KR100759988B1 - 황색포도상구균에 특이적인 항균 단백질 - Google Patents

Abstract

본 발명은 박테리오파지(Bacteriophage) 유래의 항균 기능을 갖는 신규 단백질에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 인체를 포함한 동물의 감염성 질환의 주된 원인균인 황색포도상구균(Staphylococcus aureus)을 특이적으로 사멸시킬 수 있는 용균성 박테리오파지로부터 유래한 항균 단백질, 상기 항균 단백질을 유효성분으로 포함하는 황색포도상구균에 의해 유발되는 질환의 치료용 약학적 조성물, 항생제 및 소독제에 관한 것이다.

황색포도상구균, 항생제, 박테리오파지, 단백질, 항균, 용균

Description

황색포도상구균에 특이적인 항균 단백질{Antimicrobial Protein Specific To Staphylococcus aureus}

도 1은 용균반 분석(plaque assay)에 의해 황색포도상구균에 특이적인 박테리오파지를 검출한 평판접시 사진이다.

도 2는 황색포도상구균을 특이적으로 사멸시킬 수 있는 박테리오파지의 분리 과정을 보여주는 모식도이다.

도 3은 용균반 분석에 의해 황색포도상구균에 특이적인 박테리오파지를 검출한 다음 이를 전자현미경으로 촬영한 사진이다.

도 4는 박테리오파지 유전체 라이브러리의 구축을 위해 사용한 과정을 순서대로 보여주는 모식도이다.

도 5는 재조합된 플라스미드의 선별과정을 보여주는 전기영동 사진이다.

도 6은 NCBI 홈페이지(http://ncbi.nlm.nih.gov)의 Blast 프로그램을 이용하여 염기 서열을 분석한 결과를 보여주는 것이다.

도 7은 분석된 박테리오파지의 염기 서열을 기반으로 작성된 콘티그 지도(Contig map)이다.

도 8은 NCBI Blast와 Vector NTI ContigExpress 프로그램을 이용하여 번역영역에 대해 분석한 결과를 보여주는 것이다.

도 9는 용균관련 유전자의 NCBI Blast 프로그램을 통한 분석 결과 1이다.

도 10은 용균관련 유전자의 NCBI Blast 프로그램을 통한 분석 결과 2이다.

도 11은 발현된 항균 단백질을 단백질 전기영동으로 확인한 결과를 보여주는 사진으로서, 레인 M은 크기 마커, 레인 1과 2는 레인 5와 6의 음성 기준 시료(발현 유도를 하지 않은 경우에 해당), 레인 3과 4는 레인 7과 8의 음성 기준 시료(발현 유도를 하지 않은 경우에 해당), 레인 5와 6은 동일하게 진행된 실험의 시료로서, 이 경우에는 용균관련 유전자인 CHAP 영역과 아미다제 영역이 각각 발현된 경우에 해당하고, 레인 7과 8은 CHAP 영역과 아미다제 영역을 포함한 전체 항균 단백질이 발현된 경우에 해당한다.

도 12는 임상 분리한 두 종의 황색포도상구균에 대한 용균 활성을 확인한 결과를 보여주는 사진으로서, (A)와 (B)의 황색포도상구균은 서로 다른 종이며, W는 세포 파쇄액(whole cell lysate)을 나타내고, P는 세포 파쇄액의 원심분리 후의 침전물(pellet)로서 불용성 성분을 나타내며, S는 세포 파쇄액의 원심분리 후의 상등액(supernatant)으로서 수용성 성분을 나타낸다.

도 13은 여러 종류의 세균에 대한 용균 활성을 조사한 결과를 보여주는 사진으로서, (A)는 황색포도상구균, (B)는 연쇄상구균, (C)는 Lactococcus lactis와 유산균속에 속하는 세균, (D)는 대장균과 대장균형 박테리아에 대한 결과이다. (A)에서 S1은 SAU-YH, S2는 SAU-HR1, S3는 SAU-HR2, S4는 SAU-HR3, S5는 ATCC 31886 이고, (B)에서 E.FAL은 EFA-HR, E.FAC는 ETC-HR, S.agal1은 ATCC 27956, S.agal2는 ATCC 7077, S.U1은 SU-HY, S.U2는 ATCC BAA-854 이며, (C)에서 L.L은 Lactococcus lactis, L.R은 Lactobacillus reuteri, L.P는 Lactobacillus plantarum, L.B는 Lactobacillus brevis, L.A는 Lactobacillus acidophilus 이고, (D)에서 E는 대장균, C는 Citrobacter koseri 이며, 각각의 경우에 PC는 양성 기준을, NC는 음성 기준을, L은 세포 파쇄액의 원심분리후 상등액을 가한 경우를, BC는 완충액 기준을 나타낸다.

본 발명은 황색포도상구균 특이적 사멸능(용균능, 항균능)을 갖는 신규한 항균 단백질에 관한 것이다.

박테리오파지는 세균을 감염시키는 바이러스의 일종으로 보통 파지라고 줄여서 부르기도 한다. 박테리오파지는 핵산으로 이루어진 유전물질 중심부를 단백질 외피가 싸고 있는 단순한 구조의 유기체이며 핵산은 단일 사슬이거나 이중 사슬인 DNA 또는 RNA로 되어있다. 박테리오파지는 생존에 숙주가 반드시 필요하며 모든 세균에는 특정 박테리오파지가 존재한다고 알려져 있다. 박테리오파지는 숙주에 침투하여 복제 과정을 끝낸 다음, 숙주인 세균의 세포벽을 분해하기 위해 필요한 일군의 효소를 발현시킨다. 이들 효소는 세포벽의 경직성(rigidity) 및 기계적 강도 (mechanical strength)를 담당하는 세포벽의 뮤레인(murein) 또는 펩티도글리칸 (peptidoglycan) 층을 공격하여 세포벽을 파괴한다.

박테리오파지는 1915년 영국의 세균학자 Twort가 포도상구균(Micrococcus) 집락이 어떤 것에 의해 투명하게 녹는 현상에 대한 연구에서 발견되었다. 또한, 1917년에는 프랑스의 세균학자 d'Herelle이 이질환자 변의 여과액 중에 적리균(Shigella disentriae)을 녹이는 작용을 가진 것이 있다는 것을 발견하고 이에 대한 연구를 통해 독립적으로 박테리오파지를 발견하였으며, 세균을 잡아먹는다는 뜻에서 박테리오파지라고 명명하였다. 이후 이질균, 장티푸스균, 콜레라균 등 여러 병원균에 대한 박테리오파지가 계속적으로 발견되었고 캘리포니아 공과대학의 Delbruck와 제2차 세계대전 중에 미국으로 건너간 유럽의 과학자들에 의해 박테리오파지에 대한 연구가 집중되었다. 그러나, 1950년 Flemming에 의해 페니실린이 발견된 이후, 항생제 사용의 보급화로 인해 일부 동유럽 국가에 한정되어서만 박테리오파지에 대한 연구가 계속되었으며, 2000년 이후에 지속적인 항생제의 오남용으로 인해 다재 내성(Multidrug-resistant)을 지닌 병원성 세균의 출현빈도가 높아지고 기존 항생제의 문제점들이 부각되면서 기존 항생제의 대체 물질로의 개발 가능성 때문에 다시 박테리오파지에 대한 연구가 선진국들을 중심으로 많은 관심을 받으며 진행되고 있다.

비록 항생제(또는 항균제)가 세균 감염에 의한 감염성 질환의 치료에 있어 여전히 주된 방법으로 널리 사용되고 있는 실정이지만, 1980년대 이후 과도한 항생제의 사용으로 더욱 많은 항생제 내성 균주가 발생하고 있으며, 1986년 최후의 항생제로 불리는 반코마이신(Vancomycin)에 내성을 지닌 황색포도상구균 및 다재 내성을 가진 세균이 다수 발견됨으로써 의학계에 큰 충격을 주었다. 반코마이신에 내성을 보이는 반코마이신 내성 장구균(Vancomycin Resistant Enterococci; VRE)은 1986년 프랑스에서 처음 보고 되었고 1988년 미국에서 분리된 이래, 치료가 곤란한 병원감염(nosocomial infections)의 원인균으로서 그 분리 빈도가 해마다 증가하고 있으며 최근에는 유럽, 미국 이외에도 싱가포르, 일본, 오스트레일리아, 한국 등 전 세계적으로 증가하는 추세이다. 국내에서는 1992년에 VRE가 처음 분리되었다. 이에 따라 국민 건강과 의약 기술을 선도할 수 있는 기존 항생제에 내성을 갖는 세균에 의한 질환까지도 치료할 수 있는 새로운 항생 물질의 개발이 시급한 상황이다. 물론 이를 달성하기 위해서는 기존 항생제와는 근본적으로 다른 방법에 의한 새로운 개념의 항생 물질의 개발이 필요하다고 할 수 있다. 이러한 내성세균의 출현에 대한 심각성뿐만 아니라 최근 사회적으로 문제가 되는 항생제의 오남용에 의한 문제 및 항생제 잔류 문제에 대한 새로운 해결책으로 기존 항생제의 대체 물질의 개발 등 대안 마련이 매우 절실한 형편이다.

이를 위하여, 본 발명자들은 황색포도상구균을 특이적으로 사멸시킬 수 있는 신규 박테리오파지를 분리하였으며 이를 농업생명공학연구원에 2006년 6월 14일자로 기탁한 바가 있다(기탁번호 KACC 97001P). 그러나, 상기 신규 박테리오파지는 황색포도상구균에 의한 감염성 질환의 예방 및 치료에 매우 효과적이기는 하지만 몇 가지 단점을 가지고 있으므로, 좀더 다양한 분야에서 응용이 용이하고 보다 안전하게 황색포도상구균을 사멸시킬 수 있는 새로운 물질의 개발이 요구되고 있는 실정이다.

이에, 본 발명자들은 황색포도상구균을 특이적으로 사멸시킬 수 있는 상기 박테리오파지의 유전정보를 이용하여, 황색포도상구균을 특이적으로 사멸시킬 수 있는 신규 항균 단백질을 제공하고, 더 나아가 황색포도상구균에 특이적인 항균 단백질을 이용하여 황색포도상구균에 의해 유발되는 질환의 예방 및 치료 목적으로 이용함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 인체를 포함한 동물의 감염성 질환의 주된 원인균인 황색포도상구균을 특이적으로 사멸시킬 수 있는 신규 항균 단백질을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 항균 단백질을 유효성분으로 포함하는 황색포도상구균에 의해 유발되는 감염성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 항균 단백질을 유효성분으로 포함하는 항생제를 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 또 다른 목적은 상기 항균 단백질을 유효성분으로 포함하는 소독제를 제공하는 것이다.

본 발명은 황색포도상구균(Staphylococcus aureus)에 특이적이고, 서열번호 19로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 항균 단백질 및 이를 코딩하는 유전자를 제공 한다. 본 명세서에서는 용균 현상에 의한 항균 작용을 다른 메카니즘에 의한 항균 작용과 특별히 구별하지 않고 혼용하여 사용하였다.

황색포도상구균은 피부감염, 식중독 등을 일으키는 주요 원인균이고, 국내에서 조사된 항생제 메티실린에 대한 내성률이 평균 73%로 세계 최고 수준인 매우 위해한 병원균이다. 항생제를 써도 죽지 않는 황색포도상구균이 73%가 된다는 뜻으로 내성이 매우 심각한 병원균이라고 할 수 있다.

본 발명자들은 이러한 황색포도상구균을 선택적으로 용균하여 사멸시키기 위해 예의 노력한 결과, 병원체로부터 황색포도상구균을 분리한 후, 상기 황색포도상구균을 특이적으로 사멸시킬 수 있는 신규한 박테리오파지를 선별하였으며, 이렇게 선별된 박테리오파지를 2006년 6월 14일자로 농업생명공학연구원에 기탁하였고(기탁번호 KACC 97001P), 관련 내용을 특허출원한 바 있다(대한민국 특허출원 제2006-55461호).

그러나, 박테리오파지를 직접 사용하는 종래의 방법은 박테리오파지라는 미생물 자체를 이용하는 것에 대한 거부감으로 그 응용에 제약이 따르고, 박테리오파지를 직접 이용하기 위해서는 반드시 숙주인 병원성 세균의 배양 단계가 필요한데, 이로 인해 작업자가 박테리오파지의 생산 과정에서 병원성 세균에 노출될 위험성이 있으며, 이로 인한 병원성 세균의 엄격한 관리가 필요하다는 등의 문제점이 있었다. 이에, 본 발명에서는 박테리오파지를 직접 사용하는 것에 따르는 이러한 문제점을 해결하기 위하여, 황색포도상구균을 특이적으로 용균시킬 수 있는 특정 박테리오파지의 용균 관련 유전자를 이용하여 황색포도상구균을 특이적으로 용균시 킬 수 있는 신규한 항균 단백질을 유전자 재조합 방법을 통하여 생산하여 이용하는 방법을 제공하고자 한다.

박테리오파지의 용균관련 유전자는 박테리오파지의 유전자 발현과정 중 마지막 단계에서 발현되는 유전자로서, 숙주인 세균에서 일정한 수의 자손(progeny)을 형성한 후 박테리오파지가 숙주로부터 방출될 때 필수적으로 요구되는 유전자이다. 일반적으로 홀린(Holin)이라는 용균관련 유전자가 박테리아의 안쪽 세포막에서 발현되고, 리신(Lysin)이라는 용균 관련 유전자는 박테리아의 세포질 내에서 발현되는데, 세포막에 걸쳐 있던 홀린은 세포막에 구멍을 형성하도록 변형되고, 이 생성된 구멍을 통해 세포질 내에 발현되어 있던 리신이 빠져나가면서 펩티도글리칸과 바깥 세포막(outer membrane) 층을 파괴한다고 알려져 있다(Research in Microbiology, 153, 493-501, 2002). 본 발명에서는 이들 용균관련 유전자 중 리신에 속하는 효소 단백질을 항균 단백질로 이용하고자 한다.

일반적으로 리신은 N-말단 작용 부위(N-terminal catalytic domain)와 C-말단 결합 부위(C-terminal binding domain)로 구성되어 있고 두 부위 사이에 짧은 연결쇄(linker)로 연결되어 있다. 통상 N-말단 작용 부위는 1개 내지 4개의 세균의 펩티도글리칸을 절단할 수 있는 활성을 가진다. 드문 경우에 리신은 두 가지 다른 작용 부위(catalytic domain)를 갖는 경우도 있다. C-말단 결합 부위는 목적 박테리아(target bacteria)의 세포벽에서 기질과 결합하는 기능을 한다. 이런 리신의 두 부위는 생물분류의 린네식 계층분류체계에 있어서 동일 강(class)의 경우 작용 부위의 작용 영역(catalytic region)이 보존되며(conserved) 결합 부위는 상 대적으로 다양한(variable) 것으로 알려져 있다. 원래 숙주의 내부에서 생성되는 리신은 외부에서 처리하여도 내부에서와 동일한 세포파쇄(lysis) 효과(용균 효과)가 있음이 입증되어 있다. 또, 드물게 리신이 원래 박테리오파지의 숙주 특이성에 대한 범주를 넘어 다른 종을 사멸할 수 있는 경우도 보고된 바 있다(Journal of Bacteriology, 186, 4808-4812, 2004). 이로부터 리신은 박테리오파지의 특이성을 넘어서 넓은 세균 사멸 능력이 있다고 할 수 있다.

본 발명자들은 상기에서 분리한 박테리오파지의 유전체로부터 용균 작용과 직접적으로 관련이 있는 유전자 부분을 찾아내어, 이로부터 분자생물학 기술 및 생명공학 기술을 이용하여 항균 단백질을 생산, 분리하게 되었다. 상기 항균 단백질은 서열번호 19로 기재되는 아미노산 서열을 포함하며, 이를 코딩하는 유전자는 바람직하게는 서열번호 18로 기재되는 염기 서열을 포함한다.

또한, 본 발명은 상기 박테리오파지 유래의 항균 단백질을 유효성분으로 포함하는, 황색포도상구균에 의해 유발되는 감염성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 명세서에 있어서, '치료'라는 용어는 (ⅰ) 황색포도상구균에 의해 유발되는 감염성 질환의 예방; (ⅱ) 황색포도상구균에 의해 유발된 질환의 억제; 및 (ⅲ) 황색포도상구균에 의해 유발된 질환의 경감을 포괄적으로 의미한다.

본 발명의 약학적 조성물에 포함되는 항균 단백질은 상술한 바와 같이 황색포도상구균을 특이적으로 사멸시키므로, 황색포도상구균에 의해 유발되는 다양한 질환의 치료에 효과를 나타낸다.

황색포도상구균은 가축에서 전염성 유방염을 유발하는 주요 병원균 중 1위를 차지한다. 미국 내 전체 젖소우군의 90%에 황색포도상구균이 존재하고, 전체 젖소의 10%는 이 병원균에 감염되어 있을 것으로 추정되고 있다. 또한, 황색포도상구균은 인체에서는 급성 피부염의 원인균이기도 한데, 이 급성 피부염은 갑자기 패혈증으로 발전하여 환자의 목숨을 앗아가기도 한다. 또 황색포도상구균은 화농성 질환, 땀 냄새, 식중독의 원인균이기도 하다. 따라서, 본 발명의 약학적 조성물은 황색포도상구균에 의해 유발되는 다양한 질환, 예컨대 유방염, 급성 피부염, 패혈증, 화농성 질환, 식중독, 폐렴, 골수염, 농가진, 균혈증, 심내막염, 및 장염 등의 치료에 이용될 수 있다. 본 발명의 바람직한 실시예에 따르면, 본 발명의 항균 단백질을 유방염에 감염된 젖소의 감염 부위에 매일 분무해 주면 유의적 수준으로 유방염이 치료되며, 이를 통해 유방염 치료에 본 발명의 항균 단백질이 효과가 있음을 알 수 있다.

본 발명의 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함 할 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 질환 부위에의 도포 또는 분무하는 방법으로 이용할 수 있으며, 그 밖에 경구 투여 또는 비경구 투여를 통해 투여할 수도 있으며, 비경구 투여의 경우 정맥내 투여, 복강내 투여, 근육내 투여, 피하 투여 또는 국부 투여를 이용하여 투여할 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물의 적합한 도포, 분무 및 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 질병 증상의 정도, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하며, 보통으로 숙련된 의사는 소망하는 치료에 효과적인 투여량을 용이하게 결정 및 처방할 수 있다. 일반적으로, 본 발명의 약학적 조성물은 0.005% (w/v) 내외의 항균 단백질을 포함한다.

본 발명의 약학적 조성물은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화 됨으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수도 있다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 박테리오파지 유래의 항균 단백질을 유효성분으로 포함하는 화장품용 항균제 및 의약용 항생제를 제공한다.

황색포도상구균은 고초균(Bacillus subtilis), 대장균 및 녹농균(Pseudomonas aeruginosa) 등과 함께 화장품에서 자주 발견되는 유해균이기도 하다. 화장품은 기름이나 물을 주성분으로 하며, 미생물의 탄소원이 되는 글리세린이나 솔비톨 등과 질소원이 되는 아미노산 유도체, 단백질 등이 배합된 것이 많으므로 세균 등의 미생물 침투가 용이하다. 또, 식품에 비하여 사용기간이 매우 길기 때문에 미생물에 의한 오염 위험이 훨씬 크다고 할 수 있다. 사용함에 따른 미생물 오염으로 나타나는 변색이나 변취 등으로부터 화장품을 장기간 보호하기 위하여 항균제의 첨가가 필수적이다.

화장품에 가장 널리 사용되고 있는 파라벤류와 같은 합성방부제는 최근 그 위험성이 부각되고 있고, 특히 유방암 환자의 유방암 부위에 방부제가 축적되었다는 사실이 최근 알려지면서 아무런 경각심 없이 사용되고 있는 합성 방부제 함유 화장품이 예상 외로 위험할 수도 있다고 인식되고 있다. 또, 미국 피부과학회는 합성 방부제를 피부 알레르기 유발 원인물질 2위에 올려놓은 바도 있다. 이와 함께 최근에는 어린이용 제품에 대한 인공 합성 방부제의 사용은 어린 시절부터 방부제 함유제품을 사용하게 함으로써 방부제의 사용기간과 양을 성인에 비해 늘릴 수 있기 때문에 더욱 위험할 수도 있다는 우려가 있어 새로운 천연유래의 방부제의 개발이 절실히 요구되고 있는 실정이다.

본 발명의 박테리오파지 유래의 항균 단백질은 기존 항생제에 비하여 황색포도상구균에 대한 특이성이 매우 높다는 장점을 갖고 있다. 이는 유용한 균은 죽이지 않고 병원균인 황색포도상구균만을 선택적으로 죽일 수 있으므로 통상의 항생제 사용에서 나타나는 부작용이 없는 항생제로서 매우 가치가 있다고 할 수 있다. 또한, 본 발명의 항균 단백질은 상기 항균 단백질이 유래된 박테리오파지 자체보다 용균 효과를 보이는 황색포도상구균의 범위가 더 넓다는 장점을 제공한다(즉, 더 넓은 활성 스펙트럼을 갖고 있음).

본 발명의 황색포도상구균에 특이적인 박테리오파지 유래의 항균 단백질을 항생제로 이용하게 되면 기존의 항생제를 이용하는 것과는 달리 병원균의 내성 내지 저항성(resistance)을 유도하지 않는다는 중요한 장점을 갖기 때문에 기존의 항생물질에 비하여 제품수명(life cycling)이 긴 신규 항생제로서 제공될 수 있다. 대부분의 항생 물질들은 내성 증가에 직면함에 따라 갈수록 사용범위가 줄어들 수밖에 없는데 반해, 본 발명의 박테리오파지 유래의 항균 단백질을 유효성분으로 포함하는 항생제는 항생제 내성 문제를 근본적으로 해결할 수 있기에 그 만큼 항생제로서의 제품수명이 길어질 것으로 기대된다. 따라서, 병원성 세균인 황색포도상구균을 특이적으로 사멸시키는 본 발명의 박테리오파지 유래의 항균 단백질을 유효성분으로 포함하는 항생제는 항균 효과, 살균 효과 및 방부 효과가 뛰어난 항생제로서 유용하게 사용될 수 있다. 본 명세서에 있어서, '항생제’라는 용어는 방부제, 살균제 및 항균제를 총칭한다.

또한, 본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 박테리오파지 유래의 항균 단백질을 유효성분으로 포함하는 소독제를 제공한다.

병원감염에서 분리되는 균의 분포는 시대에 따라 변화하고 있다. 미국의 NNIS (National Nosocomial Infection Surveillance System)에서 이러한 경향을 잘 볼 수 있는데, 1980년대 후반부터는 그람양성균, 특히 황색포도상구균의 분리가 증가하고 있으며, 이러한 경향은 국내에서도 볼 수 있다. 1985년 국내 조사에 의하면 대장균, 녹농균, 코아굴레이스 음성 포도상구균(coagulase negative Staphylococcus), 황색포도상구균의 순으로 나타났으나, 그 후 점차 황색포도상구균의 분리가 증가하고 있으며, 1996년 대한병원감염관리학회의 조사에 따르면 황색포도상구균이 전체의 17.2%를 차지하였고, 다음으로 녹농균이 13.8%, 그 다음으로 대장균이 12.3%의 순이었다. 그리고 분리된 전체 황색포도상구균의 78.8%는 기존 항생제에 대한 내성을 가졌다.

이러한 점을 고려한다면, 황색포도상구균에 대해 특이적인 사멸능을 갖는 본 발명의 박테리오파지 유래의 항균 단백질을 유효성분으로 포함하는 소독제는 병원감염을 막기 위한 병원 및 보건용의 소독제로 유용하게 사용될 수 있고 또한, 일반 생활 소독제, 식품 및 조리 장소 및 조리 설비의 소독제, 축산산업의 축사 소독제로서 유용하게 사용될 수 있다. 특히 박테리오파지라는 미생물 자체의 이용이 아닌 단백질 형태의 이용이므로 식품 및 조리 장소에 거부감 없이 이용되어질 수 있다.

이하, 실시예에 의거하여 본 발명을 보다 구체적으로 설명하지만, 이들 실시예는 본 발명의 예시일 뿐이며 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 병원체로부터 황색포도상구균의 분리 및 황색포도상구균을 특이적으로 사멸시킬 수 있는 박테리오파지의 분리

1-1: 황색포도상구균의 분리

박테리오파지는 자연계에 널리 존재하는데, 특히 세균이 존재하는 곳에 공생하는 경우가 많다. 본 발명자들은 황색포도상구균에 특이적으로 감염하는 파지를 분리하기 위해 기본적으로 황색포도상구균이 존재할 것으로 예상되는 곳을 기반으로 시료를 채집한 후 실제로 황색포도상구균이 존재하는 지를 황색포도상구균 선택배지인 Baird-Parker 아가(agar) 배지를 이용하여 조사하였다.

이를 상세히 설명하면, 대상 세균인 황색포도상구균을 병원체로부터 분리하고자 선택한 질환은 젖소 유방염이었다. 유방염은 황색포도상구균에 의해 발병되는 대표적 질환 중의 하나이다. 유방염에 감염된 젖소의 우유에서 채취한 시료로부터 황색포도상구균의 선택배지인 Baird-Parker 아가 배지를 이용하여 황색포도상구균을 획득하였고 얻어진 황색포도상구균을 그람염색법(Gram staining method), 카탈라아제 조사(catalase test)와 bioMerieux 사의 Vitek을 이용한 생화학적 조사를 통해 선별된 균이 황색포도상구균임을 최종적으로 확인하였다. 그 결과는 다음 표 1과 같다.

Vitek ID		200000-0 (A1-18) 카탈라아제 + 코아귤라아제(Coagulase) +
타입		그램 양성 동정(identification) 카드(GPI)
상태		최종
경과 시간		5 시간
생물		황색포도상구균
PB +	BAC -		OPT +	HCS +	6NC +	10B +
40B -	ESC -		ARG -	URE -	TZR +	NOV -
DEX +	LAC +		MAN +	RAF -	SAL -	SOR -
SUC +	TRE +		ARA -	PYR +	PUL -	INU -
MEL -	MLZ -		CEL -	RIB -	XYL -	CAT +
BH/CO +

1-2: 황색포도상구균에 특이적인 박테리오파지의 분리

다음 단계로서, 분리된 황색포도상구균에 특이적인 박테리오파지를 분리하기 위해 박테리오파지가 있을 것으로 예상되는 시료를 황색포도상구균과 함께 배양한 후 이 배양액을 원심분리하고 여과한 다음, 파지 분리를 위한 미끼가 되는 배양된 황색포도상구균과 함께 다시 배양하여 황색포도상구균의 사멸 여부를 확인하였다. 사멸 여부확인은 최종적으로 용균반 분석을 통해 판별하였다.

이를 상세히 설명하면, 황색포도상구균을 선택적으로 사멸시킬 수 있는 박테리오파지를 분리하기 위하여 박테리오파지가 존재할 것이라 예상되는 우사 내의 토양, 지푸라기, 흙, 및 하수 등에서 검체를 채집한 후, 상기 실시예 <1-1>에서 얻은 황색포도상구균과 함께 37℃에서 3-4시간동안 진탕배양 후, 8,000 rpm에서 20분간 원심분리하여 상등액을 회수하였다. 회수된 상등액을 0.45 ㎛의 필터를 이용하여 여과하였다. 이렇게 얻어진 여과액을 이용한 용균반 분석을 통해 황색포도상구균에 특이적인 박테리오파지를 검출하였다(도 1). 이 때 사용한 방법의 모식도가 도 2에 개시되어 있다.

얻어진 박테리오파지의 형태를 관찰하기 위해 염화세슘(CsCl) 밀도 구배법 (밀도: 1.15 g/㎖, 1.45 g/㎖, 1.50 g/㎖ 및 1.70 g/㎖)을 이용한 원심분리 (38,000 rpm, 22시간, 4℃)를 통해 박테리오파지를 정제한 다음, 이를 구리 격자(cupper grid)에 묻히고, 2% 유라닐 아세테이트(Uranyl acetate)로 역염색법(negative staining)과 건조를 수행한 후, 투과전자현미경을 통해 그 형태를 촬영하였다. 그 결과, 분리된 박테리오파지가 형태학적 분류상 미오비리대 과 T4-유사 파지 속에 속하는 것을 확인할 수 있었다(도 3).

실시예 2: 황색포도상구균에 특이적인 분리된 박테리오파지의 유전적 특성 분석

얻어진 박테리오파지의 유전자 서열분석을 실시하였다. 이를 위해 박테리오파지의 유전체(genome)를 통상의 방법으로 추출한 다음 유전적 특성을 분석하였다. 구체적으로, 먼저 1 ℓ 플라스크에 TSB(Tryptic Soy Broth) 배지(카제인 다이제스트, 17 g/ℓ; 소이빈 다이제스트, 3 g/ℓ; 덱스트로스, 2.5 g/ℓ; NaCl, 5 g/ℓ; 디포타슘 포스페이트, 2.5 g/ℓ) 200 ㎖와 600 nm에서 흡광도가 1인 황색포도상구균 부유액 50 ㎖ 및 108 pfu/㎖ 수준으로 여과한 박테리오파지 용액 1 ㎖을 첨가하여 37℃에서 3-4시간 진탕배양 하였다. 배양 후, 황색포도상구균이 용균되었는지 여부를 확인한 다음, 용균이 일어났을 때 이 배양액을 0.45 ㎛의 필터로 여과해 주었다. 그 후 여과액에 여과액 부피의 6분의 1 부피에 해당하는 20%의 수분자량 8,000의 폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycol)/2.5 M NaCl 수용액을 첨가한 다음, 4℃에서 하룻밤 동안 정치시켰다. 그 후 정치한 액을 8,000 rpm에서 20분간 원심분리하여 박테리오파지를 침전물로부터 회수하였다. 이렇게 얻어진 박테리오파지 침전물을 인산완충식염수(phosphate buffer saline; PBS) 1 ㎖로 부유시킨 후, 다시 20% 폴리에틸렌 글리콜 8,000/2.5 M NaCl 수용액을 6분의 1 부피만큼 첨가한 다음 4℃에서 1시간 동안 정치시켰다. 1시간이 지난 후, 정치했던 액을 14,000 rpm에서 10분간 원심분리하여 정제된 박테리오파지 침전물을 얻었다. 이 침전물을 요오드 완충액(iodide buffer; 10 mM Tris-HCl (pH 8.0),1 mM EDTA, 4 M NaI) 200 ㎕를 이용해 가볍게 섞어준 다음 이를 15분간 상온에서 정치한 후 DNeasy 티슈(Tissue) 키트(Kit)(QIAGEN사)와 PCR 정제 키트(Labopass사)를 이용하여 박테리오파지의 유전체를 추출하였다.

위와 같이 분리된 박테리오파지의 유전체는 게놈 DNA(genomic DNA; gDNA)이다. 이 gDNA의 유전자 서열을 분석하기 위해 먼저 다양한 제한효소(restriction enzyme)로 처리하여 제한효소 처리에 따른 절단 양상을 일차적으로 파악하였다. 그 결과, 제한효소 Msp I을 이용하는 경우가 gDNA의 라이브러리(library) 구축에 가장 적합하다고 판단되어 Msp I 처리 유전자 단편(fragment)을 이용한 gDNA의 라이브러리를 통상의 방법에 따라 구축하였다. gDNA의 라이브러리 구축에 사용된 방법이 모식적으로 도 4에 제시되어 있다.

이를 상세히 설명하면, 먼저 다양한 유전자 단편을 얻기 위해서는 특정 제한 효소(본 경우에는 Msp I)에 의한 부분적 절단(partial digestion)이 달성되는 조건의 선택이 필요한데, 미리 조사해 본 결과에 의하면 Msp I으로 gDNA를 30℃에서 1분간 처리하였을 경우가 라이브러리 구축에 가장 적합한 부분적 절단 결과를 보였다. 따라서, 이 조건을 Msp I에 의한 박테리오파지 gDNA의 부분적 절단 조건으로 하였다. 이 조건을 따라 gDNA를 부분적으로 절단시킨 후, 절단되어 유리된 유전자 단편들을 T4 리가아제(ligase)를 이용해 pBluescript II SK(+) 파지미드 벡터(phagemid vector)(Stratagene사)에 도입시켰다. 이렇게 하여 준비된 박테리오파지의 유전자 단편이 도입된 재조합 벡터를 전기천공법(electroporation)이라는 전기적 형질전환 방법(electro-transformation)을 통해 대장균의 한 종인 Top10F' 종 (Invitrogen사)에 도입시켰다. 이렇게 하여 형질전환된 형질전환체를 엑스-갈(X-Gal; 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-beta-D-galactopyranoside) 및 이소프로필 베타-디-1-티오갈락토피라노시드(isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside; IPTG)가 첨가된 암피실린(ampicillin) 함유 아가 평판배지 상에서 통상의 청백 콜로니 선별법(Blue-White colony selection)을 통해 선별하였다. 선별된 단일 콜로니(colony)를 암피실린이 포함된 배양배지에 접종한 후 하룻밤동안 진탕배양하였다. 이 배양 세포로부터 플라스미드(plasmid) 정제 키트(iNtRON사)를 이용하여 플라스미드를 추출하였다. 이 추출된 플라스미드는 0.8% 아가로즈 젤을 이용한 전기영동을 통하여 그 크기를 확인하였으며 확인된 크기를 바탕으로 재조합된 플라스미드를 선별하였다. 이 과정을 보여주는 실험 결과가 도 5에 제시되어 있다.

이렇게 선별된 플라스미드는 51개였으며 이에 해당하는 클론(clone)도 당연히 그 플라스미드 수만큼 51개를 얻을 수 있었다. 이 클론들을 다시 배양하여 배양 세포로부터 다시 플라스미드를 상기 방법과 같이 추출하였고, 추출된 플라스미드를 이용하여 염기 서열을 분석하였다. 염기 서열 분석은 통상의 염기 서열 분석에서 널리 이용되는 프라이머(primer)인 서열번호 1로 기재되는 M13 정방향(forward) 프라이머와 서열번호 2로 기재되는 M13 역방향(reverse) 프라이머를 이용해 수행하였다. 이렇게 하여 얻어진 유전자 서열을 NCBI Blast 프로그램을 이용해 분석한 결과가 도 6에 제시되어 있다.

분석된 박테리오파지 염기 서열을 바탕으로 분석된 염기 서열이 실제 유전체상에서 어느 위치에 속하는지를 개략적으로 알기 위해 분석된 염기 서열의 콘티그 지도를 작성하였다(도 7 참조). 그리고, 이 염기 서열의 유전적 기능을 파악하기 위해 번역영역(open reading frame; ORF) 분석을 NCBI Blast와 Vector NTI ContigExpress (INFORMAX사) 프로그램을 이용하여 실시하였으며, 그 결과를 도 8에 나타내었다.

실시예 3: 용균관련 유전자의 클로닝

실시예 2의 번역영역 분석을 통해 용균에 관여하는 단백질 영역으로 알려진 CHAP 영역을 찾을 수 있었다(도 8 참조). 확인된 ORF 5 및 ORF 33에서의 CHAP는 세균의 용균에 관여하는 단백질 영역으로 알려져 있다. 본 발명자들은 실제 용균관련 유전자가 유전체상의 어디에 포함되어 있는지 확인하기 위해, 분리된 박테리오파지가 종래에 알려진 박테리오파지 G1(Bacteriophage G1), 황색포도상구균 파지 K(Staphylococcus phage K)와의 상동성을 가질 것이라는 가정 하에, 먼저 이 두 박테리오파지의 공지된 유전체의 염기 서열(박테리오파지 G1의 염기 서열에 해당하는 진뱅크 접근번호는 AY954969이고 황색포도상구균 파지 K의 염기 서열에 해당하는 진뱅크 접근번호는 AY176327임)을 바탕으로 하여 용균관련 유전자의 염기 서열을 조사하였다.

그 결과, 박테리오파지 G1의 경우에는 유전체의 전체 염기 서열 중 132132-132935bp 영역의 ORF042와 전체 염기 서열 중 132935-133438bp 영역의 ORF083이 용균관련 유전자 서열임을 확인하였고, 황색포도상구균 파지 K의 경우에는 유전체의 전체 염기 서열 중 27072-29435bp 영역의 ORF30/32와 전체 염기 서열 중 29435-29938bp 영역의 ORF33이 용균관련 유전자 서열임을 확인할 수 있었다. 이 두 파지 중 박테리오파지 G1이 상기 실시예 <1-1>에서 분리된 박테리오파지와의 전체적인 염기 서열 분석결과에서 가장 상동성 있는 결과를 보였다는 사실을 바탕으로 박테리오파지 G1 유전체의 염기 서열을 기반으로 분리된 박테리오파지로부터 얻은 유전체에서 용균관련 유전자 서열만을 증폭하고자 다음과 같은 프라이머를 설계 및 합성하였다(표 2).

프라이머	염기 서열
ply1-1F	서열번호 3
ply1-2R	서열번호 4

이 프라이머들을 이용해서 기 분리된 박테리오파지로부터 추출한 유전체를 주형으로 한 PCR 반응을 수행하였다. 이 때 사용 조건은 95℃로 2분 가온한 다음, 94℃에서 30초 가온, 50℃에서 30초 가온, 72℃에서 1분 20초 가온, 72℃에서 7분 가온하는 단계로 구성된 일련의 과정을 총 35회 반복한 후, 이를 최종적으로 4℃에서 방치하는 조건이었다. 그 결과, 약 1.3 kb 크기의 PCR 산물을 확인할 수 있었으며 이렇게 얻어진 PCR 산물을 아가로즈 젤을 이용한 전기영동을 실시한 다음 아가로즈 젤에서 PCR 산물을 용출하였다.

상기 PCR 산물을 pGEM-T 이지 벡터(Promega사)로 제조자의 지시에 따라 도입하였다. 이렇게 하여 준비된 재조합 플라스미드를 전기천공법을 통하여 대장균의 한 종인 Top10F' 종에 도입시켰다. 이렇게 하여 얻어진 형질전환체를 배양한 다음 통상의 방법에 따라 플라스미드를 추출하였다. 이렇게 추출된 플라스미드를 제한효소 EcoR I으로 절단한 후 이를 아가로즈 젤을 이용한 전기영동을 통하여 PCR 산물이 벡터 내로 삽입된 재조합 플라스미드를 선별하였다.

실시예 5: 용균관련 유전자의 CHAP 영역부분의 서열 분석

실시예 4에서 선별된 재조합 플라스미드를 이용하여 통상의 방법에 따라 클로닝된 유전자의 서열 분석을 실시하였다. 염기 서열 분석에는 M13 정방향 프라이머와 M13 역방향 프라이머를 사용하였다. 염기 서열 분석을 통해 확인된 서열을 NCBI blast 프로그램으로 분석한 결과, 클로닝한 유전자가 용균관련 유전자임을 확인할 수 있었다(도 9 참조). 보다 완벽한 용균관련 유전자의 염기 서열 분석을 위해 서열 분석용 프라이머를 새로이 제작하여 서열분석을 추가로 수행하였다. 이 때 사용한 서열 분석용 프라이머는 다음 표 3과 같다.

프라이머	염기 서열
SEQ-1	서열번호 5
SEQ-2	서열번호 6
SEQ-3	서열번호 7

추가 염기 서열 분석을 통하여 얻어진 최종적인 용균관련 유전자(이 경우는 CHAP임)의 염기 서열을 유사성이 높았던 박테리오파지 G1의 염기 서열과 Vector NTI AlignX (INFORMAX) 프로그램을 이용해 비교해 보았다. 그 결과, 총 염기 서열 1,307 bp 중 58 곳이 서로 차이가 나는 것을 확인할 수 있었다. 상기 유전자는 서열번호 8로 기재되는 염기 서열을 가지며, 이 유전자로부터 번역될 단백질은 서열번호 9로 기재되는 아미노산 서열을 갖는다.

실시예 6: 용균관련 유전자의 전체 서열 분석

실시예 5에서 확인된 서열은 용균관련 유전자의 CHAP 영역 부분에 해당되는데, 상동성을 가지고 있는 박테리오파지 G1과 황색포도상구균 파지 K의 용균관련 유전자는 CHAP 영역과 아미다제(amidase) 영역 사이에 인트론(intron) 서열로 연결되어 있으므로, 본 발명의 용균관련 유전자도 실시예 5에서 확인된 용균관련 유전자인 CHAP 영역 부분 외에 추가의 용균관련 유전자 영역이 있을 것으로 예상되어 실시예 5에서 밝혀진 CHAP 영역의 유전자 서열을 이용하여 추가의 클로닝 및 유전자 서열 분석을 실시하였다. 이를 위하여 다음과 같은 프라이머를 새로이 설계, 합성하였다(표 4).

프라이머	염기 서열
Nco-Lysin F	서열번호 10
Not-Lysin R	서열번호 11

이 프라이머들을 이용해서 분리한 박테리오파지로부터 확보한 유전체를 주형으로 PCR 반응을 또 한번 수행하였다. 이 때 사용한 조건은 95℃로 2분 가온한 다음, 94℃에서 30초 가온, 52℃에서 30초 가온, 72℃에서 1분 20초 가온, 72℃에서 7분 가온하는 단계로 구성된 일련의 과정을 총 30회 반복한 후, 이를 최종적으로 4℃에서 방치하는 조건이었다. 그 결과, 약 1.3 kb 크기의 PCR 산물을 얻을 수 있었다. 이렇게 얻어진 PCR 산물을 아가로즈 젤을 이용한 전기영동을 실시한 후, 젤에서 PCR 산물을 용출하였다. 이를 실시예 4에서와 동일한 방법으로 pGEM-T 이지 벡터(Promega사)에 도입시켰다. 이렇게 새로이 준비된 재조합 플라스미드를 전기천공법을 통해 대장균의 한 종인 Top10F' 종에 도입시켰다. 이렇게 하여 얻어진 형질전환체를 배양한 다음 통상의 방법에 따라 플라스미드를 추출하였다. 이렇게 추출된 플라스미드를 제한효소 Not I으로 절단한 후 이를 전기영동하여 PCR 산물이 벡터 내로 삽입되었는지를 확인하여 PCR 산물이 삽입된 재조합 플라스미드를 선별하였다.

이렇게 선별된 재조합 플라스미드를 이용하여 통상의 방법에 따라 클로닝된 유전자의 염기 서열 분석을 실시하였다. 염기 서열 분석에는 M13 정방향 프라이머와 M13 역방향 프라이머를 사용하였다. 염기 서열 분석을 통하여 추가로 확인된 서열은 NCBI blast 프로그램을 이용하여 유전자 분석을 실시하였으며, 그 결과, 클로닝한 유전자가 용균관련 유전자의 아미다제 영역임을 확인할 수 있었다(도 10 참조). 확인된 해당 아미다제 유전자는 서열번호 12로 기재되는 염기 서열을 가지며, 이 유전자로부터 번역될 단백질은 서열번호 13으로 기재되는 아미노산 서열을 갖는다. 이렇게 밝혀진 서열은 용균관련 유전자의 또 한 부분인 아미다제 영역 부분에 해당한다. 이렇게 하여 확보된 CHAP 영역 및 아미다제 영역을 포함한 전체 용균관련 유전자의 서열을 확보하기 위해서 새로이 프라이머를 준비하였다. 새로이 준비된 프라이머는 다음 표 5와 같다.

프라이머	염기 서열
Lys SEQ F	서열번호 14
Lys SEQ R	서열번호 15
NLys SEQ F	서열번호 16
NLys SEQ R	서열번호 17

이 프라이머를 이용한 유전자 서열 분석을 통하여 얻어진 용균관련 유전자의 전체 서열은 서열번호 18로 기재되는 염기 서열을 가지며, 이 유전자 서열로부터 번역될 단백질은 서열번호 19로 기재되는 아미노산 서열을 갖는다.

실시예 7: 용균관련 유전자의 발현 벡터 제작

용균관련 유전자(CHAP 영역 및 아미다제 부분 포함)로부터 목적하는 항균 단백질의 발현을 위해 pBAD-TOPO 벡터(Invitrogen 사)를 이용하여 단백질 대량 발현 벡터시스템을 구축하였다. 이를 위하여, 하기 표 6에 제시된 프라이머를 이용하여 박테리오파지로부터 추출한 유전체를 주형으로 한 PCR 반응을 수행한 다음, 그 PCR 산물을 회수하였다.

프라이머	염기 서열
Nco-Lysin F	서열번호 20
Not-Lysin R	서열번호 21

회수된 PCR 산물을 제한효소 Nco I과 Not I으로 처리하여 제한효소 처리된 DNA 단편을 통상의 방법으로 회수한 다음, 이 회수된 DNA 단편을 pBAD-TOPO 벡터 내에 미리 존재하는 Nco I과 Not I 클로닝 위치를 이용하여 pBAD-TOPO 벡터로 클로닝하였다. 전체 용균관련 유전자를 가지고 있을 것으로 기대되는 재조합 pBAD-TOPO 벡터 기반의 항균 단백질 발현 벡터를 이용하여 대장균 BL21 (DE3)을 형질전환 시켰다.

실시예 8: 항균 단백질의 과발현

실시예 7에서 제작된 재조합 플라스미드로 형질전환된 대장균을 배양한 다음 통상의 방법에 따라 플라스미드를 추출하였다. 추출된 플라스미드를 Nco I과 Not I으로 처리하여 클로닝이 제대로 된 플라스미드를 선별한 후, 선별된 플라스미드를 가지고 있는 형질전환체를 이용하여 항균 단백질을 과발현시켰다. pBAD-TOPO 벡터 기반의 발현시스템은 L-아라비노즈(arabinose)를 이용하여 발현을 유도(induction)하는 방식으로, 박테리아에 해로운(toxic) 유전자의 경우에도 원활히 발현시킬 수 있는 장점을 지닌 발현 벡터 시스템이다(제작사의 "pBAD expression system"이라는 제목의 설명서 및 제작사의 2004년 발행 설명서 25-0257호 참조). 형질전환체를 배양배지(TSA 배지)에 접종한 후, 세포 농도가 600 nm에서의 흡광도 기준으로 0.8에서 1 사이가 되었을 때, 최종 농도가 0.2%가 되도록 L-아라비노즈를 첨가하여 항균 단백질의 발현을 유도하였다. 발현 유도를 한 후 4시간 동안 더 세포를 배양해 준 다음, 세포 배양액 1 ㎖을 취하여 8,000 rpm에서 5분간 원심분리하여 세포 침전물을 회수하였다. 회수된 세포 침전물에 1% SDS 용액 100 ㎕를 가하여 세포를 파쇄한 다음, 세포 파쇄액 중 12 ㎕를 취하여 전기영동용 시료로 사용하였다. 취한 세포 파쇄액에 통상의 전기영동에 사용되는 5× 전기영동용 샘플 완충액(sample loading buffer) 3 ㎕를 첨가하여 잘 혼합하고 5분간 물중탕으로 끓여주는 방식으로 시료를 처리한 다음, 통상의 방법에 따라 전기영동을 실시하여 과발현된 항균 단백질을 확인하였다. 그 결과가 도 11에 제시되어 있다.

도 11의 레인 5 및 레인 6은 CHAP 영역(위 밴드)과 아미다제 영역(아래 밴드)이 따로 발현되도록 제작된 벡터를 이용한 항균 단백질 발현에 해당하는데, 이렇게 준비된 시료로는 기대한 용균 활성을 얻을 수 없어 본 발명에서는 레인 7과 8에서처럼 CHAP 영역 및 아미다제 영역을 모두 포함하는 전체 항균 단백질을 하나의 완전한 단백질로 발현되도록 제작된 벡터를 이용하는 발현시스템을 항균 단백질 생산에 이용하였다.

실시예 9: 발현된 항균 단백질의 용균 활성 조사

발현된 항균 단백질의 용균 활성을 확인하기 위해, 생산 균주인 대장균 형질전환체의 배양액(통상의 LB 배지; 박토-트립톤 10 g/ℓ, 효모 추출물 5 g/ℓ, 염화나트륨 10 g/ℓ) 100 ㎖을 취한 다음 8,000 rpm에서 5분간 원심분리하여 세포를 침전물 형태로 회수하였고 이 세포 침전물에 80 mM 트리스-염산(Tris-HCl, pH 7.6) 완충액 1 ㎖을 사용하여 세포 침전물을 부유시켰다. 이 세포 부유액에 부유되어 있는 세포를 초음파 분쇄법(sonication)을 사용하여 파쇄하였다. 초음파 분쇄법의 적용 조건은 20초씩 초음파를 가하여 세포를 깨고 5초간 멈추는 것을 총 20분간 반복하여 실시하였다. 이렇게 하여 얻어진 세포 파쇄액(whole cell lysate)을 다시 한 번 원심분리하여(10,000× g, 5분) 침전물과 상등액으로 구분하여 회수하였고, 이렇게 얻어진 세포 파쇄액, 침전물, 및 상등액을 이용하여 발현된 항균 단백질의 활성을 확인해 보았다. 여기서 얻어진 침전물에는 세포 찌꺼기(cell debris) 외에도 불용성 물질이 포함되어 있게 되고, 상등액에는 수용성 물질이 포함되어 있게 된다. 따라서, 발현된 항균 단백질이 수용성이면 상등액에서 용균 활성이 높을 것이고 불용성이면 활성을 가진 부분이 없거나 또는 침전물에서 높은 용균 활성을 보일 것이다. 용균 활성 확인에 사용된 박테리아는 우선 본 발명자들이 임상적으로 분리하여 기 확보하고 있던 황색포도상구균 2종을 대상으로 실시하였다.

실험방법은 TSA 배지에 600 ㎚에서 흡광도가 1 정도 되는 황색포도상구균 배양액 1 ㎖을 각각 평판배지에 도말하여 말린 후, 앞에서 준비한 세포 파쇄액 5 ㎕, 세포 파쇄액의 원심분리 후의 침전물을 트리스-염산 완축액 20 ㎕에 부유한 액 5 ㎕, 및 세포 파쇄액의 원심분리 후의 상등액 5 ㎕를 각각 떨어뜨린 후 37℃ 배양기에서 밤새도록 배양하여 황색포도상구균의 용균 정도를 확인하였다.

그 결과, 항균 단백질을 발현시키지 않은 시료는 전혀 용균 효능을 보이지 못했으며, 항균 단백질을 발현한 경우에만 기대한 용균 효과를 확인할 수 있었다. 또한 세포 파쇄액, 침전물, 및 상등액 모두에서 일정 정도의 활성을 확인할 수 있었으나 상등액에서 가장 용균 활성이 우수한 것으로 미루어 발현된 항균 단백질은 주로 수용성의 형태로 발현됨을 알 수 있었다(도 12). 도 12의 (A) 및 (B)에서 항균 단백질에 의한 용균 작용으로 투명해 지는 용균반이 형성되는 것을 확인할 수 있었다. 참고로 (A)의 위부분의 P, (B)의 위부분의 W, P, S에서의 흰색 원은 원형으로 준비된 필터 종이에 항균 단백질을 포함한 세포 파쇄액, 침전물, 상등액을 적시어 평판배지에 올려 둔 경우에 해당하는데, 직접 세포 파쇄액, 침전물, 상등액을 떨어뜨린 아랫부분의 실험 경우에 비하여 용균반 형성이 다소 미미하였으나 필터 종이 주위에 용균반이 역시 형성됨을 확인할 수 있었다. 이 미미한 용균반 형성은 본 실험에서 필터 종이에 적용한 항균 단백질이 지나치게 적어서 생긴 결과임을 별도의 실험을 통하여 확인할 수 있었다.

용균 활성이 확인된 항균 단백질에 의한 다른 박테리아에서의 용균 활성을 추가로 조사해 보았다. 이를 위해 앞서 분석한 방법과 동일하게 각 세균을 배양한 후 평판배지에 도말한 다음, 항균 단백질액(여기서는 앞 실험에서의 세포 파쇄액의 원심분리 후의 상등액에 해당) 5 ㎕씩을 떨어뜨린 후 37℃에서 밤새도록 배양하여 항균 단백질의 용균 활성을 조사하였다. 그람 양성 박테리아(Gram positive bacteria)와 황색포도상구균의 경우에는 일반적으로 이들의 세포 파쇄(Lysis)에 사용되는 물질인 리소스타핀(lysostaphin)을 5 ㎎/㎖ 농도로 함유하는 용액을 양성 기준(positive control)으로 사용하였으며, 그람 음성 박테리아(Gram negative bacteria)의 경우에는 리소자임(lysozyme)을 10 ㎎/㎖ 농도로 함유하는 용액을 양성 기준으로 사용하였으며, 항균 단백질을 포함한 세포 파쇄액을 얻을 때 사용한 완충액인 80 mM의 트리스-염산 완충액을 완충액 기준(buffer control)으로 사용하였고, 통상의 인산완충식염수를 음성 기준(negative control)으로 사용하였다. 실험에 사용된 박테리아는 총 18 종이며 그 각각에 대한 요약은 다음의 표 7과 같다.

약자	기원	박테리아
SAU-YH	bovine mastitis	Staphylococcus aureus
SAU-HR1	bovine mastitis	Staphylococcus aureus
SAU-HR2	bovine mastitis	Staphylococcus aureus
SAU-HR3	bovine mastitis	Staphylococcus aureus
ATCC 31886	bovine mastitis	Staphylococcus aureus
E.FAL	bovine mastitis	Enterococcus faecalis
E.FAC	bovine mastitis	Enterococcus faecium
S.agal1	bovine mastitis	Streptococcus agalactiae
S.agal2	bovine mastitis	Streptococcus agalactiae
S.U1	bovine mastitis	Streptococcus uberis
S.U2	bovine mastitis	Streptococcus uberis
L.L	porcine intestine	Lactococcus lactis
L.R	porcine intestine	Lactobacillus reuteri
L.P	porcine intestine	Lactobacillus plantarum
L.B	porcine intestine	Lactobacillus brevis
L.A	porcine intestine	Lactobacillus acidophilus
E	bovine mastitis	Escheria coli
C	bovine mastitis	Citrobacter koseri

용균 활성 조사 결과는 도 13에 제시되어 있는데, 조사한 황색포도상구균에서는 본 발명에서 개시한 항균 단백질이 모두 용균 활성을 가짐을 확인할 수 있었으며, 임상 분리된 연쇄상구균(Streptococcus)의 경우에는 본 발명에서 개시한 항균 단백질에 의한 용균 활성이 없음을 확인하였다. 또, 유산균인 Lactococcus lactis와 유산균속(Lactobacillus)의 박테리아 경우에도 용균 활성이 없음을 확인하였고, 임상 분리된 대장균(E. coli)과 대장균형 박테리아(Coliform bacteria)에서도 용균 활성이 없음을 확인하였다. 이로부터 본 발명에서 분리한 항균 단백질은 황색포도상구균만을 특이적으로 용균시키는 특이성을 가지고 있다고 할 수 있다.

한편, 본 항균 단백질의 기원이 되는 박테리오파지 자체는 비록 황색포도상구균에 대해 용균능을 가지고 있기는 하였으나, 도 13의 (A)에 있는 황색포도상구균 중 S2에 대해서만 용균 활성을 가졌고 다른 황색포도상구균에 대해서는 용균 활성을 갖지 못한 것에 비하여, 본 발명의 항균 단백질은 S2을 포함하여 조사된 모든 황색포도상구균에 대하여 용균 활성을 가지고 있었다. 이로서 본 발명에서 개시된 항균 단백질은 기원이 되는 박테리오파지 보다 그 용균 작용의 대상이 더 넓어졌다고 할 수 있다.

참고로, 도 13의 결과에 대해서 좀 더 자세히 설명하면, (A)에서는 양성 기준인 PC와 항균 단백질을 처리한 L에서 투명하게 보이는 용균반이 형성됨을 확인할 수 있고, (B)에서는 투명해지는 용균반 형성을 양성 기준인 PC에서도 명확히 확인되지 않았으며 항균 단백질을 처리한 L 및 완충액 기준에서는 용균 현상에 의한 투명한 용균반의 형성 대신 박테리아가 매우 많이 자라서 생기는 불투명의 박테리아 성장반(불투명한 원형의 점을 지칭)이 생겼고, (C)에서도 투명한 용균반은 생기지 않고 박테리아가 매우 많이 자라서 생기는 불투명의 박테리아 성장반이 생겼으며, (D)에서는 PC에서만 투명한 용균반이 형성되었고 나머지 경우에는 용균반이 확인되지 않았다.

실시예 10: 발현된 용균 단백질의 분리 정제

형질전환체의 LB 배지를 이용한 배양액 500 ㎖을 8,000 rpm에서 5분간 원심분리하여 세포 침전물을 얻었다. 이를 1 mM의 페닐메틸술포닐 플루오라이드(phenylmethylsulfonyl fluoride)가 포함된 6 ㎖의 20 mM 인산나트륨(sodium phosphate) 완충액(pH 6.0)에 부유시켰다. 여기에 리보소말(ribosomal) 단백질의 침전을 유발시키기 위해 2 ㎎의 스트렙토마이신 설페이트(streptomycin sulfate)를 추가로 넣어주었다. 이렇게 준비된 세포 부유액을 실시예 9에서와 동일하게 초음파 분쇄법을 이용하여 세포를 파쇄하였다. 이 세포 파쇄액을 8,000 rpm에서 5분간 원심분리하여 세포 찌꺼기를 제거하였다. 이 원심분리를 통하여 얻어진 상등액은 60%(w/v)의 암모늄 설페이트 침전법으로 발현된 항균 단백질을 농축하였다. 이를 자세히 설명하면, 최종 농도가 60%(w/v)가 되게 암모늄 설페이트를 첨가한 후, 그 암모늄 설페이트 첨가액을 얼음 속에 15분간 정치시켜 단백질이 원활히 침전되도록 하였다. 15분간의 정치 후, 혼합액을 10,000× g에서 15분간 원심분리하여 침전물을 회수하였다. 이를 크로마토그라피에서 사용할 흡착 완충액(adsorption buffer; 50 mM 인산나트륨(sodium phosphate), 0.25 M 염화나트륨(sodium chloride), pH 6.5) 2 ㎖을 사용하여 녹였다. 이렇게 준비된 단백질 용액을 과량 포함된 암모늄 설페이트를 제거하기 위해 흡착 완충액에 대하여 간간이 흡착 완충액을 교환해 주면서 4℃에서 밤새도록 투석을 실시하였다. 투석이 완료된 단백질 용액을 10,000× g에서 25분간 원심분리하여 불용성 물질을 제거해 주었다. 이렇게 준비된 단백질 용액을 마지막으로 0.2 ㎛ 필터로 여과한 다음 양이온-교환 크로마토그라피(cation-exchange chromatography)를 수행하였다. 이때, 양이온-교환 수지(resin)로는 CM-세파덱스 C-50(CM-Sephadex C-50, Pharmacia사)을 사용하였으며, 이는 약한(weak) 양이온-교환 수지에 해당한다. CM-세파덱스 C-50은 2 × 7 ㎝로 칼럼에 충진하여 사용하였으며 총 충진 부피는 약 14 ㎖이었다. 크로마토그라피는 칼럼을 흡착 완충액으로 미리 평형화시킨 다음 실시하였고, 항균 단백질액을 칼럼에 적하한 다음에는 100 ㎖의 흡착 완충액으로 세척 단계를 실시하였다. 이 조건에서는 대장균 유래의 다른 단백질은 거의 칼럼의 충진 수지에 붙지 않았다. 최종적으로 항균 단백질은 0.2 에서 0.8 M까지 농도를 변화시킨 염화나트륨를 포함한 50 mM의 인산나트륨 용액(pH 6.5)을 사용하여 용출하였다. 용균 단백질을 포함한 용출액 분획(fraction)은 50 mM의 인산나트륨 용액 (pH 6.5)에 대하여 간간히 인산나트륨 용액을 교환해 주면서 4℃에서 밤새도록 투석하여 항균 단백질의 용출에 사용된 염화나트륨을 제거하였고, 이 투석액을 건조한 폴리에틸렌 글리콜 20,000에 대하여 투석을 실시하여 마지막으로 농축하였다.

실시예 11: 황색포도상구균에 특이적인 항균 단백질을 이용한 황색포도상구균의 감염 예방에 대한 적용예

9 ㎖의 영양배지(Nutrient broth: Beef extract 3 g/L, peptone 5 g/L) 하나에는 실시예 9에서 얻어진 항균 단백질을 포함한 세포 추출액의 원심분리 후의 상등액 100 ㎕를 넣어주고, 또 하나에는 실시예 10에서 얻은 순수 분리한 항균 단백질 용액 100 ㎕를 넣어주고, 대조실험의 배지에는 아무 것도 추가로 넣어주지 않은 시료를 각각 준비하였다. 여기에 108 cfu/㎖의 황색포도상구균 배양액 100 ㎕를 각각 넣어준 다음 황색포도상구균의 배양 상태를 관찰해 보았다. 아무 것도 추가로 첨가해 주지 않은 배지에서는 황색포도상구균이 매우 잘 성장하는 반면에 항균 단백질을 포함한 상등액이나 순수 분리한 항균 단백질 용액을 첨가해 준 영양배지에서는 황색포도상구균이 전혀 자라지 않음을 관찰할 수 있었다. 이 결과로부터 실시예 9 및 실시예 10에서 얻어진 본 발명의 항균 단백질이 황색포도상구균의 감염을 막는데 매우 효과적임을 알 수 있었다.

실시예 12: 황색포도상구균에 특이적인 항균 단백질을 이용한 황색포도상구균의 감염에 기인한 질환의 치료에의 적용예

황색포도상구균이 주요 원인균인 젖소유방염에 감염된 젖소 15두를 대상으로 실시예 10에서 얻은 항균 단백질이 유방염 치료에 효과적인지 여부에 대해 조사해 보았다. 젖소를 5두씩 세 그룹으로 나누어 한 그룹은 실시예 10에서 얻어진 항균 단백질 농축액을 50 mM의 인산나트륨 용액(pH 6.5)을 이용하여 100배 희석한 용액 10 ㎖을 매일 감염부위에 분무해 주었고, 다른 하나의 5두로 구성된 대조 그룹에는 항균 단백질이 포함되지 않은 50 mM의 인산나트륨 용액(pH 6.5)을 매일 동일한 양인 10 ㎖씩 감염부위에 분무해 주었으며, 나머지 5두로 구성된 대조 그룹에는 항균 단백질이 포함되지 않은 통상의 인산완충식염수를 동일한 양인 10 ㎖씩을 매일 감염부위에 분무해 주었다. 이와 같은 처치를 10일간 해준 결과, 항균 단백질을 포함한 액을 분무해 준 경우에만 유의적 수준으로 유방염 치료 효과가 있는 것을 확인할 수 있었다. 이 결과로부터 실시예 10에서 얻어진 본 발명의 항균 단백질이 황색포도상구균으로 원인한 감염성 질환의 치료에도 매우 효과적이라는 것을 알 수 있었다.

상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 박테리오파지 유래의 항균 단백질은 황색포도상규균만을 선별적으로 사멸시킬 수 있기 때문에, 황색포도상구균이 주원인이 되는 감염성 질환의 예방 및 치료제, 항생제, 화장품용 항균제 또는 천연 유래의 방부제, 및 다양한 소독제 등으로 광범위하게 사용될 수 있다.

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5. 황색포도상구균(Staphylococcus aureus) 특이적 사멸능을 갖고, 서열번호 19로 표시되는 아미노산 서열로 표시되는 항균 단백질 또는 기탁번호 KACC 97001P의 박테리오파지 유래의 항균 단백질을 유효성분으로 포함하는, 황색포도상구균 유발성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
6. 제5항에 있어서, 상기 황색포도상구균 유발성 질환은 유방염, 급성 피부염, 패혈증, 화농성 질환, 식중독, 폐렴, 골수염, 농가진, 균혈증, 심내막염 및 장염으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 황색포도상구균 유발성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
7. 황색포도상구균(Staphylococcus aureus) 특이적 사멸능을 갖고, 서열번호 19로 표시되는 아미노산 서열로 표시되는 항균 단백질 또는 기탁번호 KACC 97001P의 박테리오파지 유래의 항균 단백질을 유효성분으로 포함하는 항생제.
8. 황색포도상구균(Staphylococcus aureus) 특이적 사멸능을 갖고, 서열번호 19로 표시되는 아미노산 서열로 표시되는 항균 단백질 또는 기탁번호 KACC 97001P의 박테리오파지 유래의 항균 단백질을 유효성분으로 포함하는 소독제.

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