각각의 클론을 씨퀀싱(sequencing)하고 그결과를 NCBI에서 블라스트 써치(blast search)를 해서 하이드로포빈 유전자와 높은 상동성을 나타냄을 확인하였다.
실험예 1: Clustal X 프로그램을 이용한 담자균류의 하이드로포빈 유전자 아미노산 서열과 송이버섯으로부터 분리한 하이드로포빈 유전자의 아미노산 서열의 다상정렬 (multiple-alignment)
송이버섯으로부터 분리한 하이드로포빈 유전자의 아미노산 서열과 다른 담자균류에서 분리된 하이드로포빈 유전자 아미노산 서열을 Clustal X 프로그램을 이용 하여 다상정렬 (multiple-alignment) 결과, 하이드로포빈 유전자의 큰 특징중의 하나인 일정한 위치에서의 8개의 cysteine을 확인할 수 있었으며 2번째와 4번째 그리고 6번째와 7번째의 cysteine은 다른 하이드로포빈 유전자에서와 마찬가지로 인접하여 존재하고 있음을 확인하였다.(도 2 참조)
실험예 2: SC3 와 Tmhyd2의 아미노산의 일차구조의 비교 분석
이미 많은 연구가 진행된 치마버섯의 하이드로포빈인 SC3와 송이버섯으로부터 새롭게 클론닝 한 Tmhyd2의 아미노산 서열의 일차구조를 비교, 분석 한 결과 도 3에서 보는 바와 같이 그 구조가 매우 유사하며 disulfide 결합으로 4개의 특정한 크기의 루프(loop)를 형성하는 구조를 확인할 수 있었다. 또한 1번, 3번, 4번의 루프를 형성하고 있는 아미노산의 수도 각각 6개, 5개, 12개로 구성되어 있음을 확인하였다. 또한 여러 종류의 하이드로포빈 유전자에서 보존되어있는 아미노산 잔기 역시 송이버섯으로부터 새롭게 클론닝 한 Tmhyd2의 아미노산 서열에서도 일정하게 보존되어 있음을 확인하였다.
실험예 3: Kyte and Doolittle 알고리즘을 이용한 SC3, ABH3, Tmhyd2의 아미노산의 소수성 패턴 분석,비교
여러 가지 담자균류에서 분리한 하이드로포빈 유전자는 아미노산 잔기는 다르지만 매우 유사한 소수성 패턴을 가지는 것이 큰 특징중의 하나로 밝혀져 있다. 이는 하이드로포빈이 자가결합시 강한 소수성을 나타내는 데 관련되어 있는 것으로 밝혀져 있다.
치마버섯의 하이드로포빈 유전자(SC3), 양송이버섯에서 분리한 하이드로포빈 유전자(ABH3)와 송이버섯에서 새롭게 클론닝 한 하이드로포빈 유전자(Tmhyd2)의 아미노산의 소수성 패턴을 비교,분석 한 결과 도 4에서 보인바와 같이 아미노산의 배열은 다르지만 모두 일정한 패턴의 소수성을 나타낸다는 것을 확인하였다.
실험예 4: Clustal X 프로그램을 이용한 담자균류의 하이드로포빈 유전자 아미노산 서열과 송이버섯으로부터 분리한 하이드로포빈 유전자의 아미노산 서열의 계통분류(phylogenetic relationship)
여러 가지의 담자균류에서 분리한 하이드로포빈 유전자 아미노산 서열과 송이버섯으로부터 새롭게 분리한 하이드로포빈 유전자의 아미노산 서열을 Clustal X 프로그램을 이용하여 계통분류(phylogenetic relationship)를 실행한 결과, 도 5에서 보인바와 같이 송이버섯에서 분리한 신규의 하이드로포빈 유전자 Tmhyd2는 기존에 분리된 Tmhyd1과는 다른 그룹에 속하며 표고버섯, 느타리버섯, 팽이버섯 등의 담자균류에 속하는 하이드로포빈 유전자의 아미노산 서열과 가장 가까운 연관관계를 가지고 있음을 확인하였다.
이상의 실시예 및 실험예에 따라 본 발명은 종래의 하이드로포빈 유전자와는 다른 하이드로포빈 유전자를 송이버섯으로부터 클로닝하여 확인하고, 하이드로포빈 유전자의 염기서열을 규명함으로써 친수성과 소수성에서의 특이한 성질을 이용한 상업적 용도로 활용할 수 있는 뛰어난 효과가 있음을 알 수 있다.
이상 설명한 바와 같이 본 발명 송이버섯(Tricholoma matsutake)으로부터 분리된 신규 하이드로포빈 유전자는 친수성과 소수성에서의 특이한 성질을 이용한 상업적 용도로 활용할 수 있는 놀라운 효과가 있고 앞으로 식물 형질전환 벡터의 재조합과 형질전환을 통한 송이버섯의 대량생산을 가능하게 하는 효과가 있으므로 화장품 공업을 비롯하여 의료용 제품 및 주류를 포함하는 식품공업 산업상 매우 유용한 발명인 것이다.
서열목록 전자파일 첨부

Claims (1)

  1. 송이버섯(Tricholoma matsutake)으로부터 분리되며, 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 하이드로포빈 유전자(Tmhyd2).
KR1020040052417A 2004-07-06 2004-07-06 송이버섯으로부터 분리된 신규 하이드로포빈 유전자Ｔｍｈｙｄ2 KR100554672B1 (ko)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020040052417A KR100554672B1 (ko) 2004-07-06 2004-07-06 송이버섯으로부터 분리된 신규 하이드로포빈 유전자Ｔｍｈｙｄ2

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020040052417A KR100554672B1 (ko) 2004-07-06 2004-07-06 송이버섯으로부터 분리된 신규 하이드로포빈 유전자Ｔｍｈｙｄ2

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20060003510A KR20060003510A (ko) 2006-01-11
KR100554672B1 true KR100554672B1 (ko) 2006-02-22

Family

ID=37105939

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020040052417A KR100554672B1 (ko) 2004-07-06 2004-07-06 송이버섯으로부터 분리된 신규 하이드로포빈 유전자Ｔｍｈｙｄ2

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR100554672B1 (ko)

Also Published As

Publication number Publication date
KR20060003510A (ko) 2006-01-11

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Kershaw et al. Hydrophobins and repellents: proteins with fundamental roles in fungal morphogenesis
US20060068470A1 (en) Antifreeze proteins from basidiomy cetes
Young-Joon et al. Diversity of the Hyaloperonospora parasitica complex from core brassicaceous hosts based on ITS rDNA sequences
Aas et al. Four new Ophiostoma species associated with hardwood-infesting bark beetles in Norway and Poland
Wang et al. Coriolopsis trogii hydrophobin genes favor a clustering distribution and are widely involved in mycelial growth and primordia formation
Ando et al. A gene encoding a hydrophobin, fvh1, is specifically expressed after the induction of fruiting in the edible mushroom Flammulina velutipes
KR100554672B1 (ko) 송이버섯으로부터 분리된 신규 하이드로포빈 유전자Ｔｍｈｙｄ2
Trembley et al. Hydrophobins DGH1, DGH2, and DGH3 in the lichen-forming basidiomycete Dictyonema glabratum
Redecker New views on fungal evolution based on DNA markers and the fossil record
Varvas et al. Preliminary study of endophytic fungi in timothy (Phleum pratense) in Estonia
Kulkarni et al. Identification and characterization of a hydrophobin Vmh3 from Pleurotus ostreatus
TAGU et al. Review article Hydrophobins in Ectomycorrhizal Symbiosis: Hypothesis
CN104530204B (zh) 一种油菜抗菌肽BnPRP1及其应用
KR100536917B1 (ko) 유용 토착 사상균을 포함한 송이버섯으로부터하이드로포빈의 분리 및 정제, 이의 유전자 염기서열 및이를 포함하는 조성물
KR100765431B1 (ko) 유용 토착 사상균을 포함한 상황버섯으로부터의하이드로포빈 유전자의 염기 서열 및 이를 발현하는 단백질또는 이의 유사물질을 포함하는 조성물
MESSNER et al. Sequences of ribosomal genes and internal transcribed spacers move three plant parasitic fungi, Eremothecium ashbyi, Ashbya gossypii, and Nematospora coryli, towards Saccharomyces cerevisiae
KR20050023562A (ko) 유용 토착 사상균을 포함하는 송이버섯 유래의 신규한하이드로포빈 및 이를 코딩하는 유전자의 염기서열
Thio et al. Current status of Colletotrichum capsici strains, causal agents of Brown blotch disease of cowpea in Burkina Faso
CA2759311A1 (en) Regulators involved in mushroom formation
Lunkenbein et al. Characterization of a hydrophobin of the ascomycete Paecilomyces farinosus
Ma et al. Characterization of a Pleurotus ostreatus fruiting body‐specific hydrophobin gene, Po. hyd
Sakamoto et al. Differential protein expression in the fruiting dikaryon and the non-fruiting monokaryon of Flammulina velutipes
Islam et al. Analysis of structure and differential expression of Pseudomonas syringae 5-like (RPS5-like) genes in pathogen-infected Vitis flexuosa
Choi et al. Homology search of genus Pleurotus using an internal transcribed spacer region
Memarzadeh et al. Lecanicillium fungicola, the predominant cause of Agaricus bisporus basidiocarp deformity in Isfahan, Alborz and Khuzestan provinces

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E701 Decision to grant or registration of patent right
N231 Notification of change of applicant
GRNT Written decision to grant
FPAY Annual fee payment

Payment date: 20120111

Year of fee payment: 8

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20140127

Year of fee payment: 9

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20150130

Year of fee payment: 10

LAPS Lapse due to unpaid annual fee