상기와 같은 목적을 달성하기 위한 본 발명은,
돼지콜레라 유전자형을 검사하는 방법으로,
돼지 혈청 또는 혈액으로부터 RNA를 추출하는 단계;
상기 추출된 RNA를 다중(Multiplex) 역전사 중합효소 연쇄반응(Multiplex Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction; RT-PCR)을 이용하여 증폭하는 단계;
상기 증폭된 돼지콜레라 유전자를 올리고 유전자칩에 교잡반응시키는 단계; 및
상기 교잡반응에서 특이적으로 결합된 돼지콜레라 유전자 및 이의 유전자형을 확인하는 단계를 포함하는 유전자침을 이용한 돼지콜레라 유전자의 검사방법을 제공한다.
본 발명의 다른 실시로는, 서열번호: 1 내지 13으로 이루어진 군으로부터 선 택된 1종 이상의 염기서열, 및 상기 서열번호: 1 내지 13의 10-mer 이상의 염기 상동성을 갖는 탐침(probe)으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 전방향 염기서열을 포함하며, 상기 전방향 염기서열 및 상기 전방향 염기서열 중 10-mer 이상의 염기 상동성을 갖는 탐침의 역방향 염기서열로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 염기서열을 포함하는 유전자칩을 제공한다.
이에 상기 염기서열 및 이의 역방향 염기서열이 펩타이드 헥산(Peptide nucleic acid: PNA) 또는 차단 헥산(Locked nucleic acid: LNA)으로 치환된 염기서열을 포함하는 탐침을 포함하고, 상기 염기서열은 5'-말단 위치에 형광염료가 부착되며, 상기 형광염료는 Cy3, Cy5, 비오틴-결합물질, (5-(2'-아미노에틸)아미노-1-나프탈렌 황산)(EDANS), 테트라메틸로다민(TMR), 테트라메틸로다민 이소시아네이트(TMRITC), x-로다민 및 텍사스 레드로 이루어지는 군으로부터 선택되고, 형광염료가 부착된 상기 전방향 염기서열 또는 상기 역방향 염기서열과 반응하는 하이브리드화 대조군(Hybridization Control, 교잡반응) 탐침을 추가로 포함하는 유전자칩을 제공한다.
또한 상기 하이브리드화 대조군 탐침과의 반응 유무를 통해 시료와의 반응 조건이 정확한지 확인하고, 상기 하이브리드화 대조군 탐침을 기준으로 유전자 탐침의 위치를 알려주며, 구아닌 인식 유전자칩 기판을 이용하여 돼지콜레라 바이러스 및 소바이러스성설사증 바이러스 유전자를 검출하고, 서열번호: 14 내지 18로 기재되는 염기서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 유전자칩을 제공한다.
그리고 돼지콜레라 및 소바이러스성설사증 바이러스가 양성임을 확인하고 유전자형 검사 올리고 염기칩에 사용된 탐침의 종류와 위치를 확인하는데 사용되고, 돼지콜레라 및 소바이러스성설사증 바이러스의 유전자를 함께 검사하며, 돼지콜레라 및 소바이러스성설사증 바이러스의 백신주 및/또는 야외주 바이러스 유전자 및 이의 유전자형을 동시에 검사하는 유전자칩을 제공한다.
본 발명의 다른 실시로, 상기에 따른 유전자칩을 이용하여 돼지콜레라 바이러스 또는 소바이러스성설사증 바이러스 유전자를 검출하는 유전자칩을 포함하는 진단키트를 제공한다.
그리고 본 발명의 또 다른 실시로, 상기에 따른 유전자칩을 이용하여 돼지콜레라 바이러스 또는 소바이러스성설사증 바이러스 유전자를 검출하는 유전자칩을 이용한 돼지콜레라 바이러스 또는 소바이러스성설사증 바이러스 유전자의 검사방법을 제공한다.
이와 같은 본 발명에 의하면, 돼지 혈청 또는 혈액으로부터 RNA를 추출하는 단계; 상기 추출된 RNA를 다중(Multiplex) 역전사 중합효소 연쇄반응(Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction; 이하, MP RT-PCR이라함)을 이용하여 증 폭하는 단계; 상기 증폭된 돼지콜레라 유전자를 올리고 유전자칩에 교잡반응시키는 단계; 및 상기 교잡반응에서 특이적으로 결합된 돼지콜레라 유전자 및 이의 유전자형을 확인하는 단계를 포함하는 것이다
상기 RNA 추출방법은 Qiagen사의 RNeasy Mini Kit에 포함된 사용자 매뉴얼에 따라 RNA를 추출하는 것이 바람직하며, 돼지콜레라 및 소바이러스성설사증 바이러스의 경우에 5'-NTR 영역의 422bp를 MP RT-PCR로 증폭할 수 있다. 이때, 복합 역전사 중합효소 연쇄반응에 사용된 효소와 반응액은 Qiagen Onestep RT-PCR 키드에 포함된 것을 사용하였으며, 프라이머의 5'-말단에 Cy3를 부착하여 올리고 유전자칩과의 교잡 반응을 수행한 후 반응 유무를 확인할 수 있다.
본 발명은 또한, 하기 표 1의 서열번호 1 내지 13에서 고정화 염기서열인 9개의 구아닌(GGGGGGGGG)과 공간 확보를 위한 염기서열인 티민(TTT)과 아데닌(AAA)을 제외한 나머지 유전자 탐침(probe) 염기서열 중 선택된 1종인 염기서열을 포함하는 유전자칩을 제공한다.
본 발명에서, 상기 염기서열 및 이의 역방향 염기서열이 펩타이드 헥산(Peptide nucleic acid: PNA) 또는 차단 헥산(Locked nucleic acid: LNA)으로 치환된 염기서열을 포함하는 탐침을 사용할 수 있다.
또한 본 발명의 유전자칩은 형광염료가 부착된 RT-PCR용 프라이머와 반응하는 하이브리드화 대조군(Hybridization Control, 교잡반응) 탐침을 추가로 포함할 수 있으며, 이로 인해 상기 하이브리드화 대조군 탐침과의 반응 유무를 통해 시료와의 반응 조건이 정확한지 확인한 후 상기 하이브리드화 대조군 탐침을 기준으로 유전자 탐침의 위치를 확인할 수 있다.
또한 본 발명에서 구아닌 인식 유전자칩 기판을 이용하여 돼지콜레라 바이러스 및 소바이러스성설사증 바이러스 유전자를 검출할 수 있는데, 이때 사용되는 탐침으로는 서열번호: 14 내지 18로 기재되는 염기서열로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으며, 상기 염기서열의 5'-말단 위치에는 형광염료가 부착되어 검출을 용이하게 한다. 또한 상기에서 사용된 형광염료는 Cy3, Cy5, 비오틴-결합물질, 5-(2'-아미노에틸)아미노-1-나프탈렌 황산(EDANS), 테트라메틸로다민(TMR), 테트라메틸로다민 이소시아네이트(TMRITC), x-로다민 및 텍사스 레드로 이루어지는 군으로부터 선택되지만, 이에 한정되지 않는다.
본 발명에 사용된 탐침을 고정화시키기 위한 유리 슬라이드로는 (주)바이오메트릭스테크놀로지사의 구아닌 인식용 유리슬라이드가 사용되었으며, 이러한 방법은 상기 유리슬라이드에 탐침 중 연속되는 구아닌 염기의 영역을 선택적으로 인식하여 유전자를 일정거리를 두고 밀집되게 고정화시킬 수 있는 획기적인 기술이다.
또한 본 발명의 유전자칩은 돼지콜레라 및 소바이러스성설사증 바이러스가 양성임을 확인하고 유전자형 검사 올리고 염기칩에 사용된 탐침의 종류와 위치를 확인하는데 사용될 수 있으며, 돼지콜레라 및 소바이러스성설사증 바이러스의 유전자를 동시에 검사할 뿐만 아니라, 돼지콜레라 및 소바이러스성설사증 바이러스의 백신주 및/또는 야외주 바이러스 유전자 및 이의 유전자형을 동시에 검사할 수 있 다.
또한 본 발명은 상기 유전자칩을 이용하여 돼지콜레라 바이러스 및 소바이러스성설사증 바이러스 유전자를 검출하는 진단키트를 제공한다.
실시예
이하, 도면을 참고하여 본 발명의 바람직한 실시예를 예시하지만, 하기 실시예는 본 발명의 구성 및 효과를 입증하기 위한 실시예일 뿐 본 발명이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 올리고 유전자칩의 제작
올리고 유전자칩의 제작은 (주)바이오메트릭스테크놀로지사의 구아닌 인식용 유리슬라이드 상에서 제조사의 제공 매뉴얼에 따라 탐침을 고정화하였다.
(1) 돼지콜레라 및 소바이러스성설사증 올리고 유전자 탐침의 합성
돼지콜레라 및 소바이러스성설사증 바이러스의 검출을 위해 사용된 각 바이러스의 유전형에 특이적인 올리고 유전자 탐침은 5'-말단에 연속되는 9개의 구아닌 잔기를 갖도록 하기 표 1과 같이 합성하였다.
(올리고 유전자 탐침의 염기서열 구조)
탐침명 |
염기서열 구조(5'-3') |
서열번호 |
CSFV-P1 |
5`-GGGGG GGGGAAA CAGGACTTAGACCACCCAGGG -3` |
서열번호 1 |
CSFV-P2 |
5`-GGGGGGGGGAAA CAGCACCCTATCAGGTCGTAC -3` |
서열번호 2 |
CSFV-L |
5`-GGGGGGGGGTTT ACATAGCATATCGAGGTGGG -3` |
서열번호 3 |
CSFV-W |
5`-GGGGGGGGGTTT ACATAGCATCTCGAGGTGGG -3` |
서열번호 4 |
CSFV-2-1 |
5`-GGGGGGGGGAAA ATACTAGCCTGCTAGTGGGCC -3` |
서열번호 5 |
CSFV-2-2 |
5`-GGGGGGGGGAAA ATACTAGCCTGTTAGTGGGCC -3` |
서열번호 6 |
CSFV-3-1 |
5`-GGGGGGGGGAAA ATCTCGAGATGAGCTGCTGC -3` |
서열번호 7 |
CSFV-3-2 |
5`-GGGGGGGGGAAA CCCATCACGCAGTGTGATTTCAC -3` |
서열번호 8 |
BVDV-1-1 |
5`-GGGGGGGGGAAA AGCCATCCAACGAACTCACCAC -3` |
서열번호 9 |
BVDV-1-2 |
5`-GGGGGGGGGAAA CCACTGACGACTACCCTGTAC -3` |
서열번호 10 |
BVDV-2-1 |
5`-GGGGGGGGGAAA TACTCAGGGGTTCGGCCATCC -3` |
서열번호 11 |
BVDV-2-2 |
5`-GGGGGGGGGAAA TACTCAGGGATTAGGCCATCC -3` |
서열번호 12 |
HC |
5`-GGGGGGGGGAAA CCTACTRTGGGCATGGCTAG -3` |
서열번호 13 |
(염기서열 중 R은 A, G를 의미하며, 이는 당 업계의 통상의 지식을 갖는 자들에게 널리 공지되어 있음)
탐침의 구조는 구아닌 인식 슬라이드에 고정화되는 영역, 목표유전자와 반응하는 영역 및 상기 두 영역을 연결하며 일정한 공간을 만들어주는 영역과 같이 크게 3가지 영역으로 나누어지며, 공간을 만들어주는 영역은 경우에 따라 생략될 수 있다. 상기 표 1의 탐침인 CSFV-P1을 예로 들면, 슬라이드에 고정될 영역은 GGGGGGGGG이고, 공간을 만들어주는 영역은 AAA이며, 목표유전자와 반응하는 영역 CAGGACTTAGACCACCCAGGG이다. 이는 상기 탐침에만 한정되는 것이 아니라 모든 탐침 설계에 적용되는 기술이며, 또한 연속되는 구아닌의 숫자는 9개에 국한되지 않으며, 5 내지 15개 범위에서도 가능하다. 공간을 만들어주는 영역은 A,T,C 중 어떤 염기든 가능하며, 염기서열의 순서에도 제한을 두지 않으며, 염기숫자 또한 0 내지 12개 정도이면 제한을 두지 않는다. 또한 목표유전자는 상기 표 1에 기재된 염기서열 전체 혹은 일부를 포함하는 서열이 가능하며, 이에 한정되지 않는다. 상기 표 1의 탐침 중 돼지콜레라에서 증폭 프라이머와 교잡할 수 있는 탐침은 증폭 유무와 상관없이 증폭 결과물과 교잡반응을 수행하면 항상 양성으로 나오는 특징이 있어 2가지 역할을 하는데, 첫째는 칩 분석 시 전체 탐침의 기준점이 되고, 둘째는 교잡반응이 잘못되었을 경우에도 상기 탐침을 대조군으로 사용하여 결과를 분석할 수 있다.
(2) 돼지콜레라 및 소바이러스성설사증 올리고 유전자 탐침의 고정
올리고 유전자 탐침은 (주)바이오메트릭스테크놀로지의 구아닌 인식용 유리슬라이드에 제조사의 매뉴얼에 따라 고정화하였다.
실시예 2. 표본 채취 및 RNA 추출
(1) 돼지콜레라 및 소바이러스성설사증 바이러스 검체
돼지콜레라의 유형별 국내 표준 검체 샘플은 대한민국 농림부 국립수의과학검역원으로부터 제공받았으며, 시료는 전혈, 백혈구, 조직 및 바이러스 배양액 형태의 샘플로 보관되었다. 검체 바이러스는 전염성이 강하므로 생독 바이러스 형태로는 검역원 외로 반출이 금지되어 있어 검체 RNA의 추출은 검역원내에서 수행하였으며, RNA 추출은 Qiagene사의 RNeasy mini kit를 이용하여 RNA를 제조사의 매뉴얼에 따라 추출하였다.
실시예 3: 올리고 유전자칩을 이용한 돼지콜레라 및 소바이러스성설사증 검사
(1) 복합 역전사 중합효소 연쇄반응(MP RT-PCR)
돼지콜레라 및 소바이러스성설사증 바이러스의 유전자를 증폭하기 위해 MP RT-PCR에 사용한 프라이머는 Cy3가 부착된 Pesti-F와 CSFV-R, BVDV1-R1, BVDV1-R2, BVDV2-R을 사용하였으며, 증폭된 염기서열의 길이는 422bp 내지 423bp으로 하였다.
(복합 역전사 중합효소 연쇄반응 프라이머 염기서열)
프라이머 이름 |
염기서열(5'-3') |
서열번호 |
Pesti-F |
5`-GCTAGCCATGCCTTAGTAGGACT-3` |
서열번호 14 |
CSFV-R |
5`-CAGCTTCARYGTTGATTGT-3` |
서열번호 15 |
BVDV1-R1 |
5`-GAGCTTTAGCGTCGATTGA-3` |
서열번호 16 |
BVDV1-R2 |
5`-CAGTTTTAGCGTCGCCTGC-3` |
서열번호 17 |
BVDV2-R |
5`-GTAGTTTTAGTGTKGACTGCG-3` |
서열번호 18 |
(Pesti-F 탐침은 이의 5'에 Cy3 형광물질을 부착함. 염기서열 중 R은 A, G를 의미하고, Y는 C, T를 의미하며, K는 G,T를 의미한다)
MP RT-PCR은 다음과 같은 방법으로 수행한다. Qiagen사의 OneStep RT-PCR Kit를 이용하여 제조사의 매뉴얼에 따라 최종 부피가 25ul인 반응혼합물 용액을 준비한다. 이때, 사용한 프라이머는 반응용액 25ul에 각각 10pmol의 양으로 사용되었다. PCR 서머싸이클러(thermocycler, Biometra)에서 50℃에서 30분(역전사, Reverse transcription) 동안 RNA를 cDNA로 합성하고, 95℃에서 15분 동안 초기 PCR 활성화(Initial PCR activation) 단계, 94℃에서 20초 동안 변성(denaturation) 단계, 55℃에서 20초 동안 프라이머 어닐링(primer annealing) 단계 및 72℃에서 30초 동안 연장(extension) 단계를 하여, 상기 변성단계, 프라이머 어닐링 단계 및 연장 단계 등을 35회 반복하여 cDNA를 증폭하였다. 증폭된 결과물 용액 중 10ul의 시료를 취하여 로딩 다이(loading dye)와 혼합한 후 1.5% 아가로즈겔(agarose gel)에서 전기영동하여 1ug/ml 농도의 에티움브로마이드(Ethidium Bromide, Sigma)용액에서 15분간 염색한 후, 자외선을 이용하여 증폭된 cDNA의 크기를 확인하였다.
(2) 교잡반응(hybridization)(하이브리드)
상기 올리고 유전자 탐침이 고정화된 칩 기판에 MP RT-PCR에 의해 증폭된 돼지콜레라 혹은 소바이러스성설사증의 유전자의 교잡반응을 수행하였다. 교잡반응실(hybridization reaction chamber)로는 50ul 용량의 고무 웰 플레이트(도 1)를 사용하였다.
고무 웰 플레이트가 부착된 칩 기판상에 교잡용액(saline-sodium citrate (SSC), SDS, formamide) 40ul와 MP RT-PCR 증폭 산물 10ul를 혼합하여 도말하였다. 고무 웰 플레이트를 플레이트 밀봉제(plate sealer)를 이용하여 밀봉하여 상기 용액이 증발하는 것을 방지한 후 인큐베이터(40 내지 55℃)에서 1 내지 2 시간 동안 반응시킨다. 교잡반응이 끝난 후, 웰 플레이트와 사용된 밀봉제를 제거하고, 워쉬 1(Wash 1, SSC, SDS) 용액으로 45 내지 25℃에서 2분 동안 세척한 후에 다시 워쉬 2(SSC) 용액으로 2분 동안 세척하고, 칩 슬라이드를 건조시킨 후, 콘포칼레이저스캐너(confocal laser scanner, PerkinElmer Scane Array Express HT)를 이용하여 형광신호를 분석하였다.(excitation 550nm, emission 570nm)(표 3 참조).
(3) 돼지콜레라 및 소바이러스성설사증 올리고 유전자칩의 해석
돼지콜레라 및 소바이러스성설사증 바이러스 올리고 유전자칩의 탐침에 대한 유전자 지도는 도 2에 도시된 바와 같으며, MP RT-PCR에 의해 증폭된 유전자를 상기 칩에 중합반응시킨 후 결과를 판독하였다. 탐침 CSFV-P1 또는 CSFV-P2가 반응하는 경우 돼지콜레라 양성 반응으로 판정하고, CSFV-L 탐침이 반응하는 경우 돼지콜레라의 유전자 1형 백신주로 판정하고, CSFV-L 탐침과 반응하지 않지만 CSFV-W 탐침과 반응하는 경우 1형 야외주로 판정하였다. 또한, CSFV-L 및 CSFV-W가 동시에 반응할 때에는 그 반응 우위에 따라 CSFV-L > CSFV-W인 경우에는 백신주로 판정하고, CSFV-L < CSFV-W인 경우에는 야외주로 판정하였다. CSFV-W, CSFV-2-1 또는 CSFV-2-2와 반응하는 경우 유전자 1형 야외주로 판정하고, CSFV-3-1 및 CSFV-3-2 탐침과 반응하는 경우 유전자 3형 야외주로 판정하였다. 탐침 BVDV-1-1 및 BVDV-1-2와 반응하는 경우 소바이러스성설사증 유전자 1형으로 판정하고, 탐침 BVDV-2-1와 반응하거나 BVDV-2-2와 반응하는 경우 소바이러스성설사증 유전자 2형으로 판정하였다(표 3 참조).
올리고유전자칩에 의해 확인된 돼지콜레라 혹은 소 바이러스성 설사증 유전형 및 위치
바이러스 |
유전형 |
시료명 |
Multiplex RT-PCR |
유전자칩 |
비고 |
돼지콜레라 |
Genotype1 백신주 |
1 |
|
|
|
Genotype1 야외주 |
2 |
|
3 |
|
Genotype2 야외주 |
4 |
|
5 |
|
Genotype3 야외주 |
6 |
|
소 바이러스성 설사증 |
Genotype1 |
7 |
|
Genotype2 |
8 |
|
돼지콜레라, 소 바이러스성 설사증 중복 감염 |
|
9 |
|
상술한 바와 같이, 유전자칩은 유전자 및 유전자 변이를 단시간에 대량으로 분석할 수 있는 도구로서 근래에 그 중요성이 증가하고 있으며, 본 발명에서는 상기 유전자칩 기술 중 특히 구아닌 인식 슬라이드를 이용하여 탐침 사이의 거리를 일정하게 조절하면서 밀집되게 고정시키는 기술과, 탐침의 합성구조의 개발로 인해 목표유전자와의 반응성을 높일 수 있어 소량의 유전자가 존재하여도 검출할 수 있는 우수한 민감도를 갖는 유전자 칩이 개발되었다. 또한, 바이러스와 특이적으로 반응하는 탐침을 합성하여 탐침과의 반응 결과물의 조합으로부터 바이러스 감염의 양성 및/또는 음성의 확인 및 백신주/야외주의 구분, 유전형 구분할 수 있게 되었다. 특히, 백신주/야외주를 구분할 수 있는 해당 탐침은 그 특이성이 SNP(Single Nucleotide Polymorphism)의 수준이고 유전형 구분영역도 또한 SNP 수준이여서 구분하기 힘든 기술로 알려졌지만, 본 발명에 따른 유전자칩을 이용하는 경우 매우 확하게 이를 구분할 수 있었다.