KR100723574B1 - 신규 프로브를 이용하여 돼지콜레라 바이러스 유전자를정량분석하는 방법 및 이의 시약 - Google Patents

Abstract

본 발명은 돼지콜레라 바이러스 유전자에 특이적인 탐침자(이하 프로브)와 이를 이용한 돼지콜레라 바이러스의 증폭 유전자를 정량 분석하는 방법에 관한 것이다.

본 발명은 돼지콜레라 바이러스의 특정 유전자를 증폭하고, 증폭된 유전자의 특정 부위에 상보적인 프로브를 이용하여 증폭된 유전자를 정량분석하는 방법과 그에 유용한 시약을 제공하는데 있다.

돼지콜레라 바이러스, 유전자 증폭, 유전자 정량분석

Description

신규 프로브를 이용하여 돼지콜레라 바이러스 유전자를 정량분석하는 방법 및 이의 시약{Quantification analysis methods of classic swine fever virus using novel probe and it’s reagent}

도 1는 본 발명에 따른 돼지콜레라 바이러스의 5’NTR 부위의 프로브 위치를 나타낸 것이고,

도 2는 본 발명에 따른 돼지콜레라 바이러스의 5'NTR 증폭 결과를 나타낸 것이고,

도 3은 본 발명에 따른 돼지콜레라 바이러스의 표준대조시료의 농도와 흡광도를 회귀분석 결과를 나타낸 것이다.

본 발명은 돼지콜레라 바이러스 유전자를 정량분석하는 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 유전형과 관계없이 돼지콜레라 바이러스에 특이적으로 핵산 교잡 반응을 하는 신규한 프로브를 고정상으로 제공하여 돼지콜레라 바이러스 유전자를 정량분석 하는 방법과 이의 시약에 관한 것이다.

돼지콜레라 바이러스(Classical swine fever virus : CSFV, hog cholera virus : HCV)는 우리나라 제1종 법정전염병이며 국제수역사무국(OIE)이 분류하는 List A 질병이다. 이 병은 돼지에서 치사율 및 이환율이 매우 높은 전염성 질병으로 모든 연령의 돼지에 감염될 수 있다. 감염된 돼지는 일반적으로 고열, 피부 발적, 식욕 결핍, 변비, 설사, 백혈구 감소, 후구마비, 유사산 등 번식장애 등을 수반하는 등 경제적 손실이 매우 크다. 지난 ‘96-’03년까지 지난 8년간 72농가에서 153건이 발생하여 15,565두가 발생하여 6,701두가 폐사하였다. 특히 최근‘03년에는 26농가 70건에 걸쳐 5,398두가 전국적으로 발생하여 예방접종 중지 이후 양돈 산업에 막대한 경제적 손실을 끼치고 있는 실정이다.

돼지콜레라 바이러스를 검출하는 방법으로 조직배양을 이용한 바이러스 분리법, 형광항체법, 항원검출 효소결합면역분석법(ELISA) 등이 사용되고 있다.

그러나, 상기 방법은 생물학적 검증이나 단백질 수준에서 검출하는 방법으로 정량검사가 가능하고 대량검사에 적용할수 있으나 검출감도가 낮은 단점이 있다.

표준검사법으로 돼지콜레라 바이러스의 특정 RNA를 증폭하여 검사하는 방법으로서 RT-PCR(reverse transcription-polymerase chain reaction)이 사용되고 있는데 생물학적 검증이나 단백질 수준의 검사보다 100배이상 높은 검출감도를 나타낸다. 그러나 RT-PCR은 아가로즈 겔 전기영동(agarose gel electrophoresis)을 통하여 특이유전자의 증폭 유무를 확인해야 하므로 다량검사에는 효과적이지 못하고 육안으로 판독해야 하므로 정량검사가 불가능하여 바이러스 양이나 감염정도를 검사할수 없어 병인학적 예찰검사에 사용이 어렵다. 또한 정량검사나 객관적 판독결과가 유추되지 못하면 진단시약으로 개발이 불가능하다.

그리고, 유전자를 정량검사하는 방법으로 최근에는 형광을 사용하는 리얼-타임 중합효소 연쇄반응(Real-time PCR)이 개발되어 정량검사와 객관적 판독결과를 유추할 수 있으나 시약이 매우 비싸며 고가의 장비가 필요할 뿐만 아니라 대량검사가 불가능한 문제점이 있다.

이에, 본 발명자는 상기와 같은 문제점을 해결하기 위하여, 증폭한 돼지콜레라 바이러스 유전자에 대한 특이적인 프로브를 개발하여 증폭 유전자와 교잡반응시켜 결합시키고 결합여부를 증폭유전자에 표식된 단백질과 이에 결합하는 효소 복합체(Enzyme conjugate)를 반응시켜 대량의 유전자에 대한 정량적 반응을 유도하고 이를 분광광도계를 사용하여 측정하고자 하였다.

이러한 본 발명의 기술은 최근 통칭하는 분석특이시약(Analytes Specific Reagents, 이하 ASR이라함)기술에 속하며, 유전자 검사기술과 단백질 정량분석기술을 결합한 기술이라 할 수 있다.

따라서, 본 발명의 목적은 돼지콜레라 바이러스의 증폭된 특정 RNA 유전자를 정량분석 할 수 있는 기술을 제공하는 것이다. 이를 위하여 돼지콜레라 바이러스의 유전형에 관계없이 특정유전자와 결합할 수 있으며 정량반응이 가능한 프로브를 제공하고 면역분석법을 사용하여 결합된 유전자의 양을 정량분석할 수 있는 방법 및 시약을 제공하는데 있다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위해서, 본 발명은 서열번호 1 내지 서열번호 3로 표시되는 염기서열 및 상기 염기서열에 상보적인 염기서열로 이루어지는 군에서 적어도 1개 이상 선택된 염기서열을 포함하는 돼지콜레라 바이러스 진단용 프로브를 제공한다.

또한, 다른 목적을 달성하기 위해서, 본 발명은 상기 프로브를 사용하여 시료로부터 중합PCR 증폭한 돼지콜레라 바이러스 유전자를 정량분석하는 방법을 제공한다.

나아가, 본 발명은 서열번호 1 내지 서열번호 3로 표시되는 염기서열 및 상기 염기서열에 상보적인 염기서열로 이루어지는 군에서 적어도 1개 이상 선택된 프로브를 이용하여 시료 내에 돼지콜레라 바이러스를 정량분석하는 돼지콜레라 바이러스 정량분석용 시약을 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명하기로 한다.

이때, 사용되는 기술 용어 및 과학 용어에 있어서 다른 정의가 없다면, 이 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 통상적으로 이해하고 있는 의미를 가진다.

또한, 종래와 동일한 기술적 구성 및 작용에 대한 반복되는 설명은 생략하기로 한다.

본 발명은 유전형에 관계없이 돼지콜레라 바이러스의 유전자와 정량적으로 결합하는 신규한 프로브와 상기 프로브에 대한 상보적인 염기서열의 프로브를 사용하여 시료로부터 돼지콜레라 바이러스 질병의 감염여부 및 정량분석을 하고, 이와 관련된 키트를 이용하여 간편하고 용이하게 시료 내 돼지콜레라 바이러스를 정량분 석할 수 있게 한 것이다.

이때, 본 발명에서 돼지콜레라 바이러스의 검출방법으로는 효소결합면역분석법(ELISA) 또는 방사선면역 분석법(RIA)을 사용할 수 있으며, ELISA을 사용하는 것이 보다 바람직하다.

구체적으로, 본 발명에서는 하기의 단계를 포함하여 이루어진 효소결합면역분석법을 사용하는 것이 바람직하다.

(a) 피검체로부터 돼지콜레라 바이러스의 RNA를 분리하고, 상기 RNA를 RT-PCR처리하여 두가닥의 DNA 유전자로 전환한 다음, 이를 표지물이 부착된 프라이머와 PCR증폭하여 시료를 준비하는 단계;

(b) 상기 증폭된 DNA 시료를 가열 또는 알칼리 처리하여 단일 가닥 상태로 변성시켜주는 단계;

(c) 상기 변성된 유전자를 플레이트에 고정된 제 1 항 기재의 프로브와 핵산 교잡 반응을 수행하는 단계;

(d) 비특이적으로 결합한 반응물을 세척액으로 제거하고, 상기 (a) 단계의 표지물과 특이적 결합하고 발색효소가 부착된 상보성 물질을 사용하여 교잡 반응을 수행하는 단계; 및

(e) 비특이적으로 결합한 반응물을 세척액으로 제거하고 상기 (d) 단계의 발색효소와 반응 하는 기질 반응액을 사용하여 발색정도를 측정한 다음 표준대조시료와 비교하여 돼지콜레라 바이러스 유전자를 정량분석하는 단계.

이때, 본 발명에서 사용되는 피검체는 돼지 체액에서 처리한 전혈, 혈청, 혈 장, 림프액 또는 세포간액 등을 의미하며, 시료는 상기 피검체에 포함된 돼지콜레라 바이러스로부터 RNA를 분리하고, 표지물이 부착된 프라이머를 사용하여 RT-PCR로 두가닥의 DNA 유전자로 PCR증폭하여 처리한 것을 지칭하고, 피검체 시료는 상기 피검체로부터 돼지콜레라 바이러스의 유전자를 DNA로 증폭한 산물로 정의한다.

그리고, 본 발명에서는 구체적으로 상기 프라이머에 부착된 표지물로 비오틴(Biotin), 플루오 레세인(Fluorescein) 및 디곡시제닌(Digoxigenin) 등을 사용하고, 상기 표지물질에 대한 상보성 물질은 스트랩트아비딘 혹은 아비딘(streptavidin, avidin), 항플루오레세인 항체(anti fluorescein antibody), 항디곡시제닌 항체(anti digoxigenin antibody) 등을 각각 사용하며, 상기 상보성 물질에 부착된 발색 효소는 퍼옥시데이스(peroxidase) 혹은 알칼라인 포스파테이스(alkaline phosphatase) 등을 사용하고, 상기 효소에 대응되는 기질 반응액((TMB, NBT/BCIP)을 사용하는 것이 바람직하다.

하지만, 본 발명은 상술한 방법으로 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 프로브를 고정상으로 이용하여 돼지콜레라의 바이러스를 검출할 수 있는 방법이라면 어떠한 방법을 사용해도 무방하다.

또한, 상술한 표지물, 상보성 물질 및 발색효소는 상호간 결합 특이성이 높고 반응 친화력이 강하며, 극히 낮은 농도에서도 반응을 할 수 있는 민감성을 가진 것이라면 상술한 것 이외에 그 어떠한 것을 사용해도 무방하다.

그리고, 본 발명에서는 상기 프로브를 고정상으로 이용하여 시료 내에 돼지콜레라 바이러스를 정량분석하는 돼지콜레라 정량분석용 시약을 제조한다.

그리고, 상기 정량분석용 시약은 다음의 구성성분이 포함되도록 하는 것이 바람직하다.

상기 프로브를 고정한 고정체와;

피검체에 포함된 돼지콜레라 바이러스로부터 RNA를 분리하고, 표지물이 부착된 프라이머를 사용하여 RT-PCR로 두가닥의 DNA 유전자로 PCR증폭하여 처리한 시료; 및

상기 프라이머의 표지물과 특이적으로 결합하고 발색효소가 부착된 상보성 물질 및 상기 발색효소와 반응하여 발색되는 기질 반응액.

이때, 본 발명에서 프로브는 시약 반응을 위하여 웰의 플레이트에 고정하고, RNA 분리와 RT-PCR 및 돼지콜레라 바이러스 증폭용 프라이머와 PCR은 통상적으로 공지되어 있는 방법을 사용하거나 상업적으로 판매되고 있는 키트나 세트를 이용하여 수행한다.

그리고, 상기 상보성 물질과 발색효소 및 기질 반응액은 상술한 정량분석방법과 동일 물질을 사용하는 것이 바람직하다.

이하, 본 발명을 구체적인 실시예에 의해 보다 더 상세히 설명하고자 한다. 하지만, 본 발명은 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 사상과 범위 내에서 여러가지 변형 또는 수정할 수 있음은 이 분야에서 당업자에게 명백한 것이다.

실시예 1 : 프로브의 선발

돼지콜레라 바이러스의 유전자를 분석하기 위하여, 미국국립보건원 산하 National Center for Biotechnology Information(NCBI)에서 돼지콜레라 바이러스의 5'-Non translation region(5‘NTR)의 유전자 서열을 수집하여 염기서열을 배열(align)하고 분석하여 하기 표 1과 도 1에 나타낸 바와 같이, 공통 프로브를 설정하였고, NH기가 부착되어 있는 96 웰(Well) 플레이트에 프로브를 고정화하기 위하여 프로브의 5’말단에 다중 티아민(dTTP,10개)을 추가하고 인산화하였다.

실시예 2 : 프로브의 고정

10mM EDC(1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimide), 10mM 1-Melm₇(1-methylimidazole pH7.0), 10pmol 프로브(프로브 1, 프로브 2 및 프로브 3)를 혼합한 혼합용액을 NH기가 부착된 96-웰 플레이트에 100㎕씩 분주한 후 50℃에서 5시간 동안 반응시켜 프로브를 부착하였다. 또한 세척용액(100mM Tris-HCl PH7.5, 150mM Nacl, 0.1% Tween20)과 3차 증류수로 각각 3회 세척하여 부착 되지 않은 프로브를 세척하였다. 세척이 완료된 플레이트는 4℃에 보관 후 사용하였다.

실시예 3 : 돼지콜레라 바이러스의 시험관내 배양 및 역가 산출

농림부 국립수의과학검역원의 바이러스과에서 분양받은 CSFV 백신주(LOM)를 PK-15세포에 접종하고 탄산가스 배양기에서 2-3일 동안 배양하고, 세포 배양액을 얼렸다 녹인(freeze-thawing) 후 6000 rpm에서 10분간 원심분리하여 상층액을 수확하였다. 수확한 상층액을 10배 계단 희석(serial dilution)하여 96 플레이트에 50 ㎕씩 분주하고 세포부유액을 50 ㎕을 첨가한 후 탄산가스 배양기에서 2일 동안 배양하였다. 배양된 바이러스 역가를 다음의 공식을 사용하여 1X10⁶ TCID₅₀/100㎕ 를 산출하였다.

TCID₅₀(50% Tissue Culture Infection Dose) 공식: ∑T₅₀ = t*+△t

t* : 희석배수 중 8개 well 전부가 CPE를 나타내는 최종 희석배수

△t: (t*에서 감염된 Well수 + t* 이상의 희석배수에서 감염된 Well 수)-1/2

실시예 4 : 돼지콜레라 바이러스의 유전자 증폭

돼지콜레라 바이러스 유전자를 RNA 분리키트(Qiagen, Germany)를 사용하여 분리하고, RT-PCR 프리믹스(RT-PCR Premix, Qiagen, Germany) 20㎕와 분리유전자(templete) 5㎕를 혼합하여 RT-PCR하였다.

RT-PCR 프리믹스는 5 X RT-PCR 완충용액(buffer) 6 ㎕, 10mM dNTP 1 ul, RT-PCR 효소 믹스(Enzyme Mix) 1 ㎕, 프라미머 믹스(Primer mix, cosmogenetech, Korea) 1 ㎕ ( Forward 20pmol, Reverse 20pmol ), dH₂O 11 ㎕를 혼합하여 사용하였다.

단, 유전자 증폭에 사용된 프라이머는 미국국립보건원 산하 NCBI의 유전자 은행의 접속번호(Accession Number) D49532의 유전자 염기서열 94-113와 496-514를 사용하였으며, 그 중 94-113의 5’에 바이오틴(Biotin)을 부착하여 증폭유전자의 검출 시 효소복합체(Enzyme conjugate)와 반응할 수 있도록 설계하였다.

실시예 5 : 돼지콜레라 바이러스의 증폭 유전자의 검사법

실시예 2에서 제작된 프로브 고정 플레이트에 10㎕의 변성용액(0.125M NaOH, 0.1M Nacl)과 10㎕의 5‘NTR 증폭 유전자를 첨가하고 실온에서 10분간 반응하였다. 반응 후 교잡 반응을 위하여 80ul의 교잡반응용액(6.25XSSC, 0.125% Tween20, 0.5% Casein PH7.5)을 첨가하고 37℃에서 1시간동안 반응하였다. 반응이 끝난 후 용액을 플레이트에서 버린 후 세척 용액( 0.5XSSC, 0.1% Tween20 )으로 3회 세척하고, 100㎕의 20mU 스트렙토아비딘 호스 라디쉬 퍼옥시다제[Streptavidin-Horse raddish peroxidase(SA-HRP), Roche사]를 첨가한 후 37℃에서 1시간 동안 반응하였다. 반응이 끝난 후 용액을 플레이트에서 버린 후 세척 용액으로 3회 세척하고 발색제인 100㎕의 TMB(3,3',5,5'-tetramethylbenzidine, Moss사)을 첨가하고 실온에서 15분간 발색반응을 유지시키고, 100㎕의 정지액(0.5M 황산)을 첨가하여 반응을 정지하였다. 정지 후 판독기(ELISA reader, Molecular Device사)를 이용하여 450nm에서 흡광도를 측정하였다.

실시예 6 : 돼지콜레라 바이러스 5’NTR 증폭 유전자의 정량 분석법

표준대조시료(Standard control)를 구성하기 위하여 실시예 4에서와 같이 돼지콜레라 바이러스의 5’NTR을 증폭하고 정제 한 후 U.V. 분광도계(spectrophoto- metor)A₂₆₀ 에서 유전자의 농도를 측정하였다. 측정된 5’NTR 증폭산물은 2배 또는 10배씩 증류수로 계단 희석하여 표준대조시료로 사용하였다. 준비된 표준대조시료는 실시예 5에서와 같이 검사하여 흡광도를 측정하였다.

그리고, 돼지콜레라 바이러스의 유전자 정량 및 정량분석 결과는 하기 표 2에 나타내었다.

그리고, 도 3에 도시된 바와 같이, 표준대조시료의 농도와 흡광도를 회귀분석하면 r²=0.978로 유의성 있는 정량기준선을 나타내었으며 방정식을 작성할 수 있었다. 이때, 정량범위는 4ng/㎕ - 70ng/㎕로 하였다.

그리고, 본 발명에 따라 돼지콜레라 바이러스의 역가에 따른 5’NTR 유전자를 정량분석하였으며, 이의 결과를 하기 표 3에 나타내었다.

상기 결과, 피검체 시료 1 내지 8번(10⁶-10^-1 TCID₅₀/100㎕)의 시료 중 고역가인 1-4번 시료는 증폭 유전자의 농도가 정량분석 범위를 벗어나 실제농도와 추정농도(predicted concentration)가 정확히 일치하지는 않았지만 비교적 농도의 차이는 구분할 수 있었으며, 정량분석 범위내의 피검체 시료 5-6번시료는 비교적 실제농도와 추정농도가 일치하였고, 이는 한천 겔 전기영동의 양성결과와도 일치하였다.

이상, 상기 실시 예를 통하여 설명한 바와 같은 방법으로 제작된 돼지콜레라 바이러스의 유전자 정량분석 시약은 돼지콜레라 바이러스의 5’NTR 유전자를 정량분석 하는데 유용하였다. 이 기술은 돼지콜레라 바이러스의 유전자 뿐만 아니라 많은 동물 병원체의 유전자에 대한 정량검사 기술로 응용될 수 있으며 고가의 Real-time PCR과 같은 정량검사방법을 대체할 수 있을 것이다. 또한 이와 같은 키트는 대한민국에서는 개발하여 상업화에 성공한 기업이 없는 실정이다.

또한, 개발된 원료와 완제품은 돼지콜레라가 발생하고 있는 유럽, 중남미, 아시아, 러시아 등 세계시장에 수출을 추진할 수 있어 대한민국의 동물 질병 유전자 진단시약에 대한 기술력을 선양하고 외화를 획득하는데 일조 할 수 있는 효과가 있다.

서열목록 전자파일 첨부

Claims (5)

1. 서열번호 1 내지 서열번호 3로 표시되는 염기서열 또는 상기 염기서열에 상보적인 염기서열로 이루어지는 돼지콜레라 바이러스 진단용 프로브.
2. 제 1 항 기재의 프로브를 사용하여 시료로부터 중합PCR 증폭한 돼지콜레라 바이러스 유전자를 정량분석하는 방법.
3. 제 2 항에 있어서,

   상기 검출은 하기 (a) 내지 (e) 단계를 포함하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 돼지콜레라 바이러스 유전자를 정량분석하는 방법.

   (a) 피검체로부터 돼지콜레라 바이러스의 RNA를 분리하고, 상기 RNA를 RT-PCR처리하여 두가닥의 DNA 유전자로 전환한 다음, 이를 표지물이 부착된 프라이머와 PCR증폭하여 시료를 준비하는 단계;

   (b) 상기 증폭된 DNA 시료를 가열 또는 알칼리 처리하여 단일 가닥 상태로 변성시켜주는 단계;

   (c) 상기 변성된 유전자를 플레이트에 고정된 제 1 항 기재의 프로브와 핵산 교잡 반응을 수행하는 단계;

   (d) 비특이적으로 결합한 반응물을 세척액으로 제거하고, 상기 (a) 단계의 표지물과 특이적 결합하고 발색효소가 부착된 상보성 물질을 사용하여 교잡 반응을 수행하는 단계; 및

   (e) 비특이적으로 결합한 반응물을 세척액으로 제거하고 상기 (d) 단계의 발색효소과 반응 하는 기질 반응액을 사용하여 발색정도를 측정한 다음 표준대조시료와 비교하여 돼지콜레라 바이러스 유전자를 정량분석하는 단계
4. 서열번호 1 내지 서열번호 3로 표시되는 염기서열 또는 상기 염기서열에 상보적인 염기서열로 이루어지는 프로브를 이용하여 시료 내에 돼지콜레라 바이러스를 정량분석하는 돼지콜레라 정량분석용 시약.
5. 제 4 항에 있어서,

   상기 프로브를 고정한 고정체와;

   피검체에 포함된 돼지콜레라 바이러스로부터 RNA를 분리하고, 표지물이 부착된 프라이머를 사용하여 RT-PCR로 두가닥의 DNA 유전자로 PCR증폭하여 처리한 시료; 및

   상기 프라이머의 표지물과 특이적으로 결합하고 발색효소가 부착된 상보성 물질 및 상기 발색효소와 반응하여 발색되는 기질 반응액을 포함하여 이루어지는 돼지콜레라 바이러스 정량분석용 시약.

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