CN110612349A - 新型铜绿假单胞菌噬菌体Pse-AEP-3及其用于抑制铜绿假单胞菌的增殖的用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种从自然界分离的短尾病毒科噬菌体Pse‑AEP‑3(登录号：KCTC 13165BP)，所述短尾病毒科噬菌体Pse‑AEP‑3具有特异性杀死铜绿假单胞菌的能力，并且具有以SEQ ID NO:1表示的基因组，并且涉及一种使用含有所述短尾病毒科噬菌体Pse‑AEP‑3作为活性成分的组合物来预防或治疗铜绿假单胞菌导致的疾病的方法。

Description

新型铜绿假单胞菌噬菌体Pse-AEP-3及其用于抑制铜绿假单 胞菌的增殖的用途

技术领域

本发明涉及一种从自然界分离的噬菌体，所述噬菌体感染铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)，从而杀死铜绿假单胞菌，并且涉及一种使用含有所述噬菌体作为活性成分的组合物来预防或治疗铜绿假单胞菌感染的方法。具体而言，本发明涉及一种从自然界分离的短尾病毒科(Podoviridae)噬菌体Pse-AEP-3(登录号：KCTC 13165BP)，所述短尾病毒科噬菌体Pse-AEP-3能够杀死铜绿假单胞菌，并且具有以SEQ ID NO:1表示的基因组，并且涉及一种使用含有上述噬菌体作为活性成分的组合物来预防和治疗铜绿假单胞菌感染的方法。

背景技术

铜绿假单胞菌(它是革兰氏阴性杆菌)是一种机会性细菌，它是自然环境中常见的，但是能够在免疫力下降(由于手术、烧伤、创伤或化疗而引起)的人们中引起脓毒症。铜绿假单胞菌是已知的主要医院感染病原体，并且是各种疾病(诸如心内膜炎、肺炎、脑脊髓膜炎等等)的致因。具体而言，铜绿假单胞菌感染在囊性纤维化患者中通常是致命的，并且已知婴儿被铜绿假单胞菌感染时，会经历严重的肺功能丧失。

典型地，疫苗和抗生素被用于预防和治疗铜绿假单胞菌导致的感染性疾病。在这里，由于抗生素耐药性细菌的增殖，抗生素的有效性不断降低。因此，迫切需要开发用于预防或治疗抗生素耐药性铜绿假单胞菌感染的药物。

最近，使用噬菌体作为针对细菌性疾病的对策已引起相当大的关注。具体而言，这些噬菌体由于具有针对抗生素耐药性细菌的强大抗细菌活性而受到极大关注。噬菌体是感染细菌的非常小的微生物，通常简单地称为“噬体(phage)”。一旦噬菌体感染细菌，该噬菌体即可在细菌细胞内部增殖。在增殖之后，噬菌体的子代会破坏细菌细胞壁，并从宿主细菌中逃出，这表明噬菌体具有杀死细菌的能力。噬菌体感染细菌的方式通过其非常高的特异性来表征，因此感染特定细菌的噬菌体的类型范围是有限的。也就是说，某些噬菌体可以仅感染特定细菌，这表明某些噬菌体能够提供仅针对特定细菌的抗细菌作用，因此能够单独杀死特定细菌，而不伤害其他细菌。由于噬菌体的这种细菌特异性，噬菌体赋予仅针对目标细菌的抗细菌作用，但是不影响环境中或动物肠道中的共生细菌。已经广泛用于细菌治疗的常规抗生素会顺带影响许多其他细菌类型。这会导致诸如环境污染和动物中的正常菌群紊乱的问题。相比之下，噬菌体的使用不会干扰动物中的正常菌群，因为目标细菌会被选择性杀死。因此，可以安全地利用噬菌体，从而与抗生素相比大大减少噬菌体使用的不良反应的可能性。

噬菌体由英国细菌学家图尔特(Twort)在1915年首先发现，当时他注意到微球菌属(Micrococcus)菌落由于某些未知的原因而***并变得透明。在1917年，法国细菌学家德赫雷尔(d’Herelle)发现，痢疾患者粪便滤液中的痢疾志贺氏菌(Shigella dysenteriae)由于某些原因而受到破坏，并且进一步研究了这种现象。结果，他独立地鉴定出这种微生物并将其命名为噬菌体，意思是“细菌的吞噬者”。从那以后，不断鉴定出作用于诸如志贺氏菌属(Shigella)、伤寒沙门氏菌(Salmonella Typhi)和霍乱弧菌(Vibrio cholerae)的病原菌的噬菌体。

由于噬菌体杀死细菌的独特能力，噬菌体自发现以来作为针对细菌感染的潜在有效对策引起了关注，并且已经进行了许多与噬菌体相关的研究。然而，自从弗莱明(Fleming)发现青霉素以来，对噬菌体的研究仅在一些东欧国家和前苏联继续进行，因为抗生素的使用已经普及。自从2000年以来，由于抗生素耐药性细菌的增加，常规抗生素的局限性已经很明显，并且开发作为常规抗生素的替代物的噬菌体的可能性已经非常突出，因此作为抗细菌剂的噬菌体再次引起了关注。

如上文所述，噬菌体往往对特定细菌具有高特异性。由于这种特异性，噬菌体通常展示出仅针对某些细菌株系的抗细菌作用，甚至在相同的种类内的抗细菌作用。此外，噬菌体的抗细菌强度可以根据目标细菌株系而变化。所以，有必要收集多种用于有效控制特定细菌的噬菌体。因此，为了开发有效的用于控制铜绿假单胞菌的噬菌体利用方法，必须获得展示出针对铜绿假单胞菌的抗细菌作用的多种噬菌体。此外，需要筛选所得的噬菌体以确定它们在抗细菌强度和抗细菌谱方面是否优于其他噬菌体。

发明内容

技术问题

因此，本发明人致力于开发适用于使用从自然界分离的并且能够杀死铜绿假单胞菌的噬菌体来预防或治疗铜绿假单胞菌感染的组合物，并进一步建立使用所述组合物来预防或治疗铜绿假单胞菌感染的方法。结果，本发明人从自然界分离了适用于此目的的噬菌体，并且确定了基因组的基因序列，所述基因序列将分离的噬菌体与其他噬菌体区分开。然后，本发明人开发了含有所述噬菌体作为活性成分的组合物，并确定该组合物能够用于有效地预防或治疗铜绿假单胞菌感染，从而最终实现本发明。

因此，本发明的一个目的是提供从自然界分离的短尾病毒科噬菌体Pse-AEP-3(登录号：KCTC 13165BP)，所述短尾病毒科噬菌体Pse-AEP-3具有杀死铜绿假单胞菌的能力，并且具有以SEQ ID NO:1表示的基因组。

本发明的另一个目的是提供适用于预防铜绿假单胞菌感染的组合物，所述组合物含有分离的噬菌体Pse-AEP-3(登录号：KCTC 13165BP)作为活性成分，所述分离的噬菌体Pse-AEP-3感染铜绿假单胞菌，从而杀死铜绿假单胞菌，以及使用所述组合物来预防铜绿假单胞菌感染的方法。

本发明的另一个目的是提供适用于治疗铜绿假单胞菌导致的疾病的组合物，所述组合物含有分离的噬菌体Pse-AEP-3(登录号：KCTC 13165BP)作为活性成分，所述分离的噬菌体Pse-AEP-3感染铜绿假单胞菌，从而杀死铜绿假单胞菌，以及使用所述组合物来治疗铜绿假单胞菌导致的疾病的方法。

本发明的另一个目的是提供使用上述组合物来预防或治疗铜绿假单胞菌感染的药物组合物，所述药物组合物含有分离的噬菌体Pse-AEP-3(登录号：KCTC 13165BP)作为活性成分，所述分离的噬菌体Pse-AEP-3感染铜绿假单胞菌，从而杀死铜绿假单胞菌。

本发明的另一个目的是提供杀菌剂，所述杀菌剂含有分离的噬菌体Pse-AEP-3(登录号：KCTC 13165BP)作为活性成分，所述分离的噬菌体Pse-AEP-3感染铜绿假单胞菌，从而杀死铜绿假单胞菌。具体而言，该杀菌剂可有效预防医院内感染。

本发明的另一个目的是提供抗生素，所述抗生素含有分离的噬菌体Pse-AEP-3(登录号：KCTC 13165BP)作为活性成分，所述分离的噬菌体Pse-AEP-3感染铜绿假单胞菌，从而杀死铜绿假单胞菌。

技术方案

本发明提供了从自然界分离的短尾病毒科噬菌体Pse-AEP-3(登录号：KCTC13165BP)，所述短尾病毒科噬菌体Pse-AEP-3具有特异性杀死铜绿假单胞菌的能力，并且具有以SEQ ID NO:1表示的基因组，以及使用含有所述短尾病毒科噬菌体Pse-AEP-3作为活性成分的组合物来预防或治疗铜绿假单胞菌感染的方法。

本发明人分离了噬菌体Pse-AEP-3，然后在2016年11月29日保藏于韩国生物科学与生物技术研究所(Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology)的韩国典型培养物保藏中心(Korean Collection for Type Cultures)(登录号：KCTC13165BP)。

本发明还提供了适用于预防或治疗铜绿假单胞菌感染的药物组合物，所述药物组合物含有噬菌体Pse-AEP-3作为活性成分。药物组合物的实例包括但不限于杀菌剂或抗生素。

由于本发明的组合物中含有的噬菌体Pse-AEP-3能够有效地杀死铜绿假单胞菌，所述噬菌体Pse-AEP-3对于铜绿假单胞菌导致的疾病(诸如泌尿道感染、伤口感染、菌血症、心内膜炎等等)的预防(感染的预防)或治疗(感染的治疗)是有效的。因此，本发明的组合物能够用于预防和治疗铜绿假单胞菌导致的疾病。在本发明中，铜绿假单胞菌导致的疾病可以包括泌尿道感染、伤口感染、菌血症、心内膜炎等等。

本说明书中的铜绿假单胞菌可能对现有抗生素敏感，或可能具有针对现有抗生素的耐药性。简而言之，是否表现出针对现有抗生素的耐药性并不重要。

如本文所用，术语“预防(prevention和prevent)”是指(i)预防铜绿假单胞菌感染以及(ii)抑制铜绿假单胞菌感染导致的疾病的发展。

如本文所用，术语“治疗(treatment和treat)”是指(i)抑制铜绿假单胞菌导致的疾病以及(ii)减轻铜绿假单胞菌导致的疾病的病理状况的所有作用。

如本文所用，术语“分离(isolate、isolating和isolated)”是指使用多种实验技术从自然界分离噬菌体并且确保可以将本发明的噬菌体与其他噬菌体区分开的特征的作用，并且还包括使用生物工程技术来增殖本发明的噬菌体以使得所述噬菌体适用于行业用途的作用。

本发明的组合物中包含的药学上可接受的载剂是通常用于制备药物制剂的载剂，所述载剂的实例包括乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露醇、淀粉、***橡胶、磷酸钙、藻酸盐、明胶、硅酸钙、微晶纤维素、聚乙烯基吡咯烷酮、纤维素、水、糖浆、甲基纤维素、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石、硬脂酸镁和矿物油，但是不限于此。除了上述成分之外，本发明的组合物还可以另外包含润滑剂、润湿剂、甜味剂、矫味剂、乳化剂、混悬剂和防腐剂。

本发明的组合物可以通过施用或喷涂于患病部位来使用，或者可以通过口服施用或肠胃外施用来施用。在这里，肠胃外施用可以包括静脉内施用、腹膜内施用、肌肉内施用、皮下施用或局部施用。

本发明的药物组合物的适当施用、喷涂和剂量可以根据诸如以下因素而变化：配制方法、施用方式、受试动物或患者的年龄、体重、性别和患病状况、饮食、施用时间、施用途径、***率和反应性。通常，用于所期望的治疗的有效剂量可以由熟练的内科医生或兽医容易地确定和规定。

噬菌体Pse-AEP-3作为活性成分包含在本发明的组合物中。噬菌体Pse-AEP-3以1×10¹pfu/ml至1×10³⁰pfu/ml或1×10¹pfu/g至1×10³⁰pfu/g的浓度，并且优选地以1×10⁴pfu/ml至1×10¹⁵pfu/ml或1×10⁴pfu/g至1×10¹⁵pfu/g的浓度包含在其中。

可以根据本发明所属领域的技术人员可以容易实施的方法使用药学上可接受的载剂和/或赋形剂来配制本发明的组合物，以便将所述组合物制备成单位剂型或将其加入多剂量容器中。在这里，所述组合物的制剂可以以油性或水性介质中的溶液剂、混悬剂或乳剂的形式，或者以提取物、粉末剂、颗粒剂、片剂或胶囊剂的形式提供，并且可以另外含有分散剂或稳定剂。

本发明的组合物可以根据其使用目的制备为杀菌剂或抗生素，但不限于此。如本文所用，术语“抗生素”统称为防腐剂、杀细菌剂和抗细菌剂。

为了改善本发明的组合物的有效性，赋予针对其他细菌种类的抗细菌活性的噬菌体也可以包含在其中。此外，具有针对铜绿假单胞菌的抗细菌活性的其他类型的噬菌体也可以包含在本发明的组合物中。这些噬菌体可以适当组合，以使其抗细菌效果最大化，因为它们针对铜绿假单胞菌的抗细菌活性可以在抗细菌强度和抗细菌谱方面变化。

有益效果

根据本发明，与基于现有抗生素的常规方法相比，使用含有噬菌体Pse-AEP-3作为活性成分的组合物来预防或治疗铜绿假单胞菌感染的方法可以具有针对铜绿假单胞菌的非常高的特异性的优点。这意味着，组合物可以用于预防或治疗铜绿假单胞菌感染，而不影响其他细菌，即有用的共生细菌，并且具有较少的可归因于其使用的副作用。典型地，当使用抗生素时，还会伤害共生细菌，因此必然伴有由于其使用的副作用。同时，在各种噬菌体表现出针对相同细菌种类的抗细菌活性的情况下，噬菌体的抗细菌活性在抗细菌强度和抗细菌谱方面是不同的[就属于铜绿假单胞菌的各种细菌株系而言，噬菌体的抗细菌活性谱适用于单个细菌株系，噬菌体通常仅对一些细菌株系有效，甚至在相同种类内的细菌株系也是如此，因此噬菌体的抗细菌活性取决于细菌株系，即使对于相同的细菌种类也是如此]。因此，本发明可以提供针对铜绿假单胞菌的抗细菌活性，所述抗细菌活性不同于作用于铜绿假单胞菌的其他噬菌体。这为多个行业领域提供了适用性。

附图说明

图1是示出噬菌体Pse-AEP-3的形态的电子显微照片。

图2是示出关于噬菌体Pse-AEP-3杀死铜绿假单胞菌的能力的实验结果的照片，其中亮区是细菌裂解形成的噬菌斑。

具体实施方式

在下文中，将参考实施例更详细地描述本发明。然而，实施例仅仅是本发明的实施例，并且本发明的范围不限于这些实施例。

实施例1：能够杀死铜绿假单胞菌的噬菌体的分离

从自然界收集样品，以分离能够杀死铜绿假单胞菌的噬菌体。在这里，本发明人此前已分离用于噬菌体分离的铜绿假单胞菌，并将其鉴定为铜绿假单胞菌。

在下文中详细地描述了用于分离噬菌体的程序。将收集的样品添加至TSB(胰蛋白酶大豆培养液)培养基(酪蛋白消化物，17g/L；大豆消化物，3g/L；葡萄糖，2.5g/L；NaCl，5g/L；磷酸氢二钾，2.5g/L)中，以1/1000的比率接种铜绿假单胞菌，然后在37℃下振荡培养3至4小时。在培养完成后，以8,000rpm进行离心20min，并回收上清液。以1/1000的比率用铜绿假单胞菌接种所回收的上清液，然后在37℃下振荡培养3至4小时。当样品含有噬菌体时，重复上述程序5次，以充分增加噬菌体的数量(滴定度)。在重复所述程序5次后，将培养液以8,000rpm离心20min。在离心后，使用0.45μm过滤器来过滤所回收的上清液。将所得的滤液用于典型点板测定，以检查其中是否包含能够杀死铜绿假单胞菌的噬菌体。

如下所述进行点板测定：以1/1000的比率用铜绿假单胞菌接种TSB培养基，然后在37℃下振荡培养过夜。将3ml(OD₆₀₀为1.5)上述制备的铜绿假单胞菌培养液涂布于TSA(胰蛋白酶大豆琼脂)平板培养基(酪蛋白消化物，15g/L；大豆消化物，5g/L；NaCl，5g/L；琼脂，15g/L)上。将涂布的平板放置于干净的工作台上30min，从而使涂布的溶液干燥。在干燥后，将10μl所制备的滤液点在铜绿假单胞菌涂布的平板培养基上，然后放置使其干燥约30min。在干燥后，将经过点板的平板培养基在37℃不振荡的情况下培养一天，然后检查滴加滤液位置处的亮区形成。就产生亮区的滤液而言，可以判断其中包含能够杀死铜绿假单胞菌的噬菌体。通过上述检查，可以获得含有具有杀死铜绿假单胞菌能力的噬菌体的滤液。

从上述确认具有能够杀死铜绿假单胞菌的噬菌体的滤液分离纯噬菌体。使用常规噬菌斑测定来分离纯噬菌体。详细地讲，使用灭菌吸头来回收在噬菌斑测定过程中形成的噬菌斑，然后将所述噬菌斑添加至铜绿假单胞菌的培养液中，然后在37℃下培养4至5小时。在培养后，以8,000rpm进行离心20min以获得上清液。将铜绿假单胞菌培养液以1/50的体积比添加至所得的上清液，然后在37℃下培养4至5小时。为了增加噬菌体的数量，重复上述程序至少5次。然后，以8,000rpm进行离心20min，以获得最终上清液。使用所得的上清液进一步进行噬菌斑测定。通常，纯噬菌体的分离不是通过程序的一次重复完成的，所以使用上述形成的所得噬菌斑来重复上述程序。在重复该程序至少5次之后，获得含有纯噬菌体的溶液。完全重复用于分离纯噬菌体的程序，直到所产生的噬菌斑在大小和形态方面变得彼此类似。此外，使用电子显微镜检查来确认纯噬菌体的最终分离。重复上述程序直到使用电子显微镜检查确认纯噬菌体的分离。根据常规方法来进行电子显微镜检查。简而言之，将含有纯噬菌体的溶液添加到铜载网上，然后用2％乙酸铀酰进行负染色并干燥。然后使用透射电子显微镜来观察纯噬菌体的形态。所分离的纯噬菌体的电子显微照片如图1所示。根据纯噬菌体的形态特征，确认上述分离的新型噬菌体为短尾病毒科噬菌体。

使用上述确认的含有纯噬菌体的溶液来进行以下纯化过程。将铜绿假单胞菌培养液以基于噬菌体溶液的总体积计1/50的体积比添加至含有纯噬菌体的溶液，然后进一步培养4至5小时。在培养后，以8,000rpm进行离心20min以获得上清液。重复该程序总共5次以获得含有足够数量的噬菌体的溶液。使用0.45μm过滤器来过滤从最终离心步骤获得的上清液，然后进行常规聚乙二醇(PEG)沉淀过程。具体而言，将PEG和NaCl添加至100ml滤液中直到达到10％PEG8000/0.5M NaCl，然后将所述滤液放置在4℃下2至3小时。其后，以8,000rpm进行离心30min，以获得噬菌体沉淀物。将所得的噬菌体沉淀物悬浮于5ml缓冲液(10mMTris-HCl，10mM MgSO₄，0.1％明胶，pH8.0)中。所得的材料可以称为噬菌体悬浮液或噬菌体溶液。

结果，收集上述纯化的纯噬菌体，将其命名为噬菌体Pse-AEP-3，并在2016年11月29日保藏于韩国生物科学与生物技术研究所(Korea Research Institute of Bioscienceand Biotechnology)的韩国典型培养物保藏中心(Korean Collection for TypeCultures)(登录号：KCTC 13165BP)。

实施例2：噬菌体Pse-AEP-3的基因组的分离和序列分析

如下所述分别噬菌体Pse-AEP-3的基因组。使用与实施例1中相同的方法从所获得的噬菌体悬浮液分离基因组。首先，为了除去悬浮液中包含的铜绿假单胞菌的DNA和RNA，将200U DNA酶I和RNA酶A中的每者添加至10ml噬菌体悬浮液中，然后放置在37℃下30min。在放置30min之后，为了终止DNA酶I和RNA酶A活性，将500μl0.5M乙二胺四乙酸(EDTA)添加至其中，然后将所得的混合物放置10min。此外，将所得的混合物进一步放置在65℃下10min，然后将100μl蛋白酶K(20mg/ml)添加至其中，以破坏噬菌体的外壁，然后在37℃下反应20min。其后，将500μl 10％十二烷基硫酸钠(SDS)添加至其中，然后在65℃下反应1小时。在反应1小时之后，将10ml苯酚:氯仿:异戊醇(以25:24:1的组分比混合)的溶液添加至反应溶液中，然后充分混合。此外，将所得的混合物以13,000rpm进行离心15min，从而分离各层。在分离的层中，选择上层，将异丙醇以1.5的体积比添加至其中，然后以13,000rpm离心10min以沉淀基因组。在回收沉淀物之后，将70％乙醇添加至沉淀物中，然后以13,000rpm离心10min以洗涤沉淀物。回收经洗涤的沉淀物，将其真空干燥，然后溶解于100μl水中。重复该程序从而获得大量噬菌体Pse-AEP-3的基因组。

通过进行下一代测序分析来确保关于上述获得的噬菌体Pse-AEP-3的基因组序列的信息，所述下一代测序使用首尔大学(Seoul National University)的韩国国家环境管理仪器中心(National Instrumentation Center for Environmental Management)提供的Pac-bio设备进行。最终分析的噬菌体Pse-AEP-3的基因组的大小为45,213bp，全基因组序列以SEQ ID NO:1表示。

使用基于网页的BLAST来研究上述获得的噬菌体Pse-AEP-3基因组序列与此前报道的噬菌体基因组序列的同源性(相似性)。根据BLAST研究的结果，发现噬菌体Pse-AEP-3的基因组序列与铜绿假单胞菌噬菌体PaP4的序列(GenBank登录号：KC294142.1)具有相对较高的同源性(同一性：93％)。然而，噬菌体Pse-AEP-3具有环状基因组，铜绿假单胞菌噬菌体PaP4具有线性基因组，因此它们之间的基因组拓扑结构存在显著差异，并且噬菌体Pse-AEP-3基因组上的开放阅读框(ORF)的数量为69，而与噬菌体Pse-AEP-3不同的是铜绿假单胞菌噬菌体PaP4具有70个开放阅读框。

所以，可以得出以下结论：噬菌体Pse-AEP-3是不同于常规报道的噬菌体的新型噬菌体。此外，由于噬菌体的抗细菌强度和抗细菌谱通常取决于噬菌体的类型，因此认为噬菌体Pse-AEP-3可以提供不同于此前报道的任何其他噬菌体的抗细菌活性。

实施例3：噬菌体Pse-AEP-3杀死铜绿假单胞菌的能力研究

研究了所分离的噬菌体Pse-AEP-3杀死铜绿假单胞菌的能力。为了评估杀死能力，使用结合实施例1描述的以相同方式进行的点板测定来观察亮区的形成。将总共10个株系(包括由本发明人分离和鉴定为铜绿假单胞菌的9个株系和从美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection，ATCC)获得的1个株系(铜绿假单胞菌ATCC 15692))作为用于杀死能力研究的铜绿假单胞菌。噬菌体Pse-AEP-3具有杀死10个铜绿假单胞菌株系(即，实验目标)中的总共9个株系(包含从ATCC获得的1个株系)的能力。所述噬菌体的代表性实验结果如图2所示。同时，还测量了噬菌体Pse-AEP-3杀死金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、多杀性巴斯德氏菌(Pasteurella multocida)、产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)、***链球菌(Streptococcus uberis)和粪肠球菌(Enterococcus faecalis)的能力。因此，发现噬菌体Pse-AEP-3不具有杀死这些微生物的能力。

所以，可以得出以下结论：噬菌体Pse-AEP-3具有高水平的杀死铜绿假单胞菌的能力和针对多种铜绿假单胞菌的抗细菌效果，这表明噬菌体Pse-AEP-3可以用作用于预防和治疗铜绿假单胞菌感染的组合物的活性成分。

实施例4：使用噬菌体Pse-AEP-3来预防铜绿假单胞菌感染的实验

将100μl噬菌体Pse-AEP-3溶液以1×10⁹pfu/ml的水平添加至含有9ml TSB培养基的管中。向另一个含有9ml TSB培养基的管，仅另外添加相同量的TSB培养基。然后将铜绿假单胞菌培养液添加至每个管，以使得600nm下的吸光度达到约0.5。在添加铜绿假单胞菌之后，将管放置于37℃的培养箱中，然后振荡培养，在此期间观察铜绿假单胞菌的生长。如下表1所示，观察到在添加了噬菌体Pse-AEP-3溶液的管中，铜绿假单胞菌的生长受到抑制，而在未添加所述噬菌体溶液的管中，铜绿假单胞菌的生长不受抑制。

[表1]

铜绿假单胞菌的生长抑制

上述结果显示，本发明的噬菌体Pse-AEP-3不仅抑制铜绿假单胞菌的生长，而且还具有杀死铜绿假单胞菌的能力。所以，可以得出以下结论：噬菌体Pse-AEP-3可以用作用于预防铜绿假单胞菌感染的组合物的活性成分。

实施例5：使用噬菌体Pse-AEP-3来治疗铜绿假单胞菌导致的感染性疾病1

评估了噬菌体Pse-AEP-3对铜绿假单胞菌感染的动物的治疗效果。准备2组2日龄小鸡(每组40只)，分别饲养，实验进行14天。从实验开始之后的第五天起3天内，以典型的喂养方式供应含有1×10⁷cfu/g铜绿假单胞菌的饲料。从用含有铜绿假单胞菌的饲料喂养的最后一天起，在两组的粪便中发现铜绿假单胞菌。从供应包含铜绿假单胞菌的饲料之后的第二天起3天内，在实验组(施用噬菌体)中用含有1×10⁸pfu/g噬菌体Pse-AEP-3的饲料以典型的喂养方式喂养小鸡。相比之下，在对照组(不施用噬菌体)中用具有相同组成但是不包含噬菌体Pse-AEP-3的饲料以相同的方式喂养小鸡。从实验开始之后的第九天起，测量实验动物的粪便中铜绿假单胞菌的数量。在本实施例中，在铜绿假单胞菌数量的测量中，将铜绿假单胞菌选择性培养基(假单胞菌属(Pseudomonas)十六烷基三甲基溴化铵琼脂平板；Oxoid)用于防止其他污染细菌的干扰。将样品涂布于选择性培养基上，并在37℃下培养18至24小时。从选择性培养基分离推断为铜绿假单胞菌的菌落，其后通过聚合酶链式反应(PCR)来鉴定铜绿假单胞菌(通过PCR鉴定为铜绿假单胞菌的菌落的数量为10²cfu/ml或更多的情况＝2，通过PCR鉴定为铜绿假单胞菌的菌落的数量为10¹～10²cfu/ml的情况＝1，通过PCR鉴定为铜绿假单胞菌的菌落的数量为10⁰～10¹cfu/ml的情况＝0)。结果如下表2所示。

[表2]

铜绿假单胞菌的数量测量结果(平均值)

天	D9	D10	D11	D12	D13	D14
							对照组(不施用噬菌体)	1.1	1.0	1.2	1.2	1.1	1.3
实验组(施用噬菌体)	0.2	0.2	0.1	0	0	0

从上述结果看出，可以得出以下结论：本发明的噬菌体Pse-AEP-3在铜绿假单胞菌导致的疾病的治疗中非常有效。

实施例6：使用噬菌体Pse-AEP-3来治疗铜绿假单胞菌导致的感染性疾病2

如下所述评估了噬菌体Pse-AEP-3对铜绿假单胞菌导致的疾病的治疗效果。将40只8周龄小鼠分为总共2组，每组20只小鼠，其后分别在单独的实验小鼠笼中饲养小鼠的子组(每个子组5只)，实验进行7天。在实验的第二天，通过腹膜内注射将0.1ml铜绿假单胞菌悬浮液施用于全部小鼠。如下所述制备施用的铜绿假单胞菌悬浮液。具体而言，在37℃下在TSB培养基中培养铜绿假单胞菌18小时，仅回收细胞，并且将所回收的细胞以5×10⁹cfu/ml的浓度悬浮于盐水(pH7.2)中。在施用铜绿假单胞菌2小时后，在实验组(施用噬菌体溶液)中通过腹膜内注射至小鼠来施用10⁹pfu的噬菌体Pse-AEP-3。在对照组(不施用噬菌体溶液)中通过腹膜内注射至小鼠来施用0.1ml盐水。对照组和实验组二者都用等同的饲料和饮用水来喂养。从铜绿假单胞菌的施用开始直到测试结束，每日观察小鼠是否存活。结果如下表3所示。

[表3]

存活率的测量结果(％)

细菌施用后的天数	D0	D1	D2	D3	D4	D5
							对照组(不施用噬菌体溶液)	100	75	35	10	10	10
实验组(通过腹膜内注射来施用噬菌体溶液)	100	95	95	95	95	95

从上述结果看出，可以得出以下结论：本发明的噬菌体Pse-AEP-3在铜绿假单胞菌导致的感染性疾病的治疗中非常有效。

虽然已经参考本发明的示例性实施方案具体示出并描述了本发明，但是本领域的技术人员将理解，具体描述仅仅是优选的实施方案，并且本发明的范围不限于此。因此，本发明的范围旨在由所附权利要求及其等同物限定。

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保藏机构名称：KCTC

登录号：KCTC 13165BP

登录日期：20161129

国际承认用于专利程序的

微生物保藏

布达佩斯条约

国际表单

原始保藏情况下的收据

依照细则7.1出具

保藏方名称：尹特荣生物科技株式会社

地址：韩国京畿道城南市中院区沙器膜谷路137号中央工业大厦V 903(JoongangInduspia V 903,137Sagimakgol-ro,Joongwon-gu,Seongnam,Kyeonggi-do,Republic ofKorea)(13202)

序列表

<110> 尹特荣生物科技株式会社

<120> 新型铜绿假单胞菌噬菌体Pse-AEP-3及其用于抑制铜绿假单胞菌的增殖的用途

<130> KP090505

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 45213

<212> DNA

<213> Pseudomonas aeruginosa bacteriophage Pse-AEP-3

<400> 1

tgatgacccg acgttgtagc caggtctaac ccaacgggcc ctgtcgggcc ccgttgtttc 60

tccgtaggga ctacatcatt agccatccaa ctgactttgc aattgacgaa gaccttgggc 120

tctttatccg aggataccga gaatcctgta cagcactcct agtccgtcac gcaagagcgc 180

cactctgtca acagataacc gaaaggataa tatgcgcaag gtagcaagta gtacaccccc 240

ctggttaagt cctacggcct acgtcgccgc gtctgaaggt ggacccatcg accttaacct 300

tcggttgtga cccagaccat gccgcacgat ttacccgttg gggcttaatc gaatcgagat 360

aaatggatac ctctgaggca cgggtgtaat gaatggctac gatcaataac gtaactgatc 420

tcgctattgc tgctatccag tggtctgacc gtcaggatct tacccaagaa cttctgatgt 480

tgttcattgg gaacactact gaccgtctta accgattgct acgaggaggg agaacgaaca 540

cttcgaaact ctcatggcct tcggtggtgg cattgagatc cctgagcact ttgttgctct 600

aaggtctatc agggggtctc tctctatcgg tggtcgctac tctctcagta catcacccaa 660

gatatcttca cccactatgt taactacaac taccaacctc agggtgtaac tactacactc 720

ggttgtgtaa cttcgttggc gtgcattgcc gttgttcgac ggtcccgttc attgcgaagt 780

cactgtctgt actctctaga gctgagacct ccctaacaaa ccgtcgttga gccagagcta 840

ggatccgcag atgtatccat ggatgtactt gatcggatct gagtatctgt acaccatgga 900

tgaagctcgg tcccagttct ggggtcagaa actcgaacgg gctgttatgg aactccagaa 960

cgaggagaat gccgctgact tcgctagcac tcgactggcg atcaaagaca ttgaacgtta 1020

aggagcttca gatgcctatc tttctaaaaa ccctcgcaat caaccttctg gctaccctct 1080

tcccaaccaa ggtaatcgct aagtctatcg tgactggagc taaggccctg gcagagaaga 1140

ccaactccaa ggttgacgac gagttcgtaa aagtcctgga agacaacctt aaggagaaga 1200

cggaggatgc aacttctaac tgataacctg ggcagcatcg tcagtgccct ggtcgtatcc 1260

tcggtagtga cggtaggttc ctcggttgtc ggtcagaatg ttcatcaggc tctgcttgaa 1320

agaaacatcc aggccacgga gaagctcacc caagcggtga gcgaactcca gatttctatg 1380

gcaatctttg gggagcggta tgtcacccga aaagaaatga aagaagagat aaaggaggcc 1440

aagaatgggt cttgaggtcg caacttatat taaccagttg gtgcctacga accctaccgg 1500

ctctgatctg aaatcctttg gggatgacca cctgcggctc attaagagtg ctattaagaa 1560

taccttcccc aatatttctc aggctgtcac tgtaacggca gcccagctaa acgcagtcgc 1620

tgatacaacc cagtatgtta agcctgggat ggtaatcatg tgggctgggt cattagctca 1680

gatcccagca ggttggaagc tttgcaatgg ggtaggtact acctctaacg ggattcctgt 1740

ccccaacctc attggtgcat tcccttgggg tatcgatggt acttcacagg ctgtaggtac 1800

tagaggtggt agcgctaaca ttgtatggga tgggttcact gaagggactg cccttaccct 1860

agcccagatc ccagcacaca cccacacttg gagatcccga ggggctacta ctctaactgg 1920

atctgcgggt gactcgggtg ctctaacggg tggatctggt aacgcagcca ataccaatct 1980

agagactggt cctgctggtc aaggtcagac tcacaaccat gcagtaaaga tcaacatgcc 2040

gttgggtaat atcccaccgt tctgttctgt gttcttcatc attaagaact gaggtataca 2100

atggccctag agagacaaga ggtcaagaac cctacgggga ttgtgaccga tatcaccccc 2160

gctgacctgc cactggagaa atggtccttc gggaacaacg tccggtttaa gaacggcaag 2220

gctcagaagg ctctgggcca tacgcctatc ttcgatacag cccaggcccc aatcttggat 2280

atgtttcctt tcatccggaa taacattccc tattggctcc tgtgttctga acaaaggttg 2340

tatctagccg acgggactac aatcatcgat gtatccccag gaccttactc tgctagtata 2400

actaacaggt ggtctgtagg gtcgttcaac ggggtaatct ttgctaacga tggggttaac 2460

cctcctcatc atcttccacc gtcagaatca acctttaggg tactccctaa cttcccagcg 2520

aatactactt ttaagaggct taagtctttt aagaacttcc tggttggctt aaacgctaca 2580

agtaactctg tagaaatgcc acagatggtc tggtggagta cttcggctga tgctggtggt 2640

gtacccgctt cttgggaccc aacggaccct actaaggatg ctggtcagaa caccttggct 2700

gataccaatg gtgctatcgt ggatggtgtg aagcttcgtg actccttcat catctacaag 2760

gaagactctg tatactccat gcggtatatc ggtggactgt atatcttcca gttccagcaa 2820

ctgtttaacg acgtgggtat ccttggtcct aactgtgcaa tagagtttga tgggaaccac 2880

tttgttgtag gtcacggtga tgtatatgtc cacaacggtg tgcagaagca gtctgttatt 2940

gatgcccagg tccgtaagtt cttcttctcg gatattaacc ctgacaacta tcaacggaca 3000

ttcgtacttg cagaccacgt gaatactgaa atgtgggtat gctactcttc cactaggtct 3060

gagccaggta agcactgcga cagggctatc atctggaact ggaaggaaaa cacttggagt 3120

atccgagatc ttcccaacgt tctcagtgga gcctacggga tcatcgatcc taaggtgtct 3180

aacctctggg atgacgaccc caacccctgg gataccgata cttcggtctg gggtgaaggc 3240

tcttataacc cagcaaagtc cagtatgatc ttctcgtctt tccaggataa gaagttgttc 3300

ctctttggta ataactctac attctctgga cagaacttcg tcagtaccct tgagagatcc 3360

gatatctatc taggggatga tcgaatgatg aagacagtga gtgccatcat tccacacatt 3420

actggtaacg gtacttgtaa catctgggtg ggtaacgctc aggtacaagg ttctggtatt 3480

cgatggaaag gcccttaccc ataccggatt ggtcaggact ataagattga cactaaacat 3540

gtgggccggt atatagcctt gaagttcgac ttctcttcgg agggggattg gtacttcaac 3600

ggatacacta ttgaaatggc cccgaaggca ggtatgcgat gagtcaaaag tacagccctt 3660

cgattccacc acaggaagag gaggaactgc tgcccttcct taatgaagaa ttcgttaggg 3720

ttggacagac tcttaatgac ctagctgacg gctactgggg ggtctctatg gagcccccta 3780

agaagctcaa gccagggact gtaaagtatt ttgcccccgg agtggtaggt ccagtatccg 3840

gcatctatca ttacgacttg gataaccaat ggagactcgc aggtactaaa cccaaggacc 3900

tgccggggga ttttatccta tttaccccac agaacaacca tcagccgatg ggtacctgtg 3960

cctataggat gaacactgct aaggatgaag tatggataac catgctcatg tctggtggta 4020

actacactaa cggggctact gtcctggatc taccccaggc gtattggcct cctgctgagt 4080

tgtttatccc ggcctattcc agcatcatcc cagcgcagag cactattact tatccacctc 4140

cgtctgaccc taacgcacct ccgttggatc aagtctttga tgttctcaac agggctacta 4200

ttcagactgg ggtggttaac caagcaatgt ttaagatcac agctaatggc cgtgttctaa 4260

tccaaggaat tccccaagga gcagtcttcg ggggtacatt cacattcccc ctggtggtga 4320

ctccatgatt catttgatta cccgtgagaa tatcgatctg cttcctaccg tagtccctgc 4380

tctggcccga gccttcaata ggacggacct cggtaagttt tgggacttcg aacacttggt 4440

tcactccttg gttaactacg aggcctatgt cttctaccaa gaagagagtg gctacgctgg 4500

tgtaattcaa gtgtcccaag cacccctggg taacatcctt cacttcttct ggagtggtaa 4560

gatgcctggg aatgaaaccc cggtagatta ctcggaggta gacgacttcc tcggacagtt 4620

cgcccaacga gttaactgtc ggtttatcca atgcgaaggt cgtcggggct ggaagcctac 4680

cctagagaaa ctcgggtaca ccgaagactc cgtatccttc tatcgtgagg taactccaga 4740

tgaacttcct ccaatttaat gtaaagcgtc tgatggggtt cgatgtagag gatgccctag 4800

attctcgggc ttacaagggt ggtagtaaga agcaaaagac cacctctgtc tctacaccct 4860

atcagcaagg taactataat gaactactct cgggtgccag tgattggcta cataacgggg 4920

gctttgaccc caattacggg ggcgatccga actttgaccc ggtggctgac caaaatactc 4980

tccagcttgg tggcatcgaa gggctgggtg gtctcggggg tgcccttcag tctctcctgg 5040

gtagctcagg tgttagctct ctggctgatt accttggtcc ttacgatccc aacaaaactg 5100

gcttggcgaa cgccattggt gcagccaacg agcagatgca atgggacttc gacactacgg 5160

tacgtccaga cctgcgagca ggggccacta atgctggtca gtatgggagt tcccgagcgg 5220

gtgtagcaga aggtattgct accgctagat tgctccagaa tcaacagaat aacgcctccc 5280

agttggcttt ccaagaccag caggcttaca accagaatag gttgaatacc ctgggtaacc 5340

tgtcggctat tgctaagggc ctcggctctg gtaatgccat gcaggtagat gctggtagta 5400

tgcttcagaa ccaggagcag caggaaatca acggggctct acagaagtgg gcctatgaga 5460

ataacgtcag cctcaacgac ctcctcgcct ataaggagct tatctccggc gatatggggg 5520

gaaccaacgt tactacctcc tcgggtggtg gcggtggtgg tggcctcggg tctgccctgg 5580

gtgctctcgg tggtgcttcc ttgggtgctc tcttcggtgg tccagctggt gcttctgttg 5640

gtatgaacgc aggtggtagg gtagggggcc ttctcttcta atggcttccc tccctcagaa 5700

actgttcgct ataggacaga acataggtgg tgggcaggag cgggttcagt tgagtcgtca 5760

aggctcctac cgccccaccc accttgggac gatgcaatcg ggagagtcta gtggacaatc 5820

aaaccctttt ggcgcaatgg gcggagcagc actcgcggct ctcctcgggc aaggaagtga 5880

gccttcttca gaagcagtac caagcttttc tgtcgagggg gctagaggag caagcgaacg 5940

aggcgcagcg gaagttgcag caggtatggg agcgggagtg ggaatccttc ctagcgcaga 6000

agaactcggt ttcggacagc agccaaagtc tggaatccta agtaaactat ttggaggtta 6060

atcctatggc cagcatggct tatgaagggt ccccaattcg ccctagcatc ctccgggctg 6120

ctcagaatga actggacatg gcgcgaatcg caaggaacaa actgccgctg gctgtagagg 6180

gctcaggaat ccctgatcgt gtccgccggg ctgctcaggc tgccctagag aaccctgacc 6240

gttggtctcg ggctgcccaa gaggtgaccc ctgcggctga agctacgggt cgtggtgccc 6300

tgggccgtat cgcaggtatc ctcggtggac cggtatccgt tggcatccaa gcggctgtaa 6360

ccccaggaga acttggggat gcagagcgta ctcgtgcaga agaaatagct caggctagtc 6420

aggctgtgga gaatatgggg cctgaggttg ctcaagaggc aaaccaatgg gcccagggtg 6480

taggccaacg tgcagcccag aacgccacag ggggccctac gggggctgaa ctcctgtcct 6540

atggggtaac ccctaaccaa ccctctatcg agcctgagat caccccagag gtggcttccg 6600

aggctggtgc tgctgtagca gatgaggagg aggctaatcg ccaggtcatc caacagggtg 6660

cagctgaagg tcttcgtact ggtgctgtaa gtcgtcctga aatggcccag gctgtagttg 6720

aagctgatgc ccagagagag ggtgtagagc ttaaacccca agagcttaag aaccgggtga 6780

acgaagagtt gacccagatg aggactatgg acaatgatga tctgtctcgt tatgtatctt 6840

acgctctcat tggtactggt cttctggctt cggccctaga caagactggt aaagccgggg 6900

atatgttcgc tgcttcctac gagcgtcagc tggatcgtaa cctacaggct gggatcaacc 6960

agcagaagat ggctgccgca gctgctgatc gtcagatcaa ggaaaaggat ctggagcgta 7020

aggtggctaa ggatgctgct gatgtacgtc taggcgaagg gaacctggag gtcaagaagg 7080

gaacccttaa ggaaacctct cgtaagaaca ctggtcttct ggataggtgg actgaggagg 7140

ctgctcgggg ccgagccaac cttgccctaa cccagcgagg tcaggatatg gctaaccaac 7200

gggcccagct acaggctgaa acaacccgtc gtggccagga tatgtctcaa gagaatgccc 7260

agcttagttc tgctgtacgt ctgaagactg ctaagattag cgctcaggca cgtcaggcag 7320

cagctaaggc agcccgaggt gagccggtta ctaccaaaga tgccttggga atcctcagtg 7380

aagtcagtgg atctcaggcc ttgggtggta agaagttggg taagactgcc caacaggcta 7440

tagctcagac ccttcgtaac gaaatgaggg ctaaccctgg ggctaaccct attggtatta 7500

tccagcggga ggctgctaag cttcaaccta cgggtaactg gttctttggt ggtgatctgg 7560

actatcctgc cccaacccga taaaaggtac ttgacaaagt atccaaaatg tagtataata 7620

gacctatagg ctcttaagat tccttcttcc ttttgactta cttactaaga aggttagtat 7680

cctaagatac atcttaagag cctattctct ttccagcaac tagaaggtga cttatggctc 7740

tttctccaga actgaaggcc gctattgatg cggaactggc tgaggtcaag ggcctcgacg 7800

tagccgctga attggcttcc ttgaatgagc cagaggttat cgaagaggca ccccaggaag 7860

tagctccagc tacccctgag cctgccccag acctgagtgc cctagtaact ccggctgacc 7920

ctaattctat tagctctgcg attggtcgcg gggttgatac catgcagtct aacatcggtg 7980

gtaccattgc tactctcggt gagttgactg gcagtgacta cctgaaagac tacggcacac 8040

agatggccga agagaatgct caggaagcgt cacagtacgg aacccccgat gttaggtcct 8100

tcgctgatat ccaagatatc ccatccatcg gttcgttcct caagaataac atcgtagagg 8160

cactcccctc gatggctcct gtcctggctg gtggtgcagc aggggctaag gctggctctg 8220

tatttggagc cccaggtcgt atgggtggtg ccctcattgg ttccttccta agctccatgg 8280

gtatcaacgt gggtgccctg agcaaccaga tgaaggagct agaccccgac caaagcaacc 8340

catggaccgc agtcctaggt ggtgctggtc tgtctgccct ggataccgca ggggctgggg 8400

ttatcgctgg tcccctgttg aagcaccttg ggaaagacgg ggcataccat atgctggtac 8460

agtccggtct acccaagcag actgctattg aagctgttac ccaagctggt aaacacgctg 8520

tagtctctgg tgtggctgaa ggtgttacct ctggtgccca gcaggccctc caggacacta 8580

tcgcgtatga tgccgttggg cagacccaat cccctgagca gttcatggat aacctcctga 8640

cggctgcatt cactggtact gctatgggta ctgccggtgg tgctgtatcc tcggggatgg 8700

acaccctggg tcgtcatcag gactccgctg gatctgctgt ggttgatcct aacgcccctg 8760

cggcccctcc taaggcttct gagtttgagc ctaggggtac ggtcaagaag gcttgggatg 8820

ccctaggaaa cgaagctacg tcgctcctag agccactcgc taaggcctcc cctatcgctc 8880

gtgagttctc tgagaccttc cgtgctgata tgagtggtaa gcgggcctct ggtaagacta 8940

tctttgagga ccaggaacta caggcaggta agtggaactc tgaactagat aacatctttg 9000

agggtaagtc ttccaaagag atcgatagga ttatcgctga tacatccgct ggtgtcaaca 9060

cccccgaggc tacccgtcta cgttctttga tggatgacgt aaggaatgag gctgttaatc 9120

gtggtggcat gtctgttggg accatcccca actatatgcc ctttgggttg tcccctgaga 9180

aggttcaatc tccagagttc ctgaacgaca ttactccgta cttccagaac cgacaagctg 9240

ctgaagatgc tgtagctaac tggctggttg aagtctcgga tgatactcgt ggtaacactg 9300

cccctgaggt taaccgattg gttactcaga accagcagac cggggcttgg gaagtagacc 9360

ctcgctaccg tatccagggt gatccggata cccttcgtgg acggtttgcc cagagtgatg 9420

cagtacctaa gtatggtcag ctggaagaga gtcgggcctt tggctccgtg cctcaagaga 9480

tcctcaacaa gtattctctc aacgatactc ctaagaagcg tctccaggaa atccgagatt 9540

acttcgaagg ggcttcccac cggattgcct ttaccgaacg gtttggtatc aacggagaga 9600

aggctaacgc taagattgct tctgctgtag ctgaggctca acgggctggt aagagagtca 9660

ctaaggaaga agtggatcgg atgtatgacc tagtggatgc ctataatggt atgcacggtc 9720

gtatcaaaga tcctaacctt aagaagctag cggctgttac gtcgggtgcc ctcgtgctct 9780

ccagacttcc cctcgccggc ttctcgaccc taaccgagtt cagcctacca ttcgctaagg 9840

ctggggttat gcctaccctt ggggctgtac tcccaaccat gggtgaggta gtaaggcaag 9900

cagcccgcag gatctacagt ggggttccaa agtctgagac cggtcggttt atgagtgata 9960

tgaaccacac cctggcctct gctacctctc tgatggctga ccgggttggc gctgaggtgt 10020

ttaactctac catccaaaag gcgatccgtg gtcagttcct catcaacggc ttgtccatcc 10080

taacccatgt taaccgagtc tttgcaacag agactgctaa gcgggtctat cagaacaacc 10140

tgatggatct agccgcaggg ctccccttca gttctgccaa tggtgctctg aaggttgctc 10200

agcttcggga aatgggggtt aacatcggta gccagcagga tgccctcaag ttgatctccc 10260

cggctacccc atctgaagtc ctgatggcta acaacgtcaa gaccttggcc atgcgtcggt 10320

ttgtagatca ggtagttctc gaccccacct tcgctgataa gcctatgtgg atgagcaacg 10380

gaaacgttca gatgttctcc ctcttgaagg gttacccagc agcctatggt aacatcatcc 10440

taccgatgtt ccgtagacga atgagcccac acttcgctgg ttcctggacc aacgctggta 10500

tgggtgccgc aggtgtagcc ttcactcttg gtctgatgat gagtctgggg tatctccagg 10560

atgagcttcg tcaactggct aagttcggtg ggtctagccg agaggatacc cgtagtccag 10620

aacaacggat gatggacgta gtgatgcaac agatgccact ccaggcttct atgatctacg 10680

acatgctgac gggttaccgt cgagggacta cccccgcaga ggtactattg ggtccagtag 10740

ctggtgctgc aactgagggt gctatggctg ttggtaaaac tatcgcttcg tttggggatg 10800

acccatccgc aggtgaaatc tggaagttct tgtataagca aactccagca cgtcctttcg 10860

ttgccggtat ggaagcgatg gaagatgctc tggatcttta aggagaagta atatggcaac 10920

ttatgtagaa actgatgccg ctggtcctgg tggccgtgcc tacgtggttg atgtgccaaa 10980

agtcttccga cgtaatgccg atggtgatct cattgagatt acctcggatg ccggtcgggt 11040

aaatactaac atcgttaccg ctacagagtt cctccctgac tattatgcag ttaaggagaa 11100

cgcagccctg gtagtagaga acgttacagc ctccttcccg gagaatccct cagaggccgt 11160

tatcccctct gtcctggtca ataccctcgt gggtgctcct ggagaaacct cgggtggtaa 11220

ccgtgaccct ggccacgtga ttggtctgtt ctctgagacc atgattgagg caccttgcgg 11280

tactgcattc ggtagtgaat tccgagtaga ccctcgacgg gaacacctgg gtgtttacgt 11340

ggctattaag cacgtgattg gcccggatga ccaaaacggt ggtaccatcg gggattacat 11400

tatcgagcag tttgacgaca tgcgtggtcc tgtgaagaac attggttctc ttcaacagaa 11460

ctacctggat ccccgactgg tgactactca cctcggtggt aacgttgtca acacccagca 11520

actcacccag aacattaccc ttactaagca gcagtctggt tggttcttca tgtcccaggg 11580

gactacggat attaccgtta ctcttggtcc ggatgtaacc ccaggttgtc acttccactt 11640

tatccaaggg tctacagcta agatcaagtt cgctgtatct ccggacaagg cttggtatgc 11700

taagggtaat cagacggaga ctgatggtca atttggggaa tgcactgtcc gagtgtatcc 11760

tttcggtggt accgtgggta ccttcaaatc ggcagtttaa taggagttag attatggcag 11820

gttatatcgc tgacaacgac ggcaacagtg tattcgttat tcaatcgaag gctattgctg 11880

ttcgtaatga ggatgggacc ctccgacaag tcattggccc gaaagacttt gagccagtga 11940

agtgggagga tattgagggg aagcctaagc ttctggaggt gggtgctaag gctagtgagg 12000

ctaaaccagg taactggaag cctaaggcta gcgaagtgag tggcctatat gaagccattg 12060

cggcttccat ccaggataag atatctgaga tccccgtggc ttcctatacg gatactcacg 12120

aggcactcgt ggataagttc aatacactac tgaacgctct ccggagctaa agataaggcc 12180

ccttgggata acacccttgg ggcctttttt tggttactcg acggggtggt agataggagt 12240

atcttcggat accctgtcca tgtggtcccg gatgaagcaa cagctatcct gtaggttctc 12300

gaagactaca ggaagggact ctagatatga gctgacacag tggatcccca tcccctgttt 12360

tctctgctcg aaattcctcc aacgaaacca ttgcttatac tgagggaaga agaacttccc 12420

cacttgcttc actcgatact tcataaggaa cctgcccaag ataacacttc gatgaggagt 12480

ctggatattt ctcccagggt caggagtaac atcagtcagc tataccctac atacaccagt 12540

agggcaaaca aagctgctac cgcaatgtag gtccaaggga atccaccctt acccttttga 12600

tctttctgca taacccctcc aatctccgta gaatacagaa gccctgaggt ctactagatc 12660

tagcatccct tcgaggaatt caatctgtct tttagcttct tcagccagtt cttcaaagga 12720

aaaggccttc gcctcagcct tcgcaagagc gctttgcgtc tcttcaagtg ctttctccag 12780

ttcagccttt gtcatagtac accaccttgt cactgcccct gagaacatac tcagaatcaa 12840

tagtccaact catggtaggg catttgattc gaatcatctt cggagtaaaa ccatcaactg 12900

taccaatagc taggtgggag gaggtgttcc tgtggaccag gaagactaca ctgtccccta 12960

cctctagctt acgtcccact cgatctttca tagattaccc caagatatcc ggaaggtgaa 13020

cgctggggat gtagaggatc tccaggactt cgatggaata catccctcgc ctaagcccct 13080

cctcagcacc ccctttccca aacttcatat ccagccagag ttctgcggag atcggcgtct 13140

taaacgccaa cccccgttga ccgaagtcat gctcagactt aatgtagtac aggtctggca 13200

agaacttact cacaggaact cctccacgct catcagcttg aggtcatact ctccatcctt 13260

gtggttccgg aggagggcta cacctcgcca gtggtcgtta ccctgcggtc ccttgtagga 13320

ctcatcgtgg gtatagaagc ttccgactac cagcccgtgg attcgcttct tacctactgc 13380

ctcgatgtgg tacttgaatc cttgctcatg gccttggacg aagctgcgct tgatcttatt 13440

gaggcgatgc tcggcactcc cgccgtatgg ccgaccactg ttgggattgt agaagtagtg 13500

ggcgaaggcg acaccttcga taacacccac gtcgaggaaa tcatggacaa tccaatcgga 13560

cagatcaaaa tgatcgtacc caataaaacc ttggagagca gggttagaat tttcataccg 13620

cttgatacgc tcctcgtggt ttccgatgaa gaagtgcatt tctggtcggt agatacgctt 13680

cttacaaccc gcttggtgtt gctgtaggcg gcgaagagga tcgagcagaa ctcgcatcgc 13740

atcattacca gcttgtatgt cagcgaggac tcgacggcct tcgatcttag cggtaccacg 13800

gtcgtagctt gacagactgg gcatgtccca atggtcccca atatgaacaa ttcgcttggg 13860

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actccttgaa agtctctaga gtaaaccagc ggaatccgtt acgttcggcc cattccgcca 14040

tggattgctt tgtgccatct ttacgcttac taagccaatg gcaagctgtg ttaggacgct 14100

cgaagataaa cacaagttca gtatctgggg ggagagcctc cctcacccag atgtacttag 14160

atgcctccga ggcttcctgg aagtacccct taacctctac caacaggtgc ttcgtcgatc 14220

cacaaggttg tgaggtcgat accttgaagt cgggcttgta cttgtgctgt atgacgtagc 14280

tcaccgggtc tggcttgaac tgcatccagg gcatcgtctc gtggacgatc ttctcggttt 14340

cgctgtcgta cttcgtccca atcaatgact tcagtttggg tctgaagaat ctcccctgct 14400

ttgccaatga gccctccttc ttgaagcttc cagataaccg agagtgtccc ttcagtcagg 14460

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tacttcagtt tgatacgttg gatatgagag acaacctttt caacttggtt gtcagttagg 14580

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tctgtccacg tagcgcaatg agatcctctg ggtggcattc ccactgacct tcgtcatgga 17520

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gatcctcaat gtacttattc aaggactcat taaggtcgga tccacgtagc ttcttgccat 18600

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ctaccttgtg ctcaacgaac agtgactttc tccaatccac ttagtccccc ttaagacgct 19020

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gagacaacca gggtatcccg aggatccagc tgggcgcccc tgtccacgta gaagtcatcg 19440

tagaggctca tatccttgtc acgaatccgg gcgtttcgac gatccgagta ggaactcagg 19500

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acatgtttgg agtagcttac atggtcactc atttgtatct cctatagggg taaagcaacc 19740

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cccggacacg aagataaacc atccgatatc caagtgggag gaggctaccg ccttgatgta 19920

agcaaactga gccagcgtga tacaccaaga cactacgaac ccagccttga tcttgtcatc 19980

ccggagcagc ttagagttca atcccaggag gaatacctgg aagaatgcac tccagaagat 20040

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ccatggtccg tcttgtcgcc catcgtggcg taacggttgt gacccatgta gatgcgagcc 26460

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tgagcaccac ggataatatc cacggccagg agggatttga gaagagcgat ttcgttatca 26640

ctcgcgttag ttgtggcaca gaagcctacc aatccacaca ttgtatttct ccttagtaca 26700

tatctggttc gattgttacg ccggtatggc gctgaaggtg ctgcgggtta tccatgagca 26760

gtacgaaggc atcttgaaga gcctcttggt cctccagaag gtctcgtaca cgcacttggt 26820

gaccaatacg acgcagagaa gttaccgcag taatcgccgt atccagtcga acctgggtac 26880

ctgggaccat tgccaagttg taccgctctg ctgcaccatc gagtagtctg gaggtagtag 26940

atcgagccag cagcagccta cgatccaaaa ccctctgacg ctcacgttcc tgctcccgga 27000

gacgtcgctg acggttctgt tcatcctcca gaggatctac cccggagcga acaaagccca 27060

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catagtccgg agataccccc aggaagaaca catcacggag attcacctcg gagagcacct 27180

tgaggaactc ttccaggggg gtttctgcgt gagccatggc gaaggccttg agacacaaca 27240

tacgctgcat caggcctacc atttcctgtc gagtagtcag ggcgtgagca ccacggaact 27300

cgatggaccc gaagttgtgg gttacctgga ggttcaaggc cgaatacttg ggccaggagg 27360

taagacccaa gactttctct cggtcacctt ccggggccag gatacggcga ccgaaggtct 27420

gggccaacca gtcgttgctg aagaacggga tgcagaagtt actatcccga cgatacggct 27480

ggcagtgatc gaagaaaaca tcctcgaatg ccatgtaagt caggaccgtt cgttcgtaca 27540

ccggccactc tacgtcccgc atatccatgt gcaggtgggt ggagcaacgg aaggtaggag 27600

ccggaggggt ttcttccatc gaacttacaa aggattcaac ccgagtgatt gccctctggc 27660

cagaggcggg accggagaag acatactcca taccctcccg cagagagccg tcacccttca 27720

gatcccaccc atccacttct ggccagttgt tgaggccttc cagttcgact tcgaacccga 27780

aggaagcaac cgcaggaagt tcctcgtggt gttccggggc gatgatctgg ttcttacgga 27840

accctatctg tgtgccaata actgacatag caagtcctcc tggttcttga attgttcatc 27900

tgcggacagc cgcccatcca ccatctggcc aaccttcact cccttccagt gtacaacccc 27960

atccttgatg aagaagtccc ggtgggaggg agcagagatc atttcctcgg cctgggtgaa 28020

gattcggatc atcatttcgc cggtgatagc ctgttggcca tgattcagca agatgttccg 28080

gggatctaca cccttgcgct gggtacggtt gttcacgagg aaggatacat aggtatcacg 28140

aaccccacga ccaaagacgt catagtaccc actggagggc cgcacgcttt ctacctcgct 28200

gtagacaacc cctccgtagt agttactgcc gtcggggcga tacacgttgc caaggagacg 28260

aaacccgtcg aattgacggt cgtcaccaat ggactcggta tcgtccacgt acactacccg 28320

aggctcgccg tccacccgga agaaggcata ggtggaggag tagtacatgt tgaagtctcc 28380

ggacaaccga tggcgattat tcaggtcatt catataccac ccccagcgct ttaagtgcag 28440

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tggacttgta ctcctccagg aggtgcttgg aggtgtaagc ccgtactgcc atttcataga 28560

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cgtaaggctt atagcgcatt gcgccagcct tgccgtacag cttcttacgc tgggtgtcac 28680

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cacccaggag tcgaacggaa acgatacgct tcacgaactc ttccttggtg ctggccgggt 29040

cgatgttgta ctccagaaga acgttgtctt cctggacggc accaccggct acagccaagg 29100

gggcttcctt ggttccaccg atgaagccga tgacgctctg ggggttacgg tcgtagccga 29160

cgaaaacttc gggatctgca ccgatcaggg ggattgcgtt gttcattgca tagtctccag 29220

tttttcgagg atttcgggga tgctgtaggg actggtgggt acggtctcag acctttcccg 29280

acctgggtca cctacgtcga tagtgatagg tgccatgatg gagaggatcc gatcattgtg 29340

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cttgatatcg aagtaggtga tctccttgta cccacctacg ataccatcca tgacttcgct 29520

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agccgcgagg gtgaggatct ctgcattgca gcccaggatc ttatcacgat tttcctgggt 29700

gatgcgacgc atggaatcac ctacgcacca cagacgatcg cccattcgga gggcacagat 29760

gatggccgat gcgttcttcc tgaggtccac ccgtacatac actgcctgcc ggcgtcctgg 29820

gggagagaag tggtcgggat cattgagatt cttgagatca tcattgtaat cccaccaacg 29880

agtaggccag tcgatagagg ccgagaggat accaccgtcg gtaatcctgt tgaccaaatc 29940

actgttaagg aactccacca gtttaccaga ggtattctcg tgggtagata ccagcaggtg 30000

gccaaccccg gtaacccact cacctctgat accgccgtag gtctggtcgc aataggcccc 30060

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ggcgtcatag tacacattat gggctgcata cattcccatt tgatttctcc ttggttgtca 30180

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gccaatatca cccatgatcc ccagcatgac tactccgtat ttttcacagg taggatgaga 30300

aaggcggatg aaacccccca gctcactatc tacggtcgtg tagggatctt tctttccgaa 30360

gacggttggc tgaggggcta tggtaaccac ctccaccttg tccaactgaa tcttcaggaa 30420

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catccaacga ccgaatcgca tagactcttc agcggattgg atgtggatat cccccttctt 30540

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gataccgcag acaccttcct ttccgtgatg ggtgggggaa atcatttccg tcccgttaga 30840

atacttctcg aagggggaat ccttggcctt gctttcgtaa gaccagaagt gaaccttcgg 30900

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gagggcttta tcctctccat tcttggactt cataccgaag gcgtacttga tacgtgccat 31140

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tactagcgac ctctaagtta cttagaaggc gccacggcgc tgttgcttgc ctttggtcgg 31260

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ggcattgctt ggccgccggt gacgtaggta ggcagcttgc cgtcccactt ctcgatggca 31440

ttcagttcta ccacgccggg gttctggcgg agggcttcac cctggatgcg gaggctttcg 31500

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acttccttca cgaaggcttc cttgcccgga ccatagatgg cctcggcgga cttcttactg 31800

ctggcgttgt tcacggcgtt acggaccacc tgcggcacgt tcacgcttac gatctcgttc 31860

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tagaccatgc acaatgcgat gaacatgacg aacatcagta catagaagcc ccaatcatgc 32280

gggggcttac ctgggtggcc cagcaggccg tctatcttat gtatgttgtc gtagaggtcg 32340

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atctgttccg tcatagtaca tcagacctcc acccgtttac ctgagagctt cttggagtag 32460

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cttatccatg cggggatagc caggagcatt acccgagtgt agagcttgag gaccattgtt 32640

cttacctctt tcttaagatg aagaagatag taggttagaa ccttaggtat cctagggata 32700

taaagcaacc ccggacacct taaggttatt ataccatact tccagcagaa tgtcaaggcc 32760

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ccaggggttg tagtggcttc ccatgcggcg gaggatggtg tcggctacca cctgctcgct 33000

gttcaccgtg aagaccatcg taccgtggcc ctcgttggat tcacgacgga tagcgccgat 33060

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tctgcggtgc attagtaatc tcctttgatt agtcgtttgg ttgacttgat gattgaaacc 33240

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cccaggatgg ttgagatatc cctttccttc tggctcaact cacctgagtg cgagtcgcaa 33360

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acgatgaaca ggagtatgta gatcatggct tcatcactcc gtcaatgcca gcgccacaag 33480

cactgacaca acaaagaaga ccagggggag tccgatgatg aacaggaaca gagaggtcat 33540

ggtttcatta ccctcctctt aacatcacca cagattttac actgtaggtc gtaatagaca 33600

gattcgccta ccacccgacc tttgtgcatg aagtcgaagg gaccagtcct gatgatcttg 33660

taatcgtgga ccccgaagaa gcaccccagc cgaccgaaga ccatcaccaa tccctcgcgc 33720

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cggattggat catagcctcc ctggcgtggc gcaggtaagc cgatcggctg gactccatac 33840

ctacggcagc caaggtgaaa ccaagctcac cacggggctc ctgggggcct tcctggaggc 33900

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ggctttgcta cagacacgct gaaagaagta ttggtcatgg cgtcacctta ctgaacccga 34260

tgaacgatgt ggtccaccgg gatgccgagt tcgaagaagg tttcggtgat gaactgcccg 34320

aaattgatga cctttacgtg gcgctcaccg tccttgctta ccaaccagaa aacctggggt 34380

ttagtggagt tcatagacga tacctacacg tttgccgaag atagatacac ggatgtgggt 34440

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ttgagcgtcc accgggatga cctcgcagtc gctatggatg ctgcaaatga taccagcctc 34620

caggcaaacg aagtaaacat caccgtcatt ggggaggtag tggttgtggt catcccgaag 34680

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aaccttcttg ggcttttcta ccacattaat cttcatcgga ttacctcacg atgcaaaagg 34800

gatgctgtcc aaggtcgagg acaggacgaa gagaaccacc cacactacca gcaacaaccc 34860

attggaacgt gagcgtatgg cggcacatgc aatatacttc catgccatca ccgcgccctg 34920

ttcttaacca aagatgcccg cttggcacgg agcttgttca actccagggt tttaccaagg 34980

tggctaccat tggtattggt aagctcacga gttaccttgg caatcttgcg gtcgatggcc 35040

tcgatggctt gcatgttgcg gcttacctta cgatagtcgt tgcgtttcac gggatagttt 35100

cctttgttga tttcccaaga ctccccagcc tgcgaccata ggtccggtgg gggtttcggc 35160

caggaatcac catggcctca tcagttgggt cagttgatac ccatctcttc cttccagtcg 35220

cggaagaaga agtatccgat gcctacacaa gacaccacga tagctatcgt catcgcttca 35280

acctcttaat caattcttgc tgttcttgct tccaccgggg atcgggatgg accctcagca 35340

tcctagtgag cttctgcaac cgattaacca tcagtgccct ttcgtgggcg gcttcgtagg 35400

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tttacggggt tgtctactgg tttttcatac agtctaagga ctatcagtcc cccagcaaac 37380

ccccggatat gaacagtctt tgactaacat agggtatcaa cggaagtcaa taggggatca 37440

aggggttatc aagggatatt cccccggtct ccccctggac tcccctaaga tttttcttta 37500

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gtatactctc cagcagaacg caggatgagg gccgagggtg ttcctatgct cggatctggt 40260

gtagtcttcc ccattctgga agagaagttt gtatgtgagc ctttccagat ccccgatcac 40320

ttccatagga tcatcggtat cgacctcggg tttgaccacc ctaacgctat cgcctgtgtg 40380

gcctgggacc ctgagaaaga caaatactac ctctatgatg agagaagtga gagtggtgag 40440

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tatgccctgt tgatggcttc ccggcatgca cgtcctggtg ctgtacgaaa cagtggatac 40860

tacaggagtg atactgcaaa gttgacccct gattggtttg ggagtattgt ctaatggcta 40920

agcgtcgtcg caagattaag cctatggatg atgaacaggt acttcgtcat ctagaccaac 40980

ttgttaacga cgcccttgat ttcaactctt cggaactttc caagcagcgt tctgaggccc 41040

tgaagtatta cttcggtgag cccttcggta atgagcgccc tgggaagtcc gcgattgtat 41100

ctagggacgt ccaagagact gtagactgga ttatgccttc tcttatgaag gtattcacgt 41160

caggcggtca agtagttaag tatgaacctc agactgccga ggatgttgaa caggcagagc 41220

aagagactga atatgtgaac tacctcttca tgcgtaagaa cgaggggttc aaggtaatgt 41280

tcgattggtt ccaagacact ctgatgatga agaccggggt tgtaaaggtc tacgtggaag 41340

aggtcctgaa ccccaccttc gaacgattct ctggtctctc tgaggaaatg gtagcggata 41400

tcctggctga tccagacact gagattctag cacagagtgt ggacgaggat ggaacctaca 41460

gtattaaaat tcgcaaggac aagaagaagc gagagattaa agtcacctgt atcaagcctg 41520

agaacttcct ggttgatcgg ttggctacct gcattgatga tgcacgcttc ctctgtcacc 41580

gtgagaagta taccgtaagt gacctgaggc tcttgggtgt tcccgaggat gtactagatg 41640

agcttccata cgatgagtat gaattctctg atagtcagcc agaaaggttg gtacgtgata 41700

acttcgatat gactggccaa ctccagtaca actctgggga tgatgctgaa gccaaccgtg 41760

aggtatgggc ctccgagtgc tacacccttc tggacgtaga tggggatggt atctctgagt 41820

tgcgccgtat cctgtacgtg ggcgactaca tcatcagcaa cgagccttgg gattgccgtc 41880

ccttcgctga cctgaatgcc tatcgaattg cccataagtt ccacgggatg agtgtctacg 41940

ataagatccg agacattcaa gagatccgtt cggtgctcat gcgcaacatc atggacaata 42000

tctaccggac caaccaaggg cgatctgtag tcctggatgg ccaggttaac ctcgaagact 42060

tgctgaccaa cgaggcagcg ggtatcgttc gggttaaggc catgaactct atcatgcctc 42120

tggagacccc tcagctgtct ggggaagtct acggtatgct agataggcta gaggctgata 42180

ggggtaagcg gacaggcatc actgatcgta cccgaggcct agaccaaaac accctacact 42240

ctaaccaagc ggctatgagt gttaaccagt tgatgactgc tgctgagcaa cagattgacc 42300

tgattgcccg gatgtttgca gagactggtg ttaagcgttt gttccaactt ctgcatgacc 42360

atgccatcaa gtaccagaat caggaagagg tcttccagct acgaggcaag tgggttgcta 42420

ttaaccctgc caactggcga gagagatccg acctgacggt taccgttggt attggtaaca 42480

tgaacaaaga ccagcagatg ctccacctta tgcgtatctg ggaaatggcc caggctgtag 42540

tagggggtgg tggtcttggg gtccttgtct ctgagcagaa cctttataat atccttaagg 42600

aagtcacaga gaacgctggg tacaaagacc cggatcgctt ctggactaac ccggattctc 42660

ctgaagctca acgggctaag gccatcagag agcagaagga agcacaacct aagcctgaag 42720

atatcaaagc ccaagctgat gcccaacgtg cccaatcgga cgctatggct aagcaagcgg 42780

aggcccagat gaagcaggta gaggctcaga tccgactggc tgagatcgaa ctgaagaagc 42840

aagaggctgt ccttcagcag agagaaatgg cccttaagga agcggaacta caacttgagc 42900

gtgatcgttt cacttgggaa cgggctcgta acgaagcgga gtatcatctt gaggcaactc 42960

aggctcgggc tgcttatatc ggagacggta aggtacctga gactaagaag ccctcgaagg 43020

cagtgaggaa ataatcttgg gagaacgttt tggctatagt ctagtgctga ctgatgcggc 43080

acaacagatg gtacgtgaga acgttcttcc tgagcttttc cgtattgtcc aagaagagat 43140

cgagggagag tggaagtcca cggcacctaa ggattcagaa tccagggagg ccatctacca 43200

cgaactacat gccctcaacc gcgtacaact tcgtattcag gctatcctgg attcgatcac 43260

tctaaaggag tataagtaat ggaccttgag aatcaaggca tggatgaatt cgaggcagcg 43320

gaagccttcg gagatttgct aggtgatgac ctcctggccc ccgtgatgaa accgtggatg 43380

gtaaagtcgt aggggaagaa gaggaggaag aggtagtaga cgaaggtact ccagaggaca 43440

ccgaagaggt tgagtccgag gaggaagaag agggttctga ggaagatccc gaggttgagt 43500

ccgaggaaga tcctgaggat aaactcttcg agatcccgat tggggatgaa gtctacgagg 43560

ttaacttcga agagcttaag agtggctacc ttcgcaatga agagttcgta actcgacaag 43620

ctgaactaga ggatcagtat gcagctaagt tcgaagagct tgatgctgaa cgctctaatc 43680

tactggccga gcttgagcag tatgctgtta ccgctatcgc tggtgctaat cagtatgaca 43740

atgtaaactg ggagcagctt aaggcccagg atccagagaa gtatcaaacc cttcgactgg 43800

aagccctgga agcccgagac cgagcccagg ctcttatcaa acgtcgtaac gacattaagg 43860

ctatgcaaga gaagcgagcc gagattgtcc actctgccta cgttaagcgt cagacagagc 43920

tagccaagaa acttatcccg gaaatgacta cggatgagtc ttggggtgac aagattgtgt 43980

cctacggcaa atcgattgga tactccgagg atgagatccg agggatatct gatgcccgcc 44040

aactggctgt actcgatgca gcacgtaagt gggctgaatc tcaggtccgt cgcaaggctg 44100

ccctagagaa gaaggaggag actgaactac ctgctgctgt taagcctgta gctcgtaggg 44160

cggaagcctc agagggttct aagcgggtta aagctgcccg tgctaatctg aggaaagacc 44220

agtcggttga agccgctgct gctctcttct cctctctcga cattttctaa tagaaggaag 44280

tacattatat ggcaactcca actaatgccg tctccactgt agagatcaac ggtaagcgcg 44340

aagaccttat cgatatcatc tacaacatcg caccctatga caccccgttc atgactgcta 44400

tcggcaaggg cgtagctacc gctatcaccc acgagtggca gactgatgaa ctccgccagc 44460

cgggtaagaa cacccgagtt gaaggtgagg atgcaaccat caaggctggt agcttcacca 44520

ccatgttgaa caactactgc caaatctcgg acgagaccct gcaagtcacc ggtaccgcag 44580

ataaggtcaa gaaggctggt cgtaagaacg aactggcgta tcagctggct aagaagtcga 44640

aggaactgaa gctggacatg gaatacgcca tggtcggtgc ccctcaggct aagatccagc 44700

gtaacaccac tactccgggt cagatggcaa atatctttgc ctactacaag accaacggtt 44760

cggtaggtgc taacggtacc ctgccaactg gtgatggttc cgacactggt accgctggtg 44820

acctccgtct tctgaccgaa gacatgctcc tgaatgcctc tgaggctatc tggcgcaacg 44880

gtggtcaggc taactcgatc cagacttcga gctcgatcaa gaaggccatc agcaagaaca 44940

tgaagggtcg tgcaactgag atcaccctgg acgcctcgga caaccgcatt gcgcagaccg 45000

tggacgtcta cgagagtgac ttcggtaagt acaccattcg tgccaaccgc tggttccacg 45060

aaaacaccat gttcatcttt gatccgaaga tgcacgccct ctgctacctg cgtccgttct 45120

tccagcatga actggctaag accggtgaca gcgagaagcg ccagctgctg gttgagtaca 45180

ccctgcgtgt aaacaacgag aagtccggtg ctc 45213

Claims (5)

1.一种从自然界分离的短尾病毒科噬菌体Pse-AEP-3(登录号：KCTC 13165BP)，所述短尾病毒科噬菌体Pse-AEP-3具有特异性杀死铜绿假单胞菌的能力，并且具有以SEQ ID NO:1表示的基因组。

2.一种用于预防或治疗铜绿假单胞菌导致的疾病的组合物，所述组合物包含如权利要求1所述的噬菌体Pse-AEP-3(登录号：KCTC13165BP)作为活性成分。

3.如权利要求2所述的组合物，所述组合物以包含杀菌剂和抗生素的药物组合物的形式提供。

4.一种预防或治疗铜绿假单胞菌导致的疾病的方法，所述方法包括：

将如权利要求2或权利要求3所述的包含所述噬菌体Pse-AEP-3(登录号：KCTC13165BP)作为活性成分的组合物施用于除人之外的动物。

5.如权利要求4所述的方法，其中将所述组合物以包含杀菌剂和抗生素的药物组合物的形式施用于除人之外的所述动物。