KR101643235B1 - 황색포도상구균에 대해 숙주감수성을 나타내는 박테리오파지 시포비리데 패밀리 sap4 및 이를 함유하는 조성물 - Google Patents
황색포도상구균에 대해 숙주감수성을 나타내는 박테리오파지 시포비리데 패밀리 sap4 및 이를 함유하는 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 황색포도상구균에 대해 숙주감수성을 나타내는 박테리오파지 시포비리데 패밀리 SAP4 (Siphoviridae family SAP4) (KACC97023P) 및 이를 함유하는 조성물에 관한 것으로, 본 발명의 박테리오파지는 기존에 약한 용균활성을 보이던 박테리오파지와 달리, 메티실린 항생제에 감수성이 있는 황색포도상구균 세균(MSSA)과 메티실린에 저항성을 갖는 황색포도상구균 세균(MRSA) 모두에 우수한 사멸능을 보이므로, 생물학적 조절제로서 효과적으로 활용될 수 있다.
Description
본 발명은 박테리오파지 및 이를 함유하는 조성물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 황색포도상구균에 대해 숙주감수성을 나타내는 박테리오파지 시포비리데 패밀리 SAP4 (Siphoviridae family SAP4) (KACC97023P) 및 이를 함유하는 조성물에 관한 것이다.
황색포도상구균(Staphylococcus aureus)은 그람 양성의 구균이며, 포자를 형성하지 않는 통성혐기성균으로, 주로 가축 분변, 염증 상처부위 혹은 사람의 손이 많이 닿는 조리도구 등에서 발견된다. 인간과 동물에 감염하여 수술 후 감염, 농양, 심장 내막염 및 독소 증후군 등의 심각한 질병을 유도하는 대표적인 병원성 세균이다. 황색포도상구균이 내는 독소성 쇼크 신드롬 독소 TSST-1(Toxic ShockSyndrome Toxin-1), 엔테로톡신, EF(edema factor), α-톡신, β-톡신, γ-톡신 등의 독소는 심각한 식중독을 유발하기도 한다.
황색포도상구균을 제어하기 위해 현재까지는 항생제가 주로 사용되어 왔다. 하지만, 메티실린 저항성 황색포도상구균 균주(Methicillin-resistant S. aureus), 반코마이신 저항성 황색포도상구균 균주(Vancomycin-resistant S. aureus) 등 항생제 저항성 세균을 발생하는 문제가 유발했다. 또한, 항생제 남용으로 인해 항생제가 병원균뿐 아니라 유익균도 죽임으로써 장내미생물의 균형이 무너져 염증성 장질환이나 알레르기는 물론 비만, 당뇨병 같은 대사질환도 크게 늘어났다고 보고된 바 있다.
이러한 문제를 극복하기 위한 방안으로 박테리오파지를 항생제 대체 물질로 사용할 수 있다. 1915년 영국의 미생물학자인 프레데릭 트워트가 처음으로 포도상구균의 용균 현상을 관찰하였고, 1917년 프랑스 세균학자인 펠릭스 데렐 역시 적리균에서 같은 현상을 관찰하게 되면서, 이것이 세균에 감염하는 바이러스(세균바이러스)에 의한 것임을 알아내었다. 이후, 세균을 감염하는 바이러스는 “세균(Bacteria)”을 “먹는다(Phage)”라는 의미에서 박테리오파지(bacteriophage)로 명명하였으며 간단히 “파지”로도 불리고 있다.
파지는 크게 2가지로, 용균성 생활사(lytic cycle)만을 반복하는 독성 파지(virulent phage)와, 용균성 생활사와 용원성 생활사(lysogenic cycle)를 모두 거치는 약독성 파지(temperate phage)로 분류한다. 용균성 생활사에 있는 파지의 경우, 세균 감염 약 30분 후에 100~200개의 새로운 파지를 만들어 세균의 막을 파괴하며 밖으로 나와 용균시키는데, 세균의 증식속도보다 파지의 증식속도가 훨씬 빠르므로 세균의 증식을 제한하는 중요한 요인이 될 수 있다. 약독성 파지는 숙주세균의 유전자에 파지의 유전자 정보를 넣어 파지의 모양은 사라지지만 숙주세균이 파괴되지도 않으며, 이런 상태는 숙주세균이 좋은 환경조건에 있는 한 지속하는데, 숙주세균의 환경이 악화되면, 숙주세균의 유전자에 있던 일부의 파지 유전자는 용균 사이클로 바뀌어 새로운 파지를 만들어 숙주세균을 용균시킨 후, 숙주세포 밖으로 방출된다.
파지가 발견된 후 1910년부터 1930년대에 걸쳐서 선(腺) 페스트·콜레라 등의 세균성 질환을 치료하는데 파지를 이용하는 방안이 연구되었다. 그러나 파지의 숙주특이성 문제 및 파지의 치료목적으로의 제조에 있어, 숙주세균의 내독소, 외독소 문제 등 그 당시 과학적으로 해결할 수 없는 문제가 있어 이용에 제한이 있었다. 이와 유사한 시기인 1929년 플래밍이 발견한 페니실린 및 1943년 워크스만이 발견한 스트렙토마이신은 파지와 대조적으로 항균범위가 넓어 하나의 약으로 복수의 감염증에 효과를 나타냈으며, 처음에는 내성균 문제도 없었기 때문에 항생제를 이용한 화학요법제가 널리 사용되게 되고, 효과가 불확실한 파지요법은 점점 사라지게 되었다. 또한, (1) 파지의 숙주에 대한 감수성으로 인해 임상에 사용시 감염성이 다른 다양한 파지주가 필요한 점, (2) 동물의 생체 내에서는 파지의 용균작용이 일어나기 어려운 점, (3) 파지 내성균이 동일 세균집단에 존재한다는 이유 등으로 인해, 1950년대에 WHO에 의해 파지요법이 무효 선언되고, 동구권과 구 소련연방에서만이 명맥이 근근이 유지되어 왔다.
그런데, 1980년대에 들어 파지요법에 대한 생각이 바뀌게 되는데, 1982년 영국의 연구자그룹인 스미스와 휴긴스는 뇌막염 치료 모델실험으로 마우스를 이용하여 다음과 같이 실험하였다 (Smith HW, Huggins MB, J. Gen. Microbiol, 1982, Feb;128(2); 307-18). 즉, 마우스의 피하 근육 내에 균을 주사하고 반대쪽의 피하에는 균의 특이적인 독성 파지를 주사한 결과, 파지를 주사하지 않은 대조군은 100% 폐사한 것에 비해 파지를 주사한 실험군의 경우 100% 생존하였으며, 항생제(스트렙토마이신 등)의 효과보다도 우월한 결과를 나타낸 것이다. 특히, 놀라운 것은 균을 직접 뇌 내에 주사한 경우와 파지를 근육주사 하는 경우 모두에서 파지가 뇌에서 회수가 됨으로써, 근육 주사한 파지가 혈류를 통해 뇌 조직으로 이동하여 혈액뇌관문(blood-brain barrier)을 통과한다는 사실을 확인할 수 있었던 것이다.
그 후, 독성 파지를 이용하여 송아지의 대장균성 설사증, 어류의 다양한 질병, 반코마이신 내성 장구균 패혈증, 결핵균, 닭의 파라티푸스 및 대장균 O157:H7 등 다양한 질병을 성공적으로 예방 및 치료한 사례가 보고되었으며, 파지를 직접 사용하는 방법뿐만 아니라, 파지가 숙주세균의 세포벽을 특이적으로 파괴하는데, 작용하는 리신(lysin)을 이용하여 탄저균, 폐렴구균 등에 특이적인 약제의 개발도 이루어지고 있는 실정이다.
한편, 최근 들어 항생제의 남용과 불필요한 처방으로 인해 기존 항생제로는 잘 죽지 않는 내성을 갖는 '슈퍼세균'이 발생하고 있다. 하지만, 항생제 개발이 내성균의 출현 속도를 따라잡지 못하고 있어, 항생제 내성균의 심각성이 큰 문제로 대두되고 있다.
따라서, 기존 항생제를 대체할 수 있는 물질 또는 항생제 내성 세균제어 방법의 개발이 요구되고 있으며, 이에 대한 연구가 시급한 실정이다.
본 발명에서는 상기에서 살펴본 바와 같이 심각한 질병을 유발하는 병원성 세균인 황색포도상구균을 제어하는 박테리오파지를 새롭게 발견하여 제공하고자 한다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 황색포도상구균에 대해 숙주감수성을 나타내는 박테리오파지 시포비리데 패밀리 SAP4 (Siphoviridae family SAP4) (KACC97023P)를 제공한다. 본 발명의 박테리오파지 시포비리데 패밀리 SAP4 (Siphoviridae family SAP4)는 황색포도상구균에 대한 감염능력이 있어 이를 사멸시킬 수 있다.
따라서, 본 발명의 박테리오파지 시포비리데 패밀리 SAP4 (Siphoviridae family SAP4)는 황색포도상구균의 감염으로 인한 질병의 치료에 사용할 수 있고, 식품, 사료 등에 첨가되어 항생제 내성 세균을 제어할 수 있는 생물학적 조절제로 사용할 수도 있으며, 손세정제 등으로 사용될 수도 있다.
본 발명의 박테리오파지 시포비리데 패밀리 SAP4 (Siphoviridae family SAP4)는 수축성이 없는 긴 꼬리(a long non-contractile tail)를 갖는 복합형의 시포비리데(Siphoviridae)에 속하는 것으로 동정되었고, 이중 나선 DNA (double stranded DNA)이며, 그 크기는 43,120 bp이다.
본 발명의 시포비리데(Siphoviridae)에 속하는 박테리오파지 시포비리데 패밀리 SAP4 (Siphoviridae family SAP4)는 사람 및 가축 등에 당뇨발, 농양, 독소 증후군 등의 질병을 일으키는 대표적인 박테리아인 황색포도상구균에 대한 숙주 감수성을 가져 이들을 사멸시킬 수 있다.
한편, 본 발명은 황색포도상구균에 대해 숙주감수성을 나타내는 박테리오파지 시포비리데 패밀리 SAP4 (Siphoviridae family SAP4) (KACC97023P)를 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 세균사멸용 조성물을 제공한다. 상기 세균사멸용 조성물은 바람직하게 황색포도상구균 사멸용 조성물일 수 있는데, 황색포도상구균은 메티실린에 감수성이 있는 황색포도상구균 또는 메티실린에 저항성을 갖는 황색포도상구균일 수 있다.
본 발명에 의한 세균 사멸용 조성물은 통상적인 미생물 제제 제조방법으로 제제화할 수 있다. 제제화의 방법 및 수단에 대해서는 특별히 한정되지 않으나, 인체에 투여하는 경우는 약제학적으로 허용하는 범위 내에서, 가축 또는 어류에 투여하는 경우는 수의학에서 허용하는 범위 내에서, 제제화하고 그에 따라 투여경로를 정할 수 있다.
본 발명의 세균 사멸용 조성물은 유효성분인 본 발명의 박테리오파지 시포비리데 패밀리 SAP4 (Siphoviridae family SAP4) 외에, 필요에 따라 담체, 기타 보조제 등을 포함할 수 있는데, 담체는 생리식염수, 증류수, 사료, 박테리아용 배지 (예, Tryptic Soy Broth 등) 등이 될 수 있으며, 보조제는 pH 교정 등의 목적으로 완충액 등을 첨가하여 사용할 수 있다.
본 발명의 세균 사멸용 조성물은 액상, 분말상 등의 형태로 제조화될 수 있는데, 반드시 상기 2가지 제제에 한정되는 것은 아니고, 다양한 형태의 제형으로 제제화될 수 있다.
본 발명의 세균 사멸용 조성물은 경구, 정맥 내, 동맥 내, 복강 내, 근육 내, 경피, 비측 내, 흡입 또는 직장 등의 경로를 통해 통상적인 방식으로 투여할 수 있다. 본 발명의 세균 사멸용 조성물의 투여량은 투여 대상에서 포도상구균을 사멸시키는 효과를 이루는데 요구되는 양을 의미한다. 따라서, 질환의 종류, 질환의 중증도, 제형의 조율 및 투여대상의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 경로, 투여 시간 및 기간, 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자에 따라 그 양이 조절될 수 있다.
본 발명의 박테리오파지 시포비리데 패밀리 SAP4 (Siphoviridae family SAP4)는 기존에 약한 용균활성을 보이던 박테리오파지와 달리, 메티실린 항생제에 감수성이 있는 황색포도상구균 세균(MSSA)과 메티실린에 저항성을 갖는 황색포도상구균 세균(MRSA) 모두에 대해 우수한 감염능을 보이는데, 박테리오파지 감염 후 3시간 이후부터 용균활성을 보일 뿐만 아니라, 그 용균활성을 30시간 이상 오래 유지하는 특징을 갖는다.
본 발명의 박테리오파지 또는 이를 포함한 세균 사멸용 조성물은 기존 항생제에 대한 내성 여부와 상관없이 황색포도상구균을 사멸시킬 수 있으므로, 황색포도상구균의 감염에 의한 질환 치료용으로 사용할 수 있고, 항생제 내성을 갖는 황색포도상구균에 사용 시, 기존 항생제로 제거할 수 없었던 항생제 내성균을 사멸시킬 수 있으므로, 기존 항생제 대체물로 유용하게 활용될 수 있다. 특히, 식품업, 축산업 및 어업에서, 식품, 축산물 및 수산물의 항생제 잔류 문제 등을 해결할 수 있는 항생제 사용의 대안으로써 제공될 수 있다.
한편, 본 발명은 황색포도상구균에 대해 숙주감수성을 나타내는 박테리오파지 시포비리데 패밀리 SAP4 (Siphoviridae family SAP4) (KACC97023P)를 포함하는 것을 특징으로 하는 식품 첨가제를 제공한다. 또한, 본 발명은 황색포도상구균에 대해 숙주감수성을 나타내는 박테리오파지 시포비리데 패밀리 SAP4 (Siphoviridae family SAP4) (KACC97023P)를 포함하는 것을 특징으로 하는 식품 조성물을 제공한다. 상기 식품첨가제 또는 식품은 박테리오파지 시포비리데 패밀리 SAP4 (Siphoviridae family SAP4)를 함유하기만 하면 그 제형에 특별히 국한되지 않으나, 대상식품은 황색포도상구균에 의해 오염되기 쉬운 식품이면 더욱 바람직하다.
한편, 본 발명은 황색포도상구균에 대해 숙주감수성을 나타내는 박테리오파지 시포비리데 패밀리 SAP4 (Siphoviridae family SAP4) (KACC97023P)를 포함하는 것을 특징으로 하는 사료 첨가제를 제공한다. 또한, 본 발명은 황색포도상구균에 대해 숙주감수성을 나타내는 박테리오파지 시포비리데 패밀리 SAP4 (Siphoviridae family SAP4) (KACC97023P)를 포함하는 것을 특징으로 하는 사료 조성물을 제공한다. 상기 사료 첨가제 또는 사료 조성물은 박테리오파지 시포비리데 패밀리 SAP4 (Siphoviridae family SAP4)를 함유하기만 하면 그 제형에 국한되지는 않으나, 황색포도상구균에 감염되기 쉬운 가축을 대상으로 하는 사료 첨가제 또는 사료이면 더욱 바람직하다.
본 발명의 박테리오파지는 기존에 약한 용균활성을 보이던 박테리오파지와 달리, 메티실린 항생제에 감수성이 있는 황색포도상구균 세균(MSSA)과 메티실린에 저항성을 갖는 황색포도상구균 세균(MRSA)에도 우수한 감염능을 가져 박테리오파지 감염 후, 3시간 이후부터 용균 활성을 보이며, 그 용균 활성이 30시간 이상 오래 유지되므로 넓은 범위의 숙주를 효과적으로 억제할 수 있는 생물학적 조절제로서 활용될 수 있다.
또한, 본 발명의 박테리오파지는 기존 항생제에 대한 내성 여부와 상관없이 황색포도상구균을 사멸시킬 수 있으므로 황색포도상구균의 감염에 의한 질환 치료용으로 사용할 수 있을 뿐만 아니라, 항생제 내성을 갖는 황색포도상구균으로 인한 의료 문제의 해결에도 이용될 수 있다.
또한, 본 발명의 박테리오파지는 식품업, 축산업 및 어업에서 식품, 축산물 및 수산물의 항생제 잔류 문제 등을 해결할 수 있는 항생제 사용의 대안으로서 사용될 수 있을 뿐 아니라, 황색포도상구균이 쉽게 감염되는 조리도구 및 용기 등을 살균하는 친환경 대체살균제로서 사용할 수도 있다.
도 1은 본 발명에서 선별한 박테리오파지 시포비리데 패밀리 SAP4 (Siphoviridae family SAP4)의 전자현미경 사진이다.
도 2는 박테리오파지 시포비리데 패밀리 SAP4 (Siphoviridae family SAP4)의 용균 활성능을 보여주는 그래프이다. 'Control'은 박테리오파지 시포비리데 패밀리 SAP4 (Siphoviridae family SAP4) 무처리군 (대조군)이고, 'SAP4'는 박테리오파지 시포비리데 패밀리 SAP4 (Siphoviridae family SAP4) 처리군 (실험군)이다.
도 3은 박테리오파지 시포비리데 패밀리 SAP4 (Siphoviridae family SAP4)의 숙주 수용기를 확인시켜주는 실험결과이다 (1: 황색포도상구균 야생형, 2: 테이코산을 합성하는 유전자를 제거한 돌연변이 균주, 3: 테이코산 합성 유전자를 회복시킨 재조합 균주).
도 2는 박테리오파지 시포비리데 패밀리 SAP4 (Siphoviridae family SAP4)의 용균 활성능을 보여주는 그래프이다. 'Control'은 박테리오파지 시포비리데 패밀리 SAP4 (Siphoviridae family SAP4) 무처리군 (대조군)이고, 'SAP4'는 박테리오파지 시포비리데 패밀리 SAP4 (Siphoviridae family SAP4) 처리군 (실험군)이다.
도 3은 박테리오파지 시포비리데 패밀리 SAP4 (Siphoviridae family SAP4)의 숙주 수용기를 확인시켜주는 실험결과이다 (1: 황색포도상구균 야생형, 2: 테이코산을 합성하는 유전자를 제거한 돌연변이 균주, 3: 테이코산 합성 유전자를 회복시킨 재조합 균주).
이하, 본 발명의 구성을 하기 실시예를 통해 구체적으로 설명하고자 한다. 다만, 본 발명의 권리범위가 하기 실시예에만 한정되는 것은 아니고, 그와 등가의 기술적 사상의 변형까지를 포함한다.
[실시예 1: 황색포도상구균에 특이적인 박테리오파지의 분리]
병원 유래 샘플에서 분리된 다양한 종류의 황색포도상구균의 염색체 상에 프로파지 상태로 존재하고 있는 박테리오파지를 분리하기 위해, 경상대학교병원 균주은행에서 분양받은 'Staphylococcus aureus clinical isolate 0136'를 취하여 이로부터 박테리오파지 분리실험을 수행하였다.
황색포도상구균을 선택적으로 사멸시킬 수 있는 프로파지 상태의 박테리오파지를 분리하기 위하여, 세균 배양용 TSB 배지(Tryptic Soy Broth)에 0.1 ㎖의 황색포도상구균(황색포도상구균 RN4220) 배양액을 첨가한 후, 2시간 동안 37℃에서 진탕배양하였다. 그 후, 10 μM의 미토마이신C를 처리하여 황색포도상구균의 염색체에 삽입되어 있는 박테리오파지가 세균을 용해시키고 나올 수 있도록 유도하였다. 이후, 상기의 배양액을 2시간 동안 37℃에서 진탕배양하였다. 그 후, 13,000 rpm의 속도로 1분 동안 4℃에서 원심분리하여 상등액을 취한 후, 이를 0.22 μm 막필터로 여과하였다. 이렇게 얻어진 여과액을 용균반 분석(plaque assay)을 통해 황색포도상구균에 특이적인 박테리오파지를 검출하였다.
용균반 분석을 통한 박테리오파지의 검출은, 0.1 ㎖의 여과액과 12시간 이상 배양한 세균 0.1 ㎖의 현탁액 그리고 1 M 염화칼슘 0.1 ㎖를 섞어 주었다. 혼합 후, TSB에 낮은 농도의 아가를 섞은 소프트 아가 배지 (0.4% TSB soft agar)와 함께 섞어서 1.5% TSA 배지를 포함하는 플레이트에 부었다. 이후, 상기 플레이트를 37℃에서 12시간 동안 배양하였다.
일정 시간 경과 후, 목적하는 박테리오파지가 플레이트 상에 나타난 경우에 독립되고 투명한 용균반이 관찰되었다. 이 용균반 영역을 백금 루프를 이용하여 분리해 낸 다음, 새로운 세균 배양액에 넣어 37℃에서 배양하였는데, 배양액이 뿌옇게 보였지만 세균만 넣은 대조군과 비교해보았을 때 더 맑아짐을 확인하였다.
이후 배양액을 원심분리하고, 상등액을 취해 0.22 μm 막필터를 통해 여과시켜 용해물에 남아있는 모든 세균을 제거하고, 여과액만을 취하였다. 이때, 상기 여과액은 박테리오파지만을 포함한다. 상기의 과정을 통해 얻은 박테리오파지 용액을 가지고, 아가 배지 상에서 다르게 희석하고 주입하여 용균반의 재분리를 3회 수행하였고, 이와 같은 일련의 과정을 통해 순수한 박테리오파지를 얻을 수 있었다. 상기 얻은 박테리오파지를 '박테리오파지 시포비리데 패밀리 SAP4 (Siphoviridae family SAP4)'라고 명명하였다.
[
실시예
2 : 박테리오파지
시포비리데
패밀리
SAP4
(
Siphoviridae
family
SAP4
)의 형태 관찰 및 분류]
본 실시예에서는 박테리오파지 시포비리데 패밀리 SAP4 (Siphoviridae family SAP4)의 형태를 관찰하고자 하였다.
박테리오파지 시포비리데 패밀리 SAP4 (Siphoviridae family SAP4)의 형태를 관찰하기 위해 염화세슘(CsCl) 밀도 구배법 (밀도: 0.39 g/㎖, 0.6 g/㎖, 0.67 g/㎖ 및 0.95 g/㎖)을 이용한 원심분리 (25,000 rpm, 2시간, 4℃)를 통하여 박테리오파지를 정제한 다음, 투과전자현미경을 사용하여 박테리오파지의 형태를 관찰하였다.
이를 상세히 설명하면, 정제된 박테리오파지 시포비리데 패밀리 SAP4 (Siphoviridae family SAP4)를 구리 격자(cupper grid)에 올리고, 2% 액상 우라닐 아세테이트(Uranyl acetate)로 음성 염색(negative staining)을 하고 건조하였다. 염색된 시료를 80 kV의 전압으로 에너지 여과 투과 전자현미경(LIBRA 120, CarlZeiss)을 이용하여 관찰하였고, 그 결과를 도 1에 나타내었다.
관찰결과, 박테리오파지를 모양으로 분류하는 기준으로 보았을 때, 박테리오파지 시포비리데 패밀리 SAP4 (Siphoviridae family SAP4)는 머리가 길고 수축성이 없는 긴 꼬리(a long non-contractile tail)를 갖고, 시스(sheath)가 없으므로, 복합형의 시포비리데(Siphoviridae)에 속하는 것으로 분류하였다. 머리의 길이는 높이 131.5 nm, 너비 55.7 nm로 장형이며, 꼬리의 길이는 303.5 nm이다 (도 1). 도 1은 본 발명에서 선별한 박테리오파지 시포비리데 패밀리 SAP4 (Siphoviridae family SAP4)의 전자현미경 사진이다.
한편, 상기와 같이 얻어진 시포비리데 속 박테리오파지 시포비리데 패밀리 SAP4 (Siphoviridae family SAP4)를 미생물기탁기관인 농촌진흥청 국립농업과학원 농업유전자정보센터(KACC)에 2014년 12월 4일자로 기탁하여 수탁번호 KACC97023P를 부여받았다.
[
실시예
3 : 박테리오파지
시포비리데
패밀리
SAP4
(
Siphoviridae
family
SAP4
)의 숙주별 감수성(
susceptibility
) 확인]
본 실시예에서는 박테리오파지 시포비리데 패밀리 SAP4 (Siphoviridae family SAP4)의 숙주별 감수성을 확인하고자 하였다.
숙주별 감수성은 연속 희석 적하법(serial dilution dropping method)을 사용하여 확인하였다 (Adams, M.H. 1959. Bacteriophage, pp27-34. Interscience Publishers Inc., New York). 10시간 배양한 세균 배양액과 0.4%의 소프트 아가 배지를 섞은 후, TSA 아가 플레이트 상에 부어서 37℃에서 15분간 건조하였고, 그 위에 희석배수 별로 희석된 박테리오파지 시포비리데 패밀리 SAP4 (Siphoviridae family SAP4)를 떨어뜨리고, 상온에서 말린 후 37℃에서 10시간 정치 배양하였다.
균주가 파지에 대해 감수성을 갖는 경우 플레이트 상에 용균반이 보이게 되며, 이는 세균 세포가 완전하게 용해되어 사멸된 결과를 나타낸다. 만약 감수성이 약한 경우, 뿌옇게 영역이 생길 수 있고, 리소스타핀(lysostaphin)과 같은 세균의 증식을 억제할 수 있는 항균성 효소가 존재하는 경우 억제 영역이 생길 수 있다.
하기 표 1에서는 박테리오파지 시포비리데 패밀리 SAP4 (Siphoviridae family SAP4)를 사용하여 메티실린 항생제에 감수성이 있는 황색포도상구균 세균(MSSA)과 메티실린에 저항성을 갖는 황색포도상구균 세균(MRSA)을 대상으로 숙주 감수성을 실험한 결과를 나타내었다.
| 숙주 | 박테리오파지 시포비리데 패밀리 SAP4 (Siphoviridae family SAP4)a | |
| Staphylococcus aureus RN 4220 | MSSA | C |
| Staphylococcus aureus Newman | MSSA | C |
| Staphylococcus aureus CCARM 3090 | MRSA | I |
| Staphylococcus aureus CCARM 3793 | MRSA | C |
| Staphylococcus aureus ATCC 6538 | MSSA | I |
| Staphylococcus aureus ATCC 23235 | MSSA | C |
| Staphylococcus aureus ATCC 29213 | MSSA | C |
| Staphylococcus aureus KCTC 1916 | MSSA | C |
| Staphylococcus aureus ATCC 12600 | MSSA | I |
| Staphylococcus aureus ATCC 35983 | MSSA | C |
| Staphylococcus aureus ATCC 33586 | MSSA | C |
| Staphylococcus aureus ATCC 33593 | MSSA | C |
a) C는 Clear plaque (투명한 용균반)을 형성하였다는 의미이고, I는 Inhibition zone (억제 영역)을 형성하는 것을 의미함. 억제영역은 박테리오파지에 의한 독립된 하나의 용균반이 형성되지는 않지만 어떠한 물질에 의해 세균의 증식이 억제됨을 의미함.
실험결과, 본 발명의 박테리오파지 시포비리데 패밀리 SAP4 (Siphoviridae family SAP4)는 메티실린 항생제에 감수성이 있는 포도상구균 세균(MSSA) 8종과 메티실린에 저항성을 갖는 황색포도상구균 세균, 스타필로코쿠스 아우레스(Staphylococcus aureus) CCARM 3793 균주를 용해시키는 세균 사멸능이 확인되었다. 다만, 메티실린에 저항성을 갖는 황색포도상구균 세균 스타필로코쿠스 아우레스(Staphylococcus aureus ) CCARM 3090에 대해서는 억제 영역이 형성되는 것을 확인할 수 있었다.
[
실시예
4: 박테리오파지
시포비리데
패밀리
SAP4
(
Siphoviridae
family
SAP4
)의 용균
활성능
]
본 실시예에서는 황색포도상구균 균주에 대한 박테리오파지 시포비리데 패밀리 SAP4 (Siphoviridae family SAP4)의 용균 활성능을 확인하고자 하였다.
박테리오파지 시포비리데 패밀리 SAP4 (Siphoviridae family SAP4)의 용균 활성 확인을 위해 두 개의 시험군으로 나누어 실험을 실시하였다. 대조군(●)에는 숙주균주인 황색포도상구균(RN 4220)을 액체배지에서 배양하며 실험하였고, 실험군(■)에는 숙주 균주인 황색포도상구균(RN 4220)을 액체배지에서 1시간 30분 배양 후, 10 mM의 염화칼슘과 함께 박테리오파지 시포비리데 패밀리 SAP4 (Siphoviridae family SAP4)를 감염시켰다. 감염 직후부터 시작하여 일정 시간 간격으로 대조군과 실험군 각각의 흡광도(OD600)를 측정하며 세포의 생장 및 사멸 정도를 파악하였다.
실험 결과, 도 2에서 보는 바와 같이 본 발명의 박테리오파지 시포비리데 패밀리 SAP4 (Siphoviridae family SAP4)는 숙주에 감염 후 3시간 이후부터 용균 활성을 보이기 시작하며 그 용균 활성이 30시간 이상 오래 유지되는 것을 확인할 수 있었다 (도 2). 이와 같은 특징으로 말미암아, 본 발명의 박테리오파지 시포비리데 패밀리 SAP4 (Siphoviridae family SAP4)는 오랜시간 용균 활성을 유지할 수 있는 효과적인 생물학적 조절제로 활용될 수 있는 것으로 판단할 수 있었다. 도 2는 박테리오파지 시포비리데 패밀리 SAP4 (Siphoviridae family SAP4)의 용균 활성능을 보여주는 그래프이다. 'Control'은 박테리오파지 시포비리데 패밀리 SAP4 (Siphoviridae family SAP4) 무처리군 (대조군)이고, 'SAP4'는 박테리오파지 시포비리데 패밀리 SAP4 (Siphoviridae family SAP4) 처리군 (실험군)이다.
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실시예
5 : 박테리오파지
시포비리데
패밀리
SAP4
(
Siphoviridae
family
SAP4
)의 숙주 수용기 확인]
본 실시예에서는 황색포도상구균에 감염하는 박테리오파지 시포비리데 패밀리 SAP4 (Siphoviridae family SAP4)의 작용 경로를 알아보기 위해 숙주 수용기 탐색을 목표로 실험을 수행하였다.
10시간 배양한 야생 균주, 테이코산을 합성하는 유전자를 제거한 돌연변이 균주 및 테이코산 합성 유전자를 회복시킨 재조합 균주의 세 가지 세균 배양액과 0.4%의 소프트 아가 배지를 각각 섞어 TSA 아가 플레이트 상에 부어서 상온에서 15분 동안 건조하였고, 그 위에 희석배수 별로 희석된 박테리오파지 시포비리데 패밀리 SAP4 (Siphoviridae family SAP4)를 떨어뜨리고 상온에서 말린 후 37℃에서 10시간 정치배양하였다.
실험결과, 도 3에서 보듯이 야생균주는 파지에 대해 감수성을 가지므로 플레이트 상에 독립된 투명한 영역인 용균반이 보인 반면, 테이코산 합성 유전자가 제거된 돌연변이 균주에 대해서는 용균반을 형성하지 못하는 것으로 관찰되었다. 또한, 테이코산 합성 유전자를 회복시킨 균주를 숙주세균으로 하여 실험을 수행하였을 때, 박테리오파지 시포비리데 패밀리 SAP4 (Siphoviridae family SAP4)가 세포를 완전하게 사멸시킨 것으로 확인되었다. 이와 같은 결과로부터 본 발명의 박테리오파지 시포비리데 패밀리 SAP4 (Siphoviridae family SAP4)가 숙주세포를 감염시킬 때 테이코산을 수용체로 사용하는 사실을 확인할 수 있었다 (도 3). 도 3은 박테리오파지 시포비리데 패밀리 SAP4 (Siphoviridae family SAP4)의 숙주 수용기를 확인시켜주는 실험결과이다 (1: 황색포도상구균 야생형, 2: 테이코산을 합성하는 유전자를 제거한 돌연변이 균주, 3: 테이코산 합성 유전자를 회복시킨 재조합 균주).
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실시예
6: 박테리오파지
시포비리데
패밀리
SAP4
(
Siphoviridae
family
SAP4
)를 포함하는 세균사멸용 조성물(미생물 제제)의 제조]
1) 액상 제제 1
박테리오파지 시포비리데 패밀리 SAP4 (Siphoviridae family SAP4)를 황색포도상구균 배양액에 감염시켜 수득한 상등액을 여과하여 여과액을 준비하였다. 박테리오파지의 pfu (plaque forming unit; 파지가 용균반을 형성하는 것을 수치화한 단위, 세균의 경우 cfu (colony forming unit)와 유사한 개념임)를 계산하고, TSB 배지에 5.0x109 pfu/㎖의 양으로 준비하여 세균사멸용 액상 제제를 제조하였다.
2) 액상 제제 2
상기 액상제제 1의 여과액을 생리식염수 100 ㎖ 당 박테리오파지 시포비리데 패밀리 SAP4 (Siphoviridae family SAP4)가 5.0x1011 pfu/㎖이 되도록 혼합하여 세균사멸용 액상 제제를 제조하였다.
3) 분말형 제제
대두분말 10 g 당 박테리오파지 시포비리데 패밀리 SAP4 (Siphoviridae family SAP4)가 5.0x109 pfu/㎖이 되도록 액상제제 1의 여과액을 첨가, 혼합, 동결건조 및 분말화하여 세균사멸용 분말형 제제를 제조하였다.
[
실시예
7: 박테리오파지
시포비리데
패밀리
SAP4
(
Siphoviridae
family
SAP4
)를 함유하는 식품 첨가제의 제조]
표고버섯 분말 50중량%, 새우 분말 30중량%, 다시마 분말 15중량%, 상기 실시예 6에서 제조한 분말형 제제 5중량%를 혼합하여 조미료로 사용될 수 있는 식품 첨가제 300 g을 제조하였다.
[
실시예
8: 박테리오파지
시포비리데
패밀리
SAP4
(
Siphoviridae
family
SAP4
)를 함유하는 식품 조성물의 제조]
1) 우유 제조
우유 200 ㎖에 상기 실시예 6에서 제조한 액상 제제 2를 1%(w/v) 첨가하여 본 발명에 따른 우유 조성물을 제조하였다.
2) 바나나 쥬스 제조
바나나를 믹서에 넣고 갈아 바나나 원액 180 ㎖를 준비한 후, 상기 실시예 6에서 제조한 액상 제제 2를 1%(w/v) 첨가하여 본 발명에 따른 바나나 쥬스 조성물을 제조하였다.
[
실시예
9: 박테리오파지
시포비리데
패밀리
SAP4
(
Siphoviridae
family
SAP4
)를 함유하는 사료 첨가제의 제조]
α-토코페롤 5.0중량%, 오징어간유 0.75중량%, 효모 93.25중량%, 상기 실시예 6에서 제조한 분말형 제제 1.0중량%를 혼합하여 사료 첨가제를 1 kg을 제조하였다.
[
실시예
10: 박테리오파지
시포비리데
패밀리
SAP4
(
Siphoviridae
family
SAP4
)를 함유하는 사료의 제조]
1) 산란계용 사료조성물 제조
상기 실시예 6에서 제조한 분말형 제제 1.0중량%를 시판 산란계용 사료(디럭스 산란(제품명), 부국사료, 한국)에 첨가하여 산란계용 사료조성물 1 kg을 제조하였다.
2) 넙치 양식용 사료조성물 제조
어분 58중량%, 대두박 4중량%, 콘글루텐분 3중량%, 소맥분 28.8중량%, 오징어간유 4중량%, 비타민 혼합제 1.2중량% 및 미네랄 혼합제 1중량%를 포함한 기본 사료에 상기 실시예 6에서 제조한 분말형 제제 1.0중량%를 첨가하여 넙치 양식용 사료조성물 1 kg을 제조하였다.
Claims (8)
- 황색포도상구균에 대해 숙주감수성을 나타내는 박테리오파지 시포비리데 패밀리 SAP4 (Siphoviridae family SAP4) (KACC97023P).
- 황색포도상구균에 대해 숙주감수성을 나타내는 박테리오파지 시포비리데 패밀리 SAP4 (Siphoviridae family SAP4) (KACC97023P)를 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 황색포도상구균 사멸용 조성물.
- 삭제
- 제2항에 있어서,
상기 황색포도상구균은,
메티실린에 감수성이 있는 황색포도상구균 또는 메티실린에 저항성을 갖는 황색포도상구균인 것을 특징으로 하는 황색포도상구균 사멸용 조성물.
- 황색포도상구균에 대해 숙주감수성을 나타내는 박테리오파지 시포비리데 패밀리 SAP4 (Siphoviridae family SAP4) (KACC97023P)를 포함하는 것을 특징으로 하는 식품 첨가제.
- 황색포도상구균에 대해 숙주감수성을 나타내는 박테리오파지 시포비리데 패밀리 SAP4 (Siphoviridae family SAP4) (KACC97023P)를 포함하는 것을 특징으로 하는 식품 조성물.
- 황색포도상구균에 대해 숙주감수성을 나타내는 박테리오파지 시포비리데 패밀리 SAP4 (Siphoviridae family SAP4) (KACC97023P)를 포함하는 것을 특징으로 하는 사료 첨가제.
- 황색포도상구균에 대해 숙주감수성을 나타내는 박테리오파지 시포비리데 패밀리 SAP4 (Siphoviridae family SAP4) (KACC97023P)를 포함하는 것을 특징으로 하는 사료 조성물.
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