KR100710462B1

KR100710462B1 - 폐암 진단용 퍼옥시레독신-ｉ자가항체 마커 및 이를 이용한진단키트

Info

Publication number: KR100710462B1
Application number: KR1020050078032A
Authority: KR
Inventors: 유영준; 장종욱
Original assignee: 광주과학기술원
Priority date: 2005-08-24
Filing date: 2005-08-24
Publication date: 2007-04-24
Also published as: KR20070023448A

Abstract

혈액을 이용하여 간편하게 폐암을 진단할 수 있는 자가항체 마커 및 이의 항원을 포함하는 폐암 진단키트가 제시되어 있다. 본 발명의 폐암 진단용 퍼옥시레독신-I 자가항체 마커 및 이의 항원을 포함하는 진단키트는 진단기술에 있어서의 낮은 감도로 인해 발생되는 폐암의 조기 진단의 어려움을 극복하는데 유용하게 사용될 수 있다.

폐암, 진단용 마커, 퍼옥시레독신-I, 자가항체

Description

폐암 진단용 퍼옥시레독신-Ｉ자가항체 마커 및 이를 이용한 진단키트 {Autoantibody of peroxiredoxin-I as a biomarker and diagnosis kit for lung cancer using the same}

도 1a는 이차원전기영동으로 폐암 세포주 A549세포의 단백질을 분리하여 쿠마쉬블루에 염색한 결과이고,

도 1b는 전기영동한 젤 상의 염색된 퍼옥시레독신-I의 스팟을 확대한 사진이고,

도 1c는 이차원전기영동 수행 후 니트로셀룰로즈 막으로 전이시킨 퍼옥시레독신-I 항원을 퍼옥시레독신-I에 대한 항체를 이용하여 면역블롯 (immunoblot)으로 검출한 결과이고,

도 1d는 10명의 정상인에서 얻은 혈청을 니트로셀루로즈 막에 고정된 퍼옥시레독신-I 단백질과 반응시켜 얻은 면역블롯 결과이고,

도 1e는 10명의 폐암 환자에서 얻은 혈청을 니트로셀루로즈 막에 고정된 퍼옥시레독신-I 단백질과 반응시켜 얻은 면역블롯 결과이고,

도 2a는 6개의 히스티딘이 태그된 재조합 퍼옥시레독신-I (H₆-Prx-I) 단백 질을 10명의 정상인 및 10명의 환자 혈청과 각각 반응시켜 면역블롯한 결과이고,

도 2b 및 도 2c는 10 ng의 재조합 퍼옥시레독신-I (H₆-Prx-I) 단백질을 전기영동한 후 50명의 정상인 및 57명의 폐암 환자의 혈청과 각각 반응시킨 면역블롯 결과 중 각 20명에서 얻어진 결과를 대표적으로 나타낸 결과이고,

도 3은 정제된 재조합 퍼옥시레독신-I (H₆-Prx-I)을 항원으로 하여 퍼옥시레독신-I에 대한 자가항체를 ELISA 를 이용하여 측정한 결과이다.

본 발명은 폐암을 진단할 수 있는 자가항체 마커 및 이의 항원을 포함하는 진단키트에 관한 것이다.

폐암은 흡연인구의 증가와 대기 오염 등의 원인으로 우리나라에서도 급속히 증가하고 있는 종양으로 그 발생 빈도는 남자에서 위암 다음으로 2위, 여자에서 자궁암, 위암, 폐암, 대장암 다음으로 5위를 차지하고 있고 사망률은 남녀 모두에서 암 사망율 1위를 차지하고 있다 (서재환 et al., 통계청 (2005)).

이러한 폐암의 발생 빈도 및 폐암으로 인한 사망률의 증가는 현재의 흡연 실태로 보아 앞으로도 상당 기간 지속될 것으로 예상된다. 폐암은 암세포의 성장으 로 인한 주변 조직 침범 또는 기도폐쇄, 림프절 전이 등의 증상을 초래하는 것이 보통이지만, 환자의 10-15% 정도는 아무런 증상 없이 정기 검진에서 진단된다. 또한, 대부분의 폐암이 진단 당시에 이미 제 III (3) 병기 이상으로 진행된 상태로 진단되므로 완치가 어려운 경우들이 대부분이라는 문제가 있다. 따라서 폐암을 조기에 진단하여 폐암으로 인한 사망률을 줄이는 것이 시급한 문제이다 (Wulfkuhle et al., Nat. Rev. Cancer 3, 267-275. (2003)).

폐암을 진단하기 위해서 여러 가지 방법이 복합적으로 사용되고 있는데, 현재까지는 종양의 크기, 림프절 전이 유무 등을 조사하거나, 폐 종양 조직 또는 림프절 등을 생검하여 면역조직화학방법으로 분석하거나 흉부 X-선 촬영, 흉부 전산화 단층 촬영, 기관지 내시경을 이용하여 진단하고 있다 (Manser et al., Curr. Opin. Pulm. Med. 10, 266-271. (2004)).

그러나, 흉부전산화 단층 촬영의 경우 폐암의 크기가 약 0.1 cm 이상 되어야 측정가능한데, 이 시기는 이미 암이 다른 조직으로 전이되었을 가능성이 높다는 문제가 있고, 기관지 내시경을 이용한 방법은 내시경이 기관지로 삽입되어 폐 내부를 직접 관찰할 수 있으나 폐 말단에 있는 종양을 관찰하기 어렵다는 공간적 한계의 문제를 가지고 있다.

이러한 기존 진단방법의 단점을 보완하기 위한 방법으로 환자의 혈액에서 CBC (Complete blood count), 혈청 전해질 (칼슘 포함), 염기성 탈인산화효소 (Alkaline phosphatase), 알부민 (Albumin), AST (Aspartate aminotransferase), ALT (Alanine transaminase), 총 빌리루빈 (Total bilirubin) 또는 크레아티닌 (Creatinine)의 농도를 측정하여 폐암을 진단하려는 시도가 있었다 (Fishman et al., Cancer Res. 28,150-154 (1968), Nagamine et al., Clin. Chem. 29, 379-381 (1983), Muggia et al., 1, 217-228. (1974)).

그러나, 이러한 종양 표지자 (marker)들의 진단적 또는 예후 인자로써의 가치가 연구되어 왔지만 아직까지 제한적으로 사용되고 있을 뿐으로 공식적으로 권장되고 있는 폐암 표지자는 없는 실정이다.

본 발명자들은 폐암 환자에서 얻어진 생물학적 검체 시료 내에서 특이하게 변화하는 단백질을 프로테오믹스 기술을 이용하여 발굴하였고, 폐암 특이적인 단백질을 이용하여 폐암을 조기 진단하는 방법을 연구하여 왔다. 특히, 본 발명자들에 의해 동정된 퍼옥시레독신-I 단백질이 폐암 조직에서 재현성 있게 과발현되어 있음을 확인한 바 있다 (Chang et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 289, (2001)).

또한, 본 발명자들은 상기 퍼옥시레독신-I 단백질이 폐암 조직에서 과발현될 뿐만 아니라 이에 대한 자가항체가 환자의 혈액 속에 존재한다는 사실을 새로이 알아내었고 이것의 검출을 통한 면역화학법으로 폐암을 간편하게 진단할 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

따라서 본 발명의 목적은 혈액을 이용하여 간편하게 폐암을 진단할 수 있는 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여,

본 발명의 일 측면은 폐암 진단용 퍼옥시레독신-I 자가항체 마커를 제시할 수 있다.

또한, 본 발명의 다른 측면은 퍼옥시레독신-I 자가항체 마커의 항원을 포함하는 폐암 진단키트를 제시할 수 있다.

아울러, 본 발명의 또 다른 측면은 검체에서 퍼옥시레독신-I 자가항체 마커를 검출하는 방법을 제시할 수 있다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명의 일 측면에 의하면, 폐암 진단용 퍼옥시레독신-I 자가항체 마커를 제시할 수 있다.

본 발명에서는 상기 퍼옥시레독신-I 자가항체가 폐암 환자의 혈액에 존재함을 확인하였고, 이의 항원으로 기능하는 단백질을 제조하여 정상인과 폐암 환자의 혈액 시료를 대상으로 면역화학법을 수행한 결과, 유의한 결과를 얻어 상기 퍼옥시레독신-I 자가항체가 폐암의 진단 마커로 사용할 수 있음을 확인하였다.

본 발명의 실시예에 의하면, 피검자의 혈액 시료를 채취하여 피검자의 혈액 시료에 함유된 상기 폐암 진단 마커를 검출함으로써, 폐암의 발병 여부를 확인할 수 있다.

구체적으로, 본 발명자들은 폐암 세포에서 추출 분리된 퍼옥시레독신-I 단백질을 항원으로 이용하여 혈액을 검체로 면역블롯을 수행하였다.

그 결과, 정상인 혈청과 반응시킨 나이트로셀룰로오즈 막에서는 퍼옥시레독신-I 스팟이 검출되지 않았으나 (도 1d), 폐암 환자의 혈청과 반응시킨 막에서는 퍼옥시레독신-I 스팟이 검출되었다 (도 1e). 이 결과로부터 폐암 환자의 혈액 내에 퍼옥시레독신-I의 자가항체가 생성되어 있으며, 이 자가항체는 세포 유래의 퍼옥시레독신-I과 면역반응을 일으킴을 확인하였다.

또한, 본 발명자들은 퍼옥시레독신-I 아미노산 서열(서열번호 1)의 첫번째 아미노산인 메치오닌 뒤에 여섯 개의 히스티딘이 첨가된 서열번호 2의 서열을 가지는 재조합 퍼옥시레독신 H₆-Prx-I을 박테리아에서 생산하여 이를 항원으로 정상인과 폐암 환자의 혈액을 검체로 면역블롯을 수행하였다. 세포 유래 퍼옥시레독신-I의 경우와 마찬가지로 정상인의 혈청은 재조합 퍼옥시레독신-I (H₆-Prx-I) 항원과 반응하지 않았으나 폐암 환자의 혈청은 5 ng까지 H₆-Prx-I과 반응하는 감도를 보였다 (도 2a). 전체 53명의 폐암 환자 중 25명 (47.1%)이 양성 반응을 보였으며 정상인 혈청의 경우 50명 중 4명 (8%)이 양성 반응을 보이는 것으로 분석되었으므로 (표 1), 본 발명의 자가항체 마커 및 상기 자가항체의 항원을 이용한 폐암 발병 확인방법은 환자의 혈액을 이용하는 새로운 면역학적 진단도구로서 민감도가 우수하여 폐암의 조기 진단에 기여할 수 있음을 확인하였다.

또한, 본 발명의 다른 측면에 의하면, 퍼옥시레독신-I 자가항체에 특이적으로 결합하는 항원을 포함하는 폐암 진단키트를 제시할 수 있다.

퍼옥시레독신-I 자가항체에 특이적으로 결합하는 항원은, 공지된 퍼옥시레독신-I 단백질의 아미노산 서열의 전부 또는 일부를 이용하여 합성하거나, 세포로부터 추출하거나, 유전자 재조합 기술을 이용하여 미생물로부터 생산할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 퍼옥시레독신-I 항원을 세포로부터 추출하는 경우에는 폐암 세포주 A549 (ATCC number:CCL-185)를 이용할 수 있으며, 유전자 재조합 기술을 이용하여 미생물로부터 생산하는 경우에는 재조합 단백질의 용이한 정제를 위하여 히스티딘이 태깅된 발현 벡터를 이용할 수 있다.

본 발명의 진단키트는 퍼옥시레독신-I 자가항체에 특이적인 항원; 기질과의 반응에 의해서 발색하는 표지체가 접합된 2차 항체 접합체 (Conjugate); 상기 표지체와 발색 반응할 발색 기질 용액; 세척액; 및 효소반응 정지용액을 포함할 수 있다.

본 발명의 진단키트는 항원항체 결합반응을 통하여 퍼옥시레독신-I 항원에 대한 자가항체를 분석함으로써 폐암을 진단할 수 있으며, 상기 항원항체 결합반응은 통상의 ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay), RIA (Radioimmnoassay), 샌드위치 측정법 (Sandwich assay), 폴리아크릴아미드 겔 상의 웨스턴 블롯, 면역 블롯 분석 또는 면역조직화학염색 방법 (Immnohistochemical staining) 으로 측정할 수 있다.

항원-항체 결합 반응을 위한 고정체로는 니트로셀룰로오즈 막, PVDF 막, 폴리비닐 (Polyvinyl) 수지 또는 폴리스티렌 (Polystyrene) 수지로 합성된 웰 플레이트 (Well plate) 및 유리로 된 슬라이드 글래스 등이 사용될 수 있다.

2차 항체의 표지체는 발색반응을 하는 통상의 발색제가 바람직하며, HRP (Horseradish peroxidase), 염기성 탈인산화효소 (Alkaline phosphatase), 콜로이드 골드 (Coloid gold), FITC (Poly L-lysine-fluorescein isothiocyanate), RITC (Rhodamine-B-isothiocyanate) 등의 형광물질 (Fluorescein) 및 색소 (Dye) 등의 표지체가 사용될 수 있다.

발색을 유도하는 기질은 발색반응을 하는 표지체에 따라 사용하는 것이 바람직하며, TMB (3,3',5,5'-tetramethyl bezidine), ABTS [2,2'-azino-bis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)], OPD (o-phenylenediamine) 등을 사용할 수 있다. 이 때, 발색제 기질은 완충용액 (0.1 M NaAc, pH 5.5)에 용해된 상태로 제공되는 것이 더욱 바람직하다. TMB와 같은 발색기질은 2차 항체 접합체의 표지체로 사용된 HRP에 의해 분해되어 발색 침적체를 생성하고 그 발색 침적체의 침적 정도를 육안으로 확인함으로써 퍼옥시레독신-I 자가항체의 존재 유무를 검출한다.

세척액은 인산염 완충용액, NaCl 및 트윈 20을 포함하는 것이 바람직하며, 0.02 M 인산염 완충용액, 0.13 M NaCl, 및 0.05% 트윈 20 (Tween 20)으로 구성된 완충용액 (PBST)이 더욱 바람직하다. 세척액은 항원항체 결합반응 후 항원항체 결합체에 2차 항체를 반응시킨 다음 적당량을 고정체에 가하여 3 내지 6회 세척한다. 반응 정지용액은 황산 용액(H₂SO₄)이 바람직하게 사용될 수 있다.

상기 검출방법은 퍼옥시레독신-I 항원을 검체와 접촉시켜 항원항체 반응을 통해 자가항체의 존재를 확인하는 것을 포함한다. 상기 항원항체 반응으로서 효소면역측정법 (ELISA), 면역침강법, 형광면역법, 효소기질발색법, 항원항체응집법 등을 들 수 있다. 검체로서는 혈청, 혈장 또는 혈액을 사용할 수 있고, 혈청이 가장 바람직하다.

본 발명의 바람직한 실시예에 의하면, 상기 검출방법은,

1) 퍼옥시레독신-I항원을 고정체에 코팅시키는 단계;

2) 단계 1)의 고정체에 검체를 가하여 항원항체 반응시키는 단계;

3) 단계 2)를 통해 생성된 항원항체 반응물을 2차 항체 접합체 (conjugate) 및 발색기질 용액을 이용하여 검출하는 단계; 및

4) 검체와 대조군에 대한 검출 결과를 비교하는 단계를 포함할 수 있다.

상기 검출방법을 구체적으로 설명하면, 우선 세포 내에 존재하는 퍼옥시레독신-I 또는 재조합 H₆-Prx-I을 분자량에 따라 분리한다. 퍼옥시레독신-I은 분자량이 22 kDa으로 12% 폴리아크릴아마이드 젤을 이용하여 전기영동을 수행하면 퍼옥시레독신-I 단백질이 젤 상에 위치하게 되고 (도 1a), 상기 분획화된 퍼옥시레독신-I을 고정시킬 수 있는 고정체인 니트로셀룰로즈 막으로 전이 (Transfer)시킨다. 이어, 고정된 퍼옥시레독신-I 항원에 정상인과 환자의 혈청을 가하여 항원항체 반응을 수행한다. 폐암 환자의 혈청에는 퍼옥시레독신-I의 자가항체가 존재하므로 항원이 고정된 막과 반응시키면 항원인 퍼옥시레독신-I과 결합하게 된다. 퍼옥시레독신-I과 결합된 자가 항체를 측정하기 위해서, 이 항체와 친화성을 가지고 있는 이차항체, anti-human IgG-HRP과 결합시키는 단계를 거치는데, 이차항체에 접합된 HRP (Horseradish peroxidase)가 기질인 ECL (Enhanced chemiluminescence)과 반응하여 발색반응을 일으키는지의 여부와 그 정도를 대조군과 비교함으로써 퍼옥시레독신-I의 자가항체의 존재 여부를 검출하게 된다.

한편, 퍼옥시레독신-I 자가항체에 특이적인 항원을 생물학적 마이크로칩 (Biological microchip) 상에 고정시킨 후 대상자로부터 분리된 검체 시료와 반응시켜 상기 항원 단백질에 대한 자가항체를 검출할 수 있는 생물학적 마이크로칩 (Biological microchip) 및 자동화된 미세배열 시스템 (Microarray system)을 이용하면, 대량으로 시료를 분석할 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.

실시예 1: A549 세포 추출 단백질을 이용한 퍼옥시레독신-I 자가항체의 검출

폐암 세포인 A549 (ATCC number:CCL-185) 세포로부터 퍼옥시레독신-I 단백질을 추출하기 위하여, 상기 세포를 37℃, 5%의 CO₂ 배양기 내에서 10%의 우혈청 (FBS)이 포함된 배지에서 48시간 동안 배양하였다. 배양된 세포를 회수하고 PBS (Phosphate buffered saline)로 세척한 후 PBS를 제거하고 9.5 M 우레아 (Urea)와 1% CHAPS ((3-[(3-cholamidopropyl)-dimethylammino]-1-propane sulfonate))가 함유된 용액에서 초음파파쇄기 (Sonicater)를 이용하여 세포를 파쇄하였다. 이어 12,000 rpm에서 원심분리를 수행하여 용해도가 높은 단백질만을 얻어낸 후 브래드포드 (Bradford) 방법으로 단백질의 농도를 측정하였다. 250 ug의 세포 추출 단백질을 pH 4-10의 범위를 가진 IPG 스트립(strip)에 12 시간 동안 재-수화 (Rehydration) 하고 500 V에서 1시간, 1000 V에서 1시간, 8000 V에서 2시간 동안 등전점에 따라 분리하였다. IPG 스트립을 50 mM 트리스 (Tris-HCl, pH 8.8), 6 M 우레아, 30% 글리세롤, 2% SDS, 0.1% DTT가 포함된 용액에서 30 분간 반응시킨 후 10 내지18% 농도 구배를 가지는 젤 상에서 다시 분리하였다 (도 1). 분리된 단백질을 50 mM 트리스, 130 mM 글리신, 0.05% SDS, 12.5% 메탄올이 포함된 용액 내에서 니트로셀룰로즈 막으로 전이 (transfer)시켰다. 전이된 막에 10% 탈지분유가 용해된 TBST (Tris buffered saline tween 20)을 가하여 비특이적인 결합을 블로킹하고 정상인 혈청과 폐암 환자 혈청을 각각 TBST에 1:500으로 희석하여 2시간 동안 막과 반응시켰다. 이어 1:5000으로 희석한 이차 항체 anti-human IgG-HRP와 1시간 동안 반응시키고 다시 ECL(Enhanced chemiluminance)을 가하여 암실에서 X-ray 필름에 감광시켰다. 정상 혈청과 반응시킨 막에서는 퍼옥시레독신-I의 스팟 (Spot)이 검출되지 않았으나 (도 1d), 폐암 환자의 혈청과 반응시킨 막에서는 검출되었으므로 (도 1e), 폐암 환자의 혈청 내에 퍼옥시레독신-I의 자가항체가 생성되어 있음을 확인하였다.

실시예 2: 재조합 퍼옥시레독신-I을 이용한 면역블롯팅

2-1: 재조합 퍼옥시레독신-I 단백질의 생산

먼저 말단에 BamHI과 HindIII 절단 부위를 가지는 퍼옥시레독신-I 유전자 서열을 제조하였다. 우선, 사람의 폐에서 얻어진 cDNA library (Clontech사)를 주형(template)으로, 5'말단에 BamHI 절단 부위를 가지도록 고안된 서열번호 4 (5'-GGA TCC GCG ATG TCT TCA GGA AAT GC-3')의 염기서열을 가지는 정방향 프라이머와 3' 말단에 HindIII 절단 부위를 가지도록 고안된 서열번호 5 (5'-CCC AAG CTT GGT CAC TTC TGC TTG GAG-3')의 염기서열을 가지는 역방향 프라이머를 이용하여 DNA 중합효소로 PCR 반응을 수행하였다. 증폭된 퍼옥시레독신-I 유전자를 BamHI 및 HindIII로 절단된 pET28a 벡터 (Novagen 사)에 직접 클로닝하여 재조합 퍼옥시레독신-I 발현벡터 pET/H₆-Prx-I을 제조하였다. 상기 발현벡터를 이를 대장균 BL21에 도입하고, 형질전환체를 선별한 후 30 ㎍/㎖의 가나마이신과 1 mM의 IPTG 을 포함하는 LB 배지로 37 ℃ 에서 4시간 동안 진탕 배양하였다. 배양된 균체를 5,000 × g에서 원심분리하여 상등액만 회수하고 초음파 파쇄 방법으로 세포를 파쇄하였다. 본 발 명에서 사용한 발현벡터 pET28a는 6개의 히스티딘을 포함하고 있으므로 재조합 퍼옥시레독신-I 단백질은 Ni-NTA 친화성 크로마토그래피로 분리 정제하였다.

2-2: 재조합 퍼옥시레독신-I을 항원으로 이용한 면역블롯팅

혈청이 항원을 검출할 수 있는 감도를 측정하기 위해서 40 ng부터 2배씩 5 ng 까지 희석한 재조합 퍼옥시레독신-I (H₆-Prx-I)을 12% 폴리아크릴아마이드 젤에서 전기영동하고 니트로셀룰로즈 막으로 전이시켰다. 정상인 및 폐암 환자 혈청을 퍼옥시레독신-I이 전이된 고정체 막에 가하여 반응시키고 다시 anti-human IgG-HRP와 ECL을 이용하여 퍼옥시레독신-I에 대한 자가항체를 검출하였다. 그 결과, 정상 혈청은 H₆-Prx-I과 반응하지 않았으나 폐암 환자의 혈청은 5 ng까지 H₆-Prx-I과 반응하는 감도를 보였다 (도 2a). 이 결과를 바탕으로 개개인의 혈청을 분석하기 위해 항원으로서의 H₆-Prx-I의 양을 10 ng으로 결정하였다.

50명의 정상 혈청과 53명의 폐암 (28명은 선암(Adenocarcinoma), 25명은 편평상피암(Squamous cell carcinoma))환자 혈청을 병원으로부터 확보하였다. 폐암 환자는 44세에서 81세 사이의 34명의 남성과 19명의 여성이다. 정상 혈청은 44세부터 85세 사이의 31명의 남성과 19명의 여성으로부터 채취되었다. 퍼옥시레독신I의 자가항체를 분석하기 위하여 10 ng의 H₆-Prx-I을 12% 폴리아크릴아마이드 젤에서 전기영동하고 나이트로셀룰로오즈 막에 전이시킨 후 각각 정상 혈청과 폐암 환자의 혈청에 반응시키고 anti-human IgG-HRP와 ECL을 이용하여 검출하였다 (도 2b 및 도 2c).

그 결과, 표 1에 나타난 바와 같이, 전체 53명의 폐암 환자 중 25명 (47.1%)이 양성 반응을 보였는데, 28명의 선암 환자의 경우 14명인 50%가, 25명의 편평상피암 환자의 경우는 11명 (44%)이 양성 반응을 보였다. 반면, 정상 혈청의 경우 50명 중 단 4명 (8%)만이 양성 반응을 보이는 것으로 분석되었다.

	시료수	양성
비소세포폐암	53	25 (47.1%)
선암	28	14 (50.0%)
편평상피암	25	11 (44.0%)
정상	50	4　 (8.0%)

상기 결과로부터 혈액 내에 퍼옥시레독신-I 자가항체가 검출되는 경우는 폐암 환자일 가능성이 높다고 판정할 수 있으므로 본 발명이 폐암의 조기 진단에 유용하게 이용될 수 있음을 확인하였다.

실시예 3: 재조합 퍼옥시레독신-I 을 이용한 효소면역분석 (ELISA )

폐암환자의 혈청 내에 퍼옥시레독신-I에 대한 자가항체를 측정하기 위해서 ELISA (Enzyme-linked immunsorbent assay)를 실시하였다. 먼저 96 well에 1 μg의 H₆-Prx-I을 37 ℃에서 2 시간 동안 부착시키고 5% BSA (Bovine serum albumin)로 비특이적 단백질 결합을 차단시켰다. 여분의 BSA를 PBST로 세 번 세척한 다음 1:1000으로 희석한 정상 혈청과 환자 혈청을 가하여 2시간 동안 상온에서 반응시켰다. 이어, 반응물을 PBST로 세 번 세척하고 1:5000으로 희석한 anti-human IgG-HRP 이차항체를 가하여 반응시켰다. 여분의 이차항체를 PBST로 세척하여 제거하고 HRP와 반응하는 기질 OPD (o-phenylenediamine)를 가하여 10분 동안 반응시킨 후 0.5 M H₂SO₄를 넣어 반응을 종료시켰다. OPD의 발색 정도는 490 nm 흡광도에서 분석 되었다 (도 3). 50명의 정상인 혈청과 53명의 폐암 환자의 혈청의 흡광도 분석결과는 표 2에 정리하였다. 그 결과, 실시예 2의 면역블롯팅을 이용하여 퍼옥시레독신-I에 대한 자가항체를 분석한 결과와 일치하는 양상을 나타내었으므로 본 발명의 유용성을 재차 확인하였다.

정상인의 흡광도 (O.D)					폐암환자의 흡광도 (O.D)
0.006	0.04	0.047	0.055	0.066	0.058	0.076	0.099	0.12	0.17
0.02	0.04	0.047	0.056	0.067	0.069	0.076	0.099	0.122	0.172
0.031	0.041	0.048	0.058	0.068	0.072	0.081	0.104	0.13	0.18
0.035	0.042	0.05	0.058	0.068	0.072	0.081	0.105	0.134	0.187
0.036	0.044	0.051	0.06	0.075	0.073	0.084	0.106	0.135	0.21
0.037	0.044	0.051	0.061	0.076	0.074	0.088	0.28	0.137	0.226
0.037	0.045	0.052	0.062	0.095	0.074	0.09	0.31	0.144	0.268
0.037	0.046	0.052	0.064	0.006	0.074	0.097	0.274	0.149	0.288
0.039	0.046	0.054	0.065	0.008	0.075	0.097	0.116	0.15	0.5
0.039	0.046	0.054	0.066	0.009	0.076	0.099	0.116	0.162	0.079
					0.08	0.069	0.079

상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 폐암 진단용 자가항체 마커 및 이의 항원을 이용한 폐암 진단키트는 비교적 채취가 용이한 혈액을 검체로 하므로 기존 의 폐암 진단방법이 가지는 문제를 해소할 수 있을 뿐만 아니라 진단 감도가 높아 폐암의 조기 진단에 유용하게 사용될 수 있다.

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퍼옥시레독신-1 자가항체 마커에 특이적인 퍼옥시레독신-I 항원을 포함하는 폐암 진단키트.
제2항에 있어서, 상기 항원이 폐암 세포에서 분리되거나 미생물에서 유전자 재조합되어 생산되는 것인 폐암 진단키트.
제2항에 있어서, 기질과의 반응에 의하여 발색하는 표지체가 접합된 2차 항체 접합체; 상기 표지체와 발색 반응할 발색 기질 용액; 세척액; 및 효소반응 정지액을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 폐암 진단키트.
제4항에 있어서, 2차 항체 접합체의 표지체가 HRP (Horseradish peroxidase), 염기성 탈인산화효소 (Alkaline phosphatase), 콜로이드 골드 (Coloid gold), 형광물질 (Fluorescein) 및 색소 (Dye)로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 진단 키트.
제4항에 있어서, 발색기질이 TMB (3,3',5,5'-tetramethyl bezidine), ABTS [2,2'-azino-bis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)] 및 OPD (o-phenylenediamine)로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 진단 키트.
검체로부터 항원항체 반응을 이용하여 퍼옥시레독신-I 자가항체 마커를 검출하는 방법.
제7항에 있어서, 상기 항원항체 반응이 면역블롯법, 효소면역법, 면역침강법, 형광면역법, 효소기질발색법, 항원항체 응집법으로 이루어진 군 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
제7항에 있어서, 상기 검체가 혈청, 혈장 또는 혈액인 것을 특징으로 하는 방법.
1) 퍼옥시레독신-I 항원을 고정체에 코팅시키는 단계;

2) 단계 1)의 고정체에 검체를 가하여 항원항체 반응시키는 단계;

3) 단계 2)를 통해 생성된 항원항체 반응물을 2차 항체 접합체 (Conjugate) 및 발색기질 용액을 이용하여 검출하는 단계; 및

4) 검체와 대조군에 대한 검출 결과를 비교하는 단계를 포함하는 퍼옥시레독신-I 자가항체 마커의 검출방법.
제10항에 있어서, 상기 고정체가 니트로셀룰로오즈 막, PVDF 막, 폴리비닐 (Polyvinyl) 또는 폴리스티렌 (Polystyrene) 수지로 합성된 웰 플레이트 및 유리로 된 슬라이드 글래스로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.